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肿瘤坏死因子-α 可诱导 GSTM5 核转位

曾燕婷1, 2，李理2，袁伟锋2，郭振辉3，黄文杰1, 2

1. 南方医科大学研究生学院（广东广州  510515）2. 广州军区广州总医院呼吸内科（广东广州  510010）3. 广州军区广州总医院MICU科（广东广州  510010）

【摘要】   目的    构建稳定表达谷胱甘肽 S 转移酶 mu5（GSTM5）的人支气管上皮 16HBE 细胞株，探讨诱导

GSTM5 核转位的关键因素。 方法    构建表达 GSTM5 基因的重组慢病毒载体（PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、

PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C）并制备出相应的慢病毒，感染人支气管上皮 16HBE 细胞后，经嘌呤霉素筛选获

得细胞克隆；实时荧光定量 PCR 和蛋白印迹法（Western-blot）分别检测细胞株中 GSTM5 的 mRNA、蛋白表达水

平；以肿瘤坏死因子-α（TNF-α；10 ng/mL）刺激稳转株 0.5 h，共聚焦荧光显微镜检测 GSTM5 核转位。 结果    成功构建稳定表达 GSTM5 人支气管上皮细胞株（16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N、16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C）；荧光

共聚焦显微镜显示稳转株在 TNF-α 刺激诱导后，GSTM5 由胞浆转入胞核（核转位），以 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N 稳转株更显著。 结论    TNF-α 炎症刺激可诱导 GSTM5 人支气管上皮细胞株中 GSTM5 发生核转位，可能

与其 N 端含有非经典核定位信号密切相关。

【关键词】  谷胱甘肽 S 转移酶 mu 5；重组慢病毒表达质粒；16HBE；核转位；肿瘤坏死因子-α

GSTM5 Nuclear Translocation induced by tumor necrosis factor-α

ZENG Yanting1, 2, LI Li2, YUAN Weifeng2, GUO Zhenhui3, HUANG Wenjie1, 2

1. Postgraduate Institute of Southern Medical University, Guangzhou, Guangdong, 510182, P.R.China2. Department of Respiratory Medicine, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou, Guangdong 510010,P.R.China3. Department of MICU, Guangzhou General Hospital of Guangzhou Military Command, Guangzhou, Guangdong 510010, P.R.China

Corresponding author: HUANG Wenjie, Email: huangyelu1029@vip.163.com

【Abstract】 Objective    To establish 16HBE cell lines stably expressing glutathione S-transferase mu 5 (GSTM5)gene, and explore the mechanism of GSTM5 nuclear translocation. Methods    Recombinant lentiviral expression vectorcontaining GSTM5 gene was constructed and lentivirus was produced. After lentivirus infection of 16HBE cells, 16HBE-GSTM5 cell lines were obtained by screening with puromycin. Expression of GSTM5 in different cells was examined byRT-qPCR and Western blot. The nuclear translocation of GSTM5 was observed by confocal laser scanning microscope,after the 16HBE-GSTM5 cell lines were treated with tumor necrosis factor-α (TNF-α; 10 ng/mL) for 1 hour. Results   lentiviral expression plasmid PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C, PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N were constructedand lentiviral particle were successfully packed. After infected with lentivirus and screened by puromycin, 2 cell lines:16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C were obtained. GSTM5 expression in these two cell lines wassignificantly higher compared with the control group and parental cells. After treated with TNF-α for 0.5 hour, the nucleartranslocation of GSTM5 in 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N was much more obviously than that in 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C. Conclusion    The N-terminal region of GSTM5 is critical for nuclear translocation induced by TNF-α, whichis mediated by a novel and non-classical nuclear localization signal.

【Key words】 Glutathione S-transferase mu 5; Recombinant lentiviral expression vector; 16HBE; Nucleartranslocation; Tumor necrosis factor-α

急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一个具有复杂

病理和发病机制的危重症临床综合征，其本质是肺

部过度失控的炎症反应[1]。过度炎症反应引发氧化

 

  DOI：10.7507/1671-6205.201611031基金项目：国家自然科学基金面上项目（编号：81370173），国家自然科学基金面上项目（编号：81070003），由广东省老年感染与器官功能支持重点实验室、广州市老年感染与脏器功能支持重点实验室资金支持通信作者：黄文杰，E-mail：huangyelu1029@vip.163.com

