J Clini Hepatol, March 2011, Vol.27, No.3254

高脂饮食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎

肝纤维化模型的建立

孙林林a，石 军a，郝菁华a，任万华a，阎春英a，张 捷b，林晓燕c，崔 彬b

(山东大学附属省立医院 a.肝病中心；b.临床科研中心；c.病理科，济南 250021)

非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)是一类肝组织学改变与酒精性肝病相类似，但无过量饮酒

史，病理上表现为肝实质细胞脂肪变性、坏死、炎性细胞

浸润和脂肪蓄积等临床综合症[1]。NASH可进展为非酒精性

脂肪性肝纤维化、肝硬化和原发性肝癌[2]。目前高脂饮食

所致NASH的动物模型多有报道[3-5]，而NASH肝纤维化模型

目前尚少见报道。本实验采用改进的高脂饮食方法建立大

鼠NASH肝纤维化模型，并对模型进行检测评价，为临床

研究NASH肝纤维化的发生机制及非侵入性、特异性肝纤

维化指标的研究提供理想的动物模型，以便为NASH肝纤

收稿日期：2010-11-11 修订日期：2010-11-25基金项目：山东省博士基金计划课题(2006BS03027) 作者简介：孙林林(1983-)，女，在读硕士， 主要从事非酒精性脂肪性肝病研究。通信作者：石军，E-mail: sdshij@yahoo.com.cn

摘要：目的 建立并研究高脂肪饮食导致大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝纤维化的动物模型。方法 雄性SD大鼠60只，

随机分成正常对照组30只和模型组30只，分别给予普通饲料与高脂饲料，于第4、8、12周末将正常对照组与模型组随机处死10只。分别检测血清学指标，取肝组织做HE染色及Masson染色，应用图像分析法对Masson染色进行纤维化面积定量分析。结果 两组大鼠体重均增加，8周时肝指数明显升高，血清胆固醇及总甘油三酯8周开始与正常对照组比较差异具有统计学意义。转氨

酶不同时间点均有升高，8、12周时与正常对照组比较差异具有统计学意义。高脂饮食4周末，HE染色可见肝小叶结构完整，汇

管区见少量炎症细胞浸润，无病理性纤维化发生。8周末，达到脂肪肝的诊断标准，开始出现肝纤维化趋势。造模12周，大鼠

肝组织脂肪变程度达重度，纤维化面积增大。结论 经改良配方后，成功建立了大鼠NASH肝纤维化模型。

关键词：肝硬化，实验性；疾病模型, 动物；高脂饮食

中图分类号：R575 文献标识码：A 文章编号：1001-5256（2011）03-0254-05

Effect of high-fat diet on establishment of a rat non-alcoholic steatohepatitis/liver fibrosis modelSUN Lin-lin, SHI Jun, HAO Jing-hua, et al. (Liver Research Center, Provincial Hospital Affiliated to Shandong University, Ji'nan 250021, China)Abstract: Objective This study was aimed to establish the rat model of nonalcoholic steatohepatitis/hepatic fibrosis induced by high-fat diet. Methods Sixty male Sprague-Dawley rats(N﹦60) were divided into control group(n﹦30) and model group(n﹦30) randomly. The rats of control group were fed with common forage and those of the model group were given high-fat diet. Ten rats in each group were terminated at 4, 8 and 12 week respectively. The serum-markers were detected. The degrees of hepatic steatosis, inflammation and fibrosis were observed by HE staining and Masson staining. Masson staining was analyzed by image analysis system to achieve the fibrosis area quantitative analysis. Results The weight of Rats in both of these two groups increased. Compared to the control group, the liver index (liver weight/ body weight %), serum cholesterol, triglyceride and aminotransferase levels in the model group increased significantly after 8 weeks after which, the rats in model group were diagnosed with fatty liver disease. After 12 weeks high-fat diet, the pathological injury of the rats hepatic tissue became more and more severe, and resulted into liver fibrosis. Conclusion The rat model of nonalcoholic steatohepatitis/hepatic fibrosis has been established successfully by high-fat diet.Key words: liver cirrhosis, experimental; disease models, animal; high-fat diet

