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CAPÍTULO IV Efecto de las variantes genéticas poblacionales del ADN mitocondrial en la susceptibilidad al cáncer

María Pilar Bayona-Bafaluy, Julio Montoya y Eduardo Ruiz-Pesini

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza. CIBER de Enfermedades Raras (CIBERER). Instituto Aragonés de Ciencias de la Salud. Miguel Servet 177. 50013 Zaragoza, España. jmontoya@unizar.es

RESUMEN

El microambiente que se produce en los tumores favorece la aparición de mutaciones en el ADN

mitocondrial (mtADN). Algunas de estas mutaciones, que afectan al metabolismo energético, incrementarán la supervivencia de las células y serán positivamente seleccionadas. Estas

mutaciones podrían contribuir a diferentes características de los tumores, como el remodelado de la matriz extracelular, los procesos angiogénicos y la aparición de metástasis. Del mismo modo que

las mutaciones somáticas, aunque con efectos probablemente menos dramáticos, algunos polimorfismos poblacionales del mtADN afectarán la función del sistema de fosforilación oxidativa

(OXPHOS), el metabolismo y la homeostasis celular, comportándose como factores heredados de susceptibilidad al cáncer.

A pesar de que se han acumulado numerosas evidencias epidemiológicas que relacionan variantes genéticas del mtADN con el cáncer, es necesaria la aportación de pruebas más directas. Por ello, el

modelo de líneas celulares transmitocondriales, híbridos citoplasmáticos o cíbridos puede ayudar a consolidar este campo de investigación.

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INTRODUCCIÓN

El proceso que lleva a la carcinogénesis es una secuencia de adaptaciones fenotípicas que llevan a saltarse distintas barreras microambientales que limitan la proliferación celular. La gran heterogenidad feno y genotípica que presentan las poblaciones celulares de los tumores podría explicarse por el uso de muy diversas estrategias para salvar las barreras que limitan la proliferación celular (1). Esto haría que se asocien al cáncer un gran número de genes, unos pocos frecuentemente mutados y muchos otros raramente mutados, que participan en un número pequeño de rutas bioquímicas que cooperan para inducir la enfermedad. Los componentes de la ruta que se encuentran alterados en tumores individuales varían ampliamente, sugiriendo que mutaciones en muchos genes en la misma ruta pueden tener un efecto similar sobre el crecimiento tumoral. Así, son las rutas más que los genes individuales las que dictan el curso de la tumorigénesis (2). En la carcinogénesis intervienen múltiples cambios genéticos (3) y diferentes tumores pueden mostrar distintas mutaciones. Por lo tanto, ninguna mutación particular en genes nucleares asociados al cáncer es suficiente o necesaria para provocar cáncer, cuando este se considera como un grupo de enfermedades. Estas consideraciones también deberían tenerse en cuenta cuando se estudian mutaciones en genes codificados en el mtADN en relación al fenotipo tumoral. Por ello, vamos a discutir si mutaciones en el mtADN pueden influir el fenotipo tumoral y no consideraremos si mutaciones en el mtADN y disfunción del sistema OXPHOS se requieren para el desarrollo de tumores.

La herencia, juega un papel importante en la aparición del cáncer. Así, se han descrito múltiples casos de cáncer en edad temprana que afectan a individuos de varias generaciones en unas pocas familias muy extensas. La historia familiar es un factor de riesgo en casi todos los tumores. Sin embargo, la mayoría de los cánceres familiares no parecen estar causados por mutaciones severas en genes raros. Por tanto deben estar presentes mutaciones más suaves en otros genes (4). En esta revisión, y dado que el mtADN es heredado por vía materna, exploraremos si hay o no una predisposición heredada por vía materna al cáncer, esto es, si la susceptibilidad al cáncer puede ser heredada con el mtADN.

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EL CITOPLASMA DE ALGUNAS CÉLULAS TIENE LA CAPACIDAD DE SUPRIMIR LA CAPACIDAD DE FORMAR TUMORES

La supresión de la tumorigenicidad en algunos clones híbridos entre fibroblastos humanos y células malignas de melanoma de ratón, después de la segregación de todos los cromosomas humanos derivados de la célula no tumorigénica, sugirió la posible contribución de factores extracromosómicos a la tumorigenicidad (5). Dado que muchos estudios sobre híbridos entre células de ratón y humano habían mostrado que los híbridos que habían perdido los cromosomas humanos no contenían mtADN humano, los autores excluyeron al mtADN como el factor extracromosómico. Sin embargo, el factor supresor de la tumorigenicidad era radiosensible, lo que sugería una entidad genética. El hecho de que el mtADN es el único factor genético citoplásmico en las células de mamífero y que otros trabajos muestran que estos híbridos puedan retener mtADN humano durante muchas generaciones antes de perderlo (6) sugiere que este genoma era el verdadero factor supresor de la tumorigenicidad.

