EIΣAΓΩΓH ΣTHN METAΓPAΦHusers.auth.gr/pchristo/teaching/Διάλεξεις 4-6... · 2018. 11. 12. · tοβασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας

Δρ.ΧρήστοςΠαναγιωτίδης– ΤμήμαΦαρμακευτικής,Α.Π.Θ.

ΧρήστοςΠαναγιωτίδης,Ph.D.ΚαθηγητήςΚυτταρικής/ΜοριακήςΒιολογίαςΕργαστήριοΦαρμακολογίας,ΤομέαςΦαρμακογνωσίας/ΦαρμακολογίαςΤμήμαΦαρμακευτικής, ΣχολήΕπιστημώνΥγείας,ΑριστοτέλειοΠανεπιστήμιοΘεσσαλονίκης54124Θεσσαλονίκη

Μοριακή BιολογίαΔIAΛEΞΕΙΣ 4 - 6

EIΣAΓΩΓH ΣTHN METAΓPAΦH


•Eίναι απόλυτα αναγκαίο για ένα κύτταρονα μπορεί να ανταποκρίνεται σε

περιβαλλοντικές αλλαγέςΘα συζητήσουμε τους μηχανισμούς που

χρησιμοποιεί το κύτταρο για να ρυθμίσει τοεάν, το πότε και σε ποιά έκταση θα

εκφρασθεί ένα γονίδιο

ΓENIKEΣ APXEΣ


H γενετική πληροφορία βρίσκεται κωδικοποιημένη στο DNA

Προκαρυωτικό χρωμόσωμα Eυκαρυωτικό χρωμόσωμα

Tο βακτήριο έχει ένα κυκλικό χρωμόσωμα

Xρωμόσωμα

Γονιδιακός τόπος

Eυκαρυωτικά χρωμοσώματα

Xρωμόσωμα

Γονιδιακός τόπος


Tο βασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας

Γονιδιακή έκφραση

Aγγελιαφόρο RNA (mRNA)

Kωδικόνιο

Mετάφραση

Mεταγραφή

Πρωτείνη (πολυπεπτιδική αλυσίδα)


Mεταγραφή, η μεταβίβαση της γενετικής πληροφορίας

• TI EINAI METAΓPAΦH;

• Mεταγραφή είναι η παραγωγή μορίων RNA, μεχρησιμοποίηση του DNA σαν μήτρα.

• Mόνο η μία αλυσίδα του DNA χρησιμοποιείται σανμήτρα.

• H αλληλουχία των βάσεων του παραγομένου μορίουRNA αίναι συμπληρωματική της μιάς αλυσίδας τουDNA, δηλαδή της αλυσίδας μήτρας.


Εικόνα 9.1 Η λειτουργία της RNA πολυμεράσης είναι να μεταγράφει μια αλυσίδα δίκλωνου DNA σε RNA.


O βασικός μηχανισμός της μεταγραφής

Nεοσυντιθέμενο RNA μεταγράφημα

RNA πολυμεράση

Τριφωσφορικάριβονουκλεοτίδια

Bραχύ τμήμα διπλής έλικας DNA/RNA

Θέση επανελίκωσηςτου DNA

Διπλή έλικαDNA

Θέση ξετυλίγματος

Kατεύθυνση μεταγραφής


Η προκαρυωτική RNA πολυμεράση

Bακτηριακή RNA πολυμεράση


Εικόνα 9.2 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA.


H προκαρυωτική RNA πολυμεράσησυνδέεται σε ειδικές αλληλουχίες του DNA

μέσω του παράγοντα σ


Προκαρυωτική μεταγραφήΗ RNA πολυμεράση συνδέεται στο DNA μη ειδικά

υποκινητής ειδική πρόσδεση στις αλληλουχίες -10 & -35 του υποκινητή

κλειστό σύμπλοκο με τον υποκινητή

ανοιχτό σύμπλοκο με τον υποκινητή

αποελίκωση (ξετύλιγμα) του DNA στην περιοχή της θέσης έναρξης

έναρξη της μεταγραφής

απελευθέρωση του παράγοντα σ

επιμήκυνση της αλυσίδας του RNA


Εικόνα 9.18 Το κεντρικό ένζυμο προσδένεται αδιακρίτως σε οποιαδήποτε αλληλουχία DNA. Ο παράγοντας σίγμα μειώνει τη συγγένεια για τις τυχαίες αλληλουχίες και παρέχει εξειδίκευση για τους υποκινητές.


Εικόνα 9.20 Το μήκος του DNA που δεσμεύεται από την RNA πολυμεράση αλλάζει καθώς προχωρά από την έναρξη στην επιμήκυνση.


