胃癌診断のための高感受性血清腫瘍マーカー - JST...胃癌診断のための高感受性血清腫瘍マーカー広島大学大学院医歯薬学総合研究科

胃癌診断のための高感受性血清腫瘍マーカー

広島大学大学院医歯薬学総合研究科分子病理

講師大上直秀教授安井弥

8/20 大阪広島大学「新技術説明会」

Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences

研究背景

胃癌は近年減少してきているとはいえ、尚、最も頻度の高い癌の一つであり、この克服は現代社会の最大の課題である。

分子病理学研究室では、胃癌の発生・進展のメカニズムを解析し、胃癌の病態解明を行っている。さらに、そこから得られた知見をもとに、胃癌の診断・治療に有用な標的分子を同定し、実際の診断・治療への有用性について検討している。


従来技術とその問題点

現在、癌の確定診断には主として病理形態学的診断が用いられいる。しかし、多数の検体に対して病理形態学的診断を行うことは困難であり、血液検査等の簡便な方法で癌の存在を調べる検査が必要とされている。既に実用化されている胃癌の血清腫瘍マーカーとして、CEA、CA19-9があげられるが、陽性率は10-20%程度で、早期の癌を検出するのに不適切である。さらに偽陽性も多いことが問題点として指摘されている。

従って、感受性の高い血清腫瘍マーカーの開発が必要とされている。


Serial Analysis ofGene Expression

Velculescu et al. Science 270:484, 1995

cDNAマイクロアレイとともに代表的な網羅的遺伝子発現解析法（1995年 Kinzlerらが考案）

CATG 下流の 10-12bp の tag をsequenceすることによりその出現頻度と種類を解析し、NCBIのdatabaseにより対応する遺伝子を知ることができる

定量性・再現性に優れる未知の遺伝子の解析が可能

現在までに約300種類の組織あるいは細胞のSAGE libraryが登録されており、それらのデータとdirectに比較することができる


Sample Histology clone tag

W226T tub1 (Early cancer) 2,592 43,908W246T tub1 (Advanced cancer) 2,867 32,174P208T por1 (Primary tumor) 2,701 11,582P208L por1 (LN metastasis) 1,034 15,382S219T por2 (Scirrhous type) 2,441 34,660

Total 5 samples 11,635 137,70638,903 unique tags

NCBI Gene Expression Omnibus: GEO accession: GSE545 (SAGE Hiroshima gastric cancer tissue)


Invasion

Lymph node metastasis

Frequently overexpressed genes (tumor/normal ratio>2)

Stage

COL1A1 (78.3%), CDH17 (73.9%), APOC1 (67.4%), COL1A2 (58.7%), YF13H12 (52.2%), CEACAM6 (50.0%), APOE (50.0%), REGIV (47.8%), S100A11 (41.3%), FUS (41.3%)

CDH17 (P=0.0060), APOE (P =0.0139)

FUS (P =0.0416), APOE (P =0.0006)

FUS (P =0.0414), COL1A1 (P =0.0156), COL1A2 (P =0.0395), APOE (P =0.0125)

Real time RT-PCR analysis in 46 GC samples

YF13H12 >10

1

32

456789

0

T/N

ratio

1 1 12 1 3 1 4 151 610

1 7 1 81 9 20 212 2

23 24 2 5 262 7

2 82 9

3 0 3 1 32 3 3 3 4 3 5 3 6 3 7 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 4 61 32

45

67 8

9

YF13H12 protein expressed in thyroid CDH17

>10

1

32

456789

0 7 8 9 3 1 4 71 1 1 2 1 3 1 4 1 5 1 61 0 1 1 1 2 0 2 1 2 2 2 2 4 2 5 2 6 2 7 2 8 2 9 3 0 3 3 2 3 3 3 3 5 3 6 3 3 8 3 9 4 0 4 1 4 2 4 3 4 4 4 5 461 32 4 5 6 7 8 9

T/N

ratio

W226T

P208T

胃癌関連遺伝子の同定W246T

P208L

S219T

Oue N, Yasui W, et al. Cancer Res, 2004.


Liver Kidney Heart ColonBrain Bone marrow Skeletal muscleLung Small intestine SpleenSpinal cord Stomach Pancreas Leukocyte

DEF5

OLFM4 MIA DKK4REG4 MMP10

TRAG3

HORMAD1

ATE1 BRD4 ETS2

MLL4 CCT3 GPP34R LMO6

Gastric cancer

Normal tissue Candidate gastric cancer specific genes

胃癌特異的遺伝子の探索

胃癌のSAGEライブラリーと生命維持に重要な14の臓器（心臓、肝臓等）のSAGEライブラリーを比較し、胃癌のSAGEライブラリーのみで発現している遺伝子を抽出した。抽出された54遺伝子すべてについて、realtime RT-PCR法で遺伝子発現を測定した。正常臓器で最も発現が高かった遺伝子発現量と、胃癌で最も発現が高かった遺伝子発現量を比較し、胃癌で10倍以上高かった遺伝子を癌特異的遺伝子と定義した。

Aung PP, Oue N, Yasui W, et al. Oncogene, 2006.

全身臓器におけるReg IVの遺伝子発現解析

Real time RT-PCR analysis

全身正常組織

Stom

ach

Smal

l int

estin

e

Panc

reas

Col

on

胃癌大腸癌肺癌乳癌

0

10

20

30

40

50

60

REG

IV m

RN

A e

xpre

ssio

n le

vel

TMK-1-Reg TMK-1-empty

Cel

l

Med

ium Western

blot

Cel

l

Med

ium

- β-actin

- V5-Reg IV

全身正常組織ではReg IVの発現はほとんどなかったが、胃癌、大腸癌において高いレベルのReg IVが検出された。

Reg IV培養液中に分泌される

Department of Molecular PathologyHiroshima University Graduate School of Biomedical Sciences Oue N, Yasui W, et al. J Pathol, 2005.