维化的防治提供理想的研究平台。

1 材料和方法

1.1 实验动物与饲料配制 选用SPF级健康雄性SD大鼠，体

重120～160 g，由山东中医药大学实验动物中心提供。实验

动物饲养于山东省立医院实验动物中心，温度(20±2)℃，

湿度40%，明暗各12 h，实验动物自由进食水。高脂饲料

(82.5%普通饲料、2%胆固醇、10%猪油、5%蛋黄粉、0.5%胆酸钠)由中国医学科学院实验动物研究所生产提供，饲料

经机器压制成条状，密封、真空25℃以下保存。普通饲料

由山东省立医院实验动物中心提供。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及方法 60只大鼠适应性喂养1周后，按

随机数字表法将动物随机分为正常对照组(n﹦30)给予普通饲

料，自由饮水；模型组(n﹦30)给予高脂饲料，自由饮水。

临床肝胆病杂志 2011年 第27卷 第3期 255

1.2.2 动物处死 分别于第4、8、12周末处死正常对照组及

模型组大鼠各10只。动物隔夜禁食，次日称量体重后，

以3%戊巴比妥钠按0.1 ml/100 g腹腔注射麻醉动物，下腔

静脉采血后，迅速取出肝脏称量。留取楔形肝脏组织标

本，面积为1.5 cm×1.5 cm，4%多聚甲醛固定，石蜡包

埋，切片，HE染色观察肝脏形态学改变；Masson染色观

察肝脏纤维化染色，软件进行纤维化半定量分析。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 一般情况、体质量及肝指数 观察大鼠生活状态、食

