ELISA: FUNDAMENTOS TIPOS Y APLICACIONES

GUSTAVO PANANA ACUÑADIRECTOR TÉCNICO

CENTRO DE DIAGNOSTICO CANTELLA

POR QUE ELISA?

ELISA CONCEPTOS Y FORMATOS DE ENSAYO

• El ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunológica como enzimática.

• Al estar uno de los componentes (antígeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y, por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un colorímetro.

ELISA HOMOGÉNEO ELISA HETEROGÉNEO

ELISA DIRECTO ELISA DE CAPTURA

ELISA COMPETITIVO ELISA NO COMPETITIVO

METODOLOGÍA DE ELISA

Diferentes ELISA Detección de anticuerpos específicos:

ELISA indirecto ELISA doble sandwich

Detección de antígenos: ELISA directo competitivo ELISA sandwich

Tapizado del pocillo con el antígeno o anticuerpo

Adición de la muestra problema con la mezcla de antígenos o anticuerpos.

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Unión del antígeno o anticuerpo específico al anticuerpo o antígeno tapizado en el pocillo

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antígeno o anticuerpo no unido

Adición del anticuerpo secundario marcado con la enzima

Unión del anticuerpo secundario al antígeno o anticuerpo

PASOS GENERALES DE UN ELISA

Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida

Adición del substrato Unión del substrato a la enzima

Desarrollo del color

QUE DETECTA?

Detección de Proteínas o un organismo

Detección de una Molécula pequeña

ELEMENTOS DE UN ELISA

Pocillos Microplacas de poliestireno Volumen de 350 uL Área interna de 2.5 cm2

Formato de 96 pocillos

Adsorción de Antígenos o Anticuerpos Dilución del antígeno o anticuerpo

en buffer carbonato (pH 9.6) e incubación 3h 37°C

Tratamiento a 40-50°C con PBS hasta desecación

ELEMENTOS DE UN ELISA

Solución de Lavado Cloruro de Sodio Tween 20 Agua Destilada PBS

Conjugados ß-galactosidasa Fosfatasa Alcalina Peroxidasa

SENSIBILIDAD

Depende exclusivamente del valor K (constante de equilibrio entre la interacción antígeno-anticuerpo)

Con K = 1012M-1 y 1% CV, la detección más baja posible es de 10-14 M

Como Incrementamos la sensibilidad? Reducir ruido de fondo, optimizando la union antígeno al pocillo

y sesiones de lavado La baja calidad de los pocillos suele dar señales bajas o bajo

nivel de unión con el antígeno Incorporando técnicas indirectas de marcado Aumentando los tiempos de incubación hasta el punto de

equilibrio de la reacción.

TÉCNICA: MEIA

APLICACIONES

Enfermedades producidas por parásitos Babesias y tripanosomas Toxocara canis Toxoplasmosis Triquinosis Enfermedades producidas por

Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias Mycobacterium tuberculosis Brucelas Enterotoxinas Vibrio cholerae Estreptococos Salmonelas Enfermedades producidas por virus Enfermedad de Aujeszky Enfermedad de Newcstle Fiebre aftosa Leucemia felina Peste porcina africana Peste porcina clásica Rinotraqueitis infecciosa Rotavirus Artritis vírica

Hormonas Gonadotropina coriónica Progesterona Testosterona Hormonas tiroideas Cuantificación de inmunoglobulinas IgG IgE IgA Anticuerpos Anti-DNA Factor reumatoide Inmunocomplejos circulantes

EQUIPOS REQUERIDOS

FASES QUE DEBIÓ PASAR EL KIT ANTES DE PODER SER COMERCIALIZADO O EMPLEADO EN EL LABORATORIO

DISEÑO Y OPTIMIZACIÓN DEL ENSAYO

VALIDACIÓN ANALÍTICA

VALIDACIÓN CLÍNICA

En el desarrollo de un nuevo kit estos ensayos incluyen:

Estudios de estabilidad

De las placas, látex etc. sensibilizadas De los conjugados De los sustratos.

Análisis de muestras

En paneles caracterizados En poblaciones al azar Establecer efecto de la matriz e interferencias no específicas.

VALIDACIÓN DE ELISA