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Metodos instrumentales para el analisis de alimentos
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CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIN
Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
Centro Nacional de Alimentacin
Deteccin de Alrgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de
Alimentacin
DetecciDeteccin de Aln de Alrgenos en Alimentos. rgenos en Alimentos. Actuaciones del Centro Nacional de Actuaciones del Centro Nacional de
AlimentaciAlimentacinn
M Isabel Prieto SantosServicio de BiotecnologaMM Isabel Prieto SantosIsabel Prieto SantosServicio de BiotecnologServicio de Biotecnologaa
CENTRO NACIONAL DE ALIMENTACIN
Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
LosalLosalrgenosalimentariossonrgenosalimentariossonproteprotenasoglicoprotenasoglicoprotenasnaspresentesdeformanaturalenpresentesdeformanaturalenlosalimentos,tantodeorigenlosalimentos,tantodeorigenvegetalcomoanimalvegetalcomoanimal
ALALRGENOSALIMENTARIOSRGENOSALIMENTARIOS
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PROTEPROTENAS ALERGNAS ALERGNICAS NICAS
Alimento Protenas Totales Protena Alergnica PM
Cacahuete 29%Arah1Arah2Otras(arah3aarah8)
6364kD17kD
20%(protenasdelsuero)
lactoglobulinaslactoglobulinas
18kD1314kDLeche
80%casena ,,,casenas 1933kD
Huevo 1113%
Ovomucoide(Gald1)Ovoalbumina(Gald2)Ovotransferrina(Gald3)Lisozima
Trigo(Gluten)
1015% ,,GliadinasyGluteninas Nuez
Bere1 93kD
Soja 70%GlicininaConglicininaInhibidordelatripsina
1314kD2225kD
Mostaza Sina1Braj1
15kD16kD
Crustceos Tropomiosina(Pena1,Mete1,SaIySaII)
36kD
Pescado Parvalbmina(Gadc1oalergenoM) 12kD
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A)MA)MtodosInmunoltodosInmunolgicosgicosDeteccindelasprotenasalergnicasmedianteanticuerposespecficos
B)MB)MtodosbasadosenBiologtodosbasadosenBiologaMolecularaMolecularDeteccindesecuenciasdianadeADNmediantePCR
C)MC)MtodostodoscromatogrcromatogrficosficosUtilizadoseninvestigacin
ANANLISISDEALLISISDEALRGENOSENALIMENTOSRGENOSENALIMENTOS
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Mtodosbasadosenladeteccindeunaomsprotenasofragmentosproteicos(alrgeno),mediantelauninespecificaantgenoanticuerpo
A)MA)MTODOSINMUNOLTODOSINMUNOLGICOSGICOS
a)Enzimoinmunoensayo ELISAELISAsandwichELISAcompetitivoELISAdirecto
b)Mtodosrpidos(tirasinmunocromatogrficas)
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SISTEMASDEFLUJOLATERAL(LFD)oTIRASREACTIVASSISTEMASDEFLUJOLATERAL(LFD)oTIRASREACTIVASSISTEMASDEFLUJOLATERAL(LFD)oTIRASREACTIVAS
Sistemascualitativos(puedeserutilizadoscomosemicuantitativosconprecaucin)Utilidadparamuestreoambiental,verificacinzonasdelimpieza,screeningDisponiblesparamuchosalrgenosRpidosSencillosSensibilidaddeclarada(5mg/kg (ppm))
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MMtodoELISAtodoELISASandwichSandwich :Etapas:EtapasExtractodelaExtractodelamuestramuestra
IncubacinAnticuerpoAnticuerpoconjugadoconjugado
lavado
SustratoSustrato
FrenadoFrenado
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TEPNEL BIOKITS
SISTEMASELISASISTEMASELISASISTEMASELISA
AgraQuantMtodosdirectos:DETECTANLASPROTEDETECTANLASPROTENASNAS
ALERGALERGNICASNICAS
Cuantitativos Rpidos Norequiereequiposdemasiadocomplejos(lectordeplacas)
ALTA SENSIBILIDADALTA SENSIBILIDAD: La mayora de los ELISA declaran unasensibilidad suficiente para detectar concentraciones relativamentepequeasdealrgenos(adecuadosparaprotegeralconsumidor)
