ELVLASZTSTECHNIKA III. GLKROMATOGRFIA

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIA

Dr. Kremmer Tibor

ETVS LORND TUDOMNY EGYETEMBudapest

GLKROMATOGRFIAGEL CHROMATOGRAPHY - GEL FILTRATION

MOLEKULA MRET SZERINTI ELVLASZTS KROMATOGRFIASIZE EXCLUSION CHROMATOGRAPHYSEC

GL PERMECIS KROMATOGRFIAGEL PERMEATION CHROMATOGRAPHYGPC

TRTNETI TTEKINTS McBain (1929) Molecular Sieving - Molekula szitk, zeolitok permutitok

Deuel s Neukom (1954) Desalting - Poliszacharid glek, smentests Porath s Flodin (1954) Gel Filtration - GLSZRS Uppsala Pharmacia Fine Chemicals, Sephadex Sepharose glek

Gelotte (1960), Pedersen (1962), Flodin s Porath (1961-63) Size Exclusion Chromatography (SEC) Mret szerinti kizrdsos kromatogrfia Szterikus-volumetrikus trfogati megoszlsi modell Steere s Ackers (1962) Restricted Diffusion Chromatography

Hjerten s Mosbach (1962) Molecular Sieve Chromatography A molekula szitls matematikai modellje

Moore (1964) Gel Permeaton Chromatography (GPC)

Casassa (1967), Ogston (1968-70) Termodinamikai rtelmezs Ozmotikus nyoms entrpia vltozs alapjn Determann (1964) Gel Chromatography - GLKROMATOGRFIA

A GLKROMATOGRFIA ELVLASZTSI MECHANIZMUSNAKSZTERIKUSELMLETI MODELLJE

PORZUS GLSZERKEZET ELEKTRONMIKROSZKPOS KPE

GLKROMATOGRFIA AZ ELVLASZTAND ANYAG(OK)

Kmiai tulajdonsgai:Szerkezet stabilitsFunkcionlis csoportokBiolgiai aktivitsMolekula mret-tmeg, eloszls Kis molekulk Makromolekulk, Biopolimerek Fizikai tulajdonsgai:Oldkonysg (polris-apolris)Szolvatci hidratciAlak (globulris - fibrillris), konformci aggregciHidrodinamikai jellemzkStokes-f rdiusz, diffzis lland,bels viszkozits, flexibilits

GLKROMATOGRFIA AZ RAML FZIS

AZ ELUENS OLDSZER POLARITSA

pH, IONERSSG, ION MINSG

VISZKOZITS (KONCENTRCI)

ADALKOK detergensek, stabilizlk, antioxidnsok, antibakterilis vegyletek, stb,

AZ LL (GL) FZIS

A TLTET KMIAI SSZETTELE - SZERKEZETE Xerogel - liogel, trhls polimerek, Biokompatibilits,

SZERVETLEN OXIDOKSiO2, Al203, hidroxi apatit, TiO2, vegszemcsk (CPG), SZERVES POLIMEREKDextrn, agarz, akrilamid, akril-metak-rilt, politer-szter, polivinilalkohol, polisztirol-divinilbenzol, KEVERT TPUSOKSzervetlen-szerves, Szerves-szerves, Si02-poliszacharid Dextrn-agarz, egyb polimerek, akrilamid - PS-DVBGLKROMATOGRFIA

AGARZ GL SZERKEZETE (Araki, 1956)

TRHLS DEXTRN GLEK (Sephadex) SZERKEZETE

N,N-METILN BIS-AKRILAMIDDAL TRHLSTOTT POLIAKRILAMID GLEK

GLKROMATOGRFIS TLTETEK (GPC-SEC, PITTCON 1993-94)

ElnevezssszettelGyrt - Forgalmaz Sephacryl S 100 -1000Allil - dextrn akrilamidPharmacia-LKBSuperdex 30-200Dextrn-agarzPharmacia-LKBSynChrom GPCPolipropil-glicerilWaters- Millipore SigmachromGFC 100-300Dextrn - polietilnglikolSigma-AldrichChitopearl Chitopack KOKitin - kitosan poliszacharidFuji Spinning Co. (Japn)NucleosilPhenomenex GPC-PDaisogel 2205SiO2Macherey-Nagel Phenomenex Daiso (Japn)UnisphereAl2O3BiotageHA Type 8HidroxiapatitKoken Science

