465

E MOLEKYYLIBIOLOGIAA

466

E1 Geneettinen koodi – elämän yhteinen kieliLatvala Juho & Seppälä MikaSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto12.9.2009Tarkastaja: Salla Kangas

TiivistelmäGeneettisellä kielellä DNA:han tallennettu tieto kopioituu mRNA:ksi geeniaktiivisuuden ohjaamana. Emäsjär-jestys kopioituu emäspariperiaatteen (A-T ja C-G) perusteella lähetti-, eli mRNA:han, joka varsinaisesti ohjaa valkuaisainesynteesiä eli translaatiota. RNA:ssa on tymiinin tilalla pyrimidiiniemäs urasiili U, jolloin esimer-kiksi DNA:n emäsjärjestys GAA-TAC koodaa RNA:n emäsjärjestystä CUU-AUG. Syntetisoitunutta mRNA:ta usein vielä prosessoidaan (intronien poisto), jonka jälkeen se ohjaa translaatiossa polypeptidiketjun syntymistä ribosomeilla. Lähetti-RNA:ta luetaan kolmen emäksen mittaisissa kodoneissa, joita neljästä emäksestä voidaan muodostaa 64 erilaista. Tästä johtuen moni kodoni koodaa samaa aminohappoa 20 erilaisen aminohapon jou-kosta. Lähetti-RNA:n luenta alkaa aloituskodonista (AUG tai harvoin GUG) ja päättyy lopetuskoodiin (UAA, UAG tai UGA).

JohdantoGeneettinen koodi on elävien solujen yhteinen kieli. Geneettisessä kielessä on neljä kirjainta eli DNA:n neljä typpiemästä. DNA:ssa olevat emäkset ovat pyrimidiinit tymiini T ja sytosiini C sekä puriinit adeniini A ja guaniini G. Sanat muodostuvat kolmen emäksen yhdistelmästä. Kolme emästä (kodoni) on kuin sana, joka trans-laatiossa määrittelee tietyn aminohapon. Sanat muodostavat lauseita, jotka sisältävät kaikkien yksilön valkuaisaineiden rakennusohjeen. Yhden geenin kodonien järjestys määrää valkuaisaineen aminohappojärjestyksen (Bjålie ym. 2007).

TranskriptioTranskriptiolla tarkoitetaan mRNA-ketjun muo-dostumista DNA:n nukleotidiemästen järjes-tyksen perusteella (kuva 1). Alkuvaiheen kak-soiskierteisen DNA:n heikot vuorovaikutukset hajoavat helikaasi- entsyymin vaikutuksesta ja DNA:n kaksoiskierre aukeaa. Auenneeseen DNA- ketjuun liittyy RNA- polymeraasient-syymi, entsyymi lukee vain sitä kaksoiskierteen ketjua, jossa se on tunnistanut geenin pääasial-lisen säätelyalueen, promoottorin. Yleisin kiin-nittymiskohta on emässekvenssi-TATAA. RNA-synteesissä mallina toimivaa templaattiketjua kutsutaan usein antisense-ketjuksi ja sille vas-takkainen sense- DNA- ketju sisältää siis saman sekvenssin kuin syntyvä RNA-ketju, lukuun ot-tamatta urasiilin tilalla olevaa tymiiniä.

DNA:n nukleotidiemäksiin liittyy vapaita ribo-nukleotidejä, jotka em. entsyymi liittää toisiinsa emäspariperiaatteen mukaan fosforidiesterisi-doksin ja muodostuu mRNA-ketju. RNA-ketju syntetisoituu aina 5´-3´ -suunnassa eli RNA-polymeraasi lukee DNA:n malliketjun emäsjär-jestystä 3´-5´ -suunnassa. Kopiointivauhti on noin 50 emäsparia sekunnissa ja kopiointi aloite-taan useasta kohti samaan aikaa. Järjestelmä on tarkka, sillä keskimäärin vain yksi kymmenestä miljardista emäsparista kopioituu väärin. Tämän mahdollistavat useat eri virheenkorjausmeka-nismit. RNA-polymeraasientsyymi aloittaa toi-mintansa promoottorista ja inaktivoituu kohda-tessaan lopetuskoodin, jolloin mRNA vapautuu DNA:sta. Syntyvässä mRNA:ssa toinen ketju on siis aina peräisin alkuperäisestä DNA:sta. Syn-tynyt mRNA siirtyy tumasta solun sytoplasman vapaille ribosomeille, jossa alkaa proteiinisyn-teesi eli translaatio mRNA:n ohjeiden mukaan. (Vuorio 1998)

467

Kuva 1: Kopioituminen. DNA-rihmat vapautuvat (1). RNA-polymeraasi sitoutuu siihen DNA-rihmaan, jossa on promoottori, ja kulkee rihmaa pitkin promoottorista geenin loppuun asti (2). Samalla, kun RNA-polymeraasi etenee DNA-rihmassa, vapaita ribonukleotideja sitoutuu DNA-rihman vastaaviin nukleo-tideihin. Tämän jälkeen ribonukleotidit liittyvät yhteen mRNA:ksi (3). Jokaista DNA:n emäskolmikkoa kohti mRNA:han muodostuu kodoni, jonka emäkset ovat DNA:n emästen vastinpareja (Kuva julkaistu Kari C. Toverudin luvalla, Bjålie ym. 2007).

Eukaryoottisolun vastamuodostunut mRNA ei ole vielä käyttövalmis. Esiaste-RNA:ssa vain 75–90% on aminohappoja koodaavia nukleo-tidijaksoja, eksoneita. Koodamattomat jaksot (intronit) leikkautuvat pois ja jäljelle jäävät ek-sonit liittyvät yhteen tumassa tapahtuvan silmu-koinnin avulla (splicing). Silmukointi mahdol-listaa sen, että yhdestä geenistä saadaan useita erilasisia proteiineja. Prokaryoottisoluilla (esim. bakteereilla) tätä esiaste-RNA:n prosessointia ei tapahdu (Vuorio 1998).

TranslaatioSilmukoinnin jälkeen tapahtuu translaatio joko soluliman vapaissa ribosomeissa tai endoplas-makalvostoon kiinnittyneissä ribosomeissa. En-simmäisessä vaihtoehdossa proteiini jää joko solulimaan tai kulkeutuu tumaan. Jälkimmäi-sessä vaihtoehdossa proteiineja tuotetaan joko eritettäväksi solusta ulos tai kalvoproteiineksi. Translaatiossa mRNA:n emäsjärjestys muu-tetaan proteiinien aminohappojärjestykseksi. Kolmen peräkkäisen emäksen jakso mRNA:ssa, kodoni, määrää proteiinisynteesissä käytettävät aminohapot (kuva 2). Neljästä emäksestä saa-daan 64 erilaista kolmen emäksen yhdistelmää eli kodonia. Koska aminohappoja on vain 20, niin useampi kodoni vastaa samaa aminohappoa geneettisessä koodissa. Kahdeksan aminohapon tapauksessa kodonin kaksi ensimmäistä emästä määrää syntyvän aminohapon eikä kolmannella emäksellä ole merkitystä. Tätä kutsutaan kol-mannen emäksen huojunnaksi (wobble). Muis-sa tapauksissa kolmannen emäksen merkitys on suurempi. Yksi kodoneista on niin kutsuttu aloi-tuskodoni, joka määrää lukukehyksen ja on siten olennaisen tärkeä. Lopetuskodoneja on kolme, jotka määrittävät transkription alku- ja loppu-kohdan. (Hiltunen ym. 2007)

468

Kuva 2: Geneettinen koodi. (Saatavissa http://www.de.wikipedia.org/wiki/Datei:Aminoacids_table.svg)

Geeninen luenta ribosomeillaTranslaatiossa mRNA- ketjuun liittyy ribosomi. Ribosomista on erotettavissa iso ja pieni alayk-sikkö. Pienempi alayksikkö sitoutuu mRNA-ketjuun sekä ohjaa antikodonin (tRNA) sitoutu-mista kodoniin. Isompi yksikkö jaetaan edelleen P, A ja E paikkoihin, jotka yhdessä katalysoivat peptidisidosten muodostumista syntyvään poly-peptidiketjuun. Aloituskodonin mukainen tRNA sitoutuu aminohappoineen ison alayksikön P paikkaan. Translaatio etenee seuraavan tRNA:n tuodessa aminohappoaan A paikkaan. A ja P pai-koissa olevien t-RNA-molekyylien aminohappo-jen välille syntyy peptidisidos. Peptidisidoksen muodostumista katalysoi isossa alayksikössä si-jaitseva peptidyltransferaasi. Sidoksen muodos-tuttua ribosomin muoto muuttuu, jolloin se siir-tyy kodonin verran eteenpäin pitkin mRNA:ta. A paikan tRNA siirtyy P paikkaan, josta edelli-nen aminohapponsa menettänyt tRNA poistuu E-paikan kautta. Näin edeten aminohappoketju pitenee, kunnes ribosomi kohtaa jonkin kolmes-ta lopetuskodonista (UAA, UAG tai UGA). Täl-löin translaatiovaihe on ohi. Seuraavaksi prote-iini laskostuu kaitsijaproteiinien eli chaperonien avulla. Siihen liitetään endoplasmakalvostossa ja Golgin laitteessa hiilihydraattiosia ikään kuin osoitelapuiksi, jotta se kulkeutuu oikeaan paik-kaan elimistössä. (Metsikkö 2009, Hiltunen ym. 2007)

Mitokondriaalinen DNAMitokondrioiden DNA käsittää noin 1%:n solun kokonais-DNA:sta, ja se koodittaa eräitä solu-hengityksen entsyymiyhdisteiden alayksiköitä sekä siirtäjä- ja ribosomaalisen RNA:n muotoja. Mitokondrioiden geenit periytyvät lapselle vain äidiltä. Tuman DNA:sta poiketen mitokondri-aalinen DNA (mtDNA) on replikoituva rengas-molekyyli. Myöskin geneettinen koodi poikkeaa tuman DNA:n koodista (Kuva 3): emäskolmikko AUA koodittaa isoleusiinin sijasta metioniinia, eivätkä AGA ja AGG koodita arginiina vaan toi-mivat lopetussignaalina (Savontaus 1998).

Kuva 3: Mitokondrioiden koodi. Mitokondrioiden geneettinen koodi poikkeaa tuman ns. universaa-lisesta koodista siten, että neljä kodonia 64:sta koodaa eri aminohappoa kuin eukaryoottien solu-limassa (http://www.solunetti.fi).

MutaatiostaGeneettisen koodin luenta voi häiriintyä monella eri tavalla, joka voi vaikuttaa syntyvän polypep-tidiketjun aminohappojärjestykseen. Nonsense-mutaatiossa yhden nukleotidin vaihtumisen seurauksena polypeptidikejun syntetisoiminen päättyy liian aikaisin eli ketjusta tulee vajaamit-tainen. Missense-mutaatiossa nukleotidin vaih-tuminen muuttaa kodonia, jolloin aminohappo voi vaihtua. Mikäli kodoni koodaa mutaation jälkeenkin samaa aminohappoa, ei mutaatio ole haitallinen. Lukukehystä siirtävät mutaatiot häiritsevät merkittävästi geenin luentaa. Piste-mutaatioista (yksi nukleotidi katoaa, liittyy tai muuttuu) lukukehystä siirtävät yhden nukleo-tidin lisäys (frameshift by addition) tai yhden nukleotidin poisto (frameshift by deletion) vai-kuttavat merkittävämmin geenin luentaan. Osa kromosomimutaatioista voi myös siirtää prote-iinia koodaavan sekvenssin lukukehystä. Luku-kehystä muuttavan mutaation myötä jokainen mutaatiota seuraava koodi vaihtuu ja proteiinista tulee lähes aina toimimaton (Lodish ym. 2000).

469

Lähteet

Bjålie Jan, Haug Egil, Sand Olav, Sjaastad Öystein, Toverud Kari: Ihminen, anatomia ja fysiologia WSOY Helsinki 2007.

Hiltunen E. Galenos ihmiselimistö kohtaa ympäristön 8.painos WSOY Oppimateriaalit Oy 2007 s. 46.

Lodish H, Berg A, Zipursky S, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J. Molecular Cell Biology, 4. painos W.H. Freeman and co. NY 2000 s. 257–258.

Metsikkö K. Luentomateriaali: Ribosomit ja proteiinisynteesi. Oulun yliopisto, biolääketieteen laitos 2009 s.1–2.

Savontaus M-L. Perinnöllisyyslääketiede 1.painos Duodecim 1998 s. 129–130

Solunetti. Solubiologia, mitokondrion perimä (kuva3). (Luettu: 1.9.2009). (saatavissa osoitteesta http://www.solunetti.fi)

Vuorio E. Perinnöllisyyslääketiede 1.painos Duodecim 1998 s. 24–26

Wikipedia: Die Codesonne (kuva 2). (Luettu: 1.9.2009).(saatavissa osoitteesta http://www.de.wikipedia.org/wiki/

Datei:Aminoacids_table.svg)

470

E2 DNA:n kahdentuminen – solun jakautumisen edellytysSorsa Outi & Valvisto AnttiSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto09.09.2009Tarkastaja: Salla Kangas

TiivistelmäDNA:n kahdentuminen alkaa Pre-RC:n muodostumisella aloituskohtaan DNA-juostetta. DNA-primaasi liit-tää juosteeseen alukkeen, josta DNA-polymeraasit voivat aloittaa DNA:n kopioimisen liittämällä nukleotideja juosteeksi. Helikaasit, topoisomeraasit ja SBBt pitävät kaksoiskierrettä auki. DNA:n kopioituminen on tarkoin säädeltyä, ja syklissä on useita tarkastuspisteitä.

JohdantoDNA:n on kahdennuttava, jotta solu voisi ja-kautua. Solusyklin (kuva 1) interfaasivaiheissa (G1,S ja G2) solu kasvaa, tuottaa aktiivises-ti proteiineja sekä monistaa soluelimiä. DNA kahdentuu S-vaiheessa ja M-vaiheessa tapahtuu mitoosi. Eukaryooteilla DNA:n kopioituminen tapahtuu tumassa. Kahdentumisen alkamiseen vaikuttavat monet tekijät, kuten solun saamat viestit ulkopuolelta, solun koko, sekä mahdolli-set virheet DNA:ssa (http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/interfaasi/, http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/solusykli_1/).

Kuva 1. Solusykli jaetaan neljään vaiheeseen. Kuvassa myös tarkastuspisteet (checkpoint) (mukailtu: http://herb4cancer.files.wordpress.com/2007/11/cell-cycle2.jpg).

DNA:n replikaatio

Aloituksen säätely

DNA:n kopioinnin aloituskohdat määräyty-vät solusyklin G1 vaiheessa (kuva 1). Aloitus-kohtaan muodostuu pre-replicative complex (pre-RC). Pre-RC koostuu ”origin recognition complex”:sta (ORC), ja proteiineista CDC6, CDT1 ja MCM 2–7 ja se tunnistaa kiinnitty-miskohtansa siitä, että siinä on paljon adeniini-tymiini pareja, jotka ovat sytosiini-guaniini paria heikompia. Aloituskohtia tarvitaan useita, jotta aitotumaisen solun suuri DNA määrä saadaan kopioitua nopeasti. Aloituskohtien täytyy syntyä oikeisiin kohtiin vain kerran, ettei DNA:ta ko-pioitaisi kahdesti. Tästä pitää huolen mm. CDK (cyklin-dependet kinase), jonka vaikutus estää pre-RC:n muodostumisen myöhemmissä vai-heissa. G1 vaiheen alussa CDK ei vielä vaikuta (Ballabeni ym. 2004, Bell & Dutta 2002).

Pre-RC muodostuminen (kuva 2) alkaa kuu-desta proteiinista koostuvan ORC:n sitoutuessa aloituskohtaan. Tämän jälkeen entsyymit CDC6 ja CDT1 liittävät MCM kompleksin ORC:iin. MCM koostuu proteiineista (MCM2–7). Lopuk-si kinaasit CDK ja DDK aktivoivat kompleksin ja solu voi siirtyä S-vaiheeseen. Samalla CDK estää pre-RC:n uudelleen kiinnityksen (Ballabe-ni ym. 2004, Bell & Dutta 2002).

471

Kuva 2: Pre-RC muodostuminen. ORC tunnistaa aloituskohdan ja kiinnittyy siihen, jonka jälkeen CDC6 ja CDT1 kiinnittävät MCM 2–7:n. Lopulta CDK ja DDK aktivoivat kompleksin (mukailtu: Bell & Dutta 2002: DNA Replication in Eucaryotic Cells).

DNA-juosteen pidentymisvaihe

Helikaasi-entsyymit alkavat avata kaksoisjuos-tetta kohdasta, johon pre-RC on muodostunut, rikkomalla nukleiinihappojen välisiä vetysi-doksia. Joka kohdasta syntyy aina kaksi rep-likaatiohaarukkaa, jotka etenevät eri suuntiin. Topoisomeraasit suoristavat DNA- kierrettä ja stabilisoivat replikaatiokompleksia. Single-brand binding (SBB)- proteiinit vastaavat siitä, ettei erotettuihin juosteisiin synny sekundaarista rakennetta (Watson ym. 2004).

DNAn replikoituminen on semikonservatiivista eli uudesta kaksoisjuosteesta toinen juoste on peräisin alkuperäisestä kaksoiskierteestä (http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/dna-n_semi-konservatiivisuus/2/). Juosteiden replikaatiosta eli kopioimisesta huolehtivat DNA-polymeraa-sit. Jotta DNA-polymeraasit voisivat aloittaa toimintansa, tarvitaan RNA-aluke (primer). Se on lyhyt RNA-pätkä, jonka DNA-primaasi α (Pol- α) liittää templaattijuosteeseen. DNA-po-lymeraasi voi aloittaa nukleotidien liittämisen alukkeen 3’-pään OH-ryhmästä. Polymeraasit toimivat vain 5’-3’-suunnassa. Clamp-proteiinit sitoutuvat polymeraaseihin ja auttavat sekä no-peuttavat niiden toimintaa (Watson ym. 2004).

Replikaatiohaarukassa (kuva 3) on kaksi juostet-ta, joista toista kutsutaan johtavaksi (leading) ja toista viivästyneeksi (lagging) juosteeksi. Viiväs-tynyttä juostetta on replikoitava 3’-5’-suuntaan. Koska DNA-polymeraasit eivät voi toimia siihen suuntaan, DNA-primaasi muodostaa juosteeseen alukkeita lyhyin välimatkoin ja viivästyneessä juosteessa DNA-polymeraasi ε (Pol-ε) aloittaa niistä lyhyiden DNA-pätkien rakentamisen ta-kautuvasti helikaasin etenemissuuntaan nähden. Näitä pätkiä kutsutaan Okazakin fragmenteiksi. DNA-ligaasi seuraa polymeraasia ja liittää frag-mentit toisiinsa. Johtavassa juosteessa nukleoti-deja liittää toisiinsa DNA-polymeraasi δ (Pol-δ) (Watson ym. 2004).

Kun polymeraasi on aloittanut nukleotidien liittämisen, nukleaasi (Rnase H) poistaa RNA-alukkeen. Polymeraasi palaa tyhjään kohtaan myöhemmin ja lisää siihen DNA-nukleotideja, jotka DNA-ligaasi liittää juosteeseen. Koska replikaatiohaarukoita syntyy moneen eri kohtaan Dna-juosteessa, replikaatio loppuu kun haarukat törmäävät (Watson ym. 2004).

Prokaryooteissa ja mitokondrioissa DNA-rep-likaatioprosessi eroaa eukaryooteista, mutta sekin on semikonservatiivista sekä tapahtuu 5’-3’-suuntaan (Watson ym. 2004).

472

Kuva 3: DNA:n replikaatio. Helikaasi avaa juostetta ja topoisomeraasi sekä SSB:t estävät sen kiertymis-tä. Primaasi liittää avattuun juosteeseen alukkeen, josta DNA-polymeraasi aloittaa uusien nukleotidien liitttämisen 5’-3’-suunnassa. Nukleaasi poistaa alukkeet ja ligaasi liittää uudet DNA-fragmentit juosteek-si (mukailtu: http://en.wikipedia.org/wiki/File:DNA_replication_en.svg).

Telomeerit

Eukaryooteilla kromosomien päät lyhenevät jokaisen solunjakautumisen yhteydessä. Lyhen-tyviä alueita kutsutaan telomeereiksi ja ne eivät koodaa mitään geeniä. Lineaarisen DNAn takia osa templaatista jää replikoitumatta kromosomin päissä Selkärankaisilla telomeerit koostuvat 5’-TTAGGG-3’-toistoista. Kun telomeerit lop-puvat, solu ei enää pysty replikaatioon. Ituradan soluissa telomeraasi-entsyymi liittää telomeeri-toistoja kromosomien päihin (http://fi.wikipedia.org/wiki/Telomeeri).

DNA:n kahdentumisessa tapahtuvat virheet ja niiden korjausmekanismit

Tarkistuspisteet

Solusyklin eri vaiheissa on tarkastuspisteitä (cell cycle checkpoints) (kuva 1), joissa DNA tarkastetaan virheiden varalta. Virheet pyritään korjaamaan heti, ja jos tämä ei onnistu, solusyk-li pysähtyy kunnes virheet saadaan korjatuksi. Jos virhettä ei voida korjata, solu tuhoaa itsensä apoptoosilla. Solun tärkeimpinä tarkastuspistei-nä toimivat;

G1/S, joka määrää siirtyyko solu lepotilaan (G0), vai synteesiin (S).

473

Intra-S-tarkistuspiste, joka suoritetaan S vaiheen aikana, jos replikaatiohaarukka pysähtyy. Tämä tapahtuu, kun havaitaan virhe DNA:ssa, tai kun deoksinukleotideja on liian vähän DNA- poly-meraasin toiminnan jatkamiseen. Myös kaksois-säiekatkos ja yksisäikeisen DNA- juosteen kier-tyminen voivat aiheuttaa replikaation keskeyty-misen (Goodman 2007).

G2/M- tarkistuspiste, jossa kopioitu DNA tarkis-tetaan ja virheitä korjataan. Jos havaitut virheet saadaan korjatuksi, solu siirtyy mitoosiin (Good-man 2007).

Korjausmekanismit

Replikatiivinen DNA-synteesi on hyvin tarkkaa ja virhetiheys on vain n.10–10 (Berg ym. 2002). Joskus virheitä kuitenkin sattuu ja tietyt sairau-det lisäävät virheiden todennäköisyyttä. DNA-virheet voivat aiheuttaa mm. virheellisten pro-teiinien tuoton, tai muutoksen tietyn proteiinin tuoton määrässä. Vakavat mutaatiot voivat johtaa apoptoosiin tai erilaisiin tauteihin, esimerkkeinä erilaiset syövät, sekä yhden aminohapon muu-toksesta aiheutuva sirppisoluanemia (Silverstein ym. 2008).

MMR eli mismatch-korjauskoneisto tunnistaa DNAhan liitetyt emäspariutumattomat nukleo-tidit ja leikkaa palan syntetisoidusta juostees-ta. Tämän jälkeen DNA-polymeraasi rakentaa juosteen uudelleen kokonaiseksi. Muutatiot MMR-geeneissä johtavat replikaatiovirheiden lisääntymisen, mikä ilmenee mm. perinnöllise-nä paksusuolensyöpänä (HNPCC) (Knowles & Selby 2005).

Muita korjausmekanismeja ovat mm. emäk-senpoistokorjaus ja nukleotidinpoistokorjaus. Kaksoissäiekatkosta varten solulla on eri korja-usmenetelmiä mm. homologiseen rekombinaati-oon perustuva (HR) menetelmä, joka hyödyntää ehjää sisarkromosomia, sekä ei-homologinen päiden yhteenliittäminen (NHEJ) (Knowles & Selby 2005).

Lähteet

Ballabeni A, Melixetian M, Zamponi R, Masiero L, Marinoni F, & Helin K. Human Geminin promotes pre-RC formation and DNA replication by stabilizing CDT1 in mitosis. EMBO J. 2004; 4; 23(15): 31223132. Saatavissa: http://www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=514931 (luettu 8.9.09.).

Bell S & Dutta A. DNA Replication in Eucaryotic Cells. Annu. Rev. Biochem, 2002, 71:336, s.334–366, Saatavisa: http://arjournals.annualreviews.org/doi/pdf/10.1146/annurev.biochem.71.110601.135425 (luettu 8.9.09)

Berg J, Tymoczko J & Stryer L. Biochemistry, 5th edition, Michelle Julet, 2002, Saatavissa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=stryer.chapter.3740 (luettu 9.9.09)

Goodman S. Medical cell biology 3. edition, Academic Press, 2007, s. 285–286

Knowles M & Selby P. Introduction to the cellural and molecular biology of cancer, 4th edition, Oxford University Press, 2005, s.64–68

Silverstein A, Silverstein V & Silverstein L. DNA, 2008, Twenty First Century Books, p.32–35

Watson J, Baker T, Bell S, Gann A, Levine M & Losick R. Molecular Biology of the Gene, 5th edition, Benjamin Cunnings, 2004, s. 181–232

http://herb4cancer.files.wordpress.com/2007/11/cell-cycle2.jpg (luettu. 1.9.2009)

h t tp : / /www.so lune t t i . f i / f i / so lub io log ia /dna -n_semikonservatiivisuus/2/ (luettu 8.9.09)

http://en.wikipedia.org/wiki/File:DNA_replication_en.svg (luettu 8.9.09)

http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/interfaasi/ (luettu 8.9.09)

http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/solusykli_1/ (luettu 8.9.09)

474

E3 Histonit – DNA:n pakkausVarila Annu & Heinänen JuusoSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto20.9.2011 Tarkastaja: Siri Lehtonen

TiivistelmäValtavan DNA- molekyylin moneen kertaan kierteisen ja superkierteisen rakenteen pakkaamisesta alimmal-la tasolla vastaavat eukaryoottisolussa histonit. Histonit ovat perusproteiineja, jotka yhdessä DNA:n kanssa muodostavat nukleosomirakenteen. Histonien entsymaattiset muokkaukset; asetylaatio, metylaatio, fosfory-laatio, ADP-ribosylaatio, monoubikitinaatio ja sumoylaatio säätelevät DNA:n aktiivisuutta joko löyhentämäl-lä DNA:n kietoutumista histonioktameerin ympärille tai tiivistämällä sen pakkautumista. Kromosomit voivat esiintyä löyhästi pakkaantuneena aktiivisena eukromatiinina tai tiiviimmin pakkautuneena inaktiivisempana heterokromatiinina. Histonien välityksellä voi tapahtua epigeneettistä periytymistä, jolloin muutos on nimen-omaan proteiinissa eikä DNA:ssa. Tämä voi ilmetä erilaisina perinnöllisinä sairauksina. Histonien toiminnan ja merkityksen ymmärtäminen onkin hyödyllistä lääketieteellisessä tutkimuksessa. Histonien muokkauksissa toimivien entsyymien on havaittu vaikuttavan muun muassa syövässä, diabeteksessa, sydän- ja verisuonitau-deissa sekä useissa hermostorappeumasairauksissa.

JohdantoDNA eli deoksiribonukleiinihappo sisältää eli-öiden geneettisen informaation emäsjärjestyk-sessään. Eukaryoottisolussa pääosa DNA:sta sijaitsee tumassa, jossa se on organisoitu kro-mosomeihin. Jokaisessa kromosomissa tietty DNA:n pätkä edustaa tiettyä proteiinia koodit-tavaa geeniä. Kromosomit muodostuvat pitkistä kromatiinirihmoista, jotka koostuvat kaksois-kierteisistä DNA molekyyleistä ja DNA:a pak-kaavista proteiineista, joista suurin osa on histo-neja ja loput muita kromosomaalisia proteiineja. (Mathews C ym. 2000).

Histoniproteiinikompleksia, sen ympärille kier-tyneen DNA:n muodostamaa rakennetta sekä kahden ytimen välistä DNA:ta kutsutaan nu-kleosomiksi. Nukleosomin ydinpartikkelin eli histonioktameerin muodostamiseen osallistuu neljä erilaista histonityyppiä: H2A, H2B, H3 ja H4. Näiden neljän perushistonin muokkaukset säätelevät DNA:n pakkautumista ja organisoin-tia. Viides histoniperheenjäsen, H1 toimii link-kiproteiinina histonioktameerin ja DNA-nauhan välillä. (Murray R ym. 2009).

Ilman pakkauskoneistoa yhden solun tumassa si-jaitseva lineaariseksi venytetty kaksoiskierteinen DNA-rihma olisi pituudeltaan keskimäärin noin 2 metriä eli tuhansia kertoja pidempi kuin solun tuman halkaisija. DNA:n tiivistämisen lisäksi pakkauskoneisto mahdollistaa sen avaamisen ja luennan esim. proteiinisynteesissä ja DNA:n replikaatiossa sekä suojaa DNA:ta mm. hajot-tavilta nukleaaseilta. (Mathews C ym. 2000). DNA:n pakkautuminen kromosomiksi on esitet-ty kuvassa 1.

475

Kuva 1. DNA:n pakkautuminen kromosomiin.

Histonin rakenne ja nukleosomin muodostuminenAitotumallisilla DNA on erittäin tiiviisti pakattu tuman sisään. Tiiviimmillään kromosomit ovat mitoosin metafaasi-vaiheessa, jolloin mikro-skoopissa voidaan erottaa tiivistynyt kromatii-nirihma kromosomeina. Moneen kertaan kier-teisen ja superkierteisen DNA:n pakkaamisesta alimmalla tasolla vastaavat histonit. (Alberts B ym. 2008).

Histonit voidaan jakaa viiteen eri pääryhmään, H1/H5, H2A, H2B, H3 ja H4. Näistä neljä jäl-kimmäistä ovat niin sanottuja ydin-histoneja, jotka muodostavat halkaisijaltaan 11 nm prote-iinikompleksin, joiden ympärille DNA on kää-riytynyt lepotilassaan. Nukleosomin ydinosa koostuu kaikkiaan kahdeksasta histonista, jotka muodostavat oktameerirakenteen. Ensin muo-dostuvat H3-H4 ja H2A-H2B dimeerit, joista kaksi edellistä yhdistyy edelleen tetrameerik-si. Näin syntynyt tetrameeri liittyy vielä yhteen kahden H2A-H2B dimeerin kanssa synnyttäen lujan, kiekkomaisen rakenteen, jonka ympärille DNA kääriytyy. Solun sisällä histonien liitos-reaktioita välittävät spesifiset histoni chaperoni proteiinit. (Alberts B ym. 2008). Yhden histo-niytimen ympärille kääriytyy aina 1,65 kierrosta vasenkätisesti superkiertynyttä DNA:ta käsittä-en yleensä 146–147 emäsparia. (Luger K ym. 1997). Nukleosomin muodostuminen on esitetty kaavamaisesti kuvassa 2.

Kuva 2. Nukleosomin rakentuminen histoneista ja DNA:sta.

476

Jokaiseen nukleosomiin liittyy ydinhistonien li-säksi histoni H1, niin kutsuttu linkki-histoni, joka ”istuu” nukleosomin päällä DNA:n lähtökohdalla. H1 pitää sekä paikallaan nukleosomiin kääriyty-nyttä DNA:ta, että sitoutuu nukleosomista lähte-vään linkki-DNA:han, joka on muutamasta emäs-parista 80 emäspariin pitkä, kahden nukleosomin välinen DNA alue. H1 siis auttaa pitämään kasassa kromatiinirihmaa, tiiviiksi siksakiksi vetäytynyttä nukleosomirakennetta, jonka halkaisija on vain n. 30 nm. Vuorottelevaa linkki-DNA – nukleosomi-rakennetta kutsutaan helminauharakenteeksi, kos-ka elektronimikroskoopissa nukleosomit näkyvät helminä linkki-DNA:n välissä. Eläimiltä H1-his-tonista on löydetty erilaisia muotoja, tavallisin on lintujen erytrosyyteistä (tumallisia) löydetty H5. (Zhou Y ym. 1998).

Ydinhistonit ovat konservatiivisia, suhteellisen pienen molekyylipainon ja korkean arginiini/lysiini aminohappotähde pitoisuuden omaavia proteiineja, jotka muodostuvat 102–135 amino-haposta ja laskostuvat kaikki yhtenevällä taval-la (Bhasin M ym. 2006). Kukin niistä sisältää kolme α-kierrettä (sekundaarinen proteiinira-kenne), joita yhdistää toisiinsa kaksi silmukkaa. Nämä muodostavat heterodimeerejä siten että α-kierteet lomittuvat ”kädenpuristukseksi” ja silmukat asettuvat rinnakkain samansuuntaisiksi beeta-silloiksi. Jokaisella histoni-proteiinilla on N-terminaalisessa eli proteiinin NH

2-ryhmään

loppuvassa päässä erittäin joustava ”amino-happohäntä”, joka ei ole laskostuneena nu-kleosomissa vaan ulottuu ytimen ulkopuolelle. (Luger K ym. 1997). Nämä hännät ovat alttiita muodostamaan kovalenttisia sidoksia ja ovatkin tärkeässä osassa esimerkiksi nukleosomien väli-sissä, DNA:ta tiivistävissä sidoksissa välittämäl-lä nukleosomien ja muiden kromosomaalisten proteiinien välisiä vuorovaikutuksia (Cosgrove M ym. 2004). Erityisesti histonin H4 hännällä ar-vellaan olevan tärkeä osa kromatiinin korkeam-man tason pakkautumista (Luger K ym. 1997).

DNA liittyy histoneihin yhdessä nukleosomissa noin 142 vetysidoksella, joista lähes puolet ovat muodostuneet DNA:n fosfodiesteritukirangan ja aminohappoketjujen pääketjun välille. Koska lähes viidesosa histonien aminohapoista on joko positiivisesti varautuneita lysiinejä tai arginiine-ja, kumoavat ne tehokkaasti DNA:n negatiivisen pääketjun vaikutuksen. Lisäksi lukemattomat elektrostaattiset ja hydrofobiset vuorovaikutuk-set sitovat DNA:ta nukleosomin ympärille. (Al-berts B ym. 2008).

Histonien toiminta ja vaikutukset DNA:n pakkautumisessa

Histonikoodi

Histonikoodi on hypoteesi, joka esittää, että his-tonien N-terminaalisten häntien muokkaukset vaihtelevat kromatiinin rakennetta joko suorasti tai epäsuorasti. Suoralla vaikutuksella tarkoite-taan histoni-DNA tai histoni-histoni -vuorovai-kutuksiin puuttumista ja epäsuoralla vaikutuksen välittämistä histonihäntien kemialliset merkit tunnistavien proteiinijoukkojen avulla. (Cosgro-ve M ym. 2004).

Histonien muokkaukset

Kromatiinin aktiivisuutta säädellään histonipro-teiinien post-translationaalisilla eli proteiinisyn-teesin jälkeisillä muokkauksilla. Tarkoituksena on luoda sitoutumiskohtia proteiinidomeeneille, jotka tunnistavat spesifisesti histonissa tapahtu-neet muutokset. Nukleosomin ytimen muodosta-vien H2A, H2B, H3 ja H4 histonien muokkauk-sia on monenlaisia, joista tunnetuimpien ja tutki-tuimpien joukkoon kuuluvat (de)asetylaatio, (de)metylaatio, (de)fosforylaatio, ADP-ribosylaatio, monoubikitinaatio ja sumoylaatio. (Murray R ym. 2009). Näiden muokkausten kombinato-rinen eli yhdistelevä toiminta säätelee kriittisiä DNA:n prosesseja, kuten replikaatiota, korja-usta ja transkriptiota (Smith B ja Denu J 2008). Muokkauksia on esitetty taulukossa 1.

Histonien lysiini- ja arginiinitähteet avainasemassaLysiinejä ja arginiineja muokkaavien entsyymi-en katalyyttisen aktiivisuuden, substraattispe-sifisyyden ja kohde-entsyymien tunteminen on oleellista histonien toiminnan selvittämiseksi, sillä ne muodostavat komplekseja post-trans-lationaalisia muokkauksia tekevien proteiinien kanssa. Histonien lysiini- ja arginiini-aminohap-potähteiden muokkauksessa avustavien entsyy-mien on huomattu korreloituvan useissa ihmis-ten keskuudessa esiintyvissä sairauksissa, kuten reumaattisessa niveltulehduksessa, syövässä, sydäntaudeissa, diabeteksessa ja hermostorap-peumataudeissa, esimerkiksi Alzheimerin ja Par-kinsonin taudeissa. (Smith B ja Denu J 2008).

477

Histonien asetylaatio ja deasetylaatioHistonien asetyylitransferaasi-entsyymit (HAT) katalysoivat asetyyliryhmän liittämistä asetyy-likoentsyymi-A:sta histonin lysiinitähteeseen. Histonien deasetylaasit (HDAC) puolestaan ka-talysoivat asetyyliryhmän poistamista (Smith B ja Denu J 2008). Histonien H3 ja H4 asetylaation avulla säädellään geenin transkription aktivoitu-mista ja inaktivoitumista. Asetylaatio tapahtuu näiden histonien pitkiin häntiin, jotka työntyvät ulos nukleosomista. Ydinhistonien asetylaatio on osallisena myös kromosomien kokoamisessa DNA:n replikaation aikana. Histonien asetylaati-olla on havaittu olevan ratkaiseva rooli Hunting-tonin taudissa. Huntingtonin taudin tutkimiseksi tehdyissä hiirikokeissa histonit ovat olleet hypo-asetyloituja (liian vähän liittyneitä asetyyliryh-miä) ja kokeiden perusteella on osoitettu, että histonideasetylaasi-inhibiittoreista saattaisi olla terapeuttista hyötyä kyseissä sairaudessa. (Gha-zaleh S-V ja Jang-Ho C, 2006).

Histonien metylaatio ja demetylaatioHistonien arginiinitähteet altistuvat metylaatiol-le ja sitrullinaatiolle eli deiminaatiolle guani-diinipitoisista sivuketjuistaan arginiinimetyylit-ransferaasin ja arginiinideiminaasin katalysoi-mina. Histoniproteiinien arginiinien metylaation säätely on linkitetty useisiin tärkeisiin solun prosesseihin, kuten transkription säätelyyn, translaatioon ja DNA:n korjaukseen. Arginiinin metylaatio voi mahdollisesti joko tukahduttaa tai aktivoida prosesseja riippuen metylaation sijain-nista ja asteesta. Arginiinimetyylitransferaasi on yhdistetty solun normaalien tehtäviensä lisäksi eturauhasen syöpään sekä sydän- ja verisuoni-tauteihin, jolloin entsyymiä esiintyy normaalia määrää enemmän. Arginiinideiminaasit puoles-taan liitetään multippeliskleroosiin eli MS-tau-tiin ja reumaattiseen niveltulehdukseen. (Smith B ja Denu J, 2008).

Taulukko 1. Histonien muokkauksia

Histonin muokkaus Mekanismi EsimerkkivaikutusAsetylaatio Asetyyliryhmän liittäminen

asetyylikoentsyymi-A:sta histonin N-terminaalisen hännän lysiiniin asetyylitransferaasin avulla

Geenin transkription aktivoituminen ja inaktivoituminen

Kromosomien kokoaminen DNA:n replikaatiossa

Metylaatio Metyyliryhmän liittäminen tiettyyn aminohappoon (mm. lysiiniin tai arginiiniin)

Geenin transkription aktivoiminen ja estäminen

Fosforylaatio Fosforyyliryhmän liittäminen Kromosomien tiivistäminen replikaatiosyklissä

ADP-ribosylaatio ADP-riboosi -molekyylin liittäminen - DNA:n korjausMonoubikinaatio Yhden ubikiniini-molekyylin

liittäminenGeenin aktivoiminen ja hillitseminen

Geenin hiljentäminenSumoylaatio SUMO:n liittäminen (SUMO =

small ubiquitin-related modifier)Transkription tukahduttaminen

478

Histonien toiminta ja ATP riippuvainen kromatiinin muokkaus-kompleksi

DNA:n sisältämää informaatiota tarvitaan jat-kuvasti solun toiminnassa mm. proteiinisyntee-sin lähetti-RNA:n tuottamiseen ja mitoosissa eli solunjakautumisessa DNA:n kahdentamiseen eli replikaation. Mikäli DNA olisi pysyvästi sitoutu-neena histonien ympärille, eivät nopeat geenin-luentamekanismit olisi mahdollisia. Tähän solu käyttää erilaisia ATP-riippuvaisia kromatiinin muokkauskomplekseja, jotka löysentävät histo-ni-DNA välisiä vetysidoksia. ATP-riippuvaisen kromatiinin muokkauskompleksin alayksik-kö sitoutuu sekä nukleosomin histoniytimeen, että sen ympärille kääriytyneeseen DNA:han ja ATP:n hydrolyysistä saamalla energialla liu’uttaa DNA:ta ytimen suhteen. Samalla se voi myös muuttaa väliaikaisesti ytimen rakennetta ja siten heikentää DNA:n sitoutumista histoneihin. Toistamalla tätä sykliä, muokkauskompleksi saa aikaan DNA:n liukumista nukleosomin ympäril-tä, jolloin myös pakattuna ollut DNA on myös muiden proteiinien käytössä esimerkiksi trans-kriptiossa. Tekemällä yhteistyötä histoni chape-ronien kanssa, jotkut ATP-riippuvaiset kromatii-nin muokkauskompleksit voivat korvata nukleo-somin H2A-H2B dimeerit esimerkiksi toimin-naltaan hieman erilaisella H2AZ-H2B muodolla. Kromatiinin muokkauskompleksit voivat myös täysin vaihtaa tai poistaa nukleosomiytimen. (Alberts B ym. 2008).

Histonien evoluutioHuolimatta histoniproteiinien emäsjärjestyksien erilaisuudesta, kaikki ydinhistonit kuitenkin las-kostuvat keskenään samalla lailla (s. 7) ja lomit-tuvat heterodimeereiksi ainutlaatuisella tavalla. Vain eukaryooteilla DNA on kääriytynyt histo-nien ympärille, mutta myös arkkibakteereilta on löydetty samankaltaisia nukleosomaalisia prote-iineja, joissa toistuu α-kierre-säie-α-kierre – ra-kenne proteiinin laskostumisessa. Arkkibaktee-reilla DNA on kiertynyt nukleosomin tapaiseen rakenteeseen; niiden histonialayksiköt liittyvät tetrameeriksi, mikä on saattanut olla nykyisten eukaryoottien (H3-H4)2-tetrameerin esimuoto. Myös bakteereilla on nukleosomaalisia proteii-neja, joilla on samanlaisia ominaisuuksia kuin histoneilla, vaikkakin nämä ovat laskostumisel-taan erilaisia. α-kierre-säie-α-kierre – rakenteen perusteella näyttää siltä, että arkkibakteerien ja eukaryoottien histonien laskostuminen on perin-töä yhteiseltä esi-isältä ja geenien vaihdon myö-tä se levisi myös joihinkin bakteereihin. (Alva V ym. 2007).

Lähteet

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular Biology of the cell, 2008, s. 211–2.

Alva V, Ammelburg M, Söding J, Lupas A. On the origin of the histone fold. BMC Structural Biology, 2007; 7:17.

Bhasin M, Reinherz E, Reche P. Recognition and Classification of Histones Using Support Vector Machine. Journal of computational biology, 2006; 13, s. 102–112.

Cosgrove M, Boeke J, Wolberger C. Regulated nucleosome mobility and the histone code. Nature Structural & Molecular Biology, 2004; 11, s. 1037–1043.

Ghazaleh S-V, Jang-Ho C. Mechanisms of disease: histone modifications in Huntington’s disease. [Nature 2006]. (Luettu 19.9.2011). Saatavissa: [http://www.nature.com/nrneurol/journal/v2/n6/full/ncpneuro0199.html]

Luger K, Mäder A, Richmond R, Sargent D, Richmond T. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature, 1997; 389, s. 251–260.

Mathews C, Van Holde K, Ahern K. Biochemistry, third edition, 2000, s. 1074–1079.

Murray R, Bender D, Botham K, Kennelly P, Rodwell V, Weil A. Harper’s illustrated biochemistry, 28th edition, 2009, s. 312–315.

Smith B, Denu J. Chemical mechanisms of histone lysine and arginine modifications, 2008. [Pubmed 2009]. (Luettu 19.9.2011). Saatavissa: [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2642981/?tool=pubmed]

Zhou Y, Gerchman S, Ramakrishnan V, Travers A, Muvldermans S. Position and orientation of the globular domain of linker histone H5 on the nucleosome. Nature, 1998; 395, s. 402–405.

479

E4 Geenien toiminnan säätely – DNAsta proteiineihinPalomäki Sami & Pernu RoniSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopistoPäivämäärä 8.9.2009Tarkistaja: Mika Pietilä

TiivistelmäDNA:n geenien säätely mahdollistaa solujen erilaistumisen ja kasvun, sekä rajoittaa mahdollisen liikatuotan-non. Eukaryoottien geenien ilmentämisen säätelyä tapahtuu useilla eri tasoilla, joista tärkein on transkription aloituksen säätely. Aloituksen säätelyyn kuuluu kromatiinirakenteen muokkaus DNA:n lukemista mahdollista-vaksi ja eri transkriptiotekijöiden yhteisvaikutukset ja vasteet erilaisiin solun ulkopuolisiin signaaleihin.

Transkription jälkeinen säätely tapahtuu mRNA–tasolla, muokkaamalla esi-RNA:ta, säätelemällä mRNA:n uloskuljetusta tumasta. Myös mRNA:n translaatiota proteiiniksi kontrolloidaan. Esi-RNA:n muokkaaminen määrittää millaisena geeni-ilmentymä valmistuu; läpäiseekö mRNA tumahuokoset, nukleaaseilta suojautumi-nen ja mRNA:n pysyvyys.

Geeniluennan tuotteiden käsittely ei lopu vielä translaatioon alkamisen jälkeen, vaan niitä käsitellään ja kulje-tetaan solun sisällä eri osoitteisiin. Niitä voidaan säilöä myöhempää käyttöä varten tai erittää solun ulkopuo-lelle. Myös erilaisten yhdisteiden liittämistä ja irrottamista tapahtuu valmistetuissa proteiineissa. Solun jatkuva synteesi ja kyky poistaa epästabiileja tuotteita on olennaista solun toiminnan kannalta.

JohdantoGeenit ovat tuman DNA:sta löytyviä emäsjak-soja, joista kopioidaan malli RNA-molekyylin valmistamiseen. Geenien ilmentyminen on pro-sessi, jossa muodostetaan transkriptiossa lähetti-RNA–molekyyli, jonka mukaan valmistetaan soluliman ribosomeissa valmis proteiini. Moni-soluisilla eliöillä geenejä on kymmeniä tuhansia ja vain pieni osa niistä on kerrallaan toiminnassa. Solutyypin ja sen kehitysvaiheen mukaan geeni-en toimintaa säädellään hyvin tarkoituksenmu-kaiseksi. (Heino ja Vuento 2007)

Geenien ilmentyminen ja sen säätely mahdollis-taa solujen erilaistumisen kudoksiksi sekä ympä-ristöön sopeutumisen. Monet transkriptiotekijät ohjaavat yhteisvaikutuksellaan tarkasti proteii-nien täsmätuotantoa vaikuttaen siten solujen eri-laistumiseen. Transkriptiotekijät vaikuttavat suo-raan tai epäsuorasti RNA-polymeraasientsyymin toimintaan (Heino ja Vuento 2007). Eri aineet, kuten hormonit, kemikaalit ja raskasmetallit, vai-kuttavat monimutkaisilla mekanismeilla geenien luentaan. Tämä mahdollistaa muun muassa ym-päristöön adaptoitumisen. Toisaalta geenisäätelyn tärkeimpiä tehtäviä on rajoittaa solun liikasyntee-siä, joten adaptoitumiskyky tarkoittaa myös haa-voittuvuutta erilaisille mutaatioille. Eukaryootti-

soluilla geenisäätelyä tapahtuu monilla eri tasoilla DNA:n aminohappojärjestyksen kopioituessa kromosomeista tuman ulkopuolelle valmiiksi pro-teiineiksi. Prokaryooteilla geenisäätely on yksin-kertaisempaa ja perustuu yleensä negatiiviseen palautteeseen (repressioon) geeniluennan aikana, jolloin transkriptio estyy (Baker ym. 2004).

Transkription säätely

Kromatiinin rakenne

Geenit ovat tumassa pakkautuneena kromosomei-hin (Kuva 1.). Pakkautuminen on erityisen tiivis ainoastaan solun metafaasivaiheessa eli mitoosi-jakautumisen alussa. Interfaasin aikana solu tuot-taa aktiivisesti proteiineja, joten kromatiinit ovat pakkautuneet väljemmin ja ne esiintyvät tumassa ainoastaan kahdessa muodossa; heterokroma-tiinina ja eukromatiinina (Kuva 2.) (Heino ja Vuento 2007). Heterokromatiini on rakenteeltaan liian tiivistä, joten se on transkriptionaalisesti inaktiivista. Eukromatiini puolestaan on tarpeeksi avoin, jolloin transkriptio on mahdollinen. DNA on kietoutunut kromatiineissa histoniproteiinei-hin, jotka säätelevät DNA:n geenin luettavuutta ja siten histoniproteiinien toiminnan säätely vai-kuttaa suoraan geenin luentaan (Baker ym. 2004).

480

Kuva 1: Kaavakuva DNA:n pakkautumisesta kro-mosomeihin (kuva muokattu lähteestä www.solu-netti.fi)

Kuva 2: Heterokromatiinin ja eukromatiinin ra-kenteelliset erot (kuva muokattu lähteestä www.solunetti.fi)

Histoniproteiinien fosforylaatio ja asetyloitumi-nen aktivoivat kromatiinien avautumista, mikä mahdollistaa geenien luennan. Metyloituminen (metyylin liittyminen) vastaavasti tiivistää kro-matiinia ja estää geenin emäsjärjestyksen luke-misen. DNA metyloituu myös suoraan, jolloin metyloidut geenit pysyvät inaktiivisina, vaikka solu jakautuisi. Esimerkiksi naisilla toinen X-kromosomi on metyloitunut ja siten pysyy inak-tiivisena. Myös karsinogeenisilla aineilla havai-taan kykyä metyloida DNA:ta. (Heino ja Vuento 2007)

Transkription aloitus

Transkription aloitus on tärkein eukaryoottien geeni-ilmentymän säätelymuoto. Kromatii-nirakenteen avauduttua eri transkriptiotekijät pääsevät kiinnittymään DNA:han aiheuttaen geenitoiminnan aktivoitumisen. Tavanomai-sesti koodattavan geenin ensimmäisen eksonin edessä on säätelyyn osallistuva promoottori-

alue, johon kiinnittyvien proteiinien toiminta vaikuttaa suoraan geenin toimintaan. Esimerk-kinä mRNA-molekyylin transkription käynnis-tävä RNA-polymeraasi II, joka vaatii avukseen joukon muita proteiineja, joita kutsutaan peru-stranskriptiotekijöiksi. Perustranskriptiotekijät kiinnittyvät promottorialueessa sijaitsevaan ns. TATA-laatikkoon ohjaten RNA-polymeraasin aloittamaan geenin luennan, minkä jälkeen muu proteiinikompleksi hajoaa.

Kuva 3. Kaavio transkriptiotekijän kiinnittymises-tä perustranskriptio-kompleksiin (kuva muokattu lähteestä Heino ym. 2007)

Transkriptiotekijät ovat proteiineja, jotka sitou-tuvat geenin säätelyalueelle. Näitä säätelyalu-eita sanotaan luentaa vahvistaviksi (enhancer) tai vaimentaviksi (silencer) kohdiksi. Pelkkä sitoutuminen ei kuitenkaan geenin säätelyyn riitä, vaan transkriptiotekijöiden on oltava kon-taktissa perustranskriptiotekijöiden kanssa (Kuva 3.). DNA:n rakenne mahdollistaa kui-tenkin taipumisen, joten säätelyalueet voivat si-jaita kaukanakin transkription aloituskohdasta. Geenin säätelyyn osallistuu monia tekijöitä, ja näiden yhteisvaikutus määrä synteesin lopulli-sen nopeuden. Transkriptiotekijöitä on lukuisia, mutta useimmat niistä kuuluvat suuriin geeni-perheisiin. Esimerkkeinä näistä muun muassa leusiinivetoketju-domeeni, joka välittää kahden säätelijäproteiinin kiinnittymistä toisiinsa sekä sinkki-sormi-domeeni, jonka välityksellä ne voi-vat kiinnittyä DNA:han. Eri transkriptiotekijät ja niiden yhteisvaikutus käynnistävät solussa eri-laistumista. Niiden yhteisvaikutuksen säätelyyn osallistuu myös joukko ulkoisia signaaliaineita, kuten hormonit ja metallit, ja myös solun sisäiset signaalireitit (Heino ja Vuento 2007).

481

Geenien ilmentämisen säätely mRNA tasolla

mRNA:n muokkaus

RNA-polymeraasin lukiessa geenin, se valmis-taa mRNA:n esimuodon, jota täytyy muokata en-nen kuin se voidaan kuljettaa tumasta ulos. Siinä on edelleen geenin intronijaksoja, jotka täytyy leikata pois ja liittää eksonit yhteen. Toimintoa kutsutaan silmukoinniksi. mRNA:n 5´ -päähän lisätään ns. tulppa (cap), joka suojaa valmis-ta mRNA:ta hajottavilta nukleaaseilta ja toimii mRNA:n signaalina ribosomille, joka aloittaa

translaation. mRNA:n 3´ -päähän lisätään trans-kription lopuksi polyadeniini-häntä, joka vakaut-taa valmista mRNA:ta ja toimii merkkinä tumas-ta uloskuljetukselle (Campbell ja Reese 2002).

Silmukointi on mRNA:n muokkausvaiheessa avainasemassa geeniekspression, eli geenin il-mentämisen kannalta. Silmukoinnissa intronit siis poistetaan ja eksonit liitetään yhteen spliseo-somin toimesta. Avaintekijän silmukoinnista te-kee se, että intronien poiston yhteydessä voidaan poistaa myös mikä tahansa eksonijakso, jolloin mRNA:ta luettaessa syntyy erilaisia proteiineja (Kuva 4.). Eli yksi geeni saattaa koodata useita eri proteiineja (Heino ja Vuento 2007).

Kuva 4: Kaavio vaihtoehtoisen silmukoinnin merkityksestä geeniekspressiossa (kuva mukailtu lähtees-tä wikipedia).

mRNA:n kuljetus tumasta sytoplasmaan

Tumasta sytoplasmaan kuljetetaan vain pieni määrä valmistuneesta mRNA:sta. Prosessi on hyvin valikoiva sillä poikkeavasti silmukoidut esi-mRNA:t, vialliset mRNA:t ja silmukoinnis-sa poistetut intronit eivät ole vain hyödyttömiä vaan saattavat olla jopa vaarallisia. Vain täysin kypsät mRNA:t pääsevät tumakalvon läpi.

Tumakalvossa on huokosia, joissa olevat raken-teet tunnistavat kypsässä mRNA:ssa olevat ra-kenneproteiinit, muun muassa ns. tulpan eli cap:in kiinnittävän proteiinikompleksin ja polyadeniini-hännän kiinnittävät proteiinit. Tunnistettuaan oikeat rakenteet valmiissa mRNA:ssa, tumahuo-konen päästää sen läpi sytoplasmaan translaatiota varten. Ylimääräiset kuonat jäävät tumaan ja ne pilkotaan suuressa proteiinikompleksissa, jota kutsutaan eksosomiksi (Alberts ym. 2002).

482

mRNA:n translaation estäminen

Translaation aloituksessa voidaan myös vaikut-taa geenien ilmentymiseen estämällä translaati-on aloitus. 5´ -pään tulpparakenteen ja poly(A) –hännän täytyy toimia tietyssä vuorovaikutukses-sa, jotta translaatio käynnistyisi. Solu voi estää translaation käynnistymisen sitomalla tietyt pro-teiinit 5´ -päähän tai 3´ -päähän lopetuskodonin ja poly(A) –hännän väliselle alueelle (Alberts ym. 2002).

Tärkeitä translaatiotason säätelijöitä ovat miRNA:t (micro-RNA), jotka sitoutumalla emäs-pariutumisen avulla mRNA:n 3´ -pään ei-koo-daavalle alueelle (UTR; untranslating region), estävät translaation tai edesauttavat mRNA:n ennenaikaisessa pilkkoutumisessa. DNA:ssa on sekvenssejä, joiden mukaan miRNA:t valmistu-vat samalla tavalla kuin mRNA:kin. miRNA:t ovat erityisen tärkeitä säätelytekijöitä sen ta-kia, että ne pystyvät estämään usean eri tyypin mRNA:n translaation. Lisäksi miRNA:en sää-telykohteina ovat erilaisten signaaliproteiinien, entsyymien ja transkriptiotekijöiden mRNA:t. miRNA:en ja niiden kontrolloimien kohteiden säätelemät reitit muodostavat siis laajan solunsi-säisen säätelyverkoston. Tällä hetkellä on arvioi-tu, että miRNA:t säätelevät jopa 10–30% geeni-en ilmentymisestä (Cui ym. 2006).

Yleisesti solu säätelee proteiinisynteesiä fosfo-ryloimalla erään käynnistystekijän, jolloin ylei-sesti kaiken mRNA:n lukeminen estyy. Tällainen yleinen säätely on tärkeää alkionkehityksessä: munasolu valmistaa ja varastoi suuret määrät mRNA:ta, joita ei lueta kuin vasta heti hedelmöi-tyksen jälkeen. Vasteena käynnistyy räjähdys-mäisesti tiettyjen proteiinien synteesi (Campbell ja Reese 2002).

