探討法布瑞氏症中鞘醣脂代謝干擾對

免疫細胞的恆定及功能之影響

Investigate the impact of disturbed glycosphingolipid

metabolism on the homeostasis and function

of immune cells in Fabry disease

研究生：徐明嘉 (Ming-Jia Hsu)

指導教授：徐嘉琳 博士 (Chia-Lin Hsu, Ph.D.)

國立陽明大學

微生物及免疫學研究所

碩士論文

Department of Microbiology and Immunology

National Yang-Ming University

Master Thesis

中華民國一○六年八月

August, 2017

i

致謝

轉眼在陽明兩年過去，研究之路上謝謝徐嘉琳老師的教導，進實驗室時開

始複雜的流式細胞儀之旅，隨後共軛焦顯微鏡等各種技術包山包海都有幸可以

學習。一路上各種問題徐老師都耐心地給予提示讓我學會自己思考解決並挖掘

更深層的問題，學習縝密的邏輯思考檢視自己的實驗結果提出正確且不浮誇的

結論，反覆的檢視自己實驗中所有盲點架構可靠的實驗流程，都是我在這裡最

大的收穫。實驗以外徐老師一家也讓我學到很多，Leo 和 Mia 讓我看了不少英

文卡通以及見識許多新奇的玩具，在他們一家人身上學習不論是對孩子、伴侶

以及寵物都給予尊重與關懷，這都是我未來學習並效仿的典範。

Thanks to Dr. Ivan Dzhagalov, a great scientist, gave me nice and important

recommends about my study. Also, thanks to your wonderful lecture during these

two years. I'm so fortuned having a chance to get English lectures in Taiwan.

感謝牛道明醫師及陳念容老師兩位給予我研究上重要的建議，每學期花費

時間討論及修訂我的研究方向也提點我未來出路以及人生規劃。

感謝微免所的同學們幫助，博楷一起同甘共苦的好夥伴，實驗室以及休閒

娛樂兩年來都靠你太感謝了；學樂跟丁丁兩個專精搞笑耍寶的專家們，如果少

了你們兩個的各種問題我進步沒有這麼快也不會如此歡樂；晉文會走路的實驗

記錄本幫助我很多實驗上的問題；如初和恬喬謝謝兩位幫忙扛住很多實驗室的

壓力以及包容我；謝謝葛老師家、黃老師家的各位都給了我多幫助也度過很多

愉快的時光。

最後感謝我的家人的支持讓我可以全心全意地投入在學業之中不用憂慮其

他事情，周末一起聚餐聊天分享各種事情，因為有你們我才能順利地達到現在

的高度。

感謝罕見疾病基金會以及中華民國免疫學會對本研究之重視並對本人給予

獎學金補助。

ii

中文摘要

法布瑞氏症 (Fabry disease) 為一種溶酶體儲積症，是發生機率為五萬分之

一的罕見性聯遺傳疾病。主因是由於製作 α-半乳糖甘酵素(alpha-galactosidase A,

GLA) 的基因突變引起。GLA 為溶酶體中負責分解鞘醣脂(glycosphingolipids)

的酵素，當缺乏 GLA 活性時會導致鞘醣脂無法完全代謝，導致其代謝中間產物

globotriaosylceramide (Gb3) 堆積在溶酶體中，進而產生細胞病變並引起組織損

傷和器官功能障礙。法布瑞氏症常見症狀包括腎功能衰竭、神經病變及心肌病

變，並且導致病人壽命的減短。

我們利用高專一性的螢光免疫染色方法學，成功在法布瑞氏症病人心臟切

片染色觀察 Gb3 累積並給予定量，建立一種比電子顯微鏡觀察更有特異性且敏

感的檢驗方法，同時發現細胞內 Gb3 位置與心臟病變關聯性: 尚未發現心臟病

變者 Gb3 會侷限在溶酶體中；已有明顯心臟病變者 Gb3 則位於溶酶體外。此研

究結果將會對治療起始時間點提供更精準的判斷，我們亦發現 CD8 T 細胞浸潤

治病人心臟組織，因此假設法布瑞氏症患者鞘醣脂代謝失常會影響病人免疫細

胞組成及功能。我們觀察到細胞治療前後病人血清中的細胞激素表現不會改

變，但是病人 T 細胞受體外刺激分泌 IL-2 及 IFN-量遠高於健康受試者。周邊

血單核球細胞粒線體含量、粒線體膜電位、過氧化物 (ROS)、active caspase-1

表現皆正常，但病人的單核球上接受器 CD163 和 M6PR 在細胞膜表現比例高於

健康受試者，且 M6PR 於細胞膜表現比例高於健康受試者，顯示單核球表面接

受器回收功能可能亦受 Gb3 累積影響。

我們的研究結果提供我們早期診斷的方法，更重要的是溶酶體儲積症引響

免疫系統的證據，尤其在 Gb3 累積於心臟組織造成溶酶體破損、T 細胞浸潤至

心臟以及單核球表面接受器的比例增加的現象，我們的發現將有助於重新評估

用藥時機並且在 ERT 治療對於免疫系統恆定狀態的影響有進一步的了解。

iii

Abstract

Fabry disease (FD) is a hereditary disease defined by mutations of alpha-

galactosidase A (GLA), a lysosomal enzyme responsible for breaking down

glycosphingolipids (GSL). Defective GLA activity leads to the accumulation of

globotriaosylceramide (Gb3), which eventually results in tissue damage and organ

dysfunctions. Multiple lines of evidence had shown that immune system may take part

in disease progression, thus we hypothesized that disturbed glycosphingolipid

metabolism impact the homeostasis and function of immune cells in Fabry disease.

In the first part of this study, we demonstrated an early detection method for IVS4

Fabry patient, the most common genotype in East Asia. This method also allowed us to

identify the correlation of Gb3 localization to clinical symptoms. At the same time, we

found CD8 T cell infiltrated to cardiac tissue, accompanied with activation of caspase-

dependent cell death suggesting that involvement of abnormal T cell response in the

cardiac tissue. To uncover T cell activity in Fabry patients, we purified T cell and

stimulated with CD3/CD28, and observed extremely high IL-2 and IFN- secretion

from IVS4 T cells. These results suggested that over-reactive T cell responses

contribute to the development of cardiomyopathy in IVS4 patients.

For the second part, we explored how Gb3 in IVS4 patients may affect monocyte.

Previous studies showed high levels of IL-1in Fabry patients, so we measured

inflammasome activation response by analyzing both danger signal from lysosome and

mitochondria. However, no significant differences found between healthy donors and

Fabry patients. Lastly we examined whether Gb3 accumulation impact monocyte

membrane homeostasis. We found that the monocytes from Fabry patients showed

significant higher levels of scavenger receptor (CD163) and mannose-6-phosphate

iv

receptor (CD222) expression suggesting Gb3 accumulation may alter the normal

turnover of surface receptors.

Together, our results provide valuable insights on how disturbed glycosphingolipids

metabolism affect the immune system homeostasis and function.

v

目錄

致謝 ................................................................................................................................ i

中文摘要 ....................................................................................................................... ii

Abstract ......................................................................................................................... iii

目錄 ............................................................................................................................... v

圖表目錄 .................................................................................................................... viii

附錄目錄 ...................................................................................................................... ix

緒論 ............................................................................................................................... 1

1. 溶酶體儲積症（Lysosomal storage disease, LSD）.................................... 1

1.1 法布瑞氏症（Fabry Disease） ......................................................... 2

1.2 法布瑞氏症之疾病症狀及分類 ....................................................... 3

1.3 東亞高流行 IVS4+919G>A 心臟變異型法布瑞氏症 ..................... 4

1.4 疾病的診斷及治療 ........................................................................... 5

1.5 法布瑞氏症的器官組織纖維化 ....................................................... 6

2. 免疫系統與免疫細胞功能 ........................................................................... 7

2.1 單核球及巨噬細胞的功能 ............................................................... 8

2.2 T 細胞的功能 .................................................................................... 9

2.3 細胞死亡路徑 ................................................................................... 9

2.4 發炎體誘發死亡（Inflammasome induced pyroptosis） .............. 10

3. 代謝調節免疫反應 ..................................................................................... 11

3.1 溶酶體儲積症與發炎免疫反應 ..................................................... 11

實驗材料與方法 ......................................................................................................... 13

血液樣本 ............................................................................................................. 13

切片免疫螢光染色 ............................................................................................. 13

影像分析 ............................................................................................................. 14

vi

MACSPlex 12 cytokines ...................................................................................... 15

周邊血單核球分離 ............................................................................................. 15

免疫細胞表面標記物染色 ................................................................................. 15

免疫細胞純化 ..................................................................................................... 16

CD3/CD28 體外刺激 T 細胞 .............................................................................. 17

IL-12、IL-2 和 IFN- 酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA) ................................ 18

LPS 刺激 Inflammasome 進行 FLICA 染色 ...................................................... 19

IL-1β 酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA) ............................................................ 20

Mitotracker Green FM、Mitotracker Red FM 染色 ........................................... 20

CellROX® Green Reagent .................................................................................. 22

免疫細胞內染色 ................................................................................................. 24

實驗結果 ..................................................................................................................... 26

目標一: 免疫細胞參與在法布瑞氏症病人心肌細胞病變的病理機制 .......... 26

1. 早期檢出心臟切片中 Gb3 堆積以及與溶酶體共存的現象 ......... 26

2. 早期 CD8 T 細胞浸潤至 IVS4 病人之心臟組織 .......................... 27

3. 早期 Gb3 累積心臟切片中檢測出活化之細胞凋亡訊號 ............. 28

4. 用藥前後血漿細胞激素濃度並未改變 ......................................... 29

5. 法布瑞氏症病患體外刺激 T 細胞後分泌較多細胞激素 ............. 29

目標二: 探討鞘醣脂代謝受阻對單核球/巨噬細胞功能之影響 ..................... 30

1. 部分法布瑞氏症病人單核球溶酶體失去恆定 ............................. 30

2. 法布瑞氏症病人單核球表現粒線體危險因子 ............................. 31

3. 法布瑞氏症病人單核球 inflammasome pathway 沒有異常活化 . 32

4. 法布瑞氏症單核球接受器內化回收受到阻礙 ............................. 33

討論 ............................................................................................................................. 35

參考資料 ..................................................................................................................... 41

圖片 ............................................................................................................................. 48

vii

附錄 ............................................................................................................................. 83

viii

圖表目錄

圖一 : 以螢光免疫染色法檢測電顯結晶未檢出之 IVS4 病人心臟組織。 ........... 48

圖二 : 量化心臟切片 GB3 免疫螢光染色強度的量化。 ........................................ 49

圖三: IVS4 病人心臟切片 LAMP1 和 GB3 免疫螢光染色分析。 ......................... 51

圖四: GB3 和 LAMP1 重疊比例與臨床病徵演進關係圖。 .................................... 52

圖五: 早期檢測 CD8 T 細胞浸潤至 IVS4 病人心臟組織 ....................................... 53

圖六: 定量 CD8 T 細胞浸潤至 IVS4 病人心臟組織之程度。 ............................... 55

圖七: ACTIVE CASPASE 3 於 GB3 堆積之心臟切片的表現。 .................................... 57

圖八: 長期追蹤病人血漿未發現特定細胞激素隨時間產生變化。 ....................... 59

圖九: IVS4 病人血漿細胞激素剖析。 ...................................................................... 60

圖十: LPS 刺激後單核球 IL-12 分泌量。 ................................................................. 61

圖十一: 法布瑞氏症病患 T 細胞受到刺激後表現較多 IL-2 和 IFN-。 ............... 62

圖十二: 法布瑞氏症病患部分周邊血液單核細胞溶酶體破裂滲漏 CATHEPSIN L。

............................................................................................................................. 66

圖一三: 建立免疫細胞分群圈選圖及 MITOTRACKER GREEN、MITOTRACKER RED

和 CELL ROX 染色。 ......................................................................................... 71

圖十四: 法布瑞氏症病患周邊血球粒線體危險因子較多。 ................................... 73

圖十五: 法布瑞氏症病患 MONOCYTES ACTIVE CASPASE 1 無異常活化。 ............... 75

圖一六: 法布瑞氏症病患單核球 ACTIVE CASPASE 1 活化程度無異常。 ................ 77

圖十七: 法布瑞氏症病患單核球經由 LPS 刺激未發生異常細胞死亡路徑。 ...... 79

圖十八: 法布瑞氏症病患 LPS 刺激單核球分泌 IL-1 BETA 分泌量與健康捐贈者無

顯著差異。 ......................................................................................................... 80

圖十九: 法布瑞氏症病患單核球表面接受器 CD163 表現增加。 ......................... 81

圖二十: 法布瑞氏症病患單核球接受器 M6PR 位於細胞膜表現增加。 .............. 82

ix

附錄目錄

附錄一: 法布瑞氏症病患臨床資料 ........................................................................... 85

附錄二: 病患螢光免疫染色切片組織學檢驗對照圖 ............................................... 87

附錄三: 法布瑞氏症病患細胞激素剖析 ................................................................... 88

附錄四: CELL ROX 染色建立 ..................................................................................... 89

附錄五: FLICA 染色方法區分 APOPTOSIS 和 PYROPTOSIS。 .................................... 90

