Emoglobina glicata e gap di glicazione nella diagnostica del diabete

Andrea Mosca

Università degli Studi di Milano

Centro Interdipartimentale per la Riferibilità Metrologica in Medicina di Laboratorio (CIRME)

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. HbA1c e diagnosi del diabete

3. Gap di glicazione

4. Standardizzazione e compiti del

professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 2

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. HbA1c e diagnosi del diabete

3. Gap di glicazione

4. Standardizzazione e compiti del

professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 3

A.

Mo

sca -

Un

iMI

4

A.

Mo

sca -

Un

iMI

5

www.ifcchba1c.com

A.

Mo

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Un

iMI

6

Westgard biodatabase

A.

Mo

sca -

Un

iMI

7

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. HbA1c e diagnosi del diabete

3. Gap di glicazione

4. Standardizzazione e compiti del

professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 8

9

A.

Mo

sca -

Un

iMI

Colagiuri et al, Diabetes Care 2011;34:145-50

DETECT-2 9 studies n = 27933

10 Lapolla et al, Nutr Met Cardiovasc 2011;21:467-75

A.

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Un

iMI

11

Undiagnosed diabetes in the U.S. population aged ≥20 years

by three diagnostic criteria—NHANES 2005–2006

Cowie et al, Diabetes Care 2010;33:562-8

A.

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iMI

Diabetes FPG: 2.5 % 2h PG: 4.9 % HbA1c: 1.6 %

12

Zhang et al, PLOSone 2012;7(5):e37260

A.

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Un

iMI

Diabetes FPG: 4.4 % 2h PG: 2.3 % HbA1c: 7.3 %

Pre-diabetes FPG: 10.6 % 2h PG: 1.2 % HbA1c: 23.9 %

13 Sattar et al, Diabetologia 2012;55:1564-7

A.

Mo

sca -

Un

iMI

COMMENTARY HbA1c

in type 2 diabetes diagnostic criteria: addressing the right questions to move the field

forwards

Unimportant questions

Does HbA1c diagnose the same

group of patients as glucose-based criteria? How does the cardiovascular risk factor profile differ in individuals identified by various diabetes diagnostic criteria in cross-sectional studies? Should oral glucose tolerance testing be part of future

diagnostic algorithms?

Important questions

Which glycaemia measurement is the best predictor of microvascular disease?

Does use of HbA1c

as a diagnostic

measure lead to earlier diagnosis of type 2 diabetes and thereby improve clinical outcomes? In which patients should HbA1c

measurement be combined with fasting glucose? What is the impact of using HbA1c

for

diabetes diagnosis on laboratory costs and what are the potential savings elsewhere? How best can diabetes and cardiovascular risk screening be

combined?

14

Tsugawa Y et al, Diabetes 2012;61:3280

A.

Mo

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Un

iMI

n = 19897 Japanese adults 2006-2009

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. HbA1c e diagnosi del diabete

3. Gap di glicazione

4. Standardizzazione e compiti del

professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 15

A. Mosca - UniMI 16

0.5

Albumin

Hemoglobin

Time (days)

0 4 2 6

0.1

8

0.3

0.5

Affinity of alb and hemoglobin to glucose

James F.Day, Diabetes 1980;29:524-527

A. Mosca - UniMI 17

Period of hemoglobin A1C and GA

Days passed

A. Mosca - UniMI 18

HbA1c GA

Relative value of HbA1c and GA

4.0

5.0

6.0

7.0

8.0

9.0

10.0

11.5

14.3

17.0

19.8

22.5

25.3

28.0

GG

GG

GLYCATION GAP

Cohen et al, Diabetes Care 2003;26:163-7 A. Mosca - UniMI 2

3

A. Mosca - UniMI 24

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. HbA1c e diagnosi del diabete

3. Gap di glicazione

4. Standardizzazione e compiti del

professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 25

R. Paleari - UniMI 26

Primary reference

materials

(IRMM 466 and 467)

IFCC reference measurement

procedure

(HPLC-CE or HPLC-MS) Secondary reference materials

(blood panels)

Manufacturer’s internal

reference measurement

procedure Manufacturer’s

working calibrator

Manufacturer’s standing

measurement procedure

Manufacturer’s

product calibrator

Routine measurement procedure

Patient Sample

IFCC

Network

Manufacturer

Individual

laboratory

Mosca et al, Clin Chem Lab Med 2007;45:1077-80

R. Paleari - UniMI 27

Hexapeptide

HbA1c is the stable adduct of glucose to the N-terminal

amino acid, valine of the b-chain of hemoglobin

α chains

β chains

N-terminal Valine

28

FLOW CHART FOR

REFERENCE METHODS

Hemolysate

Enzymatic Cleavage

HPLC-Mass

Spectrometry HPLC-Capillary

Electrophoresis

Approved by IFCC 2001

R. Paleari - UniMI

Clin

Chem

2004; 50:

166-74

R. Paleari - UniMI 29

30

R. Paleari - UniMI

R. Paleari - UniMI 31

R. Paleari - UniMI 32

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. Definizione dei traguardi analitici

3. Standardizzazione

1. La parte difficile

4. Compiti del professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 33

34 A. Mosca - UniMI

Lapolla et al, Nutr Met Cardiovasc 2011;21:467-75

A.

