ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ

PREPARATÍV ÉS ANALITIKAI MÓDSZEREK

Immunaffinitás kromatográfia

ELISA – Enzim kötött immunszorbens esszé

ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal a

szubsztrát hozzáadását követően

ELISA plate különböző koncentrációjú mintákkal az

enzimreakció leállítását követően

AZ IMMUNOESSZÉK ÉRZÉKENYSÉGE

ELLENANYAG TISZTÍTÁS ANTIGÉN IMMUNSZORBENSEN

oszlop polimer gyöngyök

rákötött antigének

oszlop töltelék

„affinity purified antibody” : a katalógusokból rendelhető ellenanyagokat ezzel a módszerrel tisztítják

1) Tisztítandó ellenanyagok hozzáadása

2) Kötődés3) Mosás4) Elúció

A TISZTÍTÁS LÉPÉSEI

hozzákötött antigén specifikus ellenanyagok

oszlop

oszlop töltelék

Tisztított antigén

ANTIGÉNTISZTÍTÁS1) Tisztítandó oldat felvitele

2) Kötődés

3) Mosás

4) Elúciópolimer gyöngy

IMMUNPRECIPITÁCIÓ

• egy adott fehérje izolálása és koncentrálása sok fehérjét tartalmazó mintákból

• fehérje kölcsönhatások vizsgálata (pl. jelátvitelben résztvevő molekulák vizsgálata)

ELISA plate (lemez)

lyuk avagy kút

Különböző lemezek – különböző természetű molekulákhoz

ELISAEnzyme Linked Immune Sorbent Assay

enzyme linked immune sorbent

ellenanyaghoz konjugált enzim

enzim

felülethez, vagy ellenanyagokhoz kötődő antigének/ellenanyagok

AZ ELISA VIZSGÁLATBAN AZ MENNYISÉGÉVEL ARÁNYOS MÉRTÉKŰ VÁLTOZÁST DETEKTÁLUNK

Az enzimaktivitás mértékére a katalizált színreakció mértékéből következtethetünk

Hasonló elméleti alapokon nyugszik az összes elsődleges antigén-ellenanyag kölcsönhatáson alapuló immunoassay

AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI

Direkt módszer Indirekt módszer

Antigén

Primer ellenanyag

Jelzés

Jelzés

Szekunder ellenanyagok

AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI

Enzim-antienzim rendszer

PAP – peroxidáz / anti-peroxidázAPAAP – alkalikus foszfatáz / anti-alkalikus foszfatáz

Antigén

Primer ellenanyag

Szekunder ellenanyag

(faj v. izotípus specifikus)

A primer ellenanyaggal azonos (izo)típusú enzim-specifikus

ellenanyag

Enzimek

AZ ELISA, IMMUNHISZTOKÉMIA, CITOMETRIA SORÁN HASZNÁLT MÓDSZEREK ALAPTÍPUSAI

Biotin-avidin rendszerrel kombinált indirekt módszerekAz avidin nagy affinitással képes a biotint kötni

Egyszerű ABC

Antigén

Biotinált ellenanyagAvidin

Avidin-enzim komplexek

Biotin-enzim komplex

Avidin Biotin Complex

Jel felerősítése

Kis koncentrációjú antigének (pl. citokinek, hormonok) kimutatása szendvics technikával. Szérumok, nem tiszta oldatok vagy keverékek esetén is ez használható (pl. liquor).

nem kötődő anyagok kimosása

telítés: a szabad plasztikfelület beborítása aspecifikus fehérjével

felesleges fehérjék kimosása

eltérő antigén determinánst felismerő biotinilált ellenanyagok

hozzáadása

felesleges ellenanyagok kimosása

avidinnel konjugált enzim hozzáadása

színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

citokin specifikus ”capture” ellenanyagok kitapasztása

citokin tartalmú minta hozzáadása

felesleges konjugátum kimosása

KOMBINÁLT „SZENDVICS” ELISA

EGYSZERŰ INDIREKT ELISA LÉPÉSEI

Antigén specifikus ellenanyag, vagy az antigén egyszerű kimutatásához

az antigén kitapasztása(coating avagy fedés)

