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Dr.ssa Doni Serena
Short Term Mobility 2015
La metaproteomica per definire il ruolo dei microorganismi della rizosfera nel
ciclo del fosforo
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Sommario Introduzione ...................................................................................................................................................... 3
Obiettivo ............................................................................................................................................................ 4
Materiali e metodi ............................................................................................................................................. 4
1. Studio delle proteine in colture cellulari ................................................................................................... 7
2. Studio delle proteine nei campioni di suolo e rizosfera .......................................................................... 10
Risultati ............................................................................................................................................................ 14
1. Risultati dello studio delle proteine nelle colture cellulari ...................................................................... 14
2. Risultati dello studio delle proteine nei campioni di suolo e di rizosfera ............................................... 17
Conclusioni ...................................................................................................................................................... 19
Riferimenti bibliografici ................................................................................................................................... 20
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Introduzione
La collaborazione, iniziata nel 2004, tra il gruppo di ricerca dell’ISE del CNR di Pisa coordinato
dalla Dr. Grazia Masciandaro e il gruppo dell’Università di Warwick coordinato dalla Prof.
Elizabeth M. H. Wellington, ha fornito, e continua a fornire, un contributo essenziale nella messa a
punto delle metodologie per lo studio della struttura, funzione e regolazione dell’espressione
proteica dei microrganismi del suolo.
Il progetto di ricerca svolto nell’ambito della presente Short Term Mobility ha previsto
l’applicazione delle metodologie di metaproteomica per valutare l'effetto dell'applicazione di
fosforo sull'espressione proteica dei microorganismi.
Questo è un aspetto molto importante, in quanto, per garantire la futura sicurezza alimentare e la
sostenibilità ambientale, è necessario ottenere informazioni utili ad ottimizzare le pratiche di
gestione agricole.
Il fosforo è presente nel suolo in molte forme la cui disponibilità è legata alle caratteristiche
chimiche del terreno, alla forma chimica del fosforo e all'attività dei microorganismi e delle piante.
La crescita dei microorganismi e delle piante nel suolo dipende dall’adeguata presenza di fosforo, in
forma di fosfato (Pi), nella soluzione del suolo. In un contesto agricolo, il fosforo in forma
inorganica deriva principalmente dai fertilizzanti inorganici e dalla liberazione di fosfato dalle
forme organiche e inorganiche a livello della rizosfera; rilascio che è influenzato dall’attività
microbica, dal rilascio di essudati radicali e dalle caratteristiche chimico-fisiche del terreno. Capire
in che misura l'attività microbica e gli essudati radicali contribuiscono alla disponibilità di Pi è
fondamentale per ottimizzare l’uso di fertilizzanti a base di Pi non rinnovabili e ridurre al minimo il
loro impatto negativo sull'ambiente. Il ruolo relativo di microorganismi ed essudati radicali della
pianta nel rilascio e acquisizione di Pi da parte delle piante non è ben definito e rappresenta un gap
di conoscenza nella capacità di gestire tali processi negli ecosistemi agricoli. E’ quindi importante
quantificare l'attività microbica della rizosfera, il suo impatto sulla solubilizzazione di fosforo e il
ruolo delle piante nel modificare direttamente il contenuto di fosforo solubile.
La proteomica può fornire importanti informazioni circa l’attività funzionale della rizosfera e il suo
impatto sul rilascio di P solubile. Questo approccio consente di identificare i ruoli relativi di
microorganismi e radici nel turn-over del P disponibile a livello della rizosfera, di identificare i
gruppi funzionali microbici che contribuiscono al ciclo del fosforo a livello della rizosfera e di
capire come tali processi siano regolati.
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Obiettivo
L'obiettivo principale della ricerca è comprendere il ruolo delle interazioni suolo-microorganismi-
pianta nel ciclo del fosforo a livello della rizosfera in sistemi agricoli.
