국 립 환 경 과 학 원webbook.me.go.kr/DLi-File/NIER/06/013/5514970.pdf1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 101 2) 나노물질의

다층벽탄소나노튜브(MWCNTs)의 유해성자료 생산

최종보고서

2009년 11월

연구기관 : (재)한국생활환경시험연구원

국 립 환 경 과 학 원

제 출 문

국립환경과학원장 귀하

본 보고서를 “다층벽탄소나노튜브(MWCNTs)의 유해성자료 생산”과제의 최종보고서로 제출합니다.

2009년 11월

주관연구기관 : (재)한국생활환경시험연구원

목 차

1. 최종보고서 요약문 1

(1) 요약문 1

(2) Summary 2

2. 연구의 배경 및 필요성 3

(1) 나노산업동향 3

(2) 국내외 연구동향 8

1) 국외 연구동향 8

2) 국내 연구동향 10

(3) 사업대상의 범위 11

3. 연구방법 14

(1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성 분석 14

1) 실험에 사용할 MWCNTs 선정 14

2) 고온 열처리를 이용한 MWCNTs의 금속 촉매 제거 방법 개발 14

3) 수계에서 분산제를 이용하지 않고 MWCNTs를 분산시킬 수 있는 분산

기법 개발 및 길이 제어 14

4) MWCNTs의 물리화학적 특성 분석 15

(2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교연구 19

1) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험 19

2) 포유류 배양세포를 이용한 염색체이상시험 24

3) 설치류 조혈세포를 이용한 소핵시험 30

(3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 36

1) Cell culture 및 High MWCNT 처리 36

2) 생포생존율 분석(Cell viability assay; MTT assay) 36

3) Total RNA 추출 37

4) DNA microarray 분석 37

5) Data 분석(Mining) 39

4. 연구결과 40

(1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 40

1) 실험에 사용될 상업용 multi-wall carbon nanotube(MWCNTs)의 선정

및 길이가 제어된 MWCNTs 개발 40

2) MWCNTs의 물리화학적 특성분석 40

(2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교 연구 44

1) MWCNTs의 독성시험을 위한분산제 결정 및 최고 분산농도 결정 44

2) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low

aspect ratio MWCNTs) - 예비시험 47

3) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험(High aspect ratio MWCNTs vs Low

aspect ratio MWCNTs) - 본시험 52

4) 포유류배양세포를 이용한 염색체이상시험(High aspect ratio MWCNTs vs

Low aspect ratio MWCNTs) - 예비시험 57

5) 포유류배양세포를 이용한 염색체이상시험(High aspect ratio MWCNTs vs

Low aspect ratio MWCNTs) - 본시험 64

6) High aspect ratio와 Low aspect ratio를 갖는 MWCNTs의 세포성장률차이에

있어서 Fe촉매에 대한 영향 평가 72

7) 마우스 골수세포를 이용한 in vivo 소핵시험(High aspect ratio MWCNTs vs

Low aspect ratio MWCNTs) 75

(3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 81

1)마이크로어레이 분석농도 및 시간결정 81

2) 마이크로어레이 결과분석 84

5. 고찰 및 결론 101

(1) 고찰 101

1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 101

2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교 연구 102

3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 103

(2) 결론 104

1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 104

2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교 연구 104

3) 유전자칩을 이용한 나노물질 독성시험법 기반 구축 104

6. 연구목표 달성도 106

7. 기대성과 및 활용방안 106

8. 중요변경사항 107

9. 참고문헌 110

10. 참여연구원 명단 113

표 목 차

Table 2-1. 국내 나노관련 기업현황 5

Table 2-2. 원료 및 공정제품의 분류 6

Table 2-3. 분야별 나노기술/산업의 국내 시장 전망 7

Table 4-1. The test result of Brunauer, Emmett, Teller(BET) surface area

analysis. 43

Table 4-2. The evaluation for the degree of macro dispersion of multi-wall carbon

nanotubes(MWCNTs) in D.W.. 46

Table 4-3. The evaluation for the degree of macro dispersion of multi-wall

carbon nanotubes(MWCNTs) in DPPC solution. 47

Table 4-4. The number of base substitutional revertant colonies for High aspect

ratio MWCNTs treatment in the absence of S9 mix(preliminary test). 48

Table 4-5. The number of frameshift revertant colonies for High aspect ratio

MWCNTs treatment in the absence of S9 mix(preliminary test). 48


ratio MWCNTs treatment in the presence of S9 mix(preliminary test). 49


MWCNTs treatment in the presence of S9 mix(preliminary test). 49

Table 4-8. The number of base substitutional revertant colonies for Low aspect

ratio MWCNTs treatment in the absence of S9 mix(preliminary test). 50

Table 4-9. The number of frameshift revertant colonies for Low aspect ratio

MWCNTs treatment in the absence of S9 mix(preliminary test). 50


ratio MWCNTs treatment in the presence of S9 mix(preliminary test). 51


MWCNTs treatment in the presence of S9 mix(preliminary test). 51


ratio MWCNTs in the absence of S9 mix(main test). 52


MWCNTs in the absence of S9 mix(main test). 53


ratio MWCNTs in the presence of S9 mix(main test). 53


MWCNTs in the presence of S9 mix(main test). 54


ratio MWCNTs in the absence of S9 mix(main test). 55


MWCNTs in the absence of S9 mix(main test). 55


ratio MWCNTs in the presence of S9 mix(main test). 56


MWCNTs in the presence of S9 mix(main test). 56

Table 4-20. The evaluation for the degree of macro dispersion of multi-wall carbon

nanotube(MWCNT) in F-12 medium. 58

Table 4-21. The length distribution of multi-wall carbon nanotubes(MWCNTs) in

F-12 nutrient mixture medium. 58

Table 4-22. The test result of relative cell count in the absence of S9 mix for High aspect

ratio MWCNTs(24 hrs exposure). 60

Table 4-23. The test result of relative cell count in the absence of S9 mix for High aspect


Table 4-24. The test result of relative cell count in the presence of S9 mix for High aspect


Table 4-25. The test result of relative cell count in the absence of S9 mix for Low aspect


Table 4-26. The test result of relative cell count in the absence of S9 mix for Low aspect


Table 4-27. The test result of relative cell count in the presence of S9 mix for Low aspect


Table 4-28. The number of cells with chromosome aberrations in the absence of S9

mix for High aspect ratio MWCNTs(24 hrs exposure). 65



Table 4-30. The number of cells with chromosome aberrations in the presence of S9


Table 4-31. The number of cells with chromosome aberrations in the absence of

S9 mix for Low aspect ratio MWCNTs(24 hrs exposure). 69


mix for Low aspect ratio MWCNTs(6 hrs exposure). 70

Table 4-33. The number of cells with chromosome aberrations in the presence of S9

mix for Low aspect ratio MWCNTs(6 hrs exposure). 71

Table 4-34. The test result of relative cell count in the absence of S9 mix for Iron oxide

(24 hrs exposure). 73

Table 4-35. The test result of relative cell count in the absence of S9 mix for Iron oxide


Table 4-36. The test result of relative cell count in the presence of S9 mix for Iron oxide


Table 4-37. The comparison of body weight for test animal in High aspect ratio

MWCNTs. 75

Table 4-38. The comparison of body weight for test animal in Low aspect ratio

MWCNTs. 76

Table 4-39. Frequency of PCE/(PCE + NCE) ratio in bone marrow of male mouse

treated with indicated doses of High aspect ratio MWCNTs for 24 hrs.77

Table 4-40. Frequency of PCE/(PCE + NCE) ratio in bone marrow of male mouse

treated with indicated doses of Low aspect ratio MWCNTs for 24 hrs. 79

Table 4-41. The GI50 concentration of asbestos and MWCNTs treatment for normal

human bronchial epithelia(NHBE) cells at 24 and 48 hrs. 82

Table 4-42. The analysis of crocidolite. 83

Table 4-43. The result of total RNA quality control. 84

Table 4-44. The number of 2-fold changed genes for asbestos and MWCNTs at

6 and 24 hrs. 86

Table 4-45. The result of >2-fold or 2-fold or

그 림 목 차

Figure 2-1. 나노제품의 총 등록 건수 4

Figure 2-2. 나노물질별 제품등록 현황 5

Figure 2-3. 국내 나노제품의 분류 6

Figure 2-4. 소비자 End-Products의 구성 6

Figure 2-5. 원료 및 공정 제품의 구성 7

Figure 2-6. 나노물질의 연간 생산율 12

Figure 3-1. MWCNTs's diagram after treatment. 15

Figure 3-2. The example of TGA analysis. 16

Figure 3-3. The example of SEM analysis. 17

Figure 3-4. The priciple of DLS(Dynamic Light Scattering). 18

Figure 3-5. The diagram of microarray analysis. 38

Figure 4-1. The Dynamic light scattering graphs of MWCNTs(A: Purchasing from

Hanwha nanotech, B: Manufactured by SKKU). 40

Figure 4-2. Scanning electron microscope(SEM) image of MWCNTs(A: Purchasing

from Hanwha nanotech, B: Manufactured by SKKU). 41

Figure 4-3. The test result of Raman spectroscopy(AG: As grown, HTT: High

temperature treatment, SAT: Strong acid treatment). 42

Figure 4-4. The test result of Thermogravimetric analysis. 43

Figure 4-5. Dispersion analysis for MWCNTs(A: in D.W. B: in DPPC solution). 44

Figure 4-6. Determination of dispersion concentration for MWCNTs in DPPC

solution(A: 5 % MWCNTs in DPPC solution, B: 0.5 % MWCNTs in

DPPC solution). 44

Figure 4-7. The Dispersion analysis for MWCNTs after sonication at 24 hrs(left:

High aspect ratio MWCNTs, Right: Low aspect ratio MWCNTs). 45

Figure 4-8. The picture of MWCNTs in mouse abdominal cavity. 80

Figure 4-9. The normal human bronchial epithelia(NHBE) cell viability curve for

asbestos, Low aspect ratio MWCNTs and High aspect ratio MWCNTs. 82

Figure 4-10. The result of TEM-EDX analysis. 83

Figure 4-11. The box plot data for asbestos and MWCNTs at 6 and 24hrs. 85

Figure 4-12. The number of >2-fold and < 2-fold change gene for asbestos and

MWCNTs at 6 hrs 86

Figure 4-13. The number of >2-fold and < 2-fold change gene for asbestos and

MWCNTs at 24 hrs. 87

Figure 4-14. The result of hierarchical clustering for 2-fold changed gene 88

Figure 4-15. The result of hierarchical clustering for 2-fold changed gene in

mesothelioma(left) and lung cancer(right) relative genes. 89

Figure 4-16. 2-fold up-regulated genes at 6 and 24 hrs in MWCNTs treatment for

pathway and gene ontology. 92

Figure 4-17. 2-fold down-regulated genes at 6 and 24 hrs MWCNTs treatment for

pathway and gene ontology. 93

Figure 4-18. Up and down regulated genes for neuroactive ligand-receptor

interaction by MWCNTs treatment. 94

Figure 4-19. Up and down regulated genes for actin cytoskeleton regulation by

MWCNTs treatment. 95

Figure 4-20. Up and down regulated genes for Jak-STAT signaling pathway by


Figure 4-21. Up and down regulated genes for leukocyte transendothelial migration

by MWCNTs treatment. 97

Figure 4-22. Up and down regulated genes for chemokine signaling pathway by


Figure 4-23. Up and down regulated genes for TGF-beta signaling pathway by


Figure 4-24. Up and down regulated genes for endocytosis by MWCNTs

treatment. 100

- 1 -

1. 최종보고서 요약문

(1) 요약문

과 제 명 다층벽탄소나노튜브(MWCNTs)의 유해성자료 생산

중심단어 다층벽탄소나노튜브, 유전독성시험, 세포독성, 마이크로어레이, 폐암, 중피종

주관연구기관 (재) 한국생활환경시험연구원 주관연구책임자 송 경 석

연구기간 2009. 02. 23. - 2009. 11. 30.