Mo

sca -

Un

iMI

Prevalence of anemia in diabetic patients UK experiences (Teesside)

35

Jones et al. Diabetic Medicine 2010; 27:655-9

A.

Mo

sca -

Un

iMI

n= 7331

A.

Mo

sca -

Un

iMI

36

36

Cohen, Blood 2009;112:4284-91

CV ~ 12 %

37

Shima et al, Ann Clin Biochem 2012;49:68-74

A.

Mo

sca -

Un

iMI

38 Khera, Diabetes 2008;57:2445-52

CV ~ 25 %

A.

Mo

sca -

Un

iMI

A. Mosca - UniMI 39

FN3K

Delpierre et al, Biochem J 2002

A. Mosca - UniMI 40 Mohas et al, Exp Clin Endocrinol Diabetes 2009;

G900C SNP (rs 1056534) n = 859 DT2; 265 controls

A. Mosca - UniMI 41

Mosca et al, CCLM 2011;49:803-8

42

Soranzo et al, Diabetes 2010;59:3229-39

• Associations with HbA1c

in 46,368 nondiabetic adults of European descent

• 23 genome-wide association studies (GWAS) and 8 cohorts with de novo genotyped single nucleotide polymorphisms (SNPs)

• 6 new loci near FN3K (HFE, ANK1..)

• 4 known HbA1c loci (HK1, MTNR1B, GCK, G6PC2/ABCB11)

• Reclassification of 2% general population screened for diabetes

A.

Mo

sca -

Un

iMI

43

43

A: Patient 1

0

50

100

150

200

250

300

350

400

2/15 2/16 2/17 2/18 2/19 2/20 2/21 2/22

Time (days)

Glu

cose

(mg/

dL)

B: Patient 2

0

50

100

150

200

250

300

350

400

2/8 2/9 2/10 2/11 2/12 2/13 2/14 2/15

Time (days)

Glu

cose

(mg/

dL)

A1C 7.4%

1,5-AG 12.4 µg/ml

PPG max 195 mg/dL

A1C 7.3%

1,5-AG 4.5 µg/ml

PPG max 235 mg/dL

Despite similar A1c levels…

Less Spiking

More Spiking

Dungan et al. Diabetes Care 2006; 29 (6): 1214-9

A.

Mo

sca -

Un

iMI

44

Kilpatrick et al, QJMed 1996;89:307-12

A.

Mo

sca -

Un

iMI

45

A.

Mo

sca -

Un

iMI

Pani et al, Diabetes Care 2008;31:1991-6

AM-UniMi 46

47

HEMOGLOBIN VARIANTS

Most common variants are HbS, HbC, HbE and HbD

Cannot use HbA1c for diagnosis (or for monitoring) in individuals homozygous for HbS or HbC or with HbSC

Can measure HbA1c accurately in most heterozygous Hb variants, if appropriate assay used (www.ngsp.org) A

. M

osca -

Un

iMI

48 Tsugawa et al, Ann Int Med 2012;157:153-9

A.

Mo

sca -

Un

iMI

COSA FARE PER ESSERE STANDARDIZZATI IFCC

1. Scegliere un metodo allineato IFCC

2. Effettuare la calibrazione in mmol/mol

3. Monitorare la precisione con un adeguato programma di CQI

4. Monitorare l’inesattezza con un adeguato programma di VEQ

5. Refertare in maniera appropriata

A. Mosca - UniMI 49

R. Paleari - UniMI 50

CQI USO ADEGUATO DEI DATI DEI PRODUTTORI DI DIAGNOSTICI

A. Mosca - UniMI 51

260 biochimica clinica, 2009, vol. 33, n. 4

DOCUMENTI SIBioC SIBioC DOCUMENTS

Raccomandazione 1

1. Il traguardo dell'errore totale è ±6,7% (espresso in

termini di frazione percentuale sul valore assoluto di

HbA1c).

2. L'imprecisione del metodo (CV), valutata sul lungo

periodo, deve essere contenuta entro il 2%.

3. La partecipazione a programmi di VEQ, nei quali

vengono utilizzati materiali commutabili e con valori

di HbA1c assegnati mediante il metodo di riferimento

IFCC, rappresenta il modo corretto per poter valuta-

re quanto le misure effettuate rispondano ai requisiti

di errore totale sopra definiti.

