Versuch 2

ELLMANN: Bestimmung der Gesamtzahl an Mercaptogruppen der Alkoholdehydrogenase im Ellman-Assay

Praktikant: Praktikumnummer: Praktikant: Praktikumnummer:

I. Einleitung Dehydrogenasen sind Enzyme die Redoxreaktionen katalysieren, wobei sie molekularen Wasserstoff unter Verwendung von Coenzymen als Donatoren, bzw. Akzeptoren übertragen. Die Enzyme dieser Klasse weisen eine Stereoselektivität auf, was bedeutet, dass sie vom Substrat mit Präferenz eines der chemisch gleichen, aber durch ebendiese Präferenz nicht äquivalenten Wasserstoffe abspalten. In der pro-S und pro-R Konvention bezeichnet man das Wasserstoffatom, würde es eine künstlich höhere Priorität als sein Gegenstück erhalten und dadurch das Molekül zu einen „rechtsdrehenden“ Enantiomer machen, als HR und dementsprechend das andere Wasserstoffatom als HS:

||

Würde man HA ersetzen, sodass die höhere Priorität erkennbar ist, ergäbe sich ein S-Enantiomer:

Im Gegenfall, dass HB die höhere Priorität erhält, ergäbe sich das R-Enantiomer.

Deshalb bezeichnet man die beiden Wasserstoffe entweder als pro-R oder pro-S. Eine wichtige Rolle im Zusammenhang dieser Stereoselektivität scheint auch das Akzeptor-Substrat zu spielen - Dehydrogenasen, die Aldehyd-, bzw. Carbonylgruppen zu Alkoholen reduzieren, bevorzugen das HR des Donators. Dehydrogenasen, die Carboxylgruppen und deren Derivate zu (Thio-)Halbacetalen/ Aldehydhydraten reduzieren, bevorzugen das HS des Donators.

Prochiral, noch keine Händigkeit.

Ein bekanntes Beispiel ist die Alkoholdehydrogenase, die in der alkoholischen Gärung das NAD+ regeneriert, das in der Glykolyse verbraucht wurde. Es überträgt in seiner typisch katalysierten Reaktion das HR-Hydridion vom Nikotinamid-Teil des NADH auf Acetaldehyd:

Das Gleichgewicht der Reaktion liegt unter physiologischen Bedingungen auf Seiten des Ethanols. Die Hefe-ADH ist ein Homotetramer, ein nicht-kovalenter Proteinkomplex aus vier identischen Untereinheiten. Jedes aktive Zentrum einer der Untereinheiten enthält zwei Cystein-Reste, welche essentiell für die enzymatische Aktivität des ADH sind, ihre Thiolat-Seitenketten sind Liganden für ein Zn2+-Ion, das die kovalente Bindung zwischen Carbonyl-Sauerstoff und –Kohlenstoff des Acetaldehyds stärker polarisiert (Kohlenstoff höheres δ+) und damit einen nukleophilen Angriff des zu übertragenden Hydridions begünstigt. Außer diesen beiden essentiellen Cystein-Resten besitzt jede ADH-Untereinheit 6 weitere, für die Enzymaktivität kaum relevante, Cystein-Reste. Analog zum ADH regeneriert in Vertebraten oder der Flugmuskulatur von Insekten das strukturell ähnliche LDH das zuvor reduzierte NADH zu NAD+, die Übertragung des Wasserstoffs geschieht jedoch direkt auf das Pyruvat, es entsteht daraus Lactat. Im aktiven Zentrum des LDH befindet sich auch nur ein essentieller Cysteinrest, der nicht Teil an einer dativen Bindung zu einem Metallion hat. Ziel des Versuchs ist die experimentelle Bestimmung der Anzahl der Cystein-Reste im ADH. Die funktionell wichtigen Thiolgruppen der Cysteinreste lassen sich durch die Zugabe von Ellman’s-Reagenz (DTNB = 5,5'-Dithio-bis-(2,2'-nitrobenzoesäure)) im Überschuss nachweisen, sofern sie frei zugänglich sind. Es bildet sich bei der Reaktion pro Mercaptogruppe ein 2-Nitrothiobenzoat-Anion (NTB), welches bei 412nm photometrisch gemessen werden kann.