El efecto del citoplasma sobre la expresión de la tumorigenicidad puede ser valorado utilizando cíbridos, o líneas celulares originadas por la fusión de células nucleadas con una célula enucleada (citoplasto) (7), o con otros donantes de citoplasma (Figura 1) como son fragmentos celulares con mitocondrias pero sin núcleo, tales como plaquetas (8) o sinaptosomas (9) o células tratadas con venenos nucleares (10). Así, la tumorigenicidad evaluada como la extensión y velocidad de formación de tumores en ratones desnudos, resultó parcialmente suprimida en clones cíbridos resultantes de la fusión de células de hamster CHEF/16 tumorigénicas con citoplastos CHEF/18 no tumorigénicos. Este estudio sugería que la supresión de la capacidad formadora de tumores podía ser transmitida citoplásmicamente (11). Los análisis se llevaron a cabo con poblaciones celulares que habían sufrido 20-30 doblajes tras la fusión, por lo tanto se podía descartar el papel de productos de genes nucleares, que habrían sido diluidos, y se reforzaba el posible papel del mtADN. En cíbridos construidos con células tumorigénicas del tiroides de rata y citoplastos de células epiteliales derivadas de tiroides de rata normal, también se vio supresión de la tumorigenicidad (12). En otro estudio con cíbridos producidos por la fusión de células epiteliales tumorigénicas de la glándula mamaria de ratón C2B2 y citoplastos de fibroblastos BALBc/3T3 no tumorigénicos THOC, y después de 7-13 doblajes, se observó una reducción de la capacidad tumorigénica en términos de incidencia y latencia de tumores cuando se probaron en ratones BALBc/3T3 recién nacidos (menores de un día) (13). Utilizando cíbridos derivados de la fusión de líneas del teratocarcinoma (984 C1 10-15) de

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ratón, altamente tumorigénicas y que habían perdido la capacidad para diferenciarse a músculo esquelético, con citoplastos de células de ratón no tumorigénicas (AMT), la tumorigenicidad de la línea celular original se perdía al evaluarse en ratones desnudos y se recuperaba la capacidad de diferenciarse a músculo esquelético.

Existía por lo tanto un factor en el citoplasma de la célula no tumorigénica que era

Híbridos

Recons

Cíbridos

Citoplasto

Carioplasto Citoplasto

+

+

+

Cíbridos (ρº)

Célula ρº Citoplasto +

Figura 1.- Modelos celulares construidos para estudiar la influencia del mtDNA en el cáncer. Se

representan los resultados de la fusión, tras varias generaciones celulares. Los diferentes orígenes están

codificados en gris y blanco. El citoplasma gris claro indica productos de genes nucleares de ambos orígenes. Mitocondrias rayadas reflejan un origen mezclado con productos de genes nucleares de una de

las células originales y productos codificados en el mtDNA de la otra. Las células rho0 contienen mitocondrias pero no tienen mtDNA.

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capaz de inducir supresión de tumorigenicidad heredable y con efecto prolongado en el tiempo (más de un año en cultivo continuo) (14, 15). En uno de cinco clones cíbridos, derivados de la fusión de hepatocitos de rata tumorigénicos con citoplasma de hepatocito de rata normal, hubo supresión de la tumorigenicidad. Los clones se analizaron por inyección en crías de rata recién nacidas, isogénicas con aquellas a partir de las cuales se inició el cultivo celular. Los cíbridos produjeron tumores en el 51% de los animales inyectados, comparado con el 92% de los animales inyectados con la línea parental tumorigénica. Además, los animales que desarrollaron tumores a partir de las células cíbridas sobrevivían más tiempo que los inyectados con las células tumorigénicas (15-17). La tumorigenicidad fue también suprimida en cíbridos formados por la fusión entre células del melanoma de ratón B16 altamente tumorigénicas y citoplastos de células mioblásticas de rata no tumorigénicas. Tres meses después de la fusión, la tumorigenicidad de 3 clones fue examinada por inyección en ratones desnudos y ninguno produjo tumores a los 45 días de la inyección, aunque las células B16 parentales produjeron tumores tras solo 7 días (18).

En los experimentos que hemos descrito, y en otros también llevados a cabo con cíbridos pero que no mostraron supresión de la tumorigenicidad (11, 19-23), el citoplasma de la célula tumoral quedaba diluido con el procedente del citoplasto donante. Cuando esto ocurre, la contribución de cada citoplasma a la célula después de varias generaciones celulares es muy difícil de evaluar. Una vía para incrementar la contribución de citoplasma de la célula no tumorigénica donante es utilizando la aproximación de células reconstituidas (recons). En esta aproximación, la mayoría del citoplasma de la célula receptora es eliminado y se obtiene un carioplasto, que es un núcleo rodeado de una capa fina de citoplasma (Figura 1). Así, la fusión de citoplasma de hepatocito de rata normal con carioplastos obtenidos de hepatocitos tumorigénicos resultó en la supresión de la tumorigenicidad en 5 de 6 clones recons analizados. De 68 animales inyectados con estas células reconstituidas, solo se observó un tumor (15-17). También se vio supresión de tumorigenicidad en células reconstituidas, formadas por la fusión entre carioplastos de células del melanoma de ratón B16 altamente tumorigénicas y citoplastos de células mioblásticas de rata no tumorigénicas. Aproximadamente 3 meses tras la fusión, 3 clones de células reconstituidas fueron examinados para tumorigenicidad por inyección en ratones desnudos. Ninguno produjo tumores en los 45 días siguientes a la inyección. Sin embargo, las células B16 parentales produjeron tumores después de solo 7 días (18). Los experimentos que hemos citado anteriormente con células cíbridas de hamster (11) fueron repetidos usando células reconstruidas. Se obtuvieron clones que fueron supresores y otros que formaron tumores (24). Ningún recon de la fusión de carioplastos NIH/3T3 BPDE 17 tumorigénicos y citoplastos NIH/3T3 no tumorigénicos fue tumorigénico. Por el contrario,

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aquellos con el mismo carioplasto pero citoplasto derivado de la línea tumorigénica NIH/3T3 BPDE 17 fueron tumorigénicos (25). Del mismo modo, ningún recon derivado de carioplastos NIH/3T3 BPDE tumorigénicos y citoplastos B10mtJ no tumorigénicos fue tumorigénico, pero todos los derivados del mismo carioplasto y citoplastos B10mtJ tumorigénicos lo fueron (26).