欲行为、毛发、动物死亡情况。处死前称量体重，麻醉

后取出肝脏，称量肝脏的湿重，计算肝指数(肝湿重/体重

×100%)。1.3.2 肝功及血清脂质变化 丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨

酸(AST)、总胆固醇(TCHO)、甘油三酯(TG)等，由全自动

生化分析仪测定。

1.3.3 肝组织病理学检测 将取下的肝组织标本用4%多聚甲

醛固定后，常规脱水，包埋，制作成5 μm厚切片，HE染色，光镜下观察。HE染色由山东省立医院病理科专家盲

法阅片，分别在低倍镜(×10)、高倍镜(×40)下观察肝组

织的病理学改变。肝细胞脂肪变性的程度判断标准参照

范建高及Elizabeth等[6,14]提出的大鼠高脂模型肝细胞脂肪变

的统计方法。炎症活动度计分参照王泰龄等[7]提出的慢性

肝炎炎症活动度计分方案。

1.3.4 肝组织Masson染色及Masson染色纤维化半定量 由山

东省立医院病理科完成。在光学显微镜下，将采集图像

输入LeicaQwinV3图像分析系统进行单位(视场)面积纤维

组织面积测量。每张切片(每例动物标本)随机选取5个区

域(视场)，用HSV颜色分割法测量单位面积内纤维组织的

面积，即每例切片共有5个数据，计算4、8、12周时对照

组与模型组大鼠肝内纤维组织面积的均值[8]。

1.4 统计学处理 计量资料采用x±s表示，采用SPSS17.0统计学软件处理数据，组间比较采用t检验。P＜0.05为差异

具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 实验过程中大鼠未发生死亡。正常对照组生

活状态良好；模型组大鼠毛发粗糙，精神萎靡，嗜睡，

动作迟缓，毛发渐黄。正常对照组大鼠肝脏表面光滑，

质软，无结节囊肿，色泽粉红，未见淤血及脂肪变性，

无明显肿大与萎缩；模型组大鼠肝脏表面光泽差，肝脏

体积增大，颜色白腻，切面有油腻感，偶见淤血及米粒

大小的结节(图1)。

2.2 体重及肝指数的变化 在造模过程中，两组的体重均

在增加。4周时，正常组与模型组体重及肝指数差异无统

计学意义。8周至造模结束时，模型组体重增加快于正常

组，差异有统计学意义，而肝指数也较模型组高，差异

具有统计学意义。继续造模至12周，体重虽都有增长，

但与对照组比较差异无统计学意义，但模型组中肝脏脂

质的沉积较前加重，且与此时正常对照组比较差异有统

计学意义(表1)。2.3 肝功及血清脂质变化 造模4周时模型组血清ALT、AST、TG、TCHO水平虽较对照组有所升高，但差异无

统计学意义。8周及12周末模型组ALT、AST较正常对

照组比较差异具有统计学意义。8至12周造模过程中，

模型组TG逐渐增高，与正常对照组比较差异具有统计

学意义。造模12周时TCHO水平虽较8周时略有回落，

但与正常对照组比较差异有统计学意义(表2)。2.4 肝组织HE染色 正常对照组大鼠肝小叶结构完整，

图1 左为模型组、右为正常对照组

表1 两组SD大鼠不同时间点体重、肝指数及平均胶原面积的变化(x±s)

注：1)与正常对照组相比，t﹦4.143～9.930，P＜0.05；2)与4周模型组相比，t﹦4.569，P＜0.05；3)与8周模型组相比，t﹦7.374，P＜0.05

时间

4周

8周

12周

组别

正常对照组

模型组

正常对照组

模型组

正常对照组

模型组

例数

10

10

10

10

10

10

体重(g)

377.221±33.256

371.900±52.282

395.730±36.170

463.901±37.4331)

478.250±45.550

538.176±85.397

肝指数(%)

2.427±0.402

2.832±0.383

2.534±0.309

3.217±0.2701)

2.653±0.412

3.272±0.5861)

平均胶原面积

0.143±0.065

0.628±0.131

0.182±0.063

1.166±0.3281)2)

0.240±0.174

3.052±0.6941)3)

J Clini Hepatol, March 2011, Vol.27, No.3256

肝细胞以中央静脉为中心，呈放射状排列，无肝细胞

变性坏死及炎症细胞浸润(图2a)。模型组4周时即有轻

微的脂肪变性，但肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数

之比值为＜1/3，肝小叶结构完整，病变的肝细胞散在

于肝小叶内，可见有嗜酸性小体，炎症细胞浸润不明

显(图2b)；8周时，大鼠肝组织光镜下见肝小叶结构紊

乱，脂肪变的肝细胞数占总细胞数的1/3～2/3，且出现

碎屑样坏死，汇管区有单核细胞浸润，窦周隙增宽，

炎症活动度计分明显高于对照组(图2c)。4～8周病变逐

渐加重，至12周时，中至重度肝细胞脂肪变性，肝细

胞肿大，胞浆内脂滴以大泡性脂肪变为主，胞核被挤

至一侧，以肝小叶周边脂肪变性最为严重(图2d)，且可

见小叶炎症，炎症细胞以单个核细胞浸润为主，可见

以中央静脉为中心的坏死条带延伸(图2e)。

注：1)与正常对照组相比，t﹦3.127～7.477，P＜0.05

表2 两组SD大鼠不同时间点肝功及血清脂质的变化(x±s)

时间

8周

12周

组别

正常对照组

模型组

正常对照组

模型组

例数

10

10

10

10

ALT(U/L)

28.100.4±7.520

48.510±7.7951)

32.300±3.401

54.000±8.5241)

AST(U/L)

104.600±10.416

139.950±42.9931)

103.600±9.789

143.200±29.6871)

TG(mmol/L)

0.853±0.303

1.490±0.5691)

0.963±0.351

2.035±0.2771)

TCHO(mmol/L)

0.990±0.149

1.674±0.4471)

0.991±0.158

1.341±0.2371)

2.5 肝组织Masson染色及Masson染色纤维化半定量 正常大鼠肝小叶结构完整，汇管区内有绿色胶原纤维染

色外，未见有染成绿色的胶原纤维，窦周隙见少量增

生的胶原纤维(图3a)。4周时肝小叶结构尚存，纤维局

图2 不同阶段HE染色观察大鼠肝脏脂肪变程度 a：正常对照组HE染色(×10)；b：４周模型组HE染色(×10)；c：８周模型组HE染色(×10)；d：12周模型组HE染色(×40)；e：12周模型组HE染色(×10)

