1.4. VITAMINAS

En peces, las funciones primarias de las vitaminas son similares a las cumplidas en otros animales. En su mayoría, las vitaminas del complejo B son requeridas para metabolizar carbohidratos, proteínas y grasas y las liposolubles (A,D,E y K) aportan configuraciones únicas a precursores de moléculas irremplazables en química biológica. El ácido ascórbico o vitamina C es esencial sólo para humanos, primates, cobayos y peces. El inositol y la colina son componentes estructurales de ciertos tejido especializados.

La Tabla 1.3. contiene una recopilación personal del rango de los niveles de suplementación recomendados por diversos autores. En muchos de los casos, el requerimiento no ha sido objetivamente determinado y son más bien derivaciones de las exigencias determinadas en otras especies. Además, en todos los casos, ignora el aporte de vitaminas que hacen los macro-ingredientes del alimento

Tabla 1.3. Niveles de suplementación vitamínica recomendados

Ingrediente mg/kg dieta seca

Salmón Trucha Carpa

Tiamina 10–15 10–12 2–3

Riboflavina 5–25 20–30 7–10

Piridoxina 10–20 10–15 5–10

Pantotenato 40–50 40–50 30–40

Niacina 150–200 120–150 30–50

Ácido fólico 6–10 6–10  

B12 0.015–0.020    

Mio-inositol 300–400 300–400 200–300

Colina 600–800   500–600

Biotina 1–1.5 1–1.5 1–1.5

Vit. C 100–150 100–150 30–50

Vit. A (U.I.)   2,200–2,500 1,000–2,000

Vit. E (*) 40–50   80–100

Vit. D   1,000  

(*) Requerimiento dependiente de la cantidad y tipo de la grasa insaturada contenida en el alimento.

En vitamina C, también se usa megadosis, lo que es aparentemente un absurdo debido a su extrema solubilidad, lo que hace que toda cantidad excedentaria se pierda de inmediato. Lo interesante es que en este caso, lo que se busca de la vitamina es su acción anti-stress, situación a que se son muy expuestos los salmones por haber sido sólo recientemente sometidos a cautiverio. Para enfrentar ese riesgo, conviene mantener literalmente pasando por el cuerpo de los salmones un torrente de vitamina C, para tener el organismo activado cuando sobrevenga una emergencia.

En vitamina C, también se usa megadosis, lo que es aparentemente un absurdo debido a su extrema solubilidad, lo que hace que toda cantidad excedentaria se pierda de inmediato. Lo interesante es que en este caso, lo que se busca de la vitamina es su acción anti-stress, situación a que se son muy expuestos los salmones por haber sido sólo recientemente sometidos a cautiverio. Para enfrentar ese riesgo, conviene mantener literalmente pasando por el cuerpo de los salmones un torrente de vitamina C, para tener el organismo activado cuando sobrevenga una emergencia.

3. ESPECTROFOTOMETRIA DE ABSORCION MOLECULAR ULTRAVIOLETAVISIBLE

Por:Sergio Valladares

Merck Química Chilena Soc. Ltda.

3.1. INTRODUCCIÓN

La espectrofotometría de absorción molecular ultravioleta visible, comúnmente llamada espectrofotometría UV-VIS, tiene una larga y continua historia en el campo de la química analítica. Esta técnica está basada en la medición de absorción de radiación U.V. o visible por determinadas moléculas. La radiación correspondiente a estas regiones del espectro electromagnético provocan transiciones electrónicas a longitudes de ondas características de la estructura molecular de un compuesto.

3.2. CONCEPTOS BÁSICOS DE ESTRUCTURA MOLECULAR

Toda consideración de la estructura de las moléculas debe comenzar con un estudio de los “enlaces químicos”, las fuerzas que mantienen unidos a los átomos en una molécula.

Enlace iónico:el enlace iónico es un enlace que se forma por la transferencia de uno o más electrones de un átomo o grupo de átomos.

 

Enlace covalente: se forma cuando dos átomos comparten uno o más pares de electrones. La mayoría de estos enlaces abarcan dos o tres pares de electrones. Así dos átomos forman un enlace covalente simple cuando comparten un par de electrones; un enlace covalente doble, dos pares de electrones y un triple

enlace tres pares de electrones.  CH3 - CH3; CH2 = CH2; CH = CH

3.3. ORBITALES MOLECULARES Y ENLACE QUÍMICO

Las distribuciones espaciales de los electrones en las moléculas se denominan orbitales moleculares (O.M.) y de una manera simple se puede suponer que el orbital molecular es la suma de los orbitales atómicos (O.A.) enlazantes y que el número de orbitales resultante es igual al número de orbitales utilizados en la combinación.

«Cuando se combinan dos O.A. resulta un orbital molecular de enlace de baja energía y un orbital molecular antienlazante de alta energía ».

O.A. sigma (σ):en las moléculas orgánicas está asociado con el enlace simple. Resulta del solapamiento frontal de dos orbitales atómicos.

  O. Molecular σ enlazante ; O. Molecular σ* antienlazante.

O.A. pi (π):el doble enlace en las moléculas orgánicas contiene dos tipos de orbitales moleculares, un orbital σ y un orbital π.