Al igual que ocurría en los cíbridos, en los recons habrá mezcla de mtADNs de las células donantes y receptoras. Esta condición se denomina heteroplasmia, mientras que el caso contrario, una célula con solo un tipo de mtADN, se conoce como homoplásmica. Si la supresión citoplásmica estuviese basada en el mtADN, el éxito de esta dependería de las velocidades de replicación relativa de ambos mtADNs y del impacto de las fuerzas selectivas (24). Por lo tanto, para chequear verdaderamente el efecto del mtADN donante, sería importante eliminar el mtADN parental. Esto puede lograrse mediante el uso de células rho0 (células sin mtADN) (27) o mediante pretratamiento de las células con el colorante tóxico mitocondrial rodamina 6G (28). Utilizando esta estrategia, se mostró que células del cáncer de próstata PC3 eran capaces de producir grandes tumores en ratones desnudos tras solo 4 semanas (29). Sin embargo, cíbridos producidos por tratamiento de las células PC3 con rodamina 6G y fusión con citoplasmas de una línea celular sin mutaciones en el mtADN apenas crecían en ratones desnudos después de 4 meses (30). Es interesante destacar que el mtADN original de las células PC3 porta dos mutaciones. La primera, m.11120T>C/p.MT-ND4:F121L, nunca ha sido descrita en más de 3.500 secuencias de mtADN humanas (31), pero tiene un índice de conservación bajo y es probable que no sea funcionalmente importante. La segunda, m.13802C>T/p.MT-ND5:T489M, se encontró previamente en un individuo, pero su edad, sexo o estado de salud no se conocen. La posición afectada tiene un índice de conservación moderado y podría ser funcionalmente relevante. Por lo tanto, es posible que la eliminación de esta mutación redujera el potencial tumorigénico de las células PC3 (30).

ALGUNAS VARIANTES GENÉTICAS EN EL MTADN POTENCIAN LA FORMACIÓN DE TUMORES

La mayoría de las proteínas y moléculas de ARN de las células cíbridas son productos codificados en los cromosomas nucleares. Esto significa que tras la construcción del cíbrido, las proteínas y ARNs del citoplasma donante se diluirán a medida que aumente

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el número de pases en cultivo. Solo 35 ARN maduros (11 mARN, 22 tARN y 2 rARN) en la célula cíbrida son de origen mitocondrial y permanecen en las mitocondrias generación tras generación. Este hecho sugiere que el mtADN donante es el responsable de la supresión de la tumorigenicidad en los experimentos previamente comentados. Si el nuevo mtADN suprime la tumorigenicidad, el sustituido debería favorecer el proceso tumoral.

En un estudio, se tomaron porciones de un cultivo de células epiteliales de hígado de rata y se congelaron secuencialmente. Así se pudieron recuperar células de pases tempranos, no transformadas, y tardío, malignamente transformadas de forma espontánea. Cuando se inyectaron en crías de rata recién nacidas, los cíbridos derivados de la fusión de células normales y citoplastos de células malignamente transformadas produjeron tumores en el 17% de los animales. Las células recons, derivadas de la fusión de carioplastos de células normales con citoplastos de células malignas, produjeron tumores en el 97% de los animales inyectados (32). Estos resultados podrían explicarse por la aparición de nuevas mutaciones en el mtADN de las células en pase tardío (32). El mtADN puede mutar en las células mantenidas en cultivo. Así, se ha observado que sublíneas de células HeLa que se han mantenido en cultivo por décadas han acumulado mutaciones en el mtADN. Una de estas sublíneas resultó portadora de un codon de terminación de cadena prematuro m.12533G>A/p.MT-ND5:W66TER, y aunque la mutación no fue caracterizada, probablemente tendría un efecto fenotípico dramático sobre la función OXPHOS (33). Los cíbridos pueden también acumular mutaciones en el mtADN durante el cultivo. Por ejemplo, la línea AL4.3 presentó tres nuevas mutaciones en el mtADN (m.1843T>C, m.1940A>G y m. 2623A>G, todas ellas en el gene MT-RNR2) y un fenotipo bioenergético negativo (34).

Otto Warburg, propuso que las células tumorales tienen un defecto respiratorio heredable. Sorprendentemente, y antes del descubrimiento del mtADN en las células animales (35), Warburg escribió “…entendemos porque la respiración conectada con los grana permanece dañada cuando ha sido dañada una vez; es por la misma razón que las propiedades asociadas a los genes permanecen alteradas cuando los genes están dañados.” (36). Una vez que una mitocondria está dañada, permanecerá dañada, transmitiendo su defecto a la progenie, justo como ocurriría en el caso de un gen nuclear alterado (37).