Proteiinien säätelyProteiineja muokataan vielä translaation aloituk-sen jälkeenkin. Proteiinissa on ylimääräisiä ami-nohappojaksoja, jotka määräävät proteiinin lo-pullisen sijoituspaikan solussa. Ne voivat siirtyä rakenneproteiineiksi kalvorakenteisiin tai niitä voidaan säilöä ja tarvittaessa myöhemmin erit-tää solun ulkopuolelle. Proteiinista saattaa trans-laatiossa muodostua ns. signaalisekvenssi, joka kuljettaa proteiinin SRP:n (Signal-Recognition Particle) avustamana solulimakalvostolle (Kuva 5.). Solulle jatkuva synteesi ja kyky muokata proteiineja translaation jälkeenkin on erittäin tär-keä. Se mahdollistaa muun muassa virheellisten tai väärin laskostuneiden proteiinien poistamisen (Heino ja Vuento 2007)

Kuva 5: Esimerkki proteiinin ohjautumisesta solulimakalvolle. SRP-molekyyli (signal-recognition par-ticle) tunnistaa peptitiketjusta signaalisekvenssin, kiinnittyy siihen ja tuo proteiinin solulimakalvolle SRP-reseptorille. SRP-molekyyli irtoaa ribosomin jatkaessa proteiinin valmistusta translokaattorika-navan läpi kalvoston sisään (kuva muokattu lähteestä http://www.colorado.edu/MCDB/MCDB1150/ohd/overhead.html).

483

Lähteet

Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Molecular biology of the cell. 4th edition. New York, Garland Sciences, Taylor & Francis group, 2002.

Baker TA, Bell SP, Grann A, Levine M, Richard Losick, Watson JD. Molecular Biology of the Gene 2004: s 129–180

Campbell NA, Reece JB. Biology. 6th edition, 2002: s 311, 354–367

Cui Q, Yu Z, Purisima, EO and Wang E. Principles of microRNA regulation of a human cellular signaling network. Mol. Sys. Biol. 2006;2:46;s 1–7

Heino J, Vuento M. Biokemia ja Solubiologian perusteet. WSOY, 2007.

Kuva: http://en.wikipedia.org/wiki/Alternative_splicing

Esseen laatijat piirtäneet itse kuvat yllämainittuja lähteitä apuna käyttäen, ellei kuvan lähdettä erikseen mainita.

484

E5 DNA:n korjaus – esimerkkejä mekanismeista Riikka Pankkonen & Ilkka MehtonenSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto9.9.2009Tarkastaja: Jussi Tuusa

TiivistelmäSolut altistuvat jatkuvasti säteilylle ja vapaille radikaaleille. Ne voivat vaurioittaa DNA:n emäksiä ja siten aihe-uttaa nukleotidisekvenssin pysyviä muutoksia, eli mutaatioita. Vapaita radikaaleja syntyy sekä vierasaineiden reaktioissa että aerobisen metabolian sivutuotteena. Erilaiset mutaatiot geenialueilla voivat johtaa liian lyhyen tai väärin laskostuneen proteiinin tuotantoon tai estää kokonaan lähetti-RNA:n synteesin. DNA-vauriot voivat myös edistää syövän kehitystä ja johtaa eliön kuolemaan. Toisaalta mutaatiot sukusoluissa ovat välttämättömiä evoluutiolle.

DNA:n vaurioita tapahtuu ja niitä korjataan etenkin replikaation yhteydessä. Replikaatiokoneisto pystyy itse korjaamaan virheitä (yleensä väärän emäksen liittäminen) ja lisäksi sellaisia kopioitavan DNA:n vaurioita, jotka pysäyttäisivät replikaatiohaarukan etenemisen. Lisäksi on olemassa replikaatioon liittymättömiä korja-usmekanismeja, kuten emäksenpoistokorjaus, nukleotidinpoistokorjaus ja kaksoissäiekatkoskorjaus sekä eräät suorat emäksen korjaukset. Mutaatiot ja etenkin niiden korjaamisen käynnistyminen vaikuttavat solusyklin säätelyyn pysäyttäen sen esimerkiksi G1/S-tarkistuspisteeseen. Tämä on tärkeää, jotta virheellinen geneettinen koodi ei välittyisi solujakautumisessa. Ihmisillä eräs tärkeä säätelijä tässä on p53-proteiini, jonka mutaatiot aiheuttavat erilaisia syöpiä. Myös replikaatiohaarukan pysähtyminen voi pysäyttää solusyklin jo ennen varsi-naisten korjausmekanismien aktivoitumista.

JohdantoIhmisen solussa on keskimäärin kolme miljardia emästä ja elämän aikana tapahtuu noin 10^16 solunjakautumista. Jokaisen solun DNA:ssa ta-pahtuu normaalioloissa noin miljoona mutaa-tiota vuorokaudessa. Koska DNA:n geneettinen informaatio on koodattuna nukleotidiemäksiin, vauriot etenkin emäsrakenteissa tuottavat prote-iinisynteesin kautta vaikuttavia mutaatioita.

Solujen normaali toiminta ei ole mahdollista ilman DNA:n korjausmekanismeja, joita ihmi-sellä koodaa yli 130 geeniä. Eliöstä riippumatta korjausmekanismit ovat samankaltaisia DNA:n rakenteen ja tehtävien identtisyyden vuoksi, mutta joitain erojakin tunnetaan. Kaikkien korja-usmekanismien jälkeenkin jää yhteen jokaisesta miljoonasta emäksestä virhe. Myös korjausme-kanismit voivat tuottaa mutaatioita, sillä jonkin verran korjausta tapahtuu syyttä reaktiotodennä-köisyyksien vuoksi.

DNA:n korjausmekanismien tutkimus tuottaa tärkeää tietoa etenkin syöpäsairauksien ymmär-tämiseen ja hoitoon. Tulevaisuudessa syöpähoi-

dot voivat tarkentua entisestään, jos onnistutaan kehittämään lääkkeitä yhä spesifimmin eri korja-usmekanismien häiriöihin. Jo nyt tiedetään tiet-tyjen korjausmekanismien häiriöiden liittyvän kohonneeseen riskiin tietyille syöville.

Mikäli aihe kiinnostaa enemmän, suosittelemme tutustumaan esimerkiksi Howard Lieberman-nin katsausartikkeliin DNA Damage Repair and Response Protein as Targets for Cancer Therapy (2008) sekä T. Nouspikelin katsausartikkeliin Nucleotide excision repair: variations on versa-tility (2009).

DNA:n vauriotyypitDNA:n vaurioitumista tapahtuu jatkuvasti sekä osana solun normaalia toimintaa että ympäristön vaikutuksesta. Runsas solujakautuminen ja toi-saalta vilkas aerobinen metabolia, etenkin happi-radikaaleja vapauttavat mitokondrion hengitys-ketjun reaktiot, lisäävät mutaatioriskiä. Jokaista solujakautumista varten solun DNA monistetaan, missä tapahtuu aina tietyllä todennäköisyydellä virheitä. Happiradikaaleja syntyy myös monien vieraiden aineiden vaikutuksesta.

485

Mutaatio geenialueella DNA:n emäksessä voi johtaa yksittäiseen pistemutaatioon (yksi emäs muuttuu, mutta aminohappo ei välttämättä muu-tu), lukukehyksen muutokseen (proteiinin jokai-nen aminohappo muuttuu) tai ennenaikaiseen lopetukseen (tuottaa liian lyhyen proteiinin). Mikäli DNA:n molemmat juosteet katkeavat (kaksoissäiekatkos), on mahdollista että katken-nut pätkä liittyy toiseen kromosomiin eli tapah-tuu translokaatio. DNA:n vaurioituminen saattaa myös toimia signaalina apoptoosille, mikäli vau-rioita on paljon.

Yksittäisen emäksen muutokset

Erilaiset emäsmuutokset vaikuttavat emäspariu-tumiseen ja siten kaksoisjuosteen kestävyyteen. Emäsrakenteessa voi tapahtua esimerkiksi dea-minaatio, oksidaatio, depurinaatio, depyrimidaa-tio tai alkylaatiota (metyyliguaniiniksi). Emäs voi myös muuttua toiseksi, kuten sytosiini urasii-liksi, mitä tapahtuu jokaisessa solussa keskimää-rin 500 kertaa päivässä (Lieberman 2008). Väärä emäs voi joskus johtua virheestä replikaatiossa, vaikkakin solulla on useita tällaisia virheitä kor-jaavia mekanismeja. Myös muutos sytosiinista

urasiiliksi on kohtalaisen helppoa havaita, koska urasiili ei ole normaali DNA:n emäs. Oletetaan-kin, että tymiini on korvannut RNA:n urasiilin jotta sytosiinin muuntuminen havaittaisiin eikä se pääsisi aiheuttamaan pysyviä mutaatioita. (Lieberman 2008)

Ylimääräiset kovalenttiset sidokset

Samassa DNA-juosteessa sijaitsevien vierek-käisten emästen välille voi syntyä esimerkiksi syklobutaanipyrimidiinidimeereiksi kutsuttu rakenne ultraviolettisäteilyn seurauksena (kuva 1). Yleisintä tämä on kahden tymiinin välillä. Toinen esimerkki juosteen sisäisestä emästen vä-lisestä liitoksesta on 6,4-pyrimidiinipyrimidoni-valotuotteet (photoproducts) (kuva 1).

DNA-juosteiden välille voi syntyä kovalenttisia sidoksia eräiden kemikaalien, kuten Cis-Platinin, typpisinapin ja mitomysiini-D:n seurauksesta. Nämä aiheuttavat kaksoissäiekatkoksia, koska ne johtavat replikaatiohaarukan pysähtymisen (polymeraasi ei pääse etenemään). Juosteiden väliset sidokset korjataan NER:n, transleesio-synteesin ja kaksoisjuostekorjauksen yhdistel-mällä (kpl 3). (Nouspikel 2009)

Kuva 1. Vasemmalla 6,4-pyrimidiinipyrimidonivalotuote ja oikealla syklobutaanipyrimidiinidimeeri.

Juosteiden katkeaminen

DNA-juostepätkiä syntyy luonnollisesti esi-merkiksi replikaatiossa (Okazakin fragmentit). Tahattomasti niitä voi syntyä topoisomeraasien (DNA:n kierrettä aukova entsyymi) toiminnas-sa. Myös mekaaninen rasitus ja jotkin kemote-rapeuttiset antibiootit (esimerkiksi bleomysiini) voivat katkaista DNA:ta.

Kaksoissäiekatkos, jossa molemmat juosteet kat-keavat samalta kohdalta, on DNA:n vakavimpia vaurioita, koska se voi johtaa kokonaisen kro-mosomin osan häviämiseen tai translokaatioon (siirtymiseen toiseen kromosomiin). Sitä tapah-

tuu kuitenkin luonnollisesti esimerkiksi rekom-binaatiossa, immunoglobuliinien antigeenituo-tannossa sekä replikaatiohaarukan vaurioituessa.

KorjausmekanismitDNA:n korjaus kuluttaa paljon energiaa ja vaa-tii ihmisellä yli 130 geenin toimintaa. Korjaus on helpointa kaksijuosteiselle DNA:lle, koska siinä vastinjuosteita voidaan verrata keskenään. Korjausmekanismit ovat samankaltaisia kaikilla eliöillä. Joskus myös virheetöntä DNA:ta korja-taan, jolloin korjauksen yhteydessä syntyy mu-taatio. (Nelson ja Cox 2005)

486

Korjaus replikaation yhteydessä

Replikaation yhteydessä tapahtuvia virheitä emäsjärjestyksessä korjaa heti virheen tapah-duttua polymeraasin oikolukuaktiivisuus. DNA-polymeraasi tekee DNA-synteesissä virheen 1/104–105 nukleotidi. DNA-polymeraasin oiko-lukuaktiivisuudella tarkoitetaan sen sisältämää entsyymiaktiivisuutta, joka havaitsee väärän emäksen heti nukleotidin liittämisen jälkeen. Sen ansioista polymeraasi peruuttaa 3’->5’-suuntaan virheellisen nukleotidin ohi (3’-5’-endonukle-aasiaktiivisuus) poistaen väärän nukleotidin. Poiston jälkeen polymeraasi jatkaa normaalisti 5’->3’-suuntaan ja virheellinen emäs korvautuu oikealla. Polymeraasin oikoluku tekee virheen noin 1/102–103, joten replikaation virheeksi jää noin 1/106–108. Näiden virheiden korjaukseen osallistuvat muut mekanismit kuten mismatch repair (MMR), joka tunnistaa ja korjaa vain juuri syntetisoidun juosteen virheitä. Tällöin ko-konaisvirheeksi jää vain 1/1010. (Nelson ja Cox 2005)

Emäksenpoistokorjaus (BER)

BER:llä (base excision repair) korjataan yksit-täisiä puuttuvia tai vaurioituneita emäksiä, jotka eivät aiheuta muutoksia DNA:n helix-rakentee-seen. DNA-juosteen deoksiriboosin ja emäsosan välisiä n-glykosidisidoksia katkeaa päivittäin 5 000–30 000 kappaletta. Näin syntynyttä emäk-setöntä kohtaa kutsutaan AP-kohdaksi (abasic site), mutta sellainen voi syntyä myös DNA:n glykosylaasin poistaessa muuttuneen emäksen DNA-ketjusta. Kukin glykosylaasi poistaa vain tietyllä tavalla vaurioituneita emäksiä. Uuden emäksen liittämisen mekanismi on esitetty ku-vassa 2. (Nelson ja Cox 2005) Korjauksesta vas-taa proteiinikompleksi (repairosome) joka koos-tuu 4–6:sta proteiinista (Smith 2009).

Kuva 2. Emäksenpoistokorjauksen vaiheet. 1: Glykosylaasi poistaa vaurioituneen emäksen. 2: AP-en-donukleaasi katkaisee juosteen. 3: DNA-polymeraasi tekee uutta juostetta ja ligaasi liittää sen paikoil-leen. Mukaillen (Nelson ja Cox 2005) s. 972.

Nukleotidinpoistokorjaus (NER)

NER on monipuolinen korjausmekanismi, jol-la korjataan useamman nukleotidin mittaisia pariutumattomia alueita (lesion). Sen alalajeja ovat Transcription coupled repair (TCR), Global genomic repair (GGR) sekä Domain/Differentia-tion associated repair (DAR). NER:n kompleksi

muodostuu 20 proteiinista (Smith 2009). Vaikka NER:iä tapahtuu sekä eukaryooteilla että proka-ryooteilla, niiden entsyymit eivät ole sukua toi-silleen (Sancar ym. 2004). NER:n vaiheet ovat pääpiirteissään vaurioituneen kohdan tunnistus, noin 30:n nukleotidin poisto, uuden juosteen syntetisointi ja uuden juosteen 3’-pään liittämi-nen vanhaan DNA:han (kuva 3).

487

Kuva 3. Nukleotidinpoistokorjauksen vaiheet. 1: Vaurioitunut, pariutumaton kohta. 2: Eksinukleaa-si katkaisee vaurioituneen juosteen vauriokohdan molemmin puolin. 3: DNA-helikaasi auttaa juos-teen (29 emästä) poistamisessa. 4: DNA-polyme-raasi syntetisoi uuden juosteen ja 5: DNA-ligaasi liittää sen alkuperäiseen juosteeseen. Mukaillen (Nelson ja Cox 2005) s. 973.

Transkriptioon kytketty nukleotidinpoistokorjaus (TCR)TCR:ää (transcription coupled repair) käytetään esimerkiksi replikaation aikana, kun DNA-poly-meraasi kohtaa vaurioituneen DNA-alueen, joka estää sen etenemisen ja voi johtaa replikaatio-haarukan hajoamiseen (Hanawalt 2002). Vauri-oituneet kohdat tunnistaa mahdollisesti RNA-polymeraasi II. TCR mahdollistaa sen, että ko-pioitavaa juostetta korjataan aktiivisemmin kuin muuta genomia (vertaa GGR). Niissä kohdissa, joita TCR ei onnistu paikkaamaan, käytetään vielä DAR:a (kpl 3.3.2.). (Nouspikel 2009)

Transkriptiosta riippumaton nukleotidinpoistokorjaus (GGR)GGR (global genomic repair) kattaa koko gen-omin alueen. Sen toimintaan vaikuttavat kroma-tiinin rakenne sekä DNA:han sitoutuneet proteii-nit. GGR aktivoituu p53:n vaikutuksesta (kpl 5).

GGR-reaktion on havaittu olevan heikompi ih-misen erilaistuneissa hermosoluissa kuin niiden prekursoreissa tai sikiön neuroneissa. Kypsät hermosolut eivät jakaudu, mutta useiden geenien transkriptiota tarvitaan solun perustoimintojen ylläpitämiseen. On esitetty että TCR sekä do-meeniin liittyvä korjaus (domain/differentiation

associated repair, DAR) mahdollistavat aktiivis-ten geenien suojaamisen mutaatioilta, vaikka so-lulla on pienempi mutaatioriski moniin muihin solutyyppeihin verrattuna, eikä GGR-korjaus toimi. (Hanawalt 2002), (Nouspikel 2009)

Kaksoissäiekatkoskorjaus (DSBR)

DSBR:ää (double strand break repair) on kahta eri tyyppiä: homologinen rekombinaatio (HR) ja non-homologous end joining (NHEJ). HR:ssä liitetään yhteen molemmista juosteistaan katken-neita DNA-pätkiä ja mallina käytetään mallina vastinkromosomia. Välituotteena syntyy saman-lainen Hollidayn liitos kuin meioosin rekombi-naatiossa (kuva 4). (Sancar ym. 2004) NHEJ:ssä katkenneiden kaksoisjuosteiden päitä muokataan siten, että ne voidaan taas liittää yhteen, minkä seurauksena DNA:han tulee joitain muutoksia.

Kuva 4. DNA:n rekombinaatiomekanismi. Osat vastinkromosomipareista (sininen ja punainen) asettuvat vierekkäin ja muodostavat Hollidayn välituotteen (keskellä). Oikealla rekombinaation seurauksena on tapahtunut tekijänvaihtoa. Mu-kaillen (Nelson ja Cox 2005) s. 986.

Transleesiosynteesi (TLS)

DNA-polymeraaseja on useita tyyppejä. Nor-maalisti DNA-synteesissä on käytössä sellai-nen polymeraasi-kompleksi (α, δ tai ε), jolla on suhteellisen tarkka oikolukuaktiivisuus, mutta joka toisaalta pysähtyy kohdatessaan epämuo-dostuneen DNA-pätkän. Tästä seuraa replikaa-tiohaarukan hajoaminen ja korjausmekanismien tai apoptoosin aktivointi. Transleesiosynteesis-sä käytetään vähemmän tarkkaa polymeraasia, joka voi kuitenkin jatkaa synteesiä siellä, missä tarkempi pysähtyisi. Näin solu voi syntetisoida uutta DNA:ta hieman huonommalla tarkkuu-della välttäen kuitenkin apoptoosisignaloinnin käynnistymisen. Transleesiosynteesi ei siis ole varsinainen virheen korjaus- vaan ennemminkin sen kiertämismekanismi. (Nelson ja Cox 2005)

488

Emästen suora korjaaminen (DR)

Etenkin bakteereilla tapahtuu emästen suoraa korjaamista (direct repair, DR) fotolyaasien avulla. Esimerkiksi E. Colilla on valoa absor-boivia kromoforeja (vertaa kasvien viherhiuk-kasiin), joiden avulla se voi tuottaa energiaa ja toteuttaa käänteiset korjausreaktiot. Tällaista ei tapahdu istukallisilla nisäkkäillä, mutta niiltäkin löytyy metyylitransferaasi-entsyymi, joka pois-taa metyyliguaniinin O6-metyylin palauttaen sen takaisin guaniiniksi. (Sancar ym. 2004)

DNA-vaurioiden vaikutusDNA-vaurion seurausten kannalta oleellista on se, missä kohdassa genomia vaurio on tapahtu-nut. Jos mutaatio tapahtuu geenien ulkopuoli-sella alueella, sen vaikutukset jäävät vähäisiksi, koska ne eivät vaikuta geeniluentaan. Tällaista mutaatiota kutsutaan hiljaiseksi mutaatioksi.

P53 ja solusyklin säätely

DNA-vauriot vaikuttavat solusykliin pyrkien es-tämään viallisen genomin kopioinnin ennen vau-rioiden korjausta. Eräs tärkeä tekijä tässä on p53, DNA:han sitoutuva transkriptiofaktori, joka sää-telee arviolta sataa eri proteiinia (Smith 2009). P53-geeni sijaitsee kromosomissa 17 (17p13). Kun p53 fosforyloidaan, sen ulostuonti tumas-ta sekä hajotus estyy, eli tuman p53:n pitoisuus nousee. Kohonnut määrä p53:a saa aikaan p21-proteiinin tuotannon, mikä inhiboi Cdk-syklii-nikompleksin. Cdk:t eli sykliinistä riippuvaiset kinaasit liittyvät kukin tiettyyn vaiheeseen so-lusykliä ja aktiivisena saavat solun siirtymään uuteen vaiheeseen syklissä. Cdk-sykliinikom-pleksin inaktivoituessa solusykli voi pysähtyä esimerkiksi G1/S-tarkistuspisteeseen. (Nelson ja Cox 2005), (Sancar ym. 2004) Sen lisäksi, että p53 johtaa solusyklin pysähtymiseen, sen on ha-vaittu säätelevän geenituotteittensa välityksellä NER:ä ja BER:ä. (Smith 2009)

Korjauksen häiriöistä johtuvia sairauksia

P53-geenin mutaatiot voivat johtaa syöpään, koska kuten edellisessä kappaleessa esitettiin, pysäyttää p53 solusyklin, mikäli DNA on vau-rioitunut. Lisäksi p53:n mutaatiot voivat häiritä apoptoosignalointia (Sancar ym. 2004). P53:n merkitys syöpäsairauksissa on suuri, ja yli puo-lessa syöpätapauksista löytyy mutatoitunut tai inaktiivinen p53 (Smith 2009). Toisaalta monilla kemoterapeuttisilla aineilla pyritään vaurioitta-maan DNA:ta, jotta syöpäsoluissa käynnistyisi apoptoosi. Uusia syöpälääkkeitä kehittäessä yri-tetään löytää sellaisia yhdisteitä, jotka vaikuttai-sivat yhtäaikaisesti mahdollisimman moneen eri korjausmekanismiin, jotta solu menisi apoptoo-siin (Lieberman 2008). Jotkut syövälle altistavat virukset, kuten papillomavirus E6 ja hepatiitti Bx, voivat estää p53:a käynnistämästä NER:n, mikä edistää syövän kehittymistä (Hanawalt 2002).

Vaikeat perinnölliset NER:n toimintahäiriöt voi-vat johtaa esimerkiksi xeroderma pigmentosum -tautiin (XP) sekä ylipäätänsä kohonneeseen syöpäriskiin. XP-potilailla on tuhatkertainen ris-ki sairastua ihosyöpään, kymmenkertainen riski neoplasiaan (Tyson ym. 2009), sekä suurentu-nut riski keuhko- ja maha–suolikanavan syöpiin (Nouspikel 2009). Cockaynen oireyhtymä on XP:tä muistuttava perinnöllinen sairaus. Yhteis-tä molemmille on mm. herkkyys säteilyn aihe-uttamille vaurioille. Vauriot voivat olla samoissa geeneissä. (Nouspikel 2009)

MMR:n mutaatiot voivat aiheuttaa perinnöllis-tä paksusuolensyöpää (HNPCC) ja häiriöt kak-soissäiekatkoskorjauksessa perinnöllistä rinta-syöpää.

DAR:n häiriöt voivat aiheuttaa ennenaikaista hermoston rappeutumista, mikä johtaa esimer-kiksi aikaiseen dementiaan ja muihin neurologi-siin sairauksiin. (Hanawalt 2002) Fanconin ane-miasta kärsivät ovat erityisen herkkiä juosteiden välisille ristisidoksille. (Sancar ym. 2004)

489

PohdintaLääketiede on kehittynyt viime vuosikymmeni-nä siten, että useimmat infektiosairaudet voidaan parantaa. Ihmiset elävät yhä vanhemmiksi ja yhä useamman kuolinsyynä on syöpä. Tiedetään, että kilpikonnat elävät hyvin vanhoiksi, mistä voidaan arvella niillä kenties olevan hyvin toi-mivat DNA:n korjausmekanismit. Kilpikonnien evoluutio on lähes pysähtynyt jo kauan sitten, mikä myös viittaa alhaiseen mutaatiotiheyteen ja hyviin korjausmekanismeihin. Ehkä ne ovat keskimääräistä paremmin suojassa UV-säteilyltä kilpensä ansiosta, mutta todennäköisesti näiden eläinten Dna-korjausmekanismeja kannattaisi vielä tutkia ihmisenkin pidemmän eliniän toi-vossa.

Mitokondrioiden DNA-korjausmekanismeja ei tässä työssä selvitetty erikseen, mutta mieleen tuli ajatus, onko mitokondrioissa useita kopi-oita DNA:sta sen vuoksi että niiden reaktioissa syntyy helposti happiradikaaleja etenkin paljon energiaa vaativissa soluissa. Lisäksi pohdimme RNA:n sytosiini-urasiili-muutoksia (kpl 2.1.) ja mietimme, olisikohan niin että DNA, jossa virhe huomataan helpommin kuin RNA:ssa, mahdol-listi osaltaan monimutkaisempien eliöiden ke-hittymisen, vai niin että mutaatioherkempi RNA mahdollisti solujen ja lopulta monisoluisten eli-öiden kehittymisen?

Pohdimme myös, miksi ei ole kehittynyt erityis-tä korjausmekanismia vahtimaan tarkasti tietty-jen geenien (kuten p53) mutaatioita, koska nämä ovat niin kriittisiä syövän synnyn kannalta. Ken-ties tällaiseenkin mutaatiovahtien mutaatioiden vahtimiseen vielä joskus syntyy mekanismeja. Toisaalta jos solujakautuminen on liian herkkä mutaatioille, se tuskin ehtisi tapahtua riittävän usein esim. ihmisen kokoisessa eliössä. Ihmette-limme myös, miksi meiltä puuttuu emästen suo-ra korjausmekanismi (kpl 3.6.), joka kuitenkin bakteereilla on? Ensimmäiset nisäkkääthän kyllä olivat pieniä yöeläimiä, jotka eivät altistuneet paljon säteilylle. Jossain kehitysvaiheessa korja-usmekanismi ei ilmeisesti ole ollut sukukypsyy-den saavuttamisen kannalta välttämätön, suurin osa nykyisistäkin syövistä kehittyy sukukypsyy-den saavuttamisen jälkeen. (Nelson ja Cox 2005)

Lähteet

Hanawalt PC. Subpathways of nucleotide excision repair and their regulation. Oncogene 2002 Dec 16;21(58):8949–8956.

Lieberman HB. DNA Damage Repair and Response Proteins as Targets for Cancer Therapy. Current Medicinal Chemistry 2008 1.1.;15(15):360–367.

Nelson DL, Cox MM. Lehninger Principles of Biochemistry. Fourth edition ed. New York: W. H. Freeman and Company; 2005.

Nouspikel T. DNA repair in mammalian cells : Nucleotide excision repair: variations on versatility. Cell Mol.Life Sci. 2009 Mar;66(Hanawalt 2002):994–1009.

Sancar A, Lindsey-Boltz LA, Unsal-Kacmaz K, Linn S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Annu.Rev.Biochem. 2004;73:39–85.

Smith ML, Seo YR. p53 regulation of DNA excision repair pathways. Mutagenesis 2002 March 1;17Nouspikel 2009:149–156.

Tyson J, Caple F, Spiers A, Burtle B, Daly AK, Williams EA, et al. Inter-individual variation in nucleotide excision repair in young adults: effects of age, adiposity, micronutrient supplementation and genotype. Br.J.Nutr. 2009;101(09):1316.

490

E6 Kromosomimutaatiot – mutaatiotyypit, esimerkkejäPanula, Joni & Niemi, ArttuSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto19.09.2011Tarkastaja: Jarkko Lackman

TiivistelmäKromosomimutaatiolla tarkoitetaan rakenteellista muutosta kromosomissa, ja se vaatii aina yhdestä kahteen kromosomimurtumaa. Se, miten katkaistu kromosomin osa järjestäytyy uudelleen, määrää mutaation tyypin. Tärkeimmiksi ja yleisimmiksi mutaatiotyypeiksi nostetaan lähteestä riippuen deleetio (häviämä), duplikaatio (kahdentuma), translokaatio (siirtymä) ja inversio (kääntymä). Muita kromosomimutaatiotyyppejä ovat mm. insertio ja isokromosomin muodostuminen. Mutaation vaikutus fenotyyppiin riipuu siitä, onko se tasapainoi-nen (balansoitunut) vai epätaspainoinen (ei-balansoitunut) eli tuleeko mutaatiossa lisää vai häviääkö siinä kro-mosomiainesta. Myös sillä on vaikutusta, jos kromosomi katkeaa geenin kohdalta, jolloin sen luenta häiriintyy tai jos geeni siirretään väärään säätelyalueeseen. Kromosomimutaatioita tutkitaan yleisimmin FISH-menetel-mällä, joka on perinteisiä menetelmiä tarkempi ja nopeampi.

JohdantoMutaatioita on kolmenlaisia: geenimutaatiot, kromosomimutaatiot ja kromosomistomutaatiot. Mutaatiot tapahtuvat joko sponttaanisti tai jon-kun tekijän – mutageenin – vaikutuksesta. Mu-tageenejä ovat esimerkiksi ionisoiva säteily ja tietyt kemialliset aineet. Kromosomimutaatiossa kromosomin rakenne muuttuu, kun sen geenit esimerkiksi monistuvat (duplikaatio) tai käänty-vät ympäri (inversio). (Aula ym. 2006, Giffiths 2000)

Kromosomimutaatioit voivat olla joko balansoi-tuneita tai ei-balansoituneita. Balansoituneella eli tasapainoisella poikkeavuudella tarkoite-taan muutosta, jossa geeniainesta ei tule lisää eikä sitä häviä. Geenin paikalla ei ole yleensä merkitystä sen koodaamisessa, joten balansoi-tuneet kromosomipoikkeavuudet eivät vaikuta fenotyyppiin eli ilmiasuun, mikäli kromosomi ei katkea keskeltä geeniä tai geeniä ei siirretä väärän säätelyalueen alaiseksi. Esimerkiksi jos kavutekijä siirretään säätelyalueeseen, joka lisää sen kopiointia, voi mutaatio johtaa syöpään. Toi-saalta meioosissa rakenteen poikkeavuus saattaa johtaa epätasapainoisen eli ei-balansoituneen su-kusolun syntyyn. Tällöin kromosomimateriaalia puuttuu tai on liikaa. Ei-balansoituneet muutok-set saattavat johtaa erilaisiin kromosomisairauk-siin, kuten epämuodostumiin ja kehitysvammai-suuteen. (Aula ym. 2006)

Kromosomimutaatioiden maailma osoittautui sitä mielenkiintoisemmaksi mitä syvemmälle sii-hen uppoutui. Esseemme antaa erinomaiset läh-tötiedot jokaiselle aiheesta kiinnostuvalle, lisäksi kappaleiden lopussa olevat potilastapaukset tuo-vat mielenkiintoa aiheeseen tutustumiseen.

DeleetioDeleetiossa eli häviämässä osa kromosomista poistetaan. Sen voi saada aikaan yksi kromo-somimurtuma, jolloin kromosomista poistetaan se osa, jossa ei ole sentromeeriä (asentrinen frag-mentti) (kuva 1). Koska telomeerit ovat välttä-mättömiä kromosomin toiminnalle, yleisemmän deleetion aiheuttaa kaksi murtumaa, jolloin mur-tumien väliin jäänyt asentrinen fragmentti pois-tetaan, ja jäljelle jääneet osat kiinnittyvät yhteen. (Griffiths ym. 2000)

Deleetion vaikutus riippuu sen suuruudesta. Esi-merkiksi pieni geenin sisäinen deleetio – intra-geeninen deleetio – voi inaktivoida geenin, mut-tei välttämättä vaikuta kantajan fenotyyppiin. Suurempi vaikutus on puolestaan multigeneeni-sillä deleetioilla, jotka poistavat joitakin tuhansia geenejä. Deleetion ansiosta vastinkromosomin resessiiviset alleelit näkyvät herkemmin feno-tyypissä, kun dominoivat poistetaan. (Griffiths ym. 2000)

491

Kuva 1: Deleetiossa kahden murtuman väliin jää-nyt asentrinen fragmentti (ei kuvassa) poistetaan

Cri du Chat –oireyhtymä ja retinoblastooma

Cri du Chat –oireyhtymä on kliinisesti tunnettu kromosomideleetio, jossa aivan kromosomin 5 lyhyen varren päässä häviää kromosomiaines-ta. Oireyhtymän tunnusomaisin oire on nimeen viittaava korkea kissamainen huuto. Muita oirei-ta ovat mm. pienipäisyys ja kuumaiset kasvot. Oireyhtymään ei ole erityistä parannuskeinoa, mutta kuntoutuksella elinajanennustetta voidaan parantaa huomattavasti. (Mainardi 2006)

Retinoblastooma eli verkkokalvon syöpä puoles-taan muodostuu, kun molemmat kromosomin 13 Rb-suppressorigeenit häviävät deleetiossa. Reti-noblastooman synty vaatii siis kaksi mutaatiota suppressorigeenien poistamiseen. Supressori-geenit ovat syövän etenemistä ja kasvua rajoitta-via geenejä, ja kun ne häviävät deleetiossa, syö-pä pääsee vapaasti kasvamaan. (Cooper 2000)

DuplikaatioDuplikaatiossa kromosominosa kahdentuu tai monistuu joko suoraan tai inversiona eli 180 astetta kääntyneenä, ja monistunut kromosomin osa voi liittyä alkuperäisen viereen, jonnekin päin samaa kromosomia tai täysin toiseen kro-mosomiin (insertio) (kuva 2). Geeniainesta tulee siis lisää eli duplikaatio on ei-balansoitunut, jol-loin se saattaa aiheuttaa sikiölle kromosomisai-rauden. (Aula ym. 2006, Griffiths 2000, www.eurogenetest.org)

Kuva 2: Duplikaatiossa kromosomin osa monis-tuu.

Neonataalidiabetes

Neonataalidiabesta sairastavilla noin 70 prosen-tilla on duplikaatio kromosomin 6 pitkän varren alueella (6q24). Neonataalidiabetes puhkeaa yleensä kuuden kuukauden ikään mennessä. Po-tilailla ei normaalisti todeta diabetekseen liittyviä autovasta-aineita eikä poikkeavaa määrää HLA-genotyyppia, joka altistaisi tyypin 1 diabeteksel-le. Noin puolella diabetes on ohimenevä eli tran-sient neonatal diabetes mellitus (TNDM), mutta usein sairaus uusiutuu myöhemmin lapsuus- tai nuoruusiässä, ja lopuilla sairaus on pysyvä eli permanent neonatal diabetes mellitus (PNDM), joka vaatii heti täyden insuliinikorvaushoidon. (www.terveysportti.fi, Polak ym. 2007)

TranslokaatioTranslokaatiossa eli siirtymässä on kahdessa tai useammassa kromosomissa katkoksia, joiden väliin jäävät kromosomin osat ovat vaihtaneet paikkaa keskenään (kuva 3). Translokaatio voi tapahtua minkä tahansa kahden kromosomiosa-sen välillä, ja se on yleensä resiprokaalinen eli vastavuoroinen, jolloin kromosomimateriaalia ei häviä (balansoitunut translokaatio). Tällöin se ei välttämättä ilmene fenotyypissä, mikäli se kromosomimurtuma ei katkaise geeniä, tai sitä ei siirretä väärään säätelyalueeseen. (Aula ym. 2006, www.solunetti.fi, www.terveysportti.fi)

Meioosissa translokaatiokromosomien osat pa-riutuvat normaalien homologisten vastinkromo-somiensa kanssa, jolloin syntyy neljän kromo-somin sisältämä tetravalentti, normaalin kahden kromosomi bivalentin sijaan. Tetravalentin osit-tuminen meioosin I jaossa voi olla virheellinen, mutta yleensä sukusolut vastaanottavat tasapai-noisen kromosomiston. (Aula ym. 2006)

492

Kuva 3: Translokaatiossa kromosomit vaihtavat osia keskenään.

Philadelphia-kromosomi ja leukemia

Philadelphia kromosomi syntyy, kun tranlokaa-tiossa onkogeeni abl (syövän kasvua edistävä geeni) siirtyy kromosomista 22 kromosomiin 9. Onkogeeni abl yhdistyy toiseen geeniin, joka moninkertaistaa sen koodauksen, jolloin syöpä saa otolliset olosuhteet kehittyä. Philadelphia kromosomi johtaakin krooniseen myelooini-seen leukemiaan eli KML:ään (verisyöpä), jossa kromosomin saaneet solut tuottavat aktii-vista tyrosiinikinaasi entsyymiä, joka aiheuttaa verisolujen liiallisen syntymisen. Ensisijaisena hoitona käytetään tyrosiinikinaasinestäjiä kuten imatinibiä, dasatinibiä tai nilotinibiä. (Porkka 2009, Kurzrock ym. 2003, Cooper 2000, www.solunetti.fi)

Sentrinen eli Robertsonin translokaatio

Robertsonin translokaatio on toinen muoto ta-sapainottuneesta translokaatiosta. Robertsonin translokaatiossa kaksi akrosentristä kromosomia (sentromeeri hyvin lähellä kromosomin toista päätä) 13–15 sekä 21–22 fuusioituu keskenään. Fuusiossa lyhyiden varsista muodostunut kro-mosomi häviää, kun kromosomien pitkät päät translokoituvat sentromeerien kohdalta yhteen. Fuusion seurauksena Robertsonin translokaa-tion kantajan kromosomiluku vähenee 45:een. Robertsonin translokaatio kromosomien 13 ja 14 välillä on yleisin balansoitunut translokaatio, jonka kantajia on 1:1500. (Aula ym. 2006, www.vaestoliitto.fi)

Balansoituneen Robertsonin translokaatiokro-mosomi 21 siirtyy kantajan meioosissa jompaan-kumpaan sukusoluun. Tällöin sikiönkehitys joko pysähtyy alkuraskaudessa, jos on 21-monosomi, tai jatkuu 21-trisomina, jolloin sikiöllä on Dow-nin oireyhtymä. Translokaatiota kromosomeissa 14 ja 21 kantavan äidin raskauksissa on sikiöllä 20 %:n todennäköisyys saada yksi ylimääräinen kromosomi 21. Jos isä on kantaja, riski on 5 %. (Aula ym. 2006)

InversioInversiossa eli kääntymässä kromosomi katkeaa kahdesta kohdasta, kromosomimurtumien väliin jäänyt pala kääntyy ympäri ja liittyy takaisin entiseen paikkaansa (kuva 4). Inversiot voidaan edelleen luokitella kahteen ryhmään: perisentri-seen inversioon, jossa kromosomin sentromeeri kuuluu inversioalueelle ja parasentriseen inver-sioon, jossa inversioalue ei yllä sentromeeriin saakka. Inversio on balansoitunut eikä näin ollen vaikuta kantajan fenotyyppiin, mutta kuitenkin esimerkiksi vaikean A tyypin hemofilian (veren-vuototauti) tausalla on geenin katkaiseva inver-sio X kromosomissa. (Aula ym. 2006, Griffiths ym. 2000, www.solunetti.fi)

Vaikka inversion lopputulos on balansoitunut, kantajan meioosissa inversiokromosomi pariu-tuu normaalin kromosomin kanssa, jolloin vas-tingeenit eivät ole samoin päin. Tällöin inver-siokromosomin täytyy tehdä ns. inversiosilmuk-ka, jotta kromosomien samat alleelit saataisiin kohdakkain ilman kromosomimurtumia ja –mur-tumia. Silmukassa tapahtuu herkästi tekijäin-vaihtoa, jolloin sukusolun kromosomissa saattaa olla inversiokromosomin yli- tai alijäämiä eli kromosomi on ei-balansoitunut, mikä aiheuttaa kromosomisairauksia. (Griffiths ym. 2000)

Kuva 4: Inversiossa kromosomin osa kääntyy ym-päri.

493

Inversion geneettinen käyttäytyminen

Se, millä tavalla tekijäinvaihto tapahtuu, riip-puu siitä onko inversio para- vai perisentrinen. Tekijänvaihto parasentrisessä inversiossa (sent-romeeri inversioalueen ulkopuolella) tapahtuu ns. disentrisen sillan kautta, kun silmukassa kromosomit liittyvät toisiinsa. Ylimääräisenä muodustuu hävitettävä kromosomin osa ilman sentromeeria (asentrinen fragmentti). Meioosin ensimmäisen jaon anafaasin jälkeen, kun kro-mosomit ovat taas erillään toisista, disentrinen silta katkeaa satunnaisesta kohdasta muodostaen kaksi kromosomia, joiden osassa varsista on ta-pahtunut deleetio. Meioosin toisen jaon jälkeen on huomattavissa erilaisia kromosomeja, joissa esiintyy deleetioita.

Koska perisentrisessä kromosomissa sentromee-ri on silmukan tehneellä alueella, tekijäinvaihto tapahtuu normaaliin tapaan – siis ilman disent-ristä siltaa. Kuitenkin tekijäinvaihto tuottaa kro-matidejä, jotka sisältävät duplikaatioita ja delee-tioita. (Griffiths ym. 2000)

Esimerkki: Yhteys autismin ja inversion välillä

Lapsen äidin sukusolun kromosomissa 2 oli tapahtunut balansoitunut parasentraalinen in-terversio, joka johti alkionkehityksessä kromo-somin pitkän varren alueiden deleetioon ja pie-neen duplikaatioon, joiden arveltiin johtuvan disentrisestä kromosomisillasta. Lapsella todet-tiin autismia, henkistä jälkeenjäämistä, puheen tuottamisen vaikeuksia, ylivilkkautta, kasvuhor-monin puutoksesta johtuvaa vajaakasvuisuutta, diabetes ja kasvon vähäinen dysmorfia eli muo-tojen poikkeavuus. Monet näistä oireista on ku-vattu aiheutuvan pelkästään esimerkissä tapahtu-neesta deleetiosta, joten kyseisessä mutaatiossa tapahtuneen duplikaation vaikutukset ovat vielä epäselvät – voiko olla, ettei niin pienellä dupli-kaatiolla ole merkitystä fenotyyppiin? (Devillard ym. 2010)

Muut kromosomimutaatiotInsertiossa osa kromosomia siirtyy toiseen kro-mosomiin, mutta mitään ei siirretä takaisin (vrt. translokaatio). Insertiota kutsutaankin joskus insertionaaliseksi translokaatioksi. Rengaskro-mosomi voi muodostua, kun kromosomin kum-massakin päässä tapahtuu deleetio, jonka jälkeen päät liittyvät kiinni toisiinsa. (Griffiths 2000)

Isokromosomi puolestaan muodostuu kun mi-toosissa tai meioosissa kromosomi jakautuu poikittaisesti – pitkittäisen sijaan. Tuloksena on kaksi kromosomia: toisessa kaksi identtistä ly-hyttä vartta toisessa kaksi pitkää. Yksi ylimää-räinen lyhytvartinen isokromosomi 12 aiheuttaa Pallister-Killianin oireyhtymän. (Aula ym. 2006)

Tutkimus FISH-menetelmäAina 1960-luvulta lähtien kromosomimutaatio-tutkimukset ovat olleet keskeinen osa perinnölli-syyslääketieteen diagnostiikkaa. Nykyään tutki-muksia suoritetaan synnynnäisten oireyhtymien ja kehitysvammaisuuden, riskisairauksien sekä pahanlaatuisten veri- ja syöpätautien seulomi-seksi. (Aula ym. 2006)

Kaikista tärkeimpänä, tarkimpana ja yleisimpänä kromosomitutkimusmenetelmänä voidaan nos-taa esille perinteisen sytogeneesin ja molekyy-libiologian ydistelmän, FISH-menetelmän (fluo-rescense in situ hybridization). Menetelmässä muiden in situ –hybridisaatioiden tavoin DNA-koetin yhdistyy eli hybridisoituu sen emäsjaksoja vastaavan kohdesolun DNA-alueeseen. Perintei-sistä menetelmistä poiketen in situ –hybridisaa-tiossa tutkittavaa kromosomia ei eristetä solusta vaan tutkitaan omalla paikallaan. FISH-menetel-mässä lisäksi fluoresoiva väriaine aikaansaa koh-dessolussa fluoresenssi-ilmiön, joka havaitaan mikroskooppisesti. FISH-menetelmällä voidaan esimerkiksi havaita hyvinkin pieni deleetio kro-mosomissa: deleetioalueessa käytetään spesifisiä koettimia, jolloin hybridisaatiosignaalin puuttu-minen paljastaa deleetion. (Aula ym. 2006, Price 2006, Gersen ym. 1999)

FISH-menetelmän rinnalle on tullut M-FISH-menetelmä (multicolor), jolla saadaan värjättyä jokainen kromosomi tai kromosomin osa omal-la värillään. M-FISH-menetelmä on merkittävä mm. määritettäessä ei-tasapainoisia translokaati-oita ja selvitettäessä merkityn kromosomin alku-perän. (Aula ym. 2006)

494

Lähteet

Aula P, Kääriäinen H, Palotie A. Perinnöllisyyslääketiede. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim, 2006, s. 42–46 ja 139–147.

Cooper CM. The Cell: A Molecular Approach. 2000Devillard F, Guinchat V, Moreno-De-Luca D, Tabet AC,

Grunchy N, Guillem P, Nguyen Morel MA, Leporrier N, Leboyer M, Jouk PS, Lespinasse J, Betancur C. Paracentric inversion of chromosome 2 associated with cryptic duplication of 2q14 and deletion of 2q37 in a patient with autism. 2010, saatavssa:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20684015

Gersen SL, Keagle MB. The Principles of Clinical Cytogenesis. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc, 1999, s. 443

Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki DT, Lewontin RC, Gelbart WM. An Introduction to Genetic Analysis. New York: W. H. Freeman, 2000, saatavissa: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21904/ (deleetio) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21830/ (duplikaatio) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK22042/ (inversio)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21854/ (insertio)

Huopio H, Otonkoski T. Vastasyntyneen diabetes. Duodecim 2011, saatavissa:http://www.terveysportti.f i . p c 1 2 4 1 5 2 . o u l u . f i : 8 0 8 0 / d t k / l t k / a v a a ? p _artikkeli=duo99437&p_haku=duplikaatio

Kurzrock R, Kantarjian HM, Druker BJ, Talpaz M. Philadelphia Chromosome – Positive Leukemias: From Basic Mechanisms to Molecular Therapeutics. 2003, saatavissa: http://www.annals.org/content/138/10/819.abstract

Mainardi PC. Cri du Chat Syndrome. 2006, saatavissa: http://www.ojrd.com/content/1/1/33

Peippo M. Perinnöllisyysklinikka. 2001 (muutettu 2006), saatavissa: http://www.vaestoliitto.fi/perinnollisyys/tietolehtiset/robertsonin_13_14_kromosomitrans

Polak M, Cavé H. Neonatal diabetes mellitus: a disease linked to multiple mechanisms. 2007, saatavissa:http://www.ojrd.com/content/2/1/12

Porkka K. Lääkärin käsikirja. 2009, saatavissa: http://www.terveysportti.fi.pc124152.oulu.fi:8080/dtk/ltk/koti?p_artikkeli=ykt00382&p_haku=Philadelphia-kromosomi

Price CM. Fluorescence in situ hybridisation. 2006, saatavissa: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0268960X05800232

Lisäksi internetsivut:

http://www.eurogentest.org/patient/leaflet/finnish/chromosome_changes.xhtml

http://www.eurogentest.org/patient/leaflet/finnish/chromosome_translocations.xhtml#a_N10967

http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/inversio_1/2/http://www.solunetti.fi/fi/solubiologia/translokaatio_1/2/http://www.terveysportti.fi.pc124152.oulu.fi:8080/pls/

terveysportti/rex_terminologia.kotihttp://www.vaestoliitto.fi/perinnollisyys/tietolehtiset/

robertsonin_13_14_kromosomitrans

495

E7 DNA-mutaation aiheuttamat sairaudet – ilmentyminen ja periytyminenMattila, Heli & Mella, MiiaSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian yksikkö, Oulun yliopisto11.9.2009Tarkastaja: Riina Myllylä

TiivistelmäDNA-mutaatiot voidaan luokitella pistemutaatioihin, inversioihin, deleetioihin, duplikaatioihin ja insertioi-hin. Näistä deleetiot ja insertiot voivat muuttaa lukukehystä. Mutaatiot aiheuttavat lukuisia sairauksia mm. katkaisemalla proteiinin koodauksen ennenaikaisesti, mikä johtaa toimimattomaan proteiiniin. Geenivirheet voivat periytyä joko monogeenisesti (ns. mendelöivä periytyminen) tai mitokondriaalisesti (maternaalinen pe-riytyminen). Tautien periytymistä hämärtävät uudet mutaatiot, tautien peittyminen joissain yksilöissä (johtuen epätäydellisestä penetranssista tai ekspression vaihtelusta) sekä epätyypillisen periytymisen menetelmät (mm. uniparentiaalinen disomia).

JohdantoPerimässämme tapahtuu jatkuvasti mutaatioita sekä spontaanisti että erilaisille mutageeneille (esim. ionisoiva säteily) altistumisen seurauk-sena. Joskus tällaiset mutaatiot onnistuvat vält-tämään DNA:n korjausmekanismit, jolloin seu-rauksena on pysyvä mutaatio yksilön perimässä. Jälkeläisille tällainen mutaatio voi periytyä vain, jos se esiintyy ituradan soluissa. Seuraavassa luomme lyhyen katsauksen DNA-mutaatioihin ja niiden aiheuttamiin sairauksiin.

DNA- mutaatiotyypit

DNA:n pituuteen vaikuttamattomat mutaatiot

PistemutaatiotPistemutaatiossa (taulukko 1) yksi DNA:n emäs on muuttunut toiseksi. Pistemutaatiot luokitel-laan kemiallisesti transitio- ja transversitiomu-taatioihin, joista ensin mainitussa puriini muut-tuu toiseksi puriiniksi tai pyrimidiini toiseksi pyrimidiiniksi. Transversitiomutaatiossa puo-lestaan puriini muuttuu pyrimidiiniksi tai toisin-päin. Pistemutaatiot voivat lopettaa geenin toi-minnan täydellisesti tai toisaalta olla täysin mer-kityksettömiä. Hiljaisessa mutaatiossa syntyy saman aminohapon vaihtoehtoiskodoni, jolloin proteiinin aminohapporakenteelle ei aiheudu va-hinkoa. Toisaalta emäsmuutos voi saada aikaan

aminohapon vaihtumisen polypeptidiketjussa. Tällöin puhutaan missense-mutaatiosta, joka johtaa muutoksiin syntyvän proteiinin toimin-nassa (Aula ym. 2006).

Suomalaiseen tautiperintöön kuuluva ja kehitys-vammaisuuteen johtava tauti (AGU) eli aspar-tyyliglukosaminuria on esimerkki missense-mutaatiosairauksista. Taudissa muutos G à C AGA-geenin kohdassa 488 saa aikaan kysteiini-aminohapon korvautumisen seriinillä. Tällöin N-aspartyyli-beeta-D-glukosaminidaasientsyymi ei toimi eikä asparagiinin ja N-asetyyliglukosamii-nin välinen sidos pilkkoudu glykoproteiinin so-keriketjussa. Tämän seurauksena aspartyyliglu-kosamiinia kertyy lysosomeihin, mikä on vahin-gollista erityisesti aivosolujen toiminnalle (Aula ym. 2006, Norio ja Arvio 2006). Juuri aivoku-doksen oireilun syy on epäselvä. Tutkimukset luovat kuitenkin pohjaa oletukselle, että AGU:a sairastavien henkilöiden aivosoluissa vaimen-nussäätely ja glykoasparagiinien kertyminen saavat aikaan geeniluennan loppumisen (Ikonen ja Palotie 1994).

Pistemutaatiot voivat myös saada aikaan ennen-aikaisen geenin luennan lopetuskodonin, jolloin geenituotteen valmistus ribosomeissa päättyy. Näiden ns. nonsense-mutaatioiden seurauksena syntyy joko normaalia lyhyempi inaktiivinen valkuaisaine tai ei tuotetta lainkaan. Esimerkiksi verenvuototauti hemofilia A:sta tiedetään useita hyytymistekijä VIII:n pistemutaatioita, joissa sytosiinin muutos tymiiniksi arginiinin kodonis-sa CGA johtaa lopetuskodonin TGA muodostu-

496

miseen ja geenituotteen luenta päättyy, minkä seurauksena veri ei hyydy normaalisti (Aula ym. 2006, Mustajoki 2009).

InversioDNA:n pituuteen vaikuttamattomiin mutaatioi-hin kuuluvat pistemutaatioiden lisäksi useam-man emäksen korvautuminen toisella sekvens-sillä sekä inversiot (taulukko 1), joissa DNA-jakso kääntyy suunnaltaan päinvastaiseksi (Aula ym. 2006).

DNA:n pituuteen vaikuttavat mutaatiot

Deleetio, duplikaatio ja insertioDeleetio ja duplikaatio (taulukko 1) vaikutta-vat DNA:n pituuteen siten, että deleetioissa DNA:ssa tapahtuu häviämiä ja duplikaatioissa

puolestaan jonkin DNA:n osan kahdentumisia. Deleetiot ja duplikaatiot saattavat johtua lä-heisten samanlaisten emäsjaksojen pariutumis-virheistä meioosin yhteydessä. Tällöin toisesta tytärkromosomista häviää, toisessa kahdentuu tietty kohta genomista. Esimerkkinä tästä on pu-navihersokeudessa väripigmenttien deleetiot X-kromosomissa. Useimmiten syytä näihin muu-toksiin ei tiedetä, eikä virheellisen sekvenssin ympäristössä ole mutaatiolle altistavia piirteitä. Insertiossa (taulukko 1) DNA-molekyyliin liit-tyy yksi tai useampi emäs, jolloin geenin trans-laatio voi muuttua täysin. Insertiot saattavat olla yhteydessä perinnössä liikkuvien elementtien, transposonien, toimintaan. Transposonit liikku-vat erityisen entsyymimekanismien avulla siirty-en helposti paikasta toiseen ja saattavat muuttaa geenin sekvenssiä ”laskeutumalla” geenin sisälle (Aula ym. 2006).

Lukukehystä muuttavat mutaatiotDNA- mutaatioista deleetio ja insertio kuuluvat lukukehystä muuttaviin mutaatioihin (kuva 1). Niiden toiminnalliseen merkitykseen vaikuttaa keskeisesti se, onko DNA:n pituusmuutos jaolli-nen kolmella. Geenin lukukehyksen muuttuessa geenituotteessa tapahtuu suuria muutoksia, ja lu-kukehyksen muutos itsessään johtaa väärän ami-nohappoketjun muodostumiseen ja usein ennen-aikaisen lopetuskodonin kohtaamiseen. Ennen-aikaisesti geenin luennan lopettava eli trunkoiva mutaatio ei välttämättä kaikkien sairauksien koh-dalla aiheuta vaikeampaa perinnöllistä sairautta kuin aminohappomuutoskaan. Esimerkiksi domi-nantti mutaatio, joka poistaa toisen alleelin saattaa vain pienentää proteiinin tuotantoa ja aiheuttaa näin lievemmän fenotyypin. Aminohappomuu-tos puolestaan voi johtaa epäedulliseen proteii-nirakenteeseen, jossa esimerkiksi useammasta aminohappoketjusta koostuva proteiinikompleksi tuhoutuu ja lopputuloksena on tällöin vakavam-pi fenotyyppi. Geenin lukukehyksen muutoksia aiheuttavien deleetioiden ja insertioiden merkitys

vaihtelee riippuen siitä, kuinka tärkeässä koh-dassa proteiinin rakenteelle tai entsymaattiselle toiminnalle virhe sijaitsee (Aula ym. 2006). Esi-merkiksi dystrofiinigeenin mutaatioiden aiheutta-mat taudinkuvat vaihtelevat mutaatioiden laadun mukaan: Virheet, jotka muuttavat geenin luku-kehystä, johtavat vaikeaan Duchenne-tyyppiseen lihasdystrofiaan, mikä johtaa lihasten vähittäiseen surkastumiseen. Lukukehyksen säilyessä muuttu-mattomana voi puolestaan syntyä lievempioirei-nen Becker-tyyppinen lihasdystrofia (Heliö ym. 2001). Toisaalta kolmen emäksen lukukehyksen säilyttävä F508del kystisen fibroosin geenissä aiheuttaa vaikean kystisen fibroosin taudinku-van (Aula ym. 2006).

497

Mutaation periytyminen

Monogeeninen periytyminen

Autosomeissa periytyvät sairaudet ovat yhtä yleisiä ja oireiltaan samanlaisia molemmissa sukupuolissa. Autosomaalisesti resessiivises-ti periytyvää tautia (Kaavio 1) sairastava lapsi syntyy usein terveille vanhemmille. Molemmat vanhemmat ovat kantajia, ja suvuissa on taval-lisesti esiintynyt vastaavia tautitapauksia ennen-kin. Vanhemmat ovat myös tavallista useammin sukua keskenään tai molempien sukujuuret joh-tavat samalle maalaispaikkakunnalle (Aula ym. 2006). Esimerkkisairautena kystinen fibroosi (CF), monielinsairaus, joka todetaan useimmiten jo varhaislapsuudessa. Taudista tunnetaan yli tu-hat erilaista mutaatiota, joiden yhdistelmät aihe-uttavat hyvin vaihtelevia tautitapauksia. CF on yleinen kaikkialla Euroopassa – paitsi Suomessa (Kääriäinen ym. 2002).

Autosomaalisesti dominoivasti periytyvälle tau-dille (Kaavio 2) on tyypillistä, että myös toinen vanhemmista on sairas. Jälkeläisillä on 50 % riski sairastua. Sukupuuta tarkastellessa periytymista-pa on helposti tunnistettavissa (Aula ym. 2006). Esimerkkisairautena polykystinen munuaistauti (ADPKD), munuaisten etenevä rappeumatauti, joka aiheuttaa mm. munuaisten vajaatoimintaa. Potilaat joutuvat vanhemmiten käymään dialyy-sissä (Valta 2008).