Der pH-Wert sollte knapp über 7 liegen, durch Deprotonierung bilden sich Thiolat-Anionen, die die Disulfidbindung trennen. Es entsteht ein gemischtes Disulfid und ein Nitrothiobenzoat-Anion (NTB-), welches bei neutralem bis alkalischem Mileu zum chromophoren NTB2--Dianion ionisiert.

Oft sind die Mercaptogruppen im aktiven Zentrum des Enzyms exponiert und deshalb besonders reaktiv. Diese sind direkt messbar, bei anderen ist es erst nach vollständiger Denaturierung (durch z.B. Harnstoff) möglich. Im Versuch wurde zunächst die Konzentration einer ADH-Lösung photometrisch anhand ihrer UV-Absorption (280nm) bestimmt. Um die Anzahl der Mercaptogruppen im ADH messen und berechnen zu können musste erst eine Eichgerade erstellt werden, indem N-Acetylcystein als Modellsubstrat mit Ellman’s Reagenz umgesetzt wurde. Es entsteht dabei genauso das messbare Nitrothiobenzoat. Im letzten Teil wurde ADH unter Verwendung von Harnstoff denaturiert um die Feststellung der Anzahl an essentiellen und die Gesamtzahl aller der Mercaptogruppen je Enzymeinheit zu ermöglichen.

II. Durchführung

1. Allgemeine Vorarbeiten

1.1 Herstellung von PBS-Stammlösung

Zu Beginn des Versuches benötigte man eine PBS-Stammlösung (4 mM KH2PO4; 16 mM Na2HPO4; 115 mM NaCl). Diese Lösung war auf dem Arbeitsplatz schon vorbereitet.

1.2 Herstellung der ADH-Stammlösung Als nächstes wurde eine ADH-Stammlösung benötigt. Die bereitgestellte Suspension wurde zuerst für 1 min bei 1300 rpm zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Nach dem Zentrifugieren wurde das Präzipitat in einem 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß mit 1,2 ml PBS pipettiert. Anschließend wurde die ADH-Stammlösung auf Eis gestellt.

1.3 Herstellung der 8 M Harnstofflösung

Es wurden ca. 4,8 g Harnstoff in 5 ml PBS gelöst. Danach wurde mit vorsichtigem Auf- und Abschwenken gemischt. Danach wurde das Volumen auf 10 ml mit PBS eingestellt und sterilfiltriert.

1.4 Herstellung einer ADH-Lösung in 6,4 M Harnstoff

Man benötigte eine denaturierte ADH-Lösung. Aus diesem Grund wurden 480 µl der ADH Stammlösung zu 1,920 ml einer 8 M Harnstofflösung in einem 15 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Die Lösung wurde gemischt und für 1,5 h bei 30 °C inkubiert.

1.5 Herstellung einer 1 mM N-Acetylcystein-Lösung (M = 163,2 Da) in PBS

In einem 15 ml Reaktionsgefäß wurde 16,32 mg N-Acetylcystein gegeben und in 10 ml PBS gelöst. Aus dieser Lösung wurde 1 ml in ein neues 15 ml Reaktionsgefäß gegeben und mit 9 ml PBS zu 1:10 verdünnt.

1.6 Herstellung einer 3 mM DTNB-Lösung in PBS

Es wurde 3,6 mg DTNB in ein 15 ml Reaktionsgefäß eingewogen. Danach fügte man 3 ml PBS hinzu. Dadurch löste sich das DTNB.

2. Konzentrationsbestimmung der ADH-Lösung

Für diesen Versuch benötigte man 100 µl der Enzymlösung, welche man in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß im Verhältnis 1:10 mit PBS pipettierte. Die Lösung wurde in eine Quarzküvette gegeben und ihre Extinktion wurde bei 280 nm am UV-Photometer gemessen.

3. Erstellung einer Ausgleichsgeraden für den Ellman-Assay mit N-Acetylcystein

Um eine Ausgleichsgerade zu erstellen, wurden unterschiedliche Konzentrationen des N-Acetylcysteins (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 µM) mit einer konstanten Konzentration von Ellman-Reagenz im Überschuss umgesetzt. Als erstes wurde eine Verdünnungsreihe von N-Acetylcystein erstellt. Danach folgte eine statistische Mittelwert-Bestimmung. Hierfür wurde jeder Reaktionsansatz dreimal in je einem 1,5 ml Reaktionsgefäß umgesetzt und bei 30 °C für 30 min inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Lösungen in Plastikküvetten überführt. Ihre Extinktion wurde dabei bei 412 nm gemessen. Die Ergebnisse wurden notiert.

