Einleitung

Der Nanodetektor basiert auf einem 16 cm langen Edelstahldraht (Durchmesser

0,5 mm), welcher an einem Ende über einen 2,5 cm langen Bereich mit Gold

und einem Hydrogel beschichtet wurde. Diese Oberfläche ermöglicht eine

kovalente Bindung von Antikörpern, die gegen das humane Oberflächenantigen

EpCAM (Epithelial Cell Adhesions Molecule) gerichtet sind. Die prospektive

Pilotstudie wurde zur Überprüfung der Funktionalität des medizinischen Drahtes

(FSMW) in vitro durchgeführt (Abb.1).

Prospektive  Pilotstudie zur Prüfung eines Antikörper-beschichteten Nanodetektors für die Isolierung von zirkulierenden Tumorzellen (CTC) aus dem Blut von

Nierenzellkarzinom-Patienten

Gerit Theil1, M. Raschid Hoda1, Kersten Fischer1, Klaus Lücke2, Paolo Fornara1 1 Klinik und Poliklinik für Urologie und Nierentransplantationszentrum, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg,

2 Gilupi Inc., Potsdam

Abb. 1: Aufbau des Antikörper-beschichteten Nanodetektors

a) b)

c) d)

e)

Abb. 5: Färbung: Overlay von anti-pan-CK-FITC-, anti-CD45-APC-, Hoechst-Kernfärbung. Beispiel für CTC aus RCC-Patientenblut am FSMW. a) RCC-Patient 7, b) RCC-Patient 1

Methode

Im ersten Teil der Studie wurde die EpCAM-Expression an Primärkulturen

von Nierenzellkarzinomen (RCC) unterschiedlicher Tumorentität und

unterschiedlichen Malignitätsgrades immunzytometrisch untersucht (Abb. 2

und 3). Die folgenden Spiking-Experimente dienten der Evaluierung des

FSMW. Dazu wurden 15 mL EDTA-Blut von gesunden Probanden mit

Primärkulturzellen von Nierenzellkarzinomen angereichert (12 - 660 RCC-

Zellen/mL) und der Nanodetektor im hämodynamischen Modell

(Fließgeschwindigkeit 2,65 cm/s, 30 min) angewendet (Abb. 4, Tab. 1).

Abschließend wurde Blut von 13 RCC-Patienten mit gesicherter Diagnose

in unterschiedlichen Tumorstadien eingesetzt. Das Blut von 2 gesunden

Probanden und eines Patienten mit benigner Nierenerkrankung diente als

Kontrolle (Abb. 5, Tab. 2). Die Charakterisierung der isolierten RCC-Zellen

bzw. der CTC erfolgte mit anti-pan-CK-FITC und die Kernlokalisation mit

Hoechst 33258. EpCAM-positive Leukozyten wurden mit der CD45-APC-

Kontrollfärbung identifiziert.

Ergebnisse – EpCAM-Expression der Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen - immunzytochemische Untersuchung

Primärkulturzellen von RCC-n(n = Nummer der Zelllinie)

Zellzahl/mL Blut

Anzahl pan-CK positiver Zellen am FSMW

RCC-45 (hellzellig pT3b) 660 832

RCC-149 (sarkomatoid) 660 0

RCC-53 (hellzellig pT1a) 30 186

RCC-53 (hellzellig pT1a) 15 82

RCC-84 (hellzellig pT1b) 12 2

RCC-63 (hellzellig pT1b) 12 6

RCC-182 (hellzellig pT1b) 12 2

Abb. 2: PFA-fixierte Primärkultur; immunzytochemischer Nachweis von EpCAM mit anti-EpCAM-FITC und Kernlokalisation durch Hoechst 33258 a) hellzellige RCC-45-Zellen (pT3b, G2) , b) hellzellige RCC-28 (pT1a, G1)

b)a)

Tab. 2: Zusammenfassung- FSMW ex-vivo CTC-Isolierung

Abb. 4: a) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen (hellzellig, pT3b, G2), Färbung mit pan CK-FITC und anti-CD45-APC und Kernlokalisation durch Hoechst 33258 b) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen (Rasterelektronenmikroskopie)

Abb. 3: EpCAM-Expression der Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen

Ergebnisse – Spiking-Experimente (hämodynamischen Modell)

a)b)

Tab. 1: Zusammenfassung- Spiking-Experimente

Ergebnisse – Ex-vivo-Isolierung von CTC aus Patientenblut (hämodynamisches Modell)

Histologie Tumorentität CTC Histologie Tumorentität CTC Histologie CTC

lokal begrenzte Nierentumore metastasierte Nierentumore Kontrollgruppe

pT1aG1 hellzellig 2 pT1aG1 papillär 0 Benigne Erkr. 1

pT1aG2 hellzellig 0 pT1G2 hellzellig 5 Gesund 1

pT1aG3 papillär 10 pT3aG3 hellzellig 2 Gesund 0

pT1bG1 papillär 5   hellzellig 3

pT1bG2 papillär 0 pT3aG2 hellzellig 3

pT3aG2 hellzellig 3

pT3bG2-3 hellzellig 7

pT3aG2 chromophil 8

a)b)

SchlussfolgerungDie untersuchten Tumorentitäten weisen eine unterschiedlich starke EpCAM-

Expression auf, die beim hellzelligen Nierenzellkarzinom tendenziell höher ist.

Es konnte gezeigt werden, daß eine ex-vivo CTC-Isolierung beim RCC mit

Hilfe des FSMW möglich ist. Weiterführende Untersuchungen an

Tumorgewebeproben und Patientenblut sollen die erhoben Befund

untermauern.

0

5

10

15

20

25

30

35

hellzellig papillär sarkomatoid

Nierentumorentität

Ep

CA

M-E

xpre

ssio

n [%

]