Per raggiungere tale obiettivo è necessario applicare le metodologie di metaproteomica come
strumento per lo studio delle proteine extracellulari in campioni di suolo di rizosfera. Il metodo di
estrazione delle proteine extracellulari prevede l'uso di estraenti blandi (solfato di potassio) che
permettono il recupero di enzimi, proteine di trasporto ed altre, localizzate nel periplasma e
secretoma. Gli estratti proteici sono processati utilizzando il protocollo per i campioni ambientali e
analizzati mediante spettrometria di massa (ThermoScientificTM
Orbitrap Fusion Tribrid) gel-
indipendente. Lo studio delle proteine extracellulari in campioni di rizosfera può fornire una chiara
e sensibile informazione sulla relazione tra la funzionalità globale della rizosfera e la funzionalità
dei vari consorzi microbici effettivamente coinvolti nei processi biogeochimici. In particolare, tale
studio può consentire di capire quali siano i ruoli e le caratteristiche che questi microorganismi
ricoprono nel ciclo del fosforo a livello del sistema suolo-radice.
Gli studi di metaproteomica ad oggi effettuati hanno consentito di estrarre e purificare, mediante
SDS-page, le proteine del suolo ma non di identificarle mediante spettrometria di massa. Questo è
dovuto al fatto che la matrice suolo è molto complessa, e le proteine possono formare complessi con
la fase colloidale organica e minerale del suolo. Inoltre, non ci sono librerie di proteine del suolo e
quindi, una volta definita la sequenza amminoacidica di una proteina è comunque difficile riuscire
ad identificarla.
Per questi motivi, prima di procedere allo studio dei campioni di rizosfera abbiamo cercato di
ottenere una libreria di proteine a partire da colture cellulari isolate da campioni di suolo di
rizosfera.
In particolare, le metodologie di metaproteomica sono state applicate con successo per valutare
l'effetto dell'applicazione di fosforo sull'espressione proteica dei microorganismi isolati da campioni
di suolo di rizosfera.
Materiali e metodi
I campioni di suolo e di rizosfera studiati nell’ambito della presente Short Term Mobility, sono stati
prelevati a Melbourne (Warwick - UK) in un sito sperimentale dell’Università di Warwick. In tale
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sito sperimentale sono state allestite 12 parcelle randomizzate piantumate con le specie vegetali
grano (wheat) e colza (OSR).
I punti di prelievo dei campioni di suolo e rizosfera sono indicati in rosso nella figura sottostante
(Figura 1).
Figura 1
Wheat= WinterWheat JB Diego OSR= OSR PR46W21
I campioni di suolo (bulk soil, terreno al di fuori della rizosfera non penetrato dalle radici delle
piante) sono stati prelevati alla profondità di 0-15 cm utilizzando una sgorbia del diametro di 10 cm.
I campioni di rizosfera (suolo che circonda le radici) sono stati ottenuti, una volta estratta la pianta
dal suolo, per scuotimento e per raccolta manuale del suolo attaccato alle radici (Figura 2).
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Figura 2
Grano
Colza
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Il ceppo di Pseudomonas fluorescens SBW25 è stato isolato da campioni di rizosfera ed è stato
utilizzato per la costrizione di una libreria di proteine.
Con lo scopo di valutare l’influenza del contenuto di fosforo inorganico sull’espressione proteica e
sull’attività degli enzimi legati al ciclo del fosforo, il ceppo SBW25 è stato incubato in presenza di
due dosi di fosfato: L, 50 uM KH2PO4 e H: 1,2 mM KH2PO4.
1. Studio delle proteine in colture cellulari
Preparazione del terreno di coltura e inoculo del ceppo microbicoPseudomonas fluorescens
NH4Cl 350 mg
CaCl2 120 mg
NaCl 200 mg
MgSO4 400 mg
KCl 300 mg
Succinate 20 mM
FeSO4 10 mg
MnSO4 10 mg
HEPES buffer pH 7.4 stock 10 mM (diluire 100 volte fino alla concentrazione finale di 0.1mM)
KH2PO4
H: Dose alta 1.2 mM
L: Dose bassa 50 uM
Inoculo SBW25 500 ul
Crescita microbica- Misura della densità ottica
Misurazione della densità ottica (DO) ad una lunghezza d’onda superiore a 490 nm mediante
spettrofotometria (Tabella 1). La DO è direttamente proporzionale alla densità batterica tra 0,01 e
0,5 mg/ml (da 107a 10
9 cellule/ml).
