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art 2

* Artículo producto de la investigación financiada por el SENA con el convenio 331 del año 2011, realizada porTecnasS.A. y laFundaciónINTALenColombia.

** Ingenierodealimentos,InvestigadorenSaboresCarnicosTecnasS.A.*** Ingenierodealimentos,Magisterencienciasfarmacéuticasyalimentarias,InvestigadorTecnasS.A.**** Ingenierodealimentos,Ph.D.,MSc.,CienciayTecnologíadeAlimentosCoordinador Científico-TécnicodeProyectosFundación

INTAL.

Correspondencia:Cano-Salazar,J.A.,e-mail:ctproyectos@fundacionintal.orgArtículorecibido:16/06/2012;Artículoaprobado:15/11/2012

Artículo original / Original article / Artigo original

Efecto del pH y la temperatura en la hidrólisis enzimática de subproductos de la industria bovina*

Salazar-Posada, C.**, López-Padilla, A.***, Cano-Salazar, J. A. ****

Resumen

Introducción. Debido a la gran cantidad de resi-duosquegenera la industria ganaderaenColom-biayasualtoporcentajedeproteína,seplanteóunestudioquepermitaestablecerunaalternativaparaelaprovechamientodeestosbuscandodarunvaloragregadoyalivianarunacargaambiental.Objetivo.EvaluarelefectodelpHylatemperaturasobrelascondicionesdehidrólisisenzimáticadeextractodehuesoderes.Materiales y métodos.Paraeldesa-rrollodelainvestigaciónseutilizóundiseñocentralcompuestorotable(DCCR),obteniendountotalde10experimentosparacadaunadelasenzimasdedisponibilidadcomercialAlcalase2,4LFGyFlavou-rzyme®.Resultados.Seencontróquelatempera-turatieneunefectosignificativo(p=0,0065)sobreelgradodehidrólisisenlaenzimaAlcalse,alcanzan-dosumayorgradodehidrólisis (8.21%)a55°CypH=5.79,mientrasqueparaFlavourzymeseencon-tróqueelpHtieneunefectosignificativo(p=0,0157)alcanzando un grado de hidrólisis de 20.23% a45°C y pH=6,50.Conclusión. Es factible obtenerproductosdevaloragregadocomoloshidrolizadosenzimáticosapartirdesub-productosdelaindustriabovinaconunaampliaproyecciónindustrial.

Palabras clave:hidrólisis,subproductos,huesobo-vino,pH

Effect of the pH and of the temperature on the enzymatic hydrolysis of by-products from

bovine industries

Abstract

Introduction. Given the great amount of wastegeneratedbycattle industries inColombia,and its

high contentof protein, a study toestablishanal-ternative tousesuchwastewasproposed,aimingtoprovideaddedvaluesandalleviate theenviron-mentalload.Objective. EvaluatingtheeffectsofpHand temperature on the enzymatic hydrolysis con-ditionsofbeefbones.Materials and methods. Todeveloptheresearchwork,arotatablecentralcom-posite design (RCCD) was used, and 10 experi-mentswereobtainedforeveryenzymecommercia-lly available -Alcalase2,4 LFGandFlavourzyme®. Results. Temperature has a significant effect(p=0,0065)onthedegreeofhydrolysisoftheAlcal-se enzyme, reaching its highest hydrolysis degree(8.21%)at55°CandpH=5.79,whileinthecaseofFlavourzymeasignificanteffectofthepHwasfound(p=0,0157)reachingahydrolysysdegreeof20.23%at45°CandpH=6,50.Conclusion.Itispossibletoobtainaddedvalueproducts,suchastheenzyma-tichydrolyzedones,fromby-productsgeneratedbybovineindustries,withawideindustrialprojection..