 Los orbitales moleculares π resultan del solapamiento lateral de orbitales atómicos π.

  O. Molecular π enlazante ; O. Molecular π* antienlazante.

Además de los electrones σ y π, muchas moléculas orgánicas contienen electrones que no forman enlaces. Estos electrones no compartidos se representan en el símbolo η.

Figura 3.1. Transiciones electrónicas entre orbitales σ, π, y η.

Tabla 3.1. Características de transiciones electrónicas entre orbitales σ, π y η

Transición λ (nm) ξ (L mol4cm-1) Ejemplo

σ → σ* <200 - Hidrocarburos saturados

π → π* 200–500 104 Alquenos, alquinos aromáticos

η → σ* 160–260 102 – 103 H2O, CH3OH, CH3CL

η → π* 250–600 10 – 103 Carbonilos, nitro, nitrato, carbonilo.

3.4. RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA (R.E.)

La radiación electromagnética es un tipo de energía que se transmite por el espacio a enormes velocidades. Muchas de las propiedades de la R.E. se explican convenientemente mediante la teoría ondulatoria clásica con parámetros como velocidad, frecuencia, longitud de onda y amplitud. En contraste con otros fenómenos ondulatorios, como el sonido, la R.E. no requiere un medio de transporte para su transmisión, por lo tanto se transmite fácilmente en el vacío.

La teoría ondulatoria para la R.E. no explica completamente los fenómenos asociados con la absorción o la emisión de energia radiante, para estos procesos es necesario considerar la energía radiante como un flujo de partículas discretas de energía llamados fotones o cuantos.

Estos dos conceptos se complementan muy bien (dualidad, onda partícula) y se aplican tanto al flujo de electrones como al de otras partículas elementales.

En la Figura 3.2. se ha representado el vector eléctrico en la ordenada, de una onda electromagnética.

Figura 3.2. Haz de radiación electromagnética

3.5. PARÁMETROS ONDULATORIOS

Período (p):tiempo necesario para que dos máximos sucesivos de una onda pasen por un punto.

Frecuencia (v): número de oscilaciones del campo eléctrico por segundo y es igual 1/p (1

ciclo por segundo = 1 Hertz, Hz). La frecuencia es una magnitud invariable que está determinada por la fuente de radiación.

Velocidad de propagación (V1):

velocidad a la que un frente de onda se desplaza a través de un medio, depende tanto de la densidad del medio como de v. En el vacío la velocidad de la R.E. es independiente de la frecuencia: Cvacío =2.997 × 1010 cm/s ≈ 3.0 × 1010 cm/s

Longitud de onda (λ):

es la distancia lineal entre dos máximo o dos mínimos sucesivos de una onda.

Unidades de λ

Angström Å 10-10m (rayos X; UV en el vacío)

Nanometro nm 10-9m (UV-VIS)

Micrometro μm 10-6m (IR)

Número de onda:    se define como el número de ondas por centímetro y es igual a 1/λ (cm-1).

3.6. PROPIEDADES CORPUSCULARES DE LA RADIACIÓN ELECTROMAGNÉTICA

Ciertas interacciones de la radiación con la materia requieren que la R.E. sea tratada como paquetes de energía llamados fotones o cuantos.

donde h es la constante de Planck, h = 6.63. 10-27 erg.s

3.7. ESPECTRO ELECTROMAGNÉTICO

El espectro comprende una gran variedad de longitudes de onda o energías. El siguiente esquema describe cualitativamente las principales regiones utilizadas con fines analíticos.

Figura 3.3. Propiedades espectrales, aplicaciones e interacciones de la radiación electromagnética

Energia

Numero de

onda σ

Longitud de

ondo λ

Frecuencia

ν

Tipo de radioción

Tipo de espectroscopio

Tipo de transición cuántica

kcal/mol

Electrovolts

eVcm-1 cm Hz

9.4 × 107

4.1 × 106

3.3 × 1010

3 × 10-11

1021

9.4 × 105

4.1 × 104

3.3 × 108

3 × 10-9

1019

9.4 × 103

4.1 × 102

3.3 × 106

3 × 10-7

1017

9.4 × 101

4.1 × 100

3.3 × 104

3 × 10-5

1015

9.4 × 10-1

4.1 × 10-2

3.3 × 102

3 × 10-3

1013

9.4 × 10-3

4.1 × 10-4

3.3 × 100

3 × 10-1

1011

9.4 × 10-5

4.1 × 10-6

3.3 × 10-2

3 × 101

109

9.4 × 10-7

4.1 × 10-8

3.3 × 10-4

3 × 103

107

3.8. INTERACCIONES ENTRE LA MATERIA Y LA ENERGÍA RADIANTE (E.R.)

Cuando la radiación pasa desde el vacío a la superficie de una porción de materia, el vector eléctrico de la radiación interacciona con los átomos y moléculas del medio. La naturaleza de esta interacción depende de las propiedades de la materia y puede dar lugar a la transmisión, la absorción o la dispersión de la radiación.