GLKROMATOGRFIS TLTETEK(GPC-SEC, PITTCON 1993-94)

ElnevezssszettelGyrt-ForgalmazStyragel HMWPS DVBWatersFractogel TSKSzilikagl, ill.MerckG 3000 SW-PWPolivinil - sztirol polimerToyopearl HW 55FTosoHaasMetachem GPC 102 - 106 PS - DVBMetachem Tecnol.Jordi Gel DVB 500 Polidivinil benzolJordi AssociatesBioSep SEC2000-4000PS - DVBPhenomenexAsahipak HOPolivinil alkohol Asahi Chem. Co.PL gel MIXEDPolietilnnel kevertPS-DVB PolymerPL Aquagel OHPolihidroxidPolihidroxil Laboratories Ltd,Shodex UT 800 KF 80 MPoliszachariddal kevert PS - DVBShowa Denko

A szraz (xerogl) szemcsk mrete (m) fajttl fggen: durva (coarse) 100-300, kzepes (medium) 50-150, finom (fine) 20-80, vagy szuperfinom (superfine) 10-40 lehet.

Sephadex G glek kromatogrfis tulajdonsgaiGltpusGlgy trfogata cm3/g xerogl*Kizrdsi moltmeg (kDa)Frakcionlsi tartomny (kDa)G-102 3 0,70,7 alattG-152,5 3 5 1,01,0 alattG-254 651 5G-509 11301,5 30G-7512 15703 70G-10015 201504 150G-15020 304005 400G-200 30 408005 - 800

HOMODISZPERZ SZTIROL-DIVINIL BENZOL KOPOLIMER SZEMCSK (BioBeads, 5 m) EM KPE

HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSK TRBELI ILLESZKEDSNEK HEURISZTIKUS MODELLEZSE

HOMODISZPERZ SZFEROID SZEMCSK 6 S 8 KOORDINCIS SZMMAL ILLESZKED TRBELI MODELLJEI

A GLKROMATOGRFIA SZTERIKUS-VOLUMETRIKUS EGYENLETE

AZ LL (GL) FZIS SZERKEZETE

A GLEK SZRAZANYAG (TRHL) TARTALMA (sly %)Agarz 0.3 1.5Sephadex 3 - 30Poliakrilamid 2.5 - 15 A glszemcsk 70 95 %-a vz (oldszer) !

ERSEN HIDRATLT (SZOLVATLT) SZERKEZETA vz (oldszer) molekulk (dinamikus egyenslyban) a trhlhoz rgztett trszerkezetet kpeznek.A rgztett folyadktr hozzfrhetsgt a trhls szerkezet srsge (keresztktsek szma, orientcija, prusmret) s az oldott (elvlasztand) molekula mrete (tmege) hatrozza meg.

Az elvlaszts technika szemllete szerint aGLKROMATOGRFIAa FOLYADK-FOLYADK MEGOSZLSI KROMATOGRFIASPECILIS HATRESETEahol az ll s az raml fzis ugyanaz az oldszer, a szerkezetileg rgztett s a folyadk halmazllapot vzmolekulk.

Az ELVLASZTS MECHANIZMUSA

a fzisok kztti trfogati megoszls (fzisarny, megoszlsi egytthat)a molekula mretnek (tmegnek) fggvnye.

Kav ~ f(log M)

(A molekula rendelkezsre ll tr(fogat), oldkonysga klnbz a kt fzisban)

Determann egyenletek (1966-69) Dextrn (Sephadex) glekre - fehrjkre, enzimekreBIOPOLIMEREK MOLEKULA TMEGNEK (MRETNEK) MEGHATROZSA GLKROMATOGRFIVALlogM = M0 - (6.06-5.00 ) = a xerogl szemcse srsgelog M Ve / V0 = Kav (Vt V0)(Vt V0) lland rtk 2/3 . Vt Kav = 0 1 log M Kav

MOLEKULA TMEG (MRET) MEGHATROZSA GLKROMATOGRFIVAL

A glkromatogrfia trfogati paramtereinek sszefggse a diffzis llandval

A MOLEKULA TMEGNEK S MRETNEK SSZEFGGSE

A glkromatogrfia alkalmazsra vonatkozan hangslyozni kell a molekula tmegnek s (virtulis) mretnek sszefggst (eltrst), amely a molekula fajlagos parcilis trfogatval s a Stokes-fle rdiusszal rhat le: M molekulatmeg, N Avogadro-fle szm, a Stokes-fle rdiusz, D diffuzis lland, molekula fajlagos parcilis trfogata, viszkozitsi egytthat.

