Electroforesis Capilar

Electroforesis Capilar

ElectroforesisDefinición:Técnica de separación de moléculas iónicas, de acuerdo a su tamaño y carga, en un campo eléctrico.

Electroforesis

Fuerza eléctrica Eq = fv

E = campo eléctricoq = partícula cargadaf = coeficiente de fricciónv = velocidad

Movilidad

u = v/E

u = movilidad

q+ -v

Campo eléctrico E

Tamaño y forma de la partícula

Electroforesis

ElectroforesisParámetros que influyen en la movilidad

electroforética

• Campo eléctrico• Temperatura• Viscosidad• Fuerza iónica• pH• Carga del soluto• Forma y tamaño del los iones

Electroforesis

Instrumentación básicaFase estacionaria:

Solutos no iónicos (sacarosa, glicerol)

Soporte semisólido (papel, acetato de celulosa, almidón, poliacrilamida, agarosa)

“Fase móvil”: Fuente de poder que suministre voltajes de 20 V/cm - 200 V/cm

Electroforesis

Instrumentación básica

Electroforesis

Aplicaciones

Método de separación de:ProteínasÁcidos nucleicosBiomoléculas (insulina, lipoproteínas,

enzimas)

Permite determinar:Peso molecular de proteínasPunto isoelécticoDistinguir moléculas por su carga neta


Desventajas de la electroforesis convencional

Generación de calor debido al voltaje aplicado limitando la resolución

Tiempos de análisis largos

Análisis cuantitativo impreciso

Difícil de automatizar

Voltaje limitado 20 – 200 v/cm


Antecedentes Históricos

(1967) Hjerten usa capilares milimétricos para separar iones cargados eléctricamente, favoreciendo así la disipación del calor generado

(1979) Virtamen y Makkers: desarrollan separaciones electroforéticas en capilares de 200 μm

(1980) Jorgenson y Lukacs generan capilares de silica fundida con diámetros 75 μm. Surge la EC la cual opera a voltajes de 400 – 500 v/cm en cámaras refrigeradas con aire.


Ventajas frente HPLC

Tamaño de muestra: 1 – 10 nL

Tiempos de análisis cortos, 10 – 40 min

N = 100 000 – 200 000

Mínimo ensanchamiento de picos

Consumo de reactivos reducido


Característica HPLC Electroforesisconvencional

EC

Volumen de la celda

2 – 10 μL N/A 2- 10nL

Volumen de la muestra

2 – 50 μL 1 – 150 μL 500 fL - 200 μL

Automatización

Completa Baja Completa

Sensibilidad ng- μg/mil(UV/Vis)

fg – ng/mL(UV/Vis)

μg (azul de Coomassie)

Rendimiento Alto Alto Bajo


Definición:Nanotécnica de separación de moléculas cargadas, en el seno de una solución amortiguadora contenida dentro de un capilar.


Fundamento:La técnica se basa en la migración diferencial de las partículas cargadas, en sentido y velocidad en un campo eléctrico


Velocidad de migración

v = μe · E V = velocidad lineal del ión

μe = velocidad electroforética de un ión

E = campo eléctrico aplicado (V/cm)

Conceptos básicos


Velocidad electroforética

μe= qE/6πηr

q= carga de un iónr = radio de un iónE = campo eléctrico aplicado (V/cm)η = viscosidad de la disolución

Conceptos básicos


Velocidad electroosmótica

μeo= movilidad electroosmótica

Conceptos básicos


Veo = μeo E

3 4 5 6 7 8

V eo

pH

Velocidad electroosmótica

SiO- Doble capa eléctrica

Zona difusa


V eo= μeo E

Velocidad electroosmótico

Dependerá de:

pH, a pH altos el flujo será mayor que a pH ácidos

Fuerza iónica, a mayor fuerza iónica se reduce el flujo electroosmótico

V = μeo E


Velocidad total del iónVtotal = (μe + μeo )E= Ve + Veo

V electroosmótica

++

+

-

- -

V electroforética

V Total = ve + veo

++

+

-

- -


V Total = veo - ve

Electroferograma: Grafico resultante de una electroforesis capilar

Seña

l

Tiempo++ + - - -


Tiempo de migración

t = L2/μtotal

L = Longitud de la columna

μtotal = μe + μeo


Eficiencia de la Electroforesis Capilar

N = μtotal V/2D

D = coeficiente de difusión del soluto en cm2 s-1

V = voltaje aplicado

> potencial aplicado mayor es N 0 20 3010

1

2

3

KVN

(x10

-5)


Resolución

R = 2(t2-t1)/W1 +W2


Electroferograma

Representación gráfica de las especias separadas por electroforesis capilar.