El mtADN empezó a ser analizado en células tumorales muy pronto tras su descubrimiento (38). Desde entonces, se han encontrado muchas mutaciones en el mtADN de distintos tumores (39), pero su impacto sobre la tumorigenicidad no ha sido claramente establecido. Sin embargo, la naturaleza de algunas de estas mutaciones apunta a un efecto

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fenotípico sobre la respiración mitocondrial. Probablemente la primera mutación del mtADN asociada a tumores con consecuencias fenotípicas se describió en 1983 (40). Se trataba de una deleción de una C en un tracto de 3 Cs (nucleótidos 5550-5552, numeración humana) en el tallo anticodon del gen MT-TW en un tumor de rata. En los mt-tARNs humanos solo se han descrito dos inserciones/deleciones, una deleción de uno de los tres pares de nucleótidos T-A en el gen MT-TL1 (41) y una inserción T única en la posición nucleotídica 5537 en el gen MT-TW (42) (43), y ambos se han asociado a enfermedad mitocondrial. Otro indicio de que una mutación en el mtADN en las células del cáncer podía ser funcionalmente importante vino de un adenocarcinoma renal en el cual el 50% de los mtADNs contenía una deleción de 264 nucleótidos en el gen MT-ND1 que resultaba en un mARN truncado (44), siendo las deleciones del mtADN una causa relativamente frecuente de enfermedad mitocondrial (45). Las mutaciones en el mtADN que causan codones de paro truncan la proteína y tendrán efecto fenotípico. La primera mutación que producía un codon de paro en el mtADN asociada a un cáncer fue encontrada en un tumor colorrectal. Esta fue una mutación m.6264G>A/p.MT-CO1:G121TER (46). Se ha visto que cambios similares, tales como la mutación m.6930G>A/p.MT-CO1:G343TER, están asociados a enfermedades mitocondriales (47).

Las líneas celulares transmitocondriales (cíbridos) pueden usarse, de nuevo, para chequear el efecto de mutaciones del mtADN asociadas al cáncer (48). Para algunas mutaciones del mtADN encontradas en tumores se ha llevado a cabo el análisis bioquímico y molecular. Así, la línea celular oncocítica del tiroides XTC.UC1 porta dos mutaciones en el mtADN, m.3571Ci que provoca un cambio en el marco de lectura y un codon de paro en p.MT-ND1:G101TER (>92.6% mutante) y una mutación m.15557G>A/p.MT-CYB:E271K (>27% mutante). Los cíbridos del osteosarcoma 143B producidos a partir de XTC.UC1 mostraban viabilidad y niveles de ATP disminuidos cuando se crecían en medio con galactosa que fuerza las células de mamífero a basarse en la función OXPHOS mitocondrial (49). Además, un clon cíbrido homoplásmico para la mutación m.3571Ci crecía más lento en medio con galactosa y presentaba defectos en el ensamblaje del complejo I y en la síntesis de ATP cuando se comparaba con otro clon cíbrido con 80% de

la mutación. Este cíbrido homoplásmico también mostró un cociente α-cetoglutarato / succinato significativamente más alto (50). También se construyeron cíbridos del osteosarcoma 143B con mitocondrias de la línea de células del cáncer colorrectal VACO 425 (46). El mtADN de esta línea contenía, además de la mutación m.6264G>A/p.MT-CO1:G121TER, una inserción de un nucleótido A único en la posición m.12418 (m.12418Ai) que causa una desviación del marco de lectura en K28, generando una proteína truncada. Estos cíbridos presentaban respiración endógena extremadamente baja y

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actividades de los complejos I+III y IV marcadamente reducidas, y las proteínas p.MT-ND5 o p.MT-CO1 no se detectaban (51). Otros cíbridos de osteosarcoma 143B portando la mutación m.12418Ai, pero sin la mutación m.6264G>A, tenían menor consumo de oxígeno, menor síntesis de ATP y menor tasa de crecimiento en medio con galactosa. También producían más lactato extracelular, más superóxido mitocondrial y sobreexpresaban algunos enzimas antioxidantes (52). Otros cíbridos del osteosarcoma 143B, portando mutaciones del mtADN (m.7458G>A/MT-TS1 y m.15894G>A/MT-TT) de dos líneas celulares de cáncer de mama (MDA-MB-231 y MDA-MB-436), presentaban viabilidad celular significativamente reducida en medio con galactosa, menor consumo de oxígeno, menor síntesis de ATP, actividades de los complejos respiratorios más baja y niveles más bajos de los dos tARNs afectados (53).

