Korean Journal of Microbiology (2016) Vol. 52, No. 2, pp. 226-229 pISSN 0440-2413DOI http://dx.doi.org/10.7845/kjm.2016.6026 eISSN 2383-9902Copyright ⓒ 2016, The Microbiological Society of Korea

단 보

먹물버섯 키틴질 분해효소에 의한 인체유해성 Cryptococcus neoformans

세포벽 생성억제 및 Alternaria alternata에 기인한 생쥐의 피부알레르기의

감소

강유리 ･ 최형태*

강원대학교 자연과학대학 생화학과

Inhibition of cell wall synthesis in Cryptococcus neoformans and

decrease of skin allergy induced with Alternaria alternata in mouse

model by a chitinase from an inky cap

Yuri Kang and Hyoung T. Choi*

Department of Biochemistry, Kangwon National University, Chuncheon 24341, Republic of Korea

(Received May 9, 2016; Revised June 9, 2016; Accepted June 13, 2016)

ABSTRACT: The growth of two different fungal species, human pathogenic Cryptococcus neoformans and plant pathogenic Alternaria

alternata were inhibited by a chitinase (Chi2) expressed in the autolysing tissue of Coprinellus congregatus. The cell wall thickness was reduced (up to 32%) in C. neoformans compared with that of normal cell, and polysaccharide fibers located outside of the cell wall were

also severely removed. The hyphal growth of A. alternata on agar plate was stopped by the enzyme. The allergic inflammation induced by A. alternata was reduced by the enzyme reaction when compared with untreated control in a mouse model.

Key words: Alternaria alternata, Cryptococcus neoformans, allergy, chitinase

*For correspondence. E-mail: htchoi@kangwon.ac.kr;

Tel.: +82-33-250-8511; Fax: +82-33-259-5664

현대인의 생활특성상 실외활동보다는 실내에서 더 긴 시간

을 활동하기 때문에 실내공기가 다양한 생물학적 물질로 오염

된다면 그 피해를 고스란히 받게 된다. 또한 실외 활동, 특히 낮

은 산과 하천, 호수에서 주말을 보낼 때에도 많은 생물, 특히 미

생물들에게 노출된다. 인류에게 유익한 미생물이 대부분이지

만 일부 병원성 미생물이 존재하며, 다양한 균류들이 알레르

기의 원인이 되는데(Sharpe et al., 2015a), Alternaria 속 균은

주변 환경에 많을 뿐만 아니라 천식과 아토피의 원인이 된다

(Lyons et al., 2011; Brito et al., 2012). Alternaria 속의 진균 외

에도 Aspergillus, Cladosporium, Penicillium 속 등이 알레르기

의 원인균으로 보고되었다. 한편 사람의 중추신경계를 주로 공

격하는 Cryptococcus neoformans가 천식을 포함하는 알레르

기 원인이 된다(Arora et al., 2005). Chitin의 acetyl기가 제거된

chitosan이 C. neoformans의 세포벽 안정도와 병독성에 중요하

다고 보고되었다(Baker et al., 2011). 다양한 알레르기 중에서

아토피 증상은 가려운 피부로 인하여 결과적으로 2차 감염으

로 진행된다. 앞에 언급한 대부분의 진균들은 주로 무성포자로

번식하며 우리의 주변 환경에도 이러한 진균류의 포자가 상존

하고 있어 이러한 allergy를 예방하기는 매우 어려운 실정이다.

진균류는 매우 다양한 대사과정을 가지는데, 특히 난분해

성 물질을 분해하는 능력이 뛰어나므로 자연계에서 분해자로

서 물질순환에 기여한다. 그러나 여러 가지 이유로 면역력이

저하된 사람(Immunocompromised people)을 포함하여 건강

한 사람에게까지 질병을 유발하는 것이 보고되며 항진균성

물질에 대한 관심도 크게 증가되었다. 진균류의 세포벽은 β

-1,3-glucan을 포함한 다양한 다당류와 키틴질(Chitin)로 구성

되어 있다. Chitin은 N-acetyl-glucosamine이 중합된 고분자

키틴질 분해효소에 의한 병원성 진균 억제 ∙ 227

Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 2

Fig. 1. Scanning electron microscopy of Cryptococcus neoformans. Left, control culture. Right, Chi2 added culture. Scale bar, 1 µm. Cell shape were

deformed by the Chi2 reaction, and polysaccharide fibers were also removed by the enzyme reaction.