Tabella 1 Misura della crescita microbica
Densità ottica
600nm
L1 0,5
L2 0,5
H1 0,86
H2 0,86
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Determinazione dell’attività dell’enzima fosfatasi alcalinain colture cellulari di Pseudomonas
fluorescens SBW25 mediante metodo spettrofotometrico
Il metodo è basato sulla determinazione per via colorimetrica del Para-Nitro-Fenolo (PNF),
prodotto dall’idrolisi del Para-Nitrofenil-Fosfato-esaidrato (PNP), che è il substrato impiegato in
questo saggio enzimatico (Masciandaro and Ceccanti 1999).
Sono state utilizzate eppendorf da 2 ml
Prove: 1 ml di cultura microbica+40 ul PNP 0,12 M
Controlli: 1 ml di coltura
I campioni sono stati posti in agitazione in un incubatore per 30 minuti a 30°C. Una volta terminato
il periodo d’incubazione, sono stati aggiunti anche ai controlli 40 ul di substrato (PNP) ed i
campioni sono stati posti a raffreddare a 4°C per 10 minuti, per bloccare la reazione. A questo punto
sono stati aggiunti 50 ul di NaOH 2 M (per salificare il prodotto, conferendogli un colore giallo).
I campioni sono stati centrifugati per 2 minuti a 13000 rpm. Il surnatante è stato letto allo
spettrofotometro ad una lunghezza d’onda di 398 nm. Le densità ottiche rilevate dallo strumento
sono state trasformate in concentrazioni mediante una retta standard ottenuta con soluzioni di PNF a
concentrazione nota. I risultati sono stati espressi in µgPNF/gss*h (Figura 3).
Figura 3 Retta di calibrazione
Determinazione dell’attività dell’enzima fosfatasi alcalina e acida in colture cellulari di
Pseudomonas fluorescens SBW25 mediante metodo fluorimetrico
Di seguito sono riportati gli step per la determinazione dell’attività enzimatica:
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1. Aggiunta di 50 µl di campione nei pozzetti di ogni fila orizzontale (A-H), per un totale di 8
campioni.
2. Aggiunta di 50 µl di tampone (buffer) nei 96 pozzetti
Buffer per fosfatasi acida
*Preparazione di CH₃COONa 0,5 M, pH 5,5:
Si aggiungono 6,8 mL della soluzione A in 43,2 mL della soluzione B; il volume finale di 100 ml è
stato raggiunto con acqua bidistillata.
Soluzione A: 2,875 mL di CH₃COOH in 100 mL di acqua bidistillata.
Soluzione B: 4,1 g di CH₃COONa in 100 mL di acqua bidistillata.
Buffer per fosfatasi alcalina
HEPES buffer 0.1 mM pH 7,5
3. Aggiunta del tampone e del prodotto di reazione (standard)* nei pozzetti dedicati alla
costruzione della retta di calibrazione (file verticali 7-12) (Figura 4).
Le concentrazioni crescenti/decrescenti di tampone e prodotto di reazione sono riportate nella
seguente tabella (Tabella 2):
Tabella 2
Fila verticale
Tampone
Standard
(MUF)
7 100 µL 0 µL
8 80 µL 20 µL
9 60 µL 40 µL
10 40 µL 60 µL
11 20 µL 80 µL
12 0 µL 100 µL
Figura 4 Micropiastra a 96 pozzetti
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*Preparazione dello standard MUF
Si diluisce la soluzione madre 10 mM con il buffer corrispondente (CH₃COONa o HEPES) fino a
10 µM.
Soluzione madre MUF: 0,19418 g in 50 ml di metanolo e 50 ml di acqua bidistillata.
4. Aggiunta di 100 µl di substrato* nei pozzetti delle prime file verticali (1-6): generalmente
l’attività enzimatica viene analizzata su 3 repliche per ogni campione.