La existencia de un defecto OXPHOS debido a mutaciones en el mtADN no significa que la mutación afecte la tumorigenicidad. Para analizar la tumorigenicidad de cíbridos con diferentes mutaciones en el mtADN se han utilizado ratones. Así, cíbridos derivados de la línea celular PC3 de cáncer de próstata tratados con rodamina 6G y citoplastos portando la mutación m.8993T>G/p.MT-ATP6:L156R, o cíbridos isogénicos sin esta mutación se inyectaron en ratones desnudos. Los pacientes que portan esta mutación padecen enfermedad mitocondrial (54) y los cíbridos del osteosarcoma 143B con la mutación muestran un defecto OXPHOS (55). Los cíbridos PC3 mutantes generaban tumores siete veces mayores que los cíbridos de tipo salvaje. Los tumores mutantes también generaban más ROS. Estos resultados mostraban que las mutaciones del mtADN podían jugar un papel importante en el cáncer (30, 56). En otro estudio, cíbridos HeLa con o sin las mutaciones patológicas m.8993T>G y m.9176T>C/p.MT-ATP6:L217P se inyectaron en ratones desnudos (57). Estas mutaciones conferían ventaja en el estado temprano del crecimiento de los tumores. Parecía que la mutación en el mtADN promovía tumores por supresión de la apoptosis, ya que esta ocurría menos frecuentemente en cíbridos mutantes (58). Los cíbridos del osteosarcoma portando la mutación m.3243A>G/MT-TL1 fueran más invasivos, en un ensayo de invasión en matrigel, que aquellos construidos con un mtADN tipo salvaje. Esto sugiere que las células con mutaciones en el mtADN tienen mayor potencial metastático (59). Este hecho fue confirmado mediante ensayos de metástasis en ratones, en los que se intercambiaron las mitocondrias de líneas de células tumorales de ratón con bajo y alto poder metastásico. Las últimas contenían las mutaciones m.13997G>A/p.MT-ND6:P25L y m.13885Ci/p.MT-ND6 (que resultan en un polipéptido de 79 aminoácidos en lugar de los 172 usuales) y como consecuencia presentan deficiencia en la actividad del complejo respiratorio I y sobreproducción de ROS. En los ensayos de metástasis en ratones, se encontró que las células tumorales receptoras adquirían el

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potencial metastático de los mtADNs transferidos. Estos resultados indicaban que las mutaciones en el mtADN podían contribuir a la progresión de los tumores favoreciendo el potencial metastático(60). Recientemente, se ha obtenido la primera evidencia de que una mutación del mtADN humano, encontrada en un tumor, tiene la capacidad de afectar la tumorigenicidad. Así, los cíbridos que portan la mutación heteroplásmica m.12418Ai (hay un tracto de 8As comenzando en 12148, por tanto esta mutación debería llamarse m.12425Ai), encontrada en un tumor colorrectal (46), produjeron tumores más grandes y de crecimiento más rápidos al ser inyectados en ratones desnudos que aquellos producidos por los cíbridos de tipo salvaje (52).

EFECTO DEL MICROAMBIENTE TUMORAL SOBRE EL MTADN

La proliferación de una célula está controlada por su interacción con otras células y con la matriz extracelular, y por los niveles de factores de crecimiento. Para soslayar las constricciones tisulares, los pasos más tempranos de la carcinogénesis requieren alteraciones genéticas nucleares. Estos requerimientos explicarían que el citoplasma de las células tumorales no fuera capaz de provocar tumorigenicidad en las células normales. Cuando la proliferación empuja las células lejos del suministro sanguíneo y la concentración de oxígeno disminuye, las lesiones premalignas se enfrentan a regiones hipóxicas cerca del límite de difusión del oxígeno. A cortas distancias de los vasos sanguíneos se observan presiones parciales de oxígeno de casi cero. Por tanto, las células en la proximidad del límite de difusión de oxígeno están expuestas a un ambiente inestable debido a ciclos de hipoxia-reoxigenación. Las fuerzas de selección favorecerán fenotipos que se adapten al metabolismo anaerobio en este microambiente hipóxico (61). Los portadores de electrones de la cadena respiratoria mitocondrial permanecen mas reducidos cuando los niveles de oxígeno son muy bajos (62), esto genera más ROS mitocondrial y lleva a la activación de los

factores inducidos por la hipoxia (HIFs) (63). HIF1α actúa como un factor transcripcional disparando la expresión de muchos genes, entre ellos, aquellos para las enzimas glicolíticas. De esta manera, las células tumorales potencian su metabolismo glicolítico y su supervivencia en el ambiente hipóxico. Sin embargo, las células derivadas de los tumores típicamente mantienen sus fenotipos metabólicos en cultivo bajo condiciones normóxicas, por lo tanto la glicolisis aeróbica está constitutivamente sobre-expresada a través de cambios genéticos o epigenéticos estables.

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En los ciclos de hipoxia-reoxigenación se producen mayores cantidades de especies de ROS que son mutagénicas. Se ha descrito que las condiciones hipóxicas son suficientes para generar mutaciones en genes nucleares (64) y mitocondriales (65). Así, el fenotipo metabólico, como otra barrera a la proliferación (1), podría ser adquirido por diferentes mutaciones en el nADN o el mtADN. Por tanto, a pesar de que mutaciones en el mtADN no son necesarias en algunos tumores, podrían contribuir a muchos otros. De hecho, el mtADN acumula mutaciones mucho más rápido que el nADN. El mtADN está localizado en la matriz mitocondrial, unido a la membrana interna donde está embebida la cadena de transporte de electrones (ETC), principal fuente de ROS en la célula. Además, la mutagénesis inducida por ROS se ve facilitada a causa de que los sistemas de reparación del mtADN no son tan abundantes como los del nADN (66). Es de destacar, que las rutas de reparación del ADN pueden estar comprometidas en células expuestas a las condiciones hipóxicas (67). Los dos factores unidos pueden explicar la alta frecuencia de mutaciones en el mtADN que se encuentran en las células del cáncer (68).