・ Reg IVは2001年に炎症性腸疾患にて発現が亢進している遺伝子としてクローニングされた。

・ EGFRを活性化し、アポトーシスを抑制することが知られている。

Reg IV (Regenerating islet-derived family, member 4)Reg IV (Regenerating islet-derived family, member 4)

胃癌組織におけるReg IVの免疫染色

30%の胃癌でReg IVの発現が認められた。


胃癌患者の血清におけるReg IVの検出

n = 101

n = 36

n = 6

n = 10

n = 9

2

4

6

Seru

m R

eg IV

leve

lng/ml

0


健常人 Stage I Stage II Stage III Stage IV

胃癌

特異性は99%、感受性は36%であった。

胃炎患者

n = 201

3

5

7

Mitani Y, Oue N, Yasui W, et al. Oncogene, 2007


別名、GW112、hGC-1

・骨髄芽球からクローニングされた遺伝子である。分泌蛋白をコードする。510-amino acids

・正常では、骨髄、小腸、大腸、前立腺に発現する。

・潰瘍性大腸炎、大腸癌、肺癌、乳癌などにおける発現が確認されている。

・ GRIM-19、cadherin、lectinと結合し、アポトーシスや細胞接着を制御する。

Live

rK

idne

yH

eart

Col

onB

rain

Bon

e m

arro

wSk

elet

al m

uscl

eLu

ngSm

all i

ntes

tine

Sple

enSp

inal

cor

dSt

omac

hPa

ncre

asLe

ukoc

ytes

GC

1G

C2

GC

3G

C4

GC

5G

C6

GC

7G

C8

GC

9C

RC

1C

RC

2C

RC

3C

RC

4C

RC

5C

RC

6C

RC

7C

RC

8C

RC

9

胃癌正常組織大腸癌

0

2

4

6

8

>10

Fold

diff

eren

ce (T

umor

/Nor

mal

)Stage I Stage II Stage III Stage IV

-- P = 0.0070 --6/19 (32%) 23/31 (74%)T/N>2

Gastric cancer T/N>2: 29 / 50 (58%)T/N>2: 29 / 50 (58%)全身臓器におけるReg IVの遺伝子発現解析

Real time RT-PCR analysis

OLFM4 (Olfactomedin 4)OLFM4 (Olfactomedin 4)

全身正常組織ではOLFM4の発現はほとんどなかったが、胃癌において高いレベルのOLFM4が検出された。

OLFM4の局在・発現とその機能

小腸

胃癌


59%の胃癌でOLFM4の発現を認めた。

胃癌

正常小腸においても一部に発現を認めた。

胃癌患者の血清におけるOLFM4の検出

健常人 Stage I Stage II Stage III Stage IV

胃癌

n = 101

n = 36

n = 6

n = 10

n = 9

50

100

Seru

m O

LFM

4 le

vel

ng/ml

0


150

200

250

胃炎患者

n = 76

n = 60

n = 8

n = 15

n = 40

n = 20

特異性は95%、感受性は31%であった。


OLFM4Reg IVCA19-9CEA

OLFM4+Reg IV

胃癌患者 123例、健常人 76例

OLFM4 OLFM4 OLFM4

Reg IV CA19-9 CEA

Specificity95%97%100%100%

95%

Sensitivity31%37%15%14%

57%

特願2008-005023「消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、および消化器癌検出方法」

Reg IVとOLFM4の血清診断マーカーとしての有用性

Reg IVとOLFM4の組合わせは、胃癌の高感度の血清診断マーカーである。

Reg IV、OLFM4ともに、stage Iの胃癌症例でも30％以上が陽性である。

新技術の特徴・従来技術との比較

胃癌の血清マーカーであるCEA、CA19-9の陽性率はそれぞれ10%程度であったのに対し、Reg IVの陽性率は36%、OLFM4の陽性率は31%であり、従来のマーカーよりも検出感度が高かった。

さらに、Reg IVとOLFM4陽性例は一致しない傾向にあった。両者を組み合せると陽性率は57%であり、半数以上の胃癌を検出できた。


想定される用途・業界

胃癌の新規血清マーカーであるReg IV、OLFM4、あるいは両者の組み合わせは陽性率が高いことから、胃癌のスクリーニングに使用すれば、簡便にこれらの癌を検出できる。血清を材料に用いるので、被検者への負担も少ない。

上記以外に、抗がん剤の効果判定にも使用できる可能性がある。

検査センター、病院において、これらの検出試薬が使用されるものと考えられる。尚、血清腫瘍マーカーの測定はELISA法であり、導入は容易である。


実用化に向けた課題

Reg IV、OLFM4ともELISAの系は完成しており、胃癌患者の血清解析も終了している。

実用化に向けて標準化された方法を確立すると共に、多数の胃癌患者、健常人の血清を解析する必要がある。


企業への期待

Reg IVとOLFM4の標準化されたELISAの系を開発する。

標準化されたELISAの系があれば、多数例の胃癌患者、健常人の血清を材料にReg IVとOLFM4の濃度を測定することができる。

抗体作成技術を持つ企業との共同研究を希望。


本技術に関する知的財産権

発明の名称：消化器癌検出用血清腫瘍マーカー、消化器癌検出キット、および消化器癌検出方法

出願番号：特願2008-005023

出願人：国立大学法人広島大学

発明者：安井弥、大上直秀


Reg IV、OLFM4単独での知的財産権の申請はしていない。

お問い合わせ先

広島大学大学院医歯薬学総合研究科分子病理学教室

講師大上直秀（おおうえなおひで）

TEL: 082-257-5147FAX: 082-257-5149e-mail: [email protected]


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