Preparazione del substrato della fosfatasi acida:
2,56 mg di 4-MUB-phosphate disodiumsalt in 10 mL di tampone CH₃COONa.
Preparazione del substrato della fosfatasi alcalina:
2,56 mg di 4-MUB-phosphate disodiumsalt in 10 mL di tampone HEPES.
Le letture del prodotto di reazione sono effettuate mediante l’utilizzo del fluorimetro, ad una
lunghezza d’onda di eccitazione e di emissione di 355 e 460 nm, rispettivamente. Prima di ogni
lettura, lo strumento sottopone la micropiastra ad un’agitazione per 1 minuto. La fluorescenza è
determinata dopo 15, 30, 60, 120 e 180 minuti di incubazione in agitazione a 30°C. L’attività
enzimatica, espressa in µmolMUB ml-1 h
-1, è determinata attraverso la costruzione di due rette di
calibrazione: (1) l’attività nel tempo (3 h), (2) le concentrazioni crescenti del prodotto di reazione.
2. Studio delle proteine nei campioni di suolo e rizosfera
Estrazione delle proteine in solfato di potassio
Il solfato di potassio (K2SO4) (0,5M pH 6,6) è stato aggiunto al suolo/rizosfera in rapporto 1:3
(w/v), l'estrazione è stata condotta a temperatura ambiente per 1h in agitazione in incubatore
termostatico a 150 oscillazioni per minuto (Masciandaro et al., 2008). Come inibitore di metallo
proteasi è stato aggiunto EDTA 10mM (Tabatabai e Fu, 1992).
Dopo l'estrazione il campione è stato centrifugato per 15 min a 9000 rpm ed il surnatante, privo
della frazione solida dell'estratto, costituita da terreno, è stato recuperato (Figura 5).
Filtrazione su carta rapida
Con lo scopo di separare la componente solida del suolo/rizosfera dall’estratto (surnatante) è stata
effettuata una filtrazione su carta rapida (Whatman 541).
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Filtrazione su membrana batteriologica
Con lo scopo di rimuovere la componente cellulare, gli estratti sono stati filtrati attraverso
membrane batteriologiche 0,22 µm (Masciandaro e Ceccanti 1999).
Desalificazione
L'estratto diluito di circa quattro volte, con lo scopo di rimuovere i sali in eccesso, è stato dializzato
attraverso l'utilizzo di membrane da dialisi 3.500 Da ponendo circa 20 litri di acqua all’esterno.
Concentrazione
L'estratto dializzato è stato concentrato di 600 volte rispetto al volume iniziale (300 ml) tramite
membrane Amicon PM-10 sotto pressione d'azoto; questo ha comportato l'allontanamento dal
campione della frazione con peso molecolare inferiore ai 10.000 Da (Ceccanti et al.,1989).
Precipitazione metodo DOC/TCA
1ml di estratto concentrato è stato sottoposto ad una precipitazione DOC/TCA. Il DOC (acido
deossicolico) allo 0.6% è stato aggiunto all’estratto in rapporto 1:100 v/v ed incubato per 10 min a
temperatura ambiente; successivamente, è stato aggiunto il TCA (acido tricloroacetico) al 100%
(100g in 100ml) in rapporto 1:100 v/v, la precipitazione è stata condotta a -20 °C per 30 min.
Dopo tale periodo di incubazione, il campione è stato centrifugato a 14600 xg (12500 rpm) per 15
min a 4 °C e il surnatante è stato rimosso. Il pellet è stato lavato con 0.5 ml di una soluzione di
etanolo e etere in rapporto 1:1 v/v. Dopo un’ulteriore centrifuga nelle stesse condizioni della
precedente, il pellet ottenuto è stato risospeso in 20 ul di loading buffer.
Elettroforesi
SDS-PAGE
I campioni risospesi nel sample buffer sono stati riscaldati a 100 °C per 3 min, centrifugati per altri
3 minuti ed infine caricati direttamente nei pozzetti dello stacking gel. Durante i primi 5 minuti di
corsa è stato applicato un voltaggio di 80 V per permettere alle proteine di compattarsi nello
stacking, quindi il valore è stato portato a 150 V.