附錄六: 法布瑞氏症病患單核球接受器 M6PR 染色線性圖 .................................. 91

1

緒論

1. 溶酶體儲積症（Lysosomal storage disease, LSD）

溶酶體（lysosome）是真核細胞中主要負責清除細胞代謝物的膜狀胞器，溶

酶體內含的水解酵素會在酸性環境中被活化，進行大分子物質的降解，例如：

蛋白質、碳水化合物與 DNA 經過酵素降解產生氨基酸、醣脂類、核甘酸等小

分子，溶酶體中的運送蛋白將代謝物運送到其他胞器或運送至細胞膜上，提供

細胞自身回收利用。溶酶體除了扮演細胞資源回收中心的角色外[1]，也和細胞

內訊息的傳導、蛋白質的合成及修飾、細胞吞噬作用及細胞凋亡有關[2]。當溶

酶體中酵素的基因產生突變時，大分子無法代謝質降解，隨著細胞代謝進行大

分子持續累積在溶酶體中，最後導致溶酶體功能受損甚至造成細胞受到傷害及

功能失常引發疾病[3]，我們統稱這種疾病為溶酶體儲積症。

目前已知的溶酶體儲積症有五十種以上[4]，以累積在細胞中的物質作分

類，包含有：神經鞘脂儲積症[5]、醣蛋白累積症及黏多醣症[6]，完全失去酵素

活的溶酶體儲積症病人大部份的在孩童時期即會出現徵兆，嚴重者時常出現神

經病變，例如手指灼熱疼痛、皮膚燒灼感覺，病人多半死於器官受損例如心肌

疾病、腎衰竭，病程會因不同溶酶體儲積症病失去的特定酵素有所不同臨床表

現上有很大的變異[7]，有些溶酶體儲積症的病徵在早期並不明顯，因此常有誤

診之情形[6]，但是幾乎所有的溶酶體儲積症在晚期時都會伴隨其他非先天性的

併發症，最終導致個體死亡[8]。現在除了探討溶酶體儲積症相關基因及分子生

化的資訊，更有研究指出這些溶酶體中異常物質的累積，可能與自體發炎、細

胞凋亡與影響細胞間訊息傳遞有關[9]。

2

1.1 法布瑞氏症（Fabry Disease）

法布瑞氏症為 X 性聯遺傳疾病的溶酶體儲積症，在全球其發病率大約介於

1:40,000 到 1:170,000 之間為罕見疾病之一，然而根據遺傳以及不同人種差異，

各地區流行機率有些微不同，例如北義大利的發生率約為 1:3,100[10]，而台灣

男嬰帶有相關基因突變的機率則為 1:5000[11]。

法布瑞氏症基因位置在 X 染色體的長臂 2.1 位置（Xq2.1）突變的位置也因

人而異，此片段基因突變後，經由轉錄及轉譯作用後所生產出來的 α-

galactosidase A（GLA） 酵素功能會不正常，無法在溶酶體中正常參與代謝神

經髓鞘脂（glycosphingolipids, GSLs）的過程，使中間產物無法被降解，進而大

量累積在溶酶體中。目前已經有六百多個突變點被發現，依據突變後產生不同

型態蛋白質[12]，GLA 蛋白由 2 段蛋白質區域(Domain) 組成，第一段為活性區

域第二段為連接區域，使 GLA 酵素形成兩兩相連組成 dimer 產生活性[13]，大

部分突變的原因是由於家族性的遺傳，但也有不同個體突變的案例發生[14]。

神經髓鞘脂質最初由內質網（endoplasmic reticulum, ER）與高基氏體

（Golgi Complex）生成，經過囊泡運送置細胞膜上，而目前研究指出其功能和

穩定細胞膜結構及傳遞細胞間訊號有關，同時神經髓鞘脂質也能扮演自身抗

原，參與由 CD1d 介導的活化 iNKT 細胞免疫途徑途徑[15]。正常細胞以內吞方

式代謝膜上的神經髓鞘脂質，細胞膜會先形成內含體（Endosome）包含各種細

胞膜上的物質藉由細胞骨架將內含體運送至溶酶體旁，最後和溶酶體融合借助

溶酶體內含酸性環境以及代謝所需酵素進行降解；另一方面體內神經髓鞘脂質

最多的來源為紅血球的膜，成熟的紅血球並沒有細胞核且代謝路徑受限，隨著

紅血球離開骨髓不斷接受氧化物質會逐漸死亡，紅血球的代謝週期約為三個

月，體內紅血球清除主要依賴脾臟巨噬細胞，當老舊受損的紅血球經過脾臟微

血管會迫使紅血球受到壓力擠壓最後破裂，而巨噬細胞會進行吞噬作用將紅血

3

球細胞膜回收利用，換句話說此過程有大量神經髓鞘脂質的代謝。神經髓鞘脂

質會隨著其結合的醣基與碳水化合物種類與多寡做分類及命名，主要造成法布

瑞氏症的神經髓鞘脂質種類則是 Globotetraosylceramide （Gb4），代謝過程中

會先由 hexosaminidase A+B （Hex A+B）去掉一個末端醣基，降解為

globotriaosylceramide（Gb3），再由 GLA 將末端半乳糖苷切斷，變成

lactosylceramide，然後經 β-galactosidase 及 glucocerebrosidase 作用，將所有鍵

結的醣分子都去掉後，剩下由 sphingosine backbone 及 fatty acid 所組成的

ceramide 的結構，lactosylcermide 及 ceramide 皆可以再送回內質網及高基氏體

重新做外加醣基的修飾，以新合成神經髓鞘脂質，再送回細胞表面作用[15]。

但由於法布瑞氏症病人的 GLA 酵素活性缺失，使 Gb3 無法正常降解為 Gb2，

而累積在各種不同器官或是組織細胞的溶酶體中，包括血管中的內皮與平滑肌

細胞、腎臟的上皮細胞、心肌細胞、角膜和結締組織的網狀細胞、神經系統的

神經節細胞等，進一步使細胞生化性及結構產生改變，導致細胞、組織與器官

功能受損最後產生疾病[16]。

1.2 法布瑞氏症之疾病症狀及分類

法布瑞氏症的研究統計，晚期的症狀是主要造成病人早發性死亡的原因。法

布瑞氏症目前區分為兩種: 第一型 (Type 1)又稱為典型法布瑞氏症(Classical

Fabry) 為全身系統性的疾病，臨床症狀包含多種器官及生理系統的功能失常，

幼童時期開始出現症狀例如: 神經性四肢末端疼痛、皮膚血管角質瘤增生和感

絕神經失調[17]。成年時期除了上述的症狀之外，將出現腎臟功能缺失、心臟

與心血管系統及中樞神經系統異常等狀況。中年時期不管是腎臟、心臟及心血

管或神經系統方面的病徵症狀會更加惡化，嚴重者會出現器官功能不全或器官

衰竭等情形，也導致晚期的法布瑞氏症病患出現中風、心臟肥大及腎衰竭等病

4

狀[18]；第二型(Type 2)是近年被定義的法布瑞氏症，因為第二型病人的病症較

為集中在特定器官例如心臟或腎臟變異，且和第一型相比第二型法布瑞氏症病

人發病時間較晚，發病年齡通常在 40 到 60 歲間。其中心臟變異型的病人較為

常見，疾病症狀包含心臟肥大 （cardiomyopathy）、心肌肥厚性心臟病

（hypertrophic cardiomyopathy）及心肌梗塞（myocardial infarctions）等。過去

研究也發現，在心臟方面疾病的病人紀錄中，其中有 3%的病人 GLA 活性測試

結果較低，顯示部分法布瑞氏症患者病並未正確診斷為遺傳疾病接受治療而被

診斷為心臟疾病[19]。以往統計法布瑞氏症病患平均壽命較短男性少於正常平

均值約 15 年，女性少 10 年，而晚期發現的心臟病變包含心臟肥大、心肌梗

塞、中風及腎臟病變是其主要死因[20]，已有研究發現當給予病患早期酵素替

代性治療可以降搭其他併發症發生的風險[21]。

1.3 東亞高流行 IVS4+919G>A 心臟變異型法布瑞氏症

隨著基因檢驗技術的進步，在台灣地區與法布瑞氏症相關的研究發現，約有

1:1,600 成年男性帶有因 GLA 酵素功能缺失所造成的心室肥大（idiopathic

hypertrophic cardiomyopathy）症狀[22]，進一步調查，發現台灣第二型法布瑞氏

病人，基因點突變的位置通常落在 GLA 基因 Exon 4 與 Exon 5 中間，Intron 4

第 919 個含氮鹼基上出現鳥嘌呤（G）變成腺嘌呤（A）狀況，因此被命名為

IVS4+919G>A[22]，經過檢驗可以看到 IVS4+919G>A 病人體內保留 10%的

GLA 酵素活性，因此病人多為第二型法布瑞氏症其症狀較為晚發，大部分男性

病人於 40 後開始出現症狀，近期研究更發現 IVS4+919G>A 基因點突變導致病

人失去酵素活性的原因，點突變後影響基因結構使對應的基因剪接(RNA

splicing) 蛋白改變，正常基因剪接時使用 hnRNPA1 剪接蛋白，產生

IVS4+919G>A 基因突變時 RNA 的二級結構會改變讓 hnRNPA1 剪接蛋白親和

5

力下降，取而代之的是 SF2/ASF 和 SRp20 兩種剪接蛋白造成 Intron 4 錯誤剪接

形成 cryptic exon，進而改變 mRNA 排列，不幸的是在 cryptic exon 中間有轉譯

停止點造成轉譯早期停止，形成錯誤的蛋白[23]。近期由台灣政府推廣的新生

兒基因篩檢結果中統計，有 1:875 的男嬰與 1:399 的女嬰出生時帶有 IVS4 型的

基因突變[22, 24]，同時也發現台灣地區的 IVS4 心臟變異型出現機率不但高於

第一型法布瑞氏症，同時也高於其他國家（1:40,000-1:170,000）。

1.4 疾病的診斷及治療

目前法布瑞氏症的診斷方法有下列幾種：第一種為偵測血清及尿液中的 Gb3

濃度或 Globotriaosylsphingosine（LysoGb3），LysoGb3 為 Gb3 的脫酰化態。過

去調查指出，法布瑞氏病患血清中的 LysoGb3 濃度比較高，在適當的條件下較

易於臨床上的偵測[25]。另一種診斷方法為偵測細胞中 GLA 酵素的活性，但由

於法布瑞氏症爲 X 性聯染色體遺傳，有時女性病患的酵素活性變數較大，病徵

也比男性複雜[26]，所以只測病患細胞中 GLA 酵素的活性也不是很好的確診方

法。最後一種是以分子遺傳學上的分析，配合電子顯微鏡觀察病患組織切片的

檢查，例如：皮膚、腎臟或是心臟等組織中不正常的脂類累積物質(Gb3 結晶)