X-kromosomisesti resessiivisesti periytyviä sai-rauksia (Kaavio 3) esiintyy lähes yksinomaan miehillä. Vanhemmat ovat usein terveitä, mutta äidin suvussa voi esiintyä tautia (Aula ym. 2006). Esimerkkisairautena Duchennen lihasrappeuma, joka alkaa heikentää lihaksia jo varhaislapsuu-dessa niin, että potilas joutuu pyörätuoliin ennen murrosikää. Taudin loppuvaiheessa sydämen ja hengityslihasten toiminta alkavat heiketä (Kää-riäinen ym. 2002).

X-kromosomisesti dominoivasti periytyviä sai-rauksia (Kaavio 4) esiintyy molemmilla suku-puolilla, mutta yleisemmin naisilla. Naisilla tau-din oireet ovat usein lievempiä ja vaihtelevam-pia. Dominoivasti X-kromosomisesti periytyviä tauteja on erittäin vähän (Aula ym. 2006).

Esimerkkisairautena incontinentia pigmentia, ajan myötä muuttuva ihotauti: oireet vaihtelevat ihottumasta aina keskushermoston häiriöihin ja kehitysvammaisuuteen (Lähde: Väestöliitto).

Ainoatakaan Y-kromosomisesti periytyvää sai-rautta ei tunneta. Y-kromosomisesti periytyvät ominaisuudet periytyvät isältä kaikille pojille (Aula ym. 2006).

Monet seikat voivat johtaa sukupuihin, jotka ainakin näennäisesti rikkovat Mendelin lakeja. Otetaan esimerkiksi tilanne, jossa terveille van-hemmille syntyy dominoivasti periytyvää tautia sairastava lapsi. Tälle on kolme selitystä: ky-seessä voi olla uusi mutaatio, joka on tapahtunut joko siittiön tai munasolun muodostuessa. Jos suvussa on esiintynyt samaa tautia aiemminkin, on syytä epäillä, että terveellä vanhemmallakin on tautigeeni. Se, ettei tauti ole ilmennyt, voi johtua joko taudin epätäydellisestä penetrans-sista (jotkin geenivirheet eivät ilmene kaikilla geenivirheen kantajilla. Esimerkiksi perinnölli-sen paksusuolisyövän penetranssi voi olla 60 %, mikä tarkoittaa, että vain 60 % geenin kantajis-ta sairastuu) tai ekspression vaihtelusta (taudin

498

oireet ovat yksilöllä niin lievät, ettei tautia ole ikinä diagnosoitu). Ks. myös kappale 2.3. Epä-tyypillinen periytyminen (Aula ym. 2006).

Mitokondrionaalinen periytyminen

Suurin osa ihmisen perimästä sijaitsee solujen tumissa. Loput 1 % kaikesta solun DNA:sta löytyy mitokondrioista mitokondrionaalisena DNA:na (mtDNA). MtDNA:n geenivirheet voi-vat johtaa moninaisiin eri kudosten toimintahäi-riöihin. Yleensä potilaalla on sekä normaalia että mutanttia mtDNA:ta. Koska mtDNA periytyy maternaalisesti äidin munasolun mitokondrioi-den mukana, periytyvät myös mitokondriotaudit aina äidiltä kaikille lapsille. Saman äidin jälke-läiset perivät kuitenkin eri suhteissa mutanttia ja tervettä mtDNA:ta, jolloin myös heidän taudin-kuvansa voivat poiketa toisistaan huomattavas-ti. Tyypillinen mitokondriosairaus on mtDNA:n pistemutaatiosta johtuva MELAS-tauti (Aula ym. 2006).

Epätyypillinen periytyminen

X-inaktivaatio eli lyonisaatio on tyttösikiön var-haisessa kehityksessä tapahtuva täysin normaa-li ilmiö, jossa sattumanvaraisesti jompikumpi solun X-kromosomeista hiljennetään. Yleensä inaktivaatio jakautuu tasaisesti kromosomien kesken, mutta joissain harvinaisissa tapauksissa toista kromosomia jää aktiiviseksi moninkertai-nen määrä toiseen nähden. Jos kyseisessä X-kro-mosomissa sijaitsee vaikka jokin resessiivinen tautigeeni, voi se aiheuttaa kantajalleen (jonka pitäisi Mendelin oppien mukaisesti olla oireeton heterotsygootti) lieviä taudin oireita (Aula ym. 2006).

Perimän leimautumisesta puhutaan, kun geenin ilmeneminen riippuu siitä, kummalta vanhem-malta se on peritty. Esimerkkinä tästä mainit-takoon geenin 15q11-q12-alueen deleetio, joka isältä perittynä aiheuttaa Prader-Willin oireyhty-män, äidiltä periytyessään oireiltaan hyvin erilai-sen Angelmanin oireyhtymän (Aula ym. 2006).

Toistojaksoalueet ovat DNA:n alueita, jois-sa sama kolmen nukleotidin jakso toistuu jopa useita kymmeniä kertoja. Tällaisilla toistojak-soilla on taipumus laajeta niiden periytyessä sukupolvesta toiseen, jolloin jossain vaiheessa seurauksena on usein toistojaksotauti. Toistojak-sotaudeista suurin osa on autosomaalisesti domi-noivasti periytyviä ja vanhalla iällä puhkeavia neurologisia sairauksia, esimerkiksi Huntingto-nin tauti. Toistojaksomutaatioille on tyypillistä epästabiilius sekä mitoosissa että meioosissa. Tähän liittyy myös geneettinen antisipaatio, jolla tarkoitetaan sairauden vaikeutumista sukupuus-sa alempiin polviin siirryttäessä (Aula ym. 2006, Richards 2001).

Ituratamosaikismista puhutaan, kun yksilön itu-radan soluissa esiintyy mutaatio, jota ei kuiten-kaan esiinny hänen kaikissa soluissaan. Tämä johtuu kehityksen varhaisessa vaiheessa tapah-tuneesta mutaatiosta. Mutaatio esiintyy kaikissa ensimmäisenä mutatoituneen solun jälkeläis-soluissa (Aula ym. 2006).

Uniparentiaalinen disomia (UPD) on kyseessä, kun jälkeläinen on perinyt jonkin kromosomi-parin molemmat kromosomit samalta vanhem-malta. Tämä johtuu yleensä häiriöstä meioosissa (Aula ym. 2006).

499

Lähteet

Kere J, Kivirikko S. DNA:n muutokset: mutaatiot ja polymorfismit. Kirjassa: Aula P, Kääriäinen H, Palotie A, toim. Perinnöllisyyslääketiede, 3. painos. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2006, s. 60–71.

Kääriäinen H. Perimän muutokset tautien aiheuttajina. Kirjassa: Aula P, Kääriäinen H, Palotie A, toim. Perinnöllisyyslääketiede, 3. painos. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2006, s. 84–130

Heliö T, Kaartinen M, Kärkkäinen S, Peuhkurinen K. Laajentavan kardiomyopatian geenivirheet. Duodecim 2001;117:1797–800. Saatavissa: http://www.duodecimlehti.fi/web/guest/arkisto (luettu 6.9.2009)

Ikonen E, Palotie L. AGU-tauti: pistemutaatio kehitysvammaisuuden syynä. Duodecim 1994;110:667. Saatavissa: http://www.duodecimlehti.fi/web/guest/etusivu?p_p_id=dlehtihaku_view_article_WAR_dlehtihaku&p_p_action=1&p_p_state=maximized&p_p_mode=view&p_p_col_id=column-1&p_p_col_count=1&_dlehtihaku_view_article_WAR_dlehtihaku__spage=%2Fportlet_action%2Fdlehtihakuartikkeli%2Fviewarticle%2Faction&_dlehtihaku_view_article_WAR_dlehtihaku_tunnus=duo40143&_dlehtihaku_view_article_WAR_dlehtihaku_p_auth= (luettu 9.9.2009)

Jalanko H. Kromosomihäiriöt ja geenivirheet. Lääkärikirja Duodecim. Kustannus Oy Duodecim 2009. Saatavissa: http://www.terveyskirjasto.fi/terveyskirjasto/tk.koti?p_artikkeli=dlk00434 (luettu 5.9.2009)

Kääriäinen H, Sipponen M. Mitä on perinnöllisyyslääketiede. Kirjassa: Geenit – terveys ja sairaus. Porvoo: Wsoy 2002. s. 8.

Kääriäinen H, Sipponen M. Ihmisgenetiikan historia ja eugeniikka. Kirjassa: Geenit – terveys ja sairaus. Porvoo: Wsoy 2002. s. 14

Mustajoki P. Tietoa potilaalle: Hemofilia. Lääkärikirja Duodecim. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2009 Artikkeli: dlk00813 (012.813). Saatavissa: www.terveysportti.fi (luettu: 6.9.2009)

Norio R, Arvio M. AGU (aspartyyliglukosaminuria). Lääkärin käsikirja. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim 2006. Artikkeli: ykt00694. Saatavissa: www.terveysportti.fi (luettu 6.9.2009)

Richards R. Dynamic mutations: a decade of unstable expanded repeats in human genetic disease. Hum Mol Genet 2001; 10: 2187–2194. Saatavissa: http://hmg.oxfordjournals.org/cgi/content/full/10/20/2187#SEC4 (luettu 7.9.2009)

Valta H. Polykystiset munuaistaudit. Munuais- ja maksaliiton verkkosivut. Saatavissa: http://www.musili.fi/fin/lapsi_sairastaa/polykystiset_munuaistaudit/ (luettu 5.9.2009)

Väestöliitto. Suomalainen tautiperintö. Saatavissa: http://www.vaestoliitto.fi/perinnollisyys/harvinaiset_sairaudet_ja_orphane/suomalainen_tautiperinto/ (luettu 30.8.2009)

500

E8 mRNA – synteesi, muokkaus ja kuljetusKovalainen, Jenni & Käkelä, RiikkaSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto20.09.2012Tarkastaja: Mika Nevalainen

TiivistelmämRNA molekyyli koostuu nukleotideista. Se valmistetaan tumassa prosessissa nimeltä transkriptio. Entsyymi nimeltä RNA polymeraasi II valmistaa mRNA:ta. Se liikkuu DNA:ta pitkin ja valmistaa mRNA:ta DNA:n ohjeen mukaan. Elongaatiotekijät huolehtivat, ettei RNA-polymeraasi II hajoa ennen aikojaan. Transkription lopussa syntyvään mRNA:han lisätään poly(A) häntä, joka lopulta aiheuttaa terminaation ja RNA-polymeraasi II irtoamisen DNA:sta. Esi-mRNA molekyyliä täytyy muokata monin tavoin ennen sen poistumista tumasta. 5’ päähän lisätään huppurakenne ja intronit poistetaan silmukoimalla. Valmis RNA poistetaan tumasta soluli-maan, jossa se toteuttaa tehtävänsä proteiinisynteesissä.

JohdantoRibonukleiinihappo, eli RNA, on yksijuosteinen nukleotideistä koostuva polymeeri. Jokaisessa nukleotidissa on riboosi, emäs sekä fosfaattiryh-mä. Erona DNA:han RNA:ssa sokeriosana on riboosi deoksiriboosin sijasta, ja yhden emäksen, tymiinin, korva urasiili. RNA:lla on monia tehtä-viä solussa: se pystyy muun muassa toimimaan entsyyminä. RNA:n tärkein tehtävä on proteiini-synteesi, jossa monet erilaiset RNA-molekyylit toimivat yhdessä proteiinien syntymiseksi. RNA pystyy myös säilyttämään ja siirtämään geneet-tistä materiaalia sukupolvelta toiselle. Monet virukset käyttävätkin RNA:ta DNA:n sijasta ge-neettisen tiedon säilytykseen.

Tunnetuimmat RNA tyypit ovat lähetti-RNA (mRNA), siirtäjä-RNA (tRNA) sekä ribosomaa-linen RNA (rRNA). Nämä toimivat yhdessä proteiinisynteesissä. mRNA siirtää proteiinien valmistukseen tarvittavan geneettisen informaa-tion tumasta solulimaan ja kiinnittyy sitten ribo-somiin, joka sisältää rRNA:ta. tRNA tuo paikalle aminohappoja, jotka liittyvät ketjuksi muodos-taen proteiinin. Muita RNA tyyppejä ovat snR-NA, joka osallistuu silmukointiin, snoRNA, joka muokkaa rRNA:ta ja scaRNA, joka muokkaa snRNA:ta ja snoRNA:ta. Lisäksi miRNA voi es-tää tiettyjen mRNA molekyylien translaation ja siRNA voi ohjata tiettyjen mRNA molekyylien tuhoutumista. (Alberts ym. 2008).

Eukaryoottisolussa mRNA molekyyli valmiste-taan ja muokataan tumassa. Mallina valmistuk-selle toimii DNA. Valmiit mRNA:t kuljetetaan

solulimaan, jossa niiden tehtävä on toimia ohjee-na proteiinien valmistukselle.

mRNA:n synteesi

Initaatio

Eukaryoottisoluilla on kolmenlaista RNA- poly-meraasia. RNA- polymeraasit I ja III valmistavat tRNA:ta ja rRNA:ta, RNA- polymeraasi II puo-lestaan mRNA:ta. Jotta transkriptio tapahtuisi tehokkaasti, RNA- polymeraasi II vaatii seurak-seen myös muita proteiineja, transkriptiotekijöi-tä. Nämä tekijät säätelevät geenin ilmentymistä. Transkriptiotekijä, joka ensimmäisenä DNA:n kaksoiskierteeseen on TFIID. Se sitoutuu alueel-le, joka koostuu lähes yksinomaan T ja A nukleo-tideistä. Tätä aluetta kutsutaan TATA sekvens-siksi. Tämä ei ole ainoa DNA pätkä josta trans-kriptio alkaa, mutta RNA- polymeraasi II:lle se on tärkein.TFIID:n sitoutumista promoottori-alueelle seuraa monen muun transkriptiotekijän ja RNA- polymeraasi II:n sitoutuminen. Jotta RNA- polymeraasi II pääsisi templaatin kohdal-le aloittamaan transkription, transkriptiotekijä TFIIH käyttää ATP:tä avatakseen DNA kaksois-kierteen transkription aloituskohdasta. Kun DNA kaksoiskierre on avautunut, DNA juoste taipuu niin, että aktivaatioproteiini kiinnittyy mediaat-toriin, kuten kuvassa 1. TFIIH myös muokkaa RNA- polymeraasi II:ta fosforyloimalla, jolloin se vapautuu transkriptiotekijöistä ja voi siirtyä transkription elongaatio vaiheeseen. (Alberts ym. 2008; Tuteja ym. 2011).

501

Kuva 1: Transkription aloitus eukaryoottisolussa. Mediaattori (iso tummansininen) auttaa aktivaa-tioproteiineja (pieni tummansininen) kommuni-koimaan RNA- polymeraasi II:n (vaalean sininen) ja transkriptiotekijöiden kanssa. DNA juoste on kuvassa harmaana. Kuvassa myös entsyymejä.

Elongaatio

RNA-polymeraasi II liikkuu DNA juovaa pitkin sykäyksittäin, välillä hitaasti melkein pysähtyen ja välillä erittäin nopeasti. Elongaatioon kuuluvat myös elongaatiotekijät. Ne pitävät huolen siitä, että RNA- polymeraasi II hajoaa ennen kuin se saavuttaa geenin pään. Jotkut elongaatiotekijät helpottavat RNA- polymeraasi II:n kulkua DNA juovaa pitkin, mikä ei vaadi ylimääräsitä ener-giaa.Elongaation aikana saattaa tapahtua DNA:n kiertymistä. Kun RNA-polymeraasi II avaa DNA:n kaksoiskierrettä, DNA:n loppupään pi-täisi päästä kiertymään vapaasti, jotta DNA:han ei syntyisi jännitystiloja. Jos DNA:n loppupää ei ole vapaa, jännitystilan aiheuttamana DNA:han muodostuu silmukoita. RNA-polymeraasi II:n kulkiessa pitkin DNA:ta, se synnyttää etupuo-lelleen positiivista jännitystä ja takapuolelleen negatiivista jännitystä. Positiivinen jännitys vai-keuttaa DNA:n kaksoiskierteen avaamista, mutta se helpottaa DNA:n avaamista nukleosomeissa. (Alberts ym. 2008).

Kuva 2: mRNA:n valmistus DNA:n mallin mukaan.

Terminaatio

Tämä on transkription viimeinen vaihe, jossa muodostunut RNA irtoaa DNA templaatista. Myös terminaatioon kuuluu terminaatiotekijöi-tä. Tässä vaiheessa RNA:n 3’ päähän sitoutuu polyA- häntä ja muita proteiineja suojaksi. (Mu-rawska & Brehm 2011).

Esi-mRNA:n muokkausTranskriptio on vasta ensimmäinen vaihe eu-karyoottisen mRNA molekyylin tuottamiseksi. Molekyyliä täytyy muokata monilla tavoilla en-nen kuin se poistuu tumasta. Tärkeimpiä muok-kauksia ovat esi-mRNA:n päiden muokkaus sekä silmukoituminen.

Päiden muokkaus

Eukaryoottisen esi-mRNA molekyylin muokka-us alkaa 7-metyyliguanosiinin (huppu) lisäämi-sellä ensimmäiseen transkriptoituun nukleoti-diin. Hupun lisäys alkaa esi-mRNA:n 5’ päähän, kun RNA polymeraasi II on tuottanut noin 25 nu-kleotidia RNA:ta. Kolme entsyymiä katalysoivat hupun lisäystä. Ensimmäisenä fosfataasi poistaa fosfaatin kehittyvän RNA:n 5’ päästä, tuottaen difosfaatti RNA:ta. Sitten guanyyli transferaasi lisää GMP:n (guanosiinimonofosfaatti). Tulok-sena on guanosiini-huppu. Viimeiseksi metyy-litransferaasi lisää metyyliryhmän guanosiiniin, tuottaen 7-metyyliguanosiinin, valmiin hupun. Koska kaikki kolme entsyymiä sitoutuvat RNA polymeraasiin, muodostuvan esi-mRNA:n 5’ pään muokkauksen täytyy tapahtua heti kun se il-mestyy polymeraasin alta. Lopulta 7-metyyligu-anosiini sitoutuu tumassa CBC:in (cap-binding complex). (Cowling 2010; Alberts ym. 2008).

7-metyyliguanosiinipään lisäys on tärkeä tehok-kaan geenien ilmentymisen sekä solun normaa-lin toiminnan kannalta. Se muun muassa edistää elongaatiota valmistuvassa esi-mRNA:ssa, tekee silmukoitumisen mahdolliseksi sekä on tärkeä mRNA:n translaatiossa. 3’ pään muokkaus on riippuvainen 7-metyyliguanosiinipäästä, ja sil-lä on myös merkitystä mRNA:n kuljetukselle pois tumasta. 7-metyyliguanosiini auttaa solua erottamaan mRNA:n muun tyyppisistä RNA molekyyleista. Esimerkiksi RNA polymeraasi I ja III tuottavat RNA molekyylejä, joista huppu-rakennetta ei löydy. (Cowling 2010; Alberts ym. 2008).

502

Myös esi-mRNA:n 3’ päätä muokataan. Tämä muokkaus tapahtuu, kun RNA polymeraasi II on saavuttanut geenin lopun. esi-mRNA:n 3’ pään paikka on signaali koodattuna DNA:ssa. Myös tämä signaali koodataan valmistuvaan esi-mRNA:han. Tietyt RNA:han sitoutuvat pro-teiinit ja RNA:ta muokkaavat entsyymit tun-nistavat tämän signaalin. Kaksi proteiinia, CstF (cleavage stimulation factor) ja CPSF (cleavage and polyadenylation specifity factor) ovat eri-tyisen tärkeitä. Molemmat näistä proteiineista ovat kiinni RNA polymeraasissa sen liikkuessa DNA jaksoa pitkin, mutta siirtyvät RNA mole-kyyliin tunnistaessaan signaalin. Kun nämä ovat sitoutuneet RNA:han, lisää proteiineja kokoon-tuu paikalle muokkaamaan 3’ päätä. Ensin RNA katkaistaan, jonka jälkeen poly-A-polymeraasi entsyymi lisää yksi kerrallaan noin 200 adeniini nukleotidia 3’ päähän joka syntyi RNA:n kat-ketessa. Paikalle saapuu vielä lisää proteiineja, jotka määrittävät poly-A hännän lopullisen pi-tuuden. Jotkin näistä proteiineista jäävät kiinni häntään ja auttavat ohjaamaan proteiinisyntee-siä. Pian 3’ pään muokkauksen jälkeen RNA polymeraasi irtoaa DNA:sta ja transkriptio päät-tyy. 3’ pään katkaisun jälkeen RNA:sta puuttuu 5’ pään huppu rakenne. Tämä aiheuttaa RNA:n nopean hajoamisen, joka tapahtuu polymeraasi häntää pitkin. Ilmeisesti tämä lopulta aiheuttaa RNA-polymeraasin irtoamisen DNA:sta. Poly-A hännän rakenne vaikuttaa valmiin mRNA mole-kyylin lukukertoihin. (Alberts ym. 2008; Murray ym. 2009; Proudfoot 2011; Ryan & Bauer 2008).

Silmukointi

Valmistuvassa esi-mRNA:ssa on mukana myös jaksoja, jotka eivät koodaa mitään proteiinia. Nämä jaksot, intronit, täytyy poistaa ennen mRNA:n kuljetusta tumasta solulimaan. Intronit poistetaan ja eksonit liitetään yhteen prosessilla jota kutsutaan silmukoinniksi. Silmukointi voi tapahtua yhtä aikaa transkription kanssa. Silmu-kointi tapahtuu pääasiassa RNA molekyylien toi-mesta. Erikoistuneet RNA molekyylit tunnista-vat nukleotidijaksot joissa silmukoitumisen tulee tapahtua ja osallistuvat myös silmukoitumisen kemiallisiin reaktioihin. Näitä RNA molekyylejä kutsutaan snRNA:ksi (small nuclear RNA) ja jo-kaisessa on vähintään seitsemän proteiini alayk-sikköä, jolloin muodostuu snRNP (small nuclear ribonucleoprotein). Nämä snRNP:t muodostavat spliseosomin, kokoelman RNA- ja proteiini-molekyyleja, joka on vastuussa silmukoinnista.

Spliseosomi tunnistaa esi-mRNA:n introneiden päissä olevat konservatiiviset jaksot, ja sen RNA osat sitoutuvat niihin emäspari periaatteen mu-kaan. Silmukointireaktiossa esi-mRNA katkeaa ensin intronin 5’-päästä, kun intronissa oleva adeniinin -OH-ryhmä hyökkää intronin 5’-pään fosforisidokseen. Molekyyli muodostaa tällöin lasson. Toisessa vaiheessa 5’-päässä ollut ekso-ni hyökkää 3’-pään eksonin fosfaattiryhmään. Tapahtumat on esitetty vaiheittain kuvassa 3. Silmukointi tapahtuu tällä tavalla yksi introni kerrallaan, kunnes kaikki intronit on poistettu ja jäljellä ovat enää proteiineja koodaavat eksonit. (Alberts ym. 2008).

Kuva 3: Silmukoituminen. Spliseosomi on jätetty pois selkeyden vuoksi.

Joistain geeneistä voidaan muodostaa erilaisia muotoja mRNA:sta. Tämä tapahtuu vaihtoehtoi-sen silmukoinnin avulla. Uusien tutkimusten mu-kaan jopa 95 % ihmisen geeneistä tapahtuu vaih-toehtoista silmukointia. Siinä joukko proteiineja sitoutuu esi-mRNA:han ja voi joko mahdollistaa tai estää yksittäisen intronin silmukoinnin. Näin ollen osa introneista voikin toimia eksonien ta-paan proteiinien rakennusohjeina. Jotkin eksonit voidaan myös poistaa mRNA:sta kokonaan, tai niiden pituus voi vaihdella. Tällä tavoin yhdes-tä esi-mRNA:sta saadaan suuri joukko erilaisia mRNA molekyylejä jotka koodaavat erilaisia proteiineja. (Alberts ym. 2008; Jin ym. 2011).

503

Virheellinen silmukointi voi aiheuttaa sairauk-sia. β-talassameniassa hemoglobiinin β-globiini proteiinia ei synny tarpeeksi, sillä silmukointi on estynyt eksoni-introni liitoksen nukleotidin vaih-don takia. Valmiiseen mRNA molekyyliin jää introni, joka estää normaalin proteiinisynteesin. (Murray ym. 2009).

mRNA:n kuljetusSolu tunnistaa valmiin mRNA:n siihen kiinnitty-neistä proteiineista. Valmiissa mRNA:ssa on esi-merkiksi poly-A häntä. Jos mRNA:han on sitou-tunut jokin proteiini jota valmiissa mRNA:ssa ei pitäisi olla, esimerkiksi snRNP, solu tietää että mRNA ei ole vielä valmis kuljetettavaksi pois tumasta. (Alberts ym. 2008).

Valmistuvaan mRNA:han liitetään proteiineja transkriptiossa ja muokkausprosesseissa. Näitä proteiineja kutsutaan RNA-binding proteiineiksi (RBP), ja näiden proteiinien perusteella valmis mRNA joko kuljetetaan pois tumasta, tai se jää tumaan hajotettavaksi. Transkription aikana li-sättävä proteiinikompleksi TREX (transcription and export complex) on erittäin tärkeä mRNA:n kuljetukselle pois tumasta. Kompleksin lisäys on välttämätön tapahtuma, jotta mRNA:n kuljetus olisi tehokasta. Myös poly-A häntään sitoutu-vat proteiinit ovat tärkeitä kuljetuksen kannalta. (Kelly & Corbett 2009).

Valmiiseen mRNA:han lisätään tumassa myös mRNA kuljetustekijöitä, jotka sitoutuvat sekä mRNA:han, että NPC:hen (nuclear pore comp-lex). mRNA:han lisätään myös reseptoreja, jot-ka auttavat mRNA:n kuljetuksessa NPC:n läpi. mRNA ja siihen liittyneet proteiinit muodosta-vat ison makromolekyylin, mRNP:n (mRNA ribonucleoprotein) joten solu tarvitsee energiaa mRNA:n kuljettamiseen NPC:n läpi. Kun mRNA on poistunut tumasta, siihen kiinnittynyt resepto-ri irtoaa ja siirtyy takaisin tumaan kuljettaakseen uusia mRNA ketjuja pois tumasta. Solulimassa kuljetustekijät irtoavat ja uusia proteiineja sitou-tuu. Nämä uudet proteiinit ohjaavat mRNA:n kuljetusta solulimassa.(Kelly & Corbett 2009).

Lähteet

Alberts B, Johnson A. Molecular Biology of the Cell. 2008, USA, Garland Science, s. 331–359

Ansari Abulaish, Tuteja Renu, Virander Singh Chauhan; Emerging functions of transcription factors in malaria parasite. 2011 marraskuu

Brehm Alexander, Murawska Magdalena; CHD chromatin remodelers and the transcription cycle. 2011 marraskuu-joulukuu; 2(6): 244–253

Corbett Anita H, Kelly Seth M; Messenger RNA export from the nucleus: A series of molecular wardrobe changes. 2009;10: 1199–1208

Cowling V; Regulation of mRNA cap methylation. 2010Murray R, Bender D; Harper’s illustrated biochemistry.

2009, China, The McGraw-Hill Companies, Inc. s. 346–349

Proudfoot N; Ending the message: Poly(A) signals then and now. 2011 syyskuu 25(17): 1770–1782.

Ryan K, Bauer DL; Finishing touches: post-translational modification of protein factors involved in mammalian pre-mRNA 3’ end formation. 2008 huhtikuu, 40(11) 2384–96.

Yongfeng Jin, Yun Yang, Peng Zhang; New insights into RNA secondary structure in the alternative splicing of pre-mRNAs. 2011 Toukokuu/Kesäkuu. 8(3) 450–457

504

E9 Post-transkriptionaalinen mRNA:n modifionti – miten samankaltaisista tehdään erilaisiaHarjunpää, Joel & Korkala, MattiSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto16.9.2009Tarkastaja: Jarkko Lackman

TiivistelmäTranskription lopputuloksena syntyy DNA:n koodaavan juosteen kanssa lähes identtinen mRNA-kopio (mRNA:ssa tymiinin paikalla urasiili), jonka synteesi tapahtuu aina suunnassa 5’à 3’ eli alkupäästä loppupäähän. Prokaryoot-tisten eliöiden geeniä koodaavan alueen osat ovat kaikki proteiinia koodaavia, joten niillä muodostuu transkrip-tiossa suoraan valmis mRNA. Aitotumallisen solun geenissä on koodaavassa alueessa lisäksi ei-koodaavia osia eli introneita, minkä takia muodostuvaa esiaste-mRNA:ta on muokattava transkription jälkeen. Esiaste-mRNA:n muokkaustapahtumat tapahtuvat aitotumallisen solun tumassa, minkä jälkeen valmis mRNA voidaan kuljettaa solulimaan translaatiota varten. Intronien poistoa esiaste-mRNA:sta kutsutaan silmukoinniksi. Intronit poistetaan, koska ne voivat estää valmiin proteiinin toiminnan tai häiritä proteiinin toimintaa. Muita muokkaustapahtumia ovat Cap-rakenteen lisääminen esiaste-mRNA:n alkupäähän eli 5’-päähän ja poly-A-hännän lisääminen loppu- eli 3’-päähän (polyadenylaatio). Ne lisäävät muodostuvan mRNA:n stabiiliutta, suojaavat valmista mRNA-molekyy-liä vieraiden eksonukleaasien hyökkäyksiltä ja ovat tarpeellisia translaation aloituksessa solulimassa. Vaihtoehtoi-nen silmukointi on yleinen post-transkriptionaalinen modifiointimenetelmä, jonka avulla esiaste-mRNA:ta muok-kaamalla voidaan luoda alkuperäisestä poikkeavia mRNA-molekyylejä. Editointi on erikoistapaus muokkausta-pahtumasta, jossa koodausinformaatiota voidaan transkription jälkeen kemiallisesti muokata mRNA-tasolla.

JohdantoGeenit ovat hyvin samankaltaisia eri lajeilla, lä-hilajeilla kuten ihmisellä ja muilla kädellisillä lähes identtiset. Geenien ilmentyminen proteiini-synteesissä (transkriptio ja translaatio) ja geenin rakenteen perusperiaate (geenien säätelyalueet ja koodaavat alueet) noudattavat myös samaa peruskaavaa eri eliölajeissa. Mikä mahdollistaa elämän monimuotoisuuden, jos eliölajit muistut-tavat lähtökohdiltaan näin paljon toisiaan? Vas-taus löytyy geenien organisoitumisen ja niiden erilaisen säätelyn kautta (Sariola ym. 2003).

Prokaryoottisten eliöiden, kuten bakteerien ja ark-kibakteerien, geenit ovat yhtenäisiä jaksoja, kun taas aitotumallisten eliöiden geenit ovat epäjatku-via. Prokaryoottisilla eliöillä transkriptiossa muo-dostuva mRNA on suoraan valmis translaatiota varten, koska kopioituva mRNA, ei sisällä ei-koodaavia osia eli introneita. Aitotumallisen solun esiaste-mRNA puolestaan sisältää intronit, jotka eivät varsinaisesti koodaa mitään proteiinia, ja jot-ka eivät saa sisältyä varsinaiseen mRNA:han. Sik-si esiaste-mRNA:ta on muokattava tumassa ennen niiden kuljetusta solulimaan translaatiota varten, toisin kuin bakteereilla. Post-transkriptionaalisen

mRNA:n modifioinnin tärkeimpiä vaiheita ovat intronien poisto eli silmukointi, vaihtoehtoinen silmukointi, cap-rakenteen lisäys ja poly-A-hän-nän synteesi, joita jokaista on käsitelty luvussa 2. Lisäksi luvussa 2 on käsitelty editointia, joka on voimakkaasti tutkimuksen kohteena oleva eri-koistapaus modifiointitapahtumista (Murray ym. 2006, Sariola ym. 2003).

Aitotumallisten solujen geenien epäjatkuvuus tarjoaa monia mahdollisuuksia geenien ilmen-tymisen säätelylle, joka on pakollista kehityksen ja toiminnan kannalta. Kuten tiedämme, ihmisen lähes jokaisessa solussa on sama perintöaines puna- ja sukusoluja lukuun ottamatta. Yksittäi-sissä soluissa ilmenee kuitenkin vain hyvin pieni osa yksilön kaikista geeneistä. Geenin aktivoi-tuminen väärissä paikoissa voi johtaa mm. häi-riöihin sikiönkehityksessä, minkä takia geenien ilmentymiseen on kiinnitettävä soluissa erityistä huomiota. Post-transkriptionaaliset muokkausta-vat osallistuvat geenien ilmentymiseen. Lisäksi ne parantavat solulimaan kuljetettavan mRNA:n stabiiliutta ja tunnistusta, jolloin proteiinisyntee-si ei häiriinny mRNA:n siirtyessä tumasta solu-limaan translaatiota varten (Sariola ym. 2003).

505

Post-transkriptionaalineN MRnA:N modifiointi

samaa peruskaavaa eri eliölajeissa. Mikä mahdollistaa elämän monimuotoisuuden, jos eliölajit

muistuttavat lähtökohdiltaan näin paljon toisiaan? Vastaus löytyy geenien organisoitumisen ja

niiden erilaisen säätelyn kautta (Sariola ym. 2003).

Prokaryoottisten eliöiden, kuten bakteerien ja arkkibakteerien, geenit ovat yhtenäisiä jaksoja,

kun taas aitotumallisten eliöiden geenit ovat epäjatkuvia. Prokaryoottisilla eliöillä transkripti-

ossa muodostuva mRNA on suoraan valmis translaatiota varten, koska kopioituva mRNA, ei

sisällä ei-koodaavia osia eli introneita. Aitotumallisen solun esiaste-mRNA puolestaan

sisältää intronit, jotka eivät varsinaisesti koodaa mitään proteiinia, ja jotka eivät saa sisältyä

varsinaiseen mRNA:han. Siksi esiaste-mRNA:ta on muokattava tumassa ennen niiden

kuljetusta solulimaan translaatiota varten, toisin kuin bakteereilla. Post-transkriptionaalisen

mRNA:n modifioinnin tärkeimpiä vaiheita ovat intronien poisto eli silmukointi, vaihtoehtoi-

nen silmukointi, cap-rakenteen lisäys ja poly-A-hännän synteesi, joita jokaista on käsitelty

luvussa 2. Lisäksi luvussa 2 on käsitelty editointia, joka on voimakkaasti tutkimuksen

kohteena oleva erikoistapaus modifiointitapahtumista (Murray ym. 2006, Sariola ym. 2003).

Aitotumallisten solujen geenien epäjatkuvuus tarjoaa monia mahdollisuuksia geenien

ilmentymisen säätelylle, joka on pakollista kehityksen ja toiminnan kannalta. Kuten tiedäm-

me, ihmisen lähes jokaisessa solussa on sama perintöaines puna- ja sukusoluja lukuun

ottamatta. Yksittäisissä soluissa ilmenee kuitenkin vain hyvin pieni osa yksilön kaikista

geeneistä. Geenin aktivoituminen väärissä paikoissa voi johtaa mm. häiriöihin sikiönkehityk-

sessä, minkä takia geenien ilmentymiseen on kiinnitettävä soluissa erityistä huomiota. Post-

transkriptionaaliset muokkaustavat osallistuvat geenien ilmentymiseen. Lisäksi ne parantavat

solulimaan kuljetettavan mRNA:n stabiiliutta ja tunnistusta, jolloin proteiinisynteesi ei

häiriinny mRNA:n siirtyessä tumasta solulimaan translaatiota varten (Sariola ym. 2003).

Post-transkriptionaalineN MRnA:N modifiointi

Post-transkriptionaaliset modifioinnit:

1. silmukointi eli intronien poisto

2. cap-rakenne

3. polyadenylaatio

4. Vaihtoehtoinen silmukointi, editointi

Transkriptio Esiaste-

mRNA

mRNA Translaatio

Proteiini

DNA

Kuva 1: Aitotumallisen solun geenien ilmentymisreitti vaiheittain.

Transkriptiossa DNA:sta kopioitu esiaste-mRNA on muokattava tumassa ennen valmiin mRNA:n lähettämistä solulimaan proteiinisynteesiä var-ten. Kuvassa 1 on esitetty näiden muokkaustoi-menpiteiden eli post-transkriptionaalisten modi-fiointien sijainti geenien ilmentymisreitillä (sini-nen laatikko). Prokaryoottisen (ei tumaa) solun kohdalla mRNA muodostuu transkriptiossa suo-raan solulimaan, sillä niiden geenit ovat jatkuvia, eikä muokkaustoimenpiteitä tarvita (Sariola ym 2003).

Silmukointi

Silmukointi eli intronien poisto on yksi tärkeim-mistä esiaste-mRNA:n muokkaustapahtumista, ja sen suorittaa solun tumassa silmukointiko-neisto eli spliseosomi. Spliseosomin tehtävä-

nä on tunnistaa ja poistaa jokainen yksittäinen introni esiaste-mRNA:sta. Yhdenkin intronin virheellinen poisto voi johtaa toimimattomaan tai väärin toimivaan proteiiniin. Esimerkkinä mainittakoon titiini-geeni, jonka geenin koodaa-vassa alueessa on jopa 244 intronia (Sariola ym. 2003). Nisäkkäiden solussa keskimäärin 50–75 % esiaste-RNA:n sisältämästä informaatiosta ei sisälly varsinaiseen lähetti-RNA:han (Murray ym. 2006), mikä kuvastaa silmukoinnin mer-kitystä geenin ilmentymisreitillä. Kansilehden kuvassa on nähtävillä spliseosomi toiminnassa: se taittaa eli silmukoi intronin, katkaisee sen ja liittää jäljelle jääneet eksonin päät toisiinsa kiin-ni, jolloin lopputuloksen muodostuu pelkästään eksoneista koostuva mRNA (Murray ym. 2006, Sariola ym. 2003). Kuvassa 2 on esitetty silmu-koinnin periaate.

Kuva 1: Aitotumallisen solun geenien ilmentymisreitti vaiheittain.

Transkriptiossa DNA:sta kopioitu esiaste-mRNA on muokattava tumassa ennen valmiin

mRNA:n lähettämistä solulimaan proteiinisynteesiä varten. Kuvassa 1 on esitetty näiden

muokkaustoimenpiteiden eli post-transkriptionaalisten modifiointien sijainti geenien ilmen-

tymisreitillä (sininen laatikko). Prokaryoottisen (ei tumaa) solun kohdalla mRNA muodostuu

transkriptiossa suoraan solulimaan, sillä niiden geenit ovat jatkuvia, eikä muokkaustoimenpi-

teitä tarvita (Sariola ym 2003).

Silmukointi

Silmukointi eli intronien poisto on yksi tärkeimmistä esiaste-mRNA:n muokkaustapahtumis-

ta, ja sen suorittaa solun tumassa silmukointikoneisto eli spliseosomi. Spliseosomin tehtävänä

on tunnistaa ja poistaa jokainen yksittäinen introni esiaste-mRNA:sta. Yhdenkin intronin

virheellinen poisto voi johtaa toimimattomaan tai väärin toimivaan proteiiniin. Esimerkkinä

mainittakoon titiini-geeni, jonka geenin koodaavassa alueessa on jopa 244 intronia (Sariola

ym. 2003). Nisäkkäiden solussa keskimäärin 50–75 % esiaste-RNA:n sisältämästä informaa-

tiosta ei sisälly varsinaiseen lähetti-RNA:han (Murray ym. 2006), mikä kuvastaa silmukoinnin

merkitystä geenin ilmentymisreitillä. Kansilehden kuvassa on nähtävillä spliseosomi toimin-

nassa: se taittaa eli silmukoi intronin, katkaisee sen ja liittää jäljelle jääneet eksonin päät

toisiinsa kiinni, jolloin lopputuloksen muodostuu pelkästään eksoneista koostuva mRNA

(Murray ym. 2006, Sariola ym. 2003). Kuvassa 2 on esitetty silmukoinnin periaate.

Esiaste-RNA

Lähetti-RNA

Kuva 2: Silmukoinnin eli intronien poiston yleisperiaate. Silmukoinnissa esiaste-mRNA:sta

poistetaan intronit ja liitetään eksonit päistään toisiinsa kiinni. 5’- ja 3’-UTR-alueet ovat ei-

introni5’-UTR 3’-UTR eksoni

3’-UTR

eksoni eksoni

eksoni eksoni eksoni

introni

5’-UTR

Kuva 2: Silmukoinnin eli intronien poiston yleisperiaate. Silmukoinnissa esiaste-mRNA:sta poistetaan intronit ja liitetään eksonit päistään toisiinsa kiinni. 5’- ja 3’-UTR-alueet ovat ei-koodaavia alueita, jotka rajoittavat esiaste-mRNA:ta/mRNA:ta molemmista päistä. (Sariola ym 2003, Murray ym. 2006)

506

Vaihtoehtoinen silmukointi

Vaihtoehtoinen silmukointi on merkittävä gee-nien ilmentymisen säätelymekanismi; esimer-kiksi ihmisen geeneistä on 60 % sen kohteena. Intronien päissä olevien tunnistusjaksojen avulla spliseosomi tunnistaa intronin säädellyksi intro-niksi tai vakiointroniksi. Vakiointroni tarkoit-taa normaalisti silmukoitavaa intronia, kun taas säädelty introni on vaihtoehtoisen silmukoinnin kohteena. Säädeltyjä introneita on tyypillisesti vain muutama kussakin geenissä, loput ovat va-kiointroneita. Säädellyt intronit voidaan tarvitta-essa poistaa tai jättää muodostuvaan mRNA:han. Tällöin muodostuu useita erilaisia geenituotteita samasta geenistä, mikä lisää geneettistä moni-muotoisuutta eliöissä ja parantaa solun ja ku-dosten kykyä vastata niiden erityistarpeisiin. Esimerkiksi ihmisen aivoissa ilmentyvällä neu-reksiinigeenillä on 1000 erilaista ilmentymää, ja banaanikärpäsen yhdestä geenistä voidaan

teoriassa tuottaa yli 38 000 erilaista mRNA:n muotoa, mikä on jopa kolminkertainen luku ba-naanikärpäsen geenien yhteenlaskettuun määrän verrattuna. Intronit voidaan erottaa toisistaan poikkeavien tunnistuskohtien ja erityisten tun-nistusmenetelmien avulla, jotka ovat molekyy-litasolta vielä osittain tuntemattomia. Esimerk-kejä vaihtoehtoisen silmukoinnin keinoista ovat eksonin yli hyppäys, vaihtoehtoinen eksoni, ja piilotettu introni. Myös poly-A-hännän paikka voi vaihdella, jolloin geeni katkaistaan eri koh-dista ja saadaan erilaisia (erimittaisia) mRNA-molekyylejä. Vaihtoehtoisen silmukoinnin sää-telystä vastaavat SR-proteiinit, jotka sitoutuvat vasta syntetisoituun esiaste-RNA-molekyyliin ja mahdollistavat tai estävät läheisen intronin tun-nistusjakson käytön. Kuvassa 3 on esitetty esi-merkkinä nisäkkäille tyypillisin vaihtoehtoisen silmukoinnin keino eksonin yli hyppäys, jossa intronien mukana voidaan poistaa myös eksonei-ta (Murray ym. 2006, Sariola ym. 2003).

koodaavia alueita, jotka rajoittavat esiaste-mRNA:ta/mRNA:ta molemmista päistä. (Sariola

ym 2003, Murray ym. 2006)

Vaihtoehtoinen silmukointi

Vaihtoehtoinen silmukointi on merkittävä geenien ilmentymisen säätelymekanismi; esimer-

kiksi ihmisen geeneistä on 60 % sen kohteena. Intronien päissä olevien tunnistusjaksojen

avulla spliseosomi tunnistaa intronin säädellyksi introniksi tai vakiointroniksi. Vakiointroni

tarkoittaa normaalisti silmukoitavaa intronia, kun taas säädelty introni on vaihtoehtoisen

silmukoinnin kohteena. Säädeltyjä introneita on tyypillisesti vain muutama kussakin geenissä,

loput ovat vakiointroneita. Säädellyt intronit voidaan tarvittaessa poistaa tai jättää muodostu-

vaan mRNA:han. Tällöin muodostuu useita erilaisia geenituotteita samasta geenistä, mikä

lisää geneettistä monimuotoisuutta eliöissä ja parantaa solun ja kudosten kykyä vastata niiden

erityistarpeisiin. Esimerkiksi ihmisen aivoissa ilmentyvällä neureksiinigeenillä on 1000

erilaista ilmentymää, ja banaanikärpäsen yhdestä geenistä voidaan teoriassa tuottaa yli 38 000

erilaista mRNA:n muotoa, mikä on jopa kolminkertainen luku banaanikärpäsen geenien

yhteenlaskettuun määrän verrattuna. Intronit voidaan erottaa toisistaan poikkeavien tunnistus-

kohtien ja erityisten tunnistusmenetelmien avulla, jotka ovat molekyylitasolta vielä osittain

tuntemattomia. Esimerkkejä vaihtoehtoisen silmukoinnin keinoista ovat eksonin yli hyppäys,

vaihtoehtoinen eksoni, ja piilotettu introni. Myös poly-A-hännän paikka voi vaihdella, jolloin

geeni katkaistaan eri kohdista ja saadaan erilaisia (erimittaisia) mRNA-molekyylejä. Vaihto-

ehtoisen silmukoinnin säätelystä vastaavat SR-proteiinit, jotka sitoutuvat vasta syntetisoituun

esiaste-RNA-molekyyliin ja mahdollistavat tai estävät läheisen intronin tunnistusjakson

käytön. Kuvassa 3 on esitetty esimerkkinä nisäkkäille tyypillisin vaihtoehtoisen silmukoinnin

keino eksonin yli hyppäys, jossa intronien mukana voidaan poistaa myös eksoneita (Murray

ym. 2006, Sariola ym. 2003).

Kuva 3: Eksonin yli hyppäys. Eksoni voidaan poistaa tarvittaessa säädeltyjen intronien

mukana, jolloin kyseessä on eksonin yli hyppäys (ylempi vaihtoehto). Alapuolella on

esitettynä normaali silmukointi, jossa kaikki intronit ovat vakiointroneita (Murray ym. 2006).

1 2 3 1 3

1 2 3

Kuva 3: Eksonin yli hyppäys. Eksoni voidaan poistaa tarvittaessa säädeltyjen intronien mukana, jolloin kyseessä on eksonin yli hyppäys (ylempi vaihtoehto). Alapuolella on esitettynä normaali silmukointi, jossa kaikki intronit ovat vakiointroneita (Murray ym. 2006).

Cap rakenne ja polyadenylaatio

Cap-rakenne koostuu 7-metyyliguanosiinitri-fosfaattiryhmästä. Rakenne on mukana mm. transkriptiossa. Cap-rakenne (7-metyyliguan-osiinitrifosfaattiryhmä) liitetään 5` päähän. Se liittyy ensimmäisen nukleotidiin 5`-5` trifosfaat-ti sillan kautta. Cap-rakenne on lisätty esiaste-mRNA:han transkription aikana ilmeisesti jo sil-loin kuin RNA- polymerisaatiossa on polymeri-soitunut 20–100 nukleotidiä. Cap-rakenne näyt-tää olevan iso vaikuttaja useissa osissa mRNA:n ja esiaste-mRNA:n aineenvaihduntaa. Usein liittyvä osa tunnistaa rakenteen 5` osan. (Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm)

Poly(A)-häntä koostuu n.200 adenosiinista ja sen tärkein tehtävä on translaatiossa. Poly(A)-häntä syntetisoituu 3` päähän. Lähes kaikissa mRNA:ssa on adenyliinijäämiä poly(A)-hännäs-tä. Tärkein tehtävä sillä on translaatiossa. Hännän pituutta voidaan säädellä solulimassa. On myös esitetty, että poly(A)-häntä on mukana ohjaamas-

sa, kuinka kauan mRNA on solussa ennen kuin se hajotetaan. 3’ pään pilkkominen ja polyadety-laatio ovat yhteydessä transkription päättymiseen.(Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm)

Näiden rakenteiden avulla mRNA tunnistetaan ja se voidaan kuljettaa tumasta sytoplasmaan prote-iinisynteesia varten. 5`-pään cap-rakenne suojaa mRna:ta nukleaaseilta ja toimii signaaleina ri-bosomeille RNA:n translaatiossa. Cap-rakenne ja poly(A)-häntä toimivat kiinnityskohtina kul-jetusproteiineille ja stabiloiville proteiineille. Poly(A)-häntä stabilisoi mRNA:ta ja vaikut-taa myös translaation säätelyssä. (Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm)

Eukaryoottisoluilla transkription lopetus yhdis-tyy mRNA polyadenylaatioon. Poly(A)RNA-polymeraasi lisää noin 250 adenosiininukleotidiä katkaistun mRNA:n jatkoksi. MRNA:n stabiloin-ti tapahtuu poly(A)-hännän johdosta, joka toi-mii myös merkkinä tumasta pois kuljetuksessa. (Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm

507

Cap rakenne ja polyadenylaatio

Cap-rakenne koostuu 7-metyyliguanosiinitrifosfaattiryhmästä. Rakenne on mukana mm.

transkriptiossa. Cap-rakenne (7-metyyliguanosiinitrifosfaattiryhmä) liitetään 5` päähän. Se

liittyy ensimmäisen nukleotidiin 5`-5` trifosfaatti sillan kautta. Cap-rakenne on lisätty esiaste-

mRNA:han transkription aikana ilmeisesti jo silloin kuin RNA- polymerisaatiossa on

polymerisoitunut 20–100 nukleotidiä. Cap-rakenne näyttää olevan iso vaikuttaja useissa

osissa mRNA:n ja esiaste-mRNA:n aineenvaihduntaa. Usein liittyvä osa tunnistaa rakenteen

5` osan. (Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm)

Poly(A)-häntä koostuu n.200 adenosiinista ja sen tärkein tehtävä on translaatiossa.

Poly(A)-häntä syntetisoituu 3` päähän. Lähes kaikissa mRNA:ssa on adenyliinijäämiä

poly(A)-hännästä. Tärkein tehtävä sillä on translaatiossa. Hännän pituutta voidaan säädellä

solulimassa. On myös esitetty, että poly(A)-häntä on mukana ohjaamassa, kuinka kauan

mRNA on solussa ennen kuin se hajotetaan. 3’ pään pilkkominen ja polyadetylaatio ovat

yhteydessä transkription päättymiseen.(Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm)

Näiden rakenteiden avulla mRNA tunnistetaan ja se voidaan kuljettaa tumasta sytoplasmaan

proteiinisynteesia varten. 5`-pään cap-rakenne suojaa mRna:ta nukleaaseilta ja toimii

signaaleina ribosomeille RNA:n translaatiossa. Cap-rakenne ja poly(A)-häntä toimivat

kiinnityskohtina kuljetusproteiineille ja stabiloiville proteiineille. Poly(A)-häntä stabilisoi

mRNA:ta ja vaikuttaa myös translaation säätelyssä. (Tuusa 2009,

http://www.ewa.cz/pages1/813.htm)

Eukaryoottisoluilla transkription lopetus yhdistyy mRNA polyadenylaatioon. Poly(A)RNA-

polymeraasi lisää noin 250 adenosiininukleotidiä katkaistun mRNA:n jatkoksi. MRNA:n

stabilointi tapahtuu poly(A)-hännän johdosta, joka toimii myös merkkinä tumasta pois

kuljetuksessa. (Tuusa 2009, http://www.ewa.cz/pages1/813.htm

5’-UTR eksoni eksoni eksoni 3’-UTR

cap Poly(A)-häntä

Kuva 4: Valmis mRNA, jossa cap-rakenne sekä poly(A)-häntä. Rakenteet suojaavat 5’ ja 3’ päätä. Cap-rakennetta tarvitaan translaation aloitukseen ja 5’ pään suojaukseen. Poly(A)-häntä suojaa toiselta puo-lelta tulevilta eksonukleaasin hyökkäyksiltä. (Murray ym. 2006)

Editointi

Koodausinformaatiota voidaan transkription jäl-keen muuttaa mRNA-tasolla RNA:n editoinnilla kemiallisesti. Tällöin mRNA:n koodaussekvens-si poikkeaa alkuperäisestä DNA:n sisältämäs-tä informaatiosta. Sytidiinideaminaasin avulla pystytään muuttamaan mRNA:n CAA-kodoni UAA-kodoniksi tietyssä spesifisessä paikassa. Lisäksi mRNA:han voidaan tarvittaessa lisätä tai poistaa uridiini-nukleotideja, jolloin niiden sisäl-tämä informaatio muuttuu. RNA-editoinnin tark-kaa periaatetta ei vielä tunneta, mutta nykyisten oletusten mukaan 0,01 % mRNA-molekyyleistä on sen kohteena. (Murray ym. 2006)

Lähteet

Murray R, Granner D, Rodwell V. Harper’s Illustrated Biochemistry. 27th edition. The McGraw-Hill Companies, Inc. 2006: 348–364. http://www.ewa.cz/pages1/813.htm (Luettu 7.9.2009)

Sariola H, Frilander M, Heino T, Jernvall J, Partanen J, Sainio K, Salminen M, Tuesleff J. Solusta yksilöksi: kehitysbiologia. Kustannus Oy Duodecim 2003: 80–93.

Tuusa J. Perinnöllisen informaation ilmentäminen. Solu-jakehitysbiologian luennot 2009 Saatavissa: https://optima.oulu.fi/learning/id90/bin/user

Etusivun kuva: http://www.hhmi.org/images/bulletin/sept2005/

structural_detail.jpgKuva 1 kuvastaa kirjoittajien käsitystä proteiinisynteesin

eri vaiheista, ja on itse tehty. Kuvat 2–4 on mukailtu lähdekirjojen kuvista, lähde on

mainittu kuvatekstissä.

508

E10 MiRNA ja SiRNA – geneettisen koodin säätelyssäHyykoski, Lauri & Korkala, Anna-LiinaSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto9.9.2009Tarkastaja: Olli-Matti Aho

TiivistelmäYksilön kehityksen ja normaalin kasvun edellytyksenä on tarkoin säädelty geneettisen informaation tulkinta. Jokaisen solun sisällä on koneisto, joka huolehtii geneettisen koodin oikeasta ilmentymisestä. Tässä esseessä keskitytään tarkastelemaan lyhyiden RNA -molekyylien, miRNAn ja siRNAn osuutta geneettisen koodin sää-telyssä. MiRNA osallistuu solussa elintärkeisiin prosesseihin, kuten solun kasvun ja kehittymisen säätelyyn. MiRNA-geenien epänormaali ekspressoituminen käynnistää erilaisia patologisia prosesseja. MiRNA:n on to-dettu säätelevän onkogeneenejä, tuumorisupressoreita ja lukuisia muita syöpään liittyviä geenejä. RNA-inter-ferenssi voidaan käynnistää nisäkässoluissa viemällä niihin synteettisesti valmistettuja lyhyitä kaksijuosteisia siRNA-molekyylejä tai tuottamalla niitä solussa virusvektorien avulla. SiRNA-molekyylien ollessa homologi-sia kohdegeenien kanssa on mahdollisuuksia puuttua mihin tahansa fysiologiseen tai patologiseen soluproses-siin. Menetelmään perustuvia lääkeainetutkimuksia on käynnissä lukuisia.

MiRNA MiRNA:t eli mikro-RNA:t ovat n. 22 nukleoti-din mittaisia RNA -pätkiä. Ne löydettiin ensim-mäisen kerran Victor Ambros -laboratoriossa vuonna 1993 C. Elegansilta eli laakamadolta (Lee ym. 1993). MiRNA:t ovat solujen omien geenien koodaamia. Niiden pääasiallinen tehtävä on säädellä tietyn geenin translaatioaktiivisuutta. Ihmisessä tiedetään erilaisia miRNA:n muoto-ja ainakin 400, jotka säätelevät vähintään 30% kaikista ihmisen proteiinia koodavista geeneis-tä (Aula ym. 2006). Yksittäinen miRNA pystyy säätelemään jopa satoja geenejä, ja vastaavasti yksittäistä geeniä säätelee samanaikaisesti usea mikro-RNA. Solujen miRNA -molekyylien il-mentyminen niin määrän kuin laadun suhteen vaihtelee kudostyypin, solutyypin ja yksilönke-hityksen eri vaiheiden mukaan. Siksi jokaisessa solussa on ainutlaatuinen miRNA -ympäristö (Aula ym. 2006, Appasani ym. 2008).

Mikro-RNA -säätely kohdistuu lähetti -RNA:han eli mRNA:han, johon se pyrkii sitoutumaan 3’-UTR -alueelle, poly-A-häntään. Emäspariutumi-nen on harvoin täydellisestä, sillä mikro-RNA sisältää usein muutamia mRNAn kanssa ei-komplementaarisia nukleotidejä. Tämän vuoksi lähetti -RNA ei tuhoudu prosessissa mutta me-nettää osittain tai täysin translaatioaktiivisuu-tensa. MiRNA -molekyylien yhteisvaikutus on osaltaan määrittämässä tietyn geenin ilmenty-

misastetta solussa, ja mikro-RNA -säätelyn tie-detäänkin kohdistuvan etenkin sellaisiin geenei-hin, jotka liittyvät yksilönkehitykseen, solujen erilaistumiseen ja kasvuun tai apoptoosiin sekä solun suojautumiseen ulkoisilta stressitekijöiltä (Aula ym. 2006).

SiRNA SiRNA eli small interfering RNA on myös noin 21 nukleotidin mittainen RNA, mutta eroaa miRNA:sta syntyperän ja toimintansa puolesta. SiRNAn esiaste on yleensä solun ulkopuolinen, pitkä dsRNA, jonka ribonikleaasi III (Dicer) -entsyymi pilkkoo pienemmiksi siRNA -pätkik-si. DsRNA:ta muodostuu esimerkiksi virusinfek-tioiden yhteydessä virusten replikaation välituot-teena. Sitä voi muodostua myös transposoneista, eli niin kutsutuista hyppivistä geeneistä, joiden toiminta on yleensä haitallista solulle (Aula ym. 2006).