Preparazione del gel in condizioni denaturanti
Resolving: 12% (10 ml)
_ Acqua 3,4 ml
_ Tris-HClpH 8,8 1,5 M 2,5 ml
_ SDS 10% 0,1 ml
_ Acrilammide/Bis 30% 4,0 ml
_ APS 10% 50 µl
_ TEMED 5 µl
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Stacking gel: 4% (10 ml)
_ Acqua 6,1 ml
_ Tris-HClpH 6,8 0,5 M 2,5 ml
_ SDS 10% 0,1 ml
_ Acrilammide/Bis 30% 1,3 ml
_ APS 10% 50 µl
_ TEMED 10 µl
Soluzioni
Per la preparazione di tutte le soluzioni e i lavaggi è stata utilizzata acqua milliQ.
Sample Buffer 5x (10 ml)
Tris-HCl 0,5M pH 6,8 6ml
SDS 1 g
Glicerolo 4 ml
Blu di bromofenolo 0.25 g
DTT 7.7%
Tampone di corsa 10x (Tris-Glicina) pH 8,3 (1 L)
Tris base 30,3 g
SDS 10,0 g
Glicina 144,0 g
Colorazione delle proteine con coomassie colloidale
5% Coomassie Blu G-250stock
Sciogliere 0,5 g di Coomassie Blue G-250 in 10 ml di acqua milli Q
Colloidal Coomassie Blu G-250 due stock solution
50 g Solfato di ammonio (pm 132.1)
6 ml Acido fosforico 85%
10 ml 5% Coomassie Blue G-250 stock
Portare a 500 ml con acqua milli Q
Colloidal Coomassie Blue G-250 working solution
400 ml ColloidalCoomassie Blu G-250 due stock solution
100 ml metanolo
Lasciare colorare il gel in blanda agitazione per almeno due ore.
Decolorare con acqua in leggera agitazione con cambi della soluzione decolorante fino alla
scomparsa del colore di fondo.
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Figura 5 Schema dei metodi di estrazione, filtrazione, desalificazione e concentrazione del
campione
Attività dell’enzima fosfatasi alcalina negli estratti di suolo e rizosfera
1ml di estratto concentrato è stato utilizzato per la determinazione dell’attività dell’enzima fosfatasi
alcalina utilizzando il metodo fluorimetrico descritto sopra
fluorescens SBW25.
Risultati
1. Risultati dello studio delle proteine nelle colture cellulari
La capacità di secernere proteine è essenziale per la sopravvivenza e crescita dei microorga
nel suolo. I batteri del genere Pseudomonas
delle specie Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas stutzeri hanno mostrato una capacità di promuovere la crescita delle piante (PGPR,
Plant growth-promoting rhizobacteria)
Il ceppo di Pseudomonas fluorescens
Lo studio delle proteine di questo ceppo microbico è stato effettuato incubando
fluorescens SBW25 in un terreno di coltura contenente
KH2PO4 (L) e 1,2 mM di KH2PO
Il gel di SDS-page ha messo in evidenza un aumento
in presenza di una bassa dose di fosforo inorganico nel mezzo di coltura
(Figura 6).
Figura 6 SDS-page delle proteine extracellulari
SBW25 alle due dosi
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Attività dell’enzima fosfatasi alcalina negli estratti di suolo e rizosfera
o concentrato è stato utilizzato per la determinazione dell’attività dell’enzima fosfatasi
fluorimetrico descritto sopra per le colture cellulari di
1. Risultati dello studio delle proteine nelle colture cellulari
La capacità di secernere proteine è essenziale per la sopravvivenza e crescita dei microorga
Pseudomonas colonizzano frequentemente la rizosfera e alcuni
fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas
hanno mostrato una capacità di promuovere la crescita delle piante (PGPR,
rhizobacteria) (Wu et al., 2010).
fluorescens SBW25 è stato isolato a partire da campioni di rizosfera
esto ceppo microbico è stato effettuato incubando
in un terreno di coltura contenente fosforo inorganico
PO4 (H).
page ha messo in evidenza un aumento del numero e della concentrazione di
di fosforo inorganico nel mezzo di coltura
page delle proteine extracellulari del ceppo microbico Pseudomonas
alle due dosi di KH2PO4 (L: 50 uM, H: 1,2 mM).