본 연구는 다양한 분야에서 가장 많이 개발되고, 사용되고 있는 탄소나노튜브(다층벽탄소나노튜브)에 대한 독성효과

를 정확히 검증하기 위해 용매의 영향으로부터 안전한 다층벽탄소나노튜브(MWCNTs)의 정제방법을 개발하고 다층벽

탄소나노튜브의 형태학적 차이(High aspect ratio 및 Low aspect ratio)에 따라 독성 효과(유전독성)에 어떠한 영향을

주는지에 대한 연구와 중피종 및 폐암관련 유전자의 발현 패턴 분석 및 생물독성학적 반응 탐색을 수행하였다. 본 연구

는 다층벽탄소나노튜브에 대한 다양한 물리적, 화학적, 생물학적 자료들을 생산하였으며, 이들 자료들에 대한 국제적 검

증을 통해 다층벽탄소나노튜브에 대한 건강 영향 평가에 대해 보다 정확하고 정밀한 기초자료를 확보하기 위해 본 연구

를 수행하였다. 독성평가를 위하여 용매의 영향으로부터 안전한 MWCNTs 표준정제방법을 개발하고 MWCNTs 길이

제어를 위해 상업적으로 사용되는 MWCNTs(High aspect ratio)를 구매하여 열처리, 산처리, 초음파 처리를 통하여 길

이가 제어되고, 물에서도 분산이 용이한 MWCNTs(Low aspect ratio)를 개발 및 제조하였다. 독성평가를 위해 사용될

MWCNTs에 대한 물리화학적 특성을 알아보기 위해 주사전자현미경(SEM), 동적광산란법(DLS), 열무게분석법(TGA),

Brunauer, Emmett, Teller surface area(BET) 분석, 거시분산도를 측정하였다. 그 결과 각각의 탄소나노튜브는 High

aspect ratio(545±230 nm, 10451±8422 nm)가 Low aspect ratio(192±80 nm)보다 더 긴 길이분포를 갖는 다는 것을

확인하였다. 각각의 분산도를 측정한 결과 1 %의 농도로 멸균증류수에 분산시킨 결과 High aspect ratio MWCNTs는

10 %미만의 거시분산도를 보인 반면 Low aspect ratio MWCNTs는 90 %이상의 분산도를 관찰 할 수 있었으며,

High aspect ratio MWCNTs의 분산도를 높이기 위해 생체적합성을 갖는 분산제인 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-

phosphocholine(DPPC)용액에 분산시킨 결과 거시분산도가 15 %이상으로 증가하였으나 Low aspect MWCNTs는

30 %대로 감소하였다. 그러나 DPPC내에서도 Low aspect ratio가 High aspect ratio보다 분산도가 높음을 확인하였

다. DPPC 용액을 이용하여 각각의 MWCNTs를 분산시킨 다음 3-battery로 유전독성시험(미생물을 이용한 복귀돌연변

이시험, in vitro 염색체이상시험, in vivo 소핵시험)을 OECD 가이드라인 TG471, TG473, TG474에 따라 수행한 결과,

High aspect ratio를 갖는 MWCNTs는 복귀돌연변이 시험(0~333 ug/plate), in vitro 염색체이상시험(직접법: 0~6.25

ug/ml, 대사활성법: 0~25 ug/ml), in vivo 소핵시험(0~50 mg/kg)에 대해 유전독성을 관찰 할 수 없었으며, Low

aspect ratio를 갖는 MWCNTs 또한 복귀돌연변이 시험(0~333 ug/plate), in vitro 염색체이상시험(직접법: 0~12.5

ug/ml, 대사활성법: 0~50 ug/ml), in vivo 소핵시험(0~50 mg/kg)에 대해 유전독성을 관찰할 수 없었다. 시험결과 두

종류의 MWNCNTs에 대한 유전독성은 관찰 되지 않았다. 그러나 직접법의 24시간 연속처리군 및 6시간 처리 18시간

회복군, 대사활성법의 6시간 처리 18시간 회복군에 있어서 CHO-k1세포주에 대해 High aspect ratio

MWCNTs(GI50=12.942, 12.935, 41.897 ug/ml)와 Low aspect ratio MWCNTs(GI50=60.198, 40.481, 93.193

ug/ml) 모두에서 세포독성을 관찰 할 수 있었으며, High aspect ratio가 Low aspect ratio보다 더 높은 세포독성을

보이는 것으로 관찰 되었다. NHBE 세포주를 이용해 상업적으로 사용되는 MWCNTs(High aspect ratio)에 대한 유전

자 발현 패턴을 석면과 비교하기 위해 마이크로어레이 기법을 이용해 분석한 결과, 중피종 관련 유전자 중 13개의 유전

자가 공통으로 2배 이상 증가하거나 감소하였으며, 폐암 관련 유전자 중 24개의 유전자가 공통으로 2배이상 증가하거나

감소하는 현상을 관찰 할 수 있었다. MWCNTs와 석면처리에 대해 시간대별로 구분하여 분석한 결과 induction 및

reduction된 유전자들의 발현패턴이 일정부분 유사한 것으로 나타났다. 즉, 석면과 High aspect ratio MWCNTs의 작

용점(mode of action)은 유사할 가능성이 있을 것으로 관측되었다. High aspect ratio MWCNTs에 의해 regulation된

유전자(up- & down-regulated genes, 6 & 24 h)를 대상으로 data mining한 결과(pathway, gene ontology, genetic

association), 다양한 signal transduction 현상에 관여하는 것으로 나타났다 (cell morphogenesis, angiogenesis,

MAP kinase, cytokine interaction, STAT signaling 등).

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(2) Summary

Title of Project The production of multi-wall carbon nanotubes(MWCNTs) hazardous data

Key WordsMulti-wall carbon nanotubes(MWCNTs), genotoxicity test, cytotoxicity, microarray, lung

cancer, mesothelioma

InstituteKorea Environment & Merchandise

Testing Institute Project Leader Kyung Seok Song

Project Period 2009. 02. 23. - 2009. 11. 30.

To investigate of multi-wall carbon nanotubes(MWCNTS) toxic-effect, we manufactured surfactant-effect

minimized and length controled MWCNTs and found biocompatible surfactant. Also, we performed to

genotoxicity test and microarray analysis to find the genotoxicity and gene expression pattern for

mesothelioma and lung cancer relative genes. This study produced physical, chemical and biological data

which will be provided basic information for health effect evaluation through international verification. To

evaluate of MWCNTs toxic-effect, we developed sufactant-effect minimized and length controled MWCNTs

with commercial MWCNTs(High aspect ratio MWCNTs) which was treated heat, acid and sonication. So, we

could manufacture water dispersible and length controled MWCNTs(Low aspect ratio MWCNTs). To find

physico-chemical properties, we performed to scanning electron microscope(SEM) observation, Dynamic

Light Scattering(DLS) analysis, Thermogravimetric analysis(TGA), Brunauer, Emmett, Teller surface area(BET)

analysis and macrodispersion degree analysis. we knew that High aspect ratio MWCNTs(545±230 nm,

10451±8422 nm) were longer than Low aspect ratio(192±80 nm). High aspect ratio MWCNTs had below 10

% of macrodispersion degree but Low aspect ratio MWCNTs had over 90 % degree at below 1 % MWCNTs

concentration solution. Moreover, we found a biocompatible surfactant which is 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-

phosphocholine(DPPC) solution and measured macrodispersion degree in DPPC solution for both MWCNTs.

The High aspect ratio MWCNTs had about 15 % degree but the Low was about 30 %. Nevertheless, The

Low aspect ratio MWCNTs were more dispersive than the High in DPPC. To find mutagenic potential of

MWCNTs, We performed to 3-battery genotoxicity test as bacterial reverse mutation test, in vitro

chromosome aberration test and in vivo micronuclei test according to OECD test guideline 471, 473 and 474.

We found that High aspect ratio MWCNTs had no genotoxicity for bacterial reverse mutation test (0~333

ug/plate), in vitro chromosome aberration test(without S9: 0~6.25 ug/ml and with S9: 0~25 ug/ml) and in

vivo micronuclei test(0~50 mg/kg). Also, Low aspect ratio MWCMTs had no genotoxic effect for bacterial

reverse mutation test (0~333 ug/plate), in vitro chromosome aberration test(without S9: 0~12.5 ug/ml and

with S9: 0~50 ug/ml) and in vivo micronuclei test(0~50 mg/kg). However, we could find a cytotoxicity for

both MWCNTs and there was a clear MWCNTs dose-dependant decrease in cell growth. High aspect ratio

MWCNTs (GI50=12.942, 12.935 and 41.897 ug/ml) were more toxic than low (GI50=60.198, 40.481 and 93.193

ug/ml) in 24 hours treat group(without S9 mix), 6 hours treatment group(without S9 mix) and 6 hours

treatment group (with S9 mix). To analyze gene expression patterns for commercial MWCNTs(High aspect

ratio) and asbestos, we performed microarray assay in NHBE cells. We observed 13 genes common up and

down in mesothelioma relative gene and 24 genes common up and down in lung cancer relative gene for

MWCNTs and asbestos treatment. In the results of data mining (pathway, gene ontology, genetic

assocication), we knew that High aspect ratio MWCNTs took part in various signal transduction

phenomenon as cell morphogenesis, angiogenensis, MAP kinase, cytokine interaction, STAT signaling etc.)

- 3 -

2. 연구의 배경 및 필요성

(1) 나노산업동향

나노기술은 빠른 속도로 발전하고 있으며 산업적, 사회적으로 커다란 영향을 끼치고

있는 분야 중에 하나이다. 나노기술을 이용해 경제적인 발전뿐 만 아니라 인류의 건강

과 환경을 보호하고 삶의 질을 향상시킬 수 있다. 나노기술을 활용하여 개발된 나노소

재의 특허출원 급증과 함께 이를 활용한 의약품, 식품, 화장품, 생활용품의 제품화가

급격히 증가될 것으로 전망되고 있으며, 삶의 질을 향상시킬 수 있을 것으로 기대하고

있다.

