EIΣAΓΩΓH ΣTHN ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ

Δρ. Xρήστος Παναγιωτίδης, Tµήµα Φαρµακευτικής

ΦAPMAKEYTIKHΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

ΔIAΛEΞEIΣ1-3

EIΣAΓΩΓHΣTHNΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ

ΚΑΙΣΤΗΝTEXNOΛOΓIATOYΑΝΑΣΥΝΔΥΑΣΜΕΝΟΥDNA


ΗΠΡΟΟΔΟΣΤΗΣΜΟΡΙΑΚΗΣΒΙΟΛΟΓΙΑΣΕΔΩΣΕΩΘΗΣΗΚΑΙΣΤΗΝΑΝΑΠΤΥΞΗΤΗΣΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗΣΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

HΜοριακήΒιολογίαπουέχειωςαντικείμενοτηνανάλυσητηςδομήςκαιτηςέκφρασηςτουγενετικούυλικούανέπτυξεμιάσειράεργαλείααπαραίτηταγιατηνανάπτυξηκαιτηςΦαρμακευτικηςΒιοτεχνολογίας,όπωςτιςδυνατότητες:

✔  Nα«κόβουμε»τοDNAσεμικρότερατμήματα✔  Να«αρχειοθετούμε»τοDNAστοεργαστήριο✔  NααναλύουμετηνπρωτοταγήδομήτουDNA✔  Nαμετράμετηνέκφρασητωνγονιδίων✔  Nαεκφράζουμεταγονίδιασεετερόλογασυστήματαείτεγιανα

μελετήσουμετηλειτουργικότητάτουςήγιαναπαράγουμεμεγάλεςποσότητεςτωνπροϊόντωντους

✔  Ναενισχύουμεγενετικόυλικόαπόαπειροελάχιστεςποσότητες

ΕισαγωγήDNAσεευκαρυωτικάκύτταρααλλάζειτονφαινότυποτους

ΕφαρμογήστηΦαρμακευτικήΒιοτεχνολογία;G

enes VIII - Ακαδημαϊκές Εκδόσεις 2004


Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση

Φορείς Έκφρασης

DNAΜΠΟΡΕΙΝΑΑΠΟΜΟΝΩΘΕΙΕΙΤΕΑΠΟΚΥΤΤΑΡΑΗΑΠΟΙΣΤΟΥΣΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ

ΝΑΜΕΛΕΤΗΘΕΙ■  ΠΡΟΣΟΧΗ:

ΤοDNAείναιέναΤΕΡΑΣΤΙΟμόριο(ακόμηκαιτοDNAτωνσχετικάμικρώνβακτηριακώνγονιδιωμάτωνείναιαρκετάμεγάλο)πουείναιεξαιρετικάευαίσθητοστημηχανικήκαταπόνηση,δηλαδήμπορείπολύεύκολανα«σπάσει»σεμικρότεραθραύσματακατάτηδιάρκειατωνεργαστηριακώνχειρισμών.

ΕΠΟΜΕΝΩΣ

ü Το«κόψιμο»τουDNAσεμικρότεραθεραύσματαμπορείναβελτιώσειτημηχανικήτουσταθερότητακαινααπλοποιήσειτοχειρισμότου


ΠΩΣMΠOPOYMENA«KOΨOYME»TODNAΣEMIKPOTEPAΘPAYΣMATA;

METHXPHΣHEIΔIKΩNENZYMΩN

✍ YΠAPXOYNΠPOΫΠOΘEΣEIΣ;

✔ NAI,TAENZYMAAYTAΘAΠPEΠEINAΔIAΣΠOYNTODNAΠANTAΣTIΣIΔIEΣAΛΛHΛOYXIEΣOIOΠOIEΣEINAIEKTΩN

ΠPOTEPΩNΓNΩΣTEΣ


ENΔONOYKΛEAΣEΣΠEPIOPIΣMOY

Oιενδονουκλεάσεςπεριορισμούείναιένζυματαοποίααναγνωρίζουνσυγκεκριμένες

παλινδρομικέςαλληλουχίεςτουDNAκαιτιςδιασπούνπάνταστοίδιοσημείο.Μπορύνναθεωρηθούνσαν«μοριακάψαλίδια»που

κόβουντοDNA

Παραδείγματαστιςεπόμενεςδιαφάνειες

ΤΙΕΙΝΑΙΟΙENΔONOYKΛEAΣEΣΠEPIOPIΣMOY;

Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού είναι ενδονουκλεάσες οι οποίες αναγνωρίζουν συγκεκριµένες παλινδροµικές αλληλουχίες στο DNA, το οποίο διασπούν πάντα στις

ίδιες προκαθορισµένες θεσεις.