SiRNAn tehtävä solussa on estää virusten ja tran-sposonien levittämän haitallisen mRNAn proses-sointi (Carthew ym. 2009). Toisin kuin mikro-RNA, jonka liittymiskohta mRNA:ssa on spesifi-nen, siRNA pystyy liittymään periaatteessa mihin tahansa kohtaan lähetti -RNA:ta (5‘-UTR -alueel-le, proteiinia koodaavalle aluelle tai 3‘-UTR -alu-eelle). Myös vaikutus on erilainen, sillä siRNAn emäspariutuminen mRNAn kanssa on lähes aina täydellistä, mikä johtaa mRNA:n leikkautumiseen sitoutumiskohdasta. Tämän vuoksi siRNA:t ovat

509

tehokkaampia geenien hiljentäjiä kuin miRNA:t (Aula ym. 2006). Lääketieteessä siRNA on näis-tä kahdesta käytännöllisempi juuri tehokkuutensa ansiosta. Geenitutkimuksessa siRNA -molekyy-leillä pyritään hiljentämään yksittäisiä geenejä, jotta näiden toimintaa solu- ja yksilötasolla voi-daan tutkia tarkemmin. Kliinisessä lääketieteessä siRNA pyritään valjastamaan täsmälääkkeeksi mm. perinnöllisiä sairauksia, syöpää ja virusin-fektioita vastaan (Aula ym. 2006).

RNAiRNAi eli RNA-interferenssi on solunsisäinen järjestelmä, jonka tehtävä on puolustaa solua hai-tallisilta ja patogeenisilta nukleiinihapoilta sekä säädellä geenien ilmentymistä eli geeniekspres-siota (Hannan 2002). SiRNA ja miRNA toimi-vat RNA-interferenssin pääasiallisina välittäjinä. Näiden kahden molekyylin interferenssireitit on esitetty kuvassa seuraavalla sivulla.

Kuva 1. siRNA – ja miRNA -koneistojen vertailu. SiRNA -reitti käynnistyy sytoplasmassa, kun Dicer -ent-syymi pilkkoo pitkät dsRNA -ketjut pienemmiksi siRNA -ketjuiksi. Syntyneisiin siRNA -molekyyleihin liittyy Argonaut -proteiini (AGO) sekä RISC (RNA-induced silencing complex), joiden avulla kaksijuos-teinen siRNA avautuu ja mRNA:n kanssa emäspariutuva juoste saadaan esiin. Oikea juoste kuljetetaan lähetti-RNA:n luo, jolloin siRNA liittyy emäsjärjestyksenä mukaiseen kohtaan. Liittymisen seurauksena mRNA leikkautuu liitoskohdasta (De Fougerolles ym. 2007). Mikro-RNA:n reitti alkaa tumassa DNA:sta, josta valmistetaan miRNA:n esimuoto pri-miRNA RNA -polymeraasi II:n koodaamana. Seuraavaksi Drosha -entsyymi pilkkoo syntyneen pri-miRNA:n pienemmäksi, noin 60–70 nukleotidin mittaiseksi pät-käksi, pre-miRNA:ksi. Exportin 5 -proteiini kuljettaa tämän mikro-RNA:n esiasteen sytoplasmaan, jossa siihen sitoutuu samanaikaisesti Dicer -entsyymi. Pre-miRNA pilkkoutuu entsyymin käsittelyssä noin 22 nukleotidin mittaiseksi miRNA:ksi ja liittyy AGO-RISC -kompleksiin (De Fougerolles ym. 2007). Seu-raavaksi miRNAn kaksoisjuoste avataan ja aktiivinen juoste kuljetetaan sen emäsjärjestyksen mukai-seen paikkaan, yleensä 3’-UTR -alueelle. Lopulta miRNA:n ja mRNA:n onnistunut sitoutuminen johtaa mRNA:n passivoitumiseen ja translaation estymiseen (Aula ym. 2006).

510

RNA-interferenssi solun fysiologiassa ja patologiassaMiRNA:t ja nykyisen tietämyksen mukaan myös tietyt siRNA:t ovat siis endogeenisesti syntyneitä molekyylejä, jotka osallistuvat elintärkeisiin pro-sesseihin, kuten solun kasvun ja kehittymisen sää-telyyn. Tietokone- ja kokeellisten mallien avulla on arvioitu ihmisessä olevan satoja miRNA gee-nejä ja niiden oletetaan kattavan 0.5–1% ihmisen koko genomista. Myös RISC-komponenttien ho-mologeja on osoitettu ihmisellä olevan lukuisia. Näin ollen on ymmärrettävää, että miRNA- sekä RISC-geenien epänormaali ekspressoituminen saattaa käynnistää erilaisia patologisia proses-seja. MiRNA:n ekspressioprofiili syöpäsoluissa osoittaa, että monien miRNA:n kautta tapahtuva geenien vaimentaminen häiriintyy pahanlaatuisis-sa kasvaimissa. MiRNA:n on todettu säätelevän onkogeneenejä, tuumorisupressoreita ja lukuisia muita syöpään liittyviä geenejä, jotka kontrolloi-vat solusykliä, apoptoosia, solun liikkumista sekä angiogeneesiä (Gong ym. 2005).

Yksilönkehitys ja solujen erilaistuminen

Kehityksen ajoittumiseen liittyvien geenien tut-kiminen laakamadolla (C. Elegans) vuonna 1993 johti ensimmäisen miRNA-molekyylin, lin-4:n löytämiseen. Kyseisen molekyylin kohdegeeni-en lin-14:n ja lin-28:n havaittiin osallistuvan epi-dermaalisen solulinjan kehityksen ohjelmointiin. Niiden pitoisuudet soluissa nousivat tiettyjen larvan kehitysprosessien aikana (Wightman ym. 1993). Toinen identifioitu miRNA, let-7 säätelee neljännen larvavaiheen päättymistä. Sekä lin-4 että let-7 kohdegeenien on todettu olevan erit-täin konservoituneita ja niiden oletetaankin sää-televän samantyyppisiä prosesseja myös muissa lajeissa. Let-7:n ekspression häiriintymisen on todettu korreloivan tiettyihin syöpätyyppeihin ja sen oletetaan säätelevän RAS-onkogeeniä (Johnson ym. 2005). Embryogeneesiä miRNA:n säätelykohteena on tutkittu muun muassa ba-naanikärpäsellä (D.Melanogaster). Nisäkkäillä esiintyvän miR196:n, joka säätelee Homeobox-geeniperheen jäsenen HOXB8-geenin vaimenta-mista, voidaan olettaa toimivan embryogeneesin säätelijänä myös ihmisellä (Mansfield ym. 2004).

MiRNA:n rooli solujen erilaistumisessa paljastui tutkimuksessa, joka osoitti monitumaisten solu-jen muodostumisen keskeytymisen miR-223 yli-ekspressoiduissa hiiren osteoklastien prekursori-

soluissa. Täten on oletettu, että miR-223 osallistuu solujen differentaation säätelyyn osteoklasteissa sekä mahdollisesti myös monissa muissa soluissa. Kantasolututkimuksissa MiR-133:n ja miR-1:n on osoitettu välittävän mesodermin muodostumista embryonaalisista kantasoluista neuroektodermaa-lisen geeniekspression vaimentamisen kautta. Toisaalta vaikka miR-1:n on edelleen todettu in-dusoivan sydän- ja luurankolihassolujen differen-taatiota, näyttäisi miR-133:lla olevan myogenee-siä vaimentavia vaikutuksia. Vastakkaisille vaiku-tuksille selitys löytynee miR-1:n kohdentumisesta lihassolujen differentaatiota estavän Notch-sig-nalointireitin vaimentamiseen. (Zhang ym. 2006, Sugatani ja Hruska 2007, Ivey ym. 2008).

Ohjelmoitu solukuolema ja solun kasvukontrolli

Apoptoosin säätely voi tapahtua tuumorisup-ressorien tai onkogeenien kautta. MiR-34-per-heeseen kuuluvien miRNA-molekyylien on todettu olevan komponentteja tuumorisupres-sori p53-reitillä. Kyseisen perheen geenien on havaittu aktivoituivan solussa DNA:n vaurioi-tumisen sekä onkogeenisen stressin myötä ja niiden transkription käynnistymisen olevan riip-puvainen p53-pitoisuudesta in vitro ja in vivo. Lisäksi tutkimuksissa on osoitettu, että MiR-34 indusoi solusyklin pysähtymisen sekä primaari että tuumorisoluviljelmissä. Apoptoosin solun sisäisinä säätelijöinä toimivat myös miR-15 ja miR-16. Vaikutus välittyy antiapoptoottisen tekijän Blc2:n välityksellä. Antiapoptoottisen Blc-2:n on todettu yliekspressoituvan tietyissä syöpäsoluissa (rintasyöpä, hodgkinin lymfoo-ma, B-solu lymfooma) ja aiheuttavan kudos-ten tuumorigeneesin. Näissä soluissa havaittiin samanaikaisesti alentuneita miR-15 ja miR-16 pitoisuuksia ja edelleen miR-15–16 -ryppäiden soluun siirtäminen normalisoi välittömästi Blc2-tasoa (Lynam-Lennon ym. 2009, Pawitan 2009).

Solun ulkopuolelta tuleviin apoptoosisignaa-leihin liittyy solun pinnan reseptori DR (death reseptor), jonka ligandina toimii TRAIL (tumor necrosis –related apoptosis inducing ligand). Reseptorin aktivoituminen johtaa kaspaasiakti-vaation kautta solun apoptoosiin. Kyseisen sig-nalointireitin säätelyyn osallistuu useita eri koh-degeeneihin vaikuttavia miRNA-molekyylejä. Näistä miR-221 ja miR-222 näyttäisivät säätele-vän apoptoosia TRAIL- aktivaation vaimentami-sella (Lynam-Lennon ym. 2009).

511

RNA-interferenssin terapeuttinen hyödyntäminenRNA-interferenssi voidaan käynnistää nisäkäs-soluissa viemällä niihin synteettisesti valmistet-tuja lyhyitä kaksijuosteisia siRNA-molekyylejä tai tuottamalla niitä solussa virusvektorien avul-la. RNA-molekyylien ollessa homologisia koh-

degeenien kanssa on mahdollisuudet puuttua erittäin tehokkaasti ja vaivattomasti mihin tahan-sa fysiologiseen tai patologiseen soluprosessiin. RNA-interferenssiin perustuvia prekliinisiä ja kliinisiä tutkimuksia onkin käynnistetty lukuisia. Taulukossa 1 on esitetty lupaavia siRNA-me-kanismia käyttävia terapeuttisia hoitokokeiluja (Gong ym. 2005, Saksela 2007).

Taulukko 1. siRNA-mekanismia hyödyntäviä hoitokokeiluja

siRNA

kohdegeeni

Sairaus siRNA

kohdegeeni

Sairaus siRNA

kohdegeeni

Sairaus

Mutaatio

p53

K-Ras

BCR-ABL

MDR1

C-RAF

Bcl-2

VEGF

PKC-αB-kateniini

Syöpä HIV-Tat

HIV-Tat

HIV-Rev

HIV-Vif

HIV-Hef

HPV-E6, -E7

HBV-S1

HBV-S2

HBV-S

HBV-X

CCR5

CXCR4

CD4

Virus- infektio

Fas-reseptori

Kaspaasi-8

Akuutti maksan

vajaatoiminta

TNF-α Sepsis

Menestyksellisiä hoitokokeiluita sekä kudos-viljelmillä että koe-eläimillä on tehty lukuisia. Toistaiseksi ei vielä kuitenkaan yhdelläkään siRNA-valmisteella ole myyntilupaa. Ongel-mia tuottaa synteettisesti tai geenivektoreiden avulla tuotettun siRNA:n annostelu ja kuljetus potilaiden kudoksiin ja soluihin. Paikallisesti annosteltavien lääkeaineiden kehittelyssä ollaan pidemmällä, joskin tulokset laskimoon annostel-tavilla liposomeihin pakatulla siRNA:lla apoli-poroteiini B-pitoisuuksien pienentämisessä ja

korkean kolesterolin hoidossa ovat vaikuttaneet optimistisilta. Huolta ovat aiheuttaneet myös tiedot eräiden siRNA-molekyylien kyvystä es-tää myös niille vain osittain homologisten gee-nien ilmentymistä. Lisäksi siRNA saattaa myös pienestä koostaan huolimatta laukaista soluissa haitallisen viruspuolustusvasteen. Siten RNAi:n vahvuutena pidetty spesifisyys saattaa olla yli-mainostettua ja hoitojen haittavaikutukset luul-tua todennäköisempiä (Saksela 2007).

512

Lähteet

Appasani K. MicroRNAs: From basic science to disease biology 2008 36–48.

Aula P, Kääriäinen H, Palotie A. Perinnöllisyyslääketiede. 3. uudistettu painos. Duodecim 2006 25–30.

Carthew RW, Sontheimer EJ. Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell 2009; 136: 642–655.

De Fougerolles A, Vornlocher H-P, Maraganore J, Lieberman J. Nature reviews drug discovery 2007; 6: 443–453.

Gong H, Liu C-M, Liu D-P, Liang C-C. The role of small RNAs in human diseases: Potential troublemaker and therapeutic tools. Medicinal Research Reviews 2005; 25: 361–381.

Hannan GJ. RNA-interference. Nature 2002; 11: 418(6894): 244–51

Ivey KN, Muth A, Arnold J, King FW, Yeh R-F, Fish JE, Hsiao EC, Schwartz RJ, Conklin BR, Bernstein HS, Srivastava D. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell 2008; 2: 219–229.

Johnson SM, Grosshans H, Shingara J, Byrom M, Jarvis R, Cheng A, Labourier E, Reinert KL, Brown D, Slack FJ. RAS is regulated by the let-7 microRNA family. Cell 2005; 120: 635–647.

Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. Elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell 1993; 75: 843–854.

Lynam-Lennon N, Maher SG, Reynolds JV. The roles of microRNA in cancer and apoptosis. Biol Rew 2009; 84: 55–71.

Mansfield JH, Harfe BD, Nissen R, Obenauer J, Srineel J, Chaudhuri A, Farzan-Kashani R, Zuker M, Pasquinelli AE, Ruvkun G, Sharp PA, Tabin CJ, McManus MT. MicroRNA-responsive ‘sensor’ transgenes uncover Hox-like and other developmentally regulated patterns of vertebrate microRNA expression. Nat Genet 2004; 36(10): 1079–83.

Pawitan JA. The possible use of RNA interference in diagnosis and treatment of various diseases. The International J of Clin Practise 2009; 63: 1378–1385.

Saksela K. Joko RNA-interferenssi on valmis klinikkaan? Duodecim 2007; 123: 1137–1138.

Sugatani T, Hruska KA. MicroRNA-223 is a key factor in osteoclast differentiation. J Cell Biochem 2007; 101: 996–9.

Wightman B, Ha I, Ruvkun G. Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. Elegans. Cell 1993; 75: 855–862.

Zhang B, Xiaoping P, Anderson TA. MicroRNA: A new player in stem cells. J Cell Physiol 2006; 209: 266–269.

513

E11 Mitokondrion DNA – mitokondriosairaudetRaumonen, Salli & Ryynänen, VilleSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto20.9.2011Tarkastaja: Sami Palomäki

TiivistelmäMitokondrion genomi eroaa suuresti tuman genomista. Se on rakenteeltaan tiiviimpi, eri geenit ovat osittain päällekkäin pakkautuneita,muistuttaen näin suuresti bakteerien perimää. Myöskin mitokondriossa tapahtuva transkriptio ja translaatio toimivat hieman erilaisesti kuin tuman geenien vastaavat tapahtumat. Mitokond-riotaudit ovat joukko kliinisesti, geneettisesti ja biokemiallisesti monimuotoisia tauteja, jotka voivat ilmetä missä tahansa kudoksessa, sekä millä iällä tahansa noudattaen useita eri periytymismalleja. Mitokondriotaudit kehittyvät yleensä mitokondrioiden soluhengitysketjun häiriöistä. Täten mitokondrioiden toiminnan vaurioitu-minen johtaa häiriöihin erityisesti lihaksiston ja hermoston toiminnassa. Mitokondriotaudit johtuvat mutaati-oista mtDNA:ssa tai niissä tuman geeneissä, jotka koodittavat mitokondrioiden proteiineja. Mitokondriotaudin epäily perustuu usein sekä kliiniseen kuvaan että sukutietoihin ja poikkeaviin laboratoriolöydöksiin. Tunnettuja mitokondriotauteja ovat PEO-tauti, Leberin perinnöllinen näköhermosairaus (LHON) ja MIRAS eli mitokond-rionaalinen resessiivinen ataksia syndrooma.

JohdantoVaikka eri ominaisuuksien periytymistä on tut-kittu jo vuosisatojen ajan, suuri harppaus koettiin vuonna 1944 kun Oswald Averyn tutkimusryhmä yhdisti eliöiden ominaisuuksien periytymisen DNA:han. Ihmisen genomi kartoitettiin vuonna 2001, ja nykyään erilaiset DNA-tutkimukset ovat yleistymässä diagnostisina työkaluina lääketie-teessä. Kuitenkin mitokondrion oma DNA ja sen erilaisista vajaatoiminnoista johtuvat sairaudet ovat vielä ns. uutta aluetta. Tuntemattomia mi-tokondriotauteja tullaankin varmasti diagnosoi-maan tulevaisuudessa runsaasti. Odotettavissa onkin myös ennakoivan seulonnan yleistyminen esim. lasten hankintaa harkittaessa.

Mitokondrion DNAIhmisen genomi, perimämme, on kaikki se ge-neettinen tieto jonka solumme sisältävät DNA:n muodossa. Tosiasiassa omaamme kaksi geno-mia, monimutkaisen tuman genomin ja yksin-kertaisen mitokondrion genomin. (Read ym. 1999) Mitokondrio sisältää oman geneettisen aineksen, mtDNA:n, joka on solun tumassa si-jaitsevasta DNA:sta erillään. Endosymbiootti-sen teorian mukaan mitokondriot olivatkin alun perin bakteereja, jotka solun sisään päästyään kehittivät symbioottisen suhteen isäntäsoluunsa mahdollistaen uudenlaisen aineenvaihdunnan niille molemmille. (Cooper ym. 2007)

Ihmisen mitokondrioiden DNA on huomattavas-ti pienempi ja suppeampi kuin solun tuman sisäl-tämä DNA. Kuitenkin se on täynnä erittäin tii-viisti vierekkäin tai osittain päällekkäin pakkau-tuneita geenejä, joiden välissä on hyvin vähän ei-koodaavia nukleotideja ja intronijaksot puut-tuvat siitä tyystin. (Montoya ym. 2006, Cooper ym. 2007) Mitokondrioiden DNA ei myöskään sisällä histoneita ja muistuttaa näin läheisesti bakteerien DNA:ta. Erikoista onkin, että loppu mitokondrion tarvitsemasta perinnöllisestä ai-neksesta sijaitsee tumassa, jonne sen uskotaan siirtyneen varhaisen mitokondrion genomista. (Cooper ym. 2007)

MtDNA

Mitokondrion DNA on pakkautuneena yhdeksi kierteiseksi kaksoisjuosteiseksi molekyyliksi, joka sisältää vain 37 eri geeniä. Ihmisen koko genomissa on noin 80 000 eri geeniä. Mito-kondrion geenit ovat myös pienempiä kuin tu-massa sijaitsevat vastineensa. (Read ym. 1999) MtDNA:n vastinjuosteet eroavat suuresti toi-sistaan jo nukleiinihappojen osalta, H-juoste (Heavy) on täynnä guaniineja kun taas L-juoste (Light) sytosiineja. Erikoisuutena on myös pieni kohta mitokondrion genomista, jossa kaksois-juosteet saavat rinnalleen vielä kolmannen, H-juosteen pienen kopion. Tätä rakennetta kutsu-taan 7S DNA:ksi. (Read ym. 1999)

514

37 eri geenistä 24 kappaletta ovat valmiita tuot-teita RNA-muodossa; kaksi ribosomi-RNA:ta (12 S ja 16 S rRNA), sekä 22 eri siirtäjä-RNA:ta (tRNA). Jäljelle jäävät 13 eri geeniä ovat po-lypeptidien (proteiinien) koodaamista varten. Nämä ribosomi-RNA:t sekä siirtäjä-RNA:t muodostavat lähes täydellisen koneiston mito-kondriossa tapahtuvaa proteiinisynteesiä varten. (Montoya ym. 2006, Cooper ym. 2007) Syntyvät proteiinit ovat kaikki välttämättömiä elektronin-siirtoketjun komponenttien alayksiköitä. (Solu-netti 2011)

MtDNA:n transkriptioMitokondrion transkriptio eroaa huomattavasti tumassa tapahtuvasta. Transkriptio alkaa kol-mesta eri pisteestä mtDNA:ssa, joista kaksi H-juosteessa, molempia juosteita kopioidaan samanaikaisesti ja luenta jatkuu useiden geeni-en yli. Tuloksena on kolme useita geenejä sisäl-tävää suurta RNA-juostetta, jotka ”rakoilevat” osiin synnyttäen kypsät lähetti-RNA:t. (Montoya ym. 2006) Rakoilussa tietyille geeneillä lisätään myös lopetuskodoni lähetti-RNA:han, koska ne puuttuvat mtDNA:sta sen tiiviin pakkauksen vuoksi. (Read ym. 1999) Ainoa mtDNA:n pro-moottorialue löytyy kolmoisjuosteiselta, D Loo-piksi kutsutulta alueelta, ja se toimii molempien juosteiden promoottorina. (Montoya ym. 2006)

MtDNA:n translaatioMtDNA:n koodaama pieni siirtäjä-RNA:n mää-rä (22kpl) korostaa koko perintöaineksen tärkeää piirrettä: se käyttää aavistuksen erilaista geneet-tistä koodia kuin tuman DNA:n ”universaali” koodi, joka ilmenee sen poikkeavassa kodoni-antikodoni luennassa. (Solunetti 2011, Coo-per ym. 2007) Mitokondrion proteiinisynteesin translaatiovaiheessa tapahtuvaa erikoista lähetti-RNA:n luentaa voidaan kuvata äärimmäiseksi ”huojuva emäs” käyttäytymiseksi. Kahdeksan siirtäjä-RNA:n antikodonit tunnistavat kodonit vain varmasti kahden ensimmäisen emäksen tarkkuudella, kolmas emäs voi olla mikä tahansa neljästä vaihtoehdosta ja ”huojumaan” kykenevä antikodonin U pariutuu siihen. Näin yksi siirtäjä-RNA tunnistaa neljä eri kodonia. Loput 14 siir-täjä-RNA:ta tunnistavat kodonit kahden ensim-mäisen emäksen tarkan vastinemäksen mukaan, sekä kolmannen sen puriini- tai pyrimidiiniluon-teen mukaisesti. Näistä siirtäjistä kukin kykenee

tunnistamaan kaksi eri kodonia lähetti-RNA:sta. Näin toimiessaan siirtäjä-RNA:t tunnistavat 60 eri kodonia ja neljä ”lukukelvotonta” toimivat lopetuskodoneina. (Read ym. 1999) Koska lu-enta eroaa suuresti normaalin translaation toi-minnasta, myös lopputuotteet ovat erilaisia. Osa lähetti-RNA:n kodoneita saa aikaan mitokond-riossa tapahtuvassa luennassa eri aminohapon liittymisen syntyvään polypeptidiketjuun kuin solulimassa. (Solunetti 2011, Cooper ym. 2007)

Tuman mitokondrionaalinen DNA

Mitokondrion keskeiset toiminnot kuten mat-riksissa tapahtuva pyruvaatin ja rasvahappojen hapetus, β-oksidaatio sekä sitruunahappokierto, sisäkalvolla toimiva oksidatiivinen fosforylaatio, sekä osallistuminen steroidien ja hemin syntee-siin vaativat kaikki valtavat määrät esim. erilai-sia entsyymejä. Koska mtDNA on niin suppea, valtaosaa mitokondrion toimintaan vaadittavista proteiineista, yli 600 kpl, koodataan tuman mi-tokondrionaalisessa DNA:ssa. (Solunetti 2011) Sieltä löytyvät geenit lopuille elektroninsiirto-ketjun kompleksien alayksiköille, sekä erilaisille siirtäjäproteiineille, lukuisille rakenneproteii-neille ja etsyymeille yms. Nämä proteiinit synte-tisoidaan normaalin transkription avulla tumas-sa, jonka jälkeen translaatio tapahtuu soluliman ribosomeissa. Valmiit tuotteet kuljetetaan mito-kondrioon kuljetusrakkuloissa. Onkin tärkeää huomata että vaikka mtDNA sisältää ribosomi-RNA:n geenit niin ribosomien proteiiniosat koodataan tumassa, samoin kuin aminoasyyli-tRNA-syntetaasi. (Read ym. 1999) Kumpikaan DNA ei siis saa aikaan toimivaa mitokondriota ilman toista. (Solunetti 2011)

Mitokondrio sairaudetMitokondriotaudit ovat hyvin laaja tautiryhmä, ja ne ovat kliinisesti, geneettisesti sekä biokemi-allisesti erittäin monimuotoisia. Ne voivat ilmetä missä tahansa kudoksessa, sekä millä iällä tahan-sa noudattaen useita eri periytymismalleja. (Aula ym. 2006) Mitokondriotaudit kehittyvät yleensä soluhengitysketjun ja sen alatoimintojen häiri-öistä. Täten mitokondrioiden toiminnan vaurioi-tuminen johtaa häiriöihin erityisesti aineenvaih-dunnaltaan aktiivisten elinten ja kudosten, kuten lihaksiston ja hermoston toiminnassa. (Wallace 1999, Kuusisto ym. 2003)

515

Mitokondriotautien geneettiset syyt

Mitokondriotaudit johtuvat mutaatioista mtDNA:ssa tai niissä tuman geeneissä, jotka koo-dittavat mitokondrioiden proteiineja (tuman mito-kondrionaalinen DNA). Lisäksi geenivirheet tu-massa, niissä geeneissä jotka huoltavat mtDNA:ta, voivat aiheuttaa erilaisten mtDNA-mutaatioiden kertymistä. (Wallace 1999, Aula ym. 2006)

Erilaisia mtDNA:n mutaatioita, jotka aiheuttavat mitokondriotauteja ovay mtDNA:n yksittäinen deleetio sekä mtDNA:n pistemutaatio. Deleetios-sa mtDNA:sta puuttuu kohta, kun taas pistemu-taatiossa yksi emän on muuttunut DNA-jaksossa. Pistemutaatiot voidaan jakaa vielä kahteen alaryh-mään, ensimmäisessä mutaatio kohdistuu proteii-neja koodaaviin geeneihin (missense-mutaatio), ja saa aikaan sen että translaatiossa syntyvään po-lypeptidiketjuun liitetäänkin eri aminohappo. Toi-sessa mutaatio kohdistuu niihin geeneihin jotka koodaavat proteiinisynteesikoneiston osia, kuten siirtäjä-RNA:ta tai ribosomi-RNA:ta. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006, Solunetti 2011)

Tuman DNA:n geenivirheet aiheuttavat myös mitokondriotauteja. Multippelit mtDNA-delee-tiot johtuvat tuman geenivirheistä niiden prote-iinien geeneissä, jotka normaalisti huolehtivat mtDNA:n tarkastamisesta, korjauksesta ja kah-dentamisesta. MtDNA:n määrällinen vähentymi-nen eli depleetio on usein hyvin kudosspesifis-tistä, ja rajoittuu täten yhteen kudokseen. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

Periytyminen

Mitokondriotaudit voivat periytyä maternaali-sesti tai mendelisten periytymistapojen mukai-sesti. Maternaalisesti eli vain äidin välityksellä periytyviin tauteihin kuuluvat mitokondrion oman DNA:n mutaatiot eli esim. mtDNA:n pis-temutaatio. MtDNA periytyy siis äidiltä jälkeläi-selle munasolun sytoplasmassa, joten mtDNA:n häiriöistä johtuvaa tautia sairastavan miehen jälkeläiset ovat aina terveitä mutta tautia sai-rastavan naisen lapset voivat sen periä. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006, Kuusisto ym. 2003) Tuman geenivirheet periytyvät mendelististen kaavojen mukaisesti, eli autosomissa joko vallit-sevasti tai peittyvästi. Lisäksi mitokondriotaudit voivat ilmetä myös sporadisesti eli satunnaisesti esiintyvinä. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006, Kuusisto ym. 2003)

Oireet

Vakavasti mitokondrioiden toimintaa häiritse-vä geenivirhe aiheuttaa taudin ilmentymisen jo varhaislapsuudessa ja johtaa varhaiseen meneh-tymiseen, mutta biokemiallisesti lievemmät tau-dit puhkeavat usein vasta aikuisiällä. MtDNA:n geenivirheet aiheuttavat eri kudosten toiminta-häiriöitä, kuten aikuisten sydänlihasrappeutu-mia, myopatioita, kuulon menetystä, diabetesta, aivoinfarkteja, sekä eriasteisia hermoston rap-peumasairauksia. Lapsilla ilmenee usein vaikei-ta aivo- ja systeemisairauksia. (Aula ym. 2006) Lapsilla mitokondriotaudit ilmenevät yleensä monielinsairauksina, joissa kohde-elimet eivät ole toiminnallisesti suorassa yhteydessä toisiin-sa. Esimerkkinä tästä Pearsonin oireyhtymä, jolloin potilaalla voi ilmetä munuaisten vajaatoi-mintaa, diabetestä ja anemiaa. (Aula ym. 2006)

Diagnosointi

Mitokondriotaudin epäily perustuu usein sekä kliiniseen kuvaan että sukutietoihin ja poikkea-viin laboratoriolöydöksiin. Tautien diagnosointi on kuitenkin erittäin haasteellista niiden moni-muotoisuuden takia. Sama biokemiallinen häiriö voi johtaa erilaisiin taudinkuviin tai erilaiset gee-nivirheet voivat aiheuttaa saman kliinisen oireis-ton. Joka tapauksessa kliinisen epäilyn jälkeen tutkitaan veren ja aivo-selkäydinnesteen laktaat-tipitoisuudet, jotka tyypillisesti ovat tautia sai-rastavilla koholla mutta ei välttämättä aina, joten sen jälkeen otetaan usein lihasbiopsia. (Aula ym. 2006, Kuusisto ym. 2003)

Lihasbiopsian (koepalan) histologinen tutkimus on erittäin tärkeä diagnostinen työkalu tutkittaes-sa mitokondriotaudin epäilyä, koska mitokond-rioiden toiminnan häiriöt voivat näkyä esim. niiden lisääntyneenä määränä lihassoluissa. Ker-tymä havaitaan histokemiallisessa erikoisvärjä-yksessä, modifioitu Gomorin trikromivärjäys, punaisena rakenteeltaan pirstoutuneena alueena. Löydös voidaan vielä varmistaa elektronimik-roskooppisesti mutta tätä lisätutkimusmenetel-mää ei tarvita rutiinidiagnostiikassa. Kaikkien näiden tulosten ja kliinisen oirekuvan sopiessa mitokondriotautiin teetätetään mahdollisesti geenianalyysi, jonka jälkeen päätetään jatkotoi-menpiteistä. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

516

Mitokondriotauteja

Nykyään tunnetaan jo yli 100 erilaista mtDNA:n patogeenista pistemutaatiota sekä erinäisiä dup-likaatioita ja deleetioita, jotka aiheuttavat jonkin mitokondriotaudin (Aula ym. 2006) mutta tässä esseessä käydään läpi vain muutamia, keskeisiä mitokondriotauteja ja pyritään esimerkkien avul-la antamaan monipuolinen käsitys niiden eri il-mentymismuodoista.

mtDNA:n deleetiotYksittäinen mtDNA:n deleetio tarkoittaa puutos-ta eli ns. katkosta mitokondrion omassa DNA:ssa. Usein yksittäinen deleetio tapahtuu äidin muna-solun kehityksessä tai varhaisessa sikiönkehi-tyksessä. Tästä johtuvia mitokondriotauteja ovat esim. sporadinen PEO, Kearns-Sayren (KSS) ja Pearsonin oireyhtymät. Sporadinen PEO eli etenevä ulkoisten silmälihasten heikkous on aikuisiällä puhkeava tauti, joka alkaa luomien roikkumisella ja voi joko rajoittua silmän seudun ongelmiin tai ilmetä koko kehossa yleistyneenä lihasten kramppaustaipumuksena ja heikkoute-na. Tauti todetaan lihasbiopsiasta, jossa tutkitaan mitokondrioiden poikkeavuutta tai jatkotutki-muksessa, jossa tutkitaan mitokondrionaalisia entsyymejä biokemiallisesti. (Lihastautiliitto)

KSS eli Kearns-Sayren oireyhtymä on myös usein sporadinen eli ei periytyvä mitokondrio-tauti, joka puhkeaa usein ennen 20 ikävuotta. Oireina esiintyy silmien liikerajoittuneisuutta, verkkokalvon rappeumia, lihasten heikkoutta ja yhteistoiminnan häiriöitä (ataxia), sekä joskus tavataan myös eriasteisia sydänongelmia, diabe-testa ja kehitysvammaisuutta. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006, Lihastautiliitto)

Pearsonin oireyhtymä on varhaislapsuudessa alkava vakava sairaus, jolle on tyypillistä ime-väisiässä alkava vaikea anemia, haiman eksok-riinisen osan toimintahäiriö sekä joskus myös muita oireita kuten munuaisen tubulusvaurio ja diabetes. Potilas yleensä menehtyy ensimmäis-ten elinvuosien aikana. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

Multippelit deleetiot eli useat katkokset mtDNA:ssa syntyvät tumassa olevan geenivir-heen seurauksena. Multippelit deleetiot ovat peräisin tumasta ja periytyvät joko vallitsevas-ti tai peittyvästi. Tähän tautiryhmään kuuluu myös PEO, joka ei kliinisesti eroa sporadisesta PEO:sta, vaan vain periytymismallin kautta. Li-

säksi ryhmään kuuluu MIRAS eli mitokondrio-naalinen resessiivinen ataksia syndrooma, joka on Suomen yleisin periytyvä ataksia. Ataksia on pikkuaivojen toimintahäiriö, joka ilmenee moto-riikan poikkeavuutena kuten hapuilevana käve-lynä. MIRAS ilmenee tyypillisesti noin 30 ikä-vuoden tienoilla alkavilla tasapaino-ongelmilla ja sairauteen liittyy usein kognitiivisen tason las-kua, erinäisiä psykiatrisia ongelmia sekä epilep-siaa. Taudista seuraa usein pysyvä sairaalahoito. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

mtDNA:N pistemutaatiotPistemutaatiot ovat mtDNA:n yhden emäksen mutaatiota, jotka voidaan jakaa kahteen ryhmään riippuen sen geenin lopputuotteesta, jossa mu-taatio on tapahtunut. Ryhmässä yksi, eli proteii-nia koodaava geeni, esiintyy maternaalisesti (X-kromosomin kautta) periytyvä Leberin perinnöl-linen näköhermosairaus (LHON), joka on yleisin missense-mutaatioista johtuva tauti. Se ilmenee erikoisesti aiemmin terveiden nuorten miesten äkillisenä näönmenetyksenä, joka johtaa sokeu-teen. Tauti on huomattavasti yleisempi miehillä kuin naisilla. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

Ryhmään kaksi, eli joko siirtäjä-tai ribosomi-RNA:ta koodaavan geenin pistemuutatio, kuu-luvat esim. MELAS- ja MERFF-oireyhtymät. MELAS taudissa mutaatio tapahtuu siirtäjä-RNA:ssa. Oireina ovat mm. varhaislapsuuden hidastunut pituuskasvu, aivohalvauksen kaltaiset tilat sekä kouristukset. Taudissa sekä veren että aivo-selkäydinnesteen laktaattipitoisuus on ko-honnut, joka helpottaa diagnosointia. Kuvanta-mistutkimuksissa havaintaan myös aivojen muu-toksia yleensä temporaali- ja okkipitaalilohkojen alueella. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

MERFF-oireyhtymässä keskeisiä kliinisiä oi-reita ovat ataksia, lihasheikkous ja neuraalinen kuulovika. Taustalta havainnoidaan usein piste-mutaatio tRNA:ssa. MERFF periytyy maternaa-lisesti. (Aula ym. 2006, Kaste ym. 2006)

mtDNA:n depleetioSiinä missä yksittäinen depleetio tarkoitti yh-den emäksen katkosta mtDNA:ssa, depleetiossa mtDNA:n kokonaismäärä on pienentynyt. Tähän tautiryhmään kuuluu esim. Alpersin hepatoenke-falopatia, joka on aivo-maksaoireinen varhais-lapsuuden sairaus. Siihen liittyy vaikeita epilep-tisiä kohtauksia, psykomotorista heikentymistä ja maksasairaus. Alpers alkaa terveenä synty-

517

neellä lapsella aikaisintaan muutaman viikon ikäisenä, viimeistään muutaman vuoden iässä, ja johtaa usein nopeasti potilaan menehtymiseen. (Aula ym. 2006)

Tuman geenivirheet soluhengitysketjun geeneissäSuuri määrä proteiineja osallistuu hengitus-ketjun kompleksien rakentamiseen ja niiden geeneissä on todettu useita sairauteen johtavia ressessiivisiä mutaatioita. Valtaosa näiden gee-nien mutaatioista johtaa Leigh’n oireyhtymään eli subakuuttiin nekrosoivaan enkefalopatiaan. Oireita ovat mm. kehityksen taantuminen, kehi-tysvammaisuus, ataksia ja epilepsia. Oireyhty-män taustalla on kuvattu geenivirheitä kaikkien soluhengitysketjun entsyymien rakenteellisissa alayksiköissä. Tauti alkaa ensimmäisten elinvuo-sien aikana, ja etenee vaikeaksi enkefalopatiaksi (aivojen toimintahäiriö), jonka seurauksena on varhainen menehtyminen. (Aula ym. 2006)

JohtopäätöksetVarhaislapsuudessa kehittyvät mitokondriotaudit ovat erittäin vakavia ja hankalasti hoidettavia. Käytännössä hoitomuotoja ei ole ja useat tau-dit johtavat varhaiseen kuolemaan. Aikuisiällä tilanne on vähän parempi ja hoitomuotojen ke-hittymisen tulevaisuus on valoisampi mutta ti-lanne ei ole optimaalinen. Tautien diagnisointi on tosin kehittynyt ja vaikka geeniteknologian kehittyminen on ollut huimaa, niin sen edelleen kehittyminen antaa paremmat työkalut myös mi-tokondriotautien diagnisointiin ja mahdollisten hoitomuotojen kehittelyyn.

Valmistuessamme lääkäreiksi voi käytössäm-me olla jo tulevaisuuden diagnostisia työkaluja kuten mtDNA:n suora sekvensointi eli nukleii-nihappojen emäsjärjestyksen tai polypeptidien aminohappojärjestyksen määrittäminen, kun etsitään DNA-mutaatioita. Samoin erilaisten hoitomuotojen tutkimus ja kehitys on kiivasta. Erityisesti ravitsemuksen muuttaminen mito-kondroiden toimintaa stimuloivaan suuntaan voi mahdollistaa uudenlaisen hoitomuodon jossa so-lun omaan toimintaa vaikuttamalla esim. tiettyjä aineenvaihduntareittejä muuttamalla kyettäisiin vaikuttamaan mitokondrioiden toimintaan vä-lillisesti. Kuitenkin nämä hoitomuodot toisivat helpotusta vain aikuispotilaiden tilanteeseen, lapsilla ilmenevat taudit ovat niin voimakkai-ta ja laaja-alaisia että ne vaativat toisenlaisen

lähestymistavan. Onko tulevaisuudessa siis mahdollista esim. antaa potilaille terveitä mito-kondrioita vaurioituneiden tilalle tai kehittyyko geeniterapia niin että voimme korjata mutaatiot esim. käyttäen virusvektoreita siirtämään ehyttä DNA:ta suoraan soluun? Aika näyttää.

Lähteet

Aula P, Kääriäinen H, Palotie A. Perinnöllisyyslääketiede. 3. painos. Helsinki: Duodecim, 2006

Cooper GM, Hausman RE. The Cell: A Molecular Approach. 4th edition. Washington: ASM Press, 2007, s. 433–437

Kaste M, Soinila S, Somer H. Neurologia. 2. painos. Helsinki: Duodecim, 2006

Kuusisto H, Keränen T, Simola K.O.J. Tapausselostus : NARP-oireyhtymän -vähän tunnettu mitokondriotauti. Lääketieteellinen aikakausikirja. Helsinki: Duodecim, 2003; 119(16): 1563–1566

Montoya J, López-Pérez MJ, Ruiz-Pesini E. Review Mitochondrial DNA transcription and diseases: Past, present and future. Biochimica et Biophysica Acta 1757, 2006;1179–1189

Read AP, Strachan T. Human Molecular Genetics. 2nd edition. New York; Wiley-Liss, 1999

Wallace DC. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging. Environmental and molecular mutagenesis, 2010 June; 51(5):440–450, Pubmed.

Wallace DC. Mitochondrial diseases in man and mouse. Science, 1999; 283(5407): 1482–8

www.solunetti.fi. Mitokondrion perimä. Luettu 1.9.2011.www.lihastautiliitto.fi. Lihastaudit: Diagnoosit. Luettu

5.9.2011

518

E12 Proteiinien virheellinen laskostuminen endoplasmakalvostossa – sairaudetSikkilä, Herkko & Terho, AleksiSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitosOulun yliopisto10.9.2012Tarkastaja: Ulla Petäjä-Repo

TiivistelmäProteiinien oikeanlainen laskostuminen on edel-lytys solun normaalille toiminnalle. Useat so-luun kehittyneet järjestelmät pyrkivät estämään proteiinien väärän kolmiulotteisen rakenteen muodostumista. Näiden järjestelmien pettämi-nen voi johtaa lukuisien vaikeiden sairauksien puhkeamiseen.

JohdantoProteiinit ovat biokemiallisia molekyylejä, jotka muodostuvat peptidisidoksilla yhteen liittyneistä aminohapoista muodostaen polypeptidiketjun. Proteiinin aminohappojärjestyksen määrää so-lun DNA:ssa (deoksiribonukleiinihappo) sijait-sevat geenit. Yksi geeni koodaa yleensä yhtä proteiinia. Geenin emäsjärjestyksen perusteella proteiini laskostuu sille ominaiseen (natiiviin) kolmiulotteiseen muotoon, mikä määrää sen fy-siologiset ominaisuudet. Solut koostuvat pääosin proteiineista, jotka toimivat niissä mm. raken-nusaineina, entsyymeinä ja viestimolekyyleinä. Virheellinen laskostuminen johtaa proteiiniin vääränlaiseen kolmiulotteiseen rakenteeseen, jolloin proteiini joko toimii huonosti, ei toimi lainkaan tai pyritään hajottamaan. Proteiinien laskostuminen on monimutkainen tapahtuma ja siinä esiintyy luonnostaan paljon virheitä. Solul-la on erilaisia mekanismeja, jotka pyrkivät estä-mään virheellisen laskostumisen ja korjaamaan jo tapahtunutta virheellistä laskostumista. Jos väärinlaskostunutta proteiinia ei voida palauttaa oikeaan muotoonsa, se ohjataan hajotettavaksi. Tämä johtaa kyseisen proteiinin puutokseen. Väärin laskostuneet proteiinit endoplasmakal-vostossa laukaisevat soluvasteen, joka voi joh-taa solun ohjelmoituun kuolemaan, apoptoosiin. Mikäli virheellisesti laskostuneita proteiineja ei saada poistettua elimistöstä, kertyy proteiinia so-luihin. Kaikista edellä mainituista virheellisestä laskostumisesta johtuvista häiriöistä on seurauk-

sena joukko hyvin erilaisia sairauksia. (Guerri-ero ja Brodsky 2012, Cooper ja Hausman 2007)

Proteiinien laskostuminen

Laskostumisen tasoja

Aminohappojen järjestymistä polypeptidiket-jussa kutsutaan proteiinin primaarirakenteek-si.. Muodostuvan proteiinin hydrofobiset osat pyrkivät spontaanisti hautautumaan hydrofiilis-ten osien sisäpuolelle (hydrophobic collapse). Peptidiketjun lähekkäin joutuneet osat kiinnit-tyvät toisiinsa muodostaen molekyylin sisäisiä heikkoja vuorovaikutuksia ja asettuvat kolmi-ulotteisiin muotoihin, joista tunnetuimmat ovat kierteiset α-heliksit ja tasomaiset β-laskokset. Kyseistä järjestäytymistä kutsutaan proteiinin sekundaarirakenteeksi. Proteiinirakenteen sta-bilointi perustuu yleensä ei-kovalenttisiin vuo-rovaikutuksiin (vetysidokset, suolasillat happa-mien/varauksellisten sivuryhmien välillä), mutta varsinkin kysteiiniryhmien kovalenttisilla disul-fidisidoksilla (S–S, rikkisillat) on myös tärkeä osuus erityisesti eritettävissä ja kalvoproteiineis-sa. Kun sekundaarirakenteet edelleen järjestäy-tyvät keskenään ja mahdollistavat polypeptidi-ketjun etäisten osien välisen vuorovaikutuksen, puhutaan proteiinin tertiäärirakenteesta. Kun useampia tertiääriyksiköitä liittyy (yleensä ei ko-valenttisesti) toisiinsa, kutsutaan muodostunutta systeemiä kvaternäärirakenteeksi. (Agashe et al. 1995, Murray et al. 2009)

Endoplasmakalvosto

Endoplasmakalvosto (ER) on solunsisäinen osasto, joka vastaa eritettävien ja kalvoproteii-nien laskostumisesta ja kypsymisestä toimien myös kalsiumvarastona. Yli kolmasosa ihmisen proteiineista laskostetaan ER:ssä. ER:n olosuh-

519

teet ovat ideaaliset eritettävien ja kalvoproteiini-en laskostumiselle. Lisäksi ER:ssä on mekanis-mit, joilla valvotaan syntyvien proteiinien laatua. Väärin laskostuneiden proteiinien kuljetus ulos ER:stä estetään. (Ellgaard & Helenius 2003, Moore ja Hollien 2012)

Laskostumisen edistäjät

Proteiinien laskostuminen voi tapahtua spontaa-nisti, mutta katalysoimattomana se on hidasta ja tehotonta. Kolme hitainta vaihetta proteiinin laskostumisessa on disulfidisidosten syntymi-nen, cis-trans–peptidyyliprolyyli-isomeraatio ja oligomerisaatio. Solu sisältää kaitsijaproteiineja, kaperoneita (engl. chaperone), jotka vakautta-vat laskostumattomia ja osittain laskostuneita proteiineja ja nopeuttavat oikean kolmiulotteisen rakenteen muodostumista. Kaperonien puute voi aiheuttaa polypeptidiaggregaattien (keräänty-mien) ja muiden liukenemattomien rakenteiden syntyä. Monet kaperonit tunnistettiin alun perin lämpöshokkiproteiineiksi (HSP), joita esiintyy solun altistuessa korkealle lämmölle tai muulle stressille. Kaperoineista tärkeimpiä ovat endop-lasmakalvoston ontelossa sijaitseva BiP (immu-noglobulin heavy chain binding protein), joka kuuluu HSP70–perheeseen. Se estää juuri tuotet-tujen polypeptidien aggregoitumista ja pakoa en-doplasmakalvostosta. Lisäksi kalvostolla esiin-tyvät mm. kalneksiini (CNX) ja kalretikuliini (CRT), jotka estävät osittain laskostumattomien glykoproteiinien vapautumista endoplasmakal-vostosta.

Kaperonien ohella solussa on myös laskostu-mista katalysoivia tekijöitä. Proteiinidisulfidi-isomeraasi (PDI, thioli-disulfidi-oksidoreduk-taasiperhe) ER:n lumenissa nopeuttaa proteiinin oikean konformaation löytymistä mahdollista-malla disulfidisidoksien nopean syntymisen ja tarvittaessa hajoamisen. Prolyylipitoisissa pro-teiineissa peptidyyliprolyyli-isomeraasit (PPI, syklofiliinit ja FK506:sta sitovat proteiinit) kiih-dyttävät muutoin hidasta prolyyli-peptidi–sidok-sen cis-trans–isomeraatiota, joka on tärkeä osa lukuisten proteiinien laskostumisessa. (Anfinsen 1973, Ellgaard & Helenius 2003, Yébenes et al 2011, Cooper ja Hausman 2007, Murray et al. 2009)

Laadunvalvontakoneisto

Proteiinien laadunvalvonta

ER:n laadunvalvonta perustuu yhteisiin raken-teellisiin ja biologisiin tekijöihin, jotka erotta-vat natiiviin muotoonsa laskostuneen proteiinin laskostumattomasta. Yleensä nämä ovat paljaat hydrofobiset alueet, pariutumattomat kysteiinisi-vuketjut ja aggregoitumistaipumus. Tunnetuim-mat laadunvalvontaan osallistuvista proteiineista ovat BiP, CNX, CTR, GRP94 (glucose regulated protein), PDI ja ERp57 (ER resident protein 57). Pienikin poikkeama natiivista konformaatiosta johtaa siihen, että jokin kaperoneista sitoutuu proteiiniin ja estää sitä poistumasta ER:stä.

Esimerkkinä laadunvalvontajärjestelmästä voi-daan käyttää kalneksiini/kalretikuliinisykliä. Glykosylaatio on proteiinin translaation jälkei-nen muokkaus, jossa proteiiniin lisätään sokeri-osa. Sokeriosa toimii mm. liukoisuuden edistäjä-nä, kaperonien sitoutumispaikkana ja rakenteen vakauttajana. Glykoproteiinin valmistuksessa muodostuva peptidiketju sokeroidaan ja kulje-tetaan endoplasmakalvostoon. ER:ssa sokeriket-justa poistetaan kaksi glukoosia, jolloin CNX ja CRT voivat sitoutua siihen ja yhdessä komplek-sissa ERp57:n kanssa avustavat proteiinia las-kostumaan oikein. Proteiinin laskostuessa ainoa jäljellä oleva glukoosi irrotetaan, eivätkä CNX ja CRT enää sido kyseistä proteiinia jolloin se vapautuu joko eritettäväksi (natiivi) tai uudel-leen glukosyloitavaksi (laskostumaton). UDP-glukoosi:glykoproteiini-glukosyylitransferaasi (GT) tunnistaa laskostumattoman proteiinin ja liittää siihen uuden glukoosin, jolloin CNX/CRT-sykli alkaa alusta. Sykli jatkuu kunnes proteiini on oikein laskostunut. Jos proteiini on kuiten-kin niin viallinen, ettei se voi laskostua oikein, hitaasti toimiva ER-α1,2-mannosidaasi poistaa lopulta glykoproteiinin sokeriosasta yhden man-noosin, jolloin viallinen proteiini kohdennetaan ERADiin (ER associated degradation) hajotet-tavaksi. Mannosidaasi toimii näin kelloproteii-nina, joka poistaa peruuttamattomasti väärinlas-kostuneet proteiinit laadunvalvonnan kierrosta ja lähettää ne pilkottaviksi. (Ellgaard & Helenius 2003, Cao ja Kaufman 2012, Nakatsukasa ja Brodsky 2008).

520

Kuva 1. Kalneksiini/kalretikuliinisyklin periaate. Kuvassa peptidiketjun hiilihydraattirakenne on hyvin yksinkertaistettu. Laskostuva proteiini saapuu endoplasmakalvostoon ja glukosidaasit poistavat siitä kaksi glukoosia. CNX ja CRT yhdessä ERp57:n kanssa sitoutuvat proteiiniin ja auttavat sitä laskostu-maan. Kun laskostuvasta proteiinista poistetaan viimeinenkin glukoosi, irtoaa se kaperonikompleksis-ta. Jos proteiini on laskostunut oikein, se kuljetetaan kohteeseensa. Väärinlaskostuneeseen proteiiniin liitetään GT:n toimesta uusi glukoosi ja sykli alkaa alusta. Terminaalisesti väärinlaskostuneesta proteii-nista poistetaan kierron jatkuessa mannoosi ja se ohjataan hajotettavaksi.

ERA

ERAD (endoplamic-reticulum associated pro-tein degradation) on mekanismi, joka tunnistaa väärinlaskostuneen proteiinin ER:ssä, merkitsee sen kuljetettavaksi solulimaan ja hajoitettavaksi proteasomissa. Pääpiirteittäin ERADin toimin-ta voidaan jakaa neljään vaiheeseen. Kaperonit tunnistavat laskostumattoman proteiinin ja si-toutuvat siihen pitäen samalla sakkautumisher-kän materiaalin liukoisena. Sitten laskostumaton proteiini siirretään takaisin solulimaan ER:n kal-von läpi. Tätä vaihetta ei tunneta kovin tarkasti. Soluliman puolella hävitettäväksi tarkoitettuun proteiiniin yleensä lisätään ubikitiiniä (pieni säätelyproteiini) monimutkaisessa kaskadissa. Ubikitiinin määrä ja sijainti proteiinissa voivat viestiä eri asioita, yhtenä niistä on kohdentami-nen proteasomin hävitettäväksi. Lopuksi proteii-ni pilkotaan noin alle 30 aminohapon polypepti-deiksi, jotka pilkotaan edelleen muissa reaktiois-sa. (Nakatsukasa ja Brodsky 2008, Lederkremer 2009, Hebert ja Molinari 2012, Werner et al. 1996, Bukau et al. 2006)

Laskostumattoman proteiinin vaste

Laskostumattoman proteiinin vaste, UPR (unfol-ded protein response), on evolutiivisesti hyvin vanha mekanismi, jolla solu pyrkii selviämään ER:n proteiininlaskostuskapasiteetin ylittymi-sestä. Parhaiten tunnetaan Saccharomyces ce-revisiae hiivalla tutkittu Ire1α-reitti (inositol-requiring 1α). Ire1α on ER:n solukalvon läpäise-vä endoribonukleaasi, joka sitoo BiP-proteiinia ER:n ontelossa. Kun laskostumatonta proteiinia kertyy ER:n onteloon, sitoutuu BiP laskostu-mattomaan proteiiniin irroten samalla Ire1:stä. Kun BiP irtoaa Ire1:stä, sytosolin puoleinen en-doribonukleaasiaktiivisuus käynnistyy, jolloin solulimassa oleva Hac1-mRNA muokataan toi-mivaan muotoonsa. Hac1 on transkriptiofaktori, joka tumaan kulkeuduttuaan käynnistää useiden eri geenien luennan proteiineiksi. Korkeammilla eukaryooteilla, kuten ihmisillä, Hac1:stä vastaa XBP1 (X-box binding protein).

Ihmisen kaksi muuta vastaavanlaista ER:n trans-membraaniproteiinia, jotka toimivat UPR-sen-soreina, ovat PERK (double-stranded RNA-de-pendent protein kinase (PKR)-like ER kinase) ja ATF6 (activating transcription factor 6). PERK ja ATF6 aktivoituvat BiP:n irrotessa niistä, kuten IRE1:en tapauksessakin.

521

PERK dimerisoituu aktivoituessaan ja fosforyloi translaation käynnistystekijä eIF2α:n (eukaryo-tic translation initation factor 2α), joka taas es-tää 80s -ribosomien toimintaa, joka puolestaan vähentää proteiinin tuotantoa. Lisäksi eIF2α tarvitaan ATF4-transkriptiofaktorin mRNA-translaatioon. ATF4 kulkeutuu tumaan, jossa se aktivoi useita UPR-geenejä.

Aktivoituessaan ATF6 irtoaa ER:stä solulimaan ja kulkeutuu Golgin laitteeseen. Siellä siitä pilko-taan irti osa, joka hakeutuu tumaan, jossa se toimii transkriptiofaktorina samaan tapaan XPB1:en ja ATF4 kanssa aktivoiden UPR geenejä.

UPR-geenit koodaavat kaperoneja ja entsyyme-jä, jotka auttavat proteiineja laskostumaan tai osallistuvat posttranslationaaliseen muokkauk-seen, eritykseen tai hajotukseen (ERAD). Jos tasapainon palauttaminen ei onnistu ja stressitila pitkittyy, UPR käynnistää ohjelmoidun solukuo-leman, apoptoosin. Eri UPR reitit (IRE1, PERK ja ATF6) saavat aikaan hieman erilaisia vaiku-tuksia solussa. Kaikki reitit kuitenkin viestivät soluliman kautta tumalle endoplasmakalvostossa olevasta ongelmasta.

Kuva 2. UPR:n kolme reittiä. BiP:in irrotessa UPR sensoreista ne aktivoituvat. Ire1α:n endoribonukleaa-siaktiivisuus kytkeytyy päälle ja se muokkaa soluliman Hac1/XPB1-mRNA:ta, jolloin syntyy Hac1/XBP1 transkriptiofaktori. ATF6 irtoaa ER:n kalvosta ja menee Golgin laitteeseen, jossa siitä pilkkoutuu tu-maan kulkeutuva transkriptiofaktori. PERK fosforyloi eIF2α:n joka estää 80s-ribosomia. Samalla eIF2α mahdollistaa ATF4 transkriptiofaktorin muodostumisen. Kaikki kolme transkriptiofaktoria menevät tu-maan, jossa ne aktivoivat kukin omia UPR-geenejään.

On myös esitetty, että UPR sensorit tunnistai-sivat itse suoraan laskostumattoman proteiinin ja BiP osallistuisi lähinnä vasteen säätelyyn. Todennäköisesti tämäkin malli on hyvin yksin-kertaistettu. (Back et al. 2005, Moore ja Hollien 2012, Pincus et al. 2010, Schröder ja Kaufman 2005)

LaskostumissairaudetProteiinin laskostuminen on hyvin monimutkai-nen prosessi ja siinä voi luonnostaankin tapahtua virheitä. Jos elimistö ei jostain syystä pysty las-

kostamaan proteiineja oikein, seuraa siitä yleensä erilaisia ja vaikeusasteeltaan vaihtelevia sairauk-sia. Laskostumissairaudet johtuvat virheistä eri vaiheissa laskostumista ja muokkausta valmiiksi proteiiniksi. Laskostumisaurauksia voi esiintyä, jos kaperonien toiminta on vajavaista tai jokin tietty entsyymi puuttua kokonaan, väärin las-kostuneen proteiiniin hajotus ei onnistu oikein, UPR toimii väärin tai endoplasmakalvostoon kertyvä proteiini aiheuttaa UPR-vasteen, joka voi pitkittyessään johtaa solun apoptoosiin. Eri-laisia proteiinin laskostumiseen tai hajotukseen liittyviä sairauksia tunnetaan useita kymmeniä.