나노기술은 보다 나은 물질과 제품을 우리에게 제공한다. 이미 나노물질이 포함된

제품들(코팅제, 컴퓨터, 섬유, 화장품, 스포츠용품 및 의료장비)을 상점에서 쉽게 구입

할 수 있으며, 나노재료가 포함한 제품들이 연구개발 단계에서 생산, 상업화 단계로 이

동함으로써 나노기술의 우리 경제에 대한 영향력이 점점 커지고 있다. 한국의 나노기

술 경쟁력은 나노기술종합발전 계획이 수립된 2001년 이후 비약적으로 상승하였다. 선

진국 대비 나노기술수준은 2001년 25 % 수준이었으나 2005년도에는 66 %에 이를 만

큼 괄목한 성과를 이루었다. 이러한 평가는 국외에서도 인정을 받고 있는데, 미국의

나노기술산업 전문분석기업인 Lux Capital은 미국, 일본 및 독일과 함께 우리나라를

나노기술 4대 핵심 개발 국가로 선정되었다. 또한, 나노기술은 2005년 약 35조원(전체

산업 대비 2.4 %) 규모에서, 2010년 104조원(5.5 %), 2020년 593조원(17.7 %)에 이르는

등 비약적으로 확대될 것으로 전망하였다(한국과학기술기획평가원, 2005). 미국의 나노

비즈니스 얼라이언스(NanoBusiness Alliance), 과학재단(NSF) (Roco et al., 2001), Lux

Research 등은 향후 10년에서 15년 이내에 나노관련 산업의 세계시장 규모가 수조 달

러 규모로 급성장할 것이라고 예측하고 있다. Lux Research는 나노기술을 응용한 제품

시장이 2004년 당시 전 세계 제조업 부문의 0.1 % 이하인 130억 달러 수준이지만 2014

년에는 15 %까지 성장해 2조 6천억 달러에 이를 것으로 전망하였다(Lux Research,

2004). 나노제품은 시장에서 눈에 띄게 증가하고 있지만, 아직은 단순한 나노응용 제품

이 대부분이다. 스미스소니언(Smithsonian Institution)의 연구정책관련 산하기관인 우드

로윌슨 국제학술센터(Woodrow Wilson International Center for Scholars)에서 지원하는

“떠오르는 나노기술 프로젝트(Project on Emerging Nanotechnologies)”의 보고(2007)에서

2007년 5월까지 500여 종의 소비재 나노제품이 등록되었고 지속적으로 증가하고 있다

- 4 -

고 밝히고 있다. 나노룩스리서치(Nano Lux Research)사의 최근 조사에 따르면 2014년

까지 나노기술 관련 제품의 판매량이 2조 6천억 달러로 증가하고, 생산되는 모든 생산

품의 약 15 %가 나노 기술을 이용한 제품이 될 것으로 예측한다.

나노제품의 분류는 생활가전, 음식과 음료, 건강과 보건, 아동제품, 자동차, 전자제품과

컴퓨터, 이동통신과 통신관련, 가정용품으로 구분할 수 있다. 2006년 3월부터 2007년 5

월까지 14개월 동안 사이트에 등록된 나노기술을 사용한 소비자 제품의 수는 212개에

서 475개로 선형적으로 증가하였다. 이를 분야별로 살펴보면 의류와 화장품류가 각각

77종과 75종이었고, 침구류, 보석, 스포츠 용품, 영양 및 개인용품 등이 뒤를 따르고 있

다(Fig. 2-1).

최근 나노 산업의 발전에 따라 여러 종류의 나노입자가 개발되고 있다. 그중 산업계

에서 가장 주목을 받고 있는 나노입자 중의 하나가 탄소나노튜브에 대한 연구이다.

1985년에 처음으로 발견된 나노 탄소 공(일명 버키볼(buckyball))은 60개의 탄소 원자

로 구성되어 있고 축구공 모양을 하고 있다. 이러한 탄소나노튜브는 지름이 1나노미터

정도이며, 튜브 모양을 하고 있으며 인장력은 강철보다 100배 강하다. 그리고 경우에

따라 도체, 반도체, 초전도체 등 다양한 특성을 보이기 때문에, 첨단 윤활유, 연료전지,

약물전달체계, 차세대 반도체, 디스플레이 분야 등에서 연구되고 있다(Oberdörster,

2004) (Fig. 2-2).

Figure 2-1. 나노제품의 총 등록 건수

- 5 -

Figure 2-2. 나노물질별 제품등록 현황

나노관련 기업현황을 보면 2001년도에 78개(벤처기업 33개 포함)에 불과하였던 나노관련 기업수가 2005년도에는 214개(벤처기업 127개 포함)로 94개가 증가하고 있으며, 벤처기업이 50 %이상을 차지한다는 사실은 산업화로 진행되고 있음을 증명한다(Table 2-1).

Table 2-1. 국내 나노관련 기업현황

2001년도 2004년도 2005년도

대기업45

18 32

중소기업 28 56

벤처기업 33 78 126

계 78 124 214

국내에서 산업화/제품화된 22개 품목에 대하여 소비자 제품(End-Products), 원료 및 공정 제품별로 분석해 보면 원료 및 공정 제품은 나노 입자 등의 소재 생산과 소자 생

산 공정 품목으로서 조사대상 전체품목 중 약 40 %의 비중을 차지하고 있으며 반면, 소비자 제품 End-Products는 원료를 공급 받아 기존의 제품(가전제품, 화장품, 생활용품 등)에 코팅 또는 혼합하여 제작한 것으로서 약 60 %의 비중을 차지하고 있다(Fig 2-3).

- 6 -

E n d -P r o d u c t s7 5 품 목( 6 0 % )

원 료 및공 정4 7 품 목( 4 0 % )

E n d -P r o d u c t s7 5 품 목( 6 0 % )

원 료 및공 정4 7 품 목( 4 0 % )

Figure 2-3. 국내 나노제품의 분류

End-Products 중 소모품이 차지하는 비중은 36 %이고, 내구재의 경우 64 %로서 나노기술이 표방된 제품 중 가장 큰 비중을 차지한다. End-Products 생산 기업은 대기업, 중소기업, 벤처 기업을 망라하고 있으며, 특히 백색가전 제품의 경우 대기업 중심(대우, LG, 삼성 등)으로 생산되고 있다(Fig. 2-4).

소 모 품2 7 품 목( 3 6 % ) 내 구 재

4 8 품 목( 6 4 % )

소 모 품2 7 품 목( 3 6 % ) 내 구 재

4 8 품 목( 6 4 % )

Figure 2-4. 소비자 End-Products의 구성

원료 및 공정 제품 중 원료 생산 분야는 중소기업과 벤처기업 중심으로 중소규모 연구비 투자로 가능한 나노 소재(나노 입자, 복합소재, 섬유 등의 원료)의 생산이 주종이다. 공정 개발 분야는 나노급 전자소자 개발 등 대규모 연구비 투자가 필요하다는 측면에서 대기업 중심으로 산업화되고 있는 추세이다(Table 2-2).

Table 2-2. 원료 및 공정제품의 분류

제품의 성격 제품의 종류

원료 생산

- 나노분말

- 복합소재

- 나노박막 등의 생산

공정 개발- 전자소자 공정

- 나노튜브 생산공정 등

- 7 -

원료 및 공정 제품은, End-Products를 생산하기 위한 원료 생산 및 공급 분야가 87 %로 주종을 이루었으며, 공정 개발 품목은 13 %를 차지하고 있음(Fig 2-5).

원 료 생 산4 1 품 목( 8 7 % )

공 정 개 발6 품 목( 1 3 % )

원 료 생 산4 1 품 목( 8 7 % )

공 정 개 발6 품 목( 1 3 % )

Figure 2-5. 원료 및 공정 제품의 구성

국내 ‘20년까지 나노산업의 연평균 성장률은 22.6 %로 관련 산업에의 기여도는 약 593조원으로 예측되며, 전자통신 분야가 관련 산업에서 차지하는 비중은 50～57 %로 예측되고 의료, 항공우주/수송기계 및 국방/기타 분야 등의 성장이 두드러질 것으로 전망된다(Table 2-3).

Table 2-3. 분야별 나노기술/산업의 국내 시장 전망 (단위 :십억원)

구분 2000년 2005년 2010년 2015년 2020년연평균 증감율

'01-10 '11-20

전자통신 5,069 18,277 56,449 151,484 333,465 27.3 19.4

의 료 238 726 2,792 6,978 14,694 27.9 18.1

환경/에너지 333 813 2,724 6,255 14,673 23.4 18.3

생명공학 730 1,342 3,103 5,873 10,920 15.6 13.4

소재/제조 2,591 9,486 22,113 45,473 97,869 23.9 16.0

항공우주/

수송기계 692 2,389 8,876 26,625 66,176 29.1 22.2

국방/기타1) 500 2,354 8,853 22,277 55,227 33.3 20.1

합 계 10,153 35,387 104,910 264,966 593,024 26.3 18.9

종합하면, 현재 국내 기업에서는 중장기 연구투자가 필요한 원료 및 공정 개발 분야 보다는 소재의 가공을 통한 소비재 생산에 치우치고 있다. 긍정적 측면으로는, 제품 응

- 8 -

용성이 다양한 나노 소재의 경우 다각적인 제품들이 대기업, 중소기업, 벤처기업을 망라하여 출시되고 있는 점으로 보아 국내 기업이 나노기술의 가치를 인정하고 차별성

있는 제품화에 주력하는 등 나노기술의 산업화 마인드가 매우 높다고 볼 수 있다.

(2) 국내외 연구동향

1) 국외 연구동향

탄소나노튜브는 와이어(w ire), 반도체, 컴퓨터 기억소자 등에 경량이며 강한 구조를 가지면서

열 발산 효과가 높으며, 축도된 전자기계나 고효율 공기청정기에 적용할 수 있는 여러 가지 장점

이 있다. 이런 신기술과 더불어 이런 물질의 유출은 특히 우주선이나 공학적 작업의 밀폐된 공간

에서는 건강문제를 야기할 수 있다. 실제적으로 나노 튜브가 폐에 도달하는 양은 소량이지만 어떤

조건에서는 작은 크기가 공기 중에 있게 되어 폐에 도달할 수 있다(M ay n ard et a l., 2004 ). L am

등의(20 0 4 ) 연구결과에 의하면 단일벽 탄소나노튜브(S W C N T )는 1 n m 의 직경에 1 0 00 n m 의

길이를 가지고 있는데 반데르발스(v an d er W aals)의 힘에 의해 엉기는 성질을 가지고 있으며

너덜너덜한 롤(ta ttered ro le ) 같은 형태를 이루고 있으며 일부는 미세입자 형태를 보인다. 의도

적 비의도적 불순물이 전기적, 화학적 및 기계적 성질에 영향을 주며 궁극적으로 독성에 영향

을 준다. 이런 입자의 독성은 입자의 지속성과 제거에 달려 있다.