화합물로써 곤충의 외피와 갑각류에 다량 존재하기 때문에 자

연계에 섬유질 다음으로 많이 존재한다. 따라서 균류의 생장

을 조절하는 항진균성 항생물질에 chitinase의 가능성에 대한

관심도 증가되고 있다. 균류의 chitinase 유전자를 도입한 유전

자 변형 레몬(Distefano et al., 2008)과 완두콩(Amian et al.,

2011)이 다양한 진균류의 질병에 저항성을 보였다. 또한 동물

병원성 진균류는 대부분이 이형태성(異形態性, dimorphism)

전환이 필수적인데 López-Matas 등(2000)은 이형태성의 전

환 시 chitin 함량에 변화가 있으며 chitin 양의 적절한 조절을

통하여 이형태성을 억제함으로써 병원성의 조절이 가능함을

시사하였다. Alternaria 속의 대표종인 Alternaria alternata는

식물에게 병을 유발함과 동시에 인체에 알레르기를 유발한다

(Zhao et al., 2012).

먹물버섯의 한 종류인 Coprinellus congregatus는 버섯이

생성되고 성숙되면서 갓(pileus)이 먹물처럼 녹으며, 이때 조

직세포의 세포벽이 자가분해 된다(Choi and Cho, 2005). 자가

분해 되는 자실체에서 발현되는 chitinase cDNA (chi2)를 분리

하고 이를 Pichia pastoris에서 발현하여 생성된 효소단백질의

생화학적 특성을 보고하였다(Kang et al., 2013). 이 chitinase 2

(Chi2)가 A. alternata (KCTC26781)와 F. graminearum 표준

균주(ZO3639) 및 벼에서 분리한 분리균주(ASR1R1) 등 3가

지 식물병원성 균류(Kang and Choi, 2012) 및 사람에게 질병

을 일으키는 Candida albicans와 Cryptococcus neoformans의

생장(Yoo and Choi, 2014)을 모두 억제하는 것을 보고하였다.

이 논문에서 두 가지 결과를 제시하고자 한다. 첫째, 병원성

균 C. neoformans (H99, serotype A)가 Chi2에 의하여 생장이

억제될 때 미세구조의 변화를 분석하고자 SEM과 TEM을 사

용하여 capsule 층과 세포벽의 변화를 분석하였다. 둘째, 대표

적인 allergy 원인균 A. alternata (KCTC 26781)의 생장이 고

체배지에서 억제되는가 확인하고 실제로 Chi2가 A. alternata

에 의한 피부알레르기에 대하여 예방/치료 효과가 있는지 분

석하였다.

C. neoformans 균을 YMPG (yeast extract 3 g, malt extract 3 g,

peptone 5 g, glucose 10 g, d-H2O 1 L)에 접종하고 25°C에서

배양하였으며 Chi2를 처리할 때는 배지에 7 μ/ml에 해당하

는 효소를 더하고 균을 배양하였다. 배양 48시간 후에 세포를

모아 한국기초과학지원연구원 춘천센터에서 SEM (Variable

pressure field emission SEM, SUPRA55VP, Carl Zeiss)과

TEM (Energy filtering TEM, LEO 912AB OMEGA, Carl

Zeiss)를 사용하여 미세구조를 비교하였다. 다른 실험에서는

A. alternata (KCTC 26781) 균을 PDA (potato dextrose agar)

배지에 접종하고 25°C에서 배양한 균체를 종균으로 사용하였

다. 새로운 PDA 배지 중앙(지름 7 mm)을 cork borer (#3)를 사

용하여 제거하고 동일한 크기로 자른 종균을 옮겨 접종한 후

25°C에서 배양하였다. 접종원에서 약 0.5 cm 떨어진 두 곳에

멸균된 여과지(지름 5 mm)를 올리고 배양 2일째부터 한 곳에

는 효소(5 unit)를 더하고, 다른 곳에는 효소를 제외하고 5 μg의

bovine serum albumin을 매일 더한 후 배양 5일째 균사 생장을

비교하였다.

C. neoformans의 생장은 Chi2를 더하면 10% 전후로 감소

하기 때문에(Yoo and Choi, 2014) 세포를 얻기 위하여 원심분

리 방법으로 세포를 농축하여 세포벽의 구조변화를 분석하였

다. SEM을 사용하여 세포 변화를 분석한 결과 Chi2를 더한 C.

neoformans는 대조구와 비교할 때 세포의 모양이 심하게 변형

된 것은 물론 세포벽의 섬유상 물질이 제거되었다(Fig. 1).

TEM을 사용하여 세포벽의 두께를 분석한 결과 대조구의 세

포벽 두께(386 ± 8 nm) 보다 Chi2를 처리한 의하여 세포벽 두

께(126–165 nm)가 32–42% 수준으로 감소하였다(Fig. 2). 이

처럼 세포벽 외부의 구조가 변형되고 세포벽의 두께가 감소된

것은 세포벽과 capsule 층이 병원성과 밀접한 관계가 있는 것

(Lee et al., 2012)에 근거하여 chitinase에 의하여 이들의 생장

은 물론 병원성도 감소할 것이라고 판단된다.