Key words:hidrolysys,by-products,beefbones,pH

Efeito do pH e a temperatura na hidrólise enzimática de subprodutos

da indústria bovina

Resumo

Introdução. Devido à grande quantidade de resí-duosquegeraa indústriadegadonaColômbiaeasuaaltapercentagemdeproteína,propôs-seumestudo que permita estabelecer uma alternativapara o aproveitamento destes procurando dar umvaloragregadoealiviarumônusambiental.Obje-tivo.AvaliaroefeitodoPHea temperaturasobre

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ascondiçõesdehidrólisesenzimáticadeextratodeossoderês.Materiais e métodos.Paraodesen-volvimentodainvestigaçãoseutilizouumdesenhocentral composto rotatório (DCCR), obtendo umtotalde10experimentosparacadaumadasenzi-madedisponibilidadecomercialAlcalase2,4LFGeFlavourzyme®.Resultados.Encontrou-sequeatemperatura temumefeito significativo (p=0,0065)sobre o grau de hidrólise na enzimaAlcalse, atin-gindo seumaior graudehidrólise (8.21%)a55°C

ePH=5.79,enquantoparaFlavourzymeseencon-trouqueoPHtemumefeitosignificativo(p=0,0157)atingindo umgrau de hidrólise de 20.23%a 45°CePH=6,50.Conclusão.Éviávelobterprodutosdevaloragregadocomooshidrolisadosenzimáticosapartirdesub-produtosdaindústriabovinacomumaamplaprojeçãoindustrial.

Palavras importantes:hidrólise,subprodutos,ossobovino,PH.

Introducción

Conrespectoalsacrificiodeganado,Colombiaalcanzalas947mil toneladasdecarnederesen canal, es decir, 3,98 Millones de cabezasanuales.Teniendoencuentaquedelsacrificiode un bovino aproximadamente el 37,7% sonresiduos(cuero,cabeza,sangre,vísceras,pa-tasycontenidodigestivo),ydelacanalobtenidaelhuesoconstituyedel13al16%,esevidenteque hay una gran cantidad de sub-productosgenerados.Loshuesos,cabezasyvíscerassoncomúnmente utilizados para alimentación ani-mal debidoa subajo valor comercial o, enelpeorde loscasos,destinadosparaser incine-radososimplementedesechados,dandoasíuntratamientoinadecuadoaestosresiduosloquecausaproblemasambientales como laprolife-racióndeplagasymalosolores.Elhuesodelarestieneaproximadamenteentre17,6y19,9%deproteína conun contenidodiversodeami-noácidosentre ellos cisteína,metionina y unacantidad considerable de ácido glutámico; esporelloqueesválidopensareneldesarrollodediversos productos con un alto valor agregado comobienlosonlosobtenidosapartirdehidro-lizados proteicos, que pueden ser funcionalescomo base para complementos nutricionales,alimentosparadeportistas,entreotros.

Lahidrólisisenzimáticasehautilizadoparalamodificacióndelalaspropiedadesfuncionalesynutricionalesdelasproteínasdelosalimen-tos.Estos cambios son convenientes cuandosequiereaumentarlaincorporacióndeproteí-nasenformulacionesespecíficas.Estetipodehidrólisishademostradoaumentodelasolubi-lidad, las propiedadesemulsificante y la libe-ración de péptidos biológicamente activos deciertasproteínas.

Elobjetodeeste trabajode investigación fuedeterminarelefectodelatemperaturayelpHsobreelgradodehidrólisis,duranteelprocesodehidrólisisenzimáticadeunextractodehue-sobovinoprovenientede industriasubicadasenMedellín,Colombia.

Materiales y métodos

Enzimasy reactivos.Seemplearondosenzi-mas de disponibilidad comercialAlcalase 2,4LFGyFlavourzyme®,suministradasporNo-vozymeLatinAmericaLtda.,Brasil.ElpHfueajustado con NaOH 2,0N y HCl 2,0N, paracadaunodelosexperimentosdehidrólisis.

Paracadapruebaseutilizóunreactorde2,0Lde volumen de trabajo con una agitación de200rpmycontroladortérmico.

Elestudiodelahidrólisisenzimáticafuereali-zadoceñidoaundiseñoexperimentalcentralcompuesto(DCCR)2²condospuntoscentra-lesycuatropuntosaxiales,parauntotalde10experimentosparacadaenzima.Lasdosva-riables estudiadas fueron la temperatura convaloresentre45y65°CypHconvaloresen-tre6y7paracadaenzima,conunarelaciónenzima-sustrato(E/S)constantede4,2%w/w,siguiendolopropuestoporKurozawa1.