L H
o concentrato è stato utilizzato per la determinazione dell’attività dell’enzima fosfatasi
per le colture cellulari di Pseudomonas
La capacità di secernere proteine è essenziale per la sopravvivenza e crescita dei microorganismi
colonizzano frequentemente la rizosfera e alcuni ceppi
Pseudomonas mendocina e
hanno mostrato una capacità di promuovere la crescita delle piante (PGPR,
campioni di rizosfera.
esto ceppo microbico è stato effettuato incubando Pseudomonas
a due dosi: 50 uM di
della concentrazione di proteine
rispetto alla dose alta
Pseudomonas fluorescens
(L: 50 uM, H: 1,2 mM).
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Inoltre, l’analisi di queste proteine mediante spettrometria di massa ha consentito di identificare
numerose proteine appartenenti al ceppo di Pseudomonas fluorescens SBW25 con una elevata
probabilità (>95%) (Tabella 3). La concentrazione delle proteine identificate, come osservato nel
gel di SDS-page, sembra essere influenzata dalla dose di fosforo inorganico nel mezzo di coltura.
In particolare, tra le proteine che risultano avere una concentrazione particolarmente diversa alle
due dosi di fosfato, troviamo la fosfatasi alcalina.
Questa proteina è fortemente espressa alla dose bassa di fosfato, mentre non lo è alla dose alta.
Tabella 3 Proteine del ceppo di Pseudomonas fluorescens SBW25 identificate mediante
spettrometria di massa
H L
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Per ottenere ulteriori informazioni circa l’espressione e attività delle proteine legate al ciclo del
fosforo, è stata determinata l’attività dell’enzima fosfatasi alcalina del ceppo Pseudomonas
fluorescens cresciuto alle due dosi di fosforo.
L’attività dell’enzima fosfatasi alcalina, determinata nelle colture cellulari del ceppo microbico
Pseudomonas fluorescens SBW25 mediante metodo spettrofotometrico, ha confermato l’influenzata
della concentrazione di fosforo nel mezzo di coltura sull’attività di questo enzima (Tabella 4).
Tabella 4 Attività fosfatasi alcalina nelle colture cellulari del ceppo microbico Pseudomonas
fluorescens SBW25 mediante spettrofotometria
mgPNP l-1
h-1
L1 1274
L2 1261
H1 0
H2 0
Le colture cresciute in presenza di P ad alta concentrazione (1,2 mM), infatti, non hanno presentato
alcuna attività dell’enzima fosfatasi, ad indicare l’inibizione dell’espressione dei geni che
codificano per questa proteina da prodotto (fosfato). Al contrario, le colture cresciute in presenza di
fosforo inorganico a bassa dose (50 uM) hanno mostrato una forte stimolazione della sintesi e
rilascio di questo enzima (Tabella 4).
Risultati del tutto comparabili sono stati ottenuti dalla determinazione dell’attività fosfatasi alcalina
mediante metodo fluorimetrico (Figura 7).
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Figura 7 Attività fosfatasi acida e alcalina nelle colture cellulari del ceppo microbico Pseudomonas
fluorescens SBW25 mediante fluorimetria
L: 50uM KH2PO4; H: 1,2 mM KH2PO4.
Il metodo fluorimetrico è stato, inoltre, utilizzato per la determinazione dell’attività dell’enzima
fosfatasi acida. Alla dose bassa di fosfato, questo enzima ha mostrato un’attività molto più bassa
rispetto all’attività della fosfatasi alcalina e, al contrario di quest’ultima, sembra essere meno
influenzata dalla concentrazione di fosfato nel mezzo di coltura (Figura 7).