FENÓMENO EXPLOTACIÓN ANALÍTICA

Transmisión Indice de refracciónDispersión Reflexión. Efecto Tyndal. NefelometriaAbsorción Molecular, atómica

3.9. ABSORCIÓN DE LA RADIACIÓN

Al pasar R.E. por una capa transparente de un sólido, líquido o gas, pueden eliminarse selectivamente ciertas frecuencias como consecuencia del proceso llamado absorción. En este caso la E.R. se transfiere a los átomos o moléculas que constituyen la muestra, como resultado de ello estas partículas pasan del estado de menor energía a estados de mayor energia o estados excitados.

3.9.1 Absorción molecular

La absorción por moléculas poliatómicas, es un proceso considerablemente más complejo que la absorción atómica, ya que el número de estados de energía está muy aumentado. Aquí la energia total de una molécula está dada por:

E = Eelectrónica + Evibracional + Erotacional

Para cada estado de energía electrónica de la molécula hay normalmente varios estados vibratorios posibles y a su vez, para cada uno de éstos existen numerosos estados rotatorios. Como consecuencia el número de posibles niveles de energía de una molécula es mucho mayor que el de una partícula atómica. Es por ello que los espectros de absorción aparecen como anchas bandas.

3.9.2 Espectro de absorción

Tanto las moléculas como los átomos tienen un número limitado de niveles o estados energéticos cuantizados. Para que se produzca absorción de radiación, la energía del fotón excitante (incidente) debe igualar a la diferencia de energía entre el estado fundamental y uno de los estados excitados de la especie absorbente. Estas diferencias de energía (ΔE) son únicas, por lo tanto permiten caracterizar los constituyentes de una muestra. Para este objeto se obtiene experimentalmente una representación gráfica de la variación de la absorbancia en función de la longitud de onda.

Figura 3.4. Espectros de absorción molecular característicos

3.9.3 Medidas cuantitativas de la radiación - Ley de Beer

La Figura 3.5. esquematiza el fenómeno de absorción, aquí un haz de radiación monocromático, pasa a través de una capa de solución de b cm de espesor y que contiene una especie molecular absorbente cuya concentración es c.

Figura 3.5. Fenómeno de absorción

Como consecuencia de las interacciones entre los fotones y las partículas absorbentes, la potencia del haz disminuye de Po a P. Por lo tanto la transmitancia T de la solución es la fracción de radiación incidente transmitida (o no absorbida) por la solución según:

Según la Ley de Beer, entonces, la absorción A estará determinada por:

donde: ξ absortividad molar  b longitud de paso óptico  c concentración en moles/l

3.9.4 Medición experimental de la absorción

Según vimos en el esquema anterior la absorción es directamente proporcional a la longitud (b) de la trayectoria de la radiación a través de la solución y a la concentración (c) de la especie absorbente: A = a . b . c (con a: cte. de proporcionalidad).

Si c se expresa en moles por litro y b en cm, entonces la absortividad se denomina absortividad molar (ξ):A=ξ.b.c.

La Ley de Beer se cumple igualmente en soluciones que contienen más de una especie absorbente, siempre que no haya interacción entre dichas especies. Por tanto, para un sistema multicomponente la relación será:

AT = A1+A2+………+An

AT = ξ1bc1+ξ2bc2+………+ξnbcn

3.9.5 Limitaciones a la aplicabilidad de la Ley de Beer

Se observan frecuentemente desviaciones de la proporcionalidad entre A y c (cuando b es constante). Algunas de estas desviaciones son importantes y representan limitaciones reales de la ley. Estas son de tipo:

químico;

instrumental.

La Ley de Beer es sólo aplicable a soluciones en las que las interacciones dependientes de la concentración de las moléculas o iones son mínimas. Concentraciones “alts” alteran las absortividades molares y por lo tanto conducen a una relación no lineal entre A y c.

a) Desviaciones químicas

Cuando las especies absorbentes experimentan asociación, disociación o reacción con el solvente originan productos con características absorbentes distintas de las del analito.

Un ejemplo típico se observa con soluciones de dicromato potásico no amortiguadas, en las que existen los siguientes equilibrios:

Cr2O7+H2O ↔ 2HCrO4 ↔ 2H+ + 2CrO4-2

A casi todas las longitudes de onda los valores de ξ del ion dicromato y las dos especies de cromatos son muy diferentes.

b) Desviaciones instrumentales

Radiación policromática:

el requisito básico para el cumplimiento de la Ley de Beer es que la radiación incidente sea monocromática. Dependiendo de las características tecnológicas del sistema óptico del instrumento será más o menos accesible poder utilizar en forma práctica una radiación una radiación limitada a una sola longitud de onda.

Radiación dispersa:

la radiación dispersa suele diferir considerablemente en longitud de onda con respecto a la radiación principal; además puede alcanzar el detector sin haber pasado a través de la muestra.