(Lmitededeteccin:entre0,5mg/kg (ppm)a5mg/kg (ppm))
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LimitacionesanalLimitacionesanalticasenelcontroldealticasenelcontroldealrgenos:rgenos:
A) Extraccindeprotenasalergnicas
B) DiferenciasenlosdistintossistemasELISA
C) NodisponibilidaddeMRcertificados
A)A) ExtracciExtraccindeprotendeprotenasalergnasalergnicasnicas
B)B) DiferenciasenlosdistintossistemasELISADiferenciasenlosdistintossistemasELISA
C)C) NodisponibilidaddeMRcertificadosNodisponibilidaddeMRcertificados
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A)Dificultaddelaextraccindeprotenasalergnicasenlosalimentos
A)A) DificultaddelaextracciDificultaddelaextraccindeprotendeprotenasalergnasalergnicasnicasenlosalimentosenlosalimentos
a) Influenciadelprocesadoenlaspropiedadesdelasprotenasalergnicas
b)ComplejidaddelamatrizquecontieneelalrgenoPolifenolesytaninosGrasaspH
c)Distribucinenelalimento
a) Influenciadelprocesadoenlaspropiedadesdelasprotenasalergnicas
b)ComplejidaddelamatrizquecontieneelalrgenoPolifenolesytaninosGrasaspH
c)Distribucinenelalimento
Lafacilidady/odificultaddelaextraccindepende:
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Desarrollodeadecuadosprocedimientosdeextraccin
9Kits comerciales suministran sus propios tampones de extraccin9Procesos rpidos y fciles de realizar
Composicin desconocida (PBS, Tris/ClNa,....)Similares para todos los alrgenos
Necesidad de aditivos especiales: gelatina de pescado leche en polvo sustancias reductoras ( -mercaptoetanol) urea 6 mol/litro agentes surfactantes (1% Tween 20 0,4% Triton X-100,
4% SDS)Jornada sobre Alergias Alimentarias. Madrid, 21 de noviembre de 2012
RETORETO
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ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)ESTUDIOS SOBRE EL EFECTO MATRIZ ( CNA)
Efectodelamatrizenalimentosricosentaninosypolifenoles
Cacao,chocolateyderivados Caf yT Frutasricasentaninos: Uvas,platano,manzana,pera Frutossecosconpiel:
castaa..
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Efectodematrizricaentaninos(muestrasconaltocontenidoeEfectodematrizricaentaninos(muestrasconaltocontenidoenchocolate)nchocolate)enladeteccienladeteccindeglutenenalimentos.ndeglutenenalimentos.
OBJETIVOOBJETIVO:MejorarelrendimientodelaextracciMejorarelrendimientodelaextraccinn
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Valoresperado20Valoresperado20mgmg//kgkgdeglutendegluten
MuestraextraMuestraextradacondaconsolucisolucinncocktailcocktailRecuperaciRecuperacin80%
m
g
/
k
g
d
e
G
l
u
t
e
n
Datos:ProcedentesdelosEstudiosdeValidaciDatos:ProcedentesdelosEstudiosdeValidacindelprocedimientodendelprocedimientodeDeterminaciDeterminacindeglutenndeglutenenalimentosenalimentos realizadosenelCNArealizadosenelCNA
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LainfluenciadelospolifenolesenladetecciLainfluenciadelospolifenolesenladeteccindeglutenenalimentosinfantilesndeglutenenalimentosinfantileshidrolizadosabasedefruta.Efectosdelamatrizenlaextrachidrolizadosabasedefruta.Efectosdelamatrizenlaextraccicindelasprotendelasprotenasdelnasdelglutengluten
OBJETIVOOBJETIVO:ComprobarelefectoinhibidordelospolifenolespresentesenalComprobarelefectoinhibidordelospolifenolespresentesenalimentosconimentosconaltocontenidoenfrutaenlaextraccialtocontenidoenfrutaenlaextraccindegluten.ndegluten.