Refertazione della glicemia media calcolata in

base al valore di HbA1c

Concettualmente, poter convertire un valore di

HbA1c in un equivalente di glicemia media potrebbe

migliorare la comprensione e l'interpretazione del risul-

tato stesso dell'HbA1c. Uno studio clinico recentemente

concluso ha proposto di introdurre come parametro una

glicemia media stimata sulla base del risultato di HbA1c,

coniando l'acronimo eAG (“estimated Average

Glucose”) (13). Si ritiene, tuttavia, che tale studio soffra

di una serie di limitazioni, quali la mancata inclusione di

adolescenti, donne in gravidanza e pazienti nefropatici,

oltre a soggetti di origine asiatica. Inoltre, i limiti fiducia-

ri della eAG sarebbero così ampi da rendere l'utilizzo di

tale dato di scarso valore clinico. Infine, a differenza di

altri parametri di laboratorio calcolati (ad es. la velocità

di filtrazione glomerulare calcolata in base a concentra-

zioni di creatinina sierica, sesso ed età del soggetto,

oppure il LDL colesterolo calcolato da colesterolo totale,

colesterolo HDL e trigliceridi), la semplice trasformazio-

ne dell'HbA1c in eAG attraverso un'equazione che non

include altri parametri ma solo fattori numerici non

aggiunge alcuna informazione supplementare al dato

dell'HbA1c, che possa essere di utile supporto alla clini-

ca.

Raccomandazione 2

La refertazione della eAG sulla base dell'HbA1c,

attraverso l'equazione proposta a conclusione dello stu-

dio ADAG, è soggetta a troppe limitazioni perchè se ne

possa consigliare l'utilizzo sistematico.

Unità di misura e nuovi numeri per HbA1c

Il metodo di riferimento IFCC permette di misurare

direttamente e specificatamente la porzione dell'emoglo-

bina che è glicata, in particolare gli esapeptidi terminali

delle catene β dell'emoglobina. Come conseguenza

della precisa definizione dell'analita, è stata proposta l'in-

troduzione di una nuova unità di misura (mmol/mol)

essendo la precedente (%) non allineata con il Sistema

Internazionale di misura (SI) (14). L'adozione del nuovo

sistema di riferimento IFCC, oltre a comportare un cam-

bio di unità di misura, comporta quindi nuovi intervalli di

riferimento, quando confrontati con quelli attualmente in

uso:

- intervallo di riferimento (soggetti non diabetici) (risul-

tati allineati al DCCT): 4,0-6,0%;

- intervallo di riferimento (soggetti non diabetici) (risul-

tati allineati all'IFCC): 20-42 mmol/mol.

La relazione tra i due modi di espressione del risulta-

to è la seguente: HbA1c "allineata DCCT" (%) = 0,0915 x

HbA1c "allineata IFCC" (mmol/mol) + 2,15 (8). La relazio-

ne tra i valori della HbA1c, quando espressi nelle relative

unità di misura, viene esemplificata nella Tabella 1.

L'aspetto rilevante che va sottolineato è che la stan-

dardizzazione secondo il sistema di riferimento IFCC

riduce l'incertezza del risultato finale, perchè la succes-

siva trasformazione del risultato con l'equazione prima

menzionata introduce una ulteriore incertezza, che è

stata anche calcolata (15) e successivamente dimostra-

ta (16). Ad esempio, se un campione misurato col siste-

ma IFCC presenta un valore di HbA1c pari a 53 mmol/mol

ed a tale valore si associa una incertezza di 0,42

mmol/mol (pari allo 0,8%), la successiva trasformazione

in unità NGSP/DCCT aumenterà l'incertezza a 0,47

mmol/mol (pari allo 0,9%). L'aumento dell'incertezza è

piccolo, ma non trascurabile.

Un ulteriore vantaggio che deriva dall'utilizzo delle

unità di misura in mmol/mol è che si ottiene una amplifi-

cazione numerica di circa 10 volte e che quindi piccoli

cambiamenti dell'HbA1c dovrebbero risultare maggior-

mente identificabili.

Raccomandazione 3

1. L'HbA1c deve essere misurata con metodi calibrati al

sistema di riferimento IFCC.

2. Il risultato deve essere riportato in mmol/mol ed in

unità % derivate, usando l'equazione di conversione

sopra riportata.

3. Nel referto di laboratorio, per comodità degli utilizza-

tori, il valore di HbA1c sarà espresso, per un periodo

limitato di tempo, mediante le unità convenzionali (%)

seguite dalle unità IFCC (mmol/mol). Successiva-

mente, le unità convenzionali saranno abbandonate.

Tabella 1

Corrispondenza tra i valori della HbA1c allineati secondo il sistema

NGSP usato nello studio DCCT ed i valori standardizzati IFCC

Valori attuali(allineati al DCCT)

%

Valori nuovi(allineati all'IFCC)

mmol/mol

4 20

5 31

6 42

7 53

8 64

9 75

10 86

Bio-Rad Variant II, Dual Kit

Lyphochek Diabetes Control

Lot. 33730

Livello 1 media: 5,5 %

Livello 2 media: 9,6 %

CQI

CV = 1,6 %

CV = 1,3 %

A. Mosca - UniMI 53

CQI liofilo

sangue

-20 °C

-20 °C -80 °C

CV = 2,4 %

CV = 2,6 %

Cobas Integra 400 Braga et al, Biochimica clinica 2010;34:203-206

A. Mosca - UniMI 54

CQI – informazioni dai produttori

A. Mosca - UniMI

VEQ

A. Mosca - UniMI 55

260 biochimica clinica, 2009, vol. 33, n. 4

DOCUMENTI SIBioC SIBioC