Θαδείξουμεμερικάπαραδείγματαστιςεπόμενεςδύοδιαφάνειες

ΤΕΣΣΕΡΙΣ�ΔΗΜΟΦΙΛΕΙΣ��ΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΩΝΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

EcoRI

HindIII

AluI

NotI

PstI

θέσηδιάσπασης Σακχαροφωσφορικόςσκελετός

ΑΠΟΠΟΥΠΡΟΕΡΧΟΝΤΑΙΟΙΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ;

✔ Οι ενδονουκλεάσες περιορισµού αποµονώθηκαν αρχικά από βακτήρια. Είναι συστατικά ενός

µηχανισµού άµυνας των βακτηρίων ενάντια σε εισβολή ξένου γενετικού υλικού, π.χ. από

µόλυνση µε κάποιον βακτηριοφάγο.

✄ Γιατί οι ενδονουκλεάσες περιορισµού δεν διασπούν και το DNA του βακτηρίου που τα

παράγει;

ΕΞΕΙΔΙΚΕΥΜΕΝΗΧΗΜΙΚΗΤΡΟΠΟΠΟΙΗΣΗΤΟΥΒΑΚΤΗΡΙΑΚΟΥDNAΤΟΠΡΟΣΤΑΤΕΥΕΙΑΠΟ

ΠΕΨΗΑΠΟΕΝΔΟΝΟΥΚΛΕΑΣΕΣΠΕΡΙΟΡΙΣΜΟΥ

ΜεθυλιωμένοDNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

ΗEcoRIδεμπορείναδιασπάσειτομεθυλιωμένοDNA

ΜημεθυλιωμένοDNA

ΔιάσπασητουDNA

«κολλώδη»άκρα

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI

EcoRIμεθυλάση

ΕνδονουκλεάσηπεριορισμούEcoRI


ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΚΟΠΗ ΤΙ;

Πως αναλύεται το DNA µετά την πέψη του µε ενδονουκλεάσες περιορισµού;


HΛEKTPOΦOPHTIKHANAΛYΣHTΩNΘPAYΣMATΩNTOYDNA


APXEΣHΛEKTPOΦOPHTIKHΣANAΛYΣHΣ


KΛΩNOΠOIHΣH H «αρχειοθέτηση» του DNA

στο εργαστήριο


Φορείς κλωνοποίησης - Tα πλασµίδια


H Διαδικασία της Kλωνοποίησης


Πολλαπλασιασµός των Aντιγράφων ενός Γονιδίου

µε Kλωνοποίηση


Aπαραίτητες Iδιότητες ενός Πλασµιδιακού Φορέα

Kλωνοποίησης1. Aλληλουχίες έναρξης αντιγραφής (ORI) 2. Γονίδιο που επιτρέπει εύκολη επιλογή

(π.χ.Aντίσταση σε αντιβιοτικό) 3. Aλληλουχίες που επιτρέπουν κοπή από αρκετές ενδονουκλεάσες περιορισµού (polylinker)

4. ( Έναν υποκινητή που να επιτρέπει ρυθµιζόµενη έκφραση)


Δηµιουργία µιας Γενωµικής Bιβλιοθήκης


Γενωµικές & cDNA Bιβλιοθήκες


Διαδικασία Παρασκευής cDNA


Χωρητικότητα κοινών φορέων κλωνοποίησης


Bιβλιοθήκες DNA µπορούν να Kατασκευασθούν και σε

Φάγους


Τα βασικά βήµατα της κλωνοποίησης DNA σε πλασµίδιο


Συρραφή ΘραυσµάτωνDNA µε Διαδοχική Kλωνοποίηση


Προσανατολισµένη κλωνοποίηση του δίκλωνου cDNA σε πλασµιδιακό φορέα


Διάκριση µπλε-λευκών αποικιών για τον εντοπισµό ανασυνδυασµένων φορέων


ΠΩΣ MΠOPOYME NA TAYTOΠOIHΣOYME

AΠOIKIEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN ANAΣYNΔYAΣMENOYΣ ΦOPEIΣ KΛΩNOΠOIHΣHΣ

AΠO AYTEΣ ΠOY ΠEPIEXOYN «AΔEIOYΣ»

ΦOPEIΣ;

Τακοσμίδιαείναιπλασμιδιακοίφορείςκλωνοποίησηςπουπεριέχουνμίαήδύοθέσεις�cos�.(Ηθέσηcosείναιμίααλληλουχίαπερίπου200bpπουπροέρχεταιαπότονφάγολκαιηοποίαείναιαπαραίτητηγιατο«πακετάρισμα»τουDNAσεσωματίδιαφάγου).ΠωςκλωνοποιούμετοDNAσεένακοσμίδιο;1.Χρησιμοποιούμετηθέσηπολλαπλήςκλωνοποίησης(polylinker)γιαναενθέσουμε

θραύσματαDNAπουέχουνδημιουργηθείμεπέψημεενδονουκλεάσεςπεριορισμού.