[25]，此方法比上述兩種更為準確的診斷方法。

病人經過確診後，會以酵素替代性治療法（enzyme replace treatment，

ERT）來對進行治療，這是目前對於法布瑞氏症的唯一且有效減緩疾病症狀的

治療方法。治療方法為靜脈注射重組酵素進入病患血管。重組酵素進入人體循

環系統後，會被人體內細胞的細胞膜上 mannose-6-phosphate receptor (M6PR) 受

器辨識並結合，細胞膜進行內化 (internalization) 將 M6PR 吞入細胞中形成囊

泡，囊泡轉為內含體最後和溶酶體融合，重組酵素得以進入細胞溶酶體中降解

累積的 Gb3[27]。

6

2003 年起酵素替代療法（ERT）已在台灣成為法布瑞氏症的標準治療法，且

酵素替代性治療法已被證實可以清除器官內的 Gb3 累積，使受損器官恢復部分

功能、延長病患個體壽命及減輕疾病症狀[28]，但是第二型患者較為晚發亦或

是某些基因型可能終生不發病[29]，且施打酵素替代性治療的費用非常高 (一位

病人每兩週施打一次，每次施打藥物價格大約 55 萬台幣，目前為終生施打)，

經過各方討論我國目前對於未發病之第二型病患不給予藥物治療補助，必須待

病人病情累積後施行心臟組織切片以電子顯微鏡觀測其中不正常的脂類累積物

質，這項標準同時也受到質疑，因為病患受損的器官尤其是心臟、神經系統等

組織無法再生修復，酵素替代性治療法只能減緩心臟和神經病變改善代謝物質

造成的惡化，但是已經受損的組織會啟動免疫系統修復促使纖維化形成對器官

依舊是傷害，這促使我們更加重視早期診斷並在適當的時機給予酵素替代性治

療法。

1.5 法布瑞氏症的器官組織纖維化

研究指出心臟方面，由於 Gb3 的累積與血液中 LysoGb3 濃度的上升，可能

影響心肌細胞（cardiomyocytes）中氧氣的提供，使法布瑞氏症病患的心肌受

損，產生纖維化與心肌肥大，導致左心室肥厚、心肌變薄，心臟壁運動異常等

現象，最後可能引發心律不整或心臟衰竭等症狀[30]，以上這些組織細胞修復

過程中產生的纖維化現象被認為是法布瑞氏症的重要病徵。

組織纖維化（fibrosis）的主要原因是由於損傷嚴重或重複發炎的組織細

胞，在進行修復過程時，過度的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）與膠

原蛋白（collagen）增生而累積所產生的現象，為一種不可逆的反應。當細胞外

壓力增加，例如：外來病原體感染、毒性物質或機械性的損傷使組織受損時，

受傷或正在凋亡的細胞部分會利用 damage-associated molecular patterns

7

（DAMPs）和 pathogen-associated molecular patterns（PAMPs），釋放細胞因子

（cytokines）及細胞趨化因子（chemokines），使循環系統中免疫細胞，例如，

例如：中性粒細胞（neutrophils）、單核球（monocytes）、巨噬細胞

（macrophages）、自然殺手細胞（natural killer cells）、B 細胞、T 細胞、先天

淋巴細胞（innate lymphoid cells）聚集到微環境中，以及活化受損部位附近的

纖維母細胞（fibroblasts）、上皮細胞（epithelial cells）、內皮細胞（endothelial

cells）以及幹細胞（stem cell）共同參與清除異物及組織修復的過程。

其中，巨噬細胞被認為是調控免疫反應及纖維化的重要角色，當組織受到壓

力影響時，釋放的細胞趨化因子及 macrophage colony stimulating factor (M-

CSF)，會使週邊的單核球細胞聚集，進一步分化成為巨噬細胞，巨噬細胞會分

泌其他細胞因子，吸引其他免疫細胞前往受損部位，而當中所分泌的 TGF-β、

TNF-α 及 IL-1 等細胞因子，會使纖維母細胞（fibroblast）活化，誘發細胞外基

質的產生，同時巨噬細胞會進行吞噬作用，將受損細胞清除，而後呈現自身抗

原給淋巴細胞，使之被活化並分泌其他發炎因子與纖維化激素，如：IL-14、IL-

13 等，促使纖維母細胞更加活化加速組織纖維化的過程[31]。

2. 免疫系統與免疫細胞功能

免疫系統是身體用來抵禦外來病原的防禦機制，身體產生不同免疫細胞準確

的調控各種細胞激素以達到防禦外來病原的效果，目前分為先天免疫及後天免

疫，先天免疫泛指低專一性、非記憶性高效率的在第一時間產生反應對抗外來

病原，主要由單核球、吞噬細胞、嗜中性球等細胞作用同時啟動後天免疫反

應；後天免疫表示具有高專一性且有記憶性，主要細胞為: T 細胞及 B 細胞經過

抗原呈現產生高專一性的群落並附有記憶性對抗外來物並對身體達到保護的效

果。撇除外來病原菌免疫系統也有維持身體恆定的功能，例如老舊細胞會經由

8

吞噬細胞吞入代謝，經過溶酶體分解將醣類、蛋白質回收利用。免疫細胞也具

有監督器官細胞狀態的腳色，免疫細胞利用表面接受器 MHC class I 接觸自體細

胞檢查細胞狀態，當細胞被病毒感染時會被檢測後進行毒殺，或是細胞受到壓

力刺激基因突變促使細胞生長週期異常走向癌化，免疫細胞會辨識表面的接受

器辨認癌化細胞並進行毒殺作用。伴隨著如此複雜且需要精確調控的免疫系統

很多問題也油然而生，例如基因突變、外在環境引響、藥物抑制、病毒感染等

各種因素都可能破壞免疫系統的平衡，導致過度免疫反應、慢性發炎、自體免

疫、免疫低下等疾病，這些症狀可能造成不同程度的器官受損，例如自體免疫

常導致關節損傷造成行動不便、免疫低下導致伺機性感染而過度免疫反應造成

細胞激素風暴 (cytokine storm) 造成休克死亡。

2.1 單核球及巨噬細胞的功能

巨噬細胞是先天免疫細胞由骨髓細胞分化進入循環系統中的單核球，會遷移

到不同器官中駐留，作為體內免疫的第一道防線巨噬細胞會吞噬病原菌將蛋白

質消化進行抗原呈現，啟動後天免疫反應，調節 B 細胞及 T 細胞的活化及分

化，另一方面也會保持器官中的細胞恆定，將老舊或受損的細胞吞噬並刺激細

胞新生，或是傷口產生石清除受損部位並刺激纖維母細胞增生形成結痂。

巨噬細胞會利用 pattern-recognition receptors（PRRs）以低專一性的方式辨

識外來病原菌的表面結構 PAMPs 或辨識受損細胞釋放的物質 DAMPs，這時細

胞的整合蛋白（integrin）可以強化分子間的結合，辨識成功後，細胞骨架

（cytoskeleton）會增生，使巨噬細胞表面突出，將目標細胞或物質整個包住，

內吞進細胞中，吞進來的物質以囊泡做運送，最後會與溶酶體結合，物質將會

在溶酶體中被酵素降解掉。而當 PAMPs 與 PRRs 結合後，會誘發免疫細胞內一

連串的訊號蛋白表現進行轉譯轉錄之調控，讓巨噬細胞釋放細胞激素、發炎激

9

素或與其他細胞溝通。

2.2 T 細胞的功能

T 細胞是淋巴細胞的其中一種，相較於其他血球細胞 T 細胞表面有獨特的吸

細胞接受器(T cell receptor, TCR) ，T 細胞主要由骨髓產生前驅細胞並在胸腺中

發育，在胸腺中的生長過程需要經過不同篩選步驟 1. Beta selection 將正常發育

TCR 的細胞留下，藉由生長激素方式給予有表現 preTCR 接受器 T 細胞養分並

讓其生長、分裂和存活。2. Positive selection 表示篩選可以抵禦外來病原的細

胞，利用 MHC II 配對 TCR，將可以辨認外來蛋白的 T 細胞留下，如果無法辨

識 MHC II 上的外來蛋白 T 細胞也會失去 TCR 訊號失去養分競爭能力而後死

亡。3. Negative selection 用來避免自體免疫發生，過程為樹突細胞呈現自身抗

原，任何會辨認自身 MHC II 的 T 細胞會被刺激走向細胞凋亡[32]。T 細胞最主

要主要分為 CD4 T 細胞和 CD8 T 細胞，CD4 功能類似指揮官作用，經過先天

免疫刺激並呈現抗原後，CD4 T 細胞會被活化在淋巴器官中篩選對於病原高專

一的群體，並依據不同的病源調控 B 細胞、巨噬細胞、CD8 T 細胞進型免疫反

應；CD8 T 細胞的功能為毒殺作用，可以利用其 TCR 與目標細胞表面 MHC I

接觸並檢查，當腫瘤細胞形成或細胞被病毒感染時可以藉由此方式辨認進而分

泌毒殺激素將細胞毒殺[33]。

2.3 細胞死亡路徑

細胞死亡是內在免疫防禦機制，當接觸到微生物感染時宿主細胞可以經由不

同的細胞死亡路徑，例如: 通過調節線粒體導致死亡、感染過程中刺激 NF-B

10

和發炎體(inflammasome) 促使宿主細胞死亡，達到限制微生物複製擴散的效

果。目前已發現細胞死亡路徑可區分為 necroptosis (necrosis)、pyroptosis 和細胞

凋亡(apoptosis)[34]，三種細胞死亡路徑分子機轉差異甚大卻相輔相成，當外來

物質出現細胞會受到強大刺激出現 necroptosis，經過 necroptosis 死亡細胞會破

裂直接釋放大量細胞內部物質例如 ATP、細胞激素[35]，而在為環境中的其他

細胞受到病原刺激以及細胞外在壓力進入 pyroptosis 快速地釋放發炎因子，使

微環境紅腫熱痛吸引血液中的血球浸潤，在清除病原後過度反應的細胞，以極

大量增生的免疫細胞會走向 apoptosis 形成小的囊泡由巨噬細胞吞噬清除[36]。

2.4 發炎體誘發死亡（Inflammasome induced pyroptosis）

當外在刺激出現例如傷口或是病源入侵，先天免疫會在第一時間反應，組

織中的巨噬細胞便是 DAMPs 與 PAMPs 接合 PRRs 會誘發第一個刺激訊號，使

巨噬細胞活化其 NF-κB 並且進入細胞核讓發炎蛋白表現上升，促使 NLRPs

(Nod-like receptors)蛋白表現量也上升，同時增加其下游傳遞蛋白 pro-caspase-1

及接合蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的表現

量[37]。當細胞接受到第二個刺激訊號(危險因子)包括細胞外 ATP、過氧化物、

金屬離子、粒線體內 DNA[38]、溶酶體內的蛋白質、病毒蛋白、細菌蛋白[34]

等，會促使 NLRP3 活化組成 NLRP3 inflammasome complexes，進而活化 pro-

caspase-1 變成 active caspase 1，使得 pro-IL-1β 與 pro-IL-18，變成具有功能性的

IL-1β 與 IL-18 並釋出細胞[39]，刺激其他免疫細胞參與免疫反應。發炎體會使

細胞會壞死稱之為 pyroptosis[34]，這種死亡的方法與細胞凋亡 (apoptosis) 不

同，區分的方式為 pyroptosis 必須有發炎細胞激素分泌，同時間 DNA 斷裂且細

胞表面破洞脹大，細胞內的物質已 DAMPs 的形式釋放並影響鄰近的細胞，加

強為環境的發炎反應，最後導致區細胞跟著發炎而死亡[36]。目前認為有些慢

11

性發炎的症狀與發炎體相關[39]。而發炎體也與活化心臟性疾病有關，出現在

心肌梗塞和心臟組織缺血所造成的損傷[40]。

3. 代謝調節免疫反應

我們已知免疫系統防禦病原體並維持生物體內的組織穩態，然而這些步驟都

會消耗大量能量，所以免疫細胞需要精確控制細胞代謝途徑。過去十年這個領

域的初步研究逐漸闡明細胞外信號如何控制免疫系胞調節營養，例如: 當 T 細

胞未接觸病原處於安靜時期通過 IL-7 受體（IL-7 receptor）的信號傳導在細胞表

面保持葡萄糖載體蛋白(glucose transporter, GLUT)表達用以攝取葡萄糖，並進入

線粒體走向 OXPHOS 代謝路徑[41]；當 T 細胞激活後，通過 CD28 的信號傳導

激活 PI3K / Akt / mTOR 途徑誘導活化的 T 細胞中進行糖解，而 TCR 驅動的

ERK / MAPK 信號啟動 glutaminolysis 幫助 T 細胞增殖[42]。T 細胞的記憶形成

依賴於 TRAF6 和 IL-15 驅動的脂肪酸氧化[43]。這些發現並提供一個總體框架

了解細胞中代謝路徑如何調節免疫細胞的生理以及免疫反應。

3.1 溶酶體儲積症與發炎免疫反應

溶酶體對於免疫學最廣泛的認識是抗原呈現的功用，當巨噬細胞將抗原吞噬

後經過溶酶體中的酵素代謝，隨後利用主要組織相容性複合體將抗原蛋白呈現

於細胞表面。有趣的是近年科學家發現 chloroquine (CQ)一個弱鹼性的物質平常

用於中和溶酶體的酸性環境並產生抗發炎的效果，進一步看到當溶酶體的環境

改變不論是其中的酸鹼度、體積、表面的接受器等都會使整個細胞的訊號傳遞

改變[44]。隨著一個個溶酶體影響細胞生理的案例被發現，很多科學家開始著

眼於溶酶體儲積症病患，很快的發現溶酶體儲積症之病人免疫系統確實易於常

12

人: 高雪氏症(Gaucher's Disease) 病患體內樹突細胞、巨噬細胞相較正常人多，

且血清中的 IFN-g、IL-17、IL-6、TNF-a 也表現器官處於較為發炎的微環境

[45]。隨後也發現高雪氏症病患血清中 CXCL-1、CXCL-2、CXCL10 較多，並

且刺激單核球由血管中移動到器官趨化為巨噬細胞，在器官中產生細胞激素

[46]。在過去研究中一直無法確定溶酶體儲積症免疫細胞受到的刺激究竟來自

哪裡，究竟是免疫細胞內部堆積代謝物質使其錯亂，亦或是特殊器官受損引起

趨化激素分泌吸引免疫細胞浸潤，最新的一篇也是目前唯一的研究，顯示高雪

氏症發炎的原因來自於免疫系統的補體 C5a，免疫細胞會利用 C5aR 辨認 C5a

並產生趨化反應，更不幸的是 C5aR 下游會傳遞生成物質訊號讓細胞生成

glucosylceramide (GC) 也是高雪氏症本身的堆積物，此現象加劇整體免疫系統

的發炎跟細胞活化[47]，但此現象只針對高雪氏症作為解釋在其他溶酶體儲積

症中並沒有 GC 代謝之問題。

整體來說，這幾年不斷有人提出溶酶體儲積症造成免疫系統錯亂，對病人

以及用藥有重要影響，但大多數溶酶體儲積症依然缺乏相關分子機轉研究，提

供代謝物質堆積造成免疫系統錯亂的解答，我們將在這項研究中揭示 IVS4 型

法布瑞氏症的免疫系統參與心肌病變時間點，且深入剖析第一型及第二型法布

瑞氏症用藥前後血漿細胞激素表現、免疫細胞粒線體狀態、T 細胞刺激後反

應、單核球的發炎路徑和單核球細胞膜代謝能力，對法布瑞氏症病患免疫系統

提供一個完整的輪廓，以提升未來用藥安全以及治療的方向進而促進法布瑞氏

症病患的健康。

13

實驗材料與方法

血液樣本

人類免疫細胞相關實驗:血液樣本由健康志願者與法布瑞氏症病患(台北榮民

總醫院 牛道明醫師之病人) 取得 5-10 ml 全血收集於 EDTA 採血管，檢體來源為

所有樣本的取得皆遵照台北榮總及陽明大學人體試驗委員會之規範進行，病人

臨床資料對照表於附錄一。

切片免疫螢光染色

組織切片台北榮民總醫院操作，來源為心導管手術與心內膜心肌活檢。利用

digital X-ray 之路徑引導，由右頸下靜脈侵入進行右心導管手術，使用心肌活檢

鉗進入右心室並從室間隔取下兩至三組樣品。以 O.C.T. (Optimal Cutting

Temperature)進行組織包埋，以冰凍切片機將檢體冷卻至−25°C 後進行切片，切

片厚度為 5μm，將切成薄片的組織貼於玻片上以進行後續的染色，剩餘的組織

則冷凍於−80°C 冰箱保存。檢體來源為所有樣本的取得皆遵照台北榮總及陽明

大學人體試驗委員會之規範進行。

步驟:

將切片於 BD Cytofix/CytopermTM Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD

#554714) 冰上固定打洞 20 分鐘，以 BD Cytofix/CytopermTM

Fixation/Permeabilization Solution Kit wash buffer 清洗之後，用 PBS with 5%FBS

Blocking 室溫一小時。接著以一級抗體 CD77(Gb3) or active caspase 3 or CD8 避

光隔夜染色。隔天用 PBS 清洗放置水平震盪儀 15 分鐘重複三次，加上二級抗

體 Alexa 647-anti mouse IgG、Cy5-anti rabbit IgG，於室溫避光染色一小時，再

以 PBS 清洗放置水平震盪儀 15 分鐘重複三次，用 PBS with 5%FBS and dunky

serum、rabbit serum、mouse serum 進行 Blocking 室溫一小時，接著以第二個一

14

級抗體 CD8 or FITC-LAMP-1 避光隔夜染色。隔天用 PBS 清洗放置水平震盪儀

15 分鐘重複三次，加上二級抗體 Cy5-anti rabbit IgG 染色於室溫染色十分鐘，

Hoechst 染色於室溫染色十分鐘，以 PBS 清洗之後，使用 Mounting medium 封

片，於蓋玻片周圍塗上透明指甲油，放入 4°C 冰箱保存，等待上顯微鏡觀察。

抗體列表：

影像分析

使用 ImageJ 1.49V 計算細胞和數量，視野螢光強度。使用 Zen black 2012,

Carl Zeiss Microscopy GmbH 分析 Gb3 與 LAMP-1 位置套用公式為 Pearson’s

Correlation Coefficient，表示所有 Gb3 像素為分母，Gb3 與 LAMP-1 重疊的像

素數量為分子。螢光影像處理輸出使用 Zen blue 2012, Carl Zeiss Microscopy

GmbH，維持光學線性為直線增強或減弱。

Antibody Fluorescence Clone Cat. No

Anti-human CD77 BGR23 TCI Chemicals# A2586

Rabbit anti-human CD8 APC M5E2 BioLegend #301808

Mouse anti-human CD107a FITC H4A3 BioLegend # 328606

Rabbit Anti-active Caspase-3 Polyclone Abcam # ab2302

Anti mouse IgG(H+L) Alexa 647 Polyclone Jackson

ImmunoResearch

# 115-605-146

R-Phycoerythrin-conjugated

AffiniPure F(ab’) Fragment

Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)