PROCEDIMIENTO:PROCEDIMIENTO:ComprobaciComprobacindelRendimientodeextraccindelRendimientodeextraccindediferentestiposdendediferentestiposdesolucionesenalimentosinfantilesricosenfruta(papillasinfasolucionesenalimentosinfantilesricosenfruta(papillasinfantilesdefrutas):ntilesdefrutas):
1.1. SoluciSolucinnCocktailCocktail conEtanolal80%conEtanolal80%2.2. SoluciSolucindendeGuanidinaGuanidina //mercaptoetanolmercaptoetanol //IsopropanolIsopropanol3.3. SoluciSolucin1conGelatinadepescadon1conGelatinadepescado4.4. SoluciSolucin1conlechedesnatadan1conlechedesnatada
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RESULTADOSRESULTADOS:
1.1. SoluciSolucinnCocktailCocktail conEtanolal80%conEtanolal80% 2.2. SoluciSolucindendeGuanidinaGuanidina //mercaptoetanolmercaptoetanol //IsopropanolIsopropanol3.3. SoluciSolucin1conGelatinadepescadon1conGelatinadepescado 4.4. SoluciSolucin1conlechedesnatadan1conlechedesnatada
Muestrasadicionadascon40Muestrasadicionadascon40mgmg//kgkg deGlutendeGluten
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Detectandiferentesprotenas(Diferentesistemasantgenoanticuerpo)
Utilizandiferentescalibrantes
Diferentesunidadesdeexpresinderesultados
B)DiferenciaderesultadosentredistintossistemasELISAB)DiferenciaderesultadosentredistintossistemasELISA
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ESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DEESTUDIOS SOBRE EL COMPORTAMIENTO DELOS DISTINTOS SISTEMASLOS DISTINTOS SISTEMAS
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ESPECIFICACIONESDELOSKITSDEDETECCIESPECIFICACIONESDELOSKITSDEDETECCINDEPROTENDEPROTENASDEHUEVONASDEHUEVO
SISTEMAELISA ESPECIFICIDADUNIDADESDE
MEDIDACALIBRANTE
RANGODECUANTIFICACIONmg/kg (ppm)
LMITEDECUANTIFICACIN
LCmg/kg (ppm)
AAnticuerpopoliclonalOvomucoide(Gald1)
Protenablancadehuevo(EWP)
NISTSRM8445(Huevosecoenteroenpolvo)
0,5 10 0,5
B HuevoenteroenpolvoProtenatotaldehuevo 2,5 25 2,5
CAnticuerposOvomucoide(Gald1)
Huevoenteroenpolvo
1 10 1
DOvoalbminayovomucoide(Gald 1yGald 2)
Huevoenteroenpolvo
NISTSRM8445(Huevosecoenteroenpolvo)
0,5 13,5 0,5
DIFERENTES
PROTEIN
AS
DIFERENTES
PROTEIN
AS
DIFERENTES
UNIDA
DESD
EMEDIDA
DIFERENTES
UNIDA
DESD
EMEDIDA
DIFERENTECALIB
RANTE
DIFERENTECALIB
RANTE
DIFEREN
TELC
DIFEREN
TELC
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PreparacindemuestrascargadasconNISTSRM8445(HuevoenteroenPolvo,Valordereferencia48% 1%ProtenatotaldeHuevo)
1 2 3 4MUESTRAS
ValorEsperado
mg/kg (ppm)protenablancade
huevo
mg/kg (ppm)Huevoenteroen
polvo
mg/kg (ppm)Huevoenteroen
polvo
mg/kg (ppm)Huevoenteroen
polvo
Galleta3mg/kg huevoenteroenpolvo 1,1 5,6 3,15 4
Pasta6mg/kg huevoenteroenpolvo 2,6 8,2 5,58 8
Bollo3mg/kg huevoenteroenpolvo 1,21 6,8 3,05 3
Helado1,5mg/kg huevoenteroenpolvo 0,53 3,4 1,72 1,6
Vino1,5mg/kg huevoenteroenpolvo 1,35 2,4 1,7 1,6
EstudioComparativokitsELISAdeterminaciEstudioComparativokitsELISAdeterminacindeprotendeprotenasdehuevonasdehuevo
ResultadosconmuestrasdevalorconocidoResultadosconmuestrasdevalorconocido
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Valoresperadoenmg/kg dehuevoenteroenpolvo 1 2 3 4
Resultadoexpresadoenmg/kg dehuevoenteroenpolvo
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EstudioComparativokitsELISAdeterminaciEstudioComparativokitsELISAdeterminacindeAvellanandeAvellana
SistemaELISASistemaELISA ExpresiExpresinderesultadonderesultadoLimitedeLimitede
cuantificacicuantificacinn
1 Protenadeavellana 0,5mg/kg
2 Avellana 1mg/kg
3 Avellana 2,5mg/kg
4 Avellana 2,5mg/kg