Instrumentación básica

Capilar de silicie


Capilar

Silice fundida recubierto dePoliimida

Longitud: 20 – 100 cm

Diámetro interno: 20 – 200 μm


Soluciones llenado del capilar

Buffer de FosfatosBuffer de BoratosSolución de Cromato


Sistema de detecciónDetector Limite detección

UV/Vis 10-5 – 10-6 moles

Fluorescencia 10-7 – 10-9

Amperométrico 10-10 – 10-11

Conductividad 10-7 – 10-8

Espectrometría de masas 10-8 – 10-9


Tratamiento preliminar de la muestra

Las muestras deben ser previamente centrifugadas y/o filtradas en filtros de 0.22 - 45 μm


Métodos hidrodinámicos de inyección

Muestra

Presión

Muestra

Vacío

Muestra

Efecto sifón


Método electrocinético de inyección

Muestra

1/3 – 1/5 Voltaje de separación


Modos de separación

Electroforesis Capilar de Zona (CZE)

Electroforesis Capilar de Gel (CGE)

Isoelectroenfoque Capilar (CIEF)

Isotacoforesis Capilar (CITP)



El capilar esta lleno con una solución buffer

La separación de los iones esta influenciada por el flujo electroosmótico

Uso de aditivos o modificadores de flujo electroosmótico: detergentes catiónicos



Buffer Buffer Buffer Buffer

1 2 3

Cátodo Ánodo


Aplicaciones CZE

Separación de iones


Aplicaciones CZE

Antiinflamatorios


Aplicaciones CZE

Proteínas



Electroforesis Capilar en Gel (CGE)

Capilares rellenos con un gel Gel covalentemente unido a la silica(Poliacrilamida, agarosa, polietilenglicol)Gel libre en el capilar

Separación esta basada en el tamaño

Separación de grandes moléculas como fragmentos de ADN, oligonucleótidos, proteínas


Electroforesis Capilar en Gel (CGE)

++ ++ +

( - )

Migración

( + )

Gel


Isoelectroenfoque (CIEF)

Separación de aminoácidos anfóteros

La matriz presenta un gradiente de pH

Determinación de punto isoeléctrico de proteínas

Orden de migración. 1º proteínas más alcalinas seguidas de las ácidas

Isoelectroenfoque (CIEF)

OH- H+

p1 p2 p3

Cátodo Ánodo

Gradiente de pH


Puntos isoléctricos de proteínas


Proteína pH Isoeléctrico Proteína pH Isoeléctrico

Pepsina 1.1 Hemoglobina 6.8

Caseina 4.6 Mioglobina 7.0

Albumina de huevo

4.78 Ribonucleasa 9.5

Ureasa 5.0 Citrocromo c 10.65

Insulina 5.3 Lisozima 11.0

Isoelectroenfoque de proteínas



Skoog 5ª Ed .Principios de análisis instrumental QD79 15 S5.68

Galen W. Ewing Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25QH 345 C.527Rubinson and Rubinson.Química Analítica Contemporánea. Cap. 14.

Isotacoforesis Capliar (CITP)

Separación independiente de iones o cationes

Utiliza un buffer discontinúo

La muestra se aplica entre dos buffer


Isotacoforesis Capilar (CITP)

Buffer baja movilidad

Buffer elevada movilidad

1 2 3

CátodoÁnodo


Aplicaciones

Análisis inorgánicosÁcidos orgánicosAminoácidos, péptidos y proteínasÁcidos nucleicos y oligonucleotidosCarbohidratos y oligosacáridosClínicaFarmacología


Electroforesis CapilarPrincipios de análisis instrumental Skoog 5ª Ed QD79 15 S5.68

Analytical Instrumental Hadbook. Cap. 25Galen W. EwingQH 345 C.527

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