A GLKROMATOGRFIA MDSZEREI S ALKALMAZSI TERLETEIPREPARATV (BATCH) MINTA ELKSZTS - ANALITIKAI

OSZLOPKROMATOGRFIA (LC HPLC) - RTEGKROMATOGRFIA

BEKONCENTRLSSMENTESTSPUFFER CSERECSOPORT FRAKCIONLSTISZTTS ELVLASZTSMOLEKULA TMEG (MRET) MEGHATROZSDETERGENS GLKROMATOGRFIAKROMATOFOKUSZLS

MOLEKULA TMEG MEGHATROZS GLKROMATOGRFIVAL

CSOPORT FRAKCIONLS GLKROMATOGRFIVAL

POLIETILNEK (2-32 kDa) S SZNHIDROGNEK (C5-C58) ELVLASZTSA MRET SZERINTI KIZRDSOS (SEC) GLKROMATOGRFIVAL

TRANSZFERRIN TISZTTSA GLKROMATOGRFIVAL

CHYLOMICRON VLDLHUMN SZRUM LIPOPROTEINOSZTLYOK

(SEM)

A HUMN SZRUM LOW DENSITY LIPOPROTEIN (LDL) MOLEKULA DODEKAHEDRLIS (pentagon dodekader) MODELLJE

HUMN SZRUM LIPOPROTEIN OSZTLYOK ELOSZLSAVLDLLDLHDLELFOUC

HUMN SZRUM LIPOPROTEINEK ELVLASZTSAELEKTROFORZISSEL AGARZ GLEN

HUMN SZRUM LIPOPROTEINEKSEC ELVLASZTSA AGARZ (Sepharose 6B) GLOSZLOPONVLDLLDLHDL

SZOLUBILIZLS S DETERGENS GLKROMATOGRFIA

DETERGENS GLKROMATOGRFIA MEMBRN FEHRJK ELVLASZTSRA S TISZTTSRA

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIA(IEX) Ion Exchange Chromatography

TRTNETI TTEKINTS szvetsg (Exodus xv. 23-5) vz tiszttsArisztotelsz (cit. Hellferich, 1959) tengervz stlantsBacon (XVII. sz. eleje) alkimia, gygyszerszet, derts-perkollsThompson (1850), Way (1852) kationok adszorpcija agyagonEichorn (1858), Boedecker (1859) egyenslyi folyamatokra empirikus egyenletekHarms (1896) cukorgyrtsban szabadalomHarms s Rmpler (1903) szervetlen szintetikus ioncserlkGans (1905) Al-sziliktok alkalmazsa vzlgytsraFischer s Hoffmeister (1910-20) Kuhn, Lederer s Winterstein (1932-35) fehrje kmiai alkalmazsok, tisztts elvlasztsAdams s Holmes (1935- ) polimerkmia, szerves ioncserlk, PDB mgyantk, bakelit (hanglemez !) Moore s Stein (1945) aminosav analizis - kszlk

AZ ELVLASZTAND ANYAG(OK)

SSZETEVK IONOS, vagy IONIZLHAT TULAJDONSGA

FUNKCIONLIS CSOPORTOK TLTSE S MINSGE

IZOELEKTROMOS PONT (makromolekula, biopolimer)

A TLTS VISZONYOK (net charge) VLTOZSA A pH S IONERSSG HATSRA

MOLEKULA TMEG S SZERKEZET

DETEKTLHATSG BIOLGIAI AKTIVITS OLDKONYSG

STABILITS

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIA

FEHRJE MOLEKULA SZERKEZETNEK IONOS, VAGY IONIZLHAT FUNKCIONLIS CSOPORTJAI

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAAZ LL FZIS IONCSERL TLTETEKGYENGE - ERS ~~N+H2 < ~~N+HR < ~~N+R2

KATION CSERLK

Negatv tlts funkcionlis csoportokkal (szulfonil, karbonil, CM, PO4)

ANION CSERLK

Pozitv tlts (primer, vagy szubsztitult, szekunder, tercier, kvaterner amino, imino, guanidil, stb.) funkcionlis csoportokkal