PE Polyclone Jackson

ImmunoResearch

# 111-116-114

15

MACSPlex 12 cytokines

血漿由 MACSPlex 12 Cytokine Kits (Miltenyi Biotec, Order no. 130-099-169)

分析，將血漿解凍在 4℃下以 10,000×g 離心 10 分鐘，將血清轉移到新管中，

並用 MACSPlex Buffer 至少 1:8 稀釋，即將 25μL 未稀釋的樣品加入到 175μL 的

MACSPlex Buff。準備標準品和稀釋血漿轉移到 96 孔濾板 20-45 分鐘，加入

MACSPlex 細胞因子 12 Capture Beads，於水平震盪儀 450rpm 避光 2 小時，清

洗 96 孔濾板兩次，加入 MACSPLEX 緩衝液和 MACSPLEX 細胞因子 12 檢測

試劑於水平震盪儀 450rpm 避光 1 小時，清洗 96 孔濾板兩次，使用 MACSPlex

Buffer 回溶樣品，使用以流式細胞儀 Fortessa 進行偵測，並以 Flow jo 分析平

均螢光強度，以 GraphPad Prism 計算標準曲線以及樣品數值。

周邊血單核球分離

利用 Lymphoprep™（STEMCELL TECHNOLOGIES INC.’S, Catalog

#07801）將周邊血單核球（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）從 5-7

ml 新鮮血液中分離，先在離心管中加入和血液樣本等體積的常溫

Lymphoprep，再以緩慢速度將血液加入 Lymphoprep 上層，離心 300 g，室溫，

30 分鐘，並設定最低無煞車模式，離心完液面會分層，中間白色層為 PBMC 所

在位置，將 PBMC 全部吸出移到新的離心管中，以 PBS 清洗細胞兩次，離心

1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液後即成功得到血液中 PBMC。

免疫細胞表面標記物染色

取 1x106個細胞移至 U 底 96 孔盤後，以 100 μl FACS buffer 清洗，離心

1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，加入 2 μl Human Fc Receptor 冰上

16

blocking 20 分鐘，將細胞標記抗體照比例與 100 μl FACS buffer 稀釋並加到細胞

中，在冰上染色 20 分鐘，以 1ml FACS buffer 清洗多餘抗體，離心 1500 rpm，

4°C，5 分鐘，去掉上清液，以含有 PI 之 300 μl FACS buffer 回溶細胞，即可以

流式細胞儀檢測結果。

實驗溶液：

FACS buffer：5% FBS + 1 mM EDTA in PBS

免疫細胞純化

以 80 μl MACS buffer /107個細胞比例回溶 PBMC 後，加入 20 μl MACS 磁珠

抗體/107個細胞比例做細胞染色，放置冰上 15 分鐘後，再加入 1 ml MACS

buffer 洗掉多餘抗體磁珠，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘。去掉上清液，以 500

ul MACS buffer 回溶細胞並將細胞拍散。將 MACS LS or MS column 組裝置磁

座上，以 3 ml (500 l for MS column)MACS buffer 過濾潤洗，再將 500 ul MACS

buffer 細胞混合液加入 column 中以重力過濾，先流出 buffer 中含有非目標之細

胞，等過濾結束，以 3 ml(500 l for MS column) MACS buffer 清洗 column 三

次，再將 column 從磁座上取下，加入 1 ml MACS buffer，以擠壓方式將目標細

胞擠到新的離心管中，便成功純化出所需之免疫細胞。

細胞磁株抗體列表：

Name Cat. No

CD14 MACS® Miltenyi Biotec #130-050-201

CD3 MACS® Miltenyi Biotec #130-050-101

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細胞分離管柱列表：

Name Cat. No

LS column MACS,Miltenyi Biotec #130-042-401

MS column MACS,Miltenyi Biotec #130-042-201

實驗溶液：

MACS buffer：0.5% BSA + 1mM EDTA in PBS

CD3/CD28 體外刺激 T 細胞

取存化之 T 細胞以 8x104 細胞數回溶於 100 l，加入 2 l Gibco™

Dynabeads™ Human T-Activator CD3/CD28 (Thermo Fisher # 111.61D)，將細胞至

於 96 孔 U 底盤培養三天。

Complete RPMI 配方：

Name Final concentration Cat. No

RPMI medium 1640 1 package/L H2O Gibco® #31800-022

Serum of patient 10%

L- glutamine 1% Gibco® #25030-081

MEM Non-Essential

Amino Acids (NEAA)

1% Gibco® #11140-050

Sodium Pyruvate 1% Gibco® #11360-070

Penicillin-streptomycin 1% Gibco® #15140-122

培養基 pH 值調整在 7.2-7.4

18

IL-12、IL-2 和 IFN- 酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA)

實驗使用的套組是 BioLegend's Human IL-12 (p70) ELISA MAX™ Deluxe Sets

（BioLegend # 431704）、BioLegend's Human IL-2 ELISA MAX™ Set Deluxe

（BioLegend # 431804）、BioLegend's Human IFN- ELISA MAX™ Set Deluxe

（BioLegend # 430101），首先將 capture antibody 照比例與 coating buffer 稀釋，

以 100 μl 加入 ELISA 專用 96-well dish 中，於 4°C 冰箱放置過夜。隔天以 300

μl wash buffer 清洗 well 四次，甩乾後，加入 200 μl Assay diluent A，室溫

blocking well 1 小時，以 300 μl wash buffer 清洗 well 四次，甩乾後，加入 100

μl 以 Assay diluent A 稀釋的實驗樣本與序列稀釋的蛋白標準液，於室溫搖晃作

用 2 小時，以 300 μl wash buffer 清洗 4 次，甩乾後，加入 100 μl diluted

Detection Antibody，於室溫搖晃作用 1 小時，以 300 μl wash buffer 清洗四次，

甩乾，加入 100 μl HRP diluted solution，於室溫搖晃作用 30 分鐘，以 300 μl

wash buffer 清洗五次，甩乾，加入 100 μl Substrate Solution，室溫避光作用 20

分鐘，加入 100 μl Stop solution 停止作用。最後測定 OD450 nm 與 OD570 nm

（OD570 為背景值），並以蛋白標準液與吸光值結果做出標準曲線（Standard

curve）後，將實驗樣本吸光值扣除背景值結果代入標準曲線公式並乘回稀釋倍

數即可得到實驗樣本 IL-12 和 IL-2 濃度。

實驗溶液：

1. Wash buffer：0.05% Tween-20 in PBS

2. Stop solution：2N H2SO4（63 Pure Chemicals #307208）

19

LPS 刺激 Inflammasome 進行 FLICA 染色

將 5x105 周邊血液單核細胞以 100 l RPMI 回溶放置 96 孔盤，LPS

1g/mL，37 度培養 30 分鐘，加入 ATP 至整體濃度為 10M，收取上清液分保

存於負八十度冰箱等待細胞激素實驗，細胞以 200 l FACS buffer 清洗，離心

1500rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，重複清洗三次，以 FAM-FLICA®

Caspase-1 Assay Kit(ImmunoChemistry Technologies # 97 ) 進行染色，將 10 µL

30X FLICA 試劑以 PBS 回溶至 300 µL 形成 1X FLICA 試劑，將 100 µL 1X

FLICA 至於一個樣品孔洞，於 37 度避光染色 30 分鐘，以 100 µL Apoptosis

washing Buffer 清洗，離心 1500rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，重複清洗五

次，以含有 PI 之 300 μl FACS buffer 回溶細胞，即可以流式細胞儀檢測結果。

實驗溶液：

FACS buffer：5% FBS + 1 mM EDTA in PBS

Complete RPMI 配方：

Name Final concentration Cat. No

RPMI medium 1640 1 package/L H2O Gibco® #31800-022

Serum of patient 10%

L- glutamine 1% Gibco® #25030-081

MEM Non-Essential

Amino Acids (NEAA)

1% Gibco® #11140-050

Sodium Pyruvate 1% Gibco® #11360-070

Penicillin-streptomycin 1% Gibco® #15140-122

培養基 pH 值調整在 7.2-7.4

20

IL-1β酵素連結免疫吸附試驗 (ELISA)

本實驗使用的套組是 BioLegend Human IL-1β ELISA MAX™ Deluxe Sets

（BioLegend #437005），首先將 capture antibody 照比例與 coating buffer 稀釋，

以 100 μl 加入 ELISA 專用 96-well dish 中，於 4°C 冰箱放置過夜。隔天以 300

μl wash buffer 清洗 well 四次，甩乾後，加入 100 μl Assay diluent A，室溫

blocking well 1 小時，以 300μl wash buffer 清洗 well 四次，甩乾後，先在 well

中加入 50 μl Assay diluent D，再加入 50 μl 以 Assay diluent A 稀釋的實驗樣本

與序列稀釋的蛋白標準液，於室溫搖晃作用 2 小時，以 300 μl wash buffer 清洗

4 次，甩乾後，加入 100 μl diluted Detection Antibody，於室溫搖晃作用 1 小

時，以 300 μl wash buffer 清洗四次，甩乾，加入 100 μl HRP diluted solution，於

室溫搖晃作用 30 分鐘，以 300 μl wash buffer 清洗五次，甩乾，加入 100 μl

Substrate Solution，室溫避光作用 20 分鐘，加入 100 μl Stop solution 停止作用。

最後測定 OD450 nm 與 OD570 nm（OD570 為背景值），並以蛋白標準液與吸光

值結果做出標準曲線（Standard curve）後，將實驗樣本吸光值扣除背景值結果

代入標準曲線公式並乘回稀釋倍數即可得到實驗樣本 IL-1β 濃度。

實驗溶液：

Wash buffer：0.05% Tween-20 in PBS

Stop solution：2N H2SO4（63 Pure Chemicals #307208）

Mitotracker Green FM、Mitotracker Red FM 染色

將 1x106細胞放入 U 型 96 孔盤中，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上

清液，再加入 100 μl 以 37°C 的 complete RPMI 稀釋的 100 nM Mitotracker

Green、100 nM Mitotracker Red，將盤子置於 37°培養箱染色 30 分鐘，以 300 μl

FACS Buffer 清洗 96 孔盤，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，重複兩

21

次，進行免疫細胞表面標記物染色加入 2 μl Human Fc Receptor 冰上 blocking 20

分鐘，將細胞標記抗體照比例與 100 μl FACS buffer 稀釋並加到細胞中，在冰上

染色 20 分鐘，以 1ml FACS buffer 清洗多餘抗體，離心 1500 rpm，4°C，5 分

鐘，去掉上清液，以含有 PI 之 300 μl FACS buffer 回溶細胞，即可以流式細胞

儀檢測結果。

抗體列表：

實驗溶液：

FACS buffer：5% FBS + 1 mM EDTA in PBS

Antibody Fluorescence Clone Cat. No

Anti-human CD11c PE 3.9 BioLegend #301605

Anti-human CD3 PE-Cy7 OKT3 BioLegend #317334

Anti-human CD14 APC-Cy7 M5E2 BioLegend # 301820

Anti-human CD56 Pacific blue HCD56 BioLegend #318342

Anti-human CD19 BV510 HIB19 BioLegend #302242

Anti-human CD4 BV650 OKT4 BioLegend #317436

Mitotracker Green FITC channel Thermo Fisher

Scientific #M7514 †

Mitotracker Red APC Channel Thermo Fisher

Scientific #M22425

PI PE texas red Sigma-Aldrich

#P4864

Human Fc Receptor Binding Inhibitor

Purified

eBioscience #14-

9161

22

Complete RPMI 配方：

Name Final concentration Cat. No

RPMI medium 1640 1 package/L H2O Gibco® #31800-022

Serum of patient 10%

L- glutamine 1% Gibco® #25030-081

MEM Non-Essential

Amino Acids (NEAA)

1% Gibco® #11140-050

Sodium Pyruvate 1% Gibco® #11360-070

Penicillin-streptomycin 1% Gibco® #15140-122

培養基 pH 值調整在 7.2-7.4

CellROX® Green Reagent

將 1x106細胞放入 U 型 96 孔盤中，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清

液，再加入 100 μl 以 37°C 的 complete RPMI 稀釋的 5 μM CellROX® Green，將

盤子置於 37°培養箱染色 30 分鐘，以 300 μl FACS Buffer 清洗 96 孔盤，離心

1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，重複兩次，進行免疫細胞表面標記物染

色加入 2 μl Human Fc Receptor 冰上 blocking 20 分鐘，將細胞標記抗體照比例

與 100 μl FACS buffer 稀釋並加到細胞中，在冰上染色 20 分鐘，以 1ml FACS

buffer 清洗多餘抗體，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，以含有 PI

之 300 μl FACS buffer 回溶細胞，即可以流式細胞儀檢測結果。

抗體列表：

Antibody Fluorescence Clone Cat. No

CellROX® Green

Reagent

FITC

Channel

Thermo Fisher Scientific

#C10444

23

實驗溶液：

FACS buffer：5% FBS + 1 mM EDTA in PBS

Complete RPMI 配方：

Name Final concentration Cat. No

RPMI medium 1640 1 package/L H2O Gibco® #31800-022

Serum of patient 10%

Anti-human CD11c PE 3.9 BioLegend #301605

Anti-human CD3 PE-Cy7 OKT3 BioLegend #317334

Anti-human CD222 Alexa 647 MEM-238 BDPharmingenTM

#565105

Anti-human CD14 APC-Cy7 M5E2 BioLegend # 301820

Anti-human CD56 Pacific blue HCD56 BioLegend #318342

Anti-human CD19 BV510 HIB19 BioLegend #302242

Anti-human CD163 BV605 GHI/61 BioLegend #333616

Anti-human CD4 BV650 OKT4 BioLegend #317436

PI PE texas red Sigma-Aldrich #P4864

Human Fc Receptor

Binding Inhibitor

Purified

eBioscience

#14-9161

Mouse IgG1 κ Isotype

control

Alexa 647 MOPC-21 BD Phosflow™

#557783

Mouse IgG1, κ Isotype

Control

BV605 X40 BD Horizon™ # 562652

24

L- glutamine 1% Gibco® #25030-081

MEM Non-Essential

Amino Acids (NEAA)