522

Näistä useita on listattu Guirreron ja Brodskyn katsausartikkelissa.

Osa sairauksista aiheutuu tietyn väärin laskos-tuneen proteiinin pilkkoutumisesta solun oman laadunvalvonnan seurauksena. Tästä seuraa kyseisen toimivan proteiinin puutos, joka aihe-uttaa sairauden. Esimerkkeinä kystinen fibroosi (CFTR-proteiini), Marfanin oireyhtymä (fibril-liini) ja Fabryn tauti (α-galaktosidaasi). Sairauk-sia tunnetaan useita.

Metaboliset sairaudet voivat myös johtua prote-iinin laskostumisvirheistä. Tyypin II diabetes on liitetty proteiininlaskostumishäiriöihin ja UPR-signaloinnin aiheuttamaan apoptoosiin. Haiman β-solujen täytyy tuottaa suuria määriä insuliinia (jopa noin 50 % kaikesta proteiinituotannosta), johon β-solujen ER:ssä tehdään kolme disulfi-disidosta. Insuliinia muokataan edelleen Golgin laitteessa ennen eritystä. Tällainen insuliinin massatuotanto voi aiheuttaa β-soluluille ER-stressiä. Kuten aikaisemmin mainittiin, ohjaa pitkittynyt UPR signalointi solun apoptoosiin. Haiman β-solujen tuhoutuminen sekä tyypin I että tyypin II diabeteksessa saattaakin johtua pit-kään jatkuneesta UPR-signaloinnista. Neonataa-lista diabetesta sairastavista potilaista onkin löy-detty pistemutaatioita insuliini-geenissä. Diabe-tes voi syntyä myös reseptoripuutoksesta. Vika on tällöin insuliinireseptorissa, joka ei laskostu oikein ja kohdennetaan ERADin kautta pilkotta-vaksi. (Guirrero ja Brodsky 2012, Naidoo 2009)

Lähteet

Agashe VR, Shastry MC, Udgaonkar JB. Initial hydrophobic collapse in the folding of barstar. Nature 1995 Oct 26; 377(6551):754–757.

Anfinsen CB. Principles that govern the folding of protein chains. Science 1973 Jul 20; 181(4096):223–230.

Back SH, Schröder M, Lee K, Zhang K, Kaufman RJ. ER stress signaling by regulated splicing: IRE1/HAC1/XBP1. Methods 2005 Apr; 35(4):395–416.

Bukau B, Weissman J, Horwich A. Molecular chaperones and protein quality control. Cell 2006 May 5; 125(3):443–451.

Cao Stewart Siyan, Kaufman Randal J. Unfolded protein response, Current Biology, August 2012, Volume 22, Issue 16, 21, R622-R626.

Cooper GM, Hausman RE; The Cell: A Molecular Approach, Fourth Edition. Sunderland MA: Sinauer 2007, s. 52–53, 107, 329–333.

Ellgaard L, Helenius A. Quality control in the endoplasmic reticulum. Nat Rev Mol Cell Biol 2003 Mar; 4(3):181–191.

Guerriero CJ, Brodsky JL. The delicate balance between secreted protein folding and endoplasmic reticulum-associated degradation in human physiology. Physiol Rev 2012 Apr; 92(2):537–576.

Hebert DN, Molinari M. Flagging and docking: dual roles for N-glycans in protein quality control and cellular proteostasis. Trends Biochem Sci 2012 Aug 23.

Lederkremer GZ. Glycoprotein folding, quality control and ER-associated degradation. Curr Opin Struct Biol 2009 Oct; 19(5):515–523.

Moore KA, Hollien J. The Unfolded Protein Response in Secretory Cell Function. Annu Rev Genet. 2012 Aug 28.

Murray RK, Bender DA, Botham KM, Kennely PJ, Rodwell VW, Weil PA; Harper’s Illustrated Biochemistry, Twenty-Eight Edition. New York NY: McGraw-Hill Companies 2009, s. 31–37, 39, 496–497.

Naidoo N. ER and aging – Protein folding and the ER stress response. Ageing Res Rev 2009 Jul; 8(3):150–159.

Nakatsukasa K, Brodsky JL. The recognition and retrotranslocation of misfolded proteins from the endoplasmic reticulum. Traffic 2008 Jun; 9(6):861–870.

Pincus D, Chevalier MW, Aragón T, van Anken E, Vidal SE, El-Samad H, Walter P. BiP binding to the ER-stress sensor Ire1 tunes the homeostatic behavior of the unfolded protein response. PLoS Biol 2010 Jul 6; 8(7):e1000415.

Schröder M, Kaufman RJ. The mammalian unfolded protein response. Annu Rev Biochem 2005; 74:739–789.

Werner ED, Brodsky JL, McCracken AA. Proteasome-dependent endoplasmic reticulum-associated protein degradation: an unconventional route to a familiar fate. Proc Natl Acad Sci USA 1996 Nov 26; 93(24):13797–13801.

Yébenes H, Mesa P, Muñoz IG, Montoya G, Valpuesta JM. Chaperonins: two rings for folding. Trends Biochem Sci 2011 Aug; 36(8):424–432.

523

E13 Tumareseptorit – tumareseptoriperheet, toimintaSaikkonen Patrick & Sverloff JaanaSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto17.9.2014Tarkastaja: Jani Luukkonen

TiivistelmäTumareseptorit ovat geenien säätelijäproteiineja, eli transkriptiotekijöitä. Ne ovat solunsisäisiä reseptoreita, jotka eri rasvaliukoisiin ligandeihin sitoutuessaan aiheuttavat erinäisiä geeniekspressiossa ilmeneviä vasteita. Tumareseptorikompleksi aiheuttaa laajan skaalan erilaisia funktioita rasvahappoaineenvaihdunnasta vieraiden aineiden detoksifikaatioon.

Geenit ovat pakkautuneet tumassa erittäin tiiviiksi kromosomeiksi, mikä estää muun muassa geenien lukua ja transkriptiota, eli RNA-ketjun syntetisointia. Jotta transkriptio olisi mahdollinen, on DNA-ketjun oltava pakkautunut niin löyhästi, että ketjuun voi tarttua polymeraasi- ja muita entsyymejä. Tumareseptorikompleksi mahdollistaa kromatiinin rakenteen muutoksen kromosomirakenteesta löyhäksi helppolukuiseksi DNA-nau-haksi. Kun DNA-juoste on saatu lukukelpoiseksi, reseptori ohjaa tietyn geenin ekspressiota ligandin säätämän ohjeen mukaan joko aktivoiden tai vaimentaen sen ilmentymistä.

JohdantoEsseen tarkoitus on antaa selkeä kuva siitä mitä tumareseptorit ovat, miten ne vaikuttavat trans-kriptioon ja mitä ominaisuuksia eri tumaresepto-rityypeillä on. Tumareseptorien rakenne, toimin-ta ja muiden transkriptiotekijöiden vaikutusten tunteminen on oleellista, kun halutaan ymmär-tää rasvaliukoisten hormonien vaikutustapoja. Tumareseptorit ohjaavat elimistössämme muun muassa erinäisiä endo- ja parakriinisiä informaa-tioita. Lääketieteen ja lääkkeiden kehittämisen kannalta tumareseptorien tutkiminen on oleellis-ta, koska tumareseptoreilla on yhteyksiä moniin sairauksiin ja niiden tunnistamiseen.

Tumareseptorien tuntemus on tuonut markki-noille jo monia toimivia lääkkeitä, mutta tämän hetkinen tuntemus on vain jäävuoren huippu siitä mihin tumareseptorien avulla voidaan vaikuttaa. Maailmanlaajuiset arviot tumareseptoriligandi-en osuudesta kokonaislääketarjonnasta vaihte-levat 10–20% välillä. Esimerkiksi rintasyövän hoidossa voidaan käyttää tamoksifeeni nimistä lääkeainetta, joka on estrogeenireseptorin ligan-di. Tulehduksellisiin sairauksiin voidaan käyttää deksametasonia, joka on glukokortikoidiresepto-rien ligandi.

Tumareseptorit transkription säätelijöinä

Tumareseptorien rakenne

Eri tumareseptoreiden rakenteissa on eroja, mut-ta perusrakenne on aina polaarinen, eli reseptorin toinen pää on aminopää ja toinen karboksipää. Klassinen perusrakenne myöskin koostuu aina kolmesta eri toiminnallisesta alueesta, mitkä ovat kohdegeenin aktiivisuutta säätelevä tran-saktivaatio-alue, DNA:ta sitova alue (tunnetaan nimellä DBD=DNA binding domain), ja ligandia sitova alue (tunnetaan nimellä LBD=ligand bin-ding domain). Perusrakenteiden välissä on kui-tenkin muitakin toiminnallisia alueita. (Fraydoon Rastinejad et al. 2013) Aminopää, DBD ja LBD ovat rakenteellisesti vakaita ja järjestelmällises-ti laskostuneita alueita, kun taas karboksipää ja sarana-alue ovat epäjärjestäytyneitä ja taipuisia (Wikipedia, Nuclear receptors, 2014). DBD ja LBD löytyvät jokaisesta tumareseptorista, mutta muiden toiminnallisten alueiden suhteen löytyy runsaasti erilaisia variaatioita eri tumaresepto-rien ja eri lajien välillä. (Ingraham & Redinbo, 2005)

524

Kuva 1. Tumareseptorin klassinen primaarirakenne, Jaana Sverloff, 2014

Tumareseptorin toista päätä kutsutaan ami-nopääksi, eli N-terminaaliksi. N-terminaalin sekvenssissä ja ketjun pituudessa on selkeää muuntelua eri tumareseptorien ja eri tumaresep-torien alaryhmien välillä. N-terminaali sisältää koaktivaattorialue 1:n AF-1 (actication functi-on- 1), jonka toiminta on riippumaton ligandin läsnäolosta. AF-1:n aktivoiva vaikutus yksinään hyvin heikko, mutta tämä toimii yhteistyössä karboksipäässä sijaitsevan leusiinipitoisen koa-ktivaattorin, AF-2 (activation function 2) kanssa (Ingraham & Redinbo, 2005). N-terminaali on vaihtoehtoisen silmukoinnin yleisin tapahtuma-paikka ja se sisältää laajasti eri kinaasintunnis-tussekvenssejä, minkä vuoksi sitä voidaan pitää reseptori-, laji-, ja solutyyppispesifisten vaiku-tusten aiheuttajana (NRR 2011).

Karboksipää, eli C-terminaali sijaitsee ami-nopäähän nähden vastakkaisessa päässä tuma-reseptoria. N-terminaalin tavoin C-terminaalin-kin sekvenssi ja ketjun pituus vaihtelevat reilusti eri reseptorien välillä. (Nicole Clarke et al. 2004)

Reseptorin keskiosassa sijaitseva DNA:ta sitova alue, DBD, on kaikista eri tumareseptorien yhtei-sistä toiminnallisista alueista yleisesti säilynein. Rakenne on kolmiulotteista muotoaan myöten lähestulkoon identtinen kaikissa tuntemissamme tumareseptoreissa. (Fraydoon Rastinejad et al. 2013 & NRR 2011) Tumareseptorit liityvät DNA-vaste-elementtiinsä DBD:n, tai joissain tapauksis-

sa C-terminaalin, välityksellä. DBD muodostuu kahdesta sinkkisormeksi kutsutusta rakenteesta. Sinkkisormet poikkeavat toisistaan hieman raken-teeltaan ja siten myös funktioltaan. Ensimmäinen sormi, eli N-terminaalia lähin sormi sisältää P-box-alueen (P sanasta proksimaalinen) ja toinen sormi sisältää D-box alueen (D sanasta distaali-nen). P- ja D-box-alueiden alfa helix-ketjuilla on erilaiset tehtävät. P-box-alueen alfa helix-ketju vastaa vaste-elementin ytimen puoleisen alueen tunnistuksesta kun taas D-box-alue on kohtisuo-rassa D-box-ketjuun nähden ja saa aikaan resep-torin dimerisaation. (NRR, 2011)

LBD, eli ligandia sitova alue on hyvin suhteellisen samanlaisena säilynyt alue eri tumareseptoreissa. Se tunnistaa reseptorille omaisen rasvaliukoisen ligandin, ja jättää muut rasvaliukoiset ligandit re-septorin ulkopuolelle. LBD-rakennetta kuvataan alfa helix-voileiväksi, sillä vastakkaissuuntaiset alfa helix-rakenteet ovat laskostuneet kolmiker-roksisesti voileivän tavoin. Suojassa “voileipä”-rakenteen alla on tasku jonne reseptorille spesi-finen ligandi suljetaan ympäristöstään ligandin tunnistuksen jälkeen. LBD-alueet muistuttavat eri reseptoreissa huomattavasti toisiaan, mutta jokai-sen reseptorityypin liganditasku on niin ainutlaa-tuinen kooltaan, ominaisuuksiltaan ja aminohap-pokoostumukseltaan, että reseptori liittyy tarkasti vain omaan spesifiseen ligandiinsa, ja siten sulkee muut mahdolliset ligandit ulkopuolelleen. Ihmi-sen 48 tumareseptoria tutkimalla on todettu että

525

liganditaskujen tilavuus vaihtelee sisältönsä mu-kaan täysin olemattomasta 1500Å:n paikkeille. (Fraydoon Rastinejad et al. 2013)

Sarana-alue on toinen tumareseptorin joustavis-ta alueista. Se sijaitsee DBD:n ja LBD:n välissä. Sarana-alue on välttämätön ligandin liittyessä re-septorin LBD:n, sillä ligandin sitoutuminen resep-toriin voi aiheuttaa reseptorin konformaatiomuu-toksia. Alue mahdollisesti sisältää myös tuman paikannussignaaleja ja proteiinien välisten vuo-rovaikutusten toiminnallisia alueita. (NRR, 2011)

Tumareseptorien toiminta

Tumareseptorien toiminta perustuu niiden saami-en signaalien vastaanottamiseen, välittämiseen ja biokemiallisten ketjureaktioiden käynnistämi-seen ligandin sitoutuessa reseptoriin. Ligandin sitoutuessa reseptorin toiminta on vaihtelevaa riippuen reseptorin tyypistä. Erilaisia tumaresep-toreja on havaittu kahta eri funktionaalista pää-tyyppiä edustavina. Nämä päätyypit jakautuvat vielä edelleen, mutta kaksi päätyyppiä voidaan määrittää siten, että tyypin I tumareseptorit si-jaitsevat sytosolissa (kuva 1) ja tyypin II tu-mareseptorit tumassa DNA:han kiinnittyneinä (kuva 2). (Neil J. McKenna et al. 1999)

Ligandin kiinnittyminen tyypin I tumareseptoriin käynnistää lämpöshokkiproteiinien pilkkoutumi-sen ja tumareseptorikompleksin siirtymisen hor-monivaste-elementtiinsä DNA:ssa. Lämpöshok-kiproteiinit ovat tärkeässä roolissa eri proteiinien toisiinsa liittämisessä, joten lämpöshokkiproteii-nin pilkkoutuminen muuttaa reseptoriproteiinin kolmiulotteista rakennetta eli konformaatiota. Niiden tärkein tehtävä on täten tumareseptorien pitäminen inaktiivisessa muodossa. Lämpöshok-kiproteiinien pilkkouduttua vapaat reseptorili-gandikompleksit pariutuvat dimeerimuotoon ja etsivät DNA:sta niille spesifisen kiinnittymis-kohdan. DNA:han kiinnittyvä osa sisältää kaksi sinkkisormea eli sinkkiä sisältävää proteiinijak-soa. Näitä esiintyy myös monissa muissa gee-nien luentaa säätelevissä transkriptiotekijöissä. (Farmakologia ja toksikologia, 2007)

DNA:han kiinnittyessään tumareseptorikomp-leksi avaa DNA:n nukleosomirakennetta. Näin transkriptiotekijä voi kiinnittyä DNA:han ja RNA-polymeraasi aloittaa transkription. Tämän tyyppiset eli tyypin I tumareseptoreita kutsutaan steroidireseptoreiksi ja näitä ovat mm. androgee-nireseptori, estrogeenireseptori, glukokortikoidi-reseptori ja progesteronireseptori. (Gronemeyer, Laudet, 2004)

Kuva 2. Tyypin I tumareseptorin toiminta. Tumareseptori sijaitsee sytosolissa, jossa ligandi (kuvan ta-pauksessa hormoni) kiinnittyy tumareseptoriin. Patrick Saikkonen, 2014

526

Tyypin II tumareseptoreja ovat mm. kilpirau-hashormonireseptori, retinoidireseptori ja D-vitamiinireseptori. Tyypin II tumareseptorit ovat valmiiksi sitoutuneena DNA:han ja näihin on usein kiinnittyneenä myös estäjäproteiini. Li-gandin kiinnittyminen tämän tyypin reseptoriin

saa aikaan estäjäproteiinin hajoamisen, avusta-japroteiinin kiinnittymisen reseptoriin ja tämä puolestaan johtaa RNA-polymeraasin aloitta-maan transkriptioon. Täten tuotettu proteiini saa aikaan muutoksia solun toiminnassa.

Kuva 2. Tyypin II tumareseptori. Tumareseptori sijaitsee DNA:ssa vaste-elementtiinsä kiinnittyneenä. Patrick Saikkonen, 2014

Tumaresptorien suurperhe

Tumareseptorien suurperhe jaetaan neljään pää-ryhmään: steroidi-, kilpirauhashormoni-, reti-noidi- ja orpoihin reseptoreihin. Tumareseptorit voidaan jakaa myös eri tavoin mm. funktionsa mukaan. Kaikkien neljän pääryhmän uskotaan polveutuvan samasta geenistä ja saaneen resep-torikohtaiset spesifiset ominaisuutensa erinäisten mutaatioiden kautta. Tiede ei osaa sanoa onko esiaste ollut yhdelle tietylle ligandille spesifinen reseptori, jonka liganditaskun rakenne on muut-tunut ajan saatossa muille ligandeille sopivaksi, vai onko esiasteen liganditasku ollut käypä use-ammalle eri ligandille, ja liganditaskun rakenne on muuttunut vuosien saatossa spesifisemmäksi pienemmälle kohderyhmälle, tai yhdelle ainoalle ligandille. Eri pääryhmien reseptorit ovat kyke-neviä toimimaan myös keskenään, mikä tukee

ajatusta yhteisestä alkukannasta. Tumareseptorit liittyvät vaste-elementteihinsä yleensä homolo-gisina dimeereinä, mutta jotkut reseptorit sitou-tuvat vaste-elementtiinsä heterodimeerinä, jotka muodostuvat kahden eri pääryhmän tumaresep-toreista. Heterodimeereinä toimiminen tuo lisää vaihtelua transkriptioon. (Ana Aranda & An-gel Pascual, 2001)

SteroidireseptoritSteroidireseptorit ovat yksi tärkeimmistä resep-torityypeistä. Steroidireseptoriperheeseen kuulu-vat estrogeeni-, progesteroni-, glukokortikoidi-, androgeeni- ja mineralokortikoidireseptorit eli tyypin I tumareseptorit. Steroidihormonit toi-mivat reseptorin välityksellä reseptorin sitoessa hormonin. Reseptorin tumaan kulkeutuminen tapahtuu joko passiivisesti tai aktiivisesti tuma-huokosten keskuskanavan läpi. Aktiivinen kul-

527

jetus tumaan tapahtuu ATP:n avulla. Steroidi-reseptorit kulkevat saamiensa signaalien avulla sisään ja ulos tumasta jatkuvasti. Kun hormonia ei ole paikalla, niin steroidireseptori muodostaa eri lämpöshokkiproteiinien kanssa kompleksin, joka pitää reseptorin inaktiivisena, mutta valmii-na sitomaan hormonia. (Laudet, Gronemeyer, 2002)

Steroidireseptorien toiminta ei ole aivan yksi-selitteistä. Yleisesti reseptorin toiminta koostuu ligandin sitoutumisesta, reseptorien dimeeri-muodon synnystä, liittymisestä hormonivaste-elementtiin ja avustavien proteiinien kutsumi-sesta paikalle transkription aloittamiseksi. Tämä tapahtuma voi kuitenkin saman ligandin avulla tuottaa varsin erilaista geenin luentaa ja muutos-ta solun toiminnassa. Syitä miksi reseptori kyke-nee tuottamaan erilaisia vasteita on monia. Yhte-nä voidaan pitää avustavien proteiinien runsasta lukumäärää, sillä reseptorin toimintaan vaikutta-via proteiineja on mahdollisesti jopa 50 erilaista. Tämän lisäksi eri geenejä tai niiden osia saattaa olla hiljennetty tai aktivoitu. Myös vastehormo-nielementtejä saattaa olla useita, jolloin saadaan aikaan erilainen vaste eri kerroilla. (Bain, Con-naghan, 2014)

Kaikki solut ovat kosketuksissa steroidihormo-nien kanssa, mutta steroidihormonit vaikutta-vat vain kohdekudoksissaan steroidireseptorien avulla. Vaste steroidihormoneille riippuu koh-dekudoksen kehitysvaiheesta ja erilaistumisas-teesta, mutta yleisesti vaste liittyy apoptoosiin, eli ohjelmoituun solukuolemaan, sekreetiotoi-mintaan tai solun liikennöintiin. Steroidihor-moneilla on kyky vaikuttaa näihin toimintoihin, joten on ymmärrettävää, miksi steroidihormonit ja steroidireseptorit ovat osallisena moniin syö-päsairauksiin. Tällaisia syöpäsairauksia esiintyy steroidihormoneille herkissä kudoksissa kuten rintakudoksessa, haimassa ja keuhkoissa. Ste-roidireseptorien tutkiminen ja tunteminen on siis tärkeää, jotta voisimme ymmärtää syövän syn-tyä ja kuinka syöpään voidaan lääkkeiden avulla vaikuttaa. (Nicholson, McClelland, 1995)

KilpirauhashormonireseptoritKilpirauhashormonireseptori on tumareseptori, joka aktivoituu kilpirauhashormonin vaikutuk-sesta. Kilpirauhashormonireseptorit ovat olen-nainen osa metaboliassa ja sydämen sykkeen säätelyssä. Niillä on myös tärkeä rooli kudoksien kehittymisessä. (Wiersinga 2008)

Kilpirauhashormonireseptorin kiinnittymiskoh-taa DNA:ssa sanotaan kilpirauhasvaste-elemen-tiksi. Kilpirauhashormonireseptorit voivat sitou-tua vaste-elementtiinsä monomeereinä, homodi-meerimuodossa tai heterodimeerimuodossa. Re-septori voi kiinnittyä vaste-elementtiinsä vaikka ligandi ei olisikaan kiinnittynyt reseptoriin. Yleisesti kilpirauhashormonireseptorin kiinnit-tyminen vaste-elementtiinsä ilman ligandia joh-taa transkription hiljentämiseen. Ilman ligandia kiinnittyneen reseptorin kolmiulotteinen malli sitoo paikalle estäjäproteiinejä, joiden vaikutuk-sesta kyseisen geenin luenta hiljenee. Ligandin kanssa kiinnittynyt kilpirauhashormonireseptori aktivoi geenin luentaa. Ligandin kiinnittymi-nen muuttaa kilpirauhashormonireseptorin kon-formaatiota siten, että avustajaproteiinit voivat kiinnittyä reseptoriligandikompleksiin ja geeni-en luenta aktivoituu. Suuri joukko erilaisia prote-iineja on tunnistettu tällaisiksi estäjäproteiineiksi ja avustajaproteiineiksi.

Virheet kilpirauhashormonireseptoreissa vaikut-tavat hiirillä ainakin ruuminlämpöön ja sydämen toimintaan. Kilpirauhashormonireseptorien toi-mimattomuus ei kuitenkaan aiheuta samanlaisia oireita kuin kilpirauhashormonin puuttuminen kokonaan. Tähän selityksenä saattaa olla se, että kilpirauhashormonireseptorien kohdegeenit jää-vät neutraaliin tilaan eivätkä ole hiljennettyinä kuten kilpirauhashormonin puuttuessa. (Tsai, O’Malley, 1994)

RetinoidireseptoritRetinoidireseptorit ovat funktioltaan samankal-taisia kuin steroidi-, kilpirauhas-, ja D-vitamii-nireseptorit. Retinoidireseptorien ligandeja ovat A-vitamiini ja sen johdannaiset. Ligandit kul-jetetaan solulimasta tumaan kantajaproteiinien avuin ja siellä ne sitoutuvat retinoidireseptoriin. Retinoidireseptorit jaetaan retinoidihapporesep-toreihin (RAR=retinoid acid receptor) ja retinoi-di X reseptoreihin (RXR=retinoid X receptor), jotka voivat ohjata transkriptiota sekä homo-dimeereinä että RAR-RXR-heterodimeereinä. (Tapio Rantanen, 2006 & Julie Bastien ja Cecile Rochette-Egly, 2004) Retinoidihappo- ja retinoi-di X reseptorit jaetaan molemmat edelleen kol-meen ryhmään: alfaan, -beetaan, ja -gammaan. (Simon C. Dyall et al. 2010)

A-vitamiinilla ja sen johdannaisilla on hyvin tär-keä rooli kaikkien selkärankaisten alkiovaiheen kudosten kehityksessä ja homeostaasissa, sillä

528

ne säätelevät muun muassa solujen erilaistumis-ta, proliferaatiota ja apoptoosia. (Julie Bastien ja Cecile Rochette-Egly, 2004) Myös alkiovaiheen jälkeen retinoidireseptorit vaikuttavat solutasolla moniin merkittäviin prosesseihin, kuten muistiin ja oppimiskykyyn. Retinoidireseptoritasot vä-henevät iän myötä, mikä on osasyy erinäisiin vanhuuden oireiluihin, kuten muistin huonontu-miseen. (Simon C. Dyall et al. 2010)

Orvot reseptoritLBD on jokaisen tumareseptorin tunnistusmerk-ki, mutta orvot reseptorit jäävät ilman tätä mer-kintää. Tarkka luku vaihtelee tiheään, mutta noin puolet kaikista tuntemistamme tumareseptoreis-ta kuuluvat orpoihin reseptoreihin. Orvoille re-septoreille ei ole toistaiseksi löydetty sopivaa fy-siologista ligandia ja niiden toiminnan luonne ei ole täysin selvä. Tiede etsii koko ajan ligandeja, jotka täsmäävät orpojen reseptoreiden LBD:n. Aikasemmista tutkimuksista on ilmennyt että orpojen reseptorien LBD:n liganditaskun koko vaihtelee täysin olemattomasta jopa yli 1600Å:n kokoiseen.

Kun orvolle reseptorille löydetään ligandi, kut-sutaan reseptoria adoptoiduksi reseptoriksi. Jo adoptoidut reseptorit ovat olleet sekä tarkasti spesifisiä yhdelle tietylle ligandille että ava-rakatseisemmin useamman erilaisen ligandin kanssa sitoutuvia reseptoreja. (Holly A Ingraham & Matthew R Redinbo, 2005) Monien orpojen reseptorien tiedetään olevan liitoksissa erinäisiin fysiologisiin ja patologisiin tapahtumasarjoihin, minkä vuoksi niiden ligandien tunnistaminen olisi hyvin merkittävää parempien hoitomene-telmien kehittämisen vuoksi. Ligandien tunnis-tukseen hyödynnetään erinäisiä menetelmiä, bioinformatiikan tutkimuksista suoravälitteiseen ligandin ja reseptorin fyysiseen yhdistämiseen massaspektroskoopilla. Nykytekniikka ja käy-tössä olevat työkalut vauhdittavat ligandien tun-nistusprosessia huomattavasti. (Deshmukh S, Madagi SB, 2013)

Lähteet

Fraydoon Rastinejad, Pengxiang Huang, Vikas Chandra & Sepideh Khorasanizadeh – Understanding nuclear receptor form and function using structural biology. Journal of Molecular Endocrinology (2013) 51, T1–T21

Heikki A. Koistinen & Olli A. Jänne. Hormonien vaikutustavat, Endokrinologia-oppikirja, Kustannus Oy Duodecim, 1.4.2010.

Ana Aranda & Angel Pascual: Nuclear Hormone Receptors and Gene Expression. Physiol Rev 81:1269 –1304, 2001.

Nicole Clarke, Pierre Germain, Lucia Altucci and Hinrich Gronemeyer: Structural and functional organisation of the nuclear receptor superfamily. Expert Reviews in Molecular Medicine © Cambridge University Press, Vol. 6; Issue 25; 30 November 2004

Pekka Kallio, Jorma Palvimo ja Olli Jänne: Tuman hormonireseptorit, Lääketieteellinen Aikakauskirja Duodecim 1994

Wikipedia, Nuclear Receptor, 2014Nuclear Receptor Resource(=NRR) Indigo biosciences-

sponsoroima web-sivu: www.nrresource.org. Viitattu 17.9.2014

Neil J. McKenna, Rainer B. Lanz & Bert W. O’Malley: Nuclear Receptor Coregulators: Cellular and Molecular Biology, Endocrine Reviews, Volume 20 Issue 3, 1999

Heinrich Gronemeyer, Vincent Laudet: Principles for modulation of the nuclear receptor superfamily, 2004

Farmakologia ja toksikologia, 7.painos: Lääkeaineiden vaikutusmekanismit: Reseptorit, Kustannus Medicina Oy, 2007

Vincent Laudet, Hinrich Gronemeyer: The Nuclear Receptor Factsbook, 2005

David Bain, Keith Connaghan, James Lambert: Steroid receptor-DNA interactions: toward a quantitative connection between energetics and transcriptional regulation, 2014

R I Nicholson, R A McClelland J M W Gee: Steroid hormone receptors and their clinical significance in cancer, 1995

Wilmar M Wiersinga: The role of thyroid hormone nuclear receptors in the heart: evidence from pharmacological approaches, 2008

M Tsai, BW O’Malley: Molecular mechanisms of action of steroid/thyroid receptor superfamily members, 1994

Holly A Ingraham & Matthew R Redinbo: Orphan nuclear receptors adopted by crystallography, Current Opinion in Structural Biology 2005, 15:708–715

Tapio Rantanen, Ekseemoiden systeeminen lääkehoito, Lääketieteellinen Aikakauskirja Duodecim 2006;122(3):305–13

Simon C. Dyall, Gregory J. Michael, and Adina T. Michael-Titus, Omega-3 Fatty Acids Reverse Age-Relate d Decreases in Nuclear Receptors and Increase Neurogenesis in Old Rats, Journal of Neuroscience Research 2010, 88:2091–2102.

Deshmukh S, Madagi SB. A chemogenomics based approach for deorphanization of testicular receptor 4: An orphan receptor of nuclear receptor superfamily. J Nat Sc Biol Med [serial online] 2013 [cited 2014 Sep 16];4:276–81

Julie Bastien ja Cecile Rochette-Egly, Nuclear retinoid receptors and the transcription of retinoid-target genes, Gene, Vol.17 March 2004, Pages 1–16

529

E14 TBC1D4 ja Grönlannin periytyvä diabetes – perinnöllinen sairaus voi olla selviytymisen välttämätön edellytys Roininen, Nelli & Ruokojärvi, MariaSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto16.9.2014Tarkastaja: Kalervo Metsikkö

TiivistelmäTyypin II diabetes on lisääntynyt räjähdysmäisesti maailmanlaajuisesti. Suurimpana syynä on tämän hetken suurimmaksi kansanterveysongelmaksi nimetty, diabetesriskiä huomattavasti nostava lihavuusepidemia – puo-let eurooppalaisista on jo ylipainoisia. Pohjois-Atlantin ja Pohjoisen jäämeren välissä sijaitsevan Grönlannin inuiittien pienessä perustajapopulaatiossa tyypin II diabetes on myös lisääntynyt viimeisen 25 vuoden aika-na huomattavasti ja isoloituneessa populaatiossa glukoosimetaboliaan osallistuvan TBC1D4-geenin variantin (Arg684Ter) on havaittu assosioituvan kohonneen tyypin II diabetesriskin kanssa. Populaatiossa variantin al-leelifrekvenssi on 17 %, joten sen vaikutus yhdistettynä ylipainoon on Grönlannissa merkittävä.

Tyypin II diabetes on perinteisesti ollut keski-ikäisten ja iäkkäiden ihmisten sairaus, jonka määrä on kuitenkin kääntynyt kasvuun kaikissa ikäluokissa ja sitä havaitaan myös nuorissa. Tyypin II diabeteksen määrän ennus-tetaan lisääntyvän voimakkaasti vuoteen 2025 mennessä vuoden 1995 135 miljoonasta sairastuneesta jopa 300 miljoonaan maailmanlaajuisesti (King ym. 1998).

Esseessämme käymme läpi tyypin II diabetekseen liittyvän yleisen patofysiologian; miten sairaus puhkeaa ja mitkä ovat oireet. Kerromme glukoosin soluihin sisäänoton signaalireitin ja miten se liittyy tyypin II diabetek-seen ja Grönlannin inuiiteilla yleiseen TBC1D4-varianttiin. Selostamme, miten tyypin II diabetes ilmenee ja periytyy Grönlannin inuiittipopulaatiossa. Lopuksi pohdimme, miten inuiiteilla diabetesta voitaisiin ehkäistä ja hoitaa.

Tyypin II diabetes

Diagnoosi

Tyypin II diabetesdiagnoosi voidaan tehdä, kun paastoverensokeriarvo on yli 7 mmol/l, soke-rirasituskokeen kahden tunnin arvo on yli 11 mmol/l, glykolysoitunutta hemoglobiinia on yli 6,5 % tai oireisella potilaalla mitataan satunnais-arvoksi yli 11 mmol/l.

Sokerirasituskokeessa mitataan ensin 12 tunnin paastoarvo, jonka jälkeen juodaan 75 g sokeria sisältävä liuos. Kahden tunnin päästä verenso-keri mitataan uudestaan. Sokerirasituskokeessa kahden tunnin arvon ollessa alle 7,8 mmol/l ky-seessä ei ole diabetes, arvoilla 7,8–11 mmol/l pu-hutaan heikentyneestä sokerinsiedosta ja yli 11 mmol/l arvoilla henkilöllä on diabetes. Diagnoo-sikriteeristö löytyy tiivistettynä myös kuvasta 2.

530

Kuva 1: Tyypin II diabeteksen diagnosointi ja oi-reisto. Laakso ym. 2013 mukaillen.

Altistavat tekijät

Tyypin II diabeteksen lisääntyminen on suoraan verrannollista ylipainon lisääntymiseen – liikku-mattomuus, liiallinen paino sekä sen kertymi-nen erityisesti keskivartaloon lisää- vät insulii-niresistenssiä. Maailman terveysjärjestö WHO nimeää ylipainon (BMI 25–29,9) ja lihavuuden (BMI > 30) suurimmaksi kansanterveysongel-maksi maailmassa (Maailman terveysjärjestö WHO 2004). Ylipaino ja lihavuus aiheuttavat joka kahden- nentoista kuolintapauksen eli vuo-sittain noin 300 000 kuolintapausta Euroopan

Unionin alueella lisäämällä syövän ja sydän- ja verisuonisairauksien riskiä (Banegas ym. 2003). Ylipainoisella ja liikkumattomalla myös kohon-nut verenpaine, valtimosairaus ja uniapnea ovat yleisiä ja kielivät suurentuneesta riskistä tyypin II diabetekseen. Korkea ikä ja perimä lisäävät al-tistusta, mutta tyypin II diabetes on monitekijäi-nen sairaus eli myös altistavia elintapoja täytyy ilmetä taudin puhkeamiseen.

Oireet ja pitkäaikaisseuraukset

Diabeteksen tyypilliset oireet ovat jatkuva jano, suuri virtsanmäärä ja laihtuminen. Jatkuva kor-kea verensokeri glykolysoi ylimäärin proteiineja ja vaikuttaa erityisesti kapillaarisuonien toimin-taan. Diabeettinen nefropatia eli diabeteksesta aiheutunut munuaisten hiussuonikerästen vauri-oituminen ja munuaisten vajaatoiminta voi joh-taa jopa munuaisensiirtotarpeeseen. Valitettavas-ti sekään ei ole lopullinen ratkaisu, sillä usein munuaisten vajaatoiminta uusiutuu ajan kanssa. Lisäksi keho hylkii vierasta elintä ja elinsiirron jälkeen onkin koko loppuelämän ajan huoleh-dittava tehokkaasta hyljinnänestolääkityksestä. Toinen korkean glukoosipitoisuuden aiheutta-ma merkittävä seuraus on silmän verkkokalvon hiussuonien toiminnan muuttuminen, mikä voi johtaa vaikeisiin näköongelmiin ja jopa sokeutu-miseen (Laakso ym. 2013). Kolmanneksi jalko-jen kapillaarisuonten verenkierron heikentyessä jalkaterissä voi esiintyä nekroosia, johon jalan amputaatio on usein toimiva hoito. Hoitamaton diabetes voi siis heikentää merkittävästi työky-kyä, elämänlaatua ja pahimmassa tapauksessa invalidisoida kuten kuva 1 tiivistää.

Ennaltaehkäisy ja hoito Grönlannissa

Tyypin II diabeteksen puhkeaminen riippuu osit-tain perimästä, mutta terveelliset elä- mäntavat ovat tehokas tapa ennaltaehkäistä sairastumista. Henkilön ylipaino, epäterveel- linen ruokavalio, johon kuuluu runsaasti tyydyttyneitä rasvoja, glykeemiseltä indeksil- tään korkeita hiilihyd-raatteja sekä runsaasti alkoholia, suurentavat tyypin II diabetek- seen sairastumisen mahdol-lisuutta. Diabetesriskiryhmään kuuluvien tulisi käyttää ravin- tonaan paljon tyydyttymättömiä kasvi- ja kalarasvoja tyydyttyneiden rasvojen si-jaan. (Uusitupa 2009).

Länsimaistumisen seurauksena inuiittien elä-mäntavat ovat muuttuneet erityisesti ruoka- va-

531

lion osalta, mikä on osasyynä tyypin II diabetek-sen määrän suureen nousuun inuiitti- populaa-tiossa. Perinteisesti inuiitit ovat syöneet kalaa, joka sisältää paljon tyydyttymättömiä rasvoja. Inuiitit ovat syöneet myös paljon hylkeenlihaa, jolla näyttäisi olevan suojaava vaikutus glukoo-si-intoleranssia vastaan vähintään neljä kertaa viikossa syötynä. (Jørgensen ym. 2002).

Jørgensen tutkimusryhmineen (2002) on tutkinut tyypin II diabeteksen ilmaantumista ja riskiteki-jöitä inuiittipopulaatiossa ja todennut, että inuii-tit, joilla on korkea painoindeksi sekä vyötärö-lantiosuhde, ovat suuremmassa riskissä sairastua tyypin II diabetekseen. Kolmas yhdistävä tekijä diabeetikoilla inuiittipopulaatiossa oli ikä – mitä vanhempi henkilö, sitä todennäköisemmin hä-nellä oli diabetes sekä vaurioitunut glukoosito-lerans- si. Tutkimuksessa huomattiin muitakin yhtäläisyyksiä; vähäinen koulutus, liikkumatto- muus sekä runsas alkoholinkäyttö olivat yleistä sairastuneilla. (Jørgensen ym. 2002.) Diabetesta sairastavien inuiittien määrä korreloi myös hei-dän asuinpaikkansa kanssa; mitä pienemmästä kaupungista tai kylästä oli kysymys, sitä suu-rempi oli sairastuneiden määrä asukkaiden ko-konaismäärästä. Inuiiteilla diabetesriski näyttäi-sikin siis riippuvan henkilön sosioekonomisesta asemasta. (Jørgensen ym. 2011.)

Suuri osa Grönlannin inuiiteista ei edes tiedä sai-rastavansa tyypin II diabetesta (Jørgen- sen ym. 2002). Helpoin tapa ennaltaehkäistä inuiittien sairastumista diabetekseen olisi siis koulutuksen lisääminen. Jos inuiitit olisivat tietoisempia sekä ruokavalion ja liikunnan tärkeydestä diabetek-sen ennaltaehkäisyssä että sairauden oireista ja pitkäaikaisvaikutuksista, sairastuneiden määrää saattaisi olla mahdollista laskea. Koulutuksen lisäämisellä saataisiin myös jo diabetekseen sairastuneet tietoisiksi hoitokeinoista, sillä osa tyypin II diabeteksen hoitokeinoista on samoja, kuin diabeteksen ennaltaehkäisyssä. Päähoito-keinoja ovat tehokas laihduttaminen, jos henki-lö on ylipainoinen, terveellinen ruokavalio sekä säännöllinen liikunta. Kaikki nämä laskevat ve-renpainetta, alentavat verensokeria sekä paranta-vat veren rasva-arvoja, ja näihin tavoitteisiin hoi-tokeinoilla nimenomaan pyritään. Jo muutaman kilon laihduttaminen parantaa verensokeriarvoja ja toisinaan laihduttaminen parantaa diabeteksen kokonaan. Ruokavaliolla pyritään painonhallin-taan ja verensokeritasapainon tasaamiseen. Lii-kunta tukee laihtumista, mutta se myös itsessään alentaa verensokeria lisäämällä solujen insuliini-

herkkyyttä. Jo pelkästään nämä elämäntapamuu-tokset auttaisivat inuiitteja huomattavasti. Joskus tyypin II diabeteksen hoidossa tarvitaan lisäksi lääkitystä, jonka saaminen inuiiteille myös pie-niin ja vaikeasti saavutettaviin kyliin pitäisi var-mistaa ja taata.

Diabeteksen genetiikka

Inuiittien populaatiohistoria

Grönlannin inuiitit ovat pieni, noin 57 000 ihmi-sen isoloitunut populaatio. Grönlannin inuiittien perustajapopulaation uskotaan polveutuneen Ka-nadan inuiittien kanssa joko alaskalaisesta Thu-le-populaatiosta tai arktisilla alueilla olleen Dor-set-populaation ristey- tyneen saapuneen Thu-le-populaation kanssa 800–1000 vuotta sitten. Esimerkiksi mito- kondrio-DNA:ta tutkimalla inuiittien perimän on todettu olevan suhteellisen homogee- nista, sillä esimerkiksi Agnar Helga-son ja muut (2006) totesivat otantapopulaationsa geenistön edustavan vain yhdeksää erilaista pe-rustajahaplotyyppiä. (Helgason ym. 2006.)

Altistavat geenimuodot

Diabeteksen esiintymisessä on suuria eroja eri populaatioiden välillä. Merkittävä osa diabe-teksen yleisyyden eroissa aiheutuu elintavoista, mutta myös muutamia altistavia geenivariantteja tunnetaan. Meksikolais-amerikkalaisista kak-sospareista on havaittu al- tistava muoto kyste-iiniproteaasigeeni CAPN10:sta ja islantilaisilta on löydetty glukago- nin eritykseen vaikuttava variantti (TCF7l2). Lisäksi adiposyyttien erilais-tumista säätelevä PPARG ja haiman β-solujen K-ATP-kuljettajan alayksikkö KCNJ11 on todettu vaikuttavan taudin syntyyn. Haiman β-solukehityksen transkriptiotekijävarianteis-ta HNF1A-, IPF-1- ja HNF4A-geenit lisäävät riskiä diabetekselle. Tarkemmat tiedot gee- ni-varianteista löytyvät liitteestä 1. (Turnpenny & Ellard 2007).

Variantin molekyylipatologia

Insuliinin signalointireittiä molekyylitasolla ei vielä kunnolla tunneta. Glukoosinkuljettajapro-teiini 4 (GLUT4) toimintaa on tutkittu paljon, ja sen toiminnan on todettu olevan insuliiniriip-puvainen. Insuliinin kiinnittymisen ja GLUT4- transportterin aktivoitumisen välillä on useita

532

välivaiheita. (Watson ym. 2004). Koko signaa-likaskadi on esitelty kuvassa 2, jonka kohdassa 1 insuliini aktivoi solukalvossa olevan insulii-nireseptorin, jossa olevat tyrosiinit fosforyloi-tuvat. (Harvey & Ferrier, 2011, 311). Fosfory-loituneet tyrosiinit saavat aikaan solunsisäisen signaalikaskadin (kohta 2), kun tyrosiinit akti-voivat insuliinireseptorisubstraatin välityksellä fosfoinositidi-3-kinaasin (PI3K). PI3K fosfory-loi fosfatidyyli-inositolidifosfaatin fosfatidyyli-inositolitrifosfaatiksi. Tämä saa aikaan proteiini-

kinaasi B:n (Akt) ja fosfoinositidi-riippuvaisen kinaasi 1:en (PDK1) muutokset kohdassa 3. PDK1 fosforyloi Akt:n, joka edelleen fosforyloi TBC1D4-proteiinin. Fosforyloitunut TBC1D4-proteiini ei pysty inhiboimaan Rab-proteiinia, jolloin Rab-proteiini pääsee aktivoitumaan tri-fosfaattimuotoonsa ja saa aikaan kohdassa 7 kuvatun GLUT4-transportterivesikkelien fuusi-oitumisen solukalvoon. GLUT4-transportterien avulla glukoosi pääsee siirtymään sisälle soluun. (Bogan 2012).

Kuva 2: Glukoosin otto lihassolun sisään. Kohta 1. Insuliinireseptori koostuu kahdesta solunulkoisesta α- alayksiköstä ja kahdesta β-alayksiköstä, jotka ulottuvat solunulkoisen nesteen puolelta solukalvon läpi soluliman puolelle. α-alayksiköt sisältävät insuliinin sitoutumiskohdat ja β-alayksikköjen osana on tyro- siini. Insuliinin kiinnittyminen insuliinireseptoriin aktivoi reseptorin ja saa β-alayksiköiden tyrosii-nit fos- foryloitumaan. Kohta 2. Fosforyloituneet tyrosiinit aktivoivat insuliinireseptorisubstraatin (IRS) välityk- sellä fosfoinositidi-3-kinaasin (PI3K). PI3K fosforyloi solukalvolipidi fosfatidyyli-inositolidifos-faatin (PIP2) fosfatidyyli-inositolitrifosfaatiksi (PIP3). Kohta 3. Proteiinikinaasi B (Akt) ja fosfoinositi-di- riippuvainen kinaasi 1 (PDK1) tunnistavat PIP3:en. PDK1 aktivoi ja fosforyloi Akt:n. Kohta 4. Akt:n fos- foryloiduttua aktiiviseen muotoonsa se fosforyloi puolestaan TBC1D4-proteiinin. Kohta 5. Fosfo-ryloitu- neessa muodossaan TBC1D4 ei enää pysty inhiboimaan Rab-proteiinia ja Rab pystyy fosfory-loitumaan trifosfaatiksi. Kohta 6. Nyt vesikkelissä olevat GLUT4-transportterit pääsevät fuusioitumaan solukalvoon. Kohta 7. Glukoosimolekyylit pääsevät sisälle soluun GLUT4-transportterien kautta.

TBC1D4-variantti inuiiteilla

TBC1D4 (TBC1 domeeniperheen jäsen 4) on proteiinia koodaava geeni, joka sijaitsee kromo-somissa 13. Se kuuluu TBC1-geeniperheeseen, jonka kaikilla jäsenillä on toimin- nallinen TBC-domeeni (Tre-2, Bub2 ja Cdc16). TBC1D4 tun-netaan myös nimellä AS160 (160 kilodaltonin

suuruinen Akt-substraatti). TBC1D4 toimii Rab-proteiinin GTP-aktivaattorina, mikä puolestaan saa glukoositransportterit fuusioitumaan solu-kal- voon ja näin glukoosimolekyylit pääsevät sisälle soluun. Geenissä on eksoneita 23 kap- pa-letta. (National Center for Biotechnology Infor-mation, 2014)

533

TBC1D4-geenivariantin on todettu altistavan Grönlannin inuiittit tyypin II diabetekselle ja lihassolujen insuliiniresistenssille. Inuiiteilla TBC1D4-geenissä arginiini on muuttu- nut lope-tuskodoniksi ja vaikuttaa näin lopullisen proteii-nin muotoon. Jørgensenin ym. (2014) tutkimuk-sessa koehenkilöille tehtiin glukoosirasituskoe (ks. edeltä s. 5, 3.1. Diagnoosi). Sellaisilla inu-iiteilla, jotka olivat homotsygoottisia TBC1D4-geenin non- sense-mutaation Arg684Ter osalta, oli 3,8 mmol/l korkeammat verensokeriarvot kuin sellaisilla, joilla ei ollut mutaatiota ollen-kaan. Mutaation suhteen heterotsygooteilla hen-kilöillä havaittiin myös 0,43 mmol/l normaalia korkeammat verensokeriarvot, mutta ei lähes-kään niin korkeat kuin homotsygooteilla. Nor-maali verensokeriarvo tällaisessa testissä tulisi olla korkeintaan 7,8 mmol/l. Koska variantilla on suuri vaikutus erityisesti homotsygooteille kantajille, vaikuttaisi se periytyvän resessiivises-ti. (Moltke ym. 2014). Kuvasta 2 nähdään, että TBC1D4-proteiini on merkittävä tekijä GLUT4- signalointireitissä ja siis glukoosin siirtymisessä lihassoluun. Inuiiteilla signalointireitti ei pääse etenemään loppuun ja GLUT4-transportterit ei-vät pääse solukalvolle.

Kysymys onkin, miksi mutaatio on säilynyt inu-iittipopulaatiossa. Kun useista muista euroop-palaisista populaatioista TBC1D4-variantti lä-hes puuttuu, inuiiteilla alleelifrek- venssi on 17 % (Moltke ym. 2014). Onko siitä ollut hyötyä inuiittien selviytymisen kannalta? Inuiittien pe-rinteiseen ruokavalioon on kuulunut paljon kalaa ja hylkeenlihaa, jotka sisältävät runsaasti prote-iinia ja rasvaa, mutta hiilihydraattien saanti on ollut vä- häisempää. Vähäinen hiilihydraattien saanti ruokavaliosta on saattanut edesauttaa sel- viämistä vähähiilihydraattisella ravinnolla, sillä korkeana säilynyt verensokeri on taan- nut riit-tävän energiansaannin esimerkiksi aivoille, joka käyttää pääenergianlähteenään glukoosia. Näin variantti on toiminut valintaetuna ja säilynyt po-pulaatiossa.

Lähteet

Banegas JR, López-García E, Gutiérrez-Fisac JL, Guallar-Castillón P, Rodrígues- Artalejo F. A simple estimate of mortality attributable to excess weight in the European Union. Eur J Clin Nutr 2003; 57:201–208.

Bogan JS. Regulation of Glucose Transporter Translocation in Health and Diabetes. Conneticut: Annu Rev Biochem, 2012.

Harvey R, Ferrier D. Lippincott’s Illustrated Reviews: Biochemistry Fifth Edition. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkin, 2011.

Helgason A, Pálsson G, Pedersen HS, Angulalik E, Gunnarsdóttir ED, Yngvadóttir B, Stefánsson K. mtDNA Variation in Inuit Populations of Greenland and Canada: Migra- tion History and Population Structure. Am J Phys Anthropol 2006; 130:123–134. Jørgensen EM, Bjeregaard P, Borch-Johnsen K, Backer V, Becker U, Jørgensen T, Mulvad G. Diabetes and Impaired Glucose Tolerance Among the Inuit Population of Greenland. Diabetes care 2002; 25:10.

Jørgensen ME, Borch-Johnsen K, Witte1 DR, Bjerregaard P. Diabetes in Greenland and its relationship with urbanization. Diabet Med 2011; 29:755–760.

King H, Aubert RE, Herman WH. Global burden of diabetes, 1995–2025: Prevalence, numerical estimates and projections. Diabetes Care 1998; 21 Suppl 9:1414–1431. Maailman terveysjärjestö WHO:n Euroopan aluetoimisto. Food and health in Europe: a new basis for action. WHO Reg Publ Eur Ser 2004; 96:53.

Moltke I, Grarup N, Jørgensen ME, Bjerregaard P, Treebak JT, Fumagalli M, Kor- neliussen TS, Andersen MA, Nielsen TS, Krarup NT, Gjesing AP, Zierath JR, Linne- berg A, Wu X, Sun G, Jin X, Al-Aama J, Wang J, Borch-Johnsen K, Pedersen O, Nielsen R, Albrechtsen A, Hansen T. A common Greenlandic TBC1D4 variant confers muscle insulin resistance and type 2 diabetes. Nature 2014; 512:190–204.

National Center for Biotechnology Information (2014): TBC1D4 TBC1 domain family, member 4 Homo sapiens (human). http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/9882. Luettu 8.9.2014

Turnpenny P, Ellard S. Emery’s Elements of Medical Genetics. Philadelphia: W.B.

Saunders Company, 2007.Uusitupa, Matti (2009): Aikuistyypin diabeteksen (tyypin

2 diabeteksen) ehkäisy (lyhyt ohje). Terveyskirjasto, Duodecim. http://www.terveyskirjasto.fi/kotisivut/tk.koti?p_artikkeli=seh00177. Luettu 14.9.2014

Watson RT, Kanzaki M, Pessin JE. Regulated Membrane Trafficking of the Insulin- Responsive Glucose Transporter 4 in Adipocytes. New York: Endocr Soc, 2004.

534

Liite 1. Tyypin II diabetekselle altistavat tunnetut variantit. Mukaillen Turnpenny & El- lard 2007 ja Moltke ym. 2014.

Geeni Muoto Proteiinin tehtävä EsiintymispopulaatioCAPN10 SNP43

(introni 3)Kysteiiniproteaasi Meksikolais-amerikkalaisia

kaksosparejaPPARG P12A Adiposyyttien erilaistuminen KandidaattigeeniKCNJ11 E23K Haiman β-solujen K-ATP-

kuljettajan alayksikköBiologinen kandidaatti

HNF1A G319S Transkriptiotekijä β-solukehityksessä

Oji Cree

IPF-1 D76N Transkriptiotekijä β-solukehityksessä

Kandidaattigeeni

HNF4A SNP P2-promoottorissa

Transkriptiotekijä β-solukehityksessä

Kandidaattigeeni

TCF7L2 Intronin 3 variantit

Proglukagonin geeniekspressi- on transkriptiotekijä

Islantilaisia perheitä

TBC1D4 R684X Rab-proteiinin GTP-aktivaattori Grönlannin inuiitit

535

E15 PTEN-proteiini – solujen insuliiniherkkyyden säätelyJutila, Heidi & Huovinen, JereSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto17.09.2014Tarkastaja: Olli Kantola

TiivistemäFosfataasi- ja tensiinihomologi PTEN on lähes kaikkialla elimistössä toimiva kasvunrajoiteproteiini, jolla on useita tehtäviä solun kasvuun, kehitykseen, lisääntymiseen ja aineenvaihduntaan liittyen. Tämän lisäksi PTEN säätelee solujen insuliiniherkkyyttä toimimalla PI3K-reitin vastavaikuttajana. PTEN-proteiinin ylimäärän on todettu heikentävän insuliinisignalointia kudoksissa ja aiheuttavan insuliiniherkkyyden vähenemistä ja insulii-niresistenssia.

Tutkimuksissa on osoitettu PTEN-deleetioiden useimmissa kudoksissa alentavan insuliinitasoja veressä sekä ehkäisevän insuliiniresistenssia, korkeita verensokeritasoja ja tyypin 2 diabetesta. Kudosspesifisen deleetion vaikutukset näkyvät koko elimistössä. PTEN:n vaikutukset ovat erilaisia riippuen siitä mihin kudokseen de-leetio kohdistetaan: hermokudoksessa sen vaikutus saattaa olla jopa päinvastainen. PTEN-geenin deleetioon sairauksien hoito- tai ehkäisykeinona liittyy useita ongelmia, kuten joissakin tapauksissa syövän ja ylipainon riskin kohoaminen sekä kudosten liikakasvu.

JohdantoTyypin 2 diabetes, ylipaino ja metabolinen oi-reyhtymä ovat 2000-luvulla erittäin vakava kan-santerveydellinen ongelma etenkin länsimaissa, ja sen ennustetaan yleistyvän merkittävästi tule-vina vuosina (International Diabetes Federation 2013). Näiden sairauksien taustalla on yliravitse-mus ja sen myötä häiriintynyt sokeriaineenvaih-dunta, johon liittyy insuliiniresistenssin kehitty-minen. Myös Alzheimerin tautia voidaan pitää osittain samoista syistä johtuvana hermosolujen diabeteksena (Sebastiao ym. 2014).

Insuliiniresistenssi on tila, jossa haima tuottaa normaalisti insuliinia, mutta solujen herkkyys in-suliinille on heikentynyt, eikä verensokeri laske odotetulla tavalla ruokailun jälkeen (Mäkinen ym. 2013). Solujen insuliiniherkkyyttä ylläpitää muun muassa PI3K-Akt- signalointireitti, jonka yhtenä vastavaikuttajana toimii fosfataasi- ja tensiiniho-mologi PTEN (Goberdhan & Wilson 2003).

PTEN-proteiinin inhibiittoreita tai sitä koodaa-van geenin mutaatioita on tutkittu eri kudoksissa hoito- ja ehkäisykeinona insuliiniresistenssille, diabetekselle ja muille sokeriaineenvaihdunnan häiriöille. PTEN kuuluu kuitenkin kasvurajoi-tegeeneihin ja sillä on tärkeitä tehtäviä solun kasvun, kehityksen, aineenvaihdunnan, lisään-tymisen ja apoptoosin kannalta. Nämä tehtävät

on otettava huomioon, jos PTEN:n toiminnan estämistä halutaan käyttää hoitokeinona: geenin deleetion on tutkittu liittyvän useiden erilaisten syöpien kehittymiseen (Salmena ym. 2008). Kaiken lisäksi PTEN ei toimi kaikissa kehon ku-doksissa samalla tavalla, vaan hermokudoksessa se pikemminkin ehkäisee insuliiniresistenssia (Gupta ym. 2012).