AMFOTER (kevert) TIPUSOK

Pozitv s negatv tlts funkcionlis csoportokat tartalmaz komplex szerkezettel

ERS - GYENGEIONCSERLK

DISSZOCICI FOKA (pKA, pKK, pKI) SZERINT

TENTACLE ELV - KAPACITS !IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAIONCSERL TLTETEK

IONCSERL KROMATOGRFIS TLTETEK

Elnevezssszettel (matrix)Gyrt - ForgalmazDowex A (WBA) C 88 Sztirol divinil benzolSIGMAAmberlit IR Sztirol divinil benzolSERVASepharose Q, DEAE, ANX, SP, CM, Dextrn-agarz kopolimerPharmacia-LKBBioBeads MonoQ MonoP, MonoSPolivinil sztirol kopolimerPharmacia-LKBFractogel EMDDEAE 650TMAE 650SO3- 650Poli metilmetakriltMerck, DarmstadtAG MP, 50W, X4Sztirol divinil benzolAkriltPoliaminBioRad Laboratories

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAAZ RAML FZIS

A LEGFONTOSABB MODULL TNYEZKKMHATS - pH - PUFFEREK

AZ IONCSERE EGYENSLYI FZISBAN A MEGFELEL ELLENION S AZ IONCSERL TLTSNEK BIZTOSTSA

AZ ELVLASZTAND ANYAG(OK) TLTSNEKKIALAKTSA (pozitv, vagy negatv, pl. fehrjk)

AZ IONCSERE pH-val MODULLT ELCIS FZISBAN AZ ELVLASZTAND VEGYLETEK S AZ IONCSERL IONOS KLCSNHATSAINAK SZELEKTV MEGVLTOZTATSA

AZ IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIBAN LTALNOSAN HASZNLT PUFFER RENDSZEREKPufferpH tartomnyCitrt (-dihidrogn, -hidrogn)2 - 6,0 2,6 - 6,5Ammnium foszft2,2 - 6,5Klium hidrogn ftalt2,2 - 6,5Ntrium formit3,0 - 4,4Ntrium acett4,2 - 5,4Trietanolamin6,7- 8,7Ntrium bort8,0 - 9,8Ammnium acett8,6-9,8Ntrium dihidrogn foszft2,0-6,0 s 8,0-12,0Klium dihidrogn foszft2,0-8,0 s 9,0-13,0Bis-tris-propn4.0 8.0

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAAZ RAML FZISIONERSSG (I) - IONMINSGsszefggsbl szmthat, ahol:

ci az i-edik ion koncentrcija, zi2 az i-edik ion tlts szmnak ngyzete.

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAAZ RAML FZISPOLARITSAZ RAML FZIS POLARITSNAK VLTOZTATSA(CSKKENTSE) ADALK OLDSZEREKKELMETANOL, ACETONITRIL

AZ IONOS KLCSNHATSOK ERSSGNEK VLTOZTATSA

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAMUNKAFOLYAMATAI

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAEGYENSLYI LLAPOT BELLTSA(EKVILIBRLS)AZ ELVLASZTAND ANYAGOK KTDSREAZ EGYB (KONTAMINNS) ANYAGOK ELKLNTSRE

A MEGFELEL LL FZIS KIVLASZTSA

AZ RAML FZIS PARAMTEREINEK OPTIMLSApH, IONERSSG-MINSG, POLARITSKEMOSZORPCI

AZ RAML FZISBAN OLDOTT MINTAKLCSNHATSBA HOZSA AZ LL FZISSALAZ EGYB (NEM KTD) ANYAGOK LEOLDSA AZRAML FZISSAL(ELCI)

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAA DESZORPCI MVELETEI (ELVLASZTS, FRAKCIONLS)AZ IONOS KLCSNHATSOK SZELEKTV MEGBONTSAAZ RAML FZIS PARAMTEREINEK pH, IONERSSG, POLARITS SZISZTEMATIKUS SZAKASZOS s/vagy FOLYAMATOS, EGYIDEJ vagy KLNLL VLTOZTATSVAL IZOKRATIKUS ELUCIGRADIENS ELUCI AZ ELUENS PARAMTEREINEK VLTOZTATSA SZAKASZOS - LPCSZETES LINERIS, vagy EGYB (KONVEX, KONKV, stb.) FGGVNYKAPCSOLAT SZERINT