3.10. APLICACIONES DE LAS MEDICIONES DE ABSORCIÓN DE RADIACIÓN ULTRAVIOLETA Y VISIBLE

3.10.1 Especies absorbentes

La absorción de radiación ultravioleta y visible por una especie M, puede considerarse como un proceso en dos etapas, la primera de las cuales corresponde a la excitación según:

M+h.v→M*

donde M* representa la partícula atómica o molecular en su estado electrónico excitado que se produce como resultado de la absorción del fotón h v. Este estado excitado tiene un breve tiempo de existencia (10-8 a 10-9 s) y desaparece a través de través de algunos de los diferentes procesos de relajación (calor).

M*→M+calor

La absorción de la radiación ultravioleta o visible, se produce por lo general como consecuencia de la excitación de los electrones de enlace; debido a esto, la longitud de onda de los picos de absorción se puede correlacionar con los tipos de enlace existentes en la especie que se estudia.

3.10.2 Explotación analítica

Identificación proximal de los grupos funcionales en una molécula.

Método bastante selectivo para el análisis cuantitativo de compuestos cuyos enlaces producen absorción.

Conviene considerar tres tipos de transiciones electrónicas que permiten explicar porqué algunas especies pueden absorber energía radiante. Estos tres tipos son:

Los electrones π, σ y η. Los electrones d y f.

Los electrones de transferencia de carga.

a) Especies químicas absorbentes que contienen electrones π, σ y η

La absorción de radiación ultravioleta y visible (200–800 nm) se restringe a un número limitado de grupos funcionales, llamados cromóforos, que contienen electrones de valencia con energías de excitación relativamente bajos.

Tabla 3.2. Caracteristicas de absorción de algunos cromóforos comunes

Cromóforo Ejemplo Disolvente λmáx (nm) εmáxTipo de

transición

Alqueno C6H13CH = CH2 n-Heptano 177 13,000 π→π*

Alquino C5H11C=C—CH3 n-Hexano178196225

10,0002,000160

π→π*--

Carbonilo

n-Heptano

  n-Hexano

186280

180

1,00016

larga

π→σ*π→π*

 π→σ* π→π*

Carboxilo

Etanol 204 41 π→π*

Amido

Agua 214 60 π→π*

Azo CH3N=NCH3 Etanol 339 5 π→π*

Nitro CH3NO2 Isooctano 280 22 π→π*

Nitroso C4H9NO Éter etílico300665

10020

-π→π*

Nitrato C2H5ONO2 Dioxano 270 12 π→π*

b) Absorción en la que participah los electrones d y f

Iones de los metales de transición

Serie de los lantánidos y actínidos

Los iones y complejos de los 18 elementos de las dos primeras series de transición son coloreados en uno de sus estados de oxidación o en todos ellos. Dependiendo las características colorimétricas del complejo; del tipo de ligando (agente complejante) y del estado de oxidación.

Tabla 3.3. Efecto de los ligantes sobre los máximos de absorción asociados con transiciones d-d

λmáx (nm) para los ligantes indicados

Ion central

Aumento de fuerza del campo de unión

6CI 6H2O 6NH3 3en(1) 6CN-

Cr (III)   736   573 462 456 380

Co (III) -   538 435 428 294

Co (II) - 1345 980 909 -

Ni (II) 1370 1279 925 863 -

Cu (II) -   794 663 610 -

(1) en = etilendiamina, un ligante bidentado.

c) Absorción por transferencia de carga

Para fines analíticos es el tipo más importante de absorción por especies inorgánicas, debido a que las absortividades molares de los picos son muy grandes (ξ < 105). Esta es una particular característica de los complejos inorgánicos denominados también, complejos de transferencia de carga.

Ejemplos:

Hierro III- ion tiocianato Hierro II - (o-Fenantrolina)

Ion triyoduro I3-

3.11. INSTRUMENTACIÓN

Los instrumentos que miden la absorción selectiva de la radiación en las soluciones se conocen con los nombres de: colorímetros, fotómetros y espectrofotómetros. Hoy en día es pertinente diferenciar los instrumentos según su sistema de detección: detectores simples (convencional) o detectores multicanal (arreglo de diodo).

Algunos de los diseños básicos de los instrumentos usados en la medición de la absorción de Energía Radiante se ilustra en el siguiente esquema:

Figura 3.6. Diagrama de bloques de diferentes tipos de instrumentos de medición de la absorción molecular

3.11.1 Breve descripción de los principales componentes de instrumentos convencionales

a) Fuente de energía radiante

Debe producir un haz de radiación cuya potencia sea suficiente para facilitar la detección y medida; debe ser estable. Ej.:

Lámpara de hidrógeno

Lámpara de deuterio.

Ambas lámparas producen un espectro continuo entre 160–375 nm y deben emplearse ventanas de cuarzo en los tubos: ya que el vidrio absorbe fuertemente en esta región del espectro electromagnético.

Lámpara de filamento de tungsteno

Es la fuente más común para la zona del visible e infrarrojo. Esta lámpara es útil para la región entre 320 – 2,500 nm.

b) Sistema selector de la longitud de onda de trabajo

(i) Fotómetro (colorímetro): este tipo de instrumentos utiliza filtros que permiten obtener bandas de radiación que abarcan un intervalo limitado de longitudes de onda (con un fotómetro no es posible obtener una banda de absorción variable en forma continua).