L am 등(2004)은 3 종류의 SW C N T를 기관지에 단회 투여하여 폐 독성을 연구하였는데 3종

류의 SW C N T는 정제된 나노튜브는 2 % 의 잔류 F e를 함유하였으며, 비 정제된 탄소나노튜브는

27 % 의 F e함유, 2 6 % N i와 5 % 이트륨(y ttr iu m )을 함유하였다. 이 3가지의 나노튜브를 투

여하였으며, 대조군으로 카본블랙(carb o n b lack )을 사용하였다. 0 .1 m g의 실리카(s ilica )나 카본

블랙은 아무런 영향을 관찰할 수 없었지만, 3종류의 탄소나노튜브 투여동물에서는 정제여부와 상

관없이 염증반응과 육아종을 관찰하였다. 육아종은 폐 간질에서 발생하였으며, 0 .5 m g 투여농도

로 N i을 함유한 탄소나노튜브는 높은 사망률(5/ 9)을 보여주었고, Fe를 함유한 나노튜브는 정제

여부에 상관없이 사망을 보여주지 않았다. 높은 농도에서는 여러 가지 폐의 육아종을 포함한

임상적 증상을 보여주었지만, 대조군으로 사용한 카본 블랙은 아무런 자극성이나 육아종을 보여

주지 않았다. 높은 농도의 실리카는 경증에서 약정도의 염증반응이나 육아종이 폐포나 간질에서

관찰되었다. S W C N T에 함유된 철의 산화환원전위(red o x p o ten tia l)가 피부세포의 독성에도 영

향을 미친다고 Sh ed o v a(2003) 등이 발표하였다. 따라서 나노튜브의 흡입은 염증반응 육아종

(g ran u lo m a), 생체 기관 내의 섬유 조직 발생 및 증식(fibrogenic) 영향을 보여주며 기존의 무게

- 9 -

에 기준을 둔 허용농도는 불충분하다. 만약 30 g의 체중을 가진 쥐가 5 m g/ m 3(grap h ite의 허용

농도)의 농도로 노출되고 40 % 가 폐에 도달한다면 폐는 4～17일간의 근로자의 작업 기간 동안

노출되는 것과 같다. 그러나 나노튜브는 석영과 비슷한 폐 독성을 보여주기 때문에 허용농도는

석영의 허용농도인 0 .05 m g / m 3 이하가 되여야 할 것이다. 따라서 기존의 중량에 기준을 둔

농도보다는 표면적에 기반을 둔 허용농도가 필요할 것이다. H u cz k o 등(2 0 0 1 )은 기니아 픽을 이

용하여 2 5 m g의 S W C N T 를 폐에 투여하여 폐 기능을 조사하였는데, 폐 기능에 대한 영향을

발견할 수 없었고, 폐와 기관지 세척액(b ro n ch o a lv eo lar lav ag e)에서도 영향을 관찰할 수 없었

다. W arh eit 등(2004 )은 기관지 주입법(in tra trach ea l in stilla tio n )에 의해 SW C N T (50～60 % 30

n m n an otu b e, 30～40 % 비정형 탄소, 5 % N i, 5 % C o )를 수컷 쥐(ra t)에 투여하였는데, 5

m g/ kg에서 15 % 의 사망률을 보였다. 이는 상기도의 기관지가 막혀서 호흡곤란으로 죽었으며,

염증반응과 폐 세포의 분열, 폐의 다수의 육아종(g ran u lo m a)을 관찰할 수 있었다. 폐 무게의 증

가와 기관지 세척액에서 염증반응의 증가를 볼 수 있었다. 폐의 대식세포(m acro p h ag e)에는 영향

을 주지 않았으며, 폐의 반응은 실리카에 노출된 rat와 비슷하지만 정도는 실리카 보다는 낮은

반응을 보여주었다.

W arh eit의 연구와 L am 의 연구는 탄소나노튜브의 세포독성을 말해주고 있다. H u ezk o 등

(2001 )은 탄소나노튜브의 피부와 눈에 대한 영향을 조사하였는데, 탄소나노튜브를 함유한 패치

(p a tch )를 지원자에게 부착한 결과 아무런 자극이나 감작성을 관찰할 수 없었으며 토끼의 눈에

주입했을 때 안 자극을 관찰할 수 없었다. Sh ed ov a 등(2003a 및 2003b )은 SW C N T는 사람의

상피세포(k etin o cy tes)에게 양 반응 관계로 세포의 생존을 감소시키며 산화적 스트레스(o x id ativ e

stress)를 증가시켰으며, 지질과산화화(lip id p eroxid ation )를 증가시켜, 근로자의 노출은 피부독

성을 유발할 수 있을 것이라고 제시하였다. Z h en g 등 (2003 )은 적절한 직경과 전기적인 특성을

가진 탄소나노튜브는 in v itro에서 단일가닥 D N A (sin g le stran d D N A )를 풀 수 있다고 하며,

C u i 등 (2005 )은 SW C N T가 세포의 증식을 억제하며 사멸을 유도하며, 인간의 신장배아세포가

배아에 부착하는 것을 감소시켰다고 보고하였다.

Jia 등 (2005)은 SW C N T , M W C N T , 풀러렌의 기니아 픽의 폐 대식세포를 이용하여 세포독

성을 비교하였는데, 풀러렌은 세포독성이 없었으며, S W C N T가 M W C N T보다 독성이 높았으며,

석영보다도 독성이 높다고 보고하였다. S W C N T는 M W C N T 보다 적은 양에서 거식세포의 탐식

작용을 감소시켰다.

P an taro tto 등 (2004 )은 사람과 쥐의 섬유세포를 이용하여 S W C N T를 리신(ly sin )과 결합했을

- 10 -

때 세포막을 통과하여 핵에 축적되는 것을 관찰하였다. W ang 등(2004)은 수산화(hydroxylation)

한 SW C N T를 실험동물의 복강에 주사한 결과 뇌를 제외한 체내에 분포하였고, 뼈에 축적되었

다고 보고하였다. 다른 경로 즉 혈관, 경피, 경구 경로는 수산화된 SW C N T의 분포에 영향을

주지 않았다. 복강 투여 후 11일 이후에는 80 % 의 수산화된 S W C N T가 배설되었는데 94 % 는

소변으로 6 % 는 대변으로 배설되었다. C h eru k u ri 등(2004)은 쥐에서 탄소나노튜브는 복강의 대

식세포에 의해 탐식될 수 있다고 보고하였으며, M o n te iro -R iv iere 등(2005 )은 사람의 표피 세포

(k ertin o cy te )의 공포에서 탄소나노튜브를 발견할 수 있었으며, 세포의 생존을 감소시키고, 인터

루킨(in terleu k in )-8과 같은 염증반응 마커(m ark er)가 증가하여 C N T가 세포를 통과하여 자극반

응을 일으킬 수 있다고 보고하였다.

2) 국내 연구동향

국내의 나노물질의 위해성 평가 연구는 미진한 형편이다. 그리고 나노기술의 발전에 투자되는

연구비에 비해 (2005년, 2 ,776억원) 나노의 안전성에 투자되는 예산은 극히 미미하며 연구인력 및

이 분야에 경험도 미진한 형편이다. 다만, 국립독성과학원이 나노독성 평가의 주무기관으로 2006

년도에 10억 정도의 예산을 확보한 형편이다. 근로자의 안전을 위한 나노입자의 위해성에 관한

연구 예산은 노동부에서 전무한 형편이며, 환경유해성에 관한 환경부의 예산도 미미하다.

국책과제로서 나노물질의 위해성평가에 관해 연구한 바로는 “나노입자의 독성과 산업보건에서

의 대응방안연구”(맹승희 등, 2005) 에서 발표되었으며, 국립독성과학원의 기획연구(정진호, 현재

수행 중)가 있다. 그리고 국내 연구자의 관련 연구발표로는 한국독성학회지에 ‘T h e co n cep ts o f

N an o to xico lo gy an d R isk A ssessm en t o f th e N an o p artic les’(맹승희, 유일재, 2005)라는 제목

으로 발표된 바 있으며, 한국환경독성학회지에 ‘나노물질의 독성과 위해성평가 전략’(박광식,

2005년)에 관해 발표되었고, A ir C le a n in g T e ch n o lo g y 학술지에 ‘나노입자의 독성과 위해성

연구동향’(유일재, 2 0 0 6 )이라는 논문이 발표되어 있다.

나노 입자의 in vitro 독성연구에 대해서는 국내에서도 초기 단계에 있으리라고 예상된다. In

v itro 연구를 수행하기 위해서는 나노 입자는 환경매체나 생체 매체에서 시간에 따라 매질에

따라 성질이 변할 수 있으므로 철저한 나노입자의 특성 연구가 선행되어야 한다. 그냥 입자를 세

포에 투여하니까 독성이 나왔더라는 또는 d o se-resp o n se의 개념이 투여용량(무게), 표면적, 입

자수까지 정립이 제대로 안된 독성연구들은 극히 제한된 정보를 제공할 것이고, 특성화가 제대로

되더라고 몇 가지 세포형에서의 독성현상으로 생체 내에서의 반응을 제대로 알아내기에는

- 11 -

무리가 있다. 따라서 in vitro 연구는 in vivo 연구의 결과에서 메카니즘을 규명하는 연구나, 나노

입자의 변이원성을 규명하는 유전독성연구에 국한되어야 할 것이다. 국내의 나노입자에 대한 in

vitro 연구는 맹승희 등(2005)이 “나노입자의 독성과 산업보건에서의 대응방안연구”에서 시도했

는데, 나노독성의 기초 단계로서 우리나라에서 연구, 제조되어 사용되고 있는 12종의 나노입

자에 대한 세포독성과 시험관내 소핵유발 정도를 비교해 봄으로써 나노 입자의 크기와 형태에

따른 독성 차이를 찾고자 하였다. CHO-1 cell에 12종의 나노입자(Ag, Cu, TiO2, Ni, Cu-Ni, Al,

straight GNF, spiral GNF, Fe, MWNT, SWNT, MPN)들은 건열 멸균하여 멸균 증류수에 단계

희석하여 1,000 ㎍/plate, 500 ㎍/plate, 250 ㎍/plate, 125 ㎍/plate, 62.5 ㎍/plate 및 31.3 ㎍

/plate의 6단계 농도로 처리하여 세포 카운팅 키트 8을 이용하여 세포의 독성을 비교하여 본 분

석한 결과 C u 나노입자는 20 ㎍/ m l의 농도에서 세포의 50 % 가 죽었으며 이는 12종의 나노입자

들 중 가장 높은 세포독성이 나타났다. Cu를 제외한 다른 나노입자들의 세포가 50 %의 사멸 상

태를 비교한 결과 Cu-Ni>Ag>SWNT>TiO>Ni>Al>Fe>straight GNF>spiral GNF>MWCNT>

MNP의 순으로 Cu-Ni가 가장 낮은 농도에서 50 %의 세포가 살아 있었으며 이는 높은 수준의

세포독성의 정도가 보였고, M agn etic N an o P article(M N P )은 가장 높은 나노물질에서 50 % 의

세포가 살아 있어 이것은 제일 낮은 수준의 세포독성이 있음은 관찰할 수 있었다.