4. Bestimmung der Anzahl frei zugänglicher Mercaptogruppen je Enzym-Untereinheit

Für diesen Versuch wurden drei Reaktionsansätze benötigt. 150 µl der ADH-Stammlösung in PBS in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß pipettiert. Danach fügte man 600 µl PBS und 37,5 µl der 3 mM DTNB-Lösung hinzu. Die Reaktionsgefäße wurden bei 30 °C für 30 min inkubiert. Danach wurde die Absorption bei 412 nm in der Plastikküvette gemessen.

5. Bestimmung der Gesamtzahl der Mercaptogruppen je Enzymuntereinheit

In diesem Versuchsteil wurden 37,5 µl der 3 mM DTNB-Lösung zu 750 µl der (durch Harnstoff) denaturierten ADH-Lösung hinzugegeben. Die Lösung wurde gemischt und bei 30 °C für 30 min inkubiert. Danach überführte man die Lösungen in Plastikküvetten. Ihre Absorption wurde bei 412 nm gemessen. Außerdem wurden auch drei Blindwert-Proben mit 750 µl 8M Harnstoff in PBS und 37,5 µl DNTB-Lösung inkubiert und photometrisch gemessen. ΔE berechnet sich aus dem Mittelwert der ADH-Proben abzüglich dem Mittelwert der Blindwert-Proben.

III. Ergebnis und Auswertung

1. Konzentrationsbestimmung der ADH-Lösung Die Konzentration der hergestellten ADH-Lösung lässt sich durch die Tyrosin- und Tryptophan-Reste im Enzym, welche im UV-Bereich absorbieren, photometrisch messen. Die Absorption der Lösung wurde bei 280nm aufgenommen. Mit Hilfe des Lambert-Beer’schen Gesetztes lässt sich über den Referenzwert bei

der Massenkonzentration

ein Extinktionskoeffizient ε berechnen, mit dem es dann

möglich ist, die Konzentration der Lösung mit der aufgenommenen Extinktion zu bestimmen. Berechnung des Extinktionskoeffizienten:

Berechnung der Konzentration der ADH-Lösung:

Es handelt sich hierbei um eine 1:10 Verdünnung. Dadurch ergibt sich folgende Ausgangskonzentration:

Da die Molekülmasse des Enzyms ( ) bekannt ist, lässt sich die Stoffmengenkonzentration ausrechnen.

Umrechnung in

:

2. Erstellung einer Ausgleichsgeraden für den Ellman-Assay mit N-Acetylcystein Die Absorption bei 412nm ergaben folgende Werte:

Probe 0 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl 25 µl 30 µl

A 0,154 0,215 0,295 0,352 0,372 0,478 0,474

B 0,160 0,261 0,271 0,342 0,403 0,420 0,481

C 0,134 0,196 0,268 0,391 0,478 0,415 0,464

Ø 0,149 0,224 0,278 0,361 0,418 0,438 0,473

Tab. 1: Absorptionswerte des N-Acetylcysteins Nun wird der Puffer-Blindwert subtrahiert:

Probe 0 µl 5 µl 10 µl 15 µl 20 µl 25 µl 30 µl

Ø korr. 0 0,075 0,129 0,212 0,269 0,289 0,324

Tab. 2: Korrigierte durchschnittliche Absorptionswerte

Um die Eichgerade zu erhalten, wurden die korrigierten Werte gegen die N-Acetylcysteinkonzentrationen aufgetragen:

Die Gleichung der Regressionsgerade ist: Der molare Extinktionskoeffizient wird durch lineare Regression aus der Steigung der Ausgleichsgeraden berechnet. Die Steigung beträgt 0,0111.

Der Literaturwert liegt bei

Somit weicht der, aus dem Versuch ermittelter Extinktionskoeffizient um 21,3 % dem Literaturwert ab.