228 ∙ Kang and Choi

미생물학회지 제52권 제2호

Fig. 3. Determination of growth inhibition of A. alternata by Chi2. Left

plate: two filter paper discs were put at the margin of mycelium on day 1.

Bovine serum albumin (BSA, 5 µg) and Chi2 (Chi2, 5 units) were applied

every day from day 2. Right plate showed the inhibition of mycelial

growth by Chi2.

(A)

(B)

Fig. 2. Comparison of cell wall thickness of C. neoformans using transmission electron microscope. (A) normal culture; (B) Chi2 added culture. Scale bar,

1 µm (left) and 0.5 µm (right); “I”-shape bar in (A), 379 nm (left) and 394 nm (right). “I”-shape bar in (B), 126 nm (left) and 165 nm (right).

(A)

(B)

Fig. 4. Determination of Chi2 effect against allergy induced by A. alternata

using mouse model. (A) Comparison of epidermis swelling by A. alternata

and A. alternata with Chi2 on mouse ear. (B) Comparison of capillary

dilation by A. alternata and A. alternata with Chi2. The blue color of

Evans blue was reduced on left panel by Chi2 reaction.

아토피 원인균의 하나인 A. alternata가 고체배지 PDA에서

Chi2에 의한 생장 억제를 분석한 결과 균사의 생장이 억제되

었다(Fig. 3). 이는 액체배지에서 포자의 발아와 균사의 생장

이 모두 억제된 결과(Kang and Choi, 2012)와 부합된다. 이 균

의 포자현탁액(1 × 107 spores/ml) 50 μl를 1/2 PDB (potato

dextrose broth)에서 12시간 동안 발아시키고 배양현탁액을

생쥐(BALB/c mouse, 4 weeks, 20 g) 7마리 귀에 처리하고 4마

리는 포자 처리 6시간 후에 Chi2 60 unit를 더하는 전체과정을

2일에 한번씩 반복하여 수행하면서 버니어캘리퍼스를 사용

하여 귀 두께의 변화를 28일 동안 측정하였다. 처리 28일째에

생쥐의 복강에 마취제를 주입하고 꼬리정맥에 Evans blue 200

μl를 주사한 다음 1시간 후에 귀의 외형 색깔 변화를 확인하

키틴질 분해효소에 의한 병원성 진균 억제 ∙ 229

Korean Journal of Microbiology, Vol. 52, No. 2

였다. A. alternata 발아포자에 의하여 유도된 귀 두께의 증가

(최대 0.04 mm)는 Chi2를 함께 처리한 쥐의 경우(0.01 mm)

에 비하여 최대 4배까지 증가하였으며(Fig. 4A), 귀의 외형

색깔도 Evans blue 색이 더 강하게 확인되었다(Fig. 4B).

Lyons 등(2011)은 미국 어린이 914명을 대상으로 진균류에 대

한 피부반응을 분석한 결과 14%의 어린이들이 A. alternata와

Penicillium 속 균에 대하여 민감성을 나타냈고, 6%의 어린이

들이 A. alternata에 대한 반응을 보였다고 보고하였다. 미국

유아~청소년 2,849명을 포함하여 총 8,412명을 대상으로 실

내 환경에서 집먼지 진드기, A. alternata 및 A. fumigatus등에

의한 습진, 천식과 알레르기 증상에 대한 상관관계가 보고되

었다(Sharpe et al., 2015b). 이 실험에서 보고한 A. alternata 발

아포자에 의하여 생쥐에서 피부 알레르기 증상이 확인된 것은

Alternaria 속을 포함하는 진균류들이 생장에 필요한 최소의

습도를 가진 실내에서 사람들에게 천식과 아토피를 일으킬 수

있다는 보고(Sharpe et al., 2015a)와 동일하며, 이 보고에서 제

시한 chitinase가 이 병들을 치료 할 수 있는 방안이 될 수 있을

것으로 예상된다.

적 요

먹물버섯 Coprinellus congregatus의 버섯조직이 자가분해

되는 시기에 발현되는 chitinase (Chi2)는 사람에게 질병을 일

으키는 Cryptococcus neoformans의 세포벽 두께를 정상 세포

벽의 32% 수준까지 감소시킬 뿐만 아니라, 세포 외 섬유상 물

질도 제거하였다. Chi2 처리에 의하여 사람에게 알레르기를

유발하는 Alternaria alternata의 생장은 물론 생쥐 모델에서

이 균에 의한 피부알레르기 증상도 감소시켰다.

감사의 말

이 연구는 2014년도 강원대학교 학술연구조성비로 수행되

었음.

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