(3) 사업대상의 범위

나노기술의 급속한 발전과 응용분야의 확산에 의해 나노물질의 생산량은 Fig. 2-6처럼

각 분야별로 기하급수적으로 증가할 것으로 예측되고 있으며(Maynard et al., 2006),

2014년 시장 규모는 25조 달러 이상이 될 것으로 추정된다. 나노물질에 의한 인체 및 환경

노출 가능성은 이러한 추세에 따라 급격히 증가하고 있으나 나노물질의 위해성 평가 및

독성 자료는 미흡한 실정이다.

따라서 OECD 환경국에서는 2005년 6월, 제38차 화학물질 합동회의 및 나노 특별 세션을

통해 OECD나노물질 안전성 워크숍을 개최하였으며, 이를 기반으로 제1차 OECD 제조나

노물질 작업반회의(WPMN)가 개최되어 "2006～2008년 작업계획"이 작성되었다.

2006년 11월, 제40차 OECD 화학물질 산하위원회/합동회의에서 이를 승인하였으며 현

재 나노물질과 시험지침 운영그룹(SG)이 운영 중이다.

또한, 나노입자는 작업자에게 나노입자의 제조, 처리, 생산품으로의 과정 등 모든 제조

과정에 종사하는 작업자들에게 노출될 가능성이 있으며, 이를 사용하는 소비자들이나

환경에 까지 다량의 나노 입자가 노출 될 수 있는 가능성을 갖는다. 이러한 나노입자

- 12 -

들은 생체내로 흡수될 경우 축적성과 독성효과와 같은 잠재적 위험이 존재한다(김창수

et al., 2007).

Figure 2-6. 나노물질의 연간 생산율

일반적인 입자에 대한 독성평가 시 농도단위에 있어서 지금까지 중량단위로 이루어져

왔으나 나노입자의 경우 중량보다 표면적으로 하여 표현할 때 더 나은 양반응 관계를

나타내는 것으로 보고되고 있어 같은 동일한 화학적 특성을 갖고 크기가 다른 입자에

대해 평가할 때에는 입자 중량 혹은 입자수 보다 입자 표면적이 더 좋은 농도단위가

될 수 있음을 보고하고 있다(Brown et al., 2001; Tran et al., 2000; Oberdörster, 2000).

나노독성에 있어서 입자의 크기와 더불어 고려되어야 할 수 있는 사항이 입자의 모양

이다. 섬유상물질의 지속적인 노출이 폐 섬유화 및 암의 위험성 증가와 관련 있음이

알려져 왔다(Greim et al., 2001; IARC, 2002) 그러나, 나노입자에 있어서도 일반적으로

인정되는 섬유독성의 원칙이 적용될 수 있는 여부에 대한 독성학적 연구가 필요한 실

정이다.

특히 최근의 MWCNT의 유해성연구에서 Poland et al.(2008) MWNCT의 실험동물

의 복강노출에 의해 중피종(mesothelioma) 유발을 보고하였으며, 긴 tube의 영향이 짧

은 tube보다 영향의 크다고 발표했다. 또한 MWCNT와 석면의 유사성을 발표하여

MWCNT도 석면과 같이 Aspect ratio(길이와 직경비)가 독성의 발현에 중요하다고 보

고했다. 특히 이 연구진의 Maynard 박사는 아직 노출자료가 전혀 없기 때문에 작업환

- 13 -

경에서의 노출자료가 필요하다고 역설하였다. 이와 같은 시기에 일본의 Takagi et

al.(2008)도 p53 +/- mouse에 복강에 석면과 MWCNT를 주사하여 석면과 동일하게 중

피종을 유발할 수 있다고 발표하였다. Han et al.(2008) 등은 MWCNT의 노출평가 논

문에서 실험실에서의 MWCNT는 상당량 노출될 가능성이 있지만, 노출되는 MWCNT

의 길이는 평균 1.5 micron 정도 길이로 유해성이 높은 긴 MWCNT가 아니라 유해성

이 낮다고 알려진 MWCNT일 가능성을 제시하였다. 특히 CNT는 석면과 같이

HART(High aspect ratio theory) 이론이 적용되어 석면과 같은 유해성을 가지고 있는

지가 유해성의 관건이다. 그러므로, 본 연구는 현재 다양한 분야에서 가장 많이 개발되

고, 사용되고 있는 탄소나노튜브(다층벽탄소나노튜브)의 독성효과를 정확히 검증하기

위해 용매의 영향으로부터 안전한 다층벽탄소나노튜브의 정제방법이 개발되어야하며

탄소나노튜브의 형태학적 차이(High aspect ratio 및 low aspect ratio)에 따라 독성 효

과에 어떠한 영향을 주는지에 대한 연구와 발암성관련 유전자의 발현 패턴 분석 및 생

물독성학적 반응 탐색을 수행하며, 상업적으로 사용되고 있는 탄소나노튜브의 독성을

평가하고, 다양한 물리적, 화학적, 생물학적 자료들을 생산하여 국제적 검증을 통해 나

노 입자의 건강 영향 평가에 대해 보다 정확하고 정밀한 기초자료를 확보하는 데 그

목표가 있다.

- 14 -

3. 연구 방법

(1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성 분석

1) 실험에 사용할 MWCNTs 선정

사용할 MWCNTs는 2000년부터 꾸준히 CNTs를 생산해 온 국내 대표적 CNTs 생

산업체인 한화나노텍(http://hnt.hanwha.co.kr/kr/home.html)의 MWCNTs를 사용

해 실험한다.

2) 고온 열처리를 이용한 MWCNTs의 금속 촉매 제거 방법 개발

① 일반적으로 진공 상태에서 금속이 2000 oC 이상의 온도에 있으면 증발 현상이 발

생한다. 특히, 금속이 그 크기가 작아지면 이러한 증발 현상이 더 뚜렷하게 발생

하며, 더 낮은 온도에서도 증발 현상이 일어난다. 이러한 현상을 이용해

MWCNTs를 성장시키기 위해 사용한 촉매 금속(특히 Fe)을 제거할 수 있다.

② 이러한 현상을 이용해 MWCNTs의 촉매 금속을 제거할 수 있으며, 선행 실험 결

과 1800 ~ 2000 oC 사이에서 3 ~ 5 시간에 이르는 고온 열처리를 통해 금속 촉

매가 제거되는 것을 확인 할 수 있었다.

③ 금속 촉매 제거 과정

Ⅰ. As grown MWCNT 준비해 chamber에 넣음

Ⅱ. 10-5 torr 이하로 Chamber 진공 유지

Ⅲ. 진공 상태에서 Chamber 의 온도를 1800 ~ 2000 oC로 설정

Ⅳ. 3 ~ 5 시간 동안 고온 열처리 과정

Ⅴ. 시료 회수 후 Purity 확인

3) 수계에서 분산제를 이용하지 않고 MWCNTs를 분산시킬 수 있는 분산 기법 개발

및 길이제어.

① MWCNTs를 포함해 MWCNTs를 분산하는데 있어 일반적으로 계면활성제를

사용한다. 그런데 본 실험의 경우 분산제로 사용되는 계면활성제가 세포독성을

일으켜 MWCNTs의 독성 실험을 할 수 없게 만든다. 그래서 독성을 일으키는

분산제를 개발하거나 분산제를 사용하지 않고 잘 분산된 MWCNTs 용액을 만

들어야 한다. 본 연구에서는 강산인 H2SO4 / HNO3를 이용해 MWCNTs에 카

- 15 -

르복실기 등의 작용기를 결합시킴으로써 수계에서 분산시킬 수 있는 MWCNTs

를 생산할 수 있다. 생산된 MWCNTs를 초음파기를 이용하여 초음파처리시간을

조절하여 길이제어를 한다.

② 처리 과정 및 모식도

Ⅰ. 정제된 MWCNTs 준비

Ⅱ. 황산 : 질산 = 3 : 1 용액에 MWCNTs 첨가

Ⅲ. 용액 refluxing

Ⅳ. 용액 중화

Ⅴ. D.I. water에 MWCNTs 분산

Ⅵ. Sonication

Figure 3-1. MWCNTs's diagram after treatment.

4) MWCNTs의 물리화학적 특성 분석

① Purity 분석: TGA(열무게분석법, Thermogravimetric analysis)를 통해 확인

Ⅰ. TGA: 특정 Gas 속에서 온도를 상온에서 1000 oC 이상까지 증가시면서

시료의 무게 변화를 측정하는 방법

Ⅱ. MWCNTs의 TGA 측정시 특징: MWCNTs를 TGA 분석을 해 보면 MWCNTs

는 보통 550 ~ 750 oC 범위 내에서 산화되는 것을 관측할 수 있다. 이에 반해

MWCNTs 속에 포함된 촉매 금속은 1200 oC 가 넘어야 증발하기 시작하므로,

TGA 측정을 통해 측정하는 시료 속에 얼마나 많은 촉매 금속이 존재하는지를

측정 할 수 있다.

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Figure 3-2. The example of TGA analysis.

Ⅲ. TGA 측정 과정

5 ~ 10 mg 의 MWCNTs를 TGA 넣어 정확한 무게 측정 Purity 측정의 정확성을 위해 chamber 의 온도를 20 oC / min로 200 oC 까지 올려 MWCNTs 에 붙어 있는 수분을 제거

5 oC / min 의 승온 속도로 1000 oC 까지 chamber의 온도를 올리며 MWCNTs 의 질량을 관찰

② MWCNTs 직경 및 길이 분포 분석: SEM(Scaning Electron Microscopy), TEM

(Transmission Electron Microscopy), DLS (Dynamic Light Scattering) 을 이용한

길이 및 직경 분포 분석.

SEM (Scanning electron Microscopy): 측정하려는 시료에 전자를 조사한 후 방출되는

2차 전자(secondary electron)와 투과전자를 측정해 시료의 미세구조를 확인 할 수 있

고, 이를 통해 직경과 길이분포를 알 수 있다.

- 17 -

Ⅰ. SEM 측정 과정

잘 분산된 MWCNTs 용액 준비 세척된 SiO2 기판 준비 Spin coating을 통해 SiO2 기판에 MWCNTs 증착 SEM 측정

Figure 3-3. The example of SEM analysis

Ⅱ. DLS 측정 과정

Light scattering 이 잘 발생하는 농도에 맞추어 MWCNTs 용액제작 Light scattering count 확인 및 시료에 laser 조사 DLS 측정 DLS data 분석

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Figure 3-4. The priciple of DLS(Dynamic Light Scattering).