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NdeMuestras DETECTADO NODETECTADO
Puedecontenertrazasdeavellana.Rastrosdeavellana.Trazasdefrutossecos..Frutosdecascara.NoFiguraAvellanaentresusingredientesNocontieneFrutossecosContieneavellanasConunx%deavellanaPastadeavellana
ETIQUETADOPRESENCIADEAVELLANA
10 2 8
10 9 1
10 6 4
D
U
D
O
S
A
S
D
U
D
O
S
A
S
N
E
G
A
T
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V
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A
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I
V
A
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I
T
I
V
A
S
RESULTADOSINICIALESCONUNRESULTADOSINICIALESCONUNNICOKITNICOKIT
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DISTINTOSSISTEMASELISA
1 2 3 4
LC0,5mg/kg(ppm)deProtenade
avellana
LC1mg/kg (ppm)deAvellana
LC2,5mg/kg (ppm)deAvellana
LC2,5mg/kg (ppm)deAvellana
MUESTRASPOSITIVAS/NOETIQUETADAS
GalletaconchocolateNofiguraavellanaentresusingredientes >5mg/kg 35mg/kg 15,5mg/kg >20mg/kg
Galletamultivitaminada
Nofiguraavellanaentresusingredientes 0,7mg/kg 2,9mg/kg 4,9mg/kg 8,3mg/kg
MUESTRASPOSITIVAS/ETIQUETADAS
Pastel Avellana2% NODETECTADO NODETECTADO 3,6mg/kg NODETECTADO
MUESTRASETIQUETADODUDOSO
Chocolate Rastrosdeavellana NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO
BarquilloPuedecontenertrazasdenueces,almendrasysoja
NODETECTADO DETECTADO NODETECTADO NODETECTADO
Turrn Trazasdefrutossecos NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO
ChocolateRastrosdecacahuete,avellana yalmendra
NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO NODETECTADO
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RecuperaciRecuperacinconmuestrasfortificadascon5nconmuestrasfortificadascon5mgmg//kgkg deavellanadeavellana
Preparacindemuestrasfortificadas,mediantemezcladevariedadesdeavellana
PreparaciPreparacindemuestrasndemuestrasfortificadas,mediantefortificadas,mediantemezcladevariedadesmezcladevariedadesdeavellanadeavellana
C)NoDisponibilidaddeMaterialesdeReferenciaC)NoDisponibilidaddeMaterialesdeReferencia
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DeteccinmediantePCRdesecuenciasdeADN: especificasdelalimentoalergnico secuenciasdeADNquecodificanlaprotenaalergnica
Desarrollodekitscomerciales(Lmitedesensibilidaddeclaradomenosde2,5ppm dealimentoalergnico)
B)MB)MTODOSBIOLOGTODOSBIOLOGAMOLECULARAMOLECULAR ReacciReaccindelandelaPolimerasaenCadenaPolimerasaenCadena PCRPCR
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VENTAJASVENTAJAS
9 Gransensibilidad9 Granespecificidad9 Fcildeusar9 Mayorestabilidad
9 CumpleconelReglamento(UE)1169/20119tilsinoexisteELISA9Verificarresultadoscuestionables(ej:protenashidrolizadas)9Buenocomomtodoconfirmativo
INCONVENIENTESINCONVENIENTES
NodetectanlaproteNodetectanlaprotenanaalergalergnicanica NorelaciNorelacinconstantenconstanteentrepresenciadeentrepresenciadeADNyProteADNyProtenana CualitativooCualitativoosemicuantitativosemicuantitativo(nosepuedecomparar(nosepuedecompararunidadesdemedida)unidadesdemedida)
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AlcanceactualdeacreditacindelCNAbajolaNormaUNEENISO17025,enelcampodealrgenos
Gluten,en2009Cacahuete,en2010Protenaslcteas,en2010
lactoglobulinaCasena
Protenasdehuevo,en2012 AmpliacindealcancedeAcreditacin(PrximaauditoriadeENAC,2013)
Deteccindeavellana
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Muchas Gracias Muchas Gracias
DirectoradelCNADirectoradelCNAMM [email protected]@msssi.esServiciodeBiotecnologServiciodeBiotecnologaaMM [email protected]@msssi.es