felesleges antigén kimosása

telítés: a szabad plasztikfelület beborítása

aspecifikus fehérjével

felesleges fehérjék kimosása

specifikus ellenanyagok hozzáadása

enzimmel konjugált szekunder ellenanyagok hozzáadása

felesleges ellenanyagok kimosása

színreakcióhoz szükséges anyagok hozzáadása

Példa: HIV fertőzöttség diagnosztikája a páciensben megjelenő HIV specifikus ellenanyagok kimutatásával - rekombináns HIV fehérje, vagy annak megfelelő szintetikus peptid segítségével

HIV burokfehérje, vagy nagy méretű szintetikus peptid

KOMPETITÍV ELISAÉrzékenysége miatt szolubilis fázisban levő kis mennyiségű antigén kimutatásához használják. A mintában jelenlevő ismeretlen mennyiségű oldott antigén hozzáköt az ellenanyagokhoz, és így gátolja azok hozzákötődését a rendelkezésre álló, korábban a szilárd fázishoz tapasztott tisztított antigénhez.

- A tisztított antigén kitapasztása a szilárd fázishoz és blokkolás

- Az ismeretlen mennyiségű, szolubilis antigént tartalmazó vagy nem tartalmazó minta hozzáadása

- Jelölt ellenanyag hozzáadása, kötődés

- Mosás

- Kromogén anyagok hozzáadása

koncentráció

1000 50

0

250

125 62 31 16 7.8

3.9

1.9

0.97

0.49

0.24

0.12

0.03

0

0.06

1

0.00

7

0.01

5

0.00

4

0

Ismeretlen koncentrációjú minta

ODA standard hígítási sora

Az optikai denzitás alpján bármelyik lehetne

?

Az összehasonlíthatósághoz az ismeretlen mintából is hígításokat

kell csinálni!

Ez az a tartomány, ami a koncentrációt jellemző

értékeket ad

Szerencsés esetben, a minta OD-je a lineáris szakaszra esik, és nem kell hígítani.

BIOAKTÍV ANYAGOK KIMUTATÁSA

hCG (human coriogonadotropin) – terhességi tesztek

Tumor antigének kimutatása

Citokinek, hormonok kimutatása

doppingvizsgálatok: EPO (erithropoetin), szteroid származékok kimutatása

szendvics technikával vagy kompetitív tesztekkel

TUMORDIAGNOSZTIKA

A tumor specifikus (TSA,TSTA) és tumor asszociált (TAA) antigéneket felismerő ellenanyagok felhasználhatóak a diagnosztikábanSzendvics technikával ezek az antigének kimutathatóak

Tumor antigén (pl. a beteg szérumából)

Tumor Ag specifikus detektor/reporter ellenanyag (a kit része)

Tumor Ag specifikus capture ellenanyaggal (a kit része) fedett felület

Prosztata daganatok

prosztata-specifikus antigén (PSA): Szérum koncentrációja magas a prosztata rákos, benignus prosztata hiperpláziás (BPH) és prosztatitiszes páciensekben nem specifikus, de a PSA szérum szintje korrelál a prosztata daganat méretével és a klinikai állapotával (monitorozásra alkalmas)

hasonlóan felhasználható a prosztataspecifikus savas foszfatáz (PAP) mennyiségi kimutatása a szérumból

AZ ELSŐDLEGES ANTIGÉN – ELLENANYAG KAPCSOLÓDÁSON ALAPULÓ PREPARATÍV ÉS

ANALITIKAI MÓDSZEREK

immunoblot (Western blot)immunhisztokémia

WESTERN BLOT

Lépések:1) minta előkészítés (szöveti vagy

sejtes)2) gél elektroforézis3) blotolás4) jelölés5) előhívás

Felhasználás: fehérje keverékek egyes komponenseinek ellenanyag segítségével történő kimutatására

Anode(+)

Cathode(-)