El valor del grado de hidrólisis es uno de losindicadores más utilizados para comparar di-ferentesprocesosdehidrólisisdeproteínas2ysudeterminaciónmediantemétodopH-StatquefuedescritaporAdler-Nissenen19863,relacio-nandoasíelconsumodeNaOHdurantelaneu-tralización delmedio con la acidez provocadaporlaliberacióndeaminoácidostraslarupturadelasproteínasimplícitasenlamatrizcárnica.

EfectodelpHylatemperaturaenlahidrólisisenzimáticadesubproductosdelaindustriabovina

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Proceso de hidrólisis

El residuode res fuepreviamentedesconge-ladoypesado;luego,elhuesofuesuspendidoenunarelación1:1(w/w)enaguaysometidoatratamientotérmicoaunatemperaturade85°Cdurante15minutosconagitación,conelfindequelasproteínassedesnaturalizaranparafa-cilitarelataqueenzimáticoyfundirlagrasalacualdebeserretiradaensumayoríaparaevi-tar interferenciadeestaconlosagentesneu-tralizantesduranteelproceso.

Paraelseguimientodelgradodehidrólisis,seutilizóelmétodopH-statdondeelconsumodeNaOHfuemedidoen intervalosde5minutosenlaprimerahora,10minutosenlasegunday 15minutos durante el tiempo restante, ob-teniendo así un valor de grado de hidrólisis(GH)quesedefiniócomoelporcentajede larelaciónentreelnúmerodepéptidorotos(h)yelnúmerototaldeenlacesdisponiblesparahi-

drólisisproteolítica(htotal)queserácalculadoconlasiguienteecuación1.

Donde: VNaOH es el volumen de NaOH totalconsumidoexpresadoenmL paramantenerelpHconstantedurante la reacción;Nb es la normalidadde la base;MP es lamasade laproteína(g,Nx6,5);h totaleselnúmero to-taldeenlacesdepéptidosenelsustratodelaproteína (7.6mEq/gproteína);αeselgradodedisociacióndelaproteínaexpresadasegúnlaecuación2.

El valor de pk varía de forma significativacontemperaturaypuedeestimarseasí4,ecua-ción3.

Posteriormentealprocesodehidrólisis,laenzimafueinactivadaparadarporconcluidalareacción;paraellosesometióelsistemaacalentamientoa85±0,3ºCdurante10minutos,seguidodeunenfriamientoatemperaturaambiente.

(1)

(2)

(3)

DondeeslatemperaturaconstanteenKelvin(K)

Resultados y discusión

Enlatabla1seobservaeldiseñoexperimentalpropuesto (DCCR)y los resultadosobtenidosparacadatratamientodehidrólisisenzimáticaparalaenzimacomercialAlcalase2,4LFG.

Elresultadodeajustarunmodeloderegresiónlinealmúltipleparadescribirlarelaciónentreelgradodehidrólisis(%)yunmodelodesuper-ficiederespuestacuadráticosepuedeverenlaecuación4:

R2=0,9216

Donde:GH (%) eselporcentajedelgradodehidrólisisyTypHlosvaloresparalatempera-turayelpHrespectivamente.

Elparámetrolinealmásimportantequeinfluen-cia el GHenelprocesoconlaenzimaAlcalase

eslatemperatura;suvalorpositivoindicaquealincrementarseseestaríaincrementandoelGH;estocorroboraloexpuestoporotrosautores.

Los valores hallados en este estudio para laenzimaAlcalasesonmenoresalosreportados

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porautorescomoShahid yNaczken19955,quienes emplearon unmétodo de superficiesderespuestaparaestudiarelfenómeno,yre-portaron un GHde22%a60ºCenlahidrólisisenzimática de residuos de Capelin (Mollotus villosus);sinembargo,alevaluarlosproductosobtenidos,elquedióel12%presentólasme-jorespropiedades funcionalesynutricionales,lo cual indica que un elevado GH no propor-cionalasmejorespropiedadestecnológicasonutricionales.