Ⅲ. Brunauer, Emmett, Teller(BET) surface area 분석

MWCNTs 분산 용액 제조 PET 필름 위에 MWCNTs 필름 형성 면 저항 측정

③ MWCNTs 거시분산도 측정 : MWCNTs의 거시분산도는 KS D 2717에 따라 수행

하였다.

각각의 농도별로 분산 된 MWCNTs 용액 준비 420 W로 3 분간 초음파 처리 초음파 처리된 시료를 취하여 700~900 nm(본 실험에서는 800 nm 사용)에서 흡광도를 측정(측정값 = A).

초음파 처리하여 분산된 시료를 6000 g로 10 분간 원심분리한다. 원심분리 후 상층액 만을 취하여 700~900 nm(본 실험에서는 800 nm 사용) 에서 흡광도를 측정(측정값 = B).

과 의 측정을 3회 반복한다. 다음과 같은 공식을 이용하여 거시분산도(%)를 측정한다.

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(Dm(λ))=(%)100×

AB

거시분산도 (%) =(%)100)(1

1×∑

=

N

mDN λλ

(2) 나노물질의 종류에 따른 유전독성반응성 비교연구

1) 박테리아를 이용한 복귀돌연변이시험

① 시험기준

시험의 실시는 원칙적으로 국립환경과학원 고시 제2008-44호(2008년 12월 31일)

‘화학물질 유해성시험연구기관의 지정 등에 관한 규정’, OECD Guidelines for the

Testing of Chemicals No. 471 “ Bacterial Reverse Mutation Test ”(Adopted :

21st July 1997)에 준하여 실시한다.

② 대조물질

명칭 : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DPPC)

제조(로트)번호 : 078K5

CAS No. : 63-89-8

분자량 : 734.04

입수일 : 2009년 04월 06일

입수량 : 100 mg

외관 및 성상 : 백색분말

등급 : ≥99 %

보관조건 : 냉장보관

제조원 : Sigma-Aldrich, Inc.

- 20 -

Ⅰ. 양성대조물질과 양성대조물질에 대한 용매

물 질 명 제 조 원 Lot No. 순도 (%)

양성

대조

물질

Sodium azide(NaN3)

(CAS No.26628-22-8)Junsei 7D1283 98

9-Aminoacridine hydrochloride hydrate

(9AA) (CAS No.52417-22-8)Sigma 07620TD 98

2-(2-Furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)

acrylamide(AF-2)

(CAS No.3688-53-7)

Wako PKE1831 98～100

2-Aminoanthracene(2AA)

(CAS No.613-13-8)Sigma 12317CE 96

용매1,2-Dipalmitoyl-sn-phosphocholin

(CAS No.67-89-8)Sigma 078K5 ≥99

Ⅱ. 사용하는 양성대조물질의 명칭 및 농도

구분 대사활성화법에 의하지 않는 경우 대사활성화법에 의하는 경우

균주명 양성대조물질농도

(㎍/plate)양성대조물질

농도

(㎍/plate)

TA100 AF-2 0.01 2-AA 1.0

TA1535 NaN3 0.5 2-AA 2.0

TA98 AF-2 0.1 2-AA 0.5

TA1537 9-AA 80 2-AA 2.0

WP2uvrA AF-2 0.01 2-AA 10

③ 시험균주

Ⅰ. 시험에 이용할 균주는 Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535,

TA1537, Escherichia coli WP2uvrA의 5균주를 이용한다.

- 21 -

Ⅱ. 입수방법

균 주 명 입 수 처 입 수 년 월 일

TA98

TA100

TA1535

TA1537

WP2uvrA

Molecular Toxicology Inc.





2009. 02. 25

2009. 02. 25

2009. 02. 25

2009. 02. 25

2008. 03. 04

Ⅲ. 보존방법

보 존 방 법 분 주 동 결

보 존 온 도 -80 ℃ (보존 기기명: Deep Freezer DF8514)

조 성 균현탁액: 0.8 ㎖ DMSO: 0.07 ㎖

기 타: -

보존하는 균주는 미리 유전적 성질과 양성대조물질에 대한 감수성을 조사하여 균의

성질이 적절함을 확인한다. 전배양을 위하여 일단 녹였던 균주는 보존균액으로 다시

사용하지 않는다.

④ 전배양의 조건

Nutrient broth명 칭 제 조 원 Lot No.

No. 2 배지 Oxoid 588285

전배양시간 10 시간 (정지기 초기에 배양을 멈춘다)

진탕배양장치의

형식 및 제조원

장비번호: MAI-028-01

형 식: SHKE-5000-1CE

제 조 원: Barnstead International (USA)

진 탕 방 법 진탕형식: 선회 선회수: 180 회/분

선회직경: 2.54 ㎝

배 양 용 기 종류: 삼각플라스크 용량: 50 ㎖

배 양 액 량 15 ㎖ 접종균량 30 ㎕

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⑤ 시험의 조건

Ⅰ. Preincubation 법

조 성

균현탁액 0.1 ㎖

시험물질용액 0.05 ㎖

0.1 M phosphate buffered saline

(직접법의 경우)0.5 ㎖

S9 mix (대사활성화법의 경우) 0.5 ㎖

Top agar 2.0 ㎖

Incubation온 도 37 ℃

시 간 48 시간

※필요에 따라 incubation 시간을 연장한다.

Ⅱ. Top agar의 조성

균 주 명 조 성 (100 ml 당)

TA98, TA100

TA1535, TA1537

NaCl

한천

0.5 mM

Histidine/Biotin

:

:

:

0.5 g

0.6 g

10 ml

WP2uvrA

NaCl

한천

0.5 mM Tryptophan

:

:

:

0.5 g

0.6 g

10 ml

⑥ 시험구성

Ⅰ. 농도결정시험

구 분 사용 플레이트수 농도단계양성대조, 용매대조

사용플레이트 수

직접법 3매 5이상 3매

대사활성화법 3매 5이상 3매

- 23 -

Ⅱ. 본시험

구 분 사용 플레이트수 농도단계양성대조, 용매대조

사용플레이트 수

직접법 3매 5이상 3매

대사활성화법 3매 5이상 3매

※평가결과의 재현성이 의심스러울 경우는 확인시험을 추가로 실시함.

Ⅲ. 투여농도의 결정

시험물질을 칭량하여 매체인 DPPC 용액에 분산하여 최고농도의 시험물질을 조제

한다. 이를 다시 DPPC 용액으로 단계별로 희석하는 방법으로 낮은 농도의 시험

물질을 조제한다. 시험물질은 순도 100 %로 환산하여 조제한다.

농도결정을 위한 시험은 5 ㎕/plate로부터 공비 4로 5 농도이상의 단계로 실시하

여 생육 저해를 나타내는 농도를 조사한 후 본시험을 실시한다. 본시험의 최고 농

도는 변이원성이 음성인 경우, 생육저해를 나타내는 농도를 최고 농도로 하여 공

비 2로 5농도이상 단계로 실시한다. 변이원성이 양성인 경우는 변이원성의 농도

의존성이 구해지는 농도범위에서 공비 2로 5 농도이상 단계로 본시험을 실시한다.

Ⅳ. 무균시험

S9 Mix 및 시험물질용액을 0.1 ml씩 최소 글루코즈 한천배지에 top agar를 중층

시켜 37 ℃에서 48 시간 배양하여 균의 생육 유․무를 육안으로 확인한다.

Ⅴ. 대사활성계(S9 및 S9 Mix)

공 급 원 Molecular Toxicology Inc.

제 조 년 월 일 2008. 11. 07 / 2009. 01. 29

구입시 Lot No. 2361(농도결정시험) / 2374(본시험)

보 존 온 도 - 80 ℃(보존기기명: Deep Freezer DF8514)

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< S9 Mix의 조성 >

성 분S9 Mix

10 ml 중의 양성 분

S9 Mix

10 ml중의 양

S9 1 ml 0.1 M NADPH 0.4 ml0.4 M MgCl2

/ 1.65 M KCl0.2 ml

0.1 M NADH 0.4 ml

0.2 M Na-PBS 5 ml

1.0 M Glucose-6

-phosphate0.05 ml D.W 2.95 ml

⑦ 관찰, 측정, 검사 및 분석의 방법

Ⅰ. Colony수의 산정방법

90 mm 직경의 플레이트(내경 86 mm)에 생성된 콜로니를 계수하며, 콜로니카

운터를 사용하여 수를 헤아린다. 시험물질의 석출에 의해 계수가 불가능한 경우

에는 그 대상에서 제외한다.

⑧ 시험결과의 해석(판정방법)

본시험의 결과는 각 농도별 평균값과 표준편차로 작성한다. 결과의 판정은 대사활

성계 존재 유․무에 관계없이 최소 1개 균주에서 플레이트 당 복귀된 집락 수에

있어서 음성대조군에 비해 2배 이상이고(단, 음성대조군의 판정범위 이상의 집락

수), 용량의존성을 가지며, 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양

성으로 판정한다. 단 양성으로 판정될 경우 통계학적 방법으로 검정한다.

2) 포유류 배양세포를 이용한 염색체이상시험

① 시험방법의 기준


화학물질 유해성시험연구기관의 지정 등에 관한 규정, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 473 In Vitro Mammalian Chromosome Aberration Test(Adopted : 21st July 1997) 준하여 실시한다.

② 대조물질

명칭 : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC)

- 25 -


CAS No. : 63-89-8

분자량 : 734.04

입수일 : 2009년 04월 06일

입수량 : 100 mg


등급 : ≥99 %



명 칭 : Mitomycin C(MMC)

제조(로트)번호 : 037k0710

CAS No. : 50-07-7

분자량 : 334.3

입수일 : 2008년 05월 27일

입수량 : 2 mg

특성 : 수용성

보관조건 : 냉장(4 ℃)


적용농도 : 0.04 ㎍/㎕

명칭 : CyclophosphamideㆍH2O(CPA)

제조(로트)번호 : 091K1176

CAS No. : 6055-19-2

분자량 : 279.1

입수일 : 2006년 02월 21일

입수량 : 1 g

특성 : 수용성

- 26 -



적용농도 : 10 ㎍/㎕

③ 시험계

Ⅰ. 시험에 사용할 세포는 CHO-K1(Chinese hamster Ovary fibroblast) 유래의

배양세포를 이용한다.

Ⅱ. 선정이유

이 세포는 염색체이상시험에 있어서 화학물질에 대한 감수성이 높은 것으로 알려

져있으며 자료가 풍부하기 때문에 선택하였다.