1% Gibco® #11140-050

Sodium Pyruvate 1% Gibco® #11360-070

Penicillin-streptomycin 1% Gibco® #15140-122

培養基 pH 值調整在 7.2-7.4

免疫細胞內染色

取 1x106個細胞移至 U 底 96 孔盤後，以 100 μl FACS buffer 清洗，離心

1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，加入 100 μl 含有 Zombie dye 的 PBS 以

標記存活細胞，冰上染色 30 分鐘，以 200 l FACS buffer 清洗多於抗體，離心

1500 rpm，4°C，5 分鐘，去掉上清液，加入 2 μl Human Fc Receptor 冰上

blocking 20 分鐘，加入 200 l FACS buffer 清洗，離心 1500rpm，4°C，5 分

鐘，去掉上清液，將細胞標記抗體照比例與 FACS buffer 稀釋並加到 96 孔洞

中，在冰上避光染色 20 分鐘，以 200 l FACS buffer 清洗多餘抗體，離心：

1500 rpm，4°C，5 分鐘，去上清液，以 100μl BD Cytofix/CytopermTM

Fixation/Permeabilization Solution Kit，冰上固定打洞細胞 20 分鐘，以 100μl

wash buffer 清洗，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘，去上清液，將抗體照比例與

100μl FACS buffer 稀釋並加入細胞中，室溫染色 90 分鐘，以 200 l FACS

buffer 清洗，離心 1500rpm，4°C，5 分鐘，去上清液，將二抗照比例與 100μl

FACS buffer 稀釋並加入細胞中，室溫染色 20 分鐘，以 200 l FACS buffer 清

洗，離心 1500 rpm，4°C，5 分鐘，去上清液，以 300 μl FACS buffer 回溶細

胞，即可以流式細胞儀檢測染色結果。

25

抗體列表：

實驗溶液：

FACS buffer：5% FBS + 1 mM EDTA in PBS

Anti-human CD11c PE 3.9 BioLegend #301605

Anti-human CD3 PE-Cy7 OKT3 BioLegend #317334

Anti-human CD222 Alexa 647 MEM-238 BDPharmingenTM

#565105

Anti-human CD14 APC-Cy7 M5E2 BioLegend # 301820

Anti-human CD56 Pacific blue HCD56 BioLegend #318342

Anti-human CD19 BV510 HIB19 BioLegend #302242

Anti-human CD163 BV605 GHI/61 BioLegend #333616

Anti-human CD4 BV650 OKT4 BioLegend #317436

PI PE texas

red

26

實驗結果

目標一: 免疫細胞參與在法布瑞氏症病人心肌細胞病變的病理機制

1. 早期檢出心臟切片中 Gb3 堆積以及與溶酶體共存的現象

第二型法布瑞氏症，尤其是 IVS4 基因型，在台灣流行率非常高，對於 IVS4

病人現階段最準確的診斷方法為電子顯微鏡觀測心臟切片中 Gb3 結晶，然而早

期治療對於法布瑞氏症器官病變有顯著的保護力[28]，各方研究也不停歇的重

新審視此診斷方法。我們的研究認為當心臟出現 Gb3 結晶再給予治療已經太晚

[48]，因為心臟的病變是不可逆，這個時期的病人給予酵素替代療法只能減緩

病情惡化，但是 Gb3 結晶已造成的心臟細胞損傷並不能用酵素替代治療法回

復，這促使我們檢討常規檢驗項目敏感度是否不足並積極尋求不同檢驗方法。

這項研究中我們意外的發現三位 IVS4 基因型病人臨床主訴或超音波檢查有心

臟病變跡象，但病人心臟切片使用常規電子顯微鏡檢查時沒有 Gb3 結晶沉積，

為了達到更高的專一性與敏感性我們開始嘗試免疫螢光染色方式，利用來自日

本 Sakuraba 博士慷慨贈與的高專一性抗 Gb3 抗體進行染色[49]，並用共軛交螢

光顯微鏡進行檢測與畫面擷取，實驗結果顯示利用免疫螢光染色的方式，我們

可以發現三位病人的心臟切片已有明顯的 Gb3 堆積 (圖一)，隨後我們使用更正

總細胞螢光強度(corrected total cell fluorescence, CTCF)量化此檢驗方式，可以看

到 IVS4 病人心臟螢光強度數值有顯著的上升 (圖二)，這項結果指出在心肌細

胞中 Gb3 結晶可被電子顯微鏡觀測以前，Gb3 分子已經堆積在心肌細胞之中，

並顯示免疫螢光染色法為一個更敏感的檢驗方法。

過去對於溶酶體儲積症的了解是由於基因突變失去酵素活性，導致無法被

代謝之物質堆積於溶酶體之中，隨著溶酶體堆積脹大使細胞生理失衡，但甚少

聽到堆積物質是否會導致溶酶體破裂直接造成細胞受損，因此我們也針對 Gb3

27

在細胞中的位置作探討，成功的 Gb3 染色讓我們得以觀測 Gb3 位於溶酶體的堆

積情形，結果令我們意外，由螢光染色的圖片中可以發現不同病人 Gb3 所在位

置有明顯差異 (圖三)，我們更進一步驗證 Gb3 與溶酶體位置共存的關係是否可

以連結其他臨床檢驗的結果 (法布瑞氏症心臟病變、電子顯微鏡觀測 Gb3 結晶)