Gbogourietal.6realizaronlahidrólisisenzimá-ticadecabezasdesalmónconAlcalase2,4L,yevaluaronelefectodelatemperaturayelpHsobreelGHmediantesuperficiederespuesta,donde reportaron valores de GH superiores a loshalladosenesteestudio(11,5–17,3%)a

temperaturas 55 – 61ºC y pH7,0 – 8,0 y unR2=0,91.EnestetrabajosealcanzóunGH con Alcalasede8,21yunR2=0,9216locualindicauna fuerteexplicacióndel fenómenoa travésdelmodeloderegresiónobtenido.

Sathiveletal.7 encontraron valores de GHma-yoresa15%empleandoAlcalaseenlahidrólisisenzimáticadecabezasdesalmónrojo(Onchor-hynchus nerka);Ovissipouretal.8alcanzaronunGHde16%a55ºCconAlcalaseenlahidrólisisdecabezasdeatún(Thunnus olbacens),valo-ressuperioresaloshalladosenesteestudio.

Puesto que el valor-P en la tablaANOVA esmenorque0.05,existeunarelaciónsignificati-vaentrelasvariablesconunniveldeconfianzadel95.0%,comoseexpresaenlatabla2.

Tabla 1. Resultado del grado de hidrólisis (%) en función de la temperatura y el pH para la enzima Alcalase 2,4 L FG

Alcalase 2,4 L FGTemperatura °C T pH pH Grado de Hidrólisis %

69.14 +α 6.50 0 2.2845.00 -1 7.00 1 2.3355.00 0 6.50 0 1.5265.00 1 7.00 1 1.5645.00 -1 6.00 -1 6.0765.00 1 6.00 -1 5.5140.86 -α 6.50 0 4.8855.00 0 6.50 0 5.7955.00 0 5.79 -α 8.2155.00 0 7.21 +α 4.25

Tabla 2. Resultado de la tabla ANOVA para la enzima Alcalase 2,4 L FG

Error EstadísticoParámetro Estimación Estándar T Valor-PTemperatura

°C 0.994662 0.260247 3.82199 0.0065

pH -3.18599 1.05526 -3.01915 0.0194Temperatura -0.009585 0.0025029 -3.82963 0.0065

Latemperaturaresultóserelfactormássigni-ficativo (p=0,0065)para la obtencióndelGH.Enesteprocesodehidrólisisseencontróquea una temperatura de55°C y unpHde5.79

seobtieneelmayorgradodehidrólisisparalaenzimaAlcalase2,4LFG,talcualcomosevi-sualizaenlafigura1.

EfectodelpHylatemperaturaenlahidrólisisenzimáticadesubproductosdelaindustriabovina

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Porotrolado,enlatabla3seexpresaeldise-ñoexperimentalylosresultadosobtenidostras

cadatratamientodehidrólisisenzimáticaparalaencimadenombrecomercialFlavorzyme.

Figura 1. Gráfi co de superfi cie de respuesta para la función del grado de la actividad para la enzima Alcalase 2,4 L FG en función de la temperatura y el pH

Tabla 3. Resultado del grado de hidrólisis (%) en función de la temperatura y el pH para la enzima Flavorzyme

FlavorzymeTemperatura°C T pH pH GradodeHidrólisis%

45.00 -1 7.00 1 4.8555.00 0 7.21 +α 3.1255.00 0 6.50 0 4.5765.00 1 7.00 1 2.5240.86 -α 6.50 0 4.0255.00 0 5.79 -α 8.2165.00 1 6.00 -1 7.3555.00 0 6.50 0 4.1145.00 -1 6.00 -1 20.2369.14 +α 6.50 0 0.93

Ajustandoel resultadoaunmodeloderegre-sión lineal múltiple para describir la relación

R2=0,7919

entregradodehidrólisisy%enelmodelodesuperficieseobtienelaecuación5:

DondeGH(%)eselporcentajedelgradodehi-drólisisyTypHlosvaloresparalatemperaturayelpH,respectivamente

LosresultadosobtenidosenesteestudiosonsuperioresalosreportadosporSathiveletal.7

lahidrólisisenzimáticadecabezasdesalmónrojo, donde emplearon la enzima Flavourzy-me®yobtuvieronvaloresdemayoresa9%;sinembargo,sonmenoresa loshalladosporOvissipouretal.8yNilsangetal.9dondelogra-ronalcanzarvaloresdeGHde46,13%a55ºC

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yGHmayora50%a45ºC, respectivamente.Esteúltimotrabajoserealizósobreunconcen-tradosolubledepescadoprocedentedelpro-cesamientodelatún.

Comoelvalor-PenlatablaANOVAesmenorque0.05,existeunarelaciónestadísticamentesignifi-cativaentrelasvariablesconunniveldeconfianzadel95.0%talcualcomoseexpresaenlatabla4.

Figura 2. Gráfi co de superfi cie de respuesta para la función del grado de la actividad para la enzima Flavorzyme en función de la temperatura y el pH

Tabla 4. Resultado de la tabla ANOVA para la enzima Flavorzyme

Error EstadísticoParámetro Estimación Estándar T Valor-P

pH 10.6943 3.37264 3.1709 0.0157Temperatura°C^2 -0.002231 0.0013819 -1.6145 0.1505

pH^2 -1.33335 0.482313 -2.7645 0.0279

Comoseobservaen lafigura2, seencontróqueaunatemperaturade45°CyunpHde6seobtieneelmayorgradodehidrólisisparala

enzimaFlavorzyme;elGH(%)esmuchoma-yorparaestaenzima,enmenciónqueparalaAlcalase2,4LFGcasiquedoblasuvalor.

ParalaenzimaFlavorzymeelgradodehidroli-sis(%)másalto,durantelosexperimentos,fuede20.23%acondicionesdeT(°C)de45°CyunpHde6.

SegúnStanciucetal.10yKurozawaetal.11,lahi-drólisisenzimáticasellevaacaboencondicio-nessuavesdetemperatura(40-60ºC)ypH(6-8),loquepermitevisualizarquelosresultadosobtenidosestánacordesconlosrangosnormal-menteestablecidosparaestetipodeprocesos.

Según Pagan, Ibarz y Benítez12 se obtienenvalores de 15 y 20 por ciento en investiga-

ciones previas de la hidrólisis enzimática deproteínadehuesodecerdo,loqueindicaquelos resultados hallados son apropiados paraeste tipo dematriz, y ajustables a la enzimaFlavorzyme® en la hidrólisis de proteína dehuesoderes.

Conclusiones

Es posible realizar un hidrolizado proteico apartirdehuesoderes,subproductogeneradopor el repele de las canales en de la industria bovina.

EfectodelpHylatemperaturaenlahidrólisisenzimáticadesubproductosdelaindustriabovina

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La evaluación de pH y temperatura permitióacercarnosalasregionesóptimasdehidrólisisenzimática para las enzimas de carácter co-mercialAlcalase2.4LFGyFlavorzymeloqueayudaríaaunaposterioroptimizacióndelpro-cesoparalaobtencióndepéptidosyaminoáci-doslibresquepodríanserunaporteimportantepara el desarrollo de productos con valor nutri-cionalapreciableyunvaloragregadoconside-rable, debido a su contribución almanejo deresiduosagroindustriales.

Apesardequenohayestudiosreportadoseneltipodematriztrabajada,losporcentajesdegrado de hidrólisis obtenidos son adecuadostomandocomobasedecomparaciónlosresul-tadosobtenidosconotrosautores.

Agradecimientos

LosautoresagradecenalSENAporlafinancia-cióndelproyectodeinvestigaciónconelcon-venio331delaño2011,aTecnasS.A.,Funda-ciónINTALenColombiayalDepartamentodetecnologíadealimentos,UniversidaddeLleida–Españaya todoel recursohumano involu-cradoenlarealizacióndeesteproyecto.

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