2.ΤοDNAπακετάρεταισεφάγους,ακριβώςόπωςκαιτοDNAτουίδιουτουφάγου.3.Τακοσμίδιαπολλαπλασιάζονταιμέσασταβακτηριακάκύτταραόπωςκαιτα

πλασμίδια(δηλ.φέρουνγονίδιαπουπροσδίδουνστακύτταρααντίστασησεαντιβιοτικό).

4.Τακοσμίδιααπομονώνονταιακριβώςόπωςκαιταπλασμίδια.Τοπλεονέκτηματουςείναιότιμπορούννα«πακετάρουν»μέσαστην«κεφαλή»του

φάγουμεγαλύτερασεμέγεθοςθραύσματαDNA(40-55kbofDNA,δηλ.Σεκοσμίδιαμεγέθους~5kbμπορούμεναεισάγουμεενθέματα33-50kb)).

Kοσµίδια

•  Τοκοσμίδιο«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηBglIIσεθέσηκοντάστηθέσηcos.•  ΤογενωμικόDNA«κόβεται»μετηνενδονουκλεάσηSau3A(μερικήυδρόλυση),πουδημιουργεί

συμβατά«κολλώδη»άκραμετηνBglII.Ταθραύσματατακατεργαζόμαστεμεαλκαλικήφωσφατάση(ΓΙΑΤΙ;)

•  ΤοDNAδότηςσυνδέεταιμετοDNAδέκτη(κοσμίδιο)μετηνDNAλιγάσηδημιουργώνταςενσειράσυνδέσεις.ΤοDNAκαθαρίζεταιμεβάσητομέγεθος.

•  ΤοDNA«πακετάρεται»σεφάγους.

Kλωνοποίηση σε κοσµίδια - Παράδειγµα

Το DNA των κοσµιδίων «πακετάρεται» σε γραµµική µορφή

Κοσµίδια - ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ


YBPIΔIΣMOΣ NOYKΛEΪNIKΩN OΞEΩN


Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς

Kλώνους µε Yβριδισµό -1


Tαυτοποίηση Aποικιών που Περιέχουν Θετικούς

Kλώνους µε Yβριδισµό - 2


ΠΩΣ MΠOPOYME NA EΠITYXOYME THN

ANAΛYΣH/TAYTOΠOIHΣH ΣYΓKEKPIMENΩN ΘPAYΣMATΩN DNA

(πριν την κλωνοποίηση ή και µετά);


Στύπωµα κατά Southern: ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και υβριδοποίηση - 1


Στύπωµα κατά Southern:

ανάλυση DNA µε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωµα, στύπωµα και

υβριδοποίηση - 2


ANIXNEYΣH THΣ METAΛΛAΞHΣ ΠOY ΠPOKAΛEI ΔPEΠANOKYTTAPIKH

ANAIMIA ΜΕ ΥΒΡΙΔΙΣΜΟ ΝΟΥΚΛΕΪΝΙΚΩΝ ΟΞΕΩΝ


Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη

χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων


Διαδικασία αλληλούχισης DNA µε τη µέθοδο του Sanger που βασίζεται στη

χρήση διδεοξυνουκλεοτιδίων


TI KANOYME OTAN TO ΔIAΘEΣIMO ΓENETIKO

YΛIKO ΔEN EINAI ΔIAΘEΣIMO ΣE ΠOΣOTHTEΣ

IKANEΣ ΠPOΣ ANAΛYΣH; ΦTIAXNOYME ΠEPIΣΣOTEPO ΜΕ ΤΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΤΗΣ ΑΛΥΣΙΔΩΤΗΣ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗΣ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ

(PCR)


PCR – Η ενίσχυση του DNA in vitro


Ο κύκλος της τεχνικής PCR


Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την

PCR - 1


Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 2


Η εκθετική αύξηση των αντιγράφων του DNA κατά την PCR - 3


Μοριακή διαγνωστική µε PCR στην ιατροδικαστική


Aνίχνευση HIV µε RT-PCR


Xρήση RT-PCR µε πολλαπλούς εκκινητές στη µοριακή διαγνωστική µιάς

ιογενούς κτηνιατρικής νόσου


H PCR στην κλωνοποιηση DNA και RNA


Χρήση της PCR πραγµατικού χρόνου για τη µέτρηση της ποσότητας των

µορίων-στόχων που περιέχει ένα δείγµα


Μοριακοί φάροι για την PCR πραγµατικού χρόνου


Παραγωγή Mεγάλων Ποσοτήτων Πρωτεϊνών µε Kλωνοποίηση

Φορείς Έκφρασης


Kατευθυνόµενη Mεταλλαξιγένεση


Eισαγωγή Kατευθυνόµενων Tροποποιήσεων στο

Γενετικό Yλικό


Kατασκευή Διαγονιδιακών Ποντικών

Documents

EIΣAΓΩΓH ΣTHN ΦΑΡΜΑΚΕΥΤΙΚΗ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΚΑΙ ΣΤΗΝ