Región λ (nm Color filtro Color solución

380–435 Azul Amarillo

480–490 Verde azuloso Rojo

500–560 Verde amarillento Violeta

580–595 Anaranjado Azul verdoso

595–650 Rojo Verde azuloso

(ii) Espectrofotómetro: utilizan un complejo sistema óptico de selección de longitud de onda (sistema monocromador). el cual consta de variados componentes tales como:

prisma o rejilla; lentes; espejos; ranuras de entrada y salida.

Estos instrumentos pueden seleccionar longitud de onda en forma continua y en algunos casos con precisión de décimas de nm. Por lo tanto, es posible obtener en forma continua el espectro de absorción de una molécula.

c) Recipientes para la muestra

La mayor parte de las aplicaciones espectrofotométricas utiliza las muestras en solución líquida, por esta razón se requieren recipientes para colocar la muestra (celdas). La celda debe transmitir el 100% de la energía radiante en la zona espectral de trabajo.

Región U.V. =  

Celdas de cuarzo(200–2,000 nm)

Región VIS = Celdas de vidrio(350–2,000 nm)

 Algún tipo de plástico.

 

La longitud más común para el trabajo en las regiones UV-VIS es 1 cm (otras son: 2, 5 y 10 cm).

d) Detección de la radiación

Dispositivo electrónico llamado transductor que convierten la energía radiante en una señal eléctrica.

Requisitos:  • Responder a la E.R. en un amplio intervalo de λ. • Poseer elevada sensibilidad.

• Respuesta lineal. • Tiempo de respuesta rápido, etc…Detectores de fotones:  • Celdas fotovoltaicas. • Tubos fotomultiplicadores.• Fototubos. • Diodo de silicio.

e) Procesadores de señales e instrumento de lectura

Dispositivo electrónico que amplifica la señal eléctrica generada en un detector. En este sentido existe una amplia gama de alternativas, desde galvanómetros hasta avanzadas computadoras.

Figura 3.7. Componentes y materiales de los instrumentos espectroscópicos

3.11.2 Esquema general de los sistemas ópticos de espectrofotómetros

Figura 3.8. Sistema con arreglo de diodo mono haz

Figura 3.9. Sistema convencional doble haz

3.12. ANÁLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO

3.12.1 Técnicas cualitativas

Las aplicaciones cualitativas no ofrecen una herramienta muy útil, ya que con estos espectros existe un número relativamente escaso de máximos y mínimos. Sin embargo el análisis cualitativo es una excelente herramienta cuando va precedido de algún método de separación.

3.12.2 Análisis cuantitativo

a) Aplicación:

Compuestos orgánicos:

Aldehídos y cetonas

  Aromáticos  Drogas  Vitaminas, etc…Compuestos inorgánicos:

(especies absorbentes)

Compuestos no absorbentes → Derivatización(Por ej.: formación de complejos coloreados).

b) Principales características:

Alta sensibilidad: Absortividades molares ξ ≈ 105

Intervalos de concentración 10-4 a 10-6M.

Selectividad: selección de la longitud de onda en la que el único componente absorbente de una muestra sea la sustancia que se determina.

Precisión y exactitud: dependiendo del nivel de concentración es posible lograr valores menores que 1% de error relativo.

3.12.3 Procedimiento en el análisis cuantitativo

a) Recopilación de antecedentes:

Referencias bibliográficas. Métodos normalizados.

b) Preparación y/o tratamiento de la muestra:

Separación del compuesto de interés (precipitación, extracción por solvente, cromatografía, etc…).

Derivatización si es necesaria.

c) Selección de la longitud de onda de trabajo (λ máx.):

Obtención del espectro de absorción:

En el espectro de mono haz, se va alternando la medida de la absorbancia entre el disolvente (blanco) y la solución que contiene la muestra en la medida que se va variando gradualmente la longitud de onda.

En el espectro de doble haz, la operación descrita anteriormente es posible hacerla automática y simultáneamente.

Para ello los instrumentos disponen de sistemas con microprocesador que permiten una fácil y expedita obtención de la información. Mediante estos instrumentos es posible hacer barrido de longitudes de ondas en determinadas zonas del espectro y a diferentes velocidades.

La excepción a esto último la proporcionan los espectrofotómetros de Arreglo de Diodos ya que dada su configuración es posible obtener el espectro de absorción en un amplio rango de longitudes de onda (200–800 nm) en fracción de segundos.

Una vez establecida la longitud de λ máx. (máxima sensibilidad) se prepara la curva de calibración.

3.13. CURVA DE CALIBRACIÓN

Set de soluciones de concentraciones crecientes del analito, en un rango tal que se cumple la Ley de Beer.

« No es conveniente suponer que para una determinada concentración se cumple la Ley de Beer y por ello utilizar un patrón único como referencia ».

Una vez obtenidos los distintos puntos (o niveles de calibración) se debe determinar la ecuación de la recta mediante análisis de regresión lineal (o ajuste de la curva por mínimos cuadrados). Los instrumentos automatizados traen estas funciones ya incorporadas en su sistema de cálculo, lo cual permite obtener el resultado final directamente.