Fosfaatti- ja tensiinihomologi PTEN

Yleistä

PTEN, eli fosfataasi- ja tensiinihomologi, on samannimisen geenin koodaama proteiini. Tä-män kromosomissa 10 sijaitsevan kasvunrajoi-tegeenin mutaation tai proteiinin vähäisyyden on osoitettu monissa tapauksissa liittyvän syö-päkasvaimen kehitykseen. (Salmena ym. 2008.) Joitain vuosia sen jälkeen, kun geeni löydettiin 1997, todettiin, että kun osa geenin eksoneista oli deletoitunut, aiheutui hiirillä sikiökuolemia, ja heterotsygoottisenakin PTEN-deleetio pystyt-tiin yhdistämään hiirillä esiintyneisiin syöpiin. (Suzuki ym. 2004).

Itse PTEN-proteiinia löytyy lähes jokaisesta ke-hon kudoksesta, mikä antaa viitteitä proteiinin ja geenin suuresta merkityksestä elimistölle. PTEN on noin 400 aminohaposta koostuva fosfataasi-

536

proteiini, eli se defosforyloi (irrottaa) fosfaatti-ryhmän kohdemolekyyleistään, joita ovat pää-osin lipidit, mutta myös proteiinit. Tämän lisäksi PTEN-proteiini säätelee osaltaan apoptoosia ja solujen lisääntymistä, mikä korostaa sen roolia esimerkiksi eturauhassyövän synnyssä (Zhao ym. 2004).

Tehtävät

PTEN-proteiinin tehtävä on syövän syntymisen estämisen lisäksi toimia yleisesti lipidifosfataa-sina, eli käytännössä toimia fosfoinositidi-3-ki-naasi (PI3K) -Akt -reitin negatiivisena säätelijä-nä (Goberdhan & Wilson 2003). PTEN-proteiini estää Akt:n fosforylaation. Tällöin Akt:n tehtävät solun kasvuun, kehitykseen ja insuliiniherkkyy-teen liittyen häiriintyvät. Toisaalta PTEN kyke-nee toimimaan myös proteiinifosfataasina eri-tyisesti FAK:lle eli fokaaliadheesiokinaasille, minkä vuoksi sillä on myös suuri merkitys her-mokudoksessa (Gupta & Chinmoy 2012).

PTEN on kuitenkin myös laajemmin mukana prosesseissa, jotka liittyvät muun muassa solujen kasvuun, tukirangan kehitykseen ja aineenvaih-duntaan (Song ym. 2012). Tämä selittää hyvin, miksi PTEN-geenin häiriöistä johtuva PTEN-proteiinin vähäinen määrä tai toimimattomuus johtaa syövän syntyyn hallitsemattoman kasvun kautta. Esimerkiksi PI3K- Akt-signaaliketju es-tää apoptoosia, ja sillä on tutkittu olevan yhte-yksiä solusyklin etenemiseen, eli käytännössä se on olennainen solujen kasvun ja jakaantumisen kannalta (Chang ym. 2003).

PTEN ja insuliiniherkkyys

Insuliiniresistenssi

Insuliiniresistenssi on poikkeava fysiologinen vaste insuliiniin sen kohdekudoksessa (Mäkinen ym. 2013). Usein insuliiniresistenssiin liittyy lii-karavitsemus ja ylipaino. Ne käynnistävät tuleh-dusreaktion rasvakudoksessa ja maksassa, joista se leviää myös muihin kudoksiin. Tulehdustila indusoi insuliiniresistenssin kehittymistä usei-den signalointireittien kautta. Insuliiniresistentin kudoksen insuliiniherkkyys on heikentynyt, eikä solu ota insuliinin kuljettamaa glukoosia vastaan tavalliseen tapaan. Niinpä energiaa varastoidaan yhä enemmän rasvakudokseen, mikä lisää yli-painoa, inflammaatiota ja insuliiniresistenssiä entisestään. (Shoelson ym. 2006.)

PTEN insuliiniherkkyyden säätelijänä eri kudoksissa

Tutkimuksissa on osoitettu, että PTEN-proteiini toimii yhtenä insuliiniherkkyyden säätelijänä muun muassa rasvakudoksessa (Kurlawalla-Martinez ym. 2005), maksassa (Stiles ym. 2003), luustolihaksissa (Wijesekara ym. 2005), hypota-lamuksessa (Wang, Opland ym. 2014, Sumita ym. 2014) ja haimassa (Wang, Luk ym. 2014, Tong ym. 2009, Stiles ym. 2006). Tutkimuk-sissa todettiin PTEN-geenin deleetion lisäävän glukoositoleranssia ja insuliiniherkkyyttä. Nämä vaikutukset näkyivät koko kehon metaboliassa pelkän kohdekudoksen sijaan. Joissain tapauk-sissa kudosspesifinen PTEN-deleetio aiheuttaa energiavarojen siirtymistä muista kudoksista in-suliiniherkimpään kudokseen.

Rasvakudosspesifinen PTEN-deleetio paransi glukoositoleranssia ja insuliiniherkkyyttä, vä-hensi insuliinin määrää veressä, lisäsi glukoo-sikuljettajia solukalvolla ja vähensi seerumin resistiinia, joka on tulehdussoluista vapautu-va hormoni. Myös maksan insuliinisignaloin-ti lisääntyi. Kuitenkaan rasvakudosspesifinen PTEN-deleetio ei lisännyt ylipainoisuutta tai rasvahappojen määrää plasmassa. (Kurlawalla-Martinez ym. 2005.)

PTEN-deleetio hiirten maksassa vähensi insulii-nin määrää veressä, lisäsi glukoositoleranssia ja insuliiniherkkyyttä, sekä kiihdytti glykogeenin synteesiä maksassa. Maksan lisääntynyt insu-liiniherkkyys aiheutti rasvan siirtymistä muista kudoksista maksaan. (Stiles ym. 2003.)

Luustolihasten PTEN-deleetio suojasi hiiriä in-suliiniresistanssilta yliravitsemuksen aikana ja lisäsi glukoositoleranssia niiden koko kehossa. Insuliiniresistenssin kehittyessä haiman beta- so-lut alkavat yleensä lisääntyä ja haima alkaa tuot-taa yhä enemmän insuliinia verensokerin laske-miseksi. Luustolihasten PTEN-deleetio suojasi hiiriä myös haiman liikakasvulta ja veren insulii-nipitoisuuksien nousulta. Deleetiosta huolimatta hiiret lihoivat lähes samaan tahtiin kuin hiiret, joilla PTEN-geenin deleetiota ei ollut. (Wijese-kara ym. 2005.)

Hypotalamuksen PTEN-mutaatio suojasi rottien maksaa insuliiniresistenssiltä. Koska hypotalamus säätelee kylläisyyttä ja näläntunnetta, rotat söivät vähemmän ja niiden paino nousi vähemmän kuin vertailuryhmällä. Kuitenkin kun rotat altistettiin runsasenergisemmälle dieetille, ei enää havaittu

537

eroa syömisessä ja painon nousussa mutanttien ja tavallisten rottien välillä. (Sumita ym. 2014.)

Haimaspesifinen PTEN-deleetio hiirillä kiihdytti solunjakaantumista haimassa ja suurensi haimaa. Deleetio suojasi hiiriä hyperinsulinemialta ja hy-perglykemialta, eli korkeilta veren insuliini- ja glukoositasoilta. Haiman deleetio vaikutti myös maksassa PTEN-tasojen laskuun ja Akt:n fosfo-rylaation lisääntymiseen. (Tong ym. 2009.)

PTEN-deleetio haiman beta-soluissa vaikutti myös kiihdyttävästi solunjakautumiseen ja vä-hensi apoptoosia. Näin haiman beta-solujen yh-teismassa kasvoi huomattavasti. PTEN- deleetio suojasi beta-soluja vaurioilta ja esti veren glu-koositasojen nousua beta-solujen vaurion aika-na. (Stiles ym. 2006.)

PI3K-signalointi säätelee myös haiman glukago-nia tuottavien alfa-solujen toimintaa. Havaittiin, että PTEN-deleetio haiman alfa-soluissa vähensi rasvaisella dieetillä olevien hiirten glukagonin eritystä. Glukagoni on hormoni, joka stimuloi glykogeenin pilkkomista glukoosiksi, jolloin ve-rensokeri nousee. Glukakonin erityksen vähen-tyminen suojasikin hiiriä insuliiniresistanssilta ja hyperglykemialta. (Wang 2014.)

Vaikka PTEN-toimii negatiivisena säätelijänä insuliinisignaloinnissa perifeerisissa kudoksissa, Gupta ja Dey (2012) osoittivat, että se saattaakin keskushermostossa säädellä positiivisesti insu-liinisignalointia ja glukoosin sisäänottoa solui-hin. PTEN-proteiinin inhiboiminen lisäsi Akt:n fosforylaatiota hermosoluissa, mutta tästä huoli-matta glukoosin sisäänotto soluihin häiriintyi ja seurasi hermostollinen insuliiniresistenssi.

Solutason mekanismit

PTEN perifeerisissä kudoksessaInsuliinin ja sen kaltaisten kasvutekijäproteii-nien (IGF) saapuminen soluun tapahtuu insu-liinireseptorien kautta. Reseptoreihin kiinnittyy useita eri substraatteja, joista alkaa signaaliket-ju fosforylaatioreaktion avulla. Eräs merkittävä substraatti on IRS-1, jonka fosforylaatiota PTEN inhiboi. Tämä johtaa PI3K-Akt-signaaliketjun katkeamiseen, jolloin insuliinin vaikutus solus-sa vähenee, mikä altistaa insuliiniresistenssille. Vaikkei PTEN suoraan vaikutakaan kaikkiin insuliinin vastaanottoon liittyviin signaaliketjui-hin, niin se silti heikentää solun insuliiniherk-kyyttä merkittävästi. (Weng ym. 2001.)

Esimerkiksi PTEN:n vaikutuksesta insuliini-signaloinnin kannalta merkittävän MAPK- sig-naaliketjun, eli mitogeenin aktivoimien proteii-nikinaasien kautta kulkevaan reittiin, on kaksi-suuntaista tietoa. Toisaalta PTEN:n inhiboiman insuliinireseptorisubstraatin on todettu vaikut-tavan välivaiheiden kautta myös solusyklin etenemiseen liittyvään MAPK-reittiin (Weng ym. 2001), mutta on myös tutkittu, ettei deletoi-tuneen PTEN-geenin ja MAPK- insuliinireitin aktivaatiolla ole yhteyttä (Tang ym. 2005). Se-littävä tekijä lienee se, että edellinen tutkimus oli rintasyöpäepiteelisoluista ja jälkimmäinen rasvasoluista. Kudostyyppi vaikuttaa siis PTEN-proteiinin toimintaan, kuten edellä on todettukin, mutta yleisesti PTEN vaikuttaisi toimivan kaik-kialla muualla paitsi hermokudoksessa insuliini-resistenssiä kiihdyttävästi.

PTEN hermokudoksessaPTEN-proteiinin vaikutukset keskushermostossa ovat lähes täysin vastakkaiset, ja se lisää solujen insuliiniherkkyyttä estäen insuliiniresistenssiä muodostumasta. Tämä perustuu niin sanotun FAK-ERK-signaalireitin erilaiseen toimintaan hermosoluissa. FAK (fokaaliadheesiokinaasi) on proteiinikinaasi, joka useimmissa kudoksissa ak-tivoi PI3K- signaaliketjua täten auttaen insuliinin vastaanottoa ja ehkäisten insuliiniresistenssiä, mutta hermosoluissa FAK:n vaikutus on päin-vastainen: Insuliiniresistenteissä hermosoluissa on mitattu erittäin korkeita FAK-pitoisuuksia, kun taas sitä koodaavan geenin toimimattomaksi tekeminen samanlaisissa soluissa kohensi huo-mattavasti glukoosin vastaanottoa (Gupta ym. 2012). Erot johtuvat proteiinin erilaisesta kooda-uksesta hermosoluissa, eikä kaikkia seurauksia näistä eroista vielä tiedetä (Gupta & Chinmoy 2012).

ERK (extracellular signal-regulated kinase) on edellä mainittuihin MAP-kinaaseihin kuuluva proteiini, jonka aktivaation PTEN-proteiini estää toimimalla inhiboivana substraattina FAK- pro-teiinille. Hermokudoksessa tämä FAK-ERK-ket-ju toimii insuliininvastaanottoa säätelevän PI3K-signaaliketjun vastavaikuttajana, jolloin insu-liiniresistenssin syntyminen olisi mahdollista ilman PTEN-proteiinin toimintaa. PTEN-geenin deleetio aivokuoren neuroneissa onkin tutkitusti johtanut glukoosin vastaanoton heikkenemiseen (Gupta & Chinmoy 2012.)

538

Poikkeuksellista FAK-ERK-ketjussa hermo-soluissa on erityisesti se, että niissä kyseinen signaaliketju toimii osana apoptoosin käyn-nistämistä, kun taas muissa soluissa se edistää solujen selviytymiskykyä (Gupta & Chinmoy 2012). Tämä on ominaista hermosoluille – ne ei-vät kuole, mutta myös niiden uusiutumiskyky on

heikko, ja juuri FAK-ERK-signaaliketju on eräs tätä ominaisuutta selittävä tekijä. PTEN-proteii-nin puutos tai geenin deleetio voi siis aiheuttaa PI3K-signaalireitin inhiboitumisen kautta her-mosolujen insuliiniherkkyyden vähentymistä, minkä on todettu olevan yhteydessä Alzheimerin taudin kehittymiseen (van der Heide ym. 2006).

Kuva 1: PTEN-proteiinin toiminta perifeerisessä kudoksessa. Erittäin yksinkertaistetusta kaaviosta käy ilmi PTEN:n antagonistinen vaikutus PI3K-Akt-ketjuun, joka säätelee muun muassa solun kasvua ja lisääntymistä. Näin selittyy PTEN:n vaikutus tuumorisuppressiossa. PTEN vaikuttaa myös inhiboivas-ti IRS-proteiinien (insuliinireseptorisubstraattien) toimintaan, jolloin solun insuliiniherkkyys vähenee. SHC ja MAPK-reitti ovat karkeana esimerkkinä siitä, että muitakin insuliinisignalointireittejä, joihin PTEN:lla on pienempi vaikutus, on olemassa. IRS:t vaikuttavat välivaiheiden kautta myös MAPK-sig-naalireittiin. Samoja reittejä soluun tulevat muutkin insuliinin kaltaiset kasvutekijät.

539

Kuva 2: PTEN-proteiinin toiminta hermokudoksessa. Kaaviossa näkyy samankaltainen insuliinisig-nalointiketju kuin perifeerisessäkin kudoksessa. Kuitenkin FAK-ERK-reitin erilainen toiminta saa sen vaikuttamaan PI3K-Akt signalointiketjua vastaan, jolloin insuliinisignalointi häiriintyy. PTEN-proteiinin tehtävänä on inhiboida FAK:n toimintaa jolloin PI3k-Akt-reitti toimii normaalisti, eikä insuliiniresistens-siä pääse muodostumaan.

Kliiniset sovellukset

PTEN ja diabetes

hyperglykemia. Syynä tähän on insuliiniresistens-si ja osassa tapauksista myös haiman insuliinituo-tannon heikentyminen. Usein tyypin 2 diabetek-seen liittyvät kohonneet insuliinitasot elimistössä, sillä kohonnut verensokeri kiihdyttää haiman in-suliinintuotantoa. Jatkuvassa rasituksen ja tuleh-dustilan takia haiman insuliinintuotanto voi kui-tenkin laskea ja lopulta ehtyä kokonaan (Tong ym. 2009). (Goldenberg ja Punthakee 2013.)

Metabolinen oireyhtymä sisältää samankaltaisia oireita, muun muassa vyötärölihavuus, korkeat verensokeritasot ja insuliiniresistenssi. Metabo-linen oireyhtymä ja diabetes esiintyvätkin usein yhtä aikaa samoilla henkilöillä. Metaboliseen oi-reyhtymään liittyy lisäksi sydän- ja verisuonitau-dit ja rasva-aineenvaihdunnan häiriöt. (Golden-berg ja Punthakee 2013.)

PTEN-proteiinin vaikutus insuliiniherkkyyteen te-kee siitä siis tärkeän vaikuttavan tekijän myös dia-betekseen, metaboliseen oireyhtymään ja muihin insuliiniresistenssipohjaisiin häiriöihin. PTEN-de-leetioiden onkin todettu lukuisissa tutkimuksissa ehkäisevän tyypin 2 diabetesta niin ihmisillä, ro-tilla kuin hiirilläkin useimmissa kohdekudoksissa (Stiles ym. 2006, Tong ym. 2009, Pal ym. 2012, Wang ym. 2014, Kurlawalla-Martinez ym. 2005).

Haasteita

PTEN on kasvunrajoitegeeni, joten sen syöpää estävä vaikutus on otettava huomioon hoitome-netelmiä suunniteltaessa. Esimerkiksi PTEN-geenin haploinsuffisienssi, eli toisen alleelin toi-mimattomuus niin, että proteiinin vaikutus estyy, estää tyypin 2-diabetesta tehokkaasti, mutta lisää huomattavasti syövän riskiä (Pal ym. 2012). Luurankolihaksissa PTEN kuitenkin suojasi hii-riä yliravitsemuksen aiheuttamalta insuliiniresis-tenssilta ja tyypin

540

2 diabetekselta ilman syöpäriskin kohoamista (Wijesekara ym. 2005). Haiman beta-solujen PTEN-deleetio sen sijaan korjasi haiman insu-liinituotannon häiriöitä ilman syöpäriskiä (Stiles ym. 2006).

PTEN:n vaikutuksesta ylipainoon on ristiriitaista tietoa. PTEN-geenin haploinsuffisienssin todet-tiin aiheuttavan ylipainoa (Pal ym. 2012). Tämän arveltiin johtuvan siitä, että rasvakudos on erityi-sen herkässä asemassa insuliinin suhteen, joten insuliiniherkkyyden kasvu kerää energiavaroja eniten rasvakudokseen. Toisessa tutkimuksessa esitettiin rasvakudosta kuitenkin hyvänä kohtee-na PTEN:n deleetiolle, eikä deleetion huomattu aiheuttavan ylipainoa (Kurlawalla-Martinez ym. 2005). Hypotalamukseen kohdistettu deleetio sen sijaan ehkäisi ylipainoa, mutta vaikutus pois-tui yliravitsemuksen aikana (Sumita ym. 2014).

Alzheimerin tautiin liittyy usein insuliinisig-naloinnin häiriöitä sekä hyperglykemiaa, ja sitä kutsutaankin joskus tyypin 3 diabetekseksi (Se-bastiao ym. 2014). Guptan ja Deyn (2012) tutki-mus ennustaa, että PTEN:n synteesin lisääminen saattaisi hermosoluissa ehkäistä ja hoitaa insulii-niresistenssia ja siihen liittyviä häiriöitä, kuten Alzheimerin tautia. Tämä PTEN:n mahdollinen käänteinen vaikutus keskushermostossa täytyy ottaa huomioon, jos PTEN:n toiminnan estämis-tä käytetään hoitokeinona esimerkiksi tyypin 2 diabetekseen.

On esitetty, ettei ylipaino tai insuliiniresistenssi pelkästään aiheuttaisi varsinaista terveydellis-tä haittaa, vaan sen sijaan vaaran aiheuttaisivat korkeat insuliinitasot elimistössä. On tutkittu, että karhujen insuliiniherkkyys kasvaa ennen tal-viunta ja vähenee talviunen ajaksi ilman että in-suliiniresistenssiin liittyisi tulehdustilaa, korkei-ta insuliinipitoisuuksia veressä tai heikentynyttä kykyä käyttää varastorasvaa energiaksi kuten yleensä lihavuuteen liittyvässä insuliiniresistens-sissa ihmisillä. (Nelson ym. 2014). Myös raskaa-na olevilla naisilla esiintyy samankaltainen ”ter-ve” insuliiniresistenssi johon liittyy kiihtynyt lipolyysi, eli lipidien pilkkominen rasvahapoiksi ja glyseroliksi (Barbour ym. 2007).

Insuliiniresistenssin on myös tutkittu toimivan osana elimistön antioksidanttista puolustusjär-jestelmää, eli suojaavan elimistöä oksidatiivi-selta stressiltä. Insuliiniresistenssi saattaakin siis olla elimistön hyödyllinen puolustusreaktio lii-karavitsemukselle. Tällöin pelkän insuliiniresis-tenssin hoitaminen ei ole välttämättä järkevää el-

lei myös sen alkuperäistä syytä poisteta (Hoehn ym. 2009).

Jos PTEN:a halutaan käyttää kohteena insulii-niresistenssin ja muiden häiriöiden hoidossa tulevaisuudessa, täytyy suorittaa paljon lisätut-kimuksia aiheesta. Suurin osa tutkimuksista on tehty hiirillä tai rotilla, joten täytyy selvittää, kuinka suuri osa tuloksista pitää paikkansa myös ihmisen elimistössä. Yksinkertaisempi, hait-tavaikutuksettomampi ja huomattavasti edul-lisempi tapa ehkäistä niin tyypin 2 diabetesta, insuliiniresistanssia kuin Alzheimerin tautiakin on useissa PTEN-tutkimuksissakin esiin noussut ruokavalio. Selvittämällä tarkemmin häiriötilo-jen pohjalla olevia signaaliketjuja voidaan kui-tenkin ymmärtää paremmin eri ruokavalioiden-kin vaikutuksia.

Lähteet

Barbour L, McCurdy C, Hernandez T, Kirwan J, Catalano P, Friedman, J (2007): Cellular Mechanisms for Insulin Resistance in Normal Pregnancy and

Gestational Diabetes. Diabetes Care 7/2007 vol. 30 no. Supplement 2 S112-S119

Chang, F, Lee, J. T, Navolanic, P. M, Steelman, L. S, Shelton, J.G, Blalock, W. L, Franklin, R. A, McCubrey, J . A. (2003) Involvement of PI3K/Akt pathway in cell cycle progression, apoptosis, and neoplastic transformation: a target for cancer chemotherapy. Leukemia 17, 590–603

Goberdhan, Deborah C.I. & Wilson, Clive (2003) PTEN: tumour suppressor, multifunctional growth regulator and more. Human molecular genetics 12, 2, 239–248

Goldenberg R, Punthakee Z (2013): Definition, Classification and Diagnosis of Diabetes, Prediabetes and Metabolic Syndrome. C anadian Journal of Diabetes, Volume 37, Supplement 1, Pages S8–S11, April 2013.

Gupta, Amit & Dey, Chinmoy Sankar (2012) PTEN, a widely known negative regulator of insulin/PI3K signaling, positively regulates neuronal insulin resistance. Molecular biology of the cell 23, 19, 3882–3898

Gupta, A, Bisht, B, Dey, C. S. (2012) Focal adhesion kinase negatively regulates neuronal insulin resistance. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Basis of Disease 1822, 6, 1030–1037

van der Heide, L. P, Ramakers, G. M. J, Smidt, M. P. (2006) Insulin signaling in the central nervous system: Learning to survive. Progress in Neurobiology 79, 4, 205–221

Hoehn K, Salmon A, Hohnen-Behrens C, Turner N, Hoy A, Maghzai G, Stocker R, Van Remmen H, Kraegen E, Cooney G, Richardson A, James D (2010): Insulin resistance is a cellular antioxidant defense mechanism. PNAS 20.10.2009 vol. 106 no. 42, 17787–17792.

541

Kurlawalla-Martinez C, Stiles B, Wang Y, Devaskar S, Kahn B, Wu H (2005): Insulin Hypersensitivity and Resistance to Streptozotocin-Induced Diabetes in Mice Lacking PTEN in Adipose Tissue. Mol. Cell. Biol. March 2005 vol. 25 no. 6 2498–2510.

International Diabetes Federation: http://www.idf.org/worlddiabetesday/toolkit/gp/facts-figures (Luettu 17.9.2014)

Mäkinen S, Skrobuk P, Nguyen Y, Koistinen H (2013): Insuliiniresistenssin mekanismit. Lääketieteellinen Aikakauskirja Duodecim 2013;129(20):2115–22. Nelson O, Jansen H, Galbreath E, Morgenstern K, Gehring J, Rigano K, Lee J, Gong J, Shaywitz A, Vella C, Robbins C, Corbit K (2014): Grizzly Bears Exhibit

Augmented Insulin Sensitivity while Obese Prior to a Reversible Insulin Resistance during Hibernation. Cell Metabolism Volume 20, Issue 2, p376 –382.

Pal A, Barber T, Van de Bunt M, Rudge S, Zhang Q, Lachan K, Cooper N, Linden H, Levy J, Wakelam M, Walker L, Karpe F, Gloyn A (2012): PTEN mutations as a cause of constitutive insulin sensitivity and obesity. New England Journal of Medicine. 367(11):1002–11, 2012 Sep 13. RCSB Protein databank, http://www.rcsb.org/pdb/explore/jmol.do?structureId=1D5R&bionumber=1 katsottu 15.09.2014 (kannen kuva) Salmena, L, Carracedo, A, Pandolfi, P. P (2008) Tenets of PTEN Tumor Suppression. (Review) Cell, vol. 3, 2, 403–414

Sebastiao I, Candeais E, Santos M, de Oliveira C, Moreira P, Duarte A (2014): Insulin as a Bridge between Type 2 Diabetes and Alzheimer Disease – How Anti- Diabetics Could be a Solution for Dementia. Frontiers in Endocrinology (Lausanne), 2014 Jul 8;5:110.

Shoelson S, Lee J, Goldfine A (2006): Inflammation and insulin resistance. J Clin Invest 2006; 116(7): 1793–1801.

Song, M. S, Salmena, L, Pandolfi, P. P (2012) The functions and regulation of the PTEN tumour suppressor. Nature Reviews Molecular Cell Biology 13, 283–296

Stiles B, Wang Y, Stahl A, Bassilian S, Lee W, Kim Y, Sherwin R, Devaskar S, Lesche R, Magnuson M, Wu H (20 03): Liver-specific deletion of negative regulator Pten results in fatty liver and insulin hypersensitivity. PNAS vol. 101 no. 7 2082–2087.

Stiles BC, Kurlwalla-Martinez C, GUo W, Gregorian C, Wang Y, Tian J, Magnuson MA, Wu H (2006): Selective deletion of Pten in pancreatic beta cells leads to increased islet mass and resistance to STZ-induced diabetes. Mol Cell Biol. Apr 2006; 26(7): 2772–2781.

Sumita T, Ono H, Suzuki T, Sakai G, Kouichi K, Katagiri H, Asano T, Katayama S, Awata T (2014): Mediobasal hypothalamic PTEN modulates hepatic insulin resistance independently of food intake in rats. American Journal of Physiology – Endocrinology and Metabolism, 1 July 2014Vol. 307no. 1, E47-E60.

Suzuki, A, de la Pompa, J. L, Stambolic, V, Elia, A. J, Sasaki, T, del Barco Barrantes, I, Ho, A, Wakeham, A, Itie A, Khoo, W, Fukumoto, M, Mak, T. W. (1998) High cancer susceptibility and embryonic lethality associated with mutation of the PTEN tumor suppressor gene in mice. Current biology, vol.8, 21, 1169–1178

Tang, X, Powelka, A. M, Soriano, N. A, Czech, M. P, Guilherme, A (2005) PTEN, but Not SHIP2, Suppresses Insulin Signaling through the Phosphatidylinositol 3-Kinase/Akt Pathway in 3T3-L1 Adipocytes. The Journal of Biological Chemistry, 280, 22523–22529.

Tong Z, Fan Y, Zhang W, Xu J, Cheng J, Mingxiao D, Deng H (2009): Pancreas-specific Pten-deficiency causes partial resistance to diabetes and elevated hepatic AKT signaling. Cell Research (2009) 19:710–719.

Wang L, Opland D, Tsai S, Luk C, Schroer S, Allison M, Elia A, Furlonger C, Suzuki A, Paige C, Mak T, Winer D, Myers M, Woo M (2014): Pten deletion in RIP-Cre neurons protects against type 2 diabetes by activating the anti-inflammatory reflex. Nature Medicine 2014 May;20(5):484–92.

Wang L, Luk C, Cai E, Schroer S, Allister E, Shi S, Wheeler M, Gaisano H, Woo M (2014): PTEN Deletion in Pancreatic α Cells Protects Against High Fat

Diet-induced Hyperglucagonemia and Insulin Resistance. Diabetes 9/2014 63:2899–2900.

Weng, L.-P, Smith, W. M, Brown, J. L, Eng, C. (2001) PTEN inhibits insulin-stimulated MEK/MAPK activation and cell growth by blocking IRS-1 phosphorylation and IRS-1/Grb-2/Sos complex formation in a breast cancer model. Human Molecular Genetics 10, 6, 605–616

Wijesekara N, Kondrad D, Eweida M, Jefferies C, Liadis N, Giacca A, Crackower M, Suzuki A, Mak T, Kahn C, Klip A, Woo M (2005): Muscle-Specific Pten

Deletion Protects against Insulin Resistance and Diabetes. Mol. Cell. Biol. February 2005 vol. 25 no. 3 1135–1145.

Zhao, H, Dupont, J, Yakar, S, Karas, M, LeRoith, D. (2004) PTEN inhibits cell proliferation and induces apoptosis by downregulating cell surface IGF-IR expression in prostate cancer cells. Oncogene 23, 786–794

542

E16 Alipogeenitiparvoveekki – ja muut geeniterapialääkkeet Saastamoinen, Eemeli & Salmela, ArttuSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto13.09.2013Tarkastaja: Siri Lehtonen

TiivistelmäGeeniterapihoidolla tarkoitetaan geenin siirtämistä yksilön soluihin ja kudoksiin, joissa se inaktivoi tai korvaa toimimattoman tai väärin toimivan geenin tai muutoin vaikuttaa sen ilmentymiseen. Geenien paremman ym-märtämisen ja ihmisen genomin kartoittamisen myötä geeniterapia on alkanut kehittyä yhä kiihtyvällä tahdilla aina 1990-luvun ensimmäisistä läpimurroista asti. Euroopan lääkevirasto onkin jo hyväksynyt markkinoille ensimmäisen geeniterapialääkkeen ja uusia kehitetään ja testataan jatkuvasti. Moniin vaikeasti hoidettaviin sairauksiin, kuten HIV ja syövät, on myös kehitteillä lupaavia geeniterapiahoitoja.

GeeniterapiaGeeniterapialla tarkoitetaan nukleiinihappojen (pääasiassa DNA:n) siirtämistä soluihin sairauden estämiseksi, parantamiseksi tai muutoin hoitami-seksi. Hoitojen kehityksen alkaessa etsittiin lähin-nä terapiamuotoja yksittäisen geenin aiheuttamiin sairauksiin (mm. Blaese ym. 2005), mutta pian tutkimuskohteiden kirjo laajeni muun muassa monitekijäisten sairauksien kuten syövän hoitoon (mm. Morgan, 2006). Hoidot kohdistuvat aina so-maattisiin soluihin, sillä vaikka periaatteessa näil-lä hoidoilla voisi pysäyttää joidenkin geneettisten sairauksien periytymisen, ituradan solujen mani-puloiminen on kiellettyä siihen liittyvien eettisten ongelmien takia. Heinäkuussa 2013 käynnissä oli 1970 kliinistä tutkimusta, joista kaksi on faasissa IV, 72 faasissa III ja 20 faasissa II/III. (John Wiley & Sons ltd, 2013)

DNA:han perustuvat hoitomenetelmät ovat toi-mintamekanismeiltaan hyvin monimuotoisia. Hoitavat geenit voivat tuottaa normaaleja prote-iineja väärin toimivien sijaan (Blaese ym. 1995) tai aiheuttaa apoptoosin syöpäsolussa. (Tu K ym. 2013) Hoitava nukleiinihappo voi olla lyhyt oligonukleotidi, joka estää viallisen proteiinin translaation liittymällä mRNA-han. (Vitravene Study Group 2002) tai aptameeri joka tarttuu sairautta aiheuttavaan proteiiniin ja muuttaa sen toimintaa.

Hoitojen kehitys

Vuonna 1990 aloitettiin ensimmäinen geenite-rapiahoito kahdelle lapselle, joilla oli havaittu adenosiinideaminaasi (ADA) -geenin puutos,

mikä saa aikaan immuunipuolustuksen romah-tamisen. Hoidossa käytettiin vektoreina retro-viruksia, joilla geeniä siirrettiin lasten T-lymfo-syytteihin. Hoidon seurauksena T-lymfosyyttien määrä normalisoitui ja monet soluvasteet parani-vat. (Blaese ym. 1995) Hoidon onnistuminen loi pohjan geeniterapian kehittämiselle ja erilaisten geeniterapialääkkeiden tuotannolle.

Eräs lupaavimmista mahdollisista geeniterapia-hoidettavista sairauksista on sirppisoluanemia, sillä se johtuu yhdestä ainoasta pistemutaatiosta ihmisen perimässä. Mutaatio saa aikaan virheel-lisen hemoglobiinimolekyylin muodostumisen. Vuonna 2001 saatiin siirrettyä terveitä kanta-soluja hiiriin, joilla oli sirppisoluanemia, käyt-täen HIV-perusteista virusvektoria. Hoito kor-jasi lähes kaikki punasolut ja oireet paranivat. (Pawliuk ym. 2001). Toistaiseksi HIV-vektorin käyttöön ihmisissä suhtaudutaan varauksella, ja ennen hoitojen aloittamista tarvitaan vielä suuret määrät ihmiskokeita.

Niin ikään paljon on tutkittu geeniterapian käyt-töä syövän hoidossa. Vuonna 2006 15 potilaa-seen siirrettiin potilaan omia T-lymfosyyttejä, joita oli muunneltu tunnistamaan syöpäsoluja. Kaikilla potilailla veren lymfosyyttitasot nou-sivat merkittävästi vähintään kahdeksi kuukau-deksi hoidon aloittamisesta ja kahdella potilaalla hoito sai aikaan merkittävää syöpäpesäkkeiden pienenemistä. Tällaisen hoidon vaikeutena on, että potilaalla on oltava valmiina kasvaimeen vaikuttavia lymfosyyttejä, joita sitten voidaan eristää ja muokata. Tämän takia onkin yritetty kehittää myös hoitomuotoa, jossa käytetään hy-väksi elimistön luonnollisia tappajasoluja. Tap-

543

pajasoluja saatiin muokattua siten, että ne tun-nistivat kasvaimesta peräisin olevia antigeenejä ja tuhosivat täten syöpäsoluja. Hoidolla saatiin aikaan rohkaisevia tuloksia. (Morgan 2006)

Vektorit

Koska vapaa DNA pilkkoutuu nukleaasientsyy-min vaikutuksesta, useimmiten geenihoitoon tarvitaan vektoria: kuljettajaa, joka vie hoitavan geenin kohdesoluihin. Ihanteellinen vektori veisi tarvittavan geneettisen materiaalin kohdesoluun reagoimatta muiden rakenteiden kanssa, näin mahdollistaen hoitogeenin parhaan mahdollisen ilmentämisen ilman toksisuutta. Vektorin valin-taan vaikuttaa kohdesolun lisäksi siirrettävän geeniaineksen koko sekä se, tehdäänkö siirto ke-hossa eli in vivo vai otetaanko potilaasta kohde-soluja, joihin geneettinen aines siirretään kehon ulkopuolella, ex vivo, ja jotka sitten siirretään takaisin potilaaseen. In vivo-siirrossa ongelma-na on mahdollinen immuunivaste vektorille tai vieraalle perintöainekselle, kun taas ex vivo-me-netelmässä kohdesolujen istuttaminen takaisin kehoon tuottaa vaikeuksia. (Patil ym, 2005; Kay ym, 1997)

Viraaliset vektoritEvoluution ansiosta virukset ovat kehittyneet ajan kuluessa erinomaisiksi perintöaineksen kul-jettajiksi, joiden luonnolliseen toimintaan kuuluu kaksi vaihetta: infektoiminen ja monistuminen. Infektointivaiheessa virus tarttuu spesifisesti so-pivaan isäntäsoluun ja siirtää perintöaineksensa osaksi tämän perimää, joko pysyvästi tai erillise-nä plasmidina. Monistusvaiheessa taas siirretty geneettinen aines aktivoituu, jolloin isäntäsolu alkaa tuottaa viruksen proteiineja, minkä jälkeen kootut uudet virukset vapautuvat infektoimaan uusia isäntäsoluja. Geeniterapiassa hyödynne-tään transduktiota, syklin ensimmäistä vaihetta ei-viraalisen geenin siirtämiseksi haluttuun koh-desoluun. Eri virusten ominaisuudet vektoreina vaihtelevat suuresti: esimerkiksi adeno-assosioi-dut virukset (Kuva 1) voivat kuljettaa vain noin 5 Kbp ei-viraalista DNA:ta ja integroida sen kohdesolun genomiin, kun taas herpesvirus voi kuljettaa jopa 50 Kbp vierasta DNA:ta, mutta sen siirtämä perintöaines jää soluun plasmidiksi. (Vanucci L ym. 2013)

Kuva 1. Adeno-assosioidun vektorin toiminta yk-sinkertaistettuna. Muuntogeeninen virus kiinnit-tyy (1) kohdesolun solukalvoon ja fagosytoituu. Virus kulkee endosomissa (2), kunnes pääsee siitä ulos (3) ja kulkeutuu tumaan, minne se va-pauttaa perintöaineksensa. Perintöaines kiinniit-tyy osaksi isäntäsolun genomia (4) ja solu aloittaa halutun proteiinin tuotannon.

Kesällä 2013 käynnissä olleista kliinisistä tutki-muksista noin 70 %:ssa vektorina toimii virus. Näistä käytetyimpiä ovat adenoviraaliset vekto-rit, jotka on tehty tavallisesti hengitystieinfek-tioita aiheuttavista adenoviruksista. Ne voivat kuljettaa 8 Kbp vierasta perintöainesta, joka ei liity osaksi kohdesolun perimää. Koska adenovi-rukset ovat hyvin yleisiä, useilla on tavallisimpia serotyyppejä vastaan vasta-aineita, minkä vuoksi adenoviraaliset vektorit pitää jalostaa harvinai-semmista serotyypeistä. Tämä rajoittaa myös an-nostelukertojen määrää, sillä immuunivaste näitä viruksia vastaan kehittyy nopeasti. (Vanucci L ym. 2013; John Wiley & Sons ltd, 2013)

Toiseksi yleisempiä ovat retroviraaliset vektorit, joissa geeni siirretään RNA:na, jonka kohdeso-lu kopioi DNA:ksi käänteiskopijoijaentsyymin avulla ja liittää perimäänsä. Tähän menee aikaa, joten retrovirusten kuljettamien geenien ilmen-tyminen on hieman hitaampaa kuin esimerkiksi adenoviruksilla, mutta vaikutus on pysyvä. Mui-ta tutkittavia viraalisia vektoreita ovat muun mu-assa adeno-assosioidut virukset, vaccinia-suvun virukset sekä rokkovirukset. (Vanucci L ym. 2013; John Wiley & Sons ltd, 2013)

Ei-viraaliset vektoritEi-viraalisten vektoreiden siirtoteho elimistös-sä on yleisesti ottaen pienempi kuin viraalisten, mutta ne eivät aiheuta immuunivastetta yhtä

544

herkästi. Suurimmassa osassa muuta kuin virus-vektoria käyttävissä kliinisissä geenilääketutki-muksista, noin 18 %:ssa kaikista tutkimuksista vuonna 2013, perintöaines siirretään kohdeso-luun plasmidina tai muuten vapaana DNA:na. Myös vapaata RNA:ta käytetään. Varsinaisia ei-viraalisia vektoreita on tutkimuksessa usei-ta erilaisia. Niiden tutkimus tarjoaa haastetta ja mahdollisuuksia innovaatioille, mutta on vielä alkuvaiheessa (John Wiley & Sons ltd, 2013; Zhang ym. 2012)

Eräs esimerkiksi syövän hoitoon suunniteltu kul-jetustapa on rakentaa negatiivisesti varautuneen nukleiinihapon ympärille kationinen lipidikal-vo, joka helpottaa sen siirtämistä soluun, mutta toisaalta lisää huomattavasti myös epäspesifisiä reaktioida solujen kanssa. Ongelma on ratkaistu esimerkiksi laittamalla syntyvän nanopartikkelin pintaan hydrofobisia polymeerejä kuten polye-tyyliglykolia (PEG). Tämä kuitenkin puolestaan häiritsee kuljettajavesikkelin kiinnittymistä so-luihin, joten niihin liitetään helposti muuttuvia sidoksia tai pH- tai muita reseptoreita, joiden ansiosta PEGylaatio hajoaa tavoittaessaan koh-desolun.Tällaisia vektoreita kutsutaan myös li-popolyplekseiksi. (Zhang ym. 2012)

Myös mekaanisia keinoja voidaan käyttää in vivo: ultraäänellä voidaan parantaa solukalvojen läpäisevyyttä, jolloin kohde-elimessä voidaan huomattavasti lisätä hoitavan perintöaineksen pääsyä soluun. (Negishi Y ym. 2010) Magneet-tien avulla ollaan onnistuttu lisäämään hoitogee-nin pääsyä soluun, kun se on pakattu lipopolyp-leksiin johon on liitetty magneettisia rautaoksi-dinanopartikkeleita.

Alipogeenitiparvoveekki

Alipogeenitiparvoveekki on kauppanimellä Gly-bera ensimmäinen EU:ssa markkinoille päässyt geenilääkevalmiste, jota käytetään familiaalisen lipoproteiinilipaasin puutoksen eli LPLD:n hoi-toon potilailla, joilla on ruokavalion rasvarajoi-tuksista huolimatta ilmennyt vakavia haimatu-

lehduksia. Siinä terve LPL-geeni on viety tyypin 1 adeno-assosioituun virukseen joka toimii luon-nollisesti lihassoluissa. Lääke annetaan yhdellä hoitokerralla useina pieninä injektioina potilaan alaraajojen lihaksiin, ja potilaan on käytettävä immunosupressiivista lääkitystä kolme päivää ennen hoitoa ja 12 viikkoa sen jälkeen. Koska LPLD on hyvin harvinainen sairaus, alipogeeni-tiparvoveekin kliininen näyttö perustuu pieneen, yhteensä 27 ihmisen aineistoon. Lääkkeen pitkä lupaprosessi saattaakin toimia ennakkotapaukse-na, nopeuttaen harvinaisiin sairauksiin tulevai-suudessa kehitettävien lääkkeiden hyväksymistä markkinoille. (Salmikangas, 2013; Ylä-Herttua-la, 2013)

Muut geeniterapialääkkeet

Vuonna 2003 Kiinassa hyväksyttiin ensimmäi-nen geeniterapialääke pään ja kaulan levyepi-teelikarsinooman hoitoon kauppanimellä Gen-dicine. Lääkkeessä adenoviraalinen vektori kul-jettaa p53-geenin syöpäsoluun, mikä saa aikaan solukuoleman. Kliinisissä kokeissa noin 66%:lla potilaista, jolla oli myöhäisvaiheen pään ja kau-lan levyepiteelikarsinooma, kasvaimet katosivat kokonaan. Myös Yhdysvalloissa on käynnissä vastaavanlaisia p53-geeniin perustuvia geenite-rapiahoitoja. (Patil S. ym. 2005)

Fomivirseeni (Yhdysvalloissa kauppanimellä Vitravene) on vuonna 1998 Yhdysvalloissa sy-tomegaloviruksen aiheuttamaa verkkokalvon tu-lehdusta hoitamaan kehitetty geeniterapialääke. Fomivirseeni on oligonukleotidi, jonka toimin-ta perustuu antisense-tekniikkaan. Yksijuostei-nen nukleiinihappo tarttuu viraaliseen lähetti-RNA:han ja näin ollen estää translaation. Hoitoa käytetään paikallisesti potilailla, joilla on AIDS, jos heillä muut hoidot eivät ole mahdollisia yh-teensopivuuden takia tai aiemmat hoidot eivät ole tehonneet. Euroopan lääkevirasto (EMEA) hyväksyi Fomivirseenin käytön 1999. (Vitravene Study Group 2002)

545

Taulukko 1. Eräitä muita myöhäisen vaiheen kliinisessä tutkimuksessa olevia DNA-pohjaisia lääkkeitä. Mukailtu Patil SD et al, 2005

Lääkeaine / Kehittävä yritys

Lääkkeen tyyppi Kehityksen vaihe Hoidettava sairaus

Vaikutus-mekanismi

Advexin / Introgen Therapeutics

Plasmidi Faasi III itsenäisesti tai 5-fluorourasiilin kanssa

Itsepintainen pään ja kaulan alueen levyepiteelikarsi-nooma

Adenovirus, p53-geenin aktivoituminen johtaa apoptoosiin

Affinitak / Isis Pharmaceuticals

Antisense oligonukleotidi

Faasi III karboplatiinin ja paklitakselin kanssa

Tason IIIb tai IV ei-pienisoluinen keuhkosyöpä

Proteiinikinaasi alfan ekspression inhiboiminen

Alicaforsen / Isis Pharmaceuticals

Antisense oligonukleotidi

Faasi III Crohnin tauti Solujen välisen adheesiomolekyy-lin 1 (ICAM-1) inhibiittori

Macugen / Eyetech and Pfizer

Aptameeri Faasi III fotodynaamisen terapian kanssa tai ilman

Ikään liittyvä keltatäplän solujen rappeuma

Verisuolen endoteelin kasvutekijän (VEGF) inhibiittori

Hoitojen ongelmat

Geeniterapialääkkeiden käyttö ei kuitenkaan ole ollut täysin ongelmatonta. Muun muassa ADA-geenin siirtämiseen käytetty gammaretroviraa-linen vektori, joka on tuotettu hiiren leukemia-viruksesta, on aiheuttanut potilaissa leukemian-kaltaisia häiriöitä. Tämä johtuu todennäköisesti retrovirusvektorin kiinnittymisestä proto-onko-geenin promoottorialueelle, mikä johtaa epä-tavalliseen transkriptioon. (Hacein-Bey-Abina ym. 2003)

Adenovirusvektori voi menettää tehokkuutensa, kun sitä säilötään pidempiä aikoja säilytysliu-oksessa. Niiden tehon on havaittu heikkenevän myös kudoksen vanhetessa. Adenovirusvektorit voivat aiheuttaa kudoksissa tulehduksia. Ret-roviraaliset vektorit ovat epävakautensa takia vaikeita valmistaa suuremmassa mittakaavassa ja sen takia tuotanto onkin kallista. (Patil S ym. 2005)

Myös muun muassa polymeereihin perustuvassa kuljetuksessa on havaittu ongelmia. Polymeeri-en molekyylimassan jakautumista on hyvin vai-kea säädellä, mikä saa aikaan vaihteluita hoidon vaikutuksissa. Lisäksi ne ovat kuljettajina melko tehottomia. Joidenkin polymeerien on havaittu myös aiheuttavan epätoivottuja haittavaikutuk-sia. Esimerkiksi biopolymeeri nimeltä kitosaani saa potilaassa aikaan hyperkolesterolemiaa. (Pa-til S ym. 2005)

546

Lähteet

Blaese M, Culver KW, Miller AD ym. T Lymphocyte-Directed Gene Therapy for ADA–SCID: Initial Trial Results After 4 Years. Science 1995; 270 (5235): 475–80

Hacein-Bey-Abina, Von Kalle C, Schmidt M ym. LMO2-Associated Clonal T Cell Proliferation in Two Patients after Gene Therapy for SCID-X1. Science 2003; 302 (5644): 415–419

John Wiley and Sons ltd. The Journal of Gene Medicine http://www.abedia.com/wiley/index.html Viitattu 12.09.2013

Kay MA, Liu D, Hoogerbrugge PM. Gene therapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 November 25; 94(24): 12744–12746

Morgan RA, Dudley ME ym. Cancer Regression in Patients After Transfer of Genetically Engineered Lymphocytes. Science 2006; 314 (5796): 126–129

Negishi Y, Omata D, Iijima H, Takabayashi Y, Suzuki K, Endo Y. et al. 2010. Enhanced laminin-derived peptide AG73-mediated liposomal gene transfer by bubble liposomes and ultrasound. Mol Pharm 7217–226.226.

Patil S, Rhodes DG, Burgess DJ. DNA-based Therapeutics and DNA Delivery Systems: A Comprehensive Review. The AAPS Journal 2005; 7 (1) artikkeli 9

Pawliuk R, Westerman KA, Fabry ME ym. Correction of sickle cell disease in transgenic mouse models by gene therapy. Science 2001; 294 (5550): 2368–2371

Salmikangas P. Alipogeenitiparvoveekki. Fimea 2013 http://sic.fimea.fi/1_2013/alipogeenitiparvoveekki Viitattu 12.09.2013

Tu K, Zheng X ym. Recombinant human adenovirus-p53 injection induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cell lines mediated by p53-Fbxw7 pathway, which controls c-Myc and cyclin E.PLoS One. 2013; 8(7): e68574

Vanucci L, Lai M, Chiuppesi F, Ceccherini-Nelli L, Pistello M. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology. New Microbiologica, 36, 1–22, 2013

Vitravene Study Group. A randomized controlled clinical trial of intravitreous fomivirsen for treatment of newly diagnosed peripheralcytomegalovirus retinitis in patients with AIDS. American Journal of Ophthalmology 2002 April;133(4):467–74

Wang C, Ding C, Kong M, Dong A, Qian J, Jiang D. et al. 2011. Tumor-targeting magnetic lipoplex delivery of short hairpin RNA suppresses IGF-1R overexpression of lung adenocarcinoma A549 cells in vitro and in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 2011 July 8;410(3):537–42

Ylä-Herttuala S. Geeniterapialääkkeet tekevät tuloaan. Lääketieteellinen Aikakauskirja Duodecim 2013;129(8):788–9

Zhang Y, Satterlee A, Huang L. In Vivo Gene Delivery by Nonviral Vectors: Overcoming Hurdles? Mol Ther. 2012 July; 20(7): 1298–1304.

547

E17 Y-kromosomi – sen pikkuruinen eroVaarala, Siina & Vehkalahti, RiikkaSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopiston17.9.2014Tarkastaja: Hanna Kokkonen

TiivistelmäY-kromosomin evoluutiota on määrittänyt tekijäinvaihdon estyminen varhaisten proto-sukupuolikromosomien välillä. Tämä, sekä tästä johtuva mutaatioiden kertymä, määräävät Y-kromosomin kehitystä vielä nykyäänkin. Y-kromosomi on jakautunut useisiin alueisiin, joilla on erilaisia rakenteellisia ja geneettisiä ominaisuuksia. Vain tietyt alueet kykenevät muille kromosomeille tyypilliseen tekijäinvaihtoon. Erilaiset muutokset Y-kromo-somissa voivat johtaa alueiden siirtymiseen tai katoamiseen, mistä voi seurata muun muassa lapsettomuutta. Nykylääketieteen avulla joitakin lapsettomuustapauksia voidaan kuitenkin jo hoitaa, mutta mikäli ongelman aiheuttaa esimerkiksi siittiöiden puutos, ovat hoitomahdollisuudet olemattomat.

JohdantoIhmisten sukupuoli määräytyy sukupuolikromo-somien X ja Y perusteella. XX-genotyyppinen yksilö on nainen ja XY-genotyyppinen mies. Y-kromosomin tekee mielenkiintoiseksi sen mie-hiin rajoittunut perinnöllisyys sekä sen lähes olematon kyky rekombinoida. Rekombinaatiolla tarkoitetaan tässä tapauksessa meioosissa vas-tinkromosomien välillä tapahtuvaa geenien tai niiden osien vaihtumista eli tekijäinvaihtoa.

Y-kromosomissa on muiden kromosomien ta-paan kaksi käsivartta, pidempi Yq ja lyhyempi Yp. Ihmisen Y kromosomin 78 geenistä mikään ei ole elintärkeä, sillä Y-kromosomin periyty-minen on rajoittanut vain miehiin. Emäspareja Y-kromosomissa on 60 miljoonaa. (Poongothai ym. 2009)

Y-kromosomi on kehittynyt useaan otteeseen evoluution aikana eri eliöryhmillä. Vallitsevan teorian mukaan X- ja Y-kromosomit ovat alku-jaan kehittyneet autosomiparista ja rekombinaa-tion puutos on johtanut niiden muotoutumista erillisiksi sukupuolikromosomeiksi.

Y-kromosomi vaikuttaa kivesten muodostu-miseen ja näin ollen testosteronin tuotantoon. Kromosomin poikkeavuudet voivatkin aiheuttaa muutoksia miehisiin ominaisuuksiin ja geneetti-siin tapahtumiin. Miesten lapsettomuustapauk-sista osa on Y-kromosomiperäisiä. Varsinaisia Y-kromosomisesti periytyviä sairauksia ei kui-tenkaan tunneta. (Kääriäinen H 2002)

Y-kromosomin evoluutioUseilla eukaryooteilla eli aitotumallisilla eliöil-lä sukupuoli määräytyy dimorfisten eli kahden-muotoisten sukupuolikromosomien perusteel-la. Kaikkien eukaryoottien Y-kromosomeilla ei kuitenkaan ole samaa yhteistä kantamuotoa, vaan Y-kromosomi on kehittynyt useita kertoja evoluution aikana (Charlesworth 2003). Nisäk-käiden Y kromosomeilla on keskenään yhte-näisiä piirteitä, mutta esimerkiksi nisäkkäiden ja lintujen sukupuolikromosomit eivät muistuta toisiaan. Linnuilla sukupuoli määräytyy ZZ/ZW-sukupuolikromosomien mukaan ja nisäkkäiden ja lintujen sukupuolenmääräytymismekanismit ovatkin eriytyneet toisistaan noin 300 miljoonaa vuotta sitten (Nanda ym. 2000).

Y ja X kromosomien eriytyminen

X- ja Y-kromosomien arvellaan kehittyneen eril-lisiksi ja keskenään erilaisiksi sukupuolikromo-someiksi noin 150 miljoona vuotta sitten (Veyru-nes ym. 2008). Y-kromosomin erilaistumisen se-litykseksi on tarjottu teoriaa, jossa toiseen alku-peräisesti samanlaisesta autosomiparin jäsenestä on siirtynyt miehistä kehitystä ohjaava geeni. Syntyviä erillisiä, tulevia sukupuolikromosome-ja, voi nimittää proto-sukupuolikromosomeiksi. Koska nisäkkäiden ja näin ollen myös ihmisten sukupuolikromosomit ovat keskenään erilaisia eli heteromorfisia, on seuraava vaihe niiden syn-typrosessissa ollut proto-sukupuolikromosomien välisen rekombinaation estyminen eli suppres-

548

sio. Rekombinaation suppressiota on voinut edistää esimerkiksi geenien järjestystä muutta-vat kromosomien osien kääntymät eli inversiot. (Bachtrog 2013)

Rekombinaation suppressiota ovat edistäneet myös sukupuoliset antagonistiset mutaatiot. Su-kupuolisilla antagonistisilla mutaatioilla tarkoi-tetaan mutaatioita, jotka ovat hyödyllisiä toiselle sukupuolelle, mutta haitallisia tai neutraaleja toi-selle. Antagonistiset mutaatiot perustuvat siihen, että miehet ja naiset tarjoavat alleeleille erilaisen ”ympäristön”, jolloin niihin kohdistuu erilainen valintapaine. Esimerkiksi jokin miehille hyö-dyllinen, mutta naisille neutraali tai haitallinen alleeli on ajan mittaan siirtynyt proto-Y-kromo-somiin, jossa se on ollut positiivisen valinnan kohteena ja on voinut säilyä evoluutiossa. An-tagonistisen mutaation säilymisen edellytyksenä onkin ollut sen siirtyminen siltä sukupuolelta löytyvään proto-sukupuolikromosomiin, jonka kelpoisuutta mutaatio parantaa. (Johnson ym. 2012)

Sukupuoliset antagonistiset mutaatiot ovat omal-ta osaltaan heikentäneet proto-sukupuolikro-mosomien välistä rekombinaatiota. Vähitellen rekombinaation estyminen proto-X- ja proto-Y-kromosomien välillä on johtanut kokonaan eril-listen sukupuolikromosomien syntyyn. (Bacht-rog 2013)

Evoluution mekanismit

Y-kromosomin evoluutioon vaikuttavista teki-jöistä merkittävimpiä on sen lähes täydellinen rekombinoimattomuus, sillä Y-kromosomista löytyy vain muutamia spesifisiä rekombinaati-oon kykeneviä alueita. Rekombinaation vähäi-syys aiheuttaa myös mutaatiokertymiä Y-kromo-somiin (Bachtrog 2013)

LuonnonvalintaTavallisesti luonnonvalinta pystyy karsimaan yksittäisiä heikkoja mutaatioita tai suosimaan yksittäisiä hyödyllisiä mutaatioita. Rekombinoi-mattomassa kromosomissa luonnonvalinta vai-kuttaa kuitenkin koko kromosomiin. Haitallisten mutaatioiden kertyessä koko kromosomi joutuu karsivan valinnan kohteeksi, vaikka se sisältäi-sikin joitain hyödyllisiä mutaatioita (Bachtrog 2013). Kyseessä on ilmiö, backround selection, jossa geneettinen monimuotoisuus neutraaleilla tai hyödyllisillä alueilla kromosomissa karsiutuu sinne kertyvien haitallisten mutaatioiden vuoksi (Wilson Sayres ym. 2014).

MutaatiotRekombinaation vähäisyys vaikuttaa suuresti Y-kromosomin mutaatiokertymiin. Y-kromosomiin kertyy erityisesti haitallisia mutaatioita, ja tätä il-miötä selittää muun muassa Mulletin räikkä -teo-ria ja genetic hitchhiking -malli (Bachtrog 2013).