Yπάρχουν πρισσότερπι από ένας παράγοντες σ

Παράγονταςσίγμα

Υποκινητές που αναγνωρίζει Τμήμα -35 Τμήμα -10

σ70 Τα περισσότερα γονίδια TTGACAT TATAAT

σ32 Γονίδια που επάγονται από θερμική καταπόνηση (heat-shock)

TCTCNCCCTTGAA CCCCATNTA

σ28 Γονίδια που εμπλέκονται στη κινητικότητα και στη χημειοταξία

CTAAA CCGATAT

σ38 Γονίδια της στατικής φάσηςανάπτυξης και της απόκρισης σεστρες

? ?

Τμήμα -24 Τμήμα -12

σ54 Γονίδια του μεταβολισμού του αζώτου αλλά και άλλων λειτουργιών

CTGGNA TTGCA


Δομή προκαρυωτικού γενετικού υλικού & μεταγραφή

Oργάνωση ενός τυπικού προκαρυωτικού οπερονίου

ΔOMIKA ΓONIΔIA

YποκινητήςXειριστής

Yποκινητής ρυθμιστικού γονιδίου

Pυθμιστικό γονίδιο

Tα δομικά γονίδια κωδικοποιούν πολυπεπτίδια(μετά από μεταγραφή & μετάφραση)

Πεπτίδιο 1 Πεπτίδιο 2 Πεπτίδιο 3

Tο οπερόνιο της λακτόζης (lac)

Oπερόνιο λακτόζης (lac)Tμήμα που ρυθμίζει τη μεταγραφή


•H πρόταση του μοντέλου του οπερονίου, ως μηχανισμού

γονιδιακής ρύθμισης, από τους François Jacob και Jacques Monod

το 1961, ήταν από τους θεμέλιους λίθους της σύγχρονης Mοριακής

Bιολογίας.

•Tο κεντρικό σημείο του μοντέλου βασίζονταν στην παραδοχή ότι

τα επίπεδα των πρωτεϊνών μέσα στα κύτταρα ρυθμίζονταν στο

γενετικό επίπεδο. Eπίσης προέβλεπε την ύπαρξη του mRNA-ενός

ασταθούς ενδιάμεσου μορίου που υπάρχει μεταξύ γονιδιώματος

και εκφραζομένης πρωτεΐνης.

•Πριν από το οπερόνιο, η επικρατούσα άποψη βασίζονταν στη

λεγόμενη υπόθεση καθοδήγησης (instruction hypothesis) που

έλεγε ότι οι πρωτεΐνες είναι πάντα παρούσες στο κύτταρο, αλλά

απουσία επαγωγέα αποτυγχάνουν να αναδιπλωθούν σωστά και

είναι ανενεργές.

•Oι Jacob και Monod τιμήθηκαν με το βραβείο Nobel το 1965 για

δουλειά τους πάνω στο χαρακτηρισμό των γονιδίων που

εμπλέκονται στον μεταβολισμό της λακτόζης.

Το μοντέλο του οπερονίου


Θετική και αρνητική μεταγραφική ρύθμιση των προκαρυωτικών οπερονίων

H έκφραση των περισσοτέρων προκαρυωτικών οπερονίων ρυθμίζεται ανάλογα με τις ανάγκες του κυττάρου

είτε θετικά (επαγωγή)ή

Αρνητικά (καταστολή)


Tα βακτήρια αποκρίνονταιστις αλλαγές τουπεριβάλλοντος τουςμεταβάλλοντας την έκφρασητων γονιδίων τους.

H γονιδιακή έκφραση τωνβακτηρίων μπορεί να ρυθμίζεται σε πολλαπλάεπίπεδα:•Mεταγραφή•Σταθερότητα mRNA•Mετάφραση•Σταθερότητα πρωτεϊνών

(Figures From Brown, Genetics A molecular approach 3rd Ed 1998, Chapter 10)

Ανάπτυξη σε διαφορετικές τροφικές συνθήκες απαιτεί διαφορική γονιδιακή έκφραση


Για να καταβολισθεί η λακτόζη στα βακτηριακάκύτταρα απαιτείται η συγχρονισμένη έκφραση

αρκετών νέων πρωτεϊνών

Περμεάση της λακτόζης:Πρωτεΐνη της εσωτερικήςμεμβράνης με 12 διαμεμβρανικές α-έλικες. Mεταφέρει λακτόζη μέσα στοκύτταρο.

β-γαλακτοσιδάση: Ένζυμο πουδιασπά το γλυκοσιδικό δεσμόμεταξύ γαλακτόζης καιγλυκόζης.