中国呼吸与危重监护杂志 2017年7月第16卷第4期 • 1 •

应激状态，诱导细胞内源性活性氧（ROS）的生成量

剧增，超过机体抗氧化系统的清除能力，使机体处

于进行性加重的氧化应激状态，导致肺结构细胞损

伤[2]。谷胱甘肽 S 转移酶（glutathione-S-transferase，GST）与谷胱甘肽结合，是具有多种功能的催化氧

化还原反应的酶超家族，与其他抗氧化酶在细胞内

共同起到清除活性氧，保护细胞免受氧化损伤的作

用[3]。谷胱甘肽 S 转移酶 mu 5（GSTM5）是 GST 家族的成员。本研究小组前期对炎症诱发的氧化应

激调控的研究发现，TNF-α 可诱导人气道上皮细胞

16HBE 细胞 NOX1 转录及表达明显上调[8]。GSTM5这种酶活性以外的生理功能激起了我们的兴趣。

本研究拟构建人 GSTM5 基因的慢病毒表达载体及

稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株，并观察

TNFα 刺激模拟的细胞炎症状态下 GSTM5 核转位

情况，为后续研究 GSTM5 的转录调控功能奠定

基础。

1    材料与方法

1.1    材料

16HBE、293T 细胞、Stbl3 菌种由广州军区总医

院医学实验科细胞库提供；北美胎牛血清、DMEM高糖培养基、胰酶、谷氨酰胺（Gln）购于 gibico 公司；重组人 TNF-α 购自美国 Pepro Tech 公司；

BCA 法蛋白浓度测定试剂盒、逆转录试剂、PCR、

Real-time qPCR 相关试剂购自 TaKaRa 公司；引物

由上海英潍捷基公司合成。慢病毒系统（含表达载

体 plvx-puro-3*Flag-SBP、plvx-puro-MCS-SBP-3*flag和 2 种包装质粒 psPAX2、Pmd2.G、慢病毒包装专

用促转染试剂 FItran 购于辉骏生物；限制性内切

酶 BamHI 与 XbaI、EcoRI、NotI、T4 DNA 连接酶购

自 Thermo Scientific 公司；ClonExpress II One StepCloning Kit 连接酶购自诺唯赞公司；质粒提取和

凝胶回收试剂盒为 Qiagen 公司产品。Trizol 试剂、

转染试剂 Lipofectamine 2000 和嘌呤霉素购自

Invitrogen 公司；ECL 荧光底物试剂盒购自美国

Pierce 公司。抗 flag-FITC 荧光抗体（ab106221）、抗

GSTM5 抗体（ab112918）购自 abcam。

分组：c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、

d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C。稳转株分组

A：16HBE；B：16HBE-SBP-3*flag；C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N；D：16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C。

1.2    方法

1.2.1    重组慢病毒表达质粒    PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C 及慢病毒制备：根据 GSTM5（NM_000851）基因序列

设计引物，序列见表 1，以 16HBE 总 RNA 为模板，

使用 PrimeSTAR 高保真酶扩增 GSTM5 基因片段。

使用微量琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收 PCR 产物。空载体 PLVX-puro-MCS-SBP-3*flag 与引物

Gstm5-F2、R2 的 PCR 中的目的基因片段条带和酶

切后的载体条带，回收纯化，用 T4 DNA 连接酶连

接载体和目的基因片段，以得到重组慢病毒载体

c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N。

空载体 PLVX-puro-3*flag-SBP 与引物 Gstm5-F、R 的 PCR 产物进行双酶切（BamHI 与 XbaI）后使用

ClonExpress II One Step Cloning Kit 无缝连接以得

到重组慢病毒载体 d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C。将 10 μl 连接产物加入至 100 μl Stbl3 感受态细胞（氯化钙法制备）中完成连接产物的转

化。将菌液均匀涂布于含 Amp 抗生素（100 μg/ml）的 LB 平板上，24 h 后，挑取数个菌落，PCR 检测目

的基因表达。取 10 ul PCR 产物点样到 1% 凝胶电

泳，对照 Marker 大小，选取正确的菌落摇菌，测

序。并以双酶切（XhoII、SpeI、EcoRI、BamHI）鉴定

所构建的 2 个载体。

1.2.2    慢病毒包装    293T 细胞在含 10% 灭活胎牛

表 1    引物序列 

引物 序列（5’-3’） 酶切/无缝连接 连接载体 酶切验证

GSTM5-F GGTACCGCGGGCCCGGGATCCCATGCCCATGACTCTGGGGTAC

BamHI 与 XbaI 酶切载体后无缝连接 PLVX-puro-3*flag-SBP XhoII、SpeI

GSTM5-R TACCCGGTAGAATTATCTAGACTATTTGCTGTTCCATGTAGCTG

GSTM5-F2 TTCGAATTCGCCACCATGCCCATGACTCTGGGGTAC

EcoRI 与 NotI 酶切后 T4 DNA 连接酶连接

PLVX-puro-MCS-SBP-3*flag EcoRI、BamHI

GSTM5-R2 CGAGCGGCCGCCTTTGCTGTTCCATGTAGCTG

测序引物 CMV-F CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG

测序引物 PGK3 ACTTGTGTAGCGCCAAGTG

• 2 • Chinese Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Jul. 2017, Vol. 16, No.4