Mulletin räikkä –teoria kuvaa tilannetta, jossa haitallisia mutaatioita kertyy ajan mittaan väis-tämättä suvuttomasti lisääntyviin populaatioihin. Teoriaa voidaan hyvin soveltaa myös Y-kromo-somiin, joka ei juurikaan rekombinoi. Tilantees-sa on alussa populaatio, joka ei sisällä haitallisia mutaatioita. Vähitellen syntyvistä mutaatioista useampi on haitallinen kuin hyödyllinen. Lopul-ta populaatiossa ei ole enää yhtään mutaatiotonta yksilöä, ja haitallisten mutaatioiden yleistyminen johtaa väistämättä populaation sukupuuttoon. Vastaavanlaista mutaatioiden kertymää tapahtuu myös Y-kromosomissa. X-kromosomissa tällais-ta ilmiötä ei esiinny, sillä siinä rekombinaatio pystyy säätelemään haitallisten mutaatioiden säilymistä.

549

Kuva 1: Mulletin räikkä –teoria selittää haitallisten mutaatioiden kertymistä Y-kromosomiin. Haitallisia mutaatioita on kuvassa merkitty tummilla palloilla. A.-kohdassa näkyy vertailun vuoksi X-kromosomin rekombinaation tuloksena mutaatiovapaa kromosomi. B.-kohdassa näkyy teorian mukaisesti Y-kro-mosomiin kertyvät mutaatiot, joita rekombinaatio ei pääse karsimaan. Mukaelma kuvasta artikkelissa Y chromosome evolution: emerging insights into processes of Y chromosome degeneration, Box 4. Bachtrog 2013

Hyödyllisten mutaatioiden periytyminen Y-kro-mosomeissa johtaa yleensä myös niihin linkitty-neiden haitallisten mutaatioiden periytymiseen. Tätä kuvaa genetic hitchhiking –malli. Haitalli-set mutaatiot ikään kuin ”liftaavat” (englanniksi hitchhike) hyödyllisten mutaatioiden mukana, mikä johtaa jälleen niiden kertymiseen Y-kro-mosomiin. (Bachtrog 2013)

Yleisesti ottaen mutaatiotaajuus on miehillä ha-vaittu hieman suuremmaksi kuin naisilla, johtuen todennäköisesti miesten spermatogeneesissä, eli siittiöiden kehityssarjassa, tapahtuvista lukuisis-ta mitoottisista jakautumisista. Naisilla oogenee-sissa, eli sukusolujen kehityksessä, jakautumisia on vähemmän (Wilson Sayres ym. 2011). Sper-matogeneesin suurempaan mutaatiotaajuuteen vaikuttavat myös voimakkaampi oksidatiivinen stressi ja heikommat DNA-korjausmekanismit kuin oogeneesissa (Johnson ym. 2012).

Y-kromosomin nykyinen rakenne ja ominaisuudetPienestä koostaan huolimatta Y-kromosomi ja-kautuu useisiin eri alueisiin. Arviolta 95% Y-kromosomin pituudesta on miehille ainutlaatuis-ta MSY-aluetta (male specific region of Y chro-mosome). Tätä aluetta reunustavat MSY-alueen ulkopuolelle jäävät pseudoautosomaaliset alueet, jotka löytyvät myös X-kromosomista. (Skalets-ky ym. 2003)

MSY-alue

Y-kromosomin male specific region eli MSY-alue ja sen sisältämät geenit saavat aikaan miessuku-puolen ilmentymisen. MSY-alue koostuu tiiviisti pakatusta heterokromatiinista sekä löyhästi pa-katusta eukromatiinista, joista jälkimmäisessä voi tapahtua transkriptiota eli RNA:n rakentu-mista DNA-ketjun mallin mukaan. Toiminnal-linen eukromatiinialue voidaan jakaa edelleen kolmeen eri osaan: X-transposed, X-degenerate sekä ampliconic-alue

550

Kuva 2: Ihmisen Y-kromosomin rakenne. Mukaelma kuvasta artikkelissa Y chromosome evolution: emerging insights into processes of Y chromosome degeneration, Box 1. Bachtrog 2013 sekä kuvasta http://phylogenous.files.wordpress.com/2010/07/msy-skaletsky-2003.png

(Skaletsky ym. 2003). X-transposed –alue, joka on ihmislajille ainutlaatuinen, on aikanaan siir-tynyt X-kromosomista, ja se sisältää vain kaksi geeniä. X-degenerate –alue sisältää 16 geeniä, joista suurin osa on eliöille välttämättömiä niin sanottuja taloudenpitogeenejä. Näitä vastaavat geenit löytyvät myös X-kromosomista. Alueen uskotaan olevan heikentynyt jäänne autosomis-ta, josta Y-kromosomi aikoinaan kehittyi. Laajal-la ampliconic-alueella on paljon toistojaksoja, ja se sisältää noin 60 geeniä yhdeksästä eri geeni-perheestä. Näiden geenien tiedetään koodaavan miehille ominaisia toimintoja. (Bachtrog 2013)

PAR-alueet ja rekombinaatio X- ja Y-kromosomien välillä

Miespuolisen yksilön meioosissa X- ja Y-kromo-somit pariutuvat autosomien tapaan. Niissä voi tapahtua tekijäinvaihduntaa kuitenkin vain Y-kromosomin käsivarsien distaalisimmissa päissä olevilla pseudoautosomaalisilla alueilta, PAR-alueilla. PAR-alueet ovat X- ja Y-kromosomien homologisia eli samasyntyisiä alueita, ja niitä on ihmisellä kaksi. PAR1 sijaitsee sukupuolikromo-somien lyhyiden käsivarsien, Yp, päissä, PAR2 taas pitkien käsivarsien, Yq, päissä. Ihmisen

pseudoautosomaalinen alue sisältää ainakin 29 geeniä, joilla on erilaisia tehtäviä liittyen muun muassa solusignalointiin ja mitokondriaalisiin toimintoihin. Rekombinaatiota voi tapahtua lä-hinnä vain PAR1-alueella, jossa sitä tapahtuu yleensä ainakin kerran meioosissa, joskus myös kahdesti. Teoriat PAR-alueen rekombinaatios-ta ovat kuitenkin edelleen puutteelliset. Auto-someissa rekombinaatio tapahtuu yleensä niin sanotuilla ”rekombinaatio hotspot” –alueilla. Tällainen alue löytyy myös PAR1 jaksosta, mut-ta se ei yksin selitä sitä, miten alue voi rekombi-noida kokoonsa nähden niin usein. Vastaus löy-tyy pseudoautosomaalisten alueiden biologiasta, jota ei tähän mennessä ole vielä täysin kyetty selvittämään. (Hinch ym. 2014)

Miesten infertiliteettiNoin 7 % miehistä kohtaa elämänsä aikana he-delmöittämiskykynsä heikkenemisen. Käsit-teellä atsoospermia tarkoitetaan sitä, ettei sie-mennesteessä ole mitattavia määriä siittiöitä. Tahattomaan hedelmättömyyteen on useita syitä. Syyt voivat olla synnynnäisiä, kuten laskeutu-mattomista kiveksistä johtuva hedelmättömyys, tai hankittuja, kuten kivesvammat ja siementie-

551

hyiden tukokset (Kaukoranta ym. 2012). Syn-nynnäisten syiden taustalla voi kuitenkin olla myös geneettinen tekijä. Tästä esimerkkinä on Klinefelterin syndrooma, jossa miehellä on yksi ylimääräinen X-kromosomi. Joidenkin lapsetto-muustapausten takana on kuitenkin yksinomaan Y-kromosomi. (Read ym. 2011)

Mikrodeleetiot ja rakenteelliset poikkeavuudet

Y-kromosomin pitkässä käsivarressa sijaitsee azoospermia factor –alue, eli AZF-alue. Tämä alue on välttämätön siittiöiden tuotannolle, ja se koostuu kolmesta osasta: AZFa, AZFb ja AZFc (Kaukoranta ym. 2012). AZF-osat sijaitsevat Y-kromosomin MSY-alueella, joka sisältää myös pitkiä toistojaksoja. MSY-alue ei rekombinoi toisten kromosomien kanssa, mutta alueen tois-tojaksojen sisällä tapahtuu usein erilaisia kromo-somimutaatioita, kuten deleetioita, kahdentumia ja kääntymiä (Lange ym. 2013). Kun deleetio ta-pahtuu AZF-alueella, on seurauksena usein sper-matogeneesin epäonnistuminen (Navarro-Costa ym. 2010). Suurin osa Y-kromosomin mikrode-leetioista on todettu sijaitsevan AZFc-alueella. Tällöin kiveksistä voi kuitenkin löytyä siittiöitä, ja mikroinjektoinnilla suoritettu hedelmöittämi-nen saattaa olla mahdollinen. Näin alkunsa saa-neilla lapsilla on kuitenkin todettu tavanomaista enemmän sukupuolikromosomihäiriöitä ja mie-histen sukuelinten epämuodostumia. Y-kromo-somin mikrodeleetio myös periytyy seuraavaan sukupolveen, joten lapsettomuus siirtyy infertii-lin miehen pojille. (Kaukoranta ym. 2012)

SRY-geenin rekombinaatio

Y-kromosomin lyhyen käsivarren kärkiosassa PAR-alueen ulkopuolella sijaitsee SRY-geeni (sex determining region of Y chromosome) (Nie-mi ym. 1994). Nisäkkäillä SRY-geeni saa aikaan alkion kehittymisen mieheksi mahdollistamal-la kivesten muodostumisen sikiön kehityksessä (Abusheikha ym. 2001). Vaikka geeni sijaitsee rekombinoivan PAR-alueen ulkopuolella, voi poikkeavan meioottisen tekijäinvaihdon seu-rauksena myös SRY-geeni siirtyä kromosomilta toiselle, minkä seurauksena syntyy XX-mies ja XY-nainen (Niemi ym. 1994).

XX-mies syndrooma on harvinainen lapsetto-muutta aiheuttava oireyhtymä. Fenotyyppien-sä eli ilmiasujensa perusteella XX-miehet on

jaettu kolmeen ryhmään. Näitä ovat normaalin fenotyypin omaavat miehet, monitulkinnalliset sukuelimet omaavat miehet sekä kaksineuvoi-set miehet. Fenotyyppien erot selittyvät ensi-sijaisesti sillä, sijaitseeko SRY-geeni X-kro-mosomiin siirtyneessä alueessa vai ei. Arviolta 10 % XX-miehiltä puuttuu SRY-geeni eli he ovat SRY-negatiivisia. Heillä on todettu olevan vaih-televammin miehisiä ominaisuuksia kuin SRY-positiivisilla miehillä. Kaikille XX-miehille on kuitenkin lähes poikkeuksetta yhteistä pienet kivekset, sekä atsoospermiasta aiheutuva lapset-tomuus (Wu ym. 2014). Kyseisen atsoospermian oletetaan johtuvan Y-kromosomissa sijaitsevan AZF-alueen puuttumisesta. AZF-alueen puut-tumisen vuoksi spermatogeneesi kiveksissä on epätodennäköinen, eikä XX-miesten lapsetto-muutta tämän vuoksi voida hoitaa esimerkiksi mikroinjektoinnilla, kuten mikrodeleetioissa. (Vorona ym. 2007)

Kuva 3: SRY-geenin siirtyminen tavanomaisesta poikkeavassa tekijäinvaihdossa. Mukaelma ku-vasta kirjassa: Solu- ja molekyylibiologia, 5.pai-nos 1994. Mikko Niemi, Ismo Virtanen, Eero Vuo-rio. s. 228 kuva 11.9

PohdintaY-kromosomin tulevaisuus on hieman kyseen-alainen, sillä Y-kromosomi on ollut suuren gee-nihäviön kohteena syntymästään lähtien, ja se onkin menettänyt suurimman osan alkuperäisistä geeneistään. Mikäli geenikato jatkuisi samalla tahdilla, voisi Y-kromosomi ”kuolla sukupuut-toon” jo viiden miljoonan vuoden kuluessa. Y-kromosomin tulevaisuudennäkymät eivät kui-tenkaan ole niin heikot kuin mitä voisi olettaa, sillä tutkimukset ovat osoittaneet että geenien

552

häviäminen Y-kromosomissa on hidastunut mer-kittävästi (Sun ym. 2012). Y-kromosomin tule-vaisuus onkin todennäköisesti tasapainottelua sen merkittävän sukupuoltamääräävän roolin ja evolutiivisten voimien välillä. Ehkä Y-kromo-somi selviääkin vielä pitkään, huolimatta sen heikosta geneettisestä muuntelusta. Voisimme-ko jossain vaiheessa päätyä tilanteeseen, jossa miespuoliset yksilöt kantavat raskaita mutaatioi-ta perimässään?

Olisi toisaalta mielenkiintoista nähdä, miten sukupuolen määräytyminen ja sen jälkeiset su-kupuolen kehitykseen liittyvät tapahtumasarjat saisivat alkunsa, jos Y-kromosomia ei enää oli-si. Miten paljon Y-kromosomi lopulta vaikuttaa miehisten ominaisuuksien syntyyn? Tässä ai-heessa on kiinnostavaa tarkastella SRY-negatii-visia XX-genotyyppisiä miehiä, joilta puuttuu nykytiedon mukaan tärkein miehisiä ominai-suuksia aikaansaava geenialue. Jos yksilö voi olla fenotyypiltään mies ilman Y-kromosomia tai SRY-geeniä, voitaisiinko nykylääketieteen keinoin käynnistää yksilön kehitys mieheksi il-man perittyä Y-kromosomia?

Lähteet

Abusheikha N, Lass A & Brinsden P. XX males without SRY gene and with infertility. Hum Reprod 2001; 16(4):717–8

Bachtrog D. Y chromosome evolution: emerging insights into processes of Y chromosome degeneration Nat Rev Genet 2013; 14(2): 113–124

Charlesworth B. The organization and evolution of the human Y chromosome. Genome Biol 2003; 4(9): 226 .

Hinch AG, Altemose N, Noor N, Donnelly P & Myers SR. Recombination in the human Pseudoautosomal region PAR1. PLOS Genetics 2014; 10(7)

Johnson N & Lachance J. The genetics of sex chromosomes: evolution and implications for hybrid incompatibility. Ann N Y Acad Sci 2012; 1256: E1–22

Kaukoranta S & Suikkari AM. Miehestä johtuva tahaton lapsettomuus. Suomen Lääkärilehti 2012; 67(26–31), 2065–2070 http://www.vaestoliitto.fi/@Bin/1826909/Miehest%C3%A4+johtuva+tahaton+lapsettomuus.pdf

Kääriäinen H. Monogeeninen periytyminen. Kirjassa: Aula P, Kääriäinen H & Leisti J, toim. Perinnöllisyyslääketiede. Helsinki: Kustannus Oy Duodecim, 2002, s. 121

Lange J, Noordam MJ, van Daalen SK, Skaletsky H, Clark BA, Macville MV, Page DC & Repping S. Intrachromosomal homologous recombination between inverted amplicons on opposing Y-chromosome arms. Genomics 2013; 102(4):257–64

Nanda I, Zend-Ajusch E, Shan Z, Grützner F, Schartl M, Burt DW, Koehler M, Fowler VM, Goodwin G, Schneider WJ, Mizuno S, Dechant G, Haaf T & Schmid M. Conserved synteny between the chicken Z sex chromosome and human chromosome 9 includes the male regulatory gene DMRT1: a comparative (re)view on avian sex determination. Cytogenet Cell Genet 2000;89(1–2):67–78

Navarro-Costa P, Gonçalves J & Plancha CE. The AZFc region of the Y chromosome: at the crossroads between genetic diversity and male infertility. Hum Reprod Update 2010; 16(5):525–42

Niemi M, Virtanen I & Vuorio E. Solu- ja molekyylibiologia. Porvoo: WSOY, 1994, s. 227–228

Poongothai J, Gopenath TS & Manonayaki S. Genetics of human male infertility. Singapore Med J 2009;50(4):336–47

Read A & Donnai D. New Clinical Genetics. 2nd Edition. Bandbury: Scion Publishing Limited, 2011, s. 371

Skaletsky H, Kuroda-Kawaguchi T, Minx PJ, Cordum HS, Hillier L, Brown LG, Repping S, Pyntikova T, Ali J, Bieri T, Chinwalla A, Delehaunty A, Delehaunty K, Du H, Fewell G, Fulton L, Fulton R, Graves T, Hou SF, Latrielle P, Leonard S, Mardis E, Maupin R, McPherson J, Miner T, Nash W, Nguyen C, Ozersky P, Pepin K, Rock S, Rohlfing T, Scott K, Schultz B, Strong C, Tin-Wollam A, Yang SP, Waterston RH, Wilson RK, Rozen S & Page DC. The male-specific region of the human Y chromosome is a mosaic of discrete sequence classes. Nature 2003; 423(6942):825–37

Sun S & Heitman J. Should Y stay or should Y: The evolution of non-recombining sex chromosomes. Bioessays 2012;34(11):938–942

Veyrunes F, Waters PD, Miethke P, Rens W, McMillan D, Alsop AE, Grützner F, Deakin JE, Whittington CM, Schatzkamer K, Kremitzki CL, Graves T, Ferguson-Smith MA, Warren W & Marshall Graves JA. Bird-like sex chromosomes of platypus imply recent origin of mammal sex chromosomes. Genome res 2008; 18(6):965–73

Vorona E, Zitzmann M, Gromoll J, Schüring AN & Nieschlag E. Clinical, Endocrinological, and Epigenetic Features of the 46,XX Male Syndrome, Compared with 47,XXY Klinefelter Patients. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2007; 92(9):3458–65

Wilson Sayres MA & Makova KD. Genome analyses substantiate male mutation bias in many species. Bioessays 2011; 33(12):938–45

Wilson Sayres MA, Lohmueller K & Nielsen R. Natural selection Reduced Diversity on Human Y Chromosome. PLoS Genet 2014; 10(1): e1004064

Wu QY, Li N, Li WW, Li TF, Zhang C, Cui YX, Xia XY & Zhai JS. Clinical, molecular and cytogenetic analysis of 46, XX testicular disorder of sex development with SRY-positive. BMC Urology 2014; 14(1):70

553

E18 NRF2-säätelytekijä syövässä – tarina siitä, miten hyvä on joskus pahaKoski-Vähälä Joni & Köykkä HannuSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto13.9.2013Tarkastaja: Sami Palomäki

TiivistelmäRadikaaleja sekä oksidantteja syntyy elimistössä jatkuvasti ja ne ovat elimistölle välttämättömia. Oksidatiivista stressiä saa elimistössä aikaan epätasapaino oksidatiivisten radikaalien tuottamisen sekä niiden hajoamisen välillä. Oksidatiivisesta tasapainosta vastaa antioksidanttijärjestelmä, jonka toimintakeinot radikaaleja ja ok-sidantteja vastaan ovat muodostumisen estäminen, eristäminen ja vaurion sattuessa korjaavat entsyymijärjes-telmät. Oksidatiivinen stressi on osallisena kaikissa syövän muodostumisen vaiheissa. Syöpä myös käyttää oksidantteja saadakseen ympäristöstään suurienergisia yhdisteitä. Antioksidanttijärjestelmän yksi tärkeä osa on Nrf2-säätelytekijällä, joka ohjaa antioksidanttijärjestelmään kuuluvien geenien aktivoitumista. Normaali-oloissa Nrf2 sitoutuu solulimassa Keap1-proteiiniin ja inaktivoituu proteosoimeissa. Kun solu altistuu stressil-le, Nrf2 irtoaa Keap1:stä ja siirtyy vakautuneessa muodossa tumaan, missä se aktivoi useita solusuojaukseen liittyviä geenejä. Nrf2 suojaa soluja mutaatioilta neutraloimalla hapettumisen ja haitallisten aineiden vaikutusta antioksidantti ja detoksifikaatioentsyymien synteesin avulla. Kehittyneiden syöpien yhteydessä Nrf2:n vaiku-tus on päinvastaisesti syöpäsolujen kasvua tukeva. Useat hoitomenetelmät perustuvat syöpäsolujen stressin kasvattamiseen Terveitä soluja vastaavalla tavalla Nrf2 suojaa syöpäsoluja stressiltä ja käytössä olevilta hoi-doilta. Useissa huonon ennusteen syöpäkudoksissa on mitattu normaalia korkeampia pitoisuuksia aktiivista Nrf2:ta. Jakautuvissa syöpäsoluissa Nrf2-säätelytekijä ohjaa solusuojauksen lisäksi glutamiinin ja glukoosin ohjaamista anabolisiin aineenvaihduntareaktioihin. Anabolisen aineenvaihdunnan kiihdyttäminen nopeuttaa syöpäkasvaimen kehitystä.

JohdantoElimistössä muodostuu jatkuvasti hapettavia yh-disteitä erilaisten aineenvaihdunnan reaktioiden seurauksena. Esimerkiksi happiradikaalit ovat voimakkaasti hapettavia molekyylejä, jotka ovat elintärkeitä elimistön reaktioille, mutta ylimäärin haitallisia. Tasapainon eli homeostasian ylläpi-tämiseksi solut tuottavat antioksidantteja, jotka suojaavat solun muita osia hapettumiselta hapet-tumalla itse. Nuclear factor E2-Related Factor 2 eli Nrf2-säätelytekijä on tärkeä antioksidanttien synteesiä ohjaava molekyyli, jonka vaikutus tu-massa on synteesiä aktivoiva. Antioksidanteil-la sekä Nrf2-säätelytekijällä on tärkeä merkitys DNA-ketjun suojaamisessa mutaatioilta, joiden seurauksena voi äärimmäisessä tapauksessa muo-dostua syöpäkasvain. Syöpäsoluissa Nrf2-sääte-lytekijän merkitys on syöpäkasvainten kehitystä edistävä, sillä se suojaa soluja hapettumiselta ja parantaa siten syöpäsolujen vastustuskykyä hoi-tomuotoja. Tässä esseessä käsittelemme Nrf2-säätelytekijän kytköksiä syövän kehittymiseen. (Fridovich 1978, Lau ym.2008, Wang 2008)

Oksidatiivinen stressiOksidatiivinen stressi syntyy epätasapainosta vapaiden radikaalien ja oksidanttien tuottamisen sekä molempien hajottamisen välillä. Oksidan-teilla tarkoitetaan reaktiivisia happiradikaaleja (lyhenteeltään ROS, reactive oxygen species), mikä tarkoittaa erittäin reaktiivisia hapesta muo-dostuneita yhdisteitä. Antioksidanttijärjestelmän tehtävä on poistaa oksidantit ja radikaalit elimis-töstä (Kuva 1.). Järjestelmän epätasapaino aihe-uttaa vahinkoa solutasolla, mikä voi johtaa eli-mistön laajempaan vaurioon (Durackova 2010). Vapaat radikaalit ovat tärkeitä elimistössä (Jabs 1999). Niitä syntyy normaalissa aineenvaihdun-nassa pääasiassa mitokondrion soluhengitykses-sä (Poyton ym. 2009). Soluissa molekulaarista happea pelkistetään, minkä tuloksena syntyy orgaanisia peroksideja ja superoksidianioneja ( ) sekä vetyperoksidimolekyylejä (H

2O

2)

(Fridovich 1978).

554

 

Kuva 1. Antioksidantti neutraloi vapaan radikaalin.

Kuva 2. Nrf2-säätelytekijän toiminta lepotilassa olevassa solussa.

Reaktiivisia typpiyhdisteitä voi myös syntyä, jos soluhengitys tapahtuu vähähappisessa tilas-sa (Poyton ym. 2009). Eniten soluille vahinkoa tuottava happiradikaali on hydroksyyliradikaali. Rakenteellisesti se on epävakaa, minkä takia se reagoi herkästi minkä tahansa solun osan kanssa (Valko ym. 2004).

Elimistön suojakeinot oksidatiivista stressiä vastaan

Pääasiallinen suojakeino happiradikaaleja vas-taan on niiden muodostumisen estäminen. Tähän on lukuisia eri keinoja, esimerkiksi entsyymien muodostaminen, jotka säätelevät reaktiivisten molekyylien määrää. Glutationi-S-transferaasi-ryhmä on yksi entsyymiryhmä. Toinen tapa suo-jella elimistöä vaurioilta on tuottaa radikaaleja sellaisessa solun osassa, jossa ne eivät pääse tuot-tamaan suurempaa vahinkoa. Tehokkaimmat an-tioksidantit yhdistävät edellä mainitut suojakei-not. Kaikkialla ympäristössämme on entsyyme-jä, jotka toimivat voimakkaina antioksidantteina. Esimerkiksi glutationiperoksidaasit, katalaasit, tioredoksiinit, peroksiredoksiinit ja superoksidi-dismutaasit kuuluvat tehokkaisiin antioksidant-teihin. Niiden lisäksi elimistössä on kapeammin erilaistuneita antioksidanttientsyymejä. Edellä mainitut suojakeinot eivät toimi täydellisesti ja siitä johtuen DNA vaurioituu jatkuvasti. Elimis-tössä on korjaavia entsyymijärjestelmiä, joiden tarkoitus on korjata muun muassa perimään tul-leet vauriot. (Sies 1997)

Oksidatiivisen stressin yhteys syöpään

Syöpä on moniosainen prosessi, joka koostuu initiaatiosta eli alkuun saattamisesta, promooti-osta eli edistymisestä ja progressiosta eli taudin etenemisestä. Oksidatiivinen stressi vaikuttaa jokaiseen näistä (Guyton ja Kensler 1993). Hap-piradikaalit muokkaavat solua riippuen niiden konsentraatiosta ja suhteellisesta määrästä an-tioksidantteihin nähden. Jos tasapaino pettää, kehittyy oksidatiivinen stressi, joka saa aikaan vaurioita ja muutoksia solunsisäisissä molekyy-leissä, kuten DNA:ssa, RNA:ssa, proteiineissa ja rasvoissa. Initiaatiovaiheessa happiradikaalit aiheuttavat DNA:han rakennemuutoksia ja mu-taatioita. Promootiovaiheessa ROS:t aiheuttavat geenien epänormaalia ilmentymistä ja estävät kommunikaatiota solujen välillä. Seurauksena voi olla apoptoosin eli suunnitellun solukuole-man estyminen tai solujen määrän kasvu. Prog-ressiovaiheessakin oksidatiivinen stressi voi edistää syövän kasvua aiheuttamalla lisää DNA-muutoksia (Sosa ym. 2013).

Syöpäsolut käyttävät oksidatiivista stressiä myös hyväkseen erittämällä peroksidia ympärillä ole-viin sidekudoksen soluihin. Tämä ilmiö on osa käänteistä Warburgin efektiä, jonka on todettu olevan tärkeä osa syövän energia-aineenvaih-duntaa. Peroksidin vaikutuksesta syöpäsoluja ympäröivän terveen sidekudoksen solut alkavat tuhota omia soluorganelleja. Mitokondrioiden tuhoutuessa sidekudoksen solujen aineenvaih-dunta painottuu pelkäksi aerobiseksi glykolyy-siksi. Tästä johtuen soluissa syntyy suuriener-gisiä yhdisteitä kuten laktaatteja, pyruvaatteja sekä ketoneja, joita sidekudoksen solut eivät voi hyödyntää ilman mitokondrioita. Solut erittävät yhdisteitä ekstrasellulaaritilaan eli solun ulko-puolelle. Syöpäsolut ottavat nämä energiayhdis-teet käyttöönsä kuljettimien avulla ja tuottavat niistä ATP:tä suuria määriä. Käänteisen Warbur-gin efektin tuoma tieto on mahdollistanut uusien hoitomenetelmien kehittämisen syöpää vastaan. Neutraloimalla syöpäsolujen erittämää peroksi-dia antioksidanteilla ekstrasellulaaritilassa este-tään oksidatiivisen stressin syntyminen sideku-dossoluissa. Tämän seurauksena syöpäsolut ei-vät saa energia-aineenvaihduntaansa tarvittavaa lisäenergiaa ja nääntyvät. (Martinez-Outschoorn ym. 2011)

555

Nrf2 –säätelytekijäSäätelytekijä on aktiivisesti toimiva proteii-ni, jonka tehtävänä on ohjata transkriptiota eli DNA:n geenin kopiointia lähetti-RNA:ksi. So-lussa muodostuu transkription seurauksena ami-nohapoista geenin koodaamaa proteiinia, jonka pitoisuutena säätelytekijän vaikutus ilmentyy. Nrf2 -säätelytekijä toimii vapaassa muodossaan aktivoivana tekijänä antioksidantti- ja detoksi-fikaatioentsyymien muodostumiselle (Kuva 2.). Kyseiset entsyymit ja antioksidantit muodosta-vat tärkeän osan solun suojautumista sisäistä ja ulkopuolista stressiä vastaan. Nrf2:n aktiivisuut-ta säätelee siihen inhiboivasti sitoutuva proteiini, Kelch-like ECH-associated protein 1(Keap1). Lepotilassa olevan solun altistuessa oksidatiivi-selle stressille Nrf2:n ja Keap1:n muodostama moduuli hajoaa ja vapautunut Nrf2 pääsee kul-keutumaan solulimasta tumaan, jossa se aktivoi säätelemiään geenejä. (Mitsuishi Y ym. 2012, Lau ym. 2008)

Kuva 2. Nrf2-säätelytekijän toiminta lepotilassa olevassa solussa.

Nrf2 syövän ehkäisijänä

Solujen altistuminen karsinogeeneille eli syöpää aiheuttaville aineille aiheuttaa mutaatioita solun perimään ja voi johtaa solujen hallitsemattomaan jakautumiseen eli kasvaimen syntyyn. Soluis-sa syntyvä vastareaktio karsinogeeneja, kuten myrkkyjä ja oksidantteja vastaan, perustuu anti-oksidantteihin ja myrkkyjä neutraloiviin detoksi-fikaatioentsyymeihin, joita Nrf2 puolestaan sää-telee. Tutkimuksissa onkin huomattu Nrf2:n ole-van merkittävässä yhteydessä solujen puolustau-tumiseen syövän kehittymistä vastaan. Yleisesti Nrf2:ta on pidetty ”hyvänä” proteiinina, joka suojaa elimistöä karsinogeenien aiheuttamilta vaurioilta. Useiden ravinnon terveyttä edistävien komponenttejen on todettu toimivan aktivoimal-la Nrf2-polkua (Hayes ym. 2010, Lau ym. 2008). Hiirikokeissa Nrf2-poistogeenisten yksilöiden alttius syövälle on huomattavasti vertailukantaa suurempi. Toisaalta Keap1-poistogeeniset kan-noilla, joiden soluissa Keap1 ei inhiboi Nrf2:ta on lisääntynyt vastustuskyky keuhkoissa sijait-seviin etäpesäkkeisiin. Nrf2:n rooli soluissa ei kuitenkaan ole näin yksinkertainen (Khor ym. 2010, Satoh ym. 2010).

Nrf2 syövän edistäjänä

Vastakohtaisesti on huomattu Nrf2:n auttavan syöpäsoluja selviytymään elimistön puolustus-keinoja vastaan. Voimakkaasti jakautuvien solu-jen, kuten syöpäsolujen, aineenvaihdunta on no-peaa ja tästä seuraa, että solut altistuvat runsaam-malle aineenvaihdunnan aiheuttamalle oksidatii-viselle stressille (Kuva 3.). Keap1:n mahdollinen inaktivoituminen mutaation seurauksena johtaa korkeaan Nrf2-pitoisuuteen, mikä parantaa solu-jen suojaa stressitekijöitä vastaan kiihdyttämäl-lä detoksifikaatioentsyymien ja antioksidanttien tuottamista. Jakautuvissa soluissa Nrf2 vaikuttaa solusuojauksen lisäksi myös aineenvaihduntaan aktivoimalla geenejä, jotka uudelleen ohjaavat glukoosia ja glutamiinia anabolisiin eli raken-taviin reaktioketjuihin. Syöpäsolujen jakautu-minen ja kasvaminen tapahtuu tehokkaammin kyseisten geenien aktivoiduttua. (Lau ym. 2008, Wang ym.2008, Mitsuishi 2012)

556

     

Kuva 3. Nrf2:n toiminta jakautuvassa solussa. Kuva 3. Nrf2:n toiminta jakautuvassa solussa.

YhteenvetoNrf2-säätelytekijän aktivoitumisen on todettu olevan yhteydessä syöpäsolujen kykyyn kestää hoidossa käytettyä kemoterapiaa. Yksi mahdolli-nen kemoresistenssejen syöpien hoitomenetelmä voisi olla yhdistelmähoito, jossa kemoterapiaan yhdistettäisiin syöpäsolujen altistumista tehosta-va Nrf2-inhibiittori Nrf2-säätelytekijän merkitys soluissa on siis kaksijakoinen. Tutkimukset ovat keskittyneet pitkään löytämään Nrf2-aktivaat-toreita solusuojauksen parantamiseksi. Uudet löydökset kuitenkin osoittavat, että yliesiintyvä Nrf2 toimii myös syöpäsolujen suojaajana, mikä johtaa syövän kemoterapiaresistenssiin. Ky-seisen proteiinin rooli solussa on mahdollisesti riippuvainen syöpäkasvaimen kehitysvaiheesta. Ei myöskään tiedetä nostaako korkea Nrf2-pitoi-suus itsessään riskiä syöpäkasvaimen kehittymi-seen. (Lau ym. 2008, Wang ym.2008, Mitsuishi 2012)

Lähteet

Durackova Z. Some current insights into oxidative stress. Physiol Res 2010; 59: 459–69

Fridovich I. The biology of oxygen radicals. Science 1978; 201: 875–880

Guyton KZ, Kensler TW. Oxidative mechanism in carcinogenesis. Br Med Bull 1993; 49: 523–544

Hayes, J. D., McMahon, M., Chowdhry, S. & Dinkova-Kostova, A. T. Cancer chemoprevention mechanisms mediated through the Keap1–Nrf2 pathway. Antioxid. Redox Signal. 2010;13: s.1713–1748

Jabs T. Reactive oxygen intermediates as mediators of programmed cell death in plants and animals. Biochem Pharmacol 1999; 57: 231–245.

Khor, T. O. et al. Increased susceptibility of Nrf2 knockout mice to colitis-associated colorectal cancer. Cancer Prev. Res. 1, 187–191 (2008)Redox Signal. 2010; 13: 1713–1748

Lau A, Villeneuve N, Sun Z. Dual Roles of Nrf2 in Cancer. Pharmacol Res. 2008; 58(5–6): 262–270

Martinez-Outschoorn UE, Lin Z, Trimmer C, Flomenberg N, Wang C, Pavlides S, Pestell RG, Howell A, Sotgia F, Lisanti MP. Cancer cells metabolically “fertilize” the tumor microenvironment with hydrogen peroxide, driving the Warburg effect: implications for PET imaging of human tumors. Cell Cycle, 2011 Aug 1;10(15):2504–20. Epub 2011 Aug 1

Mitsuishi Y,Motohashi H, Yamamoto M. The Keap1–Nrf2 system in cancers: stress response and anabolic metabolism. Front Oncol. 2012; 2: 200.

Mitsuishi Y, Taguchi K, Kawatani Y. Nrf2 Redirects Glucose and Glutamine into Anabolic Pathways in Metabolic Reprogramming. Cancer Cell 2012; 1: 66–79

Satoh, H. et al. Nrf2-deficiency creates a responsive microenvironment for metastasis to the lung. Carcinogenesis 2010; 31: 1833–1843

Sies H. Oxidative tress: oxidants and antioxidants. Exp Physiol 1997; 82: 291–5

Sosa V, Moliné T, Somoza R, Paciucci R, Kondoh H, Leonart M. Oxidative stress and cancer: An overview. Ageing Research Reviews, January 2013; 376–390

Valko M, Izakovic M, Rhodes CJ, Telser J. Role of oxygen radicals in DNA damage and cancer incidence. Mol Cell Biochem 2004; 266: 37–56

Wang XJ, Sun Z, Villeneuve NF, Zhang S, Zhao F, Li Y. Nrf2 enhances resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs, the dark side of Nrf2.Carcinogenesis. 2008 Jun; 29(6):1235–1243

557

E19 Mestarinaamioitujat – EBOLA ja HIVRukajärvi Asta & Paavola Saara-SofiaSolu- ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto17.9.2014Tarkastaja: Sami Palomäki

TiivistelmäEbola ja HIV ovat molemmat RNA-viruksia, jotka pystyvät infektoimaan elimistön immuunipuolustusjärjes-telmän soluja. Molemmat ovat haasteellisia ihmiskunnalle, koska ne ovat mestarinaamioitujia immuunipuolus-tukselta. Näitä vastaan on haasteellista kehittää rokotteita, eikä siinä olla vielä onnistuttu.

Ebola estää elimistön interferonijärjestelmän toimintaa tuottamiensa proteiinien välityksellä. Immuunivaste heikkenee huomattavasti Ebolan käyttäessä isäntäsolunaan immuunipuolustuksen dendriittisoluja ja makrofa-geja. Lisäksi Ebola saa aikaan myös muiden immuunijärjestelmän solujen tuhoutumista.

HI-virus muuntelee erittäin nopeasti ja estää näin immuunivasteen kehittymistä sitä vastaan. Se voi jäädä inak-tiivisena piileksimään solun sisälle ja aktivoitua myöhemmin. HIV vaikeuttaa MHC-kudostyyppiproteiinien toimintaa erittämänsä Nef-proteiinien välityksellä, jolloin immuunipuolustus ei pysty tunnistamaan viruksen infektoimaa solua. HIV tuhoaa auttaja-T-soluja, makrofageja ja dendriittisoluja käyttäessään niitä isäntänään. Lisäksi se tappaa myös sivullisia immuunijärjetelmän soluja.

JohdantoHIV ja etenkin Ebola ovat erittäin ajankohtaisia aiheita ja ovat herättäneet paljon keskustelua mediassa viime aikoina. Maailman terveysjär-jestön syyskuun 4. päivän raportin mukaan tällä hetkellä käynnissä olevaan Ebola-epidemiaan oli sairastunut 3685 ja kuollut 1841 elokuun 2014 loppuun mennessä. (World Health Organizati-on 2014). HIV-infektio johtaa lopulta AIDS:iin, johon kuoli vuonna 2011 1,7 miljoonaa ihmistä. (Laine et al. 2013)

Esseessämme käsittelemme aluksi yleisesti vi-ruksia ja sen jälkeen erikseen Ebolan ja HIV:n perusrakenteita, virusten elämänkiertoja ja piilou-tumismekanismeja immuunipuolustusta vastaan. Lopussa vertailemme vielä näitä kahta mestari-naamioitujaa.

Yleistä viruksista

Virusten luokittelu ja toiminta

Virukset ovat parasiittejä, jotka ovat erilaistues-saan menettäneet lisääntymiseen tarvittavan lait-teiston ja ovat siten riippuvaisia isäntäsolustaan. Viruksissa on joko DNA:ta tai RNA:ta geneettise-nä materiaalina, yksi- tai kaksijuosteisena. Tietty

virus voi käyttää vain joitakin solutyyppejä isäntä-nään. Tämän perusteella virukset luokitellaan bak-teriofageihin, sekä eläin- ja kasviviruksiksi. Jotkut virukset voivat käyttää vain eliön tiettyjä soluja isäntänään, esimerkiksi HI-virus vain eräitä lym-fosyyttejä. Virusten toiminta voidaan jakaa vaihei-siin: isäntäsolun tunnistaminen ja sen solukalvon reseptoriproteiineihin kiinnittyminen, tunkeutumi-nen isäntäsoluun, uusien virusten tuotto ja uusien virusten vapautuminen solusta. Tämän syklin päät-teeksi vapautuu paljon uusia viruksia ja isäntäsolu yleensä kuolee. Joidenkin virusten perintöaines voi asettua osaksi solun kromosomien DNA:ta. Solun jakautuessa myös viruksen perintöaines monistuu. Tämä kopioitunut perintöaines voi aktivoitua tuot-tamaan uusia viruksia tai aiheuttaa solun muuttu-misen syöpäsoluksi. (Niemi et al. 1993)

Immuunivaste

Virukset tunkeutuvat suhteellisen helposti lima-kalvojen puolustuksen läpi ja leviävät elimistössä veren tai imujärjestelmän mukana tai suoraan so-lusta toiseen. Virustaudin patogeneesiin vaikuttaa viruksen ominaisuudet, kuten tartuntareitti, koh-de-elin ja taudinaiheuttamiskyky, sekä isännän ominaisuudet. Taudin oireet johtuvat sekä virus-ten lisääntymisestä että virusten käynnistämästä immuunivasteesta. (Hedman et al. 2010)

558

EBOLA

Yleistä ebolasta

Ebola-virukset ovat filoviruksiin luokiteltavia negatiivisäikeisiä RNA-viruksia. Tästä RNA:sta voidaan muodostaa 7 rakenneproteiinia. Ebola-virus ja toinen filovirus, Marburg-virus muistut-tavat rakenteeltaan hyvin paljon toisiaan, mutta niiden genetiikka ja vasta-ainereaktiot ovat poik-

keavia. Ne molemmat aiheuttavat ihmiselle tap-pavaa verenvuotokuumetta. Koska filovirusten vaippaproteiinit ovat runsaasti glykosyloituneet ja niiden solupinnalla on lektiinejä, ne voivat in-fektoida useita eri soluja, etenkin dendriittisoluja ja makrofageja. Lisäksi filovirukset aiheuttavat häiriöitä veren hyytymisessä ja lisäävät verisuo-nien endoteelien läpäisevyyttä, josta myös filo-virusinfektiolle tyypilliset verenvuodot johtuvat. (Hedman et al. 2010)

Kuva 1. Ebola-viruksen RNA:n koodaamat proteiinit. (mukailtu: Cook et al. 2013)

Tunkeutuminen isäntäsoluun Ebola-virus käyttää pääasiassa makropinosytoo-sia tai vaihtoehtoisesti klatriinivälitteistä endo-sytoosia tunkeutuessaan isäntäsoluun. (Aleksan-drowicz et al. 2011) Endosytoosin jälkeen isän-täsolun solukalvosta viruksen ympärille kurou-tunut rakkula ja viruksen pintakalvo fuusioituvat ja virus vapauttaa perintöaineksensa isäntäsolun sytoplasmaan. Isäntä solu alkaa tuottaa viruksen proteiineja, joita Ebola- viruksen genomi sisältää (7kpl): NP (nucleon protein), VP35 (virion pro-tein), VP40, GP (glyckoprotein), VP30, VP24 sekä RNA-polymeraasi. Näistä VP24 ja VP35 pystyvät estämään interferonijärjestelmän toi-mintaa. (Dolnik et al. 2007)

Ebola-viruksen halkaisija on noin 80nm ja pituus voi vaihdella jopa 600nm-1400nm välillä. Isän-täsoluun tunkeutumistapa riippuu itse viruksen koosta sekä isäntäsolun tyypistä. Ebola-virukset voivat siis olla hyvinkin kookkaita, joten siksi se käyttää useimmiten makropinosytoosia tun-keutuessaan isäntäsoluun. Pieni osa viruksista voi päästä solun sisään myös klatriinivälitteisen endosytoosin välityksellä. Useat solutyypit ovat alttiita Ebola-virusinfektiolle, mutta imusolut ovat vastustuskykyisiä. Esimerkiksi makrofagei-hin, monosyytteihin, dendriittisoluihin ja hepato-syytteihin EBOV pääsee tunkeutumaan helposti. (Aleksandrowicz et al. 2011)

Kuva 2. Ebola-viruksen tunkeutuminen isän-täsoluun. Viruksen solukalvo fuusioituu isän-täsolun solukalvosta peräisin olevan rakkulan kanssa ja virus vapauttaa RNA:nsa solulimaan. (mukailtu: Kawaoka 2005)

Ebolan vaikutukset kohdesolussa

ZEBOV (Zaire species of ebola virus) infektoi makrofageja ja dendriittisoluja, joiden tehtä-vä on mm. esitellä antigeenejä lymfosyyteille. Infektio heikentää molempien kohdesolujensa toimintaa, siten että kohdesolut eivät pysty estä-mään viruksen leviämistä, mutta ne käynnistävät silti tulehdusreaktion. Tämä houkuttelee paikalle lisää dendriittisoluja ja makrofageja. Viruksen replikaatio saa aikaan nekroosin kohdesolussa. Natural killer solut ja lymfosyytit eivät infek-toidu, mutta niissäkin aiheutuu apoptoosia ebo-lan seurauksena. Immuunipuolustus heikkenee dramaattisesti, kuten HIV infektiossakin.(Bray et al. 2005)

559

Ebolan piiloutuminen elimistön immuunipuolustusjärjestelmältä

Ebola-virus pystyy estämään interferonijärjestel-män toimintaa. Tärkeässä roolissa tässä toimivat viruksen proteiinit VP35 ja VP24. Viruksen in-fektoimat solut eivät pysty tuottamaan tarpeeksi tiettyjä interferoneja tai vastaamaan toisten so-lujen interferonien tuottoon. VP35 estää inter-feronien tuotantoa ja VP24 puolestaan toisten solujen tuottamien interferonien aiheuttamaa vastetta solussa. Tämä heikentää immuunivastet-ta huomattavasti, sillä tyypin I ja II interferonit normaalisti aktivoisivat MHC-proteiineja (ma-jor histocompatibility complex), Natural Killer-soluja, makrofageja ja dendriittisoluja. (Bray et al. 2005)

Vaikka Ebola-virus ei lisäännykkään imusoluis-sa, se saa silti aikaan niiden tuhoutumista. Niiden apoptoosi alkaa jo varhaisessa vaiheessa infek-tiota. Tähän voi olla syynä heikentynyt dendriit-tisolujen toiminta ja tartunnan saaneiden makro-fagien välittämät sytokiinit. Imusolut vastaavat hankitusta immuniteetista. (Bray et al. 2005, Peters et al. 2005)

Epitoopin (antigeenin vaikuttavan osan) naami-oiminen on virusten yleinen tapa piiloutua im-muunipuolustukselta. Ebola-viruksen pinnalla on runsaasti oligosakkarideja, mikä vaikeuttaa vasta-aineiden toimintaa virusta vastaan. Myös reseptoriin kiinnittymiskohta jää tämän glykaa-nikerroksen alle suojaan. Ebola-viruksen pinnan GP ohjaa immuunipuolustuksen tuottamaan vas-ta-aineita tarpeettomia alueita vastaan. (Cook et al. 2013)

HIV

Yleistä HIV:stä

HIV-1 ja HIV-2 (The human immunodeficiency virus) ovat lentivirusten ryhmään kuuluvia ret-roviruksia, joilla on kaksi positiivista yksijuos-teista RNA-juostetta. HI-virukset käyttävät isän-täsolunaan immuunijärjestelmän soluja ja tuho-avat niitä lisääntyessään. Tämä johtaa lopulta immuunikatoon eli AIDS:iin. HIV-1:llä ja HIV-2:lla on yhteinen esivirus, josta molemmat ovat periytyneet. HIV-2:n patogeenisyys ja tarttuvuus ovat kuitenkin vähäisemmät kuin HIV-1:n. Mo-lempien virustyyppien patogeneesi on hidasta. (Requejo 2006)

Kuva 3. HI-viruksen rakenne. Kuvassa näkyvät kaksi positiivista yksijuosteista RNA-juostetta.

HI-viruksen solusykli

HIV on vaipallinen virus, jonka vaipassa olevat proteiinit ovat keskeisessä roolissa viruksen pää-syssä isäntäsolun sisään. HI-viruksen vaipassa oleva gp-120 proteiini pystyy sitoutumaan eri-tyisesti auttaja-T-solujen, makrofagien ja dend-riittisten solujen pinnalla esiintyvään CD4- re-septorimolekyyliin. (Chan et al, 1998, Dumas et al. 2014)

CD4:n rooli on keskeinen, mutta myös eräät muut solun pinnan proteiinit ja glykolipidit voi-vat auttaa HIV:n tarttumista kohdesoluun. HIV tarvitsee myös fuusioreseptorin päästäkseen so-luun, näitä ovat esimerkiksi CCR5 ja CXCR4. Sitoutuminen fuusioreseptoriin aiheuttaa konfor-maatio muutoksia gp-120 proteiinissa, joka va-pauttaa gp-41 proteiinia. Gp-41 proteiini auttaa viruksen fuusiotumaan isäntäsoluun. Viruksen ydin vapautuu isäntäsolun sytoplasmiseen tilaan. (Chan et al. 1998, Dumas et al. 2014.)

Isäntäsolun sytoplasmassa viruksen mukana tul-lut käänteiskopioijaentsyymi kääntää viruksen genomisen RNA:n kaksijuosteiseksi komple-menttaariseksi DNA:ksi. Virus DNA sirkulari-soituu renkaaksi ja muodostaa preintegraatio-kompleksin isäntäsolun, sekä viruksen omien proteiinien kanssa. Tämä kompleksi siirtyy isän-täsolun tumaan aktiivisella kuljetuksella. Virus genomin siirtyminen tumaan ei siis ole riippu-vainen tuman mitoosissa tapahtuvasta tumakal-von hajoamisesta. Viruksen DNA genomi liittyy

560

sattumanvaraiseen kohtaan isäntäsolun genomia ja käyttäytyy isäntäsolun oman geenin tavoin. Kuitenkin vain osa virus DNA:sta integroituu isäntäsolun tumaan ja huomattava osa viruksen DNA:sta jää vapaaksi sytoplasmaan. Viruksen

DNA:ta monistetaan isäntäsolun lähetti-RNA koneistolla. Uudet HIV-virukset kootaan isäntä-solun solukalvolla ja eritetään ulos solusta ekso-sytoosilla. (Zheng et al. 2005, Shehu-Xhilaga et al. 2003)

Kuva 4. HI-viruksen solusykli. (mukailtu: Hedman et al. 2010)

HI-virus estää immuunipuolustusta toimimasta

HIV infektoi päivittäin miljardeja uusia solu-ja. Jokaiseen infektioon kuuluu RNA:n kään-teiskopiointi, joka on erittäin altis virheille. HI-virukselta puuttuu korjausmekanismit näitä virheitä vastaan. Tämä antaa HIV:lle valtavan muuntelun, jolle aiemmin syntynyt immuunivas-te ei tehoa. Tästä johtuu vaikeus kehittää lääke HIV:ä vastaan. Yhden ainoan aminohapon muut-tuminen voi riittää hävittämään antigeenin tai aiheuttamaan resistenssin lääkkeelle. Valtavasta mutaatioiden määrästä on myös haittaa HIV:lle itselleen, sillä osa mutaatioista aiheuttaa raken-teellisia ja toiminnallisia muunnoksia, jotka ovat tuhoisia. (Requejo 2006, Simon et al. 2006)

HIV genomi voi liittyä isäntäsolun DNA:ssa sellaiseen kohtaan, jossa transkriptio ei ole ak-tiivinen tai isäntäsolu voi olla lepotilassa, jolloin siinä toimivat vain ylläpitogeenit. Tällöin virus genomi ei heti aktivoidu, vaan jää piiloon solun sisälle. Ulkoinen tekijä voi kuitenkin myöhem-min aktivoida solun ja tällöin myös virus genomi aktivoituu.

Normaalisti immuunijärjestelmä tunnistaa ja tu-hoaa virukselle infektoituneet solut. Tällainen solu erittää solukalvon pinnalla oleville kudos-tyyppiproteiineille, esimerkiksi MHC-proteii-neille (major histocombatibility complex) osia tuottamistaan virusproteiineista. Tämä mahdol-listaa immuunijärjestelmän tunnistamaan ja tu-hoamaan viruksen infektoimat solut. HIV erittää Nef-proteiinia, joka estää tuotettujen virusprote-iinien siirron solukalvon läpi ja kiinnittymisen MHC-proteiiniin. Lisäksi Nef lisää MHC-prote-iinien endosytoosia solun sisään. (Peterlin et al. 2003)

HIV tuhoaa soluja, joissa lisääntyy, sekä myös sivullisia immuunijärjestelmän soluja mm. lym-fosyyttejä ja makrofageja. Näiden tuhoutumi-nen heikentää immuunipuolustusta ja näin ollen myös elimistön puolustautumista HIV:ta vas-taan. (Peterlin et al. 2003)

561

YhteenvetoEbola ja HIV ovat molemmat kehittäneet itsel-leen monia mekanismeja, joilla piiloutua im-muunipuolustukselta. Molemmat ovat RNA-viruksia, joille kuuluu genomin käänteiskopionti osana solusykliä. Tämän vuoksi ne molemmat muuntelevat paljon ja niistä on olemassa useita erilaisia kantoja. Molempien virusten genomi koodaa proteiineja, jotka estävät immuunipuo-lustuksen toimintaa. Kummatkin virukset käyt-tävät isäntäsolunaan immuunipuolustujärjes-telmän soluja tuhoten niitä. Lisäksi molemmat tuhoavat myös infektoitumattomia immuunipu-lustuksen soluja. Näin elimistön puolustuskyky vähenee dramaattisesti, joka vaikeuttaa viruksen tuhoamista entisestään.

Näin sitkeiden virusten olemassa olo hämmäs-tyttää ja tuntuu suorastaan ihmeeltä, että niitä vastaan on pystytty kehittämään hoitomenetel-miä. Ebolan kohdalla hoidon kehitys on vasta alkutaipaleella, mutta ZMapp-lääkekokeissa on saatu jo lupaavia testituloksia.(Qiu et al. 2014) HI-virusta vastaan on kehitetty jo toimiva kom-binaatiolääkehoito HAART (highly active anti-retroviral therapy), joka on pidentänyt potilaiden elinikää merkittävästi. HIV ei ole enää tappava tauti, vaan se luokitellaan nykyisin krooniseksi. Nämä edistysaskeleet antavat toivoa, siitä että tulevaisuudessa voisi olla mahdollista nujertaa tämän kaltaiset sitkeät virukset kokonaan. (Lai-ne et al. 2013)

Lähteet

Aleksandrowicz T, Marzi A, Biedenkopf N, Beimforde N, Becker S, Hoenen T, Feldmann H, Schnittler H. Ebola Virus Enters Host Cell by Macropinocytosis and Clathrin-Mediated Endocytosis. 2011

Bray M, Geisbert T. W. The role of macrophages and dendritic cells in the pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever, 2005

Chan D, Kim P. HIV Entry and Its Inhibition (1998), Cell Cook J, Lee J. The Secret Life of Viral Entry Glycoproteins:

Moonlighting in Immune Evasion, 2013Dolnik O, Kolesnikova L, Becker S. Review; Filoviruses:

Interactions with the host cell, 2007Dumas F, Preira P, Salome L. Membrane organization of

virus and target cell plays a role in HIV entry, 2014Hedman K. et al. Mikrobiologia – Mikrobiologia,

immunologia ja infektiosaireudet, Duodecim 2010, painos 1

Kawaoka Y. How Ebola Virus Infects Cells, 2005Laine J, Mikkola J. HIV-infektio, Lääkärin käsikirja

(Duodecim) 2013Niemi M, Virtanen I, Vuorio E. Solu- ja molekyylibiologia.

5.painos 1993 Peterlin M, Trono D. Hide, shield and strike back: how

HIV-infected cells avoid immune eradication. 2003Peters C.J. Marburg and Ebola -Arming Ourselves against

the Deadly Filoviruses, 2005Qiu X, Wong G, Audet J, Bello A, Fernando L, Alimonti J,

Fauster-Bovendo H, Wei H, Aviles J, Hiatt E, Johnson A, Morton J, Swope K, Bohorov O, Bohorova N, Goodman C, Kim D, Pauly M, Velasco J, Pettitt J, Olinger G, Whaley K, Xu B, Strong J, Zeitlin L, Koblinger G. Reversion of advanced Ebola virus disease in nonhuman primates with ZMapp, 2014

Requejo H. Worldwide molecular epidemiology of HIV, 2006

Shehu-Xhilaga M, Oelrichs R. Basic HIV virology, Nature 2003

Simon V, Ho D, Karim Q. HIV/AIDS epidemiology, pathogenesis, prevention, and treatment 2006.

World Health Organization, Ebola virus disease outbreak- west Africa 4.9.2014

Zheng Y, Lovsin N, Peterlin M. Newly identified host factors modulate HIV replication, 2005

562

E20 G-proteiinikytkentäiset reseptorit – rakenne ja toimintaVoipio, Susanna & Tyni, KirsiSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto20.9.2012Tarkastaja: Kalervo Metsikkö

TiivistelmäReseptorit ovat solujen erikoistuneita proteiinimolekyylejä, jotka aloittavat viestinvälitysketjun. Reseptorien neljä päätyyppiä ovat: ionikanavareseptori, G-proteiinikytkentäinen reseptori, entsyymireseptori ja tuma-reseptori. G-proteiinikytkentäiset reseptorit sijaitsevat solukalvolla, ja G-proteiini koostuu kolmesta proteii-ni osasta α, β ja γ. Nämä osat ovat G-proteiinin aktiivisia osia, jotka voivat vaikuttaa entsyymien tai ionika-navien toimintaan. Reseptorin rakenne ja koostumus määräävät G-proteiini tyypin, jonka kanssa reseptori on vuorovaikutuksessa. Reseptori voi vaikuttaa myös useamman G-proteiinin kautta. G-proteiinissa tapahtuu muodonmuutos kun reseptori aktivoituu agonistin vaikutuksesta. Pääasialliset muutokset solun toiminnassa välittyvät adenylaattisyklaasin, fosfolipaasi C:n ja ionikanavien kautta. G-proteiinien kautta vaikuttavat re-septorit ovat muskariinireseptori ja adrenergiset reseptorit. Muskariinireseptoreja on kolme farmakologista alatyyppiä M1, M2 ja M3. Näiden kannalta tärkeitä kohdekudoksia ovat muun muassa aivot, sydän ja sileä lihas. Adrenergiset reseptorit jaetaan kolmeen päätyyppiin: α

1, α

2 ja β- reseptoreihin, joissa vielä jokaisessa

on kolme alatyyppiä.

JohdantoG-proteiinikytkentäiset reseptorit, joita joskus kutsutaan myös metabotrooppiseksi reseptorik-si, ovat yleisin reseptorityyppi aitotumaisilla. Ensimmäinen G-proteiinikytkentäinen resepto-ri, jonka aminohappojärjestys on selvitetty, on β

2 – reseptori. Aminohappojärjestys selvitettiin

vuonna 1986, ja siitä käsitys reseptoreiden ra-kenteesta on tarkentunut, vaikka reseptoriprote-iinin rakennetta ei ole vielä pystytty näyttämään fysikaalisin menetelmin.

