合成高分子への質量分析法の応用 1. GPC/MALDI …...1 ©2007 Nihon Waters K.K. 合成高分子への質量分析法の応用 1. GPC/MALDI MSの応用例 2. GPC/ API MSの応用例

1

©2007 Nihon Waters K.K.

合成高分子への質量分析法の応用合成高分子への質量分析法の応用

1. GPC/MALDI MS1. GPC/MALDI MSの応用例の応用例2. GPC/ API MS2. GPC/ API MSの応用例の応用例

©2007 Nihon Waters K.K. 2

応用分野:

(i) 平均分子量の測定

(ii)末端官能基や繰返しユニットの測定

(ユニットは重合体の性能の特性に重要)

(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反

応のモニター

(iv)Polymerisation 重合度の測定

Matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) 質量分析は、複

雑な混合物の大規模分析のための最も強力なツールの1つであり、bulk

polymer の MS分析に有用

GPC/MALDI MSGPC/MALDI MS

2


Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser DesorptionDesorptionIonization (MALDI)Ionization (MALDI)

サンプル調製

サンプルとケミカルマトリクスの混合 (1,000-1 to 10,000-1)

Major advantage= ease of sample prep !!

質量分析

レーザーによる固相中でのイオン化

ソフトなイオン化

一般に不揮発性高分子の(準) 分子イオン [M+H]+ が最小のフラグ

メンテーションで生成

o Proteins o Peptideso Oligonucleotideso Polysaccharideso Synthetic polymers

正・負双方のイオン化が可能


Matrix Assisted Laser Matrix Assisted Laser DesorptionDesorptionIonization (MALDI)Ionization (MALDI)

ショートレーザーパルス (10-20 ns) がターゲット

に照射

窒素レーザーが一般的 337 nm

照射サイズ: ~10-100 mm

レーザーエネルギーはマトリクスに吸収され、サンプ

ルに穏やかに移行

ソリッドステート相から気相へ不揮発性サンプルが

直接、蒸発・イオン化

3


ポリマー分析におけるポリマー分析における MALDI MALDI 法の制約法の制約

However,

ダイナミックレンジ、高い多分散度がある重合体の正確な質量分布等、MALDI-TOF MSのテクニックには、制限あり

1.3以上の多分散度のサンプル(ほとんどの商品ポリマー)では、紛らわしい平均分子量データとなる— Detector response vs m/z— 多分散サンプルにおける最適matrix/sample ratio 設定の困難さ

— Multimer形成と多価イオンによるシグナルの損失

単分散のサンプルの分析はこれらの制限を受けない


解決策は単分散フラクションに分画するためにMALDI MSの前でサンプ

ルをGPC （SEC)を使用してクロマト分離する

MALDI MS の為のサンプルのGPC （SEC)分離と溶離液分取/定着システムの開発

アプローチアプローチ

4


一般的手順

— GPC （SEC) による単分散フラクションの分離により、より簡便にMALDI MS分析が可能

— GPC 分離後、フラクションを分取

— サンプルはprecoated MALDI target プレート又は適当なマトリクス溶液を

伴ったmixed post-columnに連続的に供与される

— レーザーが連続的に供与されるサンプルに照射され, 各部位のマススペクト

ルを取得

— ソフトウェアは、GPC分画後の個々のスペクトルを結合し、分画前の元の多分散

サンプルの分子量分布に補正・換算


Waters GPC/MALDI TYOF MS system Waters GPC/MALDI TYOF MS system for polymer characterisationfor polymer characterisation

Waters Micromass MALDI micro™ high performance MALDI-TOF mass spectrometer

5


分析例（Polylactide glycolide）

GPC/MALDI MSGPC/MALDI MS


イントロダクションイントロダクション

Poly-(DL-Lactide-co-glycolide) (PLG)はドラッグ・デリバリーに使用され

る生物学的適合性と生物分解性ポリエステル

分子量データは性能の特性に関連するため重要

PLG polymers 通常は highly polydisperse (Pd>1.5)

分散型 PLG. へのGPC 分画/ MALDI-MS の応用

6


イントロダクションイントロダクション

PLG is a copolymer of lactide and glycolide.