IONCSERL FOLYADKKROMATOGRFIAGRADIENS KPZS

(pH, IONERSSG, KONCENTRCI, POLARITS)BApHVB > A

A GRADIENS ELCI FORMI S ALKALMAZSA

21TERMSZETES AMINOSAVIONCSERL KROMATOGRFIS ELVLASZTSADionex DC-6AANIONCSERLOSZLOPON(30X0,46 cm)3 LPSESNa-citrt gradiensPROGRAMMAL

DETEKTLS:NINHIDRIN(post-column)

TERMSZETES AMINOSAVAK FMOC SZRMAZKAINAK ELVLASZTSA IONCSERL KROMATOGRFIVAL

FEHRJE MOLEKULA SZERKEZETNEK IONOS, VAGY IONIZLHAT FUNKCIONLIS CSOPORTJAI

ENZIMEK TISZTITSA CSIRKE IZOMBL KATIONCSERL (Mono S)KROMATOGRFIVAL

CELLULZ TRIPSZINES EMSZTSI TERMKEINEK ELVLASZTSAANIONCSERL (Mono Q) KROMATOGRFIVAL

KGYMREG SSZETEVINEK ELVLASZTSA KATIONCSERLFOLYADKKROMATOGRFIVAL

HbA1C ELVLASZTSA S MRSE KATIONCSERL (Mono S)KROMATOGRFIVAL

HUMN SZRUM LAKTT DEHIDROGENZ IZOENZIMEK ELVLASZTSAHORIZONTLIS AGARZ GLELEKTROFORZISSEL

LAKTT DEHIDROGENZ (LDH) IZOENZIMEK ELVLASZTSA KATION CSERL FOLYADKKROMATOGRFIVAL

VIZELET FEHRJK ELVLASZTSA ANIONCSERL (Mono Q)KROMATOGRFIVAL

- LIGHT CHAINS FEHRJE KIMUTATSA KROS VIZELETBEN(MYELOMA MULTIPLEX)

HUMN SZRUM AGP ELVLASZTSA S MRSEANIONCSERLKROMATOGRFIVALKETTSpH NaCl GRADIENSSEL

pH 7,5 9,5NaCl 0 350 mM

NUKLEOTID FOSZFTOK ELVLASZTSA S MRSE IONCSERL MonoQ FPLC FOLYADKKROMATOGRFIVAL

MINTAELKSZTS: Szvetek, sejtek, biolgiai folyadkok homogenizlva 0,7M perklrsavban, centrifugls, fellsz semlegestve KHCO3-alFPLC oszlop: MonoQ, v. Polyanion SI HR 5/5 raml fzis: NH4-foszft puffer, pH: 7, 0 Gradiens elci: 0,1 1, 0 MProgram szerint ramlsi seb: 0,75 mL/perc Detektls: 254 nm

NUKLEOZIDOK S NUKLEOTID FOSZFTOK ELVLASZTSA ION-PR HPLC FOLYADKKROMATOGRFIVALMINTAELKSZTS: Szvetek, sejtek, biolgiai folyadkok homogenizlva 0,7M perklrsavban, centrifugls fellsz semlegestve KHCO3-alHPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) raml fzis: 0,025M TBAH-foszft pH: 6,0 s 0,08M NaCl Lineris gradiens eluci: MeOH 0-20% (v/v) 45perc ramlsi seb: 0,75 mL/perc Detektls: 254 nm(Ade, Cyt, Gua, Uri, CMP, UMP, GMP, IMP, CDP, UDP, AMP, GDP, CTP, UTP, GTP, ADP, ATP)

A HPLC-ION PR KROMATOGRFIA PARAMTEREINEK SSZEFGGSEk VLTOZSA AZ RAML FZIS MeOH S NaCl TARTALMNAK FGGVNYBENA NUKLEOTID FOSZFTOK ELVLASZTSNAK OPTIMLSAAZ RAML FZISMeOH s/vagy NaClKONCENTRCIJNAKVLTOZTATSVAL HPLC oszlop: Hypersil ODS (25x0,46 cm, 5 m) raml fzis: 0,025M TBAH-foszft pH: 6,0(Optimlisan) 0,08M NaCl

NHNY FONTOSABB ANION IONKROMATOGRFIS ELVLASZTSA

NHNY FONTOSABB KATION IONKROMATOGRFIS ELVLASZTSA

21 TERMSZETES AMINOSAV ELVLASZTSA Dionex D-6A OSZLOPON ANIONCSERL KROMATOGRFIVAL