3. Bestimmung der Anzahl frei zugänglicher Mercaptogruppen je Enzym-Untereinheit

ΔE berechnet sich aus der Differenz zwischen dem Mittelwert der drei gemessenen Extinktionen und dem Blindwert aus 3.2:

Probe natives ADH

A412 nm ADH + DTNB

A412 nm PBS + DTNB

ΔA412 nm CNTB [µM] nCys

A 0,478 - - -

B 0,494 - - -

C 0,444 - - -

Ø 0,472 0,149 0,323

y = 0,0111x + 0,0179

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

0,45

0 5 10 15 20 25 30 35 40

Absorption bei 412nm

N-Acetylcysteinkonzentration [µM]

Eichgerade für den Ellman-Assay

Die Konzentration der NTB-Dianionen berechnet sich über das Lambert-Beer’sche Gesetz aus ΔE, dem molaren Extinktionskoeffizienten und der Schichtdicke der Küvette:

Um die zur NTB-Konzentration äquivalente Konzentration an Mercaptogruppen in der Stammlösung zu erhalten, muss die Verdünnung berücksichtigt werden:

Das Verhältnis der NTB-Konzentration zur ADH-Konzentration ergibt die Anzahl der Mercaptogruppen (und Cysteine) pro ADH:

Im Versuch wurde mit Hefe-ADH gearbeitet. Es handelt sich hierbei um ein Homotetramer aus vier Untereinheiten. Deshalb muss man den oben errechneten Wert durch vier teilen:

Die Anzahl muss ganzstellig gerundet werden, wobei in diesem Fall definitiv aufgerundet werden muss. Angenommen wird die Wahrscheinlichkeit, dass Mercaptogruppen nicht reagiert haben und damit das Messergebnis vermindert haben. Es ergibt sich deshalb eine Anzahl von 6 Mercaptogruppen pro Untereinheit des ADH.

4. Bestimmung der Gesamtzahl der Mercaptogruppen je Enzymuntereinheit

Probe denaturierte

ADH

A412 nm ADH + DTNB + Harnstoff

A412 nm PBS + DTNB +

Harnstoff

ΔA412 nm CNTB [µM] nCys

A 0,666 0,146 - - -

B 0,678 0,115 - - -

C 0,682 0,126 - - -

Ø 0,675 0,129 0,546

Tab. 3: Messwerte der denaturierten ADH

Die Berechnung geschieht analog zu 3.3:

Anzahl der Mercaptogruppen je ADH:

je ADH-Untereinheit:

Durch Rundung ergibt sich eine Anzahl von 12 Mercaptogruppen pro Untereinheit des ADH.

5. Berechnung der Gesamtionenstärke des PBS-Puffers

Die Formel der Berechnung der Gesamtionenstärke lautet:

∑

Die Komponenten des PBS-Puffers sind:

Komponente Konzentration [mM]

Ionen

KH2PO4 4 K+ H2PO4-

Na2HPO4 16 2* Na+ HPO42-

NaCl 115 Na+ Cl-

Berechnung der Gesamtionenstärke des Puffers:

∑

Der Übersichtlichkeit halber werden erst die einzelnen Ionenstärken berechnet und zum Schluss addiert:

[ ]

[ ]

[ ]

6. Erläuterung des Reaktionsablaufs des Ellman-Assays Das Enzym ADH besitzt in ihren aktiven Zentren jeweils zwei Cystein-Reste mit Thiolat-Seitenketten. Zwei Thiolat-Anionen sind hierbei frei zugänglich und können mit dem, im Überschuss eingesetzten Ellman-Reagenz (5,5´-Dithio-bis-(2,2´-nitrobenzoesäure); DTNB) zu einem gemischten Disulfid und einem Nitrobenzoat-Anion (NTB) reagieren. Das NTB kann bei 412 nm photometrisch gemessen werden. Dabei wird pro vorhandenes Thiolat-Anion genau ein NTB gebildet (siehe Reaktionsgleichung in der Einleitung). Der Benzolring des NTB erlaubt eine mesomere Stabilisierung:

Mit Hilfe des Lambert-Beer’schen Gesetzes kann man dann die Konzentration des NTB ermitteln. Jedoch ist zu beachten, dass die quantitative Umsetzung nur mit den frei zugänglichen Thiolat-Anionen erfolgt. Somit ist das Assay von der sterischen Zugänglichkeit abhängig. Mit dem hier im Versuch verwendeten Ellman-Assay reagieren nur die essentiellen SH-Gruppen (frei zugänglich) der ADH mit dem DTNB. Die restlichen SH-Gruppen können nur sehr schwer gebunden werden. Erst nach einer Denaturierung können diese reagieren.