オリゴマーも分子量の複雑な混合物として存在

O O[–O–CH–C–]m– [–O–CH2–C–]n

CH3Figure. Poly-(DL-Lactide-co-glycolide) (PLG)


MALDI (No GPC)MALDI (No GPC)

スペクトルが共重合体の組成情報を提供している間、正確な分子量分布が

得られない

8 0 0 9 0 0 1 0 0 0 1 1 0 0 1 2 0 0 1 3 0 0 1 4 0 0 1 5 0 0 1 6 0 0 1 7 0 0 1 8 0 0 1 9 0 0 2 0 0 0 2 1 0 0 2 2 0 0 2 3 0 0 2 4 0 0 2 5 0 0 2 6 0 0 2 7 0 0m / z0

1 0 0

%

7 7 2 . 6 4 6 4

8 3 0 . 5 6 5 9

8 4 4 . 5 1 7 3

8 8 8 . 4 0 0 3

9 0 2 . 3 6 2 5

9 2 0 .3 1 3 8

9 6 0 . 2 3 2 1

9 7 6 . 1 4 1 4

1 0 6 2 . 0 4 0 31 1 3 5 . 7 8 1 3

1 1 9 3 . 6 6 8 51 4 8 0 . 9 7 8 8 1 7 2 7 . 4 3 6 3

PLG GPC 分画前のPLG のMALDI MS スペクトル

Lactide Glycolide Copolymer MW: acid MW: mer

Lactic acid: C3O3H6 90 72

Glycolic acid: C2O3H4 76 58

7


プロトコールプロトコール

Gel Permeation Chromatography (GPC)Column: Waters Styragel® HR2 4.6 x 300 mm at 25 °CHPLC Pump: Waters 616 pump with 600S controllerDetector: Waters 410 Refractive index detector

and 996 Photodiode array detector (PDA)Flow rate: Isocratic gradient of tetrahydrofuran (THF) at

0.3 mL/min for 60 min Injection volume: 20 mL

LC-MALDIprep Sample Collection ConditionsSample concentration: 10 mg/mLSheath gas temperature: 125 °CNebulizer gas flow: 25Foil: Dithranol 1 Time®/with sodium saltStage speed: 5 mm/min


.005

.01

.015

10 20 30 40 50 60

Arbitrary Y / Arbitrary X Overlay Y-Zoom CURSORFile # 1 : BASELINE Res=None

GPC - UV Chromatogram of PLG (Lactel)absorbance at 254 nm

GPC PDA chromatogram of the selected PLG co-polymer at UV wavelength of 254 nm

PDAPDA

8


1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000m/z0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

2010.21264584.06354238.5762

4093.07593805.06303777.09252466.8064

4785.46295607.9390

5795.4712

1349.4900

3834.21883271.67241364.04993241.77031571.7360

2766.4451

4325.4932

4482.85064801.1978

921.7535

929.77831130.4019

1146.4146

1355.93543241.77951579.7407 3618.0776

929.9463

2228.8044930.95462070.5942

1170.7274

2447.03642750.3337

3142.6060

1854.31261519.81802056.62622186.8171

2316.96702461.1458

PLG co-polymers GPC フラクションの溶出時間に伴う MS スペクトル

各フラクションの分子量を結合することによって、未分画サンプル（オリジナル）の分子量分布を換算

ＧＰＣ分離による多分散（分子量分布）の軽減ＧＰＣ分離による多分散（分子量分布）の軽減


MALDI target plate にスポットされたあるGPCフラクションのMS スペクトルの１例

MALDIMALDI--MS dataMS data

800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600 2800 3000 3200 3400 3600 3800 4000 4200 4400 4600 4800m /z0

100

%

1854.31261519.8180

907.9029

1461.6892

1419.5587

1375.4899

1317.3483

1289.2689

1245.15301231.1182

944.1331

2028.5533

2114.6843

2172.7500

2186.8171

2230.8557

2258.9187

2272.9343

2316.96702346.9697

2405.0195

2461.1458

2463.0964

2491.1392

The polymer distribution is centered at about m/z=2,000 (MP)

9


先のスペクトルの拡大. アイソトピック・クラスター間の１４Daの差異はLactide [OCH(CH3)C(O)] と Glycolide [OCH2C(O)]モノマーに起因

1850 1855 1860 1865 1870 1875 1880 1885 1890 1895 1900 1905 1910 1915 1920 1925 1930 1935 1940 1945 1950m /z0

100

%

1854.3126

1852.3837

1940.48211868.3789

1855.2921

1856.2722

1866.4426

1857.2819

1858.2625

1865.5198

1859.2728

1912.40491882.4089

1869.3622

1870.3160

1880.4655

1871.2700

1872.3138

1873.2983

1898.38321884.3533

1896.4314

1885.3110

1894.5406

1886.2987

1887.3168

1888.3351

1910.4761

1899.3444

1900.3357

1908.5182

1901.2976

1902.2894

1926.4480

1913.3997

1914.3647

1924.5424

1915.3604

1916.3257

1922.5773

1928.4153

1938.5695

1929.3842

1930.3834

1931.3527

1942.4260

1943.3986

1944.4015

1945.4047

1946.3776

14 14

Isotopic clustersIsotopic clusters


MALDI technologyMALDI technologyの利便性の利便性

MALDI 分析による the Poly-(DL-lactide-co-glycolide) (PLG) polymer のGPC分離の確認

GPC 分画を行う事で MALDI-MS の弱点である多分散度のサンプルの問

題を克服

10


応用分野:

(i) ポリマー添加剤の分子量測定

(ii)末端官能基や繰返しユニットの測定 (ユニットは重合体の性能の特性に重要)

(iii)生産物の化学構造のキャラクタリゼーションによる重合反応のモニター

(iv)極性ポリマーや低分子領域の重合度の測定

API 大気圧イオン化法 (ESI, APCI) は、最も一般的なLC/MSイオン化

法であり、比較的極性を有する低分子領域化合物のMS分析に非常に適

しています。

GPC/ API MSGPC/ API MS


LC(RP)/UV & LC(RP)/UV & APcIAPcI chromatograms chromatograms of of polymer additivespolymer additives

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00Time0

100

%

-0

100

%

std_1 3: Diode Array 273

9.40e52.73

8.33

7.56

4.99

2.93

5.79

9.5413.09

std_1 1: Scan AP- BPI

1.13e89.538.325.34

2.92

2.70

4.98

5.79

7.55 13.06

1. Tinuvin P2. Irganox 2453. Tinuvin 3264. Tinuvin 2345. Tinuvin 3276. Irganox 10107. Irganox 13308.Irganox 10769. Irgafos 168

23 4 5

6

7

89

1

11



CH2

*

CH3

COOCH3

* n

分析例（ Poly methyl methacrylate, PMMA ）


Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

%

77

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

AU

0.0

2.0e-2

4.0e-2

6.0e-2

8.0e-2

1.0e-1

SEC_PMMA1uv 3: Diode Array Range: 2.5888.62

210

6.47215

6.95215

7.17214

SEC_PMMA1uv 1: Scan ES+ TIC

1.02e612.167895.87

10400.80739 5.05

12461.81260 4.25

10172.2112783.40

1140

8.4712536.40

12278.40981

9.521355

10.01593

10.871179

14.9340512.29

73014.981247

NNormal GPC (THF)ormal GPC (THF)

12


Scheme of MakeScheme of Make--Up solvent Flow for Up solvent Flow for API API

HPLC (GFC)

Mobile phase: for SECe.g.,THF, CHCl3

0.3-1.0 mL /min.

MS(Q-p single-MS,

ESI/APcI)

HPLC UV/PDASEC Column(s)

T jointMake up pump(bilt in syringe pump etc.)

Make up sol.:for poler solutione.g., CH3CN, MeOH

0.3mL/min.