血清的 DMEM 培养基中，置于培养箱 37 ℃，5%CO2 培养。待细胞生长成均匀单层细胞并达 90%以上聚集度时传代接种于 1 0 c m 细胞培养皿，

5×106/皿（总共 10 ml 完全培养基）。24 h 后待细胞

密度达 70%~80% 时即可用于分盘到 150 mm 细胞

培养盘。包装当天，即分皿 24 h 后，给 293T 细胞

换上 20 ml 无抗培养基 DMEM+10% FBS+4 mmol/LGln，37 ℃、5% CO2 培养箱培养 2 h。27 μg 的慢病

毒质粒和 2 个辅助质粒加入 1 ml 的生理盐水中轻

柔颠倒混合，静止 5 m i n 后并加入质粒 2 . 5 ~3 倍转染试剂 Polyethylenimine，室温静置孵育

20 min 后缓慢均匀滴入 150 mm 培养皿中，适当摇

匀；此时记为转染开始时间。转染 4~6 h 后换液，

吸取适量 PBS 轻轻漂洗细胞 1~2 次，换上培养基

DMEM+10% FBS+4 mmol/L Gln，1% P/S。1.2.3    病毒收集    转染后 48 h 和 72 h 分别收集上

清，1 000 r/min 离心 5 min，取上清用 0.45 μm 微孔

滤器过滤。4 ℃，25 000 g 超高速冷冻离心机高速

离心 2 h，弃上清，病毒沉淀用 1 ml PBS 充分溶解，

分装为 100 ul/管。滴度测定后 –80 ℃ 冰箱保存。

切勿反复冻融，每次冻融大约有 10% 的损失。48 h收集的上清可先置于 4 ℃ 冰箱保存。

1.2.4    16HBE-GSTM5 稳转株感染、筛选    16HBE细胞传代，取 5×106 /孔的密度接种至 6 孔板，接种

4 个孔待 16HBE 细胞贴壁汇合度为 40%~50% 后进

行感染；感染前，每孔细胞换成无双抗 1 000 μl新鲜的 DMEM 完全培养基含（10 μg/ml polybrene），提高逆转录病毒感染细胞的效率，放置于培养箱孵

育 1 h。取 2 孔细胞分别加入上述制备的 2 种 GSTM5慢病毒上清液 1 000 μl，第 3 孔细胞加 1 000 μl 的空

载慢病毒上清液，第 4 孔做空白细胞对照，充分的

摇匀后放入 37 ℃、5% CO2、95% 相对湿度的培养箱

中培养。感染 6 h 后换成新鲜的 DMEM 完全培养

基+1% P/S，待细胞生长至 80% 融合度时，加入

1 μl 的 Puromycin（终浓度 4 μg/ml）进行药筛。每天

更换含 P u r o m y c i n（2 μ g / m l）完全培养基，直

至空白细胞全部凋亡。每次更换细胞培养基均

需要加入原药物浓的一半来维持细胞生长，即

Puromycin 的终浓度为 2 μg/ml。扩增培养后液氮

冻存。至此，筛选得到稳转株 B：16HBE-SBP-3*flag，C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，D：

16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 。1.2.5    RT-qPCR 检测 GSTM5 基因表达水平    取上

述 3 株细胞及正常 1 6 H B E 细胞铺板后按 l i f etechnology 公司提供的 Triozol 使用说明抽提

RNA，紫外分光光度计测定 RNA 浓度后去基因组

DNA，逆转录合成 cDNA。采用 RT-qPCR 两步法

定量分析各组细胞 GSTM5 基因 m RNA 表达水平，

引物序列见表 2。反应条件：反应条件：预变性 95 ℃3 min；变性 95 ℃ 10 s、退火 60 ℃ 34 s、延伸 72 ℃30 s，共进行 45 个循环。循环结束后从 60 ℃ 升高