限于汇管区，细胞呈长梭形，窦周隙内少量胶原纤维

增生(图3b)。至8周，肝小叶结构紊乱，小叶中央有

胶原纤维存在，可见明显的肝细胞坏死并纤维组织增

生，增生的胶原纤维形成细丝状分布于窦周隙内(图3c)。12周，肝小叶结构消失，窦周隙纤维增生明显，

几乎充满窦周隙，增生的纤维形成粗条索状包绕汇管

区并向肝小叶间及肝内，肝小叶中心延伸(图3d，3e)。Masson染色纤维化半定量显示模型组纤维化面积明显

增大，造模8、12周后肝组织纤维化面积与正常对照组

比较差异有统计学意义；造模8周后肝组织纤维化面积

与造模4周相比，造模12周与造模8周胶原面积相比差

异均有统计学意义(表1)。

3 讨论

近年来，我国患有肥胖、高脂血症、高血压、糖

尿病及药物性肝损害的人数逐年增加，由此引起的非

酒精性肝病(NAFLD)的发病率也成上升趋势[9]。Miele等[10]认为，脂肪性肝病是一种良性的病变，但发展为

NASH时，因其具备弥漫性脂肪浸润、小叶内炎症坏

图3 不同阶段Masson染色观察大鼠肝脏纤维化程度 a：正常对照组Masson染色(×10)；b：4周模型组Masson染色(×40)；c：8周模型组Masson染色(×40)；d：12周模型组Masson染色(×40)；e：12周模型组Masson染色(×10)