IV. Diskussion

Bestimmung einer ADH-Konzentration

Die berechnete Konzentration der ADH-Lösung (

, bzw. ) erscheint sinnvoll,

da Konzentrationen dieser Größe in Laboren gängig sind. Es gibt keinen Grund anzunehmen, dass bei der Bestimmung Fehler gemacht wurden.

Erstellung einer Eichgerade für den ELLMAN-Assay Die einzelnen aufgetragenen Datenpunkte liegen alle sehr nahe an der Regressionsgeraden, weshalb anzunehmen ist, dass der Versuch erfolgreich und ohne große Fehler verlaufen ist.

Der ermittelte Wert von

weicht allerdings deutlich vom Literaturwert

(

) ab. Die Abweichung von 21,3% könnte einerseits durch

unterschiedliche Reaktionsbedingungen begründet werden. Um näher an den Literaturwert zu kommen, hätte die Extinktion höher liegen müssen. Ein Puffer mit höherem pH-Wert würde das N-Acetylcystein besser deprotonieren und eine Reaktion mit DTNB begünstigen. Auch hätte eine höhere N-Acetylcystein-Konzentration ein besseres Ergebnis liefern können. Wie immer ist dennoch auch davon auszugehen, dass unsauberes Arbeiten, Pipettierfehler oder alte, bzw. gebrauchte Ausrüstung (z.B. mehrfach verwendete Plastikküvetten) die Ergebnisse verfälscht haben. Da alle individuellen Werte nur geringe Abweichungen von der Regressionsgeraden aufweisen, wird die Beteiligung dieser Faktoren jedoch als gering angesehen. Ermittlung der Anzahl essentieller Cysteinreste der ADH Die errechnete Anzahl von sechs essentiellen Cysteinresten bestätigt leider nicht die theoretische erwartete Anzahl von zwei. Eine Erklärung bietet sich darin, dass mehr Mercaptogruppen frei zugänglich waren durch unbeabsichtigte Denaturierung des Enzyms. Im Extremfall könnten eventuell vorkommende Disulfidbrücken im Enzym getrennt worden sein und weiter den Wert erhöht haben. Es besteht angesichts der starken Abweichung eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass es zu Pippetierungsfehlern gekommen ist. In jedem Fall ist die Anzahl unrealistisch und deshalb das Experiment als gescheitert anzusehen. Ermittlung aller freien Cysteinreste der ADH Die Gesamtzahl von 12 Mercaptogruppen, d.h. 12 Cysteinresten je Untereinheit entspricht nicht den Erwartungen. Obwohl in diesem Versuch das Enzym absichtlich denaturiert wurde, werden Disulfidbrücken durch Harnstoff nicht gespalten, weswegen dies als Erklärung für den hohen Wert ausscheidet. Im Skript des Praktikums wurde eine Zahl von 8 Cystein-Resten je Monomer angegeben. Nur eine starke Denaturierung die zur Freisetzung von möglicherweise vorhandenen Disulfidbrücken geführt haben kann, würde die hohe Anzahl an Mercaptogruppen erklären. Interessanterweise stieg die Anzahl der Mercaptogruppen im Vergleich zu 3.3 um sechs, was der theoretischen Anzahl der „nicht-essentiellen“ Cystein-Reste entspricht. Dennoch sind beide Werte eindeutig zu hoch und deshalb nicht aussagekräftig. Es muss auch hier zu Pipettierfehlern gekommen sein. Eine weitere Erklärung ist, dass der Extinktionswert zur Bestimmung Konzentration der ADH-Lösung nicht stimmt und deutlich höher sein sollte. Die höhere Konzentration wirkt sich auf beide Berechnungen aus und würde geringere Werte ergeben. Obwohl die Konzentration durchaus realistisch erscheint, darf dies nicht außer Betracht gelassen werden.