Se ha descrito que la frecuencia de mutaciones homoplásmicas en el mtADN de tumores humanos es alta, y se ha estimado que se requieren aproximadamente 70 generaciones celulares para que una mutación llegue a homoplasmia por azar (69). Sin embargo, en los pasos más tempranos de la carcinogénesis la mayoría de células mueren por necrosis al ser expuestas a hipoxia (61). Por tanto, estas células no tienen una capacidad ilimitada de proliferación y tras un número muy pequeño de divisiones celulares, se enfrentarán con un ambiente hipóxico y serán eliminadas. Sin embargo, si aparece una mutación en el mtADN que incremente la producción de ROS provocará una ventaja selectiva, de forma que porcentajes más altos de mutación ofrecerán mayores posibilidades de supervivencia. Así, es posible que muchas mutaciones en el mtADN aparezcan en el ambiente hipermutagénico y tengan efecto funcional y contribuyan al fenotipo tumoral.

Además de la supervivencia en un microambiente particular, otros fenotipos relacionados con los tumores pueden estar asociados a mutaciones en el mtADN. Así, cíbridos deficientes en OXPHOS debidos a una deleción del mtADN sobre-expresan los genes de la metaloproteinasa de la matriz 1 (MMP1) y sub-expresan sus inhibidores

naturales (inhibidores tisulares de la familia MMp, TMPs 1 y 2). Además, HIF1α estimula la producción de factores angiogénicos, tales como VEGF, que aumenta la vascularización y la metástasis. Estos resultados sugieren que los defectos OXPHOS también participan en la progresión de tumores modulando el remodelado de la matriz extracelular y los procesos angiogénicos (59).

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HERENCIA MITOCONDRIAL DE LA SUSCEPTIBILIDAD AL CÁNCER

La subunidad p.MT-CO1 se encuentra mutada en numerosos tumores, pero polimorfismos poblacionales y mutaciones patológicas en este polipéptido son relativamente raros. Como ejemplo, se encontraron mutaciones de MT-CO1 en 11% de 180 especímenes de cáncer de próstata de pacientes europeo-americanos, en 0% de 46 controles europeo-americanos sin cáncer y en 6.5% de 898 muestras de individuos con ancestros europeos sin información sobre su género, edad y estado de salud. Esto indica que las mutaciones en MT-CO1 son más frecuentes en pacientes con cáncer de próstata que en los controles sin cáncer o en la población general. Por otra parte, la conservación evolutiva de los aminoácidos alterados en p.MT-CO1 en el cáncer de próstata fue significativamente más alta que en la población general. Estos resultados sugieren que mutaciones en p.MT-CO1 deben ser importantes desde un punto de vista funcional. Dado que la mayoría de mutaciones en MT-CO1 fueron homoplásmicas en distintos tejidos de los pacientes, ellas debían haber surgido en la línea germinal femenina. Por tanto, parecía que las mutaciones heredadas en el mtADN podían comportarse como factores de riesgo para el cáncer (30).

Distintos cánceres muestran agrupamiento geográfico o étnico. Como ejemplo, la incidencia de cáncer de próstata es mucho más alta entre los hombres con antepasados africanos que los que tienen antepasados europeos. Factores ambientales probablemente contribuyen a las diferencias regionales en la prevalencia, pero la susceptibilidad genética puede ser otro factor de riesgo. Así, se han propuesto distintos alelos de genes nucleares para explicar algunas de estas diferencias geográficas o étnicas (70, 71). Al contrario que el genoma nuclear, el mtADN muestra considerable diversidad geográfica y étnica (72). El mtADN es heredado por línea materna. Cuando una mutación en el mtADN aparece y sobrevive, una nueva línea materna se origina. A lo largo del tiempo, las nuevas mutaciones originaran nuevas ramas y darán lugar a un árbol filogenético del mtADN. Los grupos de genotipos de mtADN filogenéticamente relacionados se conocen como haplogrupos del mtADN. Los estudios filogeográficos de los mtADNs humanos han revelado una correlación remarcable entre las líneas del mtADN y los orígenes geográficos de las poblaciones indígenas. Las raíces más profundas de todos los mtADNs humanos actuales se encuentran en África y las ramas radian a diferentes localizaciones geográficas (72). Los mtADNs africanos son los más diversos y antiguos y caen en varios haplogrupos principales conocidos como líneas L. En el noreste de África surgieron dos líneas principales del mtADN, M y N, que tuvieron éxito en colonizar Eurasia y produjeron todos los

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haplogrupos del mtADN euroasiáticos (Figura 2). Así, la variabilidad geográfica del mtADN puede haber contribuido al agrupamiento geográfico de algunos cánceres.

La carcinogénesis es un proceso que implica múltiples pasos y es a menudo descrito como evolución somática. La evolución somática de las células del cáncer puede ser vista como una secuencia de adaptaciones fenotípicas a distintas barreras microambientales. Los modelos de carcinogénesis son típicamente basados en el principio Darwiniano de que la evolución requiere cambios genéticos que generan nuevos fenotipos (1). Curiosamente, muchas mutaciones somáticas en el mtADN que son específicas de tumores también se han encontrado como variantes genéticas poblacionales que definen haplogrupos. Podría ocurrir que estas mutaciones facilitaran la supervivencia del tumor bajo ambientes nuevos con sustratos energéticos alterados o reducidos, tensión de oxígeno disminuida, variación en la temperatura ambiental o tolerancia incrementada a la toxicidad por ROS. Ya que cambios ambientales similares pudieron ser experimentados por los humanos en su expansión a través del planeta, las mismas mutaciones en el mtADN pudieron ser adaptativas en ambos, tumores y personas (39). Por tanto, sería posible que el haplogrupo mitocondrial se comportara como un factor de susceptibilidad para la carcionogénesis.