G- proteiinikytkentäiset reseptoreita on tutkittu ja tutkitaan edelleen paljon, sillä yli puolet lääke-aineista vaikuttaa G-kytkentäisten reseptoreiden kautta. Lisäksi kehon useat monet viestit kulke-vat G-proteiinikytkentäisten reseptoreiden väli-tyksellä, esimerkiksi silmän rodopsiini ja myös hajuaistimukseen tarvitaan G-proteiinikytken-täistä reseptoria. Reseptorin rakenne ja koostu-mus määräävät G-proteiini tyypin, jonka kanssa reseptori on vuorovaikutuksessa. Reseptori voi vaikuttaa myös useamman G-proteiinin kautta

G-proteiinikytkentäinen reseptori sijaitsee solu-kalvossa ja hoitaa signaalinvälityksen vasteen-välittäjille. Reseptorit ja G-proteiinit ovat siis signaalinvälitysketjun alkuosa. Solukalvolla si-jaitsevat vasteenvälittäjät jatkavat viestin kulkua eteenpäin ja muokkaavat viestiä siten, että koko

solun toiminta on viestin mukaista. Reseptorin rakenne ja koostumus määräävät G-proteiini tyy-pin, jonka kanssa reseptori on vuorovaikutukses-sa. G-proteiineja tunnetaan noin kaksikymmentä eri tyyppiä ja reseptoreita on paljon enemmän.

G-proteiini kytkentäinen reseptoriReseptorit ovat solujen erikoistuneita proteiini-molekyylejä. joiden aktivoituessa käynnistyvät solujen signaalinvälitysketjut. Reseptoreita ak-tivoivat elimistön omat viestimolekyylit, kuten hormonit, kasvutekijät, hermoston välittäjäai-neet ja sytokiinit. Reseptoriin sitoutuvaa mole-kyyliä kutsutaan ligandiksi ja se voi olla elimis-tön oma viestiaine tai synteettisesti valmistettu molekyyli. Myös useimmat lääkeaineet vaikutta-vat elimistössä sitoutumalla näihin reseptoreihin joko estäen tai lisäten reseptorien aktiivisutta. Agonistit ovat reseptoreja viestimolekyylien ta-voin aktivoivia lääkeaineita ja antagonistit vies-timolekyylien toimintaa estäviä lääkeaineita eli reseptorinsalpaajia. Antagonistilla ei yleensä ole vaikutusta solun toimintaan ellei elimistössä sa-maan aikaan ole agonistia, jonka vaikutusta se voisi estää.

Lääkeaineet voivat vaikuttaa myös muihin solu-jen makromolekyyleihin kuin elimistön viestiai-neiden reseptoreihin. Esimerkiksi entsyymeihin, solukalvojen kuljetusproteiineihin ja ionikana-

563

viin tai tuman nukleiinihappohin. Reseptorien neljä päätyyppiä ovat: ionikanavareseptori, G-proteiinikytkentäinen reseptori, entsyymiresep-tori ja tumareseptori.

Molekyylirakenne

G-proteiini reseptori koostuu yksittäisestä poly-peptidiketjusta, jonka tyypillinen rakenne käsit-tää seitsemän solukalvon läpäisevää α- heliksiä, jotka ulottuvat solun ulkopinnalta solun sytop-lasmaan muodostaen silmukoita. Yksi silmukka reseptorissa on suurempi ja on vuorovaikutuk-sessa G-proteiinin kanssa.

G-proteiini

G-proteiini on solukalvolla oleva proteiini (tri-meeri), joka koostuu kolmesta proteiini osasta α, β ja γ. G-proteiinin alayksiköistä α- osasta on tut-kittu kaikkein eniten.. Osaset voidaan jakaa 4 pää-ryhmiin niiden aminohapporakenteen perusteella. Merkittävimmät G- proteiini tyypit ovat Gα

s, Gα

i,

Gαq, Gα

o. Gα

s -proteiiniin vaikuttaa mm. β- adr-

energiset ja histamiinia vastaan ottavat reseptorit ja se stimuloi kalsiumkanavia ja adenylaattisyk-laasia lisäten cAMP muodostumista. Gα

i – prote-

iiniin vaikuttavat samanlaiset reseptorit kuin Gαs-

proteiiniin, mutta myös opioidit ja kannabinoidit-reseptorit. Gα

q- proteiinin reseptorit ovat amiini-,

protstenoidi ja peptidireseptorit ja Gαq- proteiini

edelleen aktivoimia vasteenvälittäjiä ovat mm. fosfolipaasi C. Gα

o- proteiiniin vaikuttavat samat

reseptorit kuin Gαi- proteiiniin, mutta Gα

o- prote-

iini lisää kaliumkanavan aktiivisuutta.

Lisäksi G-proteiini alayksikköihin kuuluu Gβγ- yksikkö, johon osallistuu myös soluviestintään ja vaikuttaa myös toisiolähettimekanismeihin riippumatta Gα- proteiinista tai vaikuttaen siihen. Vasteenvälittäjinä toimivat samoja kohteita, kuin Gα- alayksiköllä. Gβγ- proteiini aktivoi myös kaliumkanavia, estää jänniteporteilla varustettuja kalsiumkanavia, aktivoi G-proteiinikytkentäisten reseptoreiden kinaaseja. Gβγ- proteiinia erityistä tehtävää ei tiedetä vielä tarkkaan, mutta monia βγ- proteiinin muotoja on kuitenkin tunnistettu.

G-proteiinikytkentäisen reseptorin toiminta

G-proteiinikytkentäiset reseptorit sijaitsevat so-lukalvolla. G-proteiinit voivat liikkua vapaasti solukalvolla, minkä seurauksena yksi G-prote-

iini voi ottaa viestejä useilta solukalvon resep-toreilta, ja toisaalta sama reseptori voi johtaa usean eri G-proteiinin aktivaatioon. Inaktiivises-sa G-proteiinissa α-, β- ja γ osat ovat kiinnitty-neinä toisiinsa ja GDP eli guanosiinidifosfaatti on kiinnittyneenä α osaan, mutta G-proteiini ei ole kosketuksessa reseptorin kanssa. Kun G-pro-teiinikytkentäinen reseptori aktivoituu agonistin sitoutuessa reseptoriin, tapahtuu reseptoriprote-iinin muodonmuutos, ja G-proteiini sitoutuu re-septoriin. Tällöin G-proteiinin α osaan liittynyt GDP sitoo yhden fosfaattiosan lisää, ja muuttuu GTP: ksi. Samalla α osa irtoaa βγ- kompleksista. Nämä osat ovat G-proteiinin aktiivisia osia, jot-ka voivat vaikuttaa entsyymien tai ionikanavien toimintaan. Signaalin välitys loppuu, kun GTP hydrolysoituu GDP:ksi GTPaasi entsyymin vai-kutuksesta. Tämän jälkeen GDP-α alayksikkö si-toutuu uudelleen yhteen βγ alayksikön kanssa, ja signaalinvälitysketju voi käynnistyä uudelleen. Reseptorit ja G-proteiinit ovat siis signaalinvä-litysketjun alkuosa. Solukalvolla sijaitsevat vas-teenvälittäjät jatkavat viestin kulkua eteenpäin ja muokkaavat viestiä siten, että koko solun toimin-ta on viestin mukaista. Pääasialliset muutokset solun toiminnassa välittyvät adenylaattisyklaa-sin, fosfolipaasi C:n ja ionikanavien kautta.

AdenylaattisyklaasiSolujen adenylaattisyklaasi aktivoituu G

s- prote-

iinien kautta ja inhiboituu Gi- proteiinien kautta.

Solukalvojen adenylaattisyklaasit katalysoivat kaikissa soluissa cAMP:n muodostusta ATP:sta. Syklinen AMP säätelee monia solun toimintoja, esimerkiksi entsyymejä, jotka vaikuttavat ener-gia-aineenvaihduntaan, solujen jakautumista ja erilaistumista, ionien kuljetusta ja ionikanavien toimintaa. Tärkeitä fosforyloituvia kohdeprote-iineja ovat myös geenien ilmentymistä säätele-vät transkriptiotekijät. Ne ovat tumaproteiineja, jotka vaikuttavat kohdegeeniensä aktiivisuuteen.

cAMP aktivoi soluissa proteiinikinaaseja, jotka säätelevät solujen proteiinien toimintaa proteii-nien fosforylaation kautta. Esimerkiksi poteiini-kinaasi A -välitteinen fosforylaatio rasva-, mak-sa- ja lihassolujen energia-aineenvaihduntaan tapahtuu β -ardenergisten reseptoreiden kautta, jotka ovat G-proteiinikytkentäisiä reseptoreita. Solun cAMP pitoisuus nousee ja aktivoi pro-teiinikinaasi A:n, minkä seurauksena lipolyysi lisääntyy rasvasoluissa, glykogeenisynteesi vä-henee maksasoluissa ja glykogeenin pilkkoutu-minen lisääntyy lihassolussa.

564

β -adrenergiset reseptorit saavat sydänlihas-solujen jännitteen säätelemät kalsiumkanavat fosforyloitumaan cAMP:n vaikutuksesta, mistä seuraa lisääntynyt kalsiumin sisään virtaus ka-navien kautta ja sydämen supistusvoiman kasvu. Keuhkoputkissa taasen sileän lihaksen cAMP:n pitoisuuden nousu inaktivoi supistusta proteii-nikinaasin fosforyloidessa supistuksen kannalta keskeisen entsyymin, joten astmaatikon hengitys helpottuu. Syklinen AMP hydrolysoituu solun sisällä fosfodiesteraasientsyymien avulla. Muun muassa kofeiini ja teofylliini inhiboivat jonkin verran näitä entsyymejä.

Fosfolipaasi CFosfolipaasi C on entsyymi, joka katalysoi so-lukalvon rakenneosana esiintyvän fosfatidyy-liinositoli-4,5-difosfaatin (PIP2) hajoamista kahdeksi toisiolähetiksi: 1,2-diasyyliglyserolik-si (DAG) ja inositoli-1,4,5-trisfosfaatiksi (IP3). DAG aktivoi solukalvon proteiinikinaasi C:n. Toisiolähettinä DAG toimii siis samoin kuin cAMP, mutta sen kohdeproteiinit ovat erilaisia. DAG:n muodostusta solukalvolla voi katalysoi-da myös fosfollipaasi D. IP3 avaa endoplasma-kalvostossa kalsiumkanavat, jolloin kalsiumia vapautuu sytoplasmaan. Vapaan kalsiumin mää-rän kasvu johtaa moniin solun toiminnan muu-toksiin. Kalsium on tärkeä solun toisiolähetti, se muun muassa avaa ionikanavia ja säätelee kohdeproteiiniensa fosforylaatiota. Fosfolipaasi A vapauttaa arakidonihappoa solukalvosta. Ara-kidonihappo puolestaan toimii toisiolähettinä aktivoiden proteiinikinaasi C:n. Sen metaboliitit toimivat paikallisina välittäjäaineina esimerkiksi tulehdusreaktioissa tai solujen eritys- ja supistus-toiminnan säätelyssä.

Ionikanavien toiminta G-proteiinien yhteydessäG-proteiinikytkentäiset reseptorit voivat kont-rolloida ionikanavien toimintaa myös suoraan ilman toisiolähettimekanismeja. Esimerkiksi sy-dänlihaksessa ja hermosoluissa GPK-reseptorin aktivoituminen lisää kaliumin kanavien läpäise-vyyttä.

G-proteiinikytkentäiset reseptorityypit

Muskariinireseptorit

Muskariinireseptoreja on kolme farmakologista alatyyppiä M1, M2 ja M3. Näiden kannalta tär-keitä kohdekudoksia ovat muun muassa aivot, sydän ja sileä lihas. Muskariinireseptorien ago-nistit aiheuttavat samantyyppisiä vaikutuksia kuin parasympaattisen hermoston aktivoituminen. Ve-risuonet laajenevat, verenpaine laskee, sydämen syke hidastuu ja supistusvoima vähenee. Sileäs-sä lihaksessa ruuansulatuskanavan aktiivisuus lisääntyy, virtsaaminen helpottuu, keuhkoputket supistuvat ja limaneritys lisääntyy. Rauhasissa syljen eritys lisääntyy, hiki- ja kyynelrauhasten, nenänielun rauhasten, mahalaukun ja suolen lima-kalvon rauhasten eritys lisääntyy. Antikolinergiset aineet, kuten asetyylikoliini toimivat muskarii-nireseptoreiden inhibiittoreina. Atropiini salpaa kaikkia kolmea muskariinireseptorityyppiä sile-ässä lihaksessa, sydänlihaksessa, eksokriinisissä rauhasissa ja keskushermostossa.

Adrenergiset reseptorit

Adrenergiset reseptorit jaetaan kolmeen päätyyp-piin: α

1-, α

2- ja β -reseptoreihin, joissa vielä jokai-

sessa on kolme alatyyppiä. Kaikki adrenergiset reseptorit kytkeytyvät G-proteiineihin. Näitä re-septoreita on sydämessä, verisuonissa, ruuansula-tuskanavasssa, keuhkoputken sileässä lihaksessa, silmässä, ihossa kohdussa, virtsarakossa ja veri-hiutaleissa, eli ympäri kehoa. Esimerkiksi keuh-kojen ja sepelvaltimoiden sileässä lihaksessa on α- ja βtyypin reseptoreja molempia, mistä seuraa, että α tyypin agonistit saavat aikaan vasokonstrik-tion ja β tyypin agonistit vasodilataation. (tauluk-ko FATO s.228). Näihin reseptoreihin vaikutta-malla joko agonisteilla tai antagonisteilla saadaan aikaan erityyppisiä vaikutuksia elimistöön.

Lähteet

Rang HP, Dale M.M, Ritter JM, Flower RJ, Henderson G. Rang and Dale´s Pharma cology. Churchill Livingstone Elsevier, 2012, s. 28- 31

Rang HP, Dale M.M, Ritter JM, Flower RJ, Henderson G. Rang and Dale´s Pharma cology. Churchill Livingstone Elsevier, 2007, s.33- 42

Koulu M, Tuomisto J. Farmakologia ja toksikologia. Kuopio: Medicina, 2001, s. 46- 50

Koulu M, Tuomisto J. Farmakologia ja toksikologia. Kuopio: Medicina, 1996, s. 46- 54, 183- 191, 203- 209, 227- 236

565

E21 ADAM-metalloproteaasi – tehtävä solusignaloinnin säätelyssäIlmakangas Teemu & Lehtonen AleksiSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto17.9.2014Tarkastaja: Petäjä-Repo Ulla

TiivistelmäADAM-metalloproteaasit ovat moniosaisia transmembraaniproteiineja, jotka pilkkovat proteolyyttisesti mui-den solukalvon proteiinien ektodomeeneja. ADAM-proteiinit säätelevät solun toimintaa pilkkomalla eri re-septoreita ja niiden ligandeja ja ovat näin avainasemassa solun erilaistumisessa ja säätelyssä. Niinpä ADAM-proteiineilla on erittäin tärkeä merkitys alkionkehityksestä aina aikuisen yksilön solujen toiminnan säätelyyn. Koska ADAM-proteiinit ovat niin keskeisessä asemassa, ne voivat olla osallisina monissa tautitiloissa, kuten syövässä. ADAM-proteiinien merkitys taudeissa ei ole kuitenkaan selvä, koska kaikkia niiden vaikutusmeka-nismeja ei vielä tunneta. Aiheesta julkaistaan jatkuvasti uusia mielenkiintoisia tutkimuksia.

JohdantoADAM-metalloproteaasit (a disintegrin and metalloprotease) ovat muita solukalvon prote-iineja muokkaavia ja pilkkovia transmembraa-nisia entsyymejä. ADAM-proteiinit kykenevät pilkkomaan muiden solukalvoon kiinnittyneiden proteiinien, kuten sytokiinien, kasvutekijöiden, kemokiinien ja niiden reseptorien solukalvon ul-kopuolisia osia. Tämä ominaisuus tekee ADAM-proteiineista merkityksellisiä esimerkiksi he-delmöityksessä, alkion kehityksessä, solujen erilaistumisessa ja myös erilaisissa tautitiloissa, kuten tulehduksessa ja syövässä (Blobel 2005; Edwards ym. 2008; Weber & Saftig 2012).

ADAM-proteiineja tavataan kaikilla selkäran-kaisilla (Seals & Courtneidge 2003). ADAM-proteiineja tai niitä koodaavia geenejä on löydet-ty myös muilta lajeilta, kuten kynsisammakolta Xenopus laevis, hiivalta Schizosaccharomyces pombe, hedelmäkärpäseltä Drosophila melano-gaster ja seeprakalalta Danio rerio (Huxley-Jones ym. 2007; Iida ym. 2010; Nakamura ym. 2004; Weber & Saftig 2012). Kasveissa ei esiinny ADAM-proteiineja (Seals & Courtneid-ge 2003). Nisäkkäiden genomeista on löydet-ty neljäkymmentä erilaista ADAM-proteiinia koodaavaa geeniä. Ihmiseltä ADAM-geenejä on löydetty 22, joista kahdestatoista tuotetaan aktiivisia proteolyyttisiä ADAM-proteiineja. Lopuista puuttuu proteolyysin mahdollistava sinkkiatomin sitoutumispaikka, ja muutaman geenin tiedetään olevan intronittomia pseudo-

geenejä (Weber & Saftig 2012). ADAM-proteii-nien merkitystä yksilönkehityksessä ja elimistön toiminnassa on tutkittu poistogeenisillä hiirillä. Tärkeimmiksi ovat paljastuneet ADAM10 ja ADAM17. ADAM10-proteiinin tiedetään vai-kuttavan Notch-signalointiin ja siten esimer-kiksi alkion hermoston kehitykseen. ADAM10 osallistuu myös epiteelikudoksen säätelyyn. ADAM17-proteiinilla on tärkeä rooli epiteeli-kudoksen kehityksessä ja kasvussa, tulehdusre-aktioissa sekä rintasyövässä (Huovila ym. 2005; Weber & Saftig 2012)

ADAM-metalloproteaasien rakenne ja toimintaADAM-metalloproteaasit ovat saanet nimensä moniosaisen rakenteensa myötävaikutuksena (Edwards ym. 2008). Nimetessään uuden gee-niperheen Wolfsbergin tutkimusryhmä huomioi tiettyjen domeenien samankaltaisuudet kyy-käärmeiden myrkkyjen ja siittiöiden proteiini-en kanssa, josta juontaa juurensa akronyymi ADAM (Wolfsberg 1995). ADAM-proteiinien rakennetta on selvitetty röntgenkristallografialla ja johtamalla rakenne samankaltaisten SVMP-proteiinien (snake venom metalloproteinase) tutkimuksista saaduista tuloksista (Edwards ym. 2008). Proteiiniin koko rakennetta ei ole kuiten-kaan vielä kyetty selvittämään, vaan osa moni-mutkaisten domeenien yksityiskohtaisemmista rakenteista ja morfologiasta on pimennossa (We-ber & Saftig 2012).

566

ADAM-proteiinien ensimmäinen osa N-päässä koostuu signaalisekvenssistä ja prodomeenista. Signaalisekvenssi ohjaa tuotetun proteiiniin oi-kealle eritysreitille. Prodomeeni inhiboi metallo-proteaasiosan ennenaikaista toimintaa solun si-sällä sitoutumalla sen sinkkiatomiin estäen siten katalyyttisen toiminnan. Proproteiini-konvertaa-sientsyymi poistaa prodomeenin Golgin laittees-sa, mutta prodomeeni voi irrota myös autokata-lyyttisesti. Prodomeenin on havaittu toimivan myös kaperonina, joka saa metalloproteaasiosan laskostumaan oikein (Seals & Courtneidge 2003; Weber & Saftig 2012).

Prodomeenin jälkeen seuraa metalloproteaasido-meeni, jossa on ADAM-proteiinin varsinainen katalyyttisesti aktiivinen kohta. Kaikki ADAM-proteiinit eivät kuitenkaan ole aktiivisia prote-aaseja. Aktiivisuuteen vaaditaan spesifinen pro-teiinin aktiivinen kohta (HEXGHXXGXXHD), johon katalyyttinen sinkkiatomi ja substraatin hydrolyysissä tarvittava vesi voivat sitoutua. Näitä katalyyttisesti aktiivisia pilkkoja-ADAM -proteiineja ihmiseltä on löydetty 12 erilais-ta (Seals & Courtneidge 2003; Weber & Saftig 2012). ADAM-proteiinin aktiivisuutta voidaan inhiboida erilaisilla tavoilla, jotka pääasiassa vaikuttavat juurikin metalloproteaasidomeeniin. Sinkkikelaatilla voidaan vähentää sinkin sitoutu-mista proteiinin aktiiviseen kohtaan. Myös solu-jen tuottamia TIMP-proteiineja (tissue inhibitor of metalloproteinases) voidaan käyttää estämään proteolyysiä, sillä TIMP sitoutuu metalloprote-aasin aktiiviseen kohtaan. Erityyppiset TIMP-proteiinit ovat osoittautuneet käyttökelpoisiksi tutkittaessa ADAM-proteiinien vaikutusta so-lujen toimintaan (Edwards ym. 2008; Seals & Courtneidge 2003).

Metalloproteaasidomeenin C-päähän on liitty-neenä disintegriinidomeeni. Domeeni on saa-nut nimensä kyykärmeiden myrkystä löytyvästä vastaavanlaisesta disintegriinistä. Disintegriini estää trombosyyttien integriinireseptoreiden toi-minnan ja siten trombosyyttien tarttumisen fib-riiniin, jolloin veren normaali hyytyminen estyy (Seals & Courtneidge 2003). ADAM-proteiinin disintegriinidomeenin onkin arveltu vaikuttavan ADAM:n substraattien valintaan, kuten integrii-niin tarttumiseen, ja siten solujen välisten liitos-ten säätelyyn. Teoria disintegriinin vuorovaiku-

tuksesta integriinin kanssa on kuitenkin kyseen-alaistettu uusimmissa tutkimuksissa, sillä vaikka ADAMin disintegriinistä puuttuisi integriinin tunnistamiseen vaadittava osa (Seals & Court-neidge 2003) tai sen toiminta estettäisiin, niin ADAM voi edelleen sitoutua integriiniin (Weber & Saftig 2012).

Disintegriiniä seuraa kysteiinirikas domeeni. Yhdessä metalloproteaasi, disintegriini ja kyste-iinirikas domeeni muodostavat C-kirjainta muis-tuttavan rakenteen, jossa kysteiinirikas domeeni on lähellä metalloproteaasin aktiivista kohtaa ja on siten tärkeä osa proteolyyttistä toimintaa. Ky-steiinirikkaan domeenin on osoitettu säätelevän proteolyyttistä aktiivisuutta ja substraattien tun-nistamista (Edwards ym. 2008; Weber & Saftig 2012). Erityinen merkitys kysteiinirikkaalla do-meenilla on solu-soluväliaine vuorovaikutukses-sa. Kysteiinirikas domeeni tehostaa solun synde-kaanivälitteistä vuorovaikutusta soluväliaineen kanssa ja ilmeisesti pystyy myös itsenäisesti sitoutumaan fibronektiiniin ja lamiiniin. ADAM-proteiineilla näyttää siis olevan tärkeä rooli so-lun ja soluväliaineen vuorovaikutuksen säätelys-sä, sillä ADAM-proteiinit voivat vaikuttaa sekä integriineihin että syndekaaneihin ja myös suo-raan soluväliaineen proteiineihin sitoutumiseen (White 2003).

Lähimpänä solukalvoa sijaitsee epidermaalisen kasvutekijän tapainen domeeni (myöhemmin EGF:n tapainen; EGF-like; epidermal growth factor-like). Todennäköisesti EGF:n tapainen do-meeni säätelee ADAM-proteiinin kiinnittymistä solukalvon proteoglykaaneihin ja läheisen kyste-iinirikkaan domeenin substraattien kiinnittymis-tä. EGF:n tapaista domeenia seuraa solukalvon läpäisevä osa. Solulimassa sijaitsee transmem-braaniseen osaan kiinnittyvä soluliman domeeni (Weber & Saftig 2012). Eri ADAM-proteiineilla soluliman domeeni on erimittainen ja sisältää eri proteiinisekvenssin. Soluliman domeenilla on rooli ADAM-proteiinien toiminnan sääte-lyssä, esimerkiksi fosforylaation kautta voidaan vaikuttaa ADAM-proteiinien aktiivisuuteen. Soluliman domeenia käytetään myös ADAM-proteiinin kuljetuksessa solun oikealle puolelle esimerkiksi polarisoiduissa epiteelisolussa (Ed-wards ym. 2008).

567

Kuva 1. ADAM-metalloproteaasin rakenteen kaa-vakuva. 1. prodomeeni, 2. metalloproteaasi, 3. di-sintegriini, 4. kysteiinirikas domeeni, 5. EGF:n ta-painen domeeni, 6. solukalvon läpäisevä domee-ni, 7. soluliman domeeni (mukaillen Blobel 2005; Edwards ym. 2008).

Vaikutus solusignaloinnissa

Yleistä

ADAM-metalloproteaasit kykenevät vaikut-tamaan solujen signalointiin hyvin monilla eri mekanismeilla. Yhteistä kaikille niille näyttää kuitenkin olevan se, että kaikissa tapauksissa ADAM-proteaasi katkaisee jonkin solukalvoon kiinnittyneen proteiinin solun ulkopuolisen osan. Vapautuva proteiini ja/tai solukalvoon jäl-jelle jäänyt proteiinin osa voivat tämän jälkeen vaikuttaa signalointiin eri tavoin, tilanteesta ja kyseessä olevasta proteiinista riippuen (Blobel 2005).

Yksinkertaisena esimerkkinä ADAM voi irrottaa solukalvoon kiinnittyneen proteiinin, joka voi vapautuessaan kulkeutua ympäristöönsä ja toi-mia ligandina jonkin toisen solun solukalvolla olevalle reseptorille, mahdollistaen näin para-kriinisen signaloinnin (Blobel 2005). Esimerkik-si kaikki epidermaaliset kasvutekijät (epidermal growth factor, EGF) esiintyvät proteiinisynteesin jälkeen solukalvoon kiinnittyneinä transmem-braaniproteiineina, josta ne vapautetaan soluvä-litilaan pilkkovien entsyymien, kuten ADAM-perheen metalloproteaasien toimesta (Edwards ym. 2008). Tähän liittyen erityisesti ADAM17-proteaasin merkitystä EGF-signalointiin on tut-kittu ja hiirillä tehdyissä kokeissa sen on havaittu olevan kriittisen tärkeä sydämen kehityksessä. (Blobel 2005; Weber & Saftig 2012).

ADAM-metalloproteaasit voivat vaikuttaa signalointiin myös muilla mekanismeilla, esi-merkiksi pilkkomalla solukalvon reseptoreita ligandien irrottamisen sijaan. Tämän seurauk-sena signaloinnin aktiivisuus voi kyseessä ole-vasta signalointireitistä riippuen joko kasvaa tai pienentyä. Joissain tapauksissa tämä johtaa signalointiaktiivisuuden pienenemiseen johtuen toimintakykyisten, solukalvoon kiinnittyneiden reseptoreiden määrän vähentymisestä ja ligan-dien sitoutumisesta soluvälitilaan vapautuneisiin inaktiivisiin reseptoreihin (ns. decoy-reseptorit). Toisaalta, reseptorien pilkkoutuminen voi myös vaikuttaa juurikin päinvastaisesti. Tästä esimerk-kinä Notch-signalointi, joka vaikuttaa solujen kohtaloon ja on siten välttämätön alkionkehityk-sessä. Notch-signaloinnissa ADAM-proteiinin suorittama solukalvon reseptorin leikkaaminen johtaa välivaiheiden kautta myös reseptorin so-lun sisäinen osan (intracellular domain, ICD) ir-toamiseen gamma-sekretaasientsyymin toimesta ja signaalin välittymiseen solun tumaan. (Arta-vanis-Tsakonas ym. 1999; Blobel 2005; Brou ym. 2000; Edwards ym. 2008).

568

Kuva 2. ADAM-proteaasin merkitys solusignaloin-nissa. Kuvassa saksina kuvattu ADAM-proteiini voi leikata ligandin irti, jolloin se voi sitoutua saman solun reseptoriin (autokriininen viestin-välitys) tai läheisten solujen reseptoreihin (para-kriininen viestinvälitys). Irti leikattu reseptori voi toimia nk. decoy-reseptorina. Jukstakriinisessä viestinnässä ADAM-proteiini voi leikata ligandin irti sitoutumisen jälkeen tai ADAM-proteiinia voi-daan tarvita reseptorin aktivaatiossa (mukaillen Edwards ym. 2008).

Triple Membrane-Passing Signal (TMPS) ja ADAM

Eräs mielenkiintoinen esimerkki ADAM-pro-teaasien toiminnasta on niiden osallisuus sig-nalointiketjussa, jossa G-proteiinikytkentäisen reseptorin aktivaatio johtaa lopulta EGF-sig-nalointiin. Tämä tapahtumasarja tunnetaan ni-mellä “triple membrane passing signal”, eli siinä signaali ikään kuin läpäisee solukalvon kolme kertaa. Viestin eteneminen alkaa solukalvolla sijaitsevan G-proteiinikytkentäisen reseptorin (G protein-coupled receptor, GPCR) vastaanot-taessa ligandin solun ulkopuolelta. Sitoessaan ligandin GPCR-reseptori aktivoi samassa solus-sa ADAM-proteaasin, joka vapauttaa aktivoitu-essaan solukalvoon kiinnittyneen EGF-ligandin (epidermal growth factor), joka taas puolestaan sitoutuu solukalvon EGFR-reseptoriin (epider-mal growth factor receptor), joka edelleen jatkaa signaalin välitystä solun sisään (Edwards ym. 2008).

Sairausesimerkki: ADAM-metalloproteaasien toiminta rintasyövässäKaikista rintasyöpätapauksista noin 20–30 pro-sentissa HER2-reseptorin (human epidermal growth factor receptor 2) ilmentyminen soluis-sa on epänormaalin suuri normaaliin solukkoon verrattuna. Nämä nk. HER2-positiiviset rinta-syövät ovat aggressiivisia ja niiden ennuste on erityisen huono (Gajria & Chandarlapaty 2011; Slamon ym. 2001).

HER2 on EGFR-reseptoreiden (epidermal growth factor receptor) perheeseen kuuluva so-lukalvoreseptori, joka koostuu kolmesta pää-osasta: solukalvon ulkopuolisesta, solukalvon lä-päisevästä (transmembraani) sekä solunsisäises-tä osasta. Kasvutekijän sitoutuminen solukalvon ulkopuoliseen HER2-reseptorin osaan aiheuttaa reseptorin homo- tai heterodimerisaation tapah-tumisen muiden EGFR-perheen reseptoreiden kanssa. Tämä taas puolestaan johtaa reseptorin solunsisäisen osan aktivoitumiseen. HER2-re-septorin solunsisäinen osa toimii aktivoiduttu-aan kinaasina (tyrosiinikinaasi) ja aktivoi solun sisäisiä signalointireittejä fosforyloimalla muita sytoplasman molekyylejä. Näiden signalointi-reittien, kuten esimerkiksi PI3K-reitin (Gajria & Chandarlapaty 2011), on havaittu estävän apop-toosia ja lisäävän solujen proliferaatiota. On myös huomattu, että erityisesti HER2-geeniä yli-ilmentävissä tai sen mutaation omaavissa soluis-sa HER2 voi dimerisoitua myös ilman ligandin sitoutumista ja näin ollen HER2 voi stimuloida kasvaimen kasvua edistäviä signalointireittejä itsenäisesti ilman ligandin sitomista (nk. konsti-tutiivinen aktiivisuus) (Gajria & Chandarlapaty 2011; Liu ym. 2006).

ADAM-proteiinien yhteyttä tähän HER2-po-sitiiviseen rintasyöpään on tutkittu. Kuten jo aiemmin on todettu, kaikki EGF-ligandit irro-tetaan ADAM-proteaasien toimesta (erityisesti ADAM17) jolloin ne vapautuvat solukalvosta ja voivat näin ollen sitoutua EGFR-perheen resep-toreihin, aktivoiden solujen jakautumista lisääviä signalointireittejä (Edwards ym. 2008; Liu ym. 2006). On kuitenkin myös huomattu, että HER2-

569

positiivista syöpää sairastavilla potilailla see-rumin kohonneella HER2-ECD -pitoisuudella (HER2 extracellular domain) on yhteys syövän huonomman ennusteen kanssa. HER2-ECD va-pautuu HER2-reseptorin leikkautuessa solukal-von ulkopuolisesta osasta, jolloin solukalvolle jää jäljelle niin kutsuttu HER2-p95 -fragmentti ja reseptorin solunulkoinen osa vapautuu (ECD), jolloin sitä on havaittavissa potilaan seerumissa (Liu ym. 2006). HER2-p95 -fragmentin on in vitro tutkimuksissa havaittu olevan nk. konstitu-tiivisesti aktiivinen kinaasi (Liu ym. 2006), eli sen solun sisäinen tyrosiinikinaasi-osa toimii ak-tiivisesti ilman EGF-ligandin sitoutumista resep-toriin (p95-fragmentti ei edes kykene sitomaan ligandia, sillä sen solukalvon ulkopuolinen osa puuttuu). Näin ollen se kykenee aktivoimaan syövän pahenemista edesauttavia signalointireit-tejä itsenäisesti (Gajria & Chandarlapaty 2011).

Edelliseen kappaleeseen liittyen HER2-resepto-rin leikkautumista aiheuttavia tekijöitä on pyritty selvittämään (Liu ym. 2006) ja on huomattu, että muun muassa TIMP1-proteiini (tissue inhibitor of metalloproteinases) kykenee estämään HER2-ECD:n syntyä ja näin ollen estää HER2-resepto-rin leikkautumista. Tämän perusteella on syytä epäillä, että ADAM-metalloproteaaseilla on vai-kutusta asiaan, sillä TIMP-1 pystyy inhiboimaan

ADAM-proteiinien aktiivisuutta (Edwards ym. 2008; Liu ym. 2006). Myöhemmissä tutkimuk-sissa onkin havaittu, että ADAM10-proteiini on mahdollisesti yksi tärkeimmistä HER2-resepto-reita leikkaavista proteiineista (Liu ym. 2006).

Trastutsumabi on vasta-aine, jota käytetään lääk-keenä HER2-positiivisen rintasyövän hoidossa. Trastutsumabi pystyy sitoutumaan HER2-resep-torin solunulkoiseen osaan ja tätä kautta monilla eri mekanismeilla, kuten reseptorien dimerisaa-tiota ehkäisemällä, estää reseptorin kinaasiak-tiivisuutta ja näin ollen vähentää syöpäsolujen proliferaatiota (Gajria & Chandarlapaty 2011).

Moni HER2-positiivinen syöpä on kuitenkin resistentti trastutsumabille. Resistenssin kehit-tymisen kaikkia mekanismeja ei täysin tunneta lääkeaineen monimutkaisen vaikutusmekanis-min puutteellisen tuntemuksen vuoksi, mutta HER2-reseptoreiden pilkkoutumisella ECD ja p95-fragmentteihin on havaittu olevan yhte-ys resistenssiin, sillä HER2-p95 -fragmentista puuttuu solukalvon ulkopuolinen osa, joka on sama osa johon trastutsumabi sitoutuu. Näin ol-len HER2-reseptoreita pilkkovilla ADAM-pro-teiineilla vaikuttaisi olevan muiden tekijöiden ohella merkitys resistenssin synnyssä (Gajria & Chandarlapaty 2011; Liu ym. 2006).

Kuva 3. 1. Trastutsumabin sitoutuessa HER2-reseptoriin PI3K-reitti estyy. 2. ADAM-proteiini saattaa vaikuttaa trastutsumabiresistenssin syntyyn. ADAM-proteiinin pilkkoessa HER2-reseptorin trastutsu-mabin sitoutuminen estyy ja HER2-p95 aktivoi PI3K-reitin itsenäisesti (Gajria & Chandarlapaty 2011; Liu ym. 2006).

570

Lähteet

Artavanis-Tsakonas S, Rand MD, Lake RJ. Notch Signaling: Cell Fate Control and Signal Integration in Development. Science 1999; 5415:770–776.

Blobel CP. ADAMs: key components in EGFR signalling and development. Nature 2005; 6:32–43.

Brou C, Logeat F, Gupta N, Bessia C, LeBail O, Doedens JR, Cumano A, Roux P, Black RA, Israël A. A Novel Proteolytic Cleavage Involved in Notch Signaling: The Role of the Disintegrin-Metalloprotease TACE. Mol Cell. 2000; 5(2):207–16. Edwards DR, Handsley MM, Pennington CJ. The ADAM metalloproteinases. Mol Aspects Med 2008; 29 Issue 5:258–289.

Gajria D, Chandarlapaty S. HER2-amplified breast cancer: mechanisms of trastuzumab resistance and novel targeted therapies. Expert Rev Anticancer Ther. 2011; 11(2):263–275.

Huovila APJ, Turner AJ, Pelto-Huikko M, Kärkkäinen I, Ortix RM. Shedding light on ADAM metalloproteinases. Trends Biochem Sci 2005; 30 Issue 7:413–422.

Huxley-Jones J, Clarke TK, Beck C, Toubaris G, Robertson DL, Boot-Handford RP. The evolution of the vertebrate metzincins; insights from Ciona intestinalis and Danio rerio. BMC Evol Biol 2007; 7:63

Iida A, Sakaguchi K, Sato K, Sakurai H, Nishimura D, Iwaki A, Takeuchi M, Kobayashi M, Misaki K, Yonemura S, Kawahara A, Sehara-Fujisawa A. Metalloprotease-dependent onset of blood circulation in zebrafish. CB 2010; 20 Issue 12:1110–1116.

Liu PCC, Liu XD, Li YL, Covington M, Wynn R, Huber R, ... & Burn TC. Identification of ADAM10 as a Major Source of HER2 Ectodomain Sheddase Activity in HER2 Overexpressing Breast Cancer Cells. Cancer biology & therapy 2006; 5(6):657–664.

Nakamura T, Abe H, Hirata A, Shimoda C. ADAM family protein Mde10 is essential for development of spore envelopes in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Eukaryotic Cell 2004; 3:27–39.

Seals DF, Courtneidge SA. The ADAMs family of metalloproteases: multidomain proteins with multiple functions. Genes Dev 2003; 17:7–30.

Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S, Fuchs H, Paton V, Bajamonde A, Fleming T, Eiermaan W, Wolter J, Pegram M, Baselga J, Norton L. Use of Chemotherapy plus a Monoclonal Antibody against HER2 for Metastatic Breast Cancer That Overexpresses HER2. N Engl J Med 2001; 344:783–792.

Weber S, Saftig P. Ectodomain shedding and ADAMs in development. Development 2012; 139:3693–3709.

White JM. ADAMs: modulators of cell-cell and cell-matrix interactions. Curr Opin Cell Biol 2003; 15 Issue 5:598–606

Wolfsberg TG, Straight PD, Gerena RL, Huovila APJ, Primakoff P, Myles DG, White JM. ADAM, a Widely Distributed and Developmentally Regulated Gene Family Encoding Membrane Proteins with A Disintegrin And Metalloprotease Domain. Dev Biol 1995; 169 Issue 1:378–383.

571

E22 Antioksidanttientsyymi – suojautuminen vapailta radikaaleiltaHolmström, Lauri & Hovinen, VesaSolu-ja kehitysbiologian kurssin kirjoitelmaAnatomian ja solubiologian laitos, Oulun yliopisto11.9.2014Tarkastaja: Sami Palomäki

TiivistelmäKaikki elolliset organismit altistuvat jatkuvasti erilaisille sisä- tai ulkosyntyistä alkuperää oleville tekijöille, jotka muuttavat biomolekyylejä ja aiheuttavat näin vahinkoa solutasolla. Antioksidantit suojelevat solua täl-tä vahingolta hapettumalla itse hapetus-pelkistys-reaktiossa, jossa vapaat radikaalit pelkistyvät ja menettävät reaktiivisuutensa. Optimaalisessa tilanteessa antioksidanttien ja vapaiden radikaalien suhde on tasapainossa, koska vapaita radikaaleja tarvitaan myös solujen normaaliin toimintaan. Epätasapaino voi johtaa mm. vakaviin soluvaurioihin, diabeteksen tai syövän muodostumiseen.

JohdantoVapaat radikaalit ovat parittoman elektronin omaavia ja hyvin reaktiivisia molekyylejä. Ne voivat reagoida proteiinin, nukleiinihappojen sekä solukalvon rasvahappojen ja plasman lipo-proteiinien kanssa vahingoittaen niitä, mikä on tärkeä riskitekijä ateroskleroosin ja sepelvalti-motautien synnyssä (Poljšak B. ja Fink R. 2014). Lisäksi nukleiinihappojen vahingoittuminen voi johtaa perinnöllisiin mutaatioihin tai syöpään ja proteiinien vahingoittuminen puolestaan autoim-muunisairauksien syntymiseen. Suojautuminen radikaaleja vastaan tapahtuu erilaisten antioksi-danttien avulla, jotka pelkistävät superoksideja ja vetyperoksideja. (Murray R. K, ym. 2012). Epätasapaino antioksidanttien ja vapaiden radi-kaalien välillä voi johtaa vaurioihin solukalvol-la tai solunsisäisissä molekyyleissä (Rizzo ym. 2010). Tässä kirjoitelmassa pureudumme anti-oksidanttien ja vapaiden radikaalien maailmaan. Käsittelemme aihetta erityisesti solunsisäisten antioksidanttientsyymien osalta. Kirjoitelma pohjautuu tutkimuksiin, jotka ovat näyttöön pe-rustuvaan lääketiedettä (EBM).

Antioksidanttientsyymit

Toiminta

Antioksidantit suojaavat soluja tehokkaasti va-pailta radikaaleilta, esimerkiksi superoksideilta. Antioksidanttien toiminnan kemiallinen perusta on hapetus-pelkistys –reaktio, jossa antioksidan-tit toimivat pelkistiminä eli hapettuvat. Soluissa

on oma antioksidanttientsyymien verkosto, joka toimii vapaiden radikaalien vastavaikuttajana ja ehkäisee oksidatiivisen stressiä. (Poljšak B. ja Fink R. 2014.)

Tyypit

Antioksidantit voidaan jakaa ulkosyntyisiin (ek-sogeeninen) ja sisäsyntyisiin (endogeeninen). Nimensä mukaisesti ulkosyntyiset antioksidan-tit saadaan ravinnon kautta ja sisäsyntyisiä an-tioksidantteja elimistö kykenee muodostamaan itse. Sisäsyntyisiä antioksidantteja ovat mm. glutationisulfhydriidi (GSH), glutationidisulfidi (GSSG), superoksididismutaasi (SOD), glutatio-niperoksidaasi (GPx), glutationireduktaasi (GR) ja katalaasi (CAT). (Murray R. K, ym. 2012.)

Ulkosyntyisiä eli ravinnon mukana saatavia antioksidantteja ovat mm. polyfenoliset aineet (karoteenit ja flavonoidit) sekä vitamiinit, ku-ten rasvaliukoiset E-vitamiinit ja vesiliukoinen askorbiinihappo eli C-vitamiini. Tutkimusten mukaan niillä on terveyttä edistäviä vaikutuksia mm. oksidatiivisen stressin ehkäisyssä ja sitä kautta diabeteksen, ateroskleroosin sekä sydän- ja verisuonitautien ehkäisyssä. (Rajendran P. ym. 2014 ja Le Lay S. ym. 2014.)

SuperoksididismutaasiSuperoksididismutaasilla (SOD) tarkoitetaan entsyymien joukkoa, jotka poikkeavat toisistaan rakenteensa ja koentsyymiensä osalta, esimer-kiksi Mn-SOD ja Cu-Zn-SOD. SOD lisää super-oksidiradikaalin muuttumista vetyperoksidiksi. (Rajendran P. ym. 2014.)

572

KatalaasiKatalaasi (CAT) entsyymi, joka sisältää rauta-porfyriinia. Sitä on kaikissa aerobisissa soluis-sa ja joka hajottaa eräissä hapettamisreaktioissa syntyvän soluille myrkyllisen vetyperoksidin vedeksi ja molekulaariseksi hapeksi katalysoi SOD:n katalysoiman reaktion lopputuotetta, ku-ten vetyperoksidin muuttuminen vedeksi. Lisäk-si se toimii mm. hemoglobiinin suoja-aineena. (Rajendran P. ym. 2014.)

Glutationiperoksidaasi ja glutationireduktaasiGPx on toiminnaltaan samankaltainen entsyymi kuin CAT, mutta se pystyy katalysoimaan paljon pienemmässä konsentraatiossa olevaa solun-sisäistä vetyperoksidia. Lisäksi GPx pelkistää steroideista ja lipideistä muodostuneet orgaani-set peroksidit vaarattomaan muotoon. Samaan tapaan GR on tärkeä entsyymi peroksidien ja vierasaineiden metaboliassa. Se pelkistää ha-

pettuneessa muodossa olevan glutationin sisäl-tämän disulfidisidoksen vapaiksi tioliryhmiksi. (Rajendran P. ym. 2014.)

Glutationisulfhydriidi ja glutationidisulfidiGSH on tärkeä solujen tuottama endogeeninen antioksidantti. Se osallistuu suoraan vapaiden radikaalien ja reaktiivisten happiyhdisteiden neutralointiin (Rajendran P. ym. 2014). Lisäk-si se pitää yllä eksogeenisten antioksidanttien (esim. E- ja C-vitamiinit) pelkistynyttä muotoa ja on tärkeä tekijä DNA:n korjauksessa (Chat-terjee A. 2013). GSSG on kahden hapettuneen GSH-molekyylin muodostama disulfidi, jonka muodostumista katalysoi GPx. Samassa reakti-ossa vetyperoksidi pelkistyy vedeksi (Kuva 1). GSSG-molekyylin pelkistymistä takaisin kah-deksi GSH-molekyyliksi katalysoi GR. GSH/GSSG-suhdeluku eli tioli-indeksi on tärkeä para-metri solunsisäisestä hapetus-pelkistys-tasapai-nosta. (Rajendran P. ym. 2014.)

Kuva 1. Superoksidin formaatio ja eliminaatio (kuva on piirretty http://www.benbest.com/lifeext/oxidate.gif pohjalta)

573

Eksogeeniset antioksidantitUlkosyntyisiä eli ravinnon mukana saatavia antioksidantteja ovat mm. polyfenoliset aineet (karoteenit ja flavonoidit) sekä vitamiinit, kuten rasvaliukoiset E-vitamiinit ja vesiliukoinen as-korbiinihappo eli C-vitamiini (Murray R. K, ym. 2012).

Vapaat radikaalit ja oksidatiivinen stressiVapaa radikaali on atomi tai atomiryhmä, jolla on pariton elektroni. Välittömästi synnyttyään tämä radikaali hapettaa lähimmän kohtaamansa molekyylin. Tästä voi aiheutua soluvaurioita so-lukalvossa, DNA:ssa, solun proteiineissa tai hii-lihydraateissa. (Le Lay S. ym. 2014.)

Vapaan radikaalien syntymiseen on monia syitä. Ulkoisia tekijöitä ovat mm. radioaktiivinen sä-teily, UV-säteily, raskasmetallit, typen oksidit, torjunta-aineet, synteettiset lääkkeet tai tupakan-savu. Sisäisiä tekijöitä ovat mm. krooniset sai-raudet (diabetes, erilaiset tulehdukset) tai kova fyysinen kuormitus. Solun normaali energian-tuotanto (anaerobinen glykolyysi, Krebsin sykli, oksidatiivinen fosforylaatio) tuottaa myös vapai-ta radikaaleja (Kuva 1), esimerkiksi superoksi-deja. (Murray R. K, ym. 2012.)

Elimistössä syntyy aineenvaihdunnan tuotok-sena useita voimakkaasti hapettavia yhdisteitä, joita syntyy erityisesti verisoluissa, mutta myös muissa soluissa. Näitä yhdisteitä ovat super-oksidi (O

2-), vetyperoksidi (H

2O

2), peroksidi-

radikaalit (ROO∙) sekä hydroksyyliradikaalit (OH∙), joita kutsutaan yhteisnimellä reaktiiviset happiradikaalit (ROS; reactive oxygen species). Yleisesti ajatellaan, että 0,15–2,0 % aineenvaih-dunnan käyttämästä hapesta (O

2) metabuloituu

epätäydellisesti ja muuttuu superoksidiksi (O2

-). (Le Lay S. ym. 2014.) Lisäksi kehossa muodos-tuu typpipohjaisia radikaaleja (RNS) (Rizzo ym. 2010 ja Leeuwenburgh C. ym. 2001).

Elimistö tuottaa myös tarkoituksella reaktiivisia happiradikaaleja, jotka ovat tärkeitä solun si-säisessä signaloinnissa, solun jakautumisessa ja erikoistumisessa sekä immuunijärjes-telmässä (Rajendran P. ym. 2014). Tämän vuoksi ROS-molekyyleillä on suuri merkitys syövän muo-dostuksessa, mutta myös solujen apoptoosissa ja näin ollen paradoksaalisesti tuumorisolujen proliferaation hidastamisessa (Kardeh S. ym. 2014) (kuva 2). ROS-molekyylien muodosta-mista varten elimistössä on katalysoivia pro-oksidanttientsyymejä, kuten ksantiinioksidaasi ja NADPH-oksidaasi (Rajendran P. ym. 2014).

Kuva 2. ROS:n merkitys syövän hoidossa ja muodostuksessa (kuva piirretty artikkelin Paradoxical action of reactive oxygen species in creation and therapy of cancer pohjalta)

574

Pro- ja antioksidanttientsyymien epätasapaino johtaa oksidatiiviseen tai reduktiiviseen stressiin (Kairisalo M. 2010). Tällöin hapettavia yhdis-teitä (ROS tai RNS) on ylimäärin tai pelkistäviä yhdisteitä eli antioksidantteja liian vähän. Oksi-datiivisen stressin vastakohta on reduktiivinen stressi, jolloin hapetus-pelkistys –tasapaino on pelkistävien aineiden puolella (kuva 3). Oksida-tiivinen stressi johtaa usein solujen rakenteelli-siin ja toiminnallisiin häiriöihin, mikä puoles-taan voi aiheuttaa eri mekanismien kautta solu-kuoleman. (Rajendran P. ym. 2014.) Aivot ku-luttavat runsaasti happea, minkä vuoksi ne ovat erittäin alttiita oksidatiivisen stressin haitoille, jotka voivat aiheuttaa mm. hermorappeumasai-

rauksia, kuten Huntingtonin tautia (Kairisalo M. 2010). Jatkuva oksidatiivinen stressi altistaa ai-neenvaihdunnan häiriöille ja sairauksille, kuten kakkostyypin diabetes ja ateroskleroosi (Le Lay ym. 2014 ja Rajendran P. ym. 2014).

Oksidatiivinen stressitila syntyy usein lisäänty-neen aerobisen aineenvaihdunnan myötä (Kuva 1), kuten liikunnan seurauksena lihassolujen mitokondrion energiantuotanto lisääntyy, jolloin ROS- ja RNS–yhdisteitä muodostuu enemmän (Gomez-Cabrera M. C. ym. 2008). Elimistössä käynnistyy tällöin vastavaikuttajareaktio eli an-tioksidanttisynteesi kiihtyy, mikä estää oksida-tiivisen stressin kehittymistä (Leeuwenburgh C. ym. 2001).

Kuva 3. Oksidatiivinen ja reduktiivinen stressi sekä tasapainotila ja näihin johtavat tekijät (kuva piirretty http://jap.physiology.org/content/jap/101/4/1011/F1.large.jpg pohjalta)

Hyödyt ja haitatAntioksidantit ovat kiistämättä elämän kannalta välttämättömiä ja terveyden osalta sitä edistäviä. Useat tutkimukset viittaavat siihen, että ihmi-sen elimistö pystyy vähentämään oksidatiivisen stressin vaikutusta ulkosyntyisten antioksidant-tien avulla, mutta toisaalta on viitteitä siitä, että kaikilla ulkosyntyisillä antioksidanteilla tätä ominaisuutta ei ole, esimerkiksi β-karoteeni tai tokoferoli. Lisäksi on näyttöä siitä, että lisäravin-teina nautitut antioksidantit voivat johtaa jopa li-sääntyneeseen kuolleisuuteen sekä osa antioksi-danttivalmisteista voivat suurina määrinä toimia

pro-oksidantteina lisäten oksidatiivista stressiä. (Poljšak B. ja Fink R. 2014.) Toisaalta tätä joh-topäätelmää voidaan kyseenalaistaa, koska ko. tutkimuksessa tarkastellaan asiaa vain yhden an-tioksidanttityypin osalta. Tällöin elimistön anti-oksidanttien ja solutason holistinen toiminta jää huomioitta.

Tutkimukset osoittavat, että antioksidantit kiih-dyttävät syöpäsolujen proliferaatiota estäen kas-vurajoitegeeni p53:n ekspressiota. Ne aiheuttavat syöpäsolujen transkriptioprofiilissa hyvin pieniä muutoksia, jotka aiheuttavat endogeenisten an-tioksidanttien tuotannon vähenemistä. (Sayin V.

575

I. ym. 2014.) Mielestämme tämä johtopäätelmä on kyseenalainen, koska koe-eläimenä käytettiin hiirtä, jonka biokemialliset prosessit eivät vastaa täysin ihmistä. Lisäksi tutkimuksessa käytettiin vain kahdentyyppistä lisäravinteena annettavaa antioksidanttia (E-vitaamini ja N-asetyylikyste-iini), joiden biokemialliset ominaisuudet eivät ole täysin samanlaisia kuin luonnollisten antiok-sidanttien. Esimerkiksi E-vitamiini on rasvaliu-koinen, mikä tekee siitä vaikeasti virtsaan erit-tyvän ja tämän vuoksi se saattaa toimia pitkään säilyvänä pro-oksidanttina.

Fyysisen rasituksen aikana lihasten lisääntynyt hapenkulutus aiheuttaa ROS:n määrän kasvua ja kasvavaa oksidatiivista stressiä. Solut reagoivat tähän tuottamalla lisää antioksidanttientsyymejä, jolloin on kyseenalaista kannattaako antioksi-danttivalmisteita nauttia etenkään rasituksen ai-kana tai ennen sitä, koska ne heikentävät ROS:n signaloimaa endogeenisten antioksidanttien lisääntynyttä tuotantoa. Kuitenkin pitkään kes-tävän ja erityisen raskaan fyysisen harjoittelun aikana antioksidanttivalmisteiden on todettu olevan hyödyllisiä, koska kehon oma tuotanto ei riitä vastaaman tarpeeseen, mutta kohtuullisen rasituksen aikana itse liikuntaa voidaan ajatella antioksidanttina. (Gomez-Cabrera ym. 2008.) Lisäksi käsittääksemme lisäravinteina käytettä-viin antioksidantteihin liittyy myös toinen olen-nainen ongelma; Antioksidantit reagoivat ilman hapen kanssa hapettuen, jolloin ne menettävät antioksidatiivisen vaikutuksensa, minkä jälkeen ne voivat toimia kehossa pro-oksidantteina ha-pettaen elimistön solurakenteita.

Lähteet

Chatterjee A. (2013): Reduced glutathione: a radioprotector or a modulator of DNA-repair activity?, Nutrients. 2013 Feb 7;5(2):525–42.

Gomez-Cabrera M. C, Domenech E, Viña J. (2008): Moderate exercise is an antioxidant: upregulation of antioxidant genes by training. Free Radic Biol Med. 2008 Jan 15;44(2):126–31.

Kairisalo M. (2010): Oxidative stress and XIAP signalling in neuronal cells. Helsingin yliopisto, farmasian tiedekunta. Saatavissa https://helda.helsinki.fi/handle/10138/19079.

Kardeh S, Ashkani-Esfahani S, Alizadeh A. M. (2014): Paradoxical action of reactive oxygen species in creation and therapy of cancer. Eur J Pharmacol. 2014 Jul 15;735:150–68.

Leeuwenburgh C, Heinecke J.W. (2001): Oxidative stress and antioxidants in exercise. Curr Med Chem. 2001 Jun;8(7):829–38.

Le Lay S, Simard G, Martinez M. C, Andriantsitohaina R, (2014): Oxidative Stress and Metabolic Pathologies: From an Adipocentric Point of Vie. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:908539.

Murray R. K, Bender D. A, Botham K. M, Kennelly P. J, Rodwell V. W, Weil P. A. Harper’s Illustrated Biochemistry. 29th edition. McGraw-Hill, 2012. s. 543–547, 664–665

Poljšak B, Fink R, (2014): The Protective Role of Antioxidants in the Defence against ROS/RNS-Mediated Environmental Pollution. Oxid Med Cell Longev. 2014;2014:671539.

Rajendran P, Nandakumar N, Rengarajan T, Palaniswami R, Gnanadhas E. N, Lakshminarasaiah U, Gopas J, Nishigaki I. (2014): Antioxidants and human diseases. Clin Chim Acta. 2014 Sep 25;436C:332–347. doi: 10.1016/j.cca.2014.06.004.

Rizzo A. M, Berselli P, Zava S, Montorfano G, Neqroni M, Corsetto P, Berra B. (2010): Endogenous antioxidants and radical scavengers. Adv Exp Med Biol. 2010;698:52–67. doi: 10.1007/978–1–4419–7347–4_5.

Sayin V. I, Ibrahim M. X, Larsson E, Nilsson J. A, Lindahl P, Bergo M. O. (2014): Antioxidants accelerate lung cancer progression in mice. Sci Transl Med. 2014 Jan 29;6(221):221ra15. doi: 10.1126/scitranslmed.3007653.

http://www.benbest.com/lifeext/oxidate.gif -kuvaa mukaillen piirretty oma kuva (kuva 1). 28.8.2014

http://jap.physiology.org/content/jap/101/4/1011/F1.large.jpg mukaillen piirretty oma kuva (kuva 3), 11.9.2014

576