找到關聯性，利用直線線性回歸公式計算臨床檢驗結果分數並配合染色結果找

到 R2高達 0.9652 的回歸線，顯示當 IVS4 病人沒有心臟病變且電顯 Gb3 結晶陰

性時 Gb3 和 LAMP-1 有大於 70% colocalization，而隨著病人的心臟出現症狀降

低為 50 % colocalization，當 Gb3 結晶陽性 Gb3 和 LAMP-1 幾乎沒有

colocalization (圖四)，這項結果提供非常好的證據 1.當 Gb3 結晶出現時心肌細

胞無法再維持正常的溶酶體，Gb3 分子是否被侷限於溶酶體與心臟病變有重要

關聯。2. 心臟病變出現時間較結晶出現早。這項發現說明現階段以電顯方式檢

查 Gb3 以為時已晚，不可逆之心臟病變已發生，值得思考是否使用高專一且高

敏感的免疫螢光染色方法作為 IVS4 病人檢驗方法。且值得關注的是兩位經過

一年酵素替換治療的病患依舊有大量 Gb3 分子(圖三)，且使用微分干涉差顯微

鏡（differential interference contrast microscope） 觀察切片表面時可以看到有

Gb3 分子的部位有較多的凹凸結構，可以顯示細胞內的顆粒結構，而此現象在

三位沒有 Gb3 結晶的 IVS4 病患中並未觀察到。

2. 早期 CD8 T 細胞浸潤至 IVS4 病人之心臟組織

我們實驗室過去研究發現 IVS4 型法布瑞氏症病人周邊血液 CD8 T 細胞減

少，且藉由表面接受器染色結果發現，IVS4 病人的周邊血 CD8 T 細胞處於較

為活化的狀態[50]，對此我們很疑惑這些 CD8 T 細胞活化後數量反而減少是否

因為細胞受到誘導離開周邊血液? 於是我們提出一個假設: IVS4 病人心臟組織

異常的 Gb3 累積現象，刺激周邊血液 CD8 T 細胞並誘導其移動至病灶器官內。

為證明假設我們利用法布瑞氏症病人心臟切片驗證，我們發現心臟切片用常規

28

電子顯微鏡檢驗有 Gb3 結晶的 IVS4 病患心臟切片中確實有 CD8 T 細胞浸潤

(圖五)也證明我們的假設，心臟組織中 Gb3 累積現象刺激周邊血液 CD8 T 細胞

並引導其移動至心臟，隨後我們更深入探討 CD8 T 細胞浸潤的時間點是否與臨

床檢驗結果有關聯，我們將三位心臟沒有 Gb3 結晶的 IVS4 病人心臟切片進行

螢光免疫染色，並觀察到切片中有 Gb3 訊號且 CD8 T 細胞已在這個時間點浸潤

至心臟(圖六 A)，為確立更精確地量化方式我們統計 CD8 紅色訊號浸潤的範

圍，可以看到 IVS4 的病人心臟受 CD8 T 細胞浸潤面積顯著大於非法布瑞氏症

心臟捐贈者(圖六 B)，早期的 CD8 T 細胞浸潤現象同時也證明 IVS4 病人的免疫

系統受到代謝物質的影響導致錯亂。

3. 早期 Gb3 累積心臟切片中檢測出活化之細胞凋亡訊號

心肌細胞中我們已觀察到 Gb3 的分子，且看到早期 T 細胞就已經浸潤進入

心臟，隨後心臟細胞溶酶體受損導致 Gb3 曝露於溶酶體外，最後形成 Gb3 結

晶，才能被電子顯微鏡觀測，接續的問題就是較好的用藥時機點在哪裡，我們

假設早期浸潤的 CD8 T 細胞會進行作用，且同一時間 Gb3 分子已存在造成細胞

死亡，為證明細胞死亡發生我們挑選細胞凋亡路徑的中樞 caspase 3 進行染色，

為了精確得到已發生細胞凋亡的心肌細胞，我們使用螢光免疫染色法針對

Active caspase 3 配合 Gb3 抗體進行染色，結果顯示三位沒有心臟切片 Gb3 結

晶的 IVS4 病人都有顯著的 active caspase 3 訊號(圖七) 。表示當 Gb3 分子累積

於心臟中且有 CD8 T 細胞浸潤時，心臟細胞已有部分誘發細胞凋亡路徑的分子

走向細胞死亡的命運。兩位已接受治療一年再進行切片者也可以看到有 active

caspase 3 訊號，顯示他們的心肌細胞依然受到損傷走向細胞死亡的路徑，綜合

以上結果我們認為現今的檢驗方法雖然專一性高但敏感性過低，病人心肌細胞

已經處於溶酶體嚴重受損的狀態且細胞早已開始死亡，應提早以免疫螢光染色

法檢驗 Gb3 分子，在免疫細胞浸潤以及細胞凋亡訊號活化時及時給予治療，阻

29

止心臟組織病變的產生才能對病人有更好的保障。

4. 用藥前後血漿細胞激素濃度並未改變

由於目前常規檢驗方式敏感度較低，我們雖然使用心臟切片建立早期檢驗

Gb3，顯示為高專一高敏感的早期檢驗方式，但是取得心臟切片是一項侵入性

高的醫療行為，且一般病患不願多次實施心臟切片，故無法應用於病程及用藥

後的追蹤，對於用藥的。上述研究中我們可以看到周邊血液 CD8 T 細胞活化移

動至 Gb3 堆積之心臟組織，Gb3 堆積對於免疫系統造成影響也讓我們可以從中

著手，所以我們選擇採用低侵入性的抽血方式，藉由收集病人血漿試圖追蹤並

分析細胞激素希望可以找到生物標記做為未來診斷及用藥後的癒後追蹤，藉由

MACSPlex 12 cytokines kit 我們供通量的分析病人治療前後血漿中細胞激素含量

是否有改變，希望可以找到治療後有顯著差異的細胞激素做為追蹤病程的生物

標記，結果意外的是追蹤治療 9 至 16 個月的病人們都並未改變細胞激素的含量

(圖八)，接著我們分析比較健康捐贈者、未治療 IVS4 病人與治療後 IVS4 病人

血漿中細胞激素含量是否不同，結果顯示病人們發炎細胞激素 IFN-, IL-6, IL-

9, and IL-12 有顯著增加 (圖九)，結果顯示病人血漿中發炎細胞激素較多，但是

給予治療前後病人細胞激素並不會變動，同時也讓我們思考是否現今病人確診

病接受治療時心臟已嚴重受損不可逆，重組酵素的施打對於心臟組織並無改善

作用。

5. 法布瑞氏症病患體外刺激 T 細胞後分泌較多細胞激素

過去研究發現 IL-12 由單核球或巨噬細胞分泌可促使 CD8 T 細胞活化並移動

至發炎器官[51]，上述發現病人血漿表現高量 IL-12 (圖九) 為 CD8 T 細胞浸潤

心臟一個潛在的解釋。我們實驗室過去於病患心臟切片染色檢查巨噬細胞，發

現巨噬細胞浸潤至心臟[50]，為驗證 IL-12 是否由單核球或巨噬細胞分泌造成

30

CD8 T 細胞活化離開周邊血液，我們嘗試使用 LPS 刺激周邊血液存化單核球並

檢測 IL-12 分泌量期望看到病患單核球經過刺激會有異常的 IL-12 分泌，可惜結

果不如預期健康捐贈者與病人單核球分泌 IL-12 無統計上的差異 (圖十)。為了

解釋 CD8 T 細胞之浸潤以及活化現象，我們最終決定針對 T 細胞進行深入的調

查，藉由 MACS 分離方法將病人周邊血液中 T 細胞純化，並以 Dynabeads®

Human T-Activator CD3/CD28 進行體外刺激，期望可以藉由此實驗觀測病患 T

細胞活化之差異，首先我們先計算 T 細胞刺激後分裂趨勢，發現 IVS4 以及

classical 法布瑞氏症病患 T 細胞分裂比例高於健康捐贈者 (圖十一 A)，由於 T

細胞活化分裂時會分泌 IL-2，隨後我們分析體外刺激後的 IL-2 表現量，結果顯

示 IVS4 以及 classical 法布瑞氏症病患 IL-2 分泌量高於健康捐贈者 (圖十一

B)，最後我們著眼於 CD8 T 細胞分泌之發炎細胞激素 IFN-，經過刺激 IVS4 以

及 classical 法布瑞氏症病患 T 細胞產生之 IFN-遠高於健康捐贈者 (圖十一

C)。此結果讓我們了解法布瑞氏症病患 T 細胞有異常活化的免疫反應，伴隨著

刺激法布瑞氏症病患 T 細胞大量分裂同時製造刺進發炎之細胞激素，也提供 T

細胞浸潤心臟組織造成促進異常發炎，導致細胞凋亡最終造成心肌病變更明確

的連結。

目標二: 探討鞘醣脂代謝受阻對單核球/巨噬細胞功能之影響

1. 部分法布瑞氏症病人單核球溶酶體失去恆定

近年很多研究指出溶酶體的恆定對於免疫反應的影響但對於溶酶體儲積症

的研究多半並未深入探討分子機轉，我們希望可以將法布瑞氏症的溶酶體現象

深入探討，為此先前研究對於周邊血液我們發現單核球有最高的 GLA 基因表現

[52]，單核球為吞噬細胞的前身，可以吞噬少量的紅色素、脂質、醣蛋白等病

藉由溶酶體代謝回收利用，我們進而使用抗 Cathepsin L 抗體染色檢查法布瑞氏

31

症病人中的單核球溶酶體恆定性，當溶酶體處於健康狀態時 Cathepsin L 會被侷

限於溶酶體中，螢光影像將顯示為顆粒亮點狀分佈在細胞質，反之當溶酶體堆

積代謝物質受損，溶酶體將無法維持胞器表面膜的通透性開始破裂，螢光影像

中 Cathepsin L 將失去點狀，並且形成霧狀訊號散佈於細胞質中[53]。經過實驗

我們發現健康捐贈者周邊血液單核細胞有大量 Cathepsin L 呈現亮點散布在細胞

質中(圖十二 A) ，而 IVS4 病人的 Cathepsin L 有部分視野呈現亮點部分也同時

有視野呈現霧狀分布於細胞質(圖十二 B) ，最後 Classical 病人可以看到 Pt. 35

之 Cathepsin L 染色呈現部分視野呈現亮點部分也同時有視野呈現霧狀分布於細

胞質，但 Pt. 39 和 Pt. 40 細胞內 Cathepsin L 訊號完全呈現霧狀亦散出溶酶體(圖

十二 C)。這項結果讓我們初步觀測到溶酶體儲積症病患中部分細胞溶酶體已經

處於失衡狀態，其內的酵素及分子將溢散至細胞質中。

2. 法布瑞氏症病人單核球表現粒線體危險因子

溶酶體的恆定對於免疫系統已有相當多的研究，尤其在發炎反應上溶酶體

扮演相當重要的腳色，單核球/巨噬細胞的身為先天免疫反應的一員，他們會快

速的啟動免疫反應釋放發炎物質，主要的是走 inflammasome 分子路徑利用

DAMPs 和 PAMPs 進行第一次刺激，隨後配合細胞內危險因子或是細胞外的

ATP 等危險因子獲得第二道刺激讓 pro IL-1進行切割隨後釋放 IL-1，我們

實驗室過去研究中發現 NLRP3 在病人血球中基因表現量上升[50]，顯示

inflammasome 此先天性免疫路徑可能活化，我們想藉此尋找可以活化

inflammasome 的危險因子，使用細胞表面標定區分不同免疫細胞讓我們可以區

分周邊血液中單核球、B 細胞、CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、樹突細胞和 NK 細

胞 (圖一三 A) ，並利用 molecular probe 針對不同可能之危險因子染色。目前

已知的危險因子可以來自各種胞器，但最主要的來自溶酶體以及粒線體，溶酶

體內部的金屬離子、酸鹼值、內在酵素等都可以作為危險因子，我們也證實溶

32

酶體內的 cathepsin L 有漏出的現象；另一方面粒線體的 DNA、過氧化物、及老

舊未被代謝的粒線體皆可成為危險因子，由於粒線體代謝需經過自噬反應

(Autophagy) 過程會將粒線體包覆後形成 autopahgosome 並連接溶酶體形成

autolysosome 利用溶酶體內的酵素將老舊粒線體代謝，而法布瑞氏症為溶酶體

儲積症我們認為其自噬反應的過程將受到阻礙，老舊粒線體也會成為危險因子

誘發 inflammasome 的一員，為了探討老舊的粒腺體含量我們使用 Mitotracker

green 的活細胞胞器染劑可以準確地將粒線體膜蛋白染為綠色，觀測粒線體含量

(圖一三 B)，同時我們也使用 Mitotracker red 染劑幫助我們區分老舊粒線體膜，

Mitotracker red 可以被粒線體代謝，當粒線體健康時由於呼吸墊子傳遞戀造成內

外電賀差異並代謝 Mitotracker red 染劑型呈紅色，反之老舊粒線體將無法有效

的電子傳遞因此將顯現較少的 Mitotracker red 訊號 (圖一三 C)，最後觀察整體

細胞的過氧化物含量我們選擇使用 Cell ROX 染劑，此染劑會被細胞內的活性氧

化物質氧化形成綠色以便觀測定量 (圖一三 D)，結果顯示發現 Mitotracker green

(粒線體含量) 在第一型病人單核球表現並未增加 (圖十四 A) ，而 Mitotracker

red (粒線體膜電位) (圖十四 B)和 Cell ROX (細胞過氧化物) (圖十四 C)兩個危險

因子也沒有統計上的差異。這項結果讓我們好奇部分的單核球有溶酶體的滲漏

失去溶酶體活性，但是粒線體的危險因子卻未找到顯著差異，也伴隨著另一個

問題 inflammasome pathway 是否真的被活化。

3. 法布瑞氏症病人單核球 inflammasome pathway 沒有異常活化

為了證實 inflammasome 的活化狀況，我們選擇先用 LPS 刺激單核球給予所有

細胞第一個刺激並比較細胞內是否含有危險因子可以活化 inflammasome，採用

FLICA 染色技術檢驗，inflammasome 活化時會將 procaspase-1 改變為 active

caspase-1，而 FLICA 染劑是接合螢光發光蛋白的 active caspase-1 的抑制劑可以

專一性的螯合 active caspase-1 故可偵測 inflammasome 活化，給予周邊血球

FLICA 染劑後表面染色進行圈選單核球 (圖十五 A)，我們統計所有單核球內

33

FLICA 訊號的幾何平均螢光強度，由於個體之間差異甚大我們並未看到病人單

核球有異常活化的趨勢 (圖十五 B)，為消除個體差異的影響我們將所有人單核

球細胞的基礎值作為 1，並以刺激 LPS 或是 LPS 加 ATP 的實驗組進行常態化分

析 (normalization) ，以此方法我們依然沒辦法區分健康者與 IVS4 或是

Classical 病人各組間差異 (圖十五 C)。由於在所有單核球細胞分析時我們我法

看到差異，隨後我們將 FLICA 訊號陽性 (inflammasome 活化) 之單核球圈選出

來做比較，試圖找尋是否各組間可以看到單核球在受到刺激後產生 active

caspase-1 的程度有所不同，首先我們統計 FLICA 訊號陽性單核球的比例，結果

顯示給不同人對於刺激的反差異巨大無法看到各組間的差異(圖一六 A)，隨後

我們使用幾何螢光強度進行統計也同時操作常態化分析 (normalization) 以去除

不同個體起始值的差異，結果依然未在統計上看到病人與健康捐贈者有差異

(圖一六 B、C)。過去研究也指出 inflammasome 活化後可能走向細胞死亡，因

此我們也嘗試深入探討細胞死亡路徑，遺憾的是細胞死亡路徑的觀察中我們未

能在病人及健康捐贈者中找到任何差異 (圖十七)，為確定 inflammasome 沒有

異常活化現象，我們 LPS 刺激過後的細胞進行 ELISA 定量 inflammasome 活化

之產物 IL-，結果顯示病人 IL-表現如同預期與健康捐贈者沒有顯著差異 (圖

十八)。總結我們 FLICA 染色結果病人單核球 inflammasome 活性沒有異常活化

現象。

4. 法布瑞氏症單核球接受器內化回收受到阻礙

由於發炎體的檢測中我們受困於不同個體對於刺激的反應太過巨大，但是

我們依然看到法布瑞氏症病人免疫系統出現異常，對此我們決定從另一個對於

免疫反應有重要影響的分子 -表面接受器- 著手研究，過去已有不少學術文章

提出研究溶酶體代謝異常容易造成細胞膜回收出現問題，為研究表面接受器的

回收我們選擇兩個接受器: 1. 細胞膜接受器 CD163 –負責血色素回收，此接受

34

器也可同時作為發炎指標，當發炎反應出現時 CD163 會增加其細胞表面的表現

量，隨著發炎反應逐漸釋放為游離狀態離開細胞表面[54]，螯合周邊死亡紅血

球逸散出的血色素，以利後續單核球清除並回收血色素；2. 溶酶體及細胞膜接

受器 M6PR (CD222) –負責接收重組酵素藥物，目前酵素替代治療的原理為重組

人類 GLA 酵素並添加 M6P 分子，此設計架構於細胞內本身生產溶酶體素的方

式，酵素在細胞內備製造後會接合 M6P 蛋白並送往溶酶體，溶酶體表面的

M6PR 辨識後吞入並切 M6P 蛋白，其目的是讓酵素專一的進入溶酶體並在酸性

的環境下出現活性[28]。我們收集健康受試者、IVS4 病人與 classical 病人的周

邊單核細胞進行螢光免疫染色分析其表面接受器的含量 (圖十九 A)，如同預期

的是 CD163 在病人單核球表面確實增加 (圖十九 B)，此結果可能源於溶酶體無

法回收表面接受器，亦或是發炎的環境導致 CD163 大量表現，為此我們進而分

析 M6PR 此接受器為病人用藥的目標接受器，我們發現病人單核球細胞膜上

M6PR 表現量較多 (圖二十 A) ，但有趣的是當我們將單核球溶酶體和細胞表面

的 M6PR 加總比較，可以發現健康者 M6PR 在整個細胞的表現量較多 (圖二十

A)，我們將此有趣的現象進行細胞膜與整個細胞的 M6PR 比例換算，可以看到

健康者細胞膜上的 M6PR 約為全細胞的 15 %，而病人細胞膜上的 M6PR 高達全

細胞的 25~40 % (圖二十 B)，總結這邊的研究我們發現病人單核球表面接受器

增加，溶酶體儲積症確實影響單核球細胞的表面接受器回收，更意外的是同時

法布瑞氏症病患單核球 M6PR 蛋白整體於細胞的表現量減少。

35

討論

近年來溶酶體對於免疫系統的調控受到注目，所以溶酶體儲積症對於免疫

系統的影響也成為檢驗、治療及追蹤疾病的突破方向，本研究針對法布瑞氏症

探討其代謝物質 Gb3 影響免疫細胞反應導致免疫系統失衡。

法布瑞氏症在整個東亞地區法布瑞氏症的流行率相當高尤其又以 IVS4 型

最為常見，透過新生兒篩檢台灣法布瑞氏症病人有 86%為 IVS4 型[55]，因此本

研究第一個目標專注於 IVS4 病人的檢驗方法學建立，以往檢驗方法依賴電子

顯微鏡觀察心臟切片磷脂質的累積形成的空泡現象，亦有人稱之為 Gb3 結晶，

雖然過往研究 Gb3 累積於心臟細胞中只所佔的質量約為心臟的 1%-2%而已，並

不足以成為心臟肥大的理由，因此有其它路徑參與心臟肥大，細胞死亡與心臟

纖維化等過程[56]，榮總罕見疾病中心曾調查發現部分病患確定已經發展為心

臟纖維化，但未表現出左心室肥大也沒有顯著的臨床症狀/心肌病的，表示疾病

的進展可能是沉默的[57]，為此也進行檢查其中 17 位病患心臟切片其結果顯

示，他們的心肌細胞均具有顯著的 Gb3 結晶[48]，這表明 Gb3 積聚和組織損傷

可能早於心肌病出現明顯症狀。隨著在榮總罕見疾病中心進行的心臟切片檢查

的數量增加，觀察到大多數患有 IVS4 患者也顯示出顯著的 Gb3 結晶。然而，

有三名 IVS4 患者被懷疑患有法布瑞氏症心臟受損，但通過常規組織病理學檢

查和電子顯微鏡觀察到其活檢結果未觀察到 Gb3 結晶的跡象。本項研究利用免

疫螢光染色方法見敏感性更佳的檢驗方式(圖一)，並利用更正總細胞螢光強度

(CTCF) 方式準確定量心肌細胞堆積 Gb3 的量(圖二)。我們對於 Gb3 的堆積位

置也進行討論，為了觀察溶酶體的表現，我們加入了 Lamp1 (lysosomal-

associated membrane protein 1) 的染色，此蛋白為位於溶酶體膜上的醣蛋白，負

責維持溶酶體的骨架、酸鹼值以及代謝功能[58]，並且在自噬作用扮演重要腳

色，當細菌、病毒、老舊胞器透過自噬作用回收時，p62 蛋白會接合目標物並

促使 LC3 活化，形成膜狀物質過程中 LC3 會使用另一端接合和 LAMP1 連接溶

36

酶體進而融合形成 autolysosome[59, 60]，我們從結果中看到不同病患 Gb3 與溶

酶體的位置有很大的差異，為此我們將病人的臨床資料進行量化建立臨床分

數，利用影像分析軟體將所有 Gb3 訊號與 LAMP1 訊號統計重疊比例做為 Gb3

與溶酶體位置的指標。可以發現當 Gb3 限制於溶酶體中病人所得的臨床分數較

低，而 Gb3 滲漏至溶酶體外時病人的臨床分數開始增加，兩位有 Gb3 結晶病友

心肌病癥經過酵素替代治療一年，令人意外的可以看到他們 Gb3 完全沒有侷限

在溶酶體中(圖四)，於 2014 年曾有研究指出，IVS4 病人的心臟組織切片中可以

看到磷脂質的累積，這樣的累積會在 ERT 治療之後會漸漸降低，但是心臟組織

纖維化以及組織間空泡的現象並不會隨著 Gb3 的減少而消失，而組織纖維化亦

會增加患者致死率[61]。我們的結果都指出即便接受治療一年只用螢光免疫染

色依然可以看到 Gb3 的分子，並且當心肌細胞中溶酶體失去恆定後不能以酵素

體帶治療恢復，這也可以解釋 ERT 治療後組織間空泡的現象並不會隨著 Gb3 的

減少而消失，因為細胞失去溶酶體的酸性環境後才給予酵素，細胞中已經無法

形成酵素所需的環境，且自噬作用受到阻礙細胞生理受到嚴重影響，以上情形

皆不能被酵素替代療法復原，以至於纖維化的情形依然發生。

過去我們實驗室發現 IVS4 病人周邊血液 CD8 T 細胞減少，並且較多 T 細

胞處於活化狀態[50]，我們將以使用免疫螢光染色法檢驗呈現 Gb3 陽性的病人

切片進行免疫螢光染色，藉由區分不同時期的病人我們希望找到 CD8 T 細胞浸

潤的時間點，結果顯示只有 Gb3 呈陽性的各時期 IVS4 病人皆有 CD8 T 細胞浸

潤(圖六) ，遺憾的是我們沒有更早期的病人可以觀察，未能找到 CD8 T 細胞更

早期浸潤至心臟的時間點，且我們遺留問題: CD8 T 細胞受到何種刺激物被吸引

而浸潤心臟組織? CD8 T 細胞去心臟中的作用是甚麼是否釋放毒殺物質?