Una transición en la posición m.10398 se ha encontrado en 12 nodos internos de un árbol filogenético del mtADN que incluye más de 3000 secuencias (31) (Figura 2). El alelo m.10398G (p.MT-ND3:A114) es probablemente el derivado del ancestro común más reciente de todos los humanos (Eva mitocondrial) y es prevalente en los individuos de herencia africana. El alelo m.10398A (p.MT-ND3:T114), junto con otros polimorfismos, define la macrolínea N del mtADN. Este alelo es prevalente en individuos de herencia europea. Se ha propuesto que la selección positiva podría explicar el gran número de veces que una mutación afectando la posición m.10398 ha ocurrido en la filogenia humana y el hecho de que el alelo derivado en los humanos predomina en la secuencia consenso de los mamíferos (73). El alelo A se encontró asociado con un riesgo significativamente incrementado de cáncer de mama invasivo en un estudio que incluía 1259 mujeres afroamericanas (654 pacientes y 605 controles) (74), pero no se encontró asociación a cáncer de mama en otro estudio de mujeres afroamericanas que incluía 1456 pacientes y 978 controles (75). Sin embargo, este alelo se observó sobrerepresentado en hombres afroamericanos con cáncer de próstata confinado al órgano (76). También fue significativamente asociado con un riesgo incrementado de carcinoma de mama esporádico en la India. Los polimorfismos m.10398A/m.10400C y m.10398G/m.10400T definen los macrohaplogrupos N y M, respectivamente, en esta población. Curiosamente hay una correlación entre las tasas de incidencia de cáncer de mama y la distribución mundial del

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macrohaplogrupo N. En la India, aquellos estados con la prevalencia más alta de macrohaplogrupo N presentan una mayor incidencia de cáncer de mama. Una comparación entre casos de cáncer de mama esporádico y controles con los fondos genéticos del mtADN M y N mostró que el macrohaplogrupo N fue sobrerepresentado en los pacientes. Además, el macrohaplogrupo N se ha encontrado también sobrerepresentado en el carcinoma de células escamosas de esófago (77). Por el contrario, la macrolínea M de la India se encontró asociada al cáncer oral en otro estudio que incluía 308 pacientes y 383 controles (78). Los cíbridos del macrpohaplogrupo N presentan un pH de la matriz mitocondrial más bajo y niveles de calcio mitocondrial más alto que aquellos que no son N (79).

Las asociaciones son diferentes en los estudios con individuos de herencia europea. Así, el alelo m.10398G se encontró asociado al cáncer de mama en un estudio que incluyó 156 pacientes con cáncer de mama europeo-americanos con historia familiar de cáncer de mama y 260 controles (80). En otro estudio, el alelo m.10398G estaba presente en 23% de 44 pacientes con cáncer de mama esporádico pero solo en 3% de 100 controles polacos (81).

Figura 2.- Árbol filogenético del ADN mitocondrial. Se representan las principales líneas genéticas

del mtADN junto con su distribución geográfica según los estudios discutidos en el texto. Se

indican las mutaciones que afectan la posición m.10398 (círculos negros y blancos representan los

alelos m.10398G y m.10398A, respectivamente).

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Finalmente, el alelo m.10398G no estaba asociado al cáncer de mama en otros dos estudios (1561 pacientes con cáncer de mama y 2209 controles; 678 pacientes con cáncer de mama y 669 controles) (82).

Los resultados de todos estos estudios epidemiológicos son contradictorios y difíciles de interpretar. Por ejemplo, debido a la ausencia de recombinación en el mtADN humano, sería posible que la mutación m.10398G estuviera en desequilibrio de ligamiento con un polimorfismo causal más importante. Así, una interacción altamente significativa fue identificada entre esta variante y la m.4216C o la m.12308G en pacientes que sufren de cáncer de mama (83). La primera combinación define el haplogrupo J y la segunda el haplogrupo Uk1. Uk1 y J1c, uno de los subhaplogrupos J más frecuentes en Europa, comparten otro polimorfismo del mtADN con un efecto fenotípico potencial, m.14798C (84). Combinaciones diferentes de diversos factores genéticos y ambientales podrían estar implicadas en el cáncer. Si polimorfismos poblacionales del mtADN están implicados en el proceso de tumorigenicidad, sus contribuciones pueden ser importantes aunque ellas no serán dramáticas. Sería esperado que ellos tuvieran un efecto pequeños sobre la función OXPHOS y estos efectos serían altamente dependientes del contexto en el cual la variante genética está actuando. Para resolver este problema, los estudios epidemiológicos no serán muy útiles y se requieren otras aproximaciones. Los cíbridos pueden, otra vez, ayudar a dilucidar el papel de los polimorfismos poblacionales del mtADN en la susceptibilidad al cáncer. Así, un cíbrido con el polimorfismo m.10398A mostró una velocidad de proliferación más lenta y una progresión alterada a través del ciclo celular, así como una actividad del complejo I incrementada, niveles aumentados de ROS y mitocondrias despolarizadas que otro cíbrido con el alelo m.10398G. También mostraba resistencia frente a la apoptosis potenciada por etoposido, fosforilación de Akt incrementada en el residuo S473 y un numero mayor de colonias independientes de anclaje in vitro y metástasis en

ratones (85).