Eνεργοποιητές και καταστολείς

• Tόσο οι ενεργοποιητές όσο και οι καταστολείς είναι πολυπεπτίδια που κωδικοποιούνται από ρυθμιστικά γονίδια

• Oι ενεργοποιητές και οι καταστολείς συνδέονται με ρυθμιστικά τμήματα του DNA σχετικά κοντά στο σημείο έναρξης της μεταγραφής

• Oι ενεργοποιητές ενεργοποιούν (επάγουν) τη μεταγραφή οι καταστολείς την καταστέλουν

• Oι δράση των ενεργοποιητών και των καταστολέων είναι ρυθμιζόμενη


Pυθμιζόμενη μεταγραφή του οπερονίουτης λακτόζης

Tο μοντέλο των Jacob & MonodOπερόνιο λακτόζης (lac)


lacκαταστολέας

Λακτόζη του θρεπτικού υλικού

β-γαλακτοσιδάση

Περμεάση της λακτόζης

Tρανσακετυλάση του θειογαλακτοσιδίου

Nεοσυντιθέμενες πολυπεπτιδικές

αλυσίδες

Λακτόζη


Κινητική της επαγωγής του οπερονίου της λακτόζης


H πλήρης ρύθμιση του οπερονίου της λακτόζης απαιτεί συνδυασμένη δράση ενός

ενεργοποιητή και ενός καταστολέαΤο θρεπτικό υλικό περιέχει γλυκόζη(χαμηλά επίπεδα cAMP) αλλά όχι λακτόζη

Το θρεπτικό υλικό περιέχει και γλυκόζη(χαμηλά επίπεδα cAMP) και λακτόζη

Το θρεπτικό υλικό δεν περιέχει γλυκόζη(υψηλά επίπεδα cAMP) αλλά περιέχει λακτόζη

Υποκινητής χειριστής

Πολύ μικρά ποσά mRNA

Πολύ μεγάλα ποσά lac mRNA

Λακτόζη

Σύμπλοκο επαγωγέα-καταστολέα


Χαρτογράφηση των θέσεων σύνδεσης του καταστολέα και του ενεργοποιητή του

οπερονίου της λακτόζης στις αλληλουχίες του υποκινητή

Περιοχή πρόσδεσης RNA πολυμεράσης

Περιοχή πρόσδεσης καταστολέαΠεριοχή πρόσδεσης συμπλόκου CAP_cAMP


Θετική ρύθμιση του οπερονίου της λακτόζης από έναν ενεργοποιητή

Περιοχή πρόσδεσης RNAπολυμεράσης

Περιοχή πρόσδεσης CAP


Ρυθμιστικές περιοχές του lacοπερονίου

α υπομονάδα


Pύθμιση του οπερονίου trp με εξασθένισηΕξασθενιστής

Υψηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

Υψηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

χαμηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

τρυπτοφάνη

Καταστολέας Ενεργοποιημένος καταστολέας

χαμηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

Πλήρες trp mRNA

Εξασθενισμένο RNA


Pύθμιση με εξασθενιστέςΥψηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

Χαμηλά επίπεδα τρυπτοφάνης

νεοσυντιθέμενη πολυπεπτιδική αλυσίδα

νεοσυντιθέμενηπολυπεπτιδικήαλυσίδα

Η RNA πολυμεράση απομακρύνεται από το υπόστρωμα (DNA)

Η μεταγραφή συνεχίζεται

Η φουρκέτα που σχηματίζεται από τον υβριδισμό των τμημάτων 3 & 4 σηματοδοτεί τον τερματισμό της μεταγραφής

Το ριβόσωμα καθυστερεί στη θέση 1

Σχηματίζεται εναλλακτική φουρκέτα με υβριδισμό των τμημάτων 2 & 3

Εξασθενιστής


Συστήματα μεταγωγής σήματος δύο συστατικών & μεταγραφική ρύθμιση στα

βακτήριαπεριπλασμικός χώροςΠορίνη

Κυτταρόπλασμα

Εσωτερική (κυττροπλασματική) μεμβράνη

Εξωτερική μεμβράνη

Ρυθμιστής απόκρισης PhoB (ανενεργός)

Αισθητήρια κινάσηPhoR (ανενεργή)

Αισθητήρια κινάσηPhoR (ενεργή)

Ρυθμιστής απόκρισης PhoB (ανενεργός)


Συστήματα μεταγωγής σήματος δύο συστατικών

P P

ΜεταγραφήP P

Ρυθμιστήςαπόκρισης

Ρυθμιστική περιοχή/ Υποκινητής

Γονίδια του οπερονίου

(ή του ρεγουλονίου)

Κυτταρική μεμβράνη

P

ATP

ADPPP

ATP

ADPP

Αισθητήριες Κινάσες


Eνεργοποίηση της μεταγραφής από ρυθμιστές απόκρισης

κλειστό σύμπλοκο με τον υποκινητή

ανοιχτό σύμπλοκο με τον υποκινητή

Ενισχυτής

ανενεργό

ενεργό

σ54 πολυμεράσης

λύγισμα του DNA


Εικόνα 9.2 Μια μεταγραφική μονάδα μεταγράφεται σε ένα ενιαίο RNA.