• Az egyik leggyakrabban alkalmazott olyan módszer a molekuláris biológiában amiben ellenanyagokat használnak• SDS-PAGE gél a minta fehérje komponenseinek elválasztása molekulatömegük alapján (átfedés is lehetséges)• Membránhoz való hibridizálást követően a vizsgált fehérje kimutatása specifikus ellenanyaggal történik

StandardProtein minta

SDS-PAGE Membrán Western blot

Fehérje detektálás specifikus ellenanyag-epitóp kölcsönhatás alapján

WESTERN BLOT

• Segítségével egy adott fehérje jelenléte kimutatható a mintában

• Az egymástól elektroforézissel elszeparált fehérjéket /Nátrium-Dodecyl Szulfát-Polyacrylamid Gélelektroforézis (SDS-PAGE)/, membránra transzferálják

• Primer ellenanyagot (monoklonális vagy poliklonális) használnak a vizsgált fehérje kimutatásához

• Enzimmel (pl. torma-peroxidáz) konjugált szekunder ellenanyag segítségével mutatják ki a primer ellenanyag kötődését

WESTERN BLOT

WESTERN BLOT

Kimutatási eljárások:

Kolorimetriás (peroxidáz enzim – denzitometria / spektrofotometria)

Kemilumineszcens (ECL)

Radioaktív (izotóp – RTG)

Fluoreszcens (jelölés – CCD camera)

Fab

Fc

Epitóp a protein felszínén

Primer ellenanyag

Szekunder ellenanyag

Torma- peroxidáz

Immobilizált proteinek

Membrán

H2O2

H2O

luminol

enhancer

h

detektálás

MEGNÖVELT KEMILUMINESZCENCIA/Enhanced chemiluminescence (ECL)/

• H2O2 jelenlétében a torma-peroxidáz (HRP) oxidálja a diacilhidrazidokat (pl luminol)• Az oxidáció hatására a luminol gerjesztett állapotba kerül és egy fotont bocsát ki, hogy visszatérjen az alapállapotba• A kibocsátott foton fényérzékeny filmmel, vagy kamerával detektálható• A fénykibocsátás fenol vázzal rendelkező molekulák (pl 6-hidroxi-benzothiazol) jelenlétében körülbelül 1000-szeresére növelhető (enhancer)

luminol

IMMUNCITOKÉMIA / IMMUNHISZTOKÉMIA

Jelzéssel ellátott, antigén-specifikus ellenanyag mutatja meg az antigént a szövettani metszetben, vagy a sejtszuszpenzióban

• Immunfluoreszcencia• fluoreszcensen jelzett ellenanyag

FITC – fluoreszcein izotiocianát (zöldessárga)PE – fikoeritrin (narancssárga)

• Immunoenzim módszer• enzimmel konjugált ellenanyag

P – peroxidázAP – alkalikus foszfatáz(a szubsztrátból oldhatatlan, színes csapadékot képeznek)

Szövetminta

FIXÁLÁS

Festés előtti metszetFAGYASZTÁS

METSZÉS

IMMUNHISZTOKÉMIA

IMMUNHISZTOKÉMIA

Avidin

Szövetmetszet

Sejtek (sejttenyészetek)

Tárgylemez

Primer antitest

Biotin

Szekunder antitest

EnzimABC komplex:• biotinált ellenanyag• avidin• biotinált enzim

Hagyományos hisztokémiaAkut bronchopneumonia (hematoxilin-eozin festés)

Viszonylag kevés sejttípus azonosítható

Immunhisztokémia(CD68+ makrofágok és limfociták által képzett granulóma)

Antinukleáris (ANA) ellenanyagok kimutatása SLE-s személy szérumából, sejtkultúrában (Hep-

2), immunofluoreszcencia segítségével (indirekt jelölés)

Aktin mikrofilamentek kimutatása (TRITC)

Lehetőség van részletes morfológiai információk kinyerésére (lásd a további ábrákat is)

Fixált és permeabilizált bőr fibroblaszt

Mitokondrium F-aktin Sejtmag

Fixált és permeabilizált tüdőartéria endothel sejtPeroxiszóma Mitokondrium Sejtmag