La ecuación que relaciona la absorbancia con la concentración más común es del tipo:

Y = Ax + B donde:A = pendiente (ξ)

    B = intercepto

r es un parámetro estadístico que da cuenta de la “calidad” de la curva de calibración y se denomina coeficiente de regresión. En análisis cuantitativo se considera buena una curva cuando su valor de r es mayor que 0.99.

3.14. OTRAS APLICACIONES

3.14.1 Análisis de mezclas

Definimos anteriormente que en una mezcla de sustancias absorbentes, a una misma longitud de onda las absorbancias son aditivas.

Considerando esto, es posible determinar componentes en una mezcla determinando las respectivas absorbancias a diferentes longitudes de onda.

Así tendremos:

A1 = Cxξx + Cyξy a λ1

A2 = Cxξx + Cyξy a ι2

A partir de estándares puros de las especies X e Y se obtienen, por separado los respectivos valores de las absortividades molares de X e Y. Luego quedan como incógnitas las concentraciones de X e Y a ambas longitudes de onda y se resuelve el sistema de ecuaciones.

Figura 3.10. Espectros de absorción mezcla componentes

3.14.2 Titulaciones

Las titulaciones espectrofotométricas son otras aplicaciónes mediante las cuales es posible determinar constantes termodinámicas tales como de formación de complejos metálicos, etc…

ANALISIS CLUSTER Y NIVELES DE FOSFORO TOTALEN ALGUNAS MIELES TROPICALES COLOMBIANAS

Salamanca G.G.* Serra B. J.A.**; Quijano, M.A.***

*Departamento de Química Universidad del TolimaA.A 546 Ibagué Tolima Colombia.

 **Departamento de Ciencia y Tecnología de los AlimentosUniversidad Politécnica de Valencia España

Camino de Vera S/N46022.

 ***Centro Experimental Vitivinícola Puntalarga Boyacá Colombia.

Introducción

El fósforo es un componente normal en las mieles, se encuentra principalmente bajo la forma de ésteres orgánicos y en posiblemente en forma de fitatos. El fósforo participa en los procesos metabólicos y es el responsable de la actividad de algunas enzimas, convirtiéndose en el elemento limitante de la actividad biológica.

Los nectários florales son la fuente de los nutrientes generalmente presentan contenidos de fosforo provenientes de la actividad bioquimica del sistema vascular, haciendose variable su contenido conforme a la condicion climatica predominante y el tipo de flora asociada. Como fuente de nectar para la miel es necesario indicar que los nectarios estan . en la base de las flores y son elaborados por células especializadas. Con alguna frecuencia estos nectários se presentan en el tálamo, en los pétalos, en los sépalos o en los estambres. Los nectários extraflorales se presentan por lo general en las estípulas o en los peciolos.

La producción de néctar no es continua, varia conforme a las condiciones florales de cada planta, con las condiciones climáticas, la intensidad del brillo solar y en general con las condiciones pedoclimaticas de una zona en particular. El néctar se ofrece a las abejas que liban las flores bajo formas distintas en algunos casos se hace de forma directa tal como sucede en algunas especies de Umbellifereae, en otros casos se hace bajo condiciones de intensa actividad solar como sucede en el caso de algunas Cruciferaceae, en otros casos el néctar permanece disponible a las abejas pero se mantiene oculto por cuánto sus recipientes permanecen al interior de las plantas.

Desde el punto de vista de los requerimientos, las necesidades de fósforo como fosfato oscilan entre 0.8-1.2 Kg/día. La relación entre Ca/P en los alimentos es del orden de 1. Los compuestos orgánicos de fósforo inician su metabolismo con la acción de las fosfatasas, por lo que la absorción procede vía fosfato inorgánico.

Numerosos estudios se han realizado en procura de establecer los niveles de minerales mediante espectrofotometria (Chung. 1992, Li-1995; Salamanca, 1989).). Y en general de la composicion de los alimentos, así se han adelantado por ejemplo cuantificaciones en vinos ( Gaines1990). La determinación consiste en establecer el exceso de hidróxido de sodio remanente luego de la disolución de un precipitado de molibdofosfato, mientras que en otros la determinación procede luego de la reacción entre el fósforo y una solución de vanadomolibdato, como también la reacción resultante entre el azul de heteropoliacio mediante reducción con clorhidrato de 2-4 diaminofenol y metabisulfito en unos casos, o con sulfato de hidrazina en otros.(Vargas 1994).

El ácido ascorbico igualmente ha sido utilizado como agente de reducción del fosfomolibato. El método de ácido vanadomolibdofosfórico es útil para las muestras de alimentos que contienen hasta 200 g P/l. Los procedimientos de reducción con ácido ascorbico son sensibles solamente hasta 10 g P/l pero se ven influenciados por la presencia de algunos cationes metálicos. (Salamanca,1991, Ib. 1995).

En este trabajo se presenta la metodología necesaria para la determinación cuantitativa de los niveles de fósforo Total en mieles procesadas y artesanales bajo condiciones de mayor sensibilidad y reproducibilidad analítica.

2. Sección Experimental

En el desarrollo de este trabajo se adelantaron tres fases bien diferenciadas. Una tendiente a la implementación del método y la optimización de las condiciones de trabajo, como del control de calidad de las determinaciones, la reproducibilidad, los factores de recuperación y el rango lineal de respuesta, como el volumen de muestra mínimo en las determinaciones.

2.1 Reactivos y soluciones

Se usó ácido nítrico 2N (140 ml en 1000 ml), molibdato de amonio (NH4Mo7O24.7H2O), Etanol, glicerina y cloruro de estañoso.

Las soluciones necesarias para el desarrollo del color se prepararon de la siguiente manera: 12.5 gramos de molibdato de amonio (NH4Mo7O24.7H2O) en 87.5 ml de agua destilada, a los que se les adicionó cuidadosamente 140 ml de ácido sulfúrico y agua destilada hasta completar un volumen final de 500 ml

1.25 g de cloruro estañoso SnCl2. H20 en 50 ml de glicerol necesaria para la reducción del ácido molibdofosfórico hasta azul de molibdeno de color azul. La mezcla resultante se homogeneizó durante 15 minutos en la unidad de ultrasonido Selecta (instrumentos Científicos S.A Valencia).

2.2. Procedimiento

Las soluciones empleadas en este trabajo se prepararon con agua destilada de conductividad 3.27 S/cm. Se preparó una solución madre de fósforo de 400 g/ml hasta un volumen final de 100 ml, por dilación apropiada se preparó una solución hija de 100 g/ml hasta un volumen final de 100 ml, que se utilizó para la preparación de la curva de calibración en el rango 50-400 g/l.

Las muestras de miel se homogeneizaron y luego se pesaron con exactitud 3 g de muestra que se incineración a 550 ºC hasta cenizas blancas, con incrementos mesurados en la rampa de temperatura desde 120 a 550 ºC a intervalos de 20. A todas las muestras se les adicionó 5 ml de etanol para evitar la homogeneizar el proceso de combustión en los primeros 220 ºC. Los sólidos resultantes se pesaron y disolvieron con solución ácido nítrico 2N, posteriormente se tomaron 5 ml de muestra y completó a 50 ml.

Se adicionó para el desarrollo del color 4 ml de solución ácida de molibdato de amonio y 0,25 ml de solución de cloruro estañoso.

2.3 Equipos

Los estándares de fósforo y soluciones, se determinaron usando la unidad UV/Visible CECIL Serie1000(CECIL INSTRUMENTS CAMBRIGE). Usando celdas de vidrio de 10mm de paso espectral a 690 nm. Las digestiones se realizaron en una mufla tipo P Selecta (0-1200 ºC), las operaciones de pesadas se hicieron en una balanza tipo Sartorius I-1800 (110g ± 0.1 mg)

3. Resultados y Discusión

El fósforo reacciona con el ácido molíbdico para formar azul deheteropoliacido susceptible que puede determinarse espectrofotometricamente a 690 nm. A partir de la curva típica de calibración observó un coeficiente de correlación de 0.9992, que explica el 99,84 % de las concentraciones seleccionadas en el rango lineal de respuesta. El error estándar en la determinación de la pendiente de la curva de calibración es del orden de1.83x10-5 y con P-Valor de 0.612 para la curva P < 0.01. para la anova respectivamente.

3.1 Control de Calidad

Figura 1. Curva típica de Calibración para la determinación de fósforo.

La sensibilidad de la determinación es del orden de 4.36 g/l. Una solución de 50 g/l, reproduce una absorbancia de (50±3) x 10-3 los coeficientes de Variación en nueve determinaciones sucesivas correspondieron con ( C.V.= 6.4 ), referidas a en un limite de confianza del 3.4 x10-3 para una concentración de 50 g/l. La figura 1ilustra el comportamiento de una curva de calibración típica para fósforo en el rango 50-400 g/l.

Las condiciones analíticas del sistema evaluado permite adelantar determinaciones mediante adición de estándar. La figura 2 ilustra la determinación de fósforo en una alícuota de 2 ml y sobre un volumen de 50 ml a las cuales se les adicionó solución estándar de Fósforo en el rango 50-400 g/l. El P-Valor en la pendiente de la curva por el método de adición de estándar fue 0.0183 y 0.0082 para el caso de la pendiente. El coeficiente de correlación fue 0.9999, para un r2 de 98.36 

Tabla 1. Análisis de Estándares y factores de Recuperación en la determinación espectrofotométrica de Fósforo

Muestra g/l

n Recuperación D.S Coeficientes de Variación

50 7 101.72 0.003 2.40

100 5 98.96 0.002 2.65

200 5 98.75 0.002 2.27

400 3 100.5 0.002 1.82

n. = Número de muestras. D.S. Desviación Estándar.

Figura 2. Relación general para un sistema analítico en la determinación de fósforo usando la técnica de adición de estándar.

A partir de los resultados de la tabla 1 se deduce que el método propuesto es sensible y reproducible, con bajos coeficientes de variacion entre duplicados y con la opción de trabajar bajo condiciones de adición de estándar cuando sea posible y solamente hasta rangos inferiores a 400 g/l de fósforo.

Las determinaciones espectrofotométricas finales sobre un peso de miel calcinada a 550 ºC puede lograrse conforme a la relación:

P-(mg/Kg)baseHúmeda=(1244.93*Log(100/%T)-2.3796* 0.1*FD)/Wm.

Donde Wm Corresponde al peso de la miel en Kg, FD al factor de dilución final de la alicuota seleccionada para el análisis y hasta un volumen neto de 50 ml. %T es la

transmitancia de la disolución de trabajo y 0.1 el Volumen final de los sólidos fijos disueltos en ácido nítrico 2N.

3.3 Determinaciones Analíticas

La determinación del contenido de fósforo en cada una de las muestras de miel Colombiana están en función del origen geográfico, factor que incide en la calidad y composición final del producto. Los valores promedio en las de la zona de Boyacá son ligeramente superiores a los observados en muestras de la zona de Cundinamarca y Tolima. Este comportamiento obedece principalmente al tipo de suelo. Las características edáficas de los suelos de la zona de Tundama, Sugamuxi y suelos de Boyacá en general y con relación a los de la sabana de Santafé de Bogotá y la zona montañosa del departamento del Tolima al Norte y sur respectivamente, son ligeramente mayores. El rango en cada caso muestra la naturaleza y las condiciones de variación en la composición de las mieles, lo que presupone fuentes florales diferentes.

Tabla 2. Parámetros estadísticos sobre algunos análisis de fósforo en mieles Colombianas.

 Parámetro Boyacá Tolima Cundinamarca

Máximo113.2 139.1 80.7

Mínimo20.2 4.95 6.1

Promedio66.5 57.3 42.9

D.S.23.36 41.47 25.10

Curtosis0.279 -0.595 0.700

C. Asimetría0.064 0.593 0.071

En la tabla 2 se muestran los parámetros estadísticos asociados a las determinaciones correspondientes sobre la miel de Boyacá, Cundinamarca y Tolima, mientras que la tabla 3 presenta los promedios así como los limites superior e inferior respecto de los promedios observados en cada grupo. . El error estándar se determinó a partir de la variabilidad de los promedios para cada grupo. Los intervalos se estimaron conforme al el criterio de mínimas diferencias significativas de Fisher.al 95%.

Tabla 3. Valores medios para las determinaciones de Fósforo en Algunas mieles Tropicales Colombianas

Zona n Promedio Error Estándar Limite Inferior Limite Superior

Boyacá15 66.52 9.1 53.6 79.4

Tolima27 57,3 6.7 47.6 66.9

Cundinamarca6 42.9 14.3 22.4 63.3

Total48 58.4 - - -

Desde el punto de vista del análisis multivaridado y la afinidad entre grupos, el análisis Cluster permite establecer diferencias y semejanzas entre los niveles de fósforo en mieles de diferentes procedencias, conforme a la condiciones pedoclimáticas, geográfica y apibotanica de las zonas de origen.

La figura 3 muestra el dendograma resultante de las semejanzas y diferencias en los niveles de fósforo de las mieles analizadas en el trabajo En su construcción se consideró el criterio euclidiano, promedio entre entre grupos, con estandarización de los observables.

El resultado final permite agrupar los niveles de fósforo en cinco Cluster que coinciden con las características que se muestran en la tabla 4.

Tabla 4 Características de los grupos en función de los parámetros estadísticos

Cluster n Porcentaje Mínimo Máximo Promedio D.E.

1 17 35.4 61.5 97.2 77.4 9.9

2 14 29.2 39.2 56.5 47.2 5.4

3 1 2.1 - - - -

4 12 25 4.9 29.3 15.2 8.6

5 4 8.3 126.9 139.1 139.1 5.0

Conclusiones

Se ha implementado un método analítico de con sensibilidad equivalente a 4.36 g/l. Una solución de 50 g/l, reproduce una absorbancia de (50±3) x 10-3 3 g P/Kg,

que permite estimar el contenido de fósforo en miel, que admite caracterizaciones bajo el criterio de las adiciones continuas.

Conforme a la metodología de análisis discriminante tipo Cluster, se clasificaron cinco grupos diferentes en virtud a los niveles de fósforo observados y que permiten explicar el origen geográfico botánico conforme a la similitud de la flora y las condiciones climáticas de tres zonas diferentes, la meseta cundiboyacense y la zona montañosa del Tolima y su área de influencia.

La consideración del contenido de sólidos totales y el contenido de minerales no incluidos en este trabajo, permitiría incrementar la separación geográfico y botánica de las mieles Tropicales Colombianas.

Figura 3. Cluster resultante del análisis de fósforo en algunas muestras de miel tropical Colombiana.

  Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento a la agencia Española de Cooperación y a Corporación Universidad Empresa para la Cooperación e Innovación Tecnológica COINNOVAR, por facilitar la beca soporte al profesor G.Salamanca, de la Universidad del Tolima.