Otro ejemplo que muestra la utilidad de los cíbridos viene de las líneas celulares de cáncer de páncreas humano CFPAC-1 y CAPAN-2. Ellas contienen mutaciones no sinónimas nunca antes descritas, m.8696T>C/p.MT-ATP6:M57T y m.10176G>A/p.MT-ND3:G40S, respectivamente (86). Los efectos fenotípicos de estos genotipos de mtADN no fueron muy dramáticos ya que los cíbridos preparados usando mitocondrias derivadas de estas células no mostraban diferencias importantes en el potencial de membrana más interna mitocondrial y consumo de oxígeno, aunque ellos tendían a ser diferentes. Los cíbridos que portaban estas mutaciones crecían más lentos que los de tipo salvaje (87). Una de estas líneas celulares (CAPAN-2) también contenía la mutación m.6267G>A/p.MT-

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CO1:A122T. Esta mutación fue también encontrada en uno de 260 pacientes con cáncer de próstata (Petros et al, 2005), uno de 63 pacientes con cáncer de mama y uno de 64 pacientes con cáncer de colon y 2 de 13 líneas celulares tumorales (88). Juntas, se encontró en 6 de 415 muestras de pacientes con cáncer. Los análisis bioquímicos de cíbridos con esta mutación indicaban que el crecimiento en galactosa, la respiración y la actividad del complejo IV estaban lesionadas (88). Esta mutación se ha encontró también 5 veces en más de 3500 individuos “control”, cuya edad y estado de salud fue desconocido (31). Muy interesantemente, dos de ellos pertenecían al mismo haplogrupo mitocondrial, M38 (89). Las secuencias completas de estos dos individuos permitió caracterizar esta mutación definidora de haplogrupo como antigua, estando presente en la población durante miles de años, ya que desde la aparición de la mutación, al menos 5 y 7 mutaciones distintas se han acumulado en las líneas de mtADN que produjeron el genotipo de mtADN portado por estos dos individuos. La alta frecuencia de esta mutación en muestras de cáncer, su rareza en la población normal, junto con su efecto sobre la función OXPHOS de las líneas celulares transmitocondriales surge la posibilidad de que esta transición pudiera influir el fenotipo tumoral. Confirmando esta sugerencia, los cíbridos que portan mitocondrias de la línea celular de cácer de páncreas humano CAPAN-2 y de individuos sanos fueron transplantadas a ratones desnudos para generar tumores. Los tumores derivados de los cíbridos con el mtADN de las líneas tumorales fueron más resistentes que aquellos con mtADN de individuos sanos a la hora de suprimir el crecimiento tumoral e inducir apoptosis masiva cuando se administraron fármacos anticáncer (87).

Las mutaciones en el mtADN pueden ser responsables para la tolerancia de drogas anticáncer de las células tumorales, pero polimorfismos poblacionales del mtADN pueden también afectar el fenotipo tumoral de una manera diferente. Así, el fondo genético mitocondrial podría afectar la aparición de efectos adversos tras la terapia anticáncer. El cisplatino es un agente quimioterápico altamente efectivo, pero su uso está limitado por su nefro-, neuro- y ototoxicidad. Se ha mostrado recientemente que 5 de 20 pacientes con lesión de oído por dosis terapéuticas de cisplatino pertenecían al haplogrupo J, pero solo 1 de 19 pacientes sin lesión de oído pertenecían a este haplogrupo (90).

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CONCLUSIONES

El microambiente tumoral favorece la aparición de mutaciones en el mtADN. Algunas de estas mutaciones pueden afectar el fenotipo del cáncer alterando el metabolismo del tumor. El sistema OXPHOS es importante para adaptarse al ambiente. De hecho, señales externas, tales como nutrientes y oxígeno, interaccionan a nivel OXPHOS y modifican los niveles de segundos mensajeros, tales como ATP, ROS y Ca2+, o el estado redox celular. Estas modificaciones disparan respuestas intracelulares importantes para soslayar las barreras microambientales a la proliferación.

A lo largo de la evolución humana el mtADN ha acumulado mutaciones. Seguramente muchas de ellas no tuvieron efecto fenotípico, pero es probable que algunas ayudaran a la supervivencia de los individuos modificando sus equilibrios OXPHOS. Así, individuos de distintos haplogrupos presentarían pequeñas diferencias en su metabolismo, lo que les daría distintas susceptibilidades al cáncer. Puesto que el cáncer es una enfermedad multifactorial, diferencias metabólicas pequeñas debidas a SNPs del mtADN pueden ser difíciles de analizar en los estudios epidemiológicos y es necesario utilizar otras aproximaciones. Como hemos visto a lo largo de esta revisión, otras herramientas interesantes para estudiar la influencia de los polimorfismos poblacionales, y por tanto la susceptibilidad al cáncer heredada en el mtADN, son los cíbridos y los ratones desnudos.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo ha sido financiado por el Instituto de Salud Carlos III-FIS (PI08-0264, PI10-00662) y la Diputación General de Aragón (Grupos consolidados B33 y PIPAMER 10-010). El CIBERER es una iniciativa del ISCIII.

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