Ⅲ. 입수방법

세 포 명 입 수 처 입 수 년 월 일

CHO-K1 American Type Culture

Collection(ATCC)2007년 08월 09일

Ⅳ. 보존방법

보 존 방 법 분주동결하여 액체질소용기(-180 ℃)에 보존

조 성 세포액 1.8 ㎖ DMSO 0.2 ㎖

기 타 (배지 중 10 %의 FBS 포함)

Ⅴ. 세포의 특징

배양액 : 10 % Fetal Bovine Serum을 포함한 F-12 Medium

조 건 : 5 % CO2 , 37 ℃에서 배양하여 3-4일 마다 계대한다.

플레이트 위에 단층 상으로 증식

배가시간 : 약 15 시간

- 27 -

염색체 수(mode) : 2n=22개

④ 대사활성효소계(S9 Mix)

Ⅰ. S9의 입수방법 등

공 급 원 Molecular Toxicology Inc.

제 조 년 월 일 2009. 01. 29

구입시 Lot No. 2374

보 존 온 도 - 80℃ (보존기기명: Deep Freezer DF8514)

Ⅱ. S9 Mix의 조성

성 분 S9 Mix 1 ㎖중의 양 성 분 S9 Mix 1 ㎖중의 양

S9 0.3 ㎖ NADPH 4 μmol

MgCl 5 μmol HEPES 4 μmol

KCl 33 μmolGlucose-6-

phosphate5 μmol

⑤ 시험의 내용 및 방법

Ⅰ. 시험내용

생존세포수를 계측함으로 실시한다. 대사활성화법(S9 Mix+) 및 직접법(S9 Mix-)

하에 시험물질을 처리하고 각 농도 당 2매의 플레이트를 사용하여 농도 7단계로

하며, 최고용량은 5 ㎎/㎖ 또는 10 mM로 처리한다. 추가 배양이 끝난 후 각 플

레이트의 세포들은 헤마사이토미터 또는 세포생존계수기(Beckman Coulter,

MAI/078)를 사용하여 생존세포수를 계측하고, 플레이트 당 세포수를 산출한다.

용매대조군의 세포수를 100 %로 하여 세포증식 억제율을 산출한다.

세포증식억제시험에서 50 %의 증식 억제율을 구하여 이것을 기준으로 최고농도

를 결정한 후 최고농도로부터 공비 2로 3 단계 이상의 농도에 관해 시험한다. 그

- 28 -

러나 증식억제효과가 보이지 않는 경우는 5 ㎎/㎖ 또는 10 mM을 최고농도로 한

다.

Ⅱ. 시험방법

- 지름이 60 mm인 plate에 4000 cells/㎖의 세포를 5 ㎖씩 분주하여 약 3일간 37

℃에서 배양한다.

- 24 시간 처리군의 경우 시험물질을 투여 시 기존 배양액을 제거하고 신선한 배

양액 (37 ℃)을 4.95 ㎖을 각 plate에 분주한 후 시험물질용액(50 ㎕)을 분주하여

5 ㎖이 되도록 처리한다. 처리 후 24 시간 37 ℃에서 배양한다.

- 6 시간 처리군의 경우 시험물질을 투여 시 기존 배양액을 제거하고 신선한 배

양액 (37 ℃)을 4.95 ㎖을 각 plate에 분주한 후 시험물질용액 (50 ㎕)을 분주하

여 5 ㎖이 되도록 처리한다. 처리 6 시간 후 배양액을 1회 세척한 후 제거하고

다시 배양액을 5 ㎖씩 분주하여 18 시간동안 37 ℃에서 추가 배양을 시작한다.

- 지름이 60 mm인 plate에 4,000 cells/㎖의 세포를 5 ㎖씩 분주하여 약 3일간 37

℃에서 배양한다.

- 시험물질을 6 시간 처리하며, 시험물질 투여 시 기존 배양액을 제거하고 신선한

배양액(37 ℃)을 4.45 ㎖을 분주한 후 시험물질용액(50 ㎕) 및 S9 Mix(500 ㎕)를

분주하여 5 ㎖이 되도록 한다.

- 6 시간 후 배양액을 제거하고 5 ㎖의 신선한 배양액(37 ℃)으로 세포층을 1회

세척한 후 제거하고 다시 배양액을 5 ㎖을 분주하여 18 시간동안 37 ℃에서 추

가 배양을 시작한다.

- 모든 plate에 대해 시험물질 처리 개시로부터 약 22 시간 후에 colcemid(Gibco

BRL, Cat. No. 488482)를 100 ㎕씩 각각의 plate에 처리하여 2 시간 경과 후 중

기세포를 수거하여 염색체 표본을 제작하고 5 % Giemsa(Merck, Cat. No.

HX609300)액으로 염색한 후 염색체 이상을 계수한다.

- 표본은 각 plate 당 2매씩 제작한다.

- 29 -

⑥ 염색체이상의 관찰

각 플레이트 당 100개의 분열중기세포를 관찰하여 다음의 종류별로 분류한

다. 이상의 유발율은 염색체에 이상을 갖는 세포의 출현율을 나타낸다. 관찰은 코드화

한 표본을 이용한 BLIND방법으로 행한다.

Ⅰ. 구조이상

gap(염색분체형, 염색체형) : g

절단(염색분체형) : ctb

교환(염색분체형) : cte

절단(염색체형) : csb

교환(염색체형) : cse

기타

Ⅱ. 수적이상

수적이상 : pol

Ⅲ. 관찰기준

염색되지 않은 부분이 염색분체의 종축위에 있어 그 폭이 염색분체의 두께정도로

그 구분이 명확한 것.

절단은 염색분체의 종축으로부터 떨어져 있는 것. 동일선상에 있어도 그 폭이

염색분체의 두께의 2배를 넘는 것.

염색체형의 절단은 동원체를 갖지 않는 염색체가 있기 때문에 명확하게 판정할

수 있는 것만을 헤아린다.

1개 또는 여러 개의 염색체의 2부위 사이에서 생긴 절단이 서로 결합한 것.

염색체형에 관하여는 환상, 이동원체 등 명확하게 판정할 수 있는 것만을

헤아린다.

- 30 -

Ⅳ. 수적이상

CHO-k1과 같은 세포주 세포에서는 어느 정도 염색체에 변이가 있으므로 이수성

(aneuploidy)의 검색은 하지 않는다. 배수성(polyploidy)만 검색한다. CHO-K1 세

포에서의 mode는 22개이며 4배수체인 경우 44개가 되나 3배수체를 포함하는

36개 이상을 배수체로 간주한다. 또한 핵 내 배가(endoreduplication)를 나타내는

것은 배수체로 분류하나 다수 관찰되는 경우는 그 점을 명시해 둔다.

⑦ 통계학적 검정방법 및 자료의 평가

Ⅰ. 음성대조군과 처리군의 비교: 카이제곱검정 또는 Fisher's exact test

Ⅱ. 음성대조군과 양성대조군의 비교: 카이제곱검정 또는 Fisher's exact test

Ⅲ. 용량상관성의 평가: 경향검정 또는 선형회귀분석을 통해 용량상관성을 평가한

다.

Ⅳ. 시험물질 처리군에 있어서 염색체이상을 가진 중기상의 빈도가 음성대조군에

비해 확실히 증가하고 그 작용에 재현성이 있으며, 용량의존성을 나타낼 경우

양성으로 판정한다.

3) 설치류 조혈세포를 이용한 소핵시험

① 시험방법의 기준


‘화학물질 유해성시험연구기관의 지정 등에 관한 규정’ 및 OECD Guidelines for the

Testing of Chemicals(No. 474)에 준하여 실시한다.

② 대조물질

명칭 : 1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(DPPC)


CAS No. : 63-89-8

분자량 : 734.04

입수일 : 2009년 04월 06일

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입수량 : 100 mg


등급 : ≥99 %



명 칭 : Mitomycin C(MMC)

제조(로트)번호 : 037k0710

CAS No. : 50-07-7

분자량 : 334.3

입수일 : 2008년 05월 27일

입수량 : 2 mg

특성 : 수용성



③ 시험계

Ⅰ. 종 및 계통: ICR 계통의 특정병원균 부재(SPF) 마우스

Ⅱ. 공급원: (주) 나라바이오텍(서울시 강남구 청담동 71-22 나라B/D)

Ⅲ. 시험계의 선택이유

본 시험에 사용하는 마우스는 독성시험에 적당한 실험동물로서 소핵시험에 널

리 사용되고 있다. 또한 본 계통의 마우스는 풍부한 시험 기초 자료가 축적되어

있어서, 시험결과의 해석 및 평가에 이러한 자료를 이용할 수 있기 때문이다.

Ⅳ. 입수 시 동물 수: 예비시험 시 수컷 33 마리

본시험 시 수컷 33 마리

Ⅴ. 입수 시 주령: 생후 7 주령

Ⅵ. 검역 및 순화기간

입수 후 7일간(순화기간 중 일반증상을 관찰하여 건강한 동물만을 시험에 제

공)

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Ⅶ. 투여개시 시 주령: 8 주령

Ⅷ. 사용 동물 수: 예비시험 시 수컷 30 마리

본시험 시 수컷 30 마리

Ⅸ. 군분리법

투여개시 전일에 체중을 측정하고 순위화한 체중을 이용한 무작위법에 의하여

군분리 한다.

Ⅹ. 식별법

개체식별은 미부표시법 및 사육상자별 개체식별카드 표시법을 이용한다. 사용

동물실의 입구에는 시험번호, 시험제목, 동물실 사용기간, 시험책임자명, 시험자

명을 기재한 동물실 사용기록지를 첨부한다.

Ⅺ. 잔여동물의 처치

안락사 처리한다.

④ 동물실 및 사육조건

Ⅰ. 동물실: SPF 사육구역 4 호실

Ⅱ. 온습도 범위: 온도 22 ± 3 ℃, 상대습도 50 ± 20 %

Ⅲ. 환기횟수: 10～15 회/hr,

Ⅳ. 명암 cycle: 형광등조명 12 hrs(08:00 점등～20:00 소등)

Ⅴ. 조도: 150～300 Lux

Ⅵ. 사육상자의 종류(크기)

순화, 검역, 투여 및 관찰기간 중 폴리카보네이트 케이지(200W×260L×130H

mm)에 수용한다.

Ⅶ. 사육상자 당 동물 수

순화기간, 투여기간 및 투여 후의 관찰기간 모두 3 마리 이하

Ⅷ. 사육상자 교체주기

군 분리시

⑤ 사료

Ⅰ. 종류 : 실험동물용 고형사료

- 33 -

Ⅱ. 공급원 : 폴라스인터내셔날

Ⅲ. 생산자 : Harlan

Ⅳ. 급여법 : 급이기를 이용하여 자유섭취 시킨다.

Ⅴ. 오염물질 분석

사료생산자로부터 공급된 자료를 이용한다. 만일 이러한 자료가 없으면 안전성

평가본부의 사료 및 물중의 오염물질 검사에 관한 SOP에 따라 실시한다.