a

a

c

c

e

e

b

b

d

d

临床肝胆病杂志 2011年 第27卷 第3期 257

死、肝细胞气球样变、肝纤维化等典型病变过程，

NASH不再认为是一种良性病变，它可作为其他严重肝

病的前驱病变。尤其是NASH中发生的纤维化，因其可

导致不可逆性的肝硬化，甚至原发性肝癌，目前成为

研究的焦点[11]。然而NASH中发生纤维化的机制至今尚

未阐明，因此制备出一种制作方法简单、重复性好、

价格低廉、动物死亡率低、复制率高、病变接近于人

类疾病发生发展过程的动物模型成为研究关键。

近年来NAFLD动物模型的研究有了很大的进展，

其中单纯性脂肪肝动物模型已比较成熟，而进展期

NASH动物模型尚在探索阶段 [12]。在众多的造模方法

中，高脂饮食诱导的NAFLD的模型，在病因、病理及

发病背景方面同人类NAFLD相类似。范建高等[13]应用

基础饲料+100 g/kg猪油+20 g/kg胆固醇喂养雄性SD大

鼠，到12周时出现高胆固醇血症，中重度脂肪肝伴有

小叶内炎症，从而成功的建立了高脂饮食诱发的NASH模型。徐正婕等[14]继续用此配方造模，16周时少数造

模大鼠出现轻度的窦周纤维化，24周所有大鼠都出现

窦周纤维化，1例出现桥接纤维化。从而通过高脂饲料

喂养24周成功建立起大鼠体质量超重、高脂血症、脂

肪性肝炎伴肝纤维化模型。但其不足之处是，造模时

间长，造模24周出现NASH伴有肝纤维化；对于各个时

期的纤维化评估，只用病理切片进行观察，主观性较

大；虽与人类疾病的发生发展过程相接近，但因以上

缺点，部分限制了其应用。为缩短造模时间，对纤维

化的评估更加客观，建立实用、稳定的NASH肝纤维化

模型，现将范建高等的配方进行改良，在原有配方的

基础上加用蛋黄粉及胆酸钠，即82.5%普通饲料+2%胆

固醇+10%猪油+5%蛋黄粉+0.5%胆酸钠，加入蛋黄粉可

保证营养均衡。大鼠缺少胆囊，在饲料中加入胆酸钠

可以促进饲料胆固醇的吸收 [15]。本实验研究结果显示

高脂饮食4周后，大鼠肝脏组织HE染色可见肝小叶结构

完整，少许细胞出现脂肪变性，汇管区见炎症细胞浸

润，部分肝细胞坏死。8周后，病变较前加重，达中至

重度脂肪肝诊断标准，并可见汇管区纤维组织增生伴

有纤维条索形成，开始出现肝纤维化趋势。造模12周

后，大鼠肝组织脂肪变程度达重度，且纤维化面积增

大。肝小叶结构消失，窦周隙纤维增生明显，几乎充

满窦周隙，增生的纤维形成粗条索状包绕汇管区并向

肝小叶间及肝内，肝小叶中心延伸。Masson染色纤维

化半定量显示造模8、12周后肝组织纤维化面积与正常

对照组比较差异有统计学意义；造模8周后肝组织纤维

化面积与造模4周相比，造模12周与造模8周胶原面积

比较差异均有统计学意义。证明在造模8周时，已出现

肝纤维化趋势，12周时，肝纤维化已经形成。检测血

清脂质显示出现高脂血症，到8周时模型组与正常对照

组比较差异有统计学意义。而到12周时，甘油三酯水

平仍在增加。分析原因可能是：进入肝内的脂肪酸过

多，甘油三酯的合成超过其转运出肝脏的能力；肝内

脂肪酸β氧化障碍，脂肪酸利用减少，TG合成增加；

肝脏合成TG能力增强及脂蛋白代谢酶的活性下降。上

述因素造成过多的脂肪酸在肝细胞内沉积，从而造成

肝细胞脂肪变性[16]。另外，脂肪酸本身具有直接毒性

的作用，可引起线粒体的肿胀和通透性的增加，并通

过促进CYP2E1和CYP4A表达导致氧化应激和脂质过氧

化[17]。Deepa等[18]使用低分子量肝素对高胆固醇血症动

物模型进行干预研究，发现高胆固醇血症能够刺激动

物血液循环中产生较多的炎症因子如TNFα及脂质介导

体如血小板激活因子。TNFα是肿瘤坏死因子家族中

的重要一员，在多种细胞活动中起重要作用，在NASH肝纤维化发生中的作用机制可以概括为：①直接作用

于胰岛素信号转导系统，减少酪氨酸磷酸化；减少葡

萄糖转运体GluT4的表达及转运，从而减弱胰岛素的作

用；与过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)相拮

抗，负性调节与胰岛素敏感性有关的转录因子及脂解

作用，介导游离脂肪酸水平升高[19]。②还可作为炎性

细胞因子损伤肝细胞线粒体呼吸功能，使脂肪酸β氧

化受抑制，线粒体功能失常，体内氧自由基增加，导

致脂质过氧化，从而引起炎症和纤维化[20]。脂肪酸还

可通过枯否氏细胞而影响肝星状细胞(HSC)，共同参与

脂肪肝肝纤维化的发生[13]。HSC激活后，具有成纤维细

胞的功能，分泌胶原、纤维蛋白及各种细胞因子包括

维持炎症和炎症因子的补充[21]。因此NASH及肝纤维在

发病机制上表现为相互影响相互促进。

用此种方法制备的NASH肝纤维化模型，与人类的

自然疾病发病过程相接近，且用时短、死亡率低、材

料容易获得及转运、成本低，是研究NASH肝纤维化发

病机制和寻求临床防治策略的一个很好的研究工具。

【参考文献】

[1] Varela-Rey M, Embade N, Ariz U, et al. Non-alcoholic

steatohepatitis and animal models: Understanding the human

disease[J]. Biochem Cell Biol, 2009, 41(15):969-976.

[2] Mori S, Yamasaki T, Sakaida I, et al. Hepatocellular carcinoma

with nonalcoholic steatohepatitis[J]. Gastroenterol, 2004,

39(4):391-396.

[3] Zou Y, Li J, Lu C, et al. High-fat emulsion-induced rat of

(下转第272页)