過去研究指出心臟受損會導致免疫反應活化，巨噬細胞聚集至受損部位與

凋亡細胞周遭，釋出細胞激素引起發炎反應，並且吞噬死亡細胞與碎片。巨噬

細胞釋出 TGFβ 激素促進結締組織以及新生的血管所構成的肉芽組織生成，進

一步導致纖維母細胞活化以及內皮細胞增生的現象，造成心臟組織纖維化的結

37

果，我們實驗室過去研究發現有巨噬細胞的浸潤[50]，更重要的是有些 Gb3 染

色會與巨噬細胞相疊和，推測 Gb3 累積導致心臟細胞凋亡，引發巨噬細胞聚集

進行吞噬作用（Phagocytosis）所導致。為了確定心臟細胞受損誘發細胞凋亡我

們使用免疫螢光染色針對細胞凋亡上的關鍵分子 ''Active caspase 3'' 染色，從螢

光影像看到只有 Gb3 呈陽性的且 CD8 T 細胞浸潤的各時期 IVS4 病人皆 active

caspase 3 訊號，表示病人從 Gb3 分子出現時已經開始刺激細胞凋亡路徑，也證

明現今檢驗方法呈現陽性給予藥物已經為時已晚，早在病人未出現心肌病變且

Gb3 為於溶酶體之中未形成 Gb3 結晶時心肌細胞已開始受損，且免疫細胞浸潤

的現象加速纖維化的進展，我們必須重新審視病人的用藥時間以達到預防心臟

病變延長病人壽命的目標。

細胞激素是調節免疫系統的關鍵角色，讓不同的細胞相互溝通達到活化、

去活化、吸引移動等效果[62]，我們希望以細胞激素作為生物標的以利追蹤法

布瑞氏症病情，同時也讓我們了解法布瑞氏症病人體內的免疫系統狀態，過去

研究中發現 IL-1、IL-1、TNF-、IL-10 於病人血清中表現量增加[63, 64]，本

研究發病人血漿中發炎細胞激素 IFN-, IL-6, IL-9, and IL-12 有顯著增加 (圖

九)，而用追蹤同一病人用藥前後並未看到任一細胞激素出現顯著的趨勢，而比

較已長期施打藥物病人與未使用藥病人細胞激素表現有所不同，已長期用藥病

人血漿中細胞激素普遍增加，尤其是一位病患數值約為他人的兩倍，比對臨床

資料，其心臟肥大現象非常嚴重，肥大比例幾乎等於正常人四個心臟大小，對

此我們認為過往的檢驗方式病人已經處於非常嚴重之心肌病變狀態，顧相比未

只用藥物之病人整體細胞激素上升，且如同上述所說酵素替代療法只能減緩病

情惡化沒有清除 Gb3 結晶並改善心肌病變的功用，我們的實驗結果也呼應此現

象用藥過後細胞激素未出現顯著上升或下降趨勢。

發炎細胞激素 IL-12 有活化 CD8 T 細胞的能力，我們看到血漿中 IL-12 上

升希望可以連結 CD8 T 細胞活化並浸潤至心臟組織，於是我們將主要在血漿中

分泌 IL-12 的單核球純化給予刺激期望看到異常的 IL-12 分泌，可惜結果並不如

38

預期 (圖十)。對此我們將 T 細胞直接純化給予刺激觀察 T 細胞之反應，結果吝

人驚訝的是不論 IVS4 或是 Classical 病患 T 細胞經過刺激後分裂速率都比健康

受試者高，且大量分泌細胞激素 IL-2，更重要的是促進發炎及細胞受損的細胞

激素 IFN- 分泌量相較健康受試者提高百倍，讓我們了解病患 T 細胞免疫反應

過度活化對於浸潤心臟 CD8 T 細胞造成心臟組織損傷加速心肌病變給予連結以

及證據。

本研究之目標二希望能深入探討法布瑞氏症代謝受阻後對於免疫細胞的影

響，過去我們實驗室已發現 IVS4 病人周邊血液中會表現較高的非典型單核球

及樹突細胞，其中非典型單核球被視為發炎疾病的生物標的[65] ，同時非典型

單核球也被視為分化成巨噬細胞的前期細胞[66]；而樹突細胞為先天免疫系統

的一員，最重要的功能為抗原呈現，可以外來病原消化代謝微小的氨基酸片段

進行抗原呈現，吸引 B 或 T 細胞給予刺激誘導高專一性的細胞群產生，是啟動

後天免疫反應的關鍵[67]，過去我們也進行相關探討發現綜觀整體免疫細胞單

核球與巨噬細胞 GLA 基因以及蛋白質含量最高[52]，而後我們將研究重點專注

在 GLA 基因會高度表現的單核球上，過去研究中也有報導法布瑞氏症病人 IL-

1β 增加[63]，IL-1β 與過度的發炎反應有關目前已知 IL-1β 主要來源為單核球及

巨噬細胞[63, 68]。隨著我們對於 IL-1β 的生成路徑探討，提出一項假設法布瑞

氏症病人體內已有活化之危險因子來自於溶酶體以及粒線體，所以當發炎體以

及 IL-1β 過度活化，但是結果看來不論從 IL-1β 還是發炎體的觀測中都沒有看到

法布瑞氏症病人與健康受試者有顯著的差異，更令人疑惑的是發炎體上游的來

自溶酶體的危險因子只有部分細胞呈現，粒線體的危險因子只有些許差異，其

中一項原因是此實驗中健康受試者表現非常不同，我們認為每個人基因以及生

活環境的多樣性導致我們所收集的資料完全因人而異，無法使用臨床檢體統計

出顯著差異，另一方面我們認為目前抽血受試的法布瑞氏症病人是已經施打酵

素替代治療藥物的病人群，經過施打藥物新生的周邊血液的免疫細胞並未得到

大量 Gb3，過去我們實驗室染色結果也發現 Gb3 或是溶酶體的量在接受治療號

39

的病人群，只有些微高於健康受試者[50]，我們猜測新生的免疫細胞並未受到

溶酶體失衡的影響依然細胞生理維持恆定狀態，未來在發炎體的假設可以於基

因剃除老鼠或是細胞株實驗加以設計驗證。

單核球除了可以進行吞噬作用去除外來病原，還有一個重要功能為回收細

胞物外有用資源保持身體恆定，常見的方式為表面接受器接觸到特定的物質後

進行胞吞作用[69]，最廣泛看到的例子心血管疾病中巨噬細胞表面接受器 CD36

可以接收血液中的氧化低密度膽固醇(oxidized LDL) ，並且刺激本身形成最後

形成 form cell 造成發炎反應，導致心血管疾病惡化[70]，而其中溶酶體在巨噬

細胞內的角色更為重要，正常的溶酶體所擁有的酸性環境內含的酵素擁有正常

活性，進而代謝所有被送進溶酶體的物質並以囊泡包裹講解後的小分子運送至

溶酶體外部利用，同時將表面接受器送回細胞膜表面再次等待下次回收，我們

提出假設: 法布瑞氏症病人細胞中 Gb3 無法順利被代謝而大量累積在溶酶體

中，會改變了溶酶體中的酸性環境條件，使溶酶體在代謝產生問題[71]，並造

成表面接受器大量上升影響單核球生理功能，本研究顯示單核球細胞表面接受

器回收受阻，細胞膜接受器 CD163 – 負責血色素回收，過去研究也發現此接受

器不只有回收作用也可同時作為發炎指標，當發炎反應出現時 CD163 會增加其

細胞表面的表現量，隨著發炎反應逐漸釋放為游離狀態離開細胞表面，螯合周

邊死亡紅血球逸散出的血色素，以利後續單核球清除並回收血色素[54, 72]，

CD163 回收血色素時會將血色素分子以胞吞方式帶入細胞內前溶酶體，將過降

解形成鐵離子及膽色素，目前此特性也被運用當作藥標記，以血色素分子接合

特地藥物可以有效的送入單核球內，配合是當設計在溶酶體降解後產生藥性

[54]。CD222 又稱為 M6PR (mannose-6-phosphate receptor) ，目前酵素替代治療

目標物質，其應用原理為細胞內本身生產溶酶體素的方式，酵素在細胞內製造

後會接合 M6P 蛋白並送往溶酶體，溶酶體表面的 M6PR 便是後吞入並切除此蛋

白目的是讓酵素專一的進入溶酶體並在酸性的環境下出現活性，重組人類 GLA

酵素設計架構於此概念，將 GLA 酵素添加 M6P 分子被表面 M6PR 接合後送入

40

溶酶體，我們實驗結果看到 CD163 在病人單核球表面確實增加 (圖十八 B)，顯

示能源自於溶酶體無法回收表面接受器，亦或是發炎的環境導致 CD163 大量表

現，為此我們紛而分析 M6PR 此接受器為病人用藥的目標接受器，我們發現病

人細胞膜上 M6PR 表現量較多，但有趣的是當我們將溶酶體和細胞表面的

M6PR 加總比較，可以發現健康者細胞膜上的 M6PR 約為全細胞的 15 %，而病

人細胞膜上的 M6PR 高達全細胞的 25~40 %，表示細胞回收表面接受器出現嚴

重的影響，另一方面我們也對於酵素替代治療的效率提出疑問，是否很多酵素

被接合於細胞表面無法順利進入細胞之中? 且只有單核球大量表現 M6PR 其他

免疫細胞則表現較少，這方面研究對於病人用藥以及免疫系統的探討值得再更

深入追蹤下去。

本項研究藉由螢光免疫染色法建立診斷方式，並發現免疫細胞浸潤同時出

現心肌細胞凋亡現象，且分別刺激先天免疫細胞以及後天免疫細胞深入挖掘免

疫系統的異常，期待對未來病人用藥安全有更進一步幫助，提升病患之健康及

福祉。

41

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48

圖片

圖一 : 以螢光免疫染色法檢測電顯結晶未檢出之 IVS4 病人心臟組織。

Non fabry donor 和 IVS4 patient (Pt.1 ~ 3)之心臟切片經固定、打洞、使用 anti

Gb3 抗體染色，使用二抗 Alexa647-anti mouse 抗體呈現螢光 (綠色為軟體套

色)，藍色為 Hochest 染色之細胞核。(A) 使用 Non fabry donor 心臟切片進行二

抗螢光控制組，不含 anti Gb3 抗體顯示為背景值。(B) Non fabry donor 心臟切片

結果，做為陰性對照組。(C) 電顯判定有 Gb3 結晶之病患(Pt.6)切片染色結果，

做為陽性對照組。(D ~ F) 電顯判定 Gb3 結晶之病患 Pt.1 ~ 3 心臟切片染色結

果。比例尺為 50 m。Pt.1 ~ 3 之傳統病理分析於附錄一。

49

iso

typ

e

no

n f

ab

ry

fab

ry p

at i

en

t

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

B io p h y (-) P 't s ta in w ith G b 3

* * *

CT

CF

圖二 : 量化心臟切片 Gb3 免疫螢光染色強度的量化。

將未檢出 Gb3 結晶之三位病人 Pt.1~3 心臟切片螢光染色圖使用更正總細胞

螢光強度(corrected total cell fluorescence, CTCF)量化，各病人的 20X 視野下以

軟體計算 Gb3 螢光強度，並除以該視野下的細胞數，得到更正總細胞螢光強

度，每位病人計算兩個 20X 視野，螢光強度及細胞數目使用 image J 軟體，顯

著差異以 T test 統計，error bar 為 SEM，***表示 P < 0.001。

50

51

圖三: IVS4 病人心臟切片 LAMP1 和 Gb3 免疫螢光染色分析。

Non fabry donor 和 IVS4 patient (Pt.1 ~ 5) 之心臟切片經固定、打洞、使用

anti Gb3 抗體染色，使用二抗 Alexa 647-anti mouse 抗體呈現綠色螢光 (軟體套

色)，使用 FITC-anti LAMP1 抗體呈現紅色 (軟體套色)，藍色為 DAPI 染色之細

胞核。比例尺為 10 m。

52

圖四: Gb3 和 LAMP1 重疊比例與臨床病徵演進關係圖。

量化 Pt.1 ~ 5 之 LAMP1 染色與 Gb3 染色分布以及臨床病徵。(A)病人臨床

症狀計分表，Gb3 accumulation 以免疫螢光染色陽性作為標準，crystal deposit

以電子顯微鏡結果作為標準。(B) 使用 ZEN BLACK 軟體分析計算重疊比例，

使用 Pearson’s Correlation Coefficient =∑(𝐶ℎ1𝑖−𝐶ℎ1𝑎𝑣𝑔)(𝐶ℎ2𝑖−𝐶ℎ2𝑎𝑣𝑔)