⑥ 물

Ⅰ. 종류 : 1차 정제수(RO수)

Ⅱ. 급수방법 : 수돗물을 미세여과 장치와 자외선 살균장치를 통해 살균하여 물병을

이용하여 자유섭취 시킨다.

Ⅲ. 오염물질의 분석

국가공인검사기관에서 검사한 자료를 참조한다.

⑦ 시험방법

Ⅰ. 투여경로: 복강

Ⅱ. 선택이유: 소핵시험의 일반적인 투여경로인 복강투여를 선택하였다.

Ⅲ. 투여방법: 투여에는 1 ㎖ 용량의 주사기를 사용하여 복강 투여한다.

Ⅳ. 투여시각: 투여당일 오전 중에 투여함을 원칙으로 한다.

Ⅴ. 투여액량: 체중 측정일에 측정한 체중을 기준으로 10 ㎖/㎏으로 투여액량

을 계산한다.

Ⅵ. 투여횟수 및 투여기간: 2 회/일

Ⅰ. 예비시험

용매대조군 1군, 투여군 3군 및 양성대조군 1군으로 구성한 5군에 대해 각 군당

3 마리의 동물을 사용하여 시험동물의 간이급성독성과 골수에서의 세포독성시험

을 실시한다. 표본 제작 시기에 따라 24, 48 시간 군을 두어 실시한다.

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Ⅱ. 본시험

예비시험에서 설정된 농도에 따라 용매대조군 1군, 투여군 3군 및 양성대조군 1

군으로 군을 구성하고 5군에 대해 각 군당 6 마리의 동물로 구성한다. 예비시험

에서의 결과를 바탕으로 표본제작시기를 결정한다.

군 성별동물수(마리)

동물번호투여액량(ml/㎏)

G1 (V.C) Male 6 1～6 10

G2 Male 6 7～12 10

G3 Male 6 13～18 10

G4 Male 6 19～24 10

G5 (P.C) Male 6 25～30 10

G1(V.C): Vehicle Control, G5(P.C): Positive Control G2～G4: 시험물질 투여군

Ⅲ. 용매, 투여량 설정

용해성시험 결과 본 시험물질은 DPPC 용액에 분산시켜 사용한다. 의뢰자가 제

공한 정보를 바탕으로 예비시험의 투여농도를 결정한다. 예비시험 결과를 참고

하여 본시험에 적용한다.

⑧ 단계별 시험방법

Ⅰ. 순서

예비시험의 결과를 토대로 투여농도를 결정하여 1 회 시험물질을 투여하고, 투여

후 24, 48 시간에 도살하여 대퇴골을 절취한다. Fetal bovine serum(FBS)을 사용

하여 대퇴골에서 골수세포를 추출하고 세포의 도말표본을 만들어 고정․염색한

다. 광학현미경 또는 형광현미경을 사용하여 표본을 관찰하여 다염성 적혈구 중

의 소핵출현빈도 및 전체 적혈구중의 다염성 적혈구의 비율을 구한다.

Ⅱ. 표본제작시기

표본제작시기는 예비시험의 결과를 토대로 시험물질 투여 후 24～48 시간 후로

한다.

Ⅲ. 표본의 제작

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부검실로 동물을 옮긴 후 경추탈골하여 되도록 혈액이 뭍지 않게 하여 대퇴

골을 적출한다. FBS를 사용하여 골수세포를 원심관에 씻어 모은다. 1000 rpm에

서 5 분간 원심분리 시켜 상등액을 버리고 소량의 혈청으로 세포를 현탁 시킨

다. 세포현탁액을 도말하여 실온에서 건조시킨 후 메탄올로 5 분간 고정한다.

Ⅳ. 표본의 염색

메탄올로 고정된 표본을 40 ㎍/ml acridine orange액으로 점적하고 cover

glass를 덮어서 형광염색하거나, 4 % Giemsa 염색액에 염색한다.

Ⅴ. 표본의 관찰

표본의 관찰은 맹검법(blind method)으로 하되 400배 이상 배율에서 형광현미경

또는 광학현미경으로 관찰한다.

- 다염성 적혈구의 구별

Acridine orange 염색표본을 형광현미경으로서 관찰할 경우는 관찰 시야에서 핵

이 없이 적색 형광 빛을 보이는 것을 다염성 적혈구로 하며, Giemsa 염색하여

광학 현미경으로 관찰할 경우 보라색을 보이는 것을 다염성 적혈구로 한다.

- 정염성 적혈구의 구별

형광 염색한 표본은 관찰시야에서 다염성 적혈구의 크기로 형광 빛을 전혀 나

타내지 않고 음영으로만 구분되는 것으로 하며, Giemsa 염색한 표본은 분홍빛

의 것으로 한다.

- 소핵의 판정기준

크 기: 제일 큰 것은 적혈구 직경의 1/2로, 제일 작은 것은 식별이 가능

한 것까지로 한다.

형 태: 주로 원형이나 기타 도너츠형, 반원형 등의 형태의 것을 포함시

킨다.

색 깔: 근접한 유핵 세포의 핵과 동일한 빛을 띠는 것으로 한다.

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세포도말상태가 좋은 곳을 선택하여 다염성 적혈구(PCE) 2000개에서 소핵을 갖

는 세포를 계수한다. 또 전체 적혈구(다염성 적혈구 및 정염성 적혈구) 200개를

관찰하여 그 중 다염성 적혈구의 비율을 계측한다.

1) 음성대조군과 처리군의 비교: ANOVA test

2) 1)에서 p

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율 분석원리는 살아있는 세포에서는 전자전달계에 존재하는 탈수소효소(dehydrogenase)인

succinate-tetrazolium reductase에 의하여 외부에서 첨가한 tetrazolium salts(MTT)를 분해

하여 formazan이라는 발색물질을 생성할 수 있다. 따라서 formazan에 의한 발색 강도 증감

은 살아있는 세포 수와 직선적인 상관관계가 있다는 것을 의미한다.

① cell suspension을 haemacytometer를 사용하여 counting한 다음, 96 well plate의 각

well에 원하는 적정농도의 cell 부유액 180 ul를 넣는다.

- Blank: 배지 180 ul 와 PBS 20 ul.

- Control: 세포부유액 180 ul 와 PBS 20 ul

② 측정하고자 하는 시료는 PBS에 녹인 후 농도별로 20 ul씩 각 well에 첨가한다.

③ 24 시간 및 48 시간 incubation한다.

④ 시료를 제거하고, 각 well에 MTT solution을 100 ul씩 첨가한다.

⑤ 3시간동안 incubation시킨 후 MTT 희석액을 조심스럽게 제거한다.

⑥ 각 well에 100 ul의 DMSO를 첨가하여 15-20 분간 plate shaker로 흔들어 준다.

⑦ ELISA reader를 사용하여 wave length 570 nm에서 흡광도를 측정한다.

3) Total RNA 추출

MWCNTs 및 석면이 처리된 세포 및 무처치 세포에서 total RNA를 추출하기 위하여

RNase-free DNase I 과 TRIZOL reagent(Life Technologies, Inc.)를 사용하였다. 6 시간 및

24 시간대에서 high MWCNT와 석면을 처리하고 total RNA를 추출하였으며, quality

control을 실행하여 DNA microarray 분석에 적합한 순도인지 아닌지를 확인하였다.

Total RNA의 quality 검사는 Agilent 사(Santa Clara, CA, USA)의 2100 Bioanalyzer System

을 이용하여 측정하였다.

4) DNA microarray 분석

① 무처치 세포 및 MWCNT 및 석면을 각각 처리한 세포로부터 추출한 total RNA에 대하

여 Agilent's Low RNA Input Linear Amplification kit(Agilent Technology, USA)를 사

용하여 target cRNA probes를 합성하고 hybridization을 수행하였다. 즉, 1 ug의 total

RNA에 T7 promoter primer를 혼합하여 65 ℃에서 10 분간 반응시킨 후, 준비한 cDNA

master mix(5X first strand buffer, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP mix, RNase-Out 및

MMLV-RT)를 반응액에 첨가하여 40 ℃에서 2 시간 반응시키고 실온에서 식힌 후 65

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℃에서 15 분간 정치하여 dsDNA 합성반응을 정지하였다.

② 여기에 Transcription master mix(4X Transcription buffer, 0.1 M DTT, NTP mix, 50 %

PEG, RNase-Out, Inorganic pyrophosphatase, T7-RNA polymerase, and Cyanine

3/5-CTP)를 첨가하여 40 ℃에서 2 시간 반응하여 dsDNA의 전사반응를 유도하고

cyanine 3(Cy3)는 무처치군에 표지하고 cyanine 5(Cy5)는 MWCNT 또는 석면처리군

에 표지하면서 cRNA를 증폭하였다.

③ 증폭시킨 표지 cRNA를 cRNA Cleanup Module(Agilent Technology)를 사용하여 정

제한 후 분광형광광도계(ND-1000 spectrophotometer, NanoDrop Technologies, Inc.,

Wilmington, DE)에서 표지 cRNA target 함량을 정량하였다. 일정양의 표지 cRNA

target에 10X blocking agent와 25X fragmentation buffer를 첨가하여 60 ℃에서 30 분간

반응하여 cRNA target의 fragmentation을 유도하였다.

④ Fragmented cRNA에 2X hybridization buffer를 참가한 후 assembled Agilent's Whole

Human Genome Oligo Microarray(44K)에 점적한 후 65 oC에서 17 시간동안 Agilent

Hybridization oven(Agilent Technology, USA)에서 hybridization반응을 유도하였다.

반응이 완료된 후 세정 buffer(Agilent Technology, USA)를 사용하여 hybridized

microarray를 세정하였다.

Figure 3-5. The diagram of microarray analysis.

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5) Data 분석(Mining)

Agilent's DNA microarrayscanner 및 Feature Extraction Software(Agilent

Technology, Palo Alto, CA)를 이용하여 microarray hybridization 이미지를 받은 후 이

미지를 분석하였다. 모든 spot의 형광도는 GeneSpringGX 7.3(Agilent Technology,

USA)에서 normalization을 실시하여 이 값을 사용하여 유의한 수준의 변화를 보이는

유전자를 선발하였다. Nomalized ratio의 평균값은 처리군의 normalized signal

intensity 평균값을 대조군의 normalized signal intensity의 평균값으로 나누어 산출하였

다. 이후 GeneSpringGX 7.3에서 제공하는 Gene OntologyTM Consortium

(http://www.geneontology.org/index.shtml)을 사용하여 유의한 변화를 보이는 유전

자의 functional annotation을 실시하였다. 유전체 연구를 위한 통합분석 솔루션(integr

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국 립 환 경 과 학 원webbook.me.go.kr/DLi-File/NIER/06/013/5514970.pdf1) 독성 평가를 위한 MWCNTs 정제방법 개발과 물리화학적 특성분석 101 2) 나노물질의