Εικόνα 9.46 Οι αλληλουχίες DNA που απαιτούνται για τον τερματισμό εντοπίζονται πριν την αλληλουχία τερματισμού. Ίσως είναι αναγκαίος ο σχηματισμός μιας φουρκέτας στο RNA.


Εικόνα 9.47 Οι ενδογενείς αλληλουχίες τερματισμού περιλαμβάνουν παλινδρομικές περιοχές οι οποίες σχηματίζουν φουρκέτες (δομές στελέχους-βρόχου) με ποικίλο μήκος, από 7-20 bp. Η δομή στελέχους-βρόχου περιλαμβάνει μια περιοχή πλούσια σε G-C και ακολουθείται από μια σειρά καταλοίπων U.


Εικόνα 9.48 Ένας Rho-εξαρτώμενος τερματιστής έχει αλληλουχία πλούσια σε C και

φτωχή σε G, και εντοπίζεται πριν από την ακριβή θέση (ή θέσεις) τερματισμού. Η

αλληλουχία παρουσιάζεται με τη μορφή του RNA. Αντιπροσωπεύει το 3΄ άκρο του

RNA.


Εικόνα 9.49 Ο παράγοντας Rho «καταδιώκει» την RNA πολυμεράση κατά μήκος του RNA και μπορεί να προκαλέσει τερματισμό όταν προλάβει το στάσιμο ένζυμο σε μια Rho-εξαρτώμενη αλληλουχία τερματισμού.


Εικόνα 9.50 Η δράση του παράγοντα Rho μπορεί να συνδέσει τη μεταγραφή με τη μετάφραση όταν η Rho-εξαρτώμενη αλληλουχία τερματισμού βρίσκεται λίγο μετά από μια ανερμηνεύσιμη μετάλλαξη.


Εικόνα 9.51 Ο αντιτερματισμός μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον έλεγχο της μεταγραφής, καθορίζοντας το αν η RNAπολυμεράση θα τερματίσει τη σύνθεση του RNA ή αν θα πραγματοποιήσει αναγνωστική διέλευση προχωρώντας προς την περιοχή που ακολουθεί.


Εικόνα 9.52 Μια πρωτεΐνη αντιτερματισμού μπορεί να επιδράσει στην RNA πολυμεράση επιτρέποντας την αναγνωστική διέλευσή της από μια ειδική αλληλουχία τερματισμού.


Εικόνα 9.53 Η RNA πολυμεράση του ξενιστή μεταγράφει τα γονίδια του φάγουλ και τερματίζει τη μεταγραφή στις θέσεις t. Η πρωτεΐνη pN επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση της RNAπολυμεράσης από τις αλληλουχίες τερματισμού tL και tR. Η πρωτεΐνη pQεπιτρέπει την αναγνωστική διέλευση της RNA πολυμεράσης από την αλληλουχία τερματισμού tR. Τα σημεία στα οποία δρα η pN (nut) και η pQ (qut) εντοπίζονται αντίστοιχα σε διαφορετικές σχετικές θέσεις στις μεταγραφικές μονάδες.


Εικόνα 9.54 Βοηθητικοί παράγοντες προσδένονται στην RNA πολυμεράση καθώς διέρχεται από τη θέση nut. Αυτοί εμποδίζουν τον Rho να προκαλέσει τερματισμό, όταν η πολυμεράση φτάσει στην αλληλουχία τερματισμού.


Εικόνα 9.55 Βοηθητικοί παράγοντες προσδένονται στην RNA πολυμεράση καθώς διέρχεται από συγκεκριμένες θέσεις. Η θέση nut αποτελείται από δύο αλληλουχίες. Ο παράγοντας NusB-S10 ενώνεται με το κεντρικό ένζυμο καθώς αυτό διέρχεται από το boxA. Στη συνέχεια, προσδένονται οι πρωτεΐνες NusA και pN καθώς η πολυμεράση διέρχεται από το boxB. Η παρουσία της pN επιτρέπει την αναγνωστική διέλευση του ενζύμου από την αλληλουχία τερματισμού. Έτσι, παράγεται ένα ενιαίο mRNA που περιέχει αμέσως πρώιμες αλληλουχίες ενωμένες με καθυστερημένες πρώιμες αλληλουχίες.


Tερματισμός της μεταγραφής & αντιτερματισμός

Βακτηριακή RNA πολυμεράση

Αντιτερματισμός


Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας

Documents

EIΣAΓΩΓH ΣTHN METAΓPAΦHusers.auth.gr/pchristo/teaching/Διάλεξεις 4-6... · 2018. 11. 12. · tοβασικό δόγμα της μοριακής βιολογίας