√(∑((𝐶ℎ1𝑖−𝐶ℎ1𝑎𝑣𝑔)2(𝐶ℎ2𝑖−𝐶ℎ2𝑎𝑣𝑔)2

) 公式，計

算結果 coefficient 定義為 Gb3 和 LAMP1 在一起的 pixel 除以所有 Gb3 之 pixel

之百分比例，將各病人之 coefficient 以及臨床症狀分數使用直線線性回歸公式

計算關聯性。

53

圖五: 早期檢測 CD8 T 細胞浸潤至 IVS4 病人心臟組織

未檢出結晶之心臟切片 (Pt.1 ~ 3) 經固定、打洞、使用 anti CD8 抗體染

色，使用二抗 Cy3-anti rabbit 抗體呈現紅色螢光，藍色為 Hochest 染色之細胞

核。2nd Ab only 和 Non-FD Pt 比例尺為 80 m。Pt.1 ~ 3 比例尺為 10 m。

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圖六: 定量 CD8 T 細胞浸潤至 IVS4 病人心臟組織之程度。

定量分析 Pt.1 ~ 3 未檢出結晶之心臟切片 CD8 浸潤範圍。(A) 使用 Image J

軟體圈選 CD8 紅色螢光範圍以及細胞核藍色螢光範圍。(B) 計算圖切片上 CD8

範圍大小除以細胞核面積換算百分比。以 T test 統計， **表示 P < 0.01。

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圖七: Active caspase 3 於 Gb3 堆積之心臟切片的表現。

為了探討 Caspase-dependent cell death pathway 的活化情形，我們將有堆積

Gb3 之心臟切片進行免疫染色，使用抗 active caspase 3 抗體 (紅色)、Gb3 抗體

(綠色)，DAPI 作為核染色(藍色)。比例尺表示 20 m。

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圖八: 長期追蹤病人血漿未發現特定細胞激素隨時間產生變化。

追蹤不同治療時期典型法布瑞氏症及 IVS4 基因型病患血漿細胞激素。(A)

未治療之 IVS4 病患 Pt.12、Pt.13 以及未治療之典型病患 Pt.39、Pt.40，檢測治

療前後各時期血漿細胞激素追蹤趨勢。(B) 已接受長期治療之 IVS4 病患 Pt.6、

Pt.7、Pt.8、Pt.11 血漿細胞激素趨勢。

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圖九: IVS4 病人血漿細胞激素剖析。

分析 IVS4 病患血漿中細胞激素表現量，19 位健康捐贈者、三位尚未治療

IVS4 病人(untreated IVS4: Pt.12、Pt.13、Pt.21) 和五位已接受治療 IVS4 病人

(IVS4 treated: Pt.6、Pt.7、Pt.8、Pt.11、Pt.16) ，使用 MACSPlex 12 cytokine kit

分析血漿細胞激並分類不同發炎激素。(A) Th1 相關發炎激素分析統計；(B)

Th2 相關細胞激素分析統計；(C) Th9 和 Th17 相關細胞激素。以 T test 統計，

error bar 為 SEM， **表示 P < 0.01。

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圖十: LPS 刺激後單核球 IL-12 分泌量。

分離周邊血液中單核球，靜置培養液一天後使用 LPS 1 g/mL 刺激培養 12

小時後分析細胞激素濃度。IVS4 病患 Pt.9、Pt.14、Pt.22，Classical 病患 Pt.29、

Pt.30、Pt.32。(A) 病人及健康捐贈者血漿 IL-12 濃度。(B) 病人及健康捐贈者

單核球未刺激之 IL-12 濃度。(C) 病人及健康捐贈者單核球經過 LPS 刺激後 IL-

12。濃度 P 值以 T test 統計，**表示 P < 0.01。

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圖十一: 法布瑞氏症病患 T 細胞受到刺激後表現較多 IL-2 和 IFN-。

純化周邊血液中 CD3 陽性 T 細胞，使用 Dynabeads® Human T-Activator

CD3/CD28 刺激細胞激素分泌，分析三天 T 細胞反應趨勢以及個別時間點分泌

量差異。(A)以細胞計數儀計算細胞數目，並比較細胞分裂情形。(B) ELISA 檢

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測 T 細胞經過培養一至三天 IL-2 分泌量。(C) 以 ELISA 檢測 T 細胞經過培養

一至三天 IFN-分泌量。IVS4 病患 Pt.9、Pt.14、Pt.22，Classical 病患 Pt.29、

Pt.30、Pt.32。error bar 為 SEM，n = 3，趨勢圖 P 值以 Two way ANOVA 統計，

column factor 為不同組別基因型 (健康捐贈者與 IVS4 病人比較，健康捐贈者與

classical 病人比較)；點狀圖 P 值以 T test 統計。*表示 P < 0.05，**表示 P <

0.01，***表示 P < 0.001。

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圖十二: 法布瑞氏症病患部分周邊血液單核細胞溶酶體破裂滲漏 Cathepsin L。

周邊血液單核細胞固定打洞並用抗 Cathepsin L 抗體染色，利用螢光二抗放

大訊號，Cathepsin L 綠色螢光作為溶酶體滲漏之指標，細胞核為藍色螢光。(A)

三位健康血液捐贈者分別拍攝三個 100 倍視野。(B) 三位 IVS4 病患 Pt.17、

Pt.18、Pt.19 血液分別拍攝三個 100 倍視野。(C) 三位 Classical 病患 Pt.33、

Pt.37、Pt.38 血液分別拍攝三個 100 倍視野。使用共扼交螢光顯微鏡目鏡放大

100 倍拍攝，Zen blue 影像處理軟體，比例尺為 5 m。

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圖一三: 建立免疫細胞分群圈選圖及 Mitotracker Green、Mitotracker Red 和 Cell

ROX 染色。

周邊單核細胞經由螢光抗體免疫染色法，使用流式細胞儀分析、Flow jo 軟

體作圖。(A) 周邊單核細胞圈選 CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、B 細胞、NK 細

胞、樹突細胞和單核球。(B) CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、樹

突細胞和單核球 Mitotracker Green 染色線性圖比較。(C) CD4 T 細胞、CD8 T 細

胞、B 細胞、NK 細胞、樹突細胞和單核球 Mitotracker Red 染色線性圖比較。

(D) CD4 T 細胞、CD8 T 細胞、B 細胞、NK 細胞、樹突細胞和單核球 CellROX

染色線性圖比較。

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圖十四: 法布瑞氏症病患周邊血球粒線體危險因子較多。

(A) 周邊血液單核細胞使用 Mitotracker green 染劑染色，代表粒線體的含

量，隨後染螢光抗體區使用流式細胞儀區分細胞群並收集結果。(B) 周邊血液

單核細胞使用 Mitotracker red 染劑染色，代表粒線體的雙層膜電位差也表示粒

線體呼吸電子傳遞鏈功能，隨後染螢光抗體區使用流式細胞儀區分細胞群並收

集結果。(C) 周邊血液單核細胞使用 Cell ROX 染劑染色，表示細胞內所有活性

過氧化物之含量，隨後染螢光抗體區使用流式細胞儀區分細胞群並收集結果。

geometric mean fluorescence intensity (GMFI)由 Flow jo 軟體計算。IVS4 病患

Pt.11、Pt.15、Pt.16，Classical 病患 Pt.30、Pt.32、Pt.38。error bar 為 SEM，n =

3，P 值由 T test 統計，*表示 P < 0.05。

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圖十五: 法布瑞氏症病患 Monocytes active caspase 1 無異常活化。

周邊血液單核細胞，以 LPS 1 g/mL 刺激三小時並用 ATP 10 M 培養 15

分鐘檢測 caspase 1 活性，使用 FAM-FLICA® Caspase-1 Assay Kit 於單核球進

行 active caspase 1 染色。(A) FLICA 染色在不同控制組之線性圖結果，圖上顯

示比例以及 FLICA + Monocytes 為 untreat 組別之比例。(B) 單核球經 FLICA

染色利用 Flow jo 軟體計算幾何平均螢光強度結果。(C) 以未刺激控制組單核球

螢光強度作為 1，將其他實驗組螢光值 normalization。IVS4 病患 Pt.8、Pt.9、

Pt.11，Classical 病患 Pt.30、Pt.34、Pt.36。

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圖一六: 法布瑞氏症病患單核球 active caspase 1 活化程度無異常。

周邊血液單核細胞，以 LPS 1 g/mL 刺激三小時並用 ATP 10 M 培養 15

分鐘檢測 caspase 1 活性，使用 FAM-FLICA® Caspase-1 Assay Kit 於單核球進行

active caspase 1 染色(A) 單核球在不同控制組刺激後 FLICA 陽性百分比例。(B)

FLICA 陽性單核球經過不同控制組刺激，使用 Flow jo 軟體計算幾何平均螢光強

度結果。(C) 以未刺激控制組單核球螢光強度作為 1，將其他實驗組螢光值

normalization。IVS4 病患 Pt.8、Pt.9、Pt.11，Classical 病患 Pt.30、Pt.34、Pt.36。

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圖十七: 法布瑞氏症病患單核球經由 LPS 刺激未發生異常細胞死亡路徑。

周邊血液單核細胞，以 LPS 1 g/mL 刺激三小時並用 ATP 10 M 培養 15

分鐘，進行 FLICA 染色。(A)圈選 FLICA 陽性 PI 陽性之單核球顯示為

pyroptosis 死亡路徑的單核球比例。(B) 圈選 FLICA 陰性 PI 陽性之單核球顯示

為 apoptosis 死亡路徑的單核球比例。IVS4 病患 Pt.8、Pt.9、Pt.11，Classical 病

患 Pt.30、Pt.34、Pt.36。Pyroptosis 以及 apoptosis 圈選方式詳見附錄五。

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圖十八: 法布瑞氏症病患 LPS 刺激單核球分泌 IL-1 beta 分泌量與健康捐贈者無

顯著差異。

周邊血液單核細胞，以 LPS 1 g/mL 刺激三小時並用 ATP 10 M 培養 15

分鐘檢測 IL-1，使用 ELISA 分析 IL-1濃度。IVS4 病患 Pt.8、Pt.9、Pt.11，

Classical 病患 Pt.30、Pt.34、Pt.36。P 值由 T test 統計。

IL -1 b e tap

g/m

l

Un

treat

LP

S

LP

S+A

TP

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

H D n = 3

IV S 4 n = 3

c la s s ic a l n = 3

0 .0 5 3

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圖十九: 法布瑞氏症病患單核球表面接受器 CD163 表現增加。

以 CD163 抗體於周邊血液單核細胞染色。(A) 染色線性圖。(B) 單核球表

面 CD163 螢光由 Flow jo 作圖軟體計算，周邊血染色經流式細胞儀收集。IVS4

病患 Pt.14、Pt.15、Pt.20，Classical 病患 Pt.30、Pt.32、Pt.38。error bar 為

SEM，n = 3，P 值由 T test 統計，*表示 P < 0.05。

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圖二十: 法布瑞氏症病患單核球接受器 M6PR 位於細胞膜表現增加。

使用 M6PR 抗體進行細胞表面染色以及細胞內染色比較 M6PR 細胞分布比

例。(A) 將單核球表面染色和整個細胞染色統計比較病人及健康者。(B) 單核

球表面 M6PR 百分比，GMFI 由 Flow jo 作圖軟體計算，周邊血染色經流式細

胞儀收集。IVS4 病患 Pt.17、Pt.18、Pt.19，Classical 病患 Pt.33、Pt.37、Pt.38。

error bar 為 SEM，n = 3，P 值由 T test 統計，*表示 P < 0.05。

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附錄二: 病患螢光免疫染色切片組織學檢驗對照圖

Pt.1 ~ 5 切片於常規檢驗方法 H&E stain 以及電子顯微鏡檢測，結果為未檢

出 Gb3 堆積。螢光免疫染色法使用 anti Gb3 抗體染色，並使用二抗 Alexa647-

anti mouse 抗體呈現螢光 (綠色為軟體套色)，藍色為 Hochest 染色之細胞核。

H&E stain 比例尺為 80 m。電子顯微鏡圖比例尺為 5 m。螢光免疫染色比例

尺為 50 m。

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附錄三: 法布瑞氏症病患細胞激素剖析

分析 IVS4 病患血漿中細胞激素表現量，19 位健康捐贈者、六位以接受治

療 classical 病人 (classical: Pt.29、Pt.30、Pt.32、Pt.33、Pt.34、Pt.35)、五位已接

受治療 IVS4 病人 (IVS4 treated: Pt.6、Pt.7、Pt.8、Pt.11、Pt.16)、六位尚未治療

classical 病人 (untreated classical: Pt.23、Pt.24、Pt.25、Pt.26、Pt.39、Pt.40)、三

位尚未治療 IVS4 病人 (untreated IVS4: Pt.12、Pt.13、Pt.21)，使用 MACSPlex

12 cytokine kit 分析血漿細胞激並分類不同發炎激素。(A) Th1 相關發炎激素分

析統計；(B) Th2 相關細胞激素分析統計；(C) Th9 和 Th17 相關細胞激素。以

T test 統計，error bar 為 SEM， **表示 P < 0.01。

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附錄四: Cell ROX 染色建立

使用 Cell ROX 染劑於周邊單核細胞染色，背景值控制組使用 fluorescence-

minus-one (FMO) control (紅色)；實驗組為 Cell ROX 染色 (橘色)；陽性對照組

使用 H2O2 250 M 於 37 度培養細胞五分鐘，使 Cell ROX 染劑於細胞內氧化

(藍色)。

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附錄五: FLICA 染色方法區分 apoptosis 和 pyroptosis。

周邊血液單核細胞，以 LPS 1 g/mL 刺激三小時並用 ATP 10 M 培養 15

分鐘檢測 caspase 1 活性，使用 FAM-FLICA® Caspase-1 Assay Kit 於單核球進

行 active caspase 1 染色，區分 apoptosis 和 pyroptosis。由 Flow jo 作圖軟體計算

並繪製。

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附錄六: 法布瑞氏症病患單核球接受器 M6PR 染色線性圖

使用 M6PR 抗體進行細胞表面染色以及細胞內染色螢光強度線性比較圖。

由 Flow jo 作圖軟體計算並繪製，周邊血染色經流式細胞儀收集。