2. Risultati dello studio delle proteine nei campioni di suolo e di rizosfera
Lo studio dell’attività dell’enzima fosfatasi alcalina negli estratti di suolo e di rizosfera ha mostrato
una più alta attività a livello della rizosfera del grano (wheat) e valori simili tra colza (OSR) e suolo
(bulk soil). La rizosfera delle piante di colza è stata prelevata alla fine del ciclo vegetativo (periodo
di dormienza), durante il quale il metabolismo e la crescita delle piante è praticamente assente.
Questo può spiegare il perché la rizosfera della colza abbia mostrato valori di attività dell’enzima
fosfatasi alcalina simili al suolo non piantumato.
-100
0
100
200
300
400
500
600
700
fosfatasi alcalina fosfatasi acida
um
ol
MU
B m
l-1h
-1
Attività fosfatasi
L
H
Figura 8 Attività fosfatasi alcalina nei campioni di rizosfera e di suolo
Lo studio delle proteine mediante SDS
(Figura 9).
Figura 9 SDS-page delle proteine estratte da campioni di rizosfera di grano e colza e da suolo.
In accordo ai risultati dell'attività
maggior numero di bande proteiche, seppure non molto marcate, rispetto alla rizosfera delle
di colza e rispetto al suolo.
0
50
100
150
200
250
grano
mm
ol
MU
B k
g-1
h-1
18
Attività fosfatasi alcalina nei campioni di rizosfera e di suolo
Lo studio delle proteine mediante SDS-page ha evidenziato numerose bande in tutti i campioni
page delle proteine estratte da campioni di rizosfera di grano e colza e da suolo.
In accordo ai risultati dell'attività fosfatasi alcalina, la rizosfera delle piante di grano
ggior numero di bande proteiche, seppure non molto marcate, rispetto alla rizosfera delle
grano colza suolo
Attività fosfatasi alcalina
suolo colza grano
Attività fosfatasi alcalina nei campioni di rizosfera e di suolo
rose bande in tutti i campioni
page delle proteine estratte da campioni di rizosfera di grano e colza e da suolo.
ra delle piante di grano ha mostrato un
ggior numero di bande proteiche, seppure non molto marcate, rispetto alla rizosfera delle piante
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Conclusioni
La comprensione del ruolo dei microorganismi e degli essudati radicali nel rilascio e acquisizione di
fosforo da parte delle piante rappresenta un obbiettivo importante per l'uso efficiente di fertilizzanti,
nel miglioramento della struttura e della biodiversità del suolo e nell'aumento della produttività e
della resilienza degli ecosistemi agricoli.
Nell’ambito del progetto, le tecniche di metaproteomica (metodi di estrazione, misura dell’attività e
identificazione delle proteine extracellulari) sono state implementate ed applicate con lo scopo di
comprendere i cambiamenti nel continuum suolo-microorganismi-piante in risposta alla
disponibilità di fosforo a livello della rizosfera.
Questi studi hanno consentito di fare progressi nella definizione delle metodologie di
identificazione delle proteine di campioni di suolo e di rizosfera.
In particolare, è stata creata una libreria di proteine del ceppo microbico Pseudomonas fluorescens
SBW25 cresciuto a due dosi di fosfato ed è stata determinata l’attività dell’enzima fosfatasi alcalina
nelle stesse condizioni. I risultati hanno messo in evidenza un aumento del numero e della
concentrazione di proteine in presenza della dose bassa di fosforo inorganico nel mezzo di coltura
rispetto alla dose alta. La proteina fosfatasi alcalina è risultata fortemente espressa alla dose bassa di
fosfato; anche la misura dell’attività enzimatica ha confermato la stimolazione dell’enzima fosfatasi
alcalina in queste condizioni.
Lo studio delle proteine nei campioni di suolo e di rizosfera ha consentito la determinazione
dell’attività dell’enzima fosfatasi alcalina e la purificazione delle proteine mediante SDS-page. I
risultati hanno messo in evidenza un’attività fosfatasi alcalina più alta ed un numero maggiore di
bande proteiche nella rizosfera delle piante di grano rispetto a quella delle piante di colza e rispetto
al suolo. Ulteriori ricerche saranno necessarie per arrivare all'identificazione di queste proteine
mediante spettrometria di massa.
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Riferimenti bibliografici
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