Mn776

Time2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

%

1

2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00

AU

0.0

2.0e-2

4.0e-2

6.0e-2

8.0e-2

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 2.5788.64

6.49

6.97

7.19

7.45

10.40

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ BPI

1.03e88.237.557.23

6.986.83

6.70

6.61

6.50

6.163.701.26

8.46


13


Mn776

Time5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

%

1

5.50 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00

AU

0.0

2.0e-2

4.0e-2

6.0e-2

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-26.49

6.97

7.19

7.457.79

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ BPI

9.85e78.257.237.02

6.93

6.72

6.59

7.46

Mn776

m/z400 600 800 1000 1200 1400

%

0

100

%

0

100%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100

%

0

100SEC_PMMA1_MS 386 (7.795) 1: Scan ES+

5.94e7425.9 525.0625.1825.3

SEC_PMMA1_MS 366 (7.418) 1: Scan ES+ 9.52e7526.0425.9

625.1 725.2


725.2


825.3


925.4

SEC_PMMA1_MS 324 (6.628) 1: Scan ES+ 1.85e7925.4825.3 1025.5


1125.5

ESI at Low MW rangeESI at Low MW range


Mn776

Time6.00 7.00 8.00

%

0

6.00 7.00 8.00

%

0

6.00 7.00 8.00

%

0

100

6.00 7.00 8.00

%

0

100

6.00 7.00 8.00

%

0

100

6.00 7.00 8.00

AU

0.0

5.0e-2

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-26.49 6.97

7.19 7.79

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 1425.654

7.34e66.10

6.05


1.01e76.16

6.27


9.50e66.256.20 6.31

6.42


1.49e76.37

5.74


1.74e76.48

5.84

Mn776

Time6.00 7.00 8.00

%

0

100

6.00 7.00 8.00

%

0

6.00 7.00 8.00

%

0

6.00 7.00 8.00

%

0

6.00 7.00 8.00

%

0

100

6.00 7.00 8.00

AU

0.0

1.0

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 1.4696.49 6.97

7.457.79

SEC_PMMA1_MS 1: Scan ES+ 925.3793.20e7

6.59

5.86


6.72


6.936.857.32


7.157.087.34


7.42

ESI mass chromatogramsESI mass chromatograms

14


Time3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

AU

0.0

2.5e-2

5.0e-2

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

AU

0.0

5.0e-2

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

AU

5.0e-2

1.0e-1

3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

AU

5.0e-2

1.0e-1

1.5e-1


216


215


215

SEC_PMMA1_MS 3: Diode Array Range: 6.814e-26.49;215

6.97214 7.79

210

m/z500 1000 1500 2000

%

0

100

%0

100

%

0

100

%

0

100SEC_PMMA4_MS 244 (5.120) 1: Scan ES+

1.30e518251725

132510751024

484 807751

14251926

19271928

1983

SEC_PMMA3_MS 309 (6.347) 1: Scan ES+ 1.32e61225

1125

1025724674

1325

13261426

1626 17271926


825

484 654

1025

11251126

13251525 1727 1926


625 825

925 10251226 1426

ESI mass spectraESI mass spectra分子量分布分子量分布


GPC elution (PDA/ESI, Map)GPC elution (PDA/ESI, Map)

15


GPC elution (ESI, Map)GPC elution (ESI, Map)


質量分析計質量分析計イオン化（イオン化（ESIESI＆＆APCIAPCI））の原理の原理

M：サンプル分子X：H2OやNH3などの溶媒分子

キャピラリ 4 kVイオン蒸発

-

-+

+

+

-

+

+ +++-

帯電液滴の生成

-

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

脱溶媒が進むにしたがってイオン濃度が上昇

++-+

-+++-

++-+

-+++-

キャピラリ 4 kVイオン蒸発

-

-+

+

+

-

+

+ +++-

-

-+

+

+

-

+

+ +++-

帯電液滴の生成

-

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

-

- +

+ +

+

--

--

- +

++

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

- +

+ +

+

--

--

- +

++ -

脱溶媒が進むにしたがってイオン濃度が上昇

++-+

-+++-

++-+

-+++-

++-+

-+++-

++-+

-+++-

++-+

-+++-

++-+

-+++-

ESI

xxxx

xxHH++ MM

コロナ放電により

試薬イオンが生成

xxxx

xxHH++

MM

試薬イオンとサンプル分子が反応してサンプルイオンが生成(プロトン転移またはチャージ転移）

コロナニードル

xx

xxMM

キャピラリ

加熱

xxxx

xxHH++ MM

xxxx

xxHH++ MM

コロナ放電により

試薬イオンが生成

xxxx

xxHH++

MM

xxxx

xxHH++

MM

試薬イオンとサンプル分子が反応してサンプルイオンが生成(プロトン転移またはチャージ転移）

コロナニードル

xx

xxMM

xx

xxMM

キャピラリ

加熱APCI

Waters ESCi

ESI/APCIの同時取込

16


Time4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

0

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

%

9

4.00 5.00 6.00 7.00 8.00

AU

2.0e-2

4.0e-2

6.0e-2

8.0e-2

SEC_PMMA1_ESCi 4: Diode Array Range: 3.304e-16.50

215 6.98216

7.46217

SEC_PMMA1_ESCi 1: Scan ES+ TIC

7.49e87.48426

4.27365

7.75;426

SEC_PMMA1_ESCi 2: Scan AP+ BPI

8.95e77.69425

7.12625

7.92325

m/z400 600 800 1000 1200 1400

%

0

100

%

0

100SEC_PMMA1_ESCi 190 (7.481) 1: Scan ES+

2.91e7425

325

327

525

426

441

442

625526

541

542

725

641726 825

741 925 1025 11261226 1426

SEC_PMMA1_ESCi 191 (7.538) 2: Scan AP+ 1.87e7425

325

379

525

426625

526

542725

641 825 925 1025 11261226 1346

GPC with GPC with ESCiESCi ((ESI+APcIESI+APcI))


GPC/MS を用いる事で、従来の溶出時間情報（クロマトグラム）に加え、

１．マススペクトルからの質量情報やフラグメント情報２．低分子領域における高感度化３．共重合体 (co-polymer)におけるより正確な解析

等が可能となった。

まとめ

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合成高分子への質量分析法の応用 1. GPC/MALDI …...1 ©2007 Nihon Waters K.K. 合成高分子への質量分析法の応用 1. GPC/MALDI MSの応用例 2. GPC/ API MSの応用例