到 98 ℃ 获取熔解曲线。结果采用公式：–∆CT=–【Mean（检测基因 CT 值）–Mean（内参基因 CT值）】，–∆∆CT=–（GSTM5 组 ∆CT–对照组 ∆CT），

相对表达量 RQ=2–∆∆CT。

1.2.6    Western-blot 验证    3 株稳转株及正常

16HBE 分别提蛋白后用 BCA 法测定蛋白浓度，根

据定量结果，每个样本取 20 μg 上样，SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后分次孵育抗 flag 抗体、GSTM5 抗体。

1.2.7    细胞爬片制作、共聚焦显微镜检测    3 株稳

转株及正常 16HBE 分别传代后制作细胞爬片，传

代后 24 h 更换含 TNF-α（10 ng/mL）不含血清

DMEM 培养基，0.5 h 后固定细胞，孵育抗 flag-FITC 荧光抗体（ab106221），莱卡共聚焦显微镜观

察 GSTM5 核转位。

1.3    统计学处理

¹x § s应用 SPSS 20.0 软件进行统计学分析，计量资

料以均数±标准差（ ） 表示。数据均进行方差

齐性检验，组间均数比较采用单因素方差分析

（One-way ANOVA）。方差齐时多重比较采用 LSD检验法，方差不齐时多重比较采用 Dunnett′s T3 检验法，P<0.05 为差异有统计学意义。

2    结果

2.1    一般情况

表 2    qPCR 引物 

基因名称 Genbank ID 引物序列（5’-3’） 扩增长度

GAPDH（内参） NM_002046 Forward: GAAGGTGAAGGTCGGAGTC 226 bpReverse: GAAGATGGTGATGGGATTTC

GSTM5 NM_000851 Forward: CCATCCTGCGCTACATTGC 111 bp

Reverse: CCAGCTCCATGTGGTTATCCAT

中国呼吸与危重监护杂志 2017年7月第16卷第4期 • 3 •

成功构建表达 GSTM5 慢病毒表达载体。结果

见图 1。以核酸内切酶双酶切载体 PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C ，凝胶电泳后均呈现 2 条条带。结果见

图 2。2.2    RT-qPCR 检测

A、B、C、D 组细胞株中 GSTM5 基因表达水

平。结果显示，与 16HBE-SBP-3*flag、16HBE 相比

较，16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 细胞中，GSTM5-mRNA 表达水平显

著上升（P<0.01），而 GSTM5 表达水平在 16HBE-SBP-3*flag 和 16HBE 细胞中的差异无统计学意义

（P>0.05）。结果见图 3。2.3    16HBE-GSTM5 稳转株中 GSTM5 蛋白表达水

平分析

Western Blot 检测结果显示，经灰度值分析，四

组细胞的 GSTM5 相对表达量分别为 0 .056 9，0.049，0.483 7，0.601。稳转株 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 细胞中，

GSTM5 蛋白表达水平显著高于 16HBE、16HBE-SBP-3*flag。而后两者之间 GSTM5 表达无明显差

异。结果见图 4。2.4    共聚焦显微镜检测

G S T M 5 的人支气管上皮细胞株 1 6 H B E -GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C，及空载体细胞株 16HBE-SBP-3*flag 的细胞爬

片，经共聚焦显微镜观察，所有细胞呈现绿色荧

光，表明慢病毒介导的 GSTM5-flag/flag 基因都已整

合于全部 16HBE 细胞中。16HBE-SBP-3*flag 细胞

株核内外均较强绿色荧光表达，而另外两组核内无

绿色荧光。经 TNF-α 刺激后，相比 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5，16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N 细胞株

核内绿色荧光表达较强，GSTM5 核转位较多，其中

箭头所指细胞为典型的核内有绿色荧光细胞，代表

GSTM5-flag/flag 核转位。结果见图 5。

3    讨论

急性肺损伤（ALI）的病理生理过程是炎症反应

与氧化应激过度激活的过程，而且炎症反应与氧化

应激密切相关[5]。炎症失衡诱发了氧化相关基因的

过度表达及活性氧过量生成，继发氧化应激损伤，

加重了肺结构细胞凋亡[6, 7]。在探讨 TNF-α 诱导肺

 

 图 1     GSTM5 慢病毒表达载体结构图

 

 

1 143

 图 2     经核酸内切酶双酶切 GSTM5 慢病毒表达载体凝胶

 

 图 3     RT-qPCR 检测 GSTM5-mRNA 表达变化

 

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泡 Ⅱ 型上皮细胞的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧

化酶 1 （NADPH oxidase 1，Nox1）基因转录调控过

程中，发现 TNF-α 刺激后，肺泡 Ⅱ 型上皮细胞内

Nox 家族及 ROS 表达明显上调[8]，同时 GSTM5 表达上调，并从胞浆转移入胞核，与 Nox1 启动子结

合[4]。GSTM5 属于 GST 家族，具有催化氧化还原反

应的活性 [3]，我们前期研究也证实 GSTM5 能影响

P38、NF-κB 等激酶活化，参与细胞炎症反应、凋亡

等生理过程的调节 [9]。我们推测，在 ALI 的发生、

发展过程中，GSTM5 对炎症反应及其继发的氧化

应激过程有具有调控作用，其机制与 Nox 基因表达

密切相关。GSTM5 对氧化应激的调控需要其发生

核转位，但 GSTM5 没有核定位信号，第一种解释

是 GSTM5 可能与其他有核定位信号的分子发生相

互作用后核转位，第二种是 GSTM5 含有非经典的

核定位信号。其是否能在炎症刺激诱导下入核（核

转位），是研究其非酶学（转录）活性的关键。

为了使 GSTM5 基因能够在 16HBE 细胞核中稳

定表达，本实验构建慢病毒介导的稳定表达

GSTM5 的人支气管上皮细胞株。相比其它方法，

慢病毒感染因具有随机整合到细胞基因组的特性，

细胞株的建立更容易，荧光素酶基因的表达更稳

定[10]，还能确保携带的外源基因不发生改变。慢病

毒另一优点是可以同时感染有分裂能力细胞和无

分裂能力细胞，是基因治疗载体的理想方案[11]，保

证了其在在多种细胞中的应用。本研究所构建的

稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株，经酶

切、RT-qPCR、WB 验证，从基因、蛋白方面均证明

稳转株构建成功，可用于下一步研究 GSTM5 结构、功能、相互作用蛋白等实验。另外，所构建的

载体中有 SBP、3*flag 标签，可用于后续的串联亲和

纯化 TAP-MS，以便分析 GSTM5 的相互作用蛋白，

为探究其功能提供基础。

本实验构建慢病毒介导的稳定表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株，经 TNF-α 刺激诱导后，荧光

共聚焦显微镜显示 C、D 两组细胞株所表达的

GSTM5 都有不同程度的入核。当标签位于 GSTM5的 C 端（N 端游离）时（C 组 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N），其核内荧光强度较另一个稳转株（D 组16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C）大，提示 GSTM5 的

 

 图 4     16HBE-GSTM5 稳转株 GSTM5 蛋白表达水平分析

 

 

 图 5     GSTM5 表达及核转位荧光共聚焦显微镜检测

 

中国呼吸与危重监护杂志 2017年7月第16卷第4期 • 5 •

核转位与 N 端结构域密切相关。当标签位于

GSTM5 的 N 端时入核减少，可能与 GSTM5 的 N端序列被标签封闭相关。Miho Kawakatsu 等人发

现 GSTpi 的线粒体定位序列与其 N 端相关，其

195-208aa 则对其核定位有重要作用，并证实其为

一种非经典核定位信号（NLS）[12]。经搜索 expasy 等数据库表明，GSTM5 分 N 端和 C 端结构域，分别

是 1-88aa 和 90-207aa。我们推测，GSTM5 的 N 端结构域含有非经典核定位信号，对其核转位有重要

作用。在后续的研究中，本课题组将分别构建

GV230-GSTM51-88aa-GFP 及 GV230-GSTM5 90-207aa-GFP 载体，进一步研究这两个结构域对

GSTM5 的核转位影响。此外，免疫荧光实验显示，

在 T N F - α 刺激诱导前后对照组细胞株（B 组16HBE-SBP-3*flag）核内外均有较强绿色荧光表达，

可能与 SBP、3*flag 标签分子量小，可自由弥散进入

细胞核相关。

综上所述，本文成功建立了慢病毒介导的稳定

表达 GSTM5 的人支气管上皮细胞株，同时证实在

TNF-α 诱导的炎症过程中 GSTM5 存在核转位，并

与其 N 端含有非经典核定位信号密切相关。本研

究发现为后续 ALI 炎症氧化失衡导致的肺结构细

胞损伤调控机制的研究奠定基础。

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12

收稿日期：2016-11-22    修回日期：2017-05-19本文编辑：梁宗国

• 6 • Chinese Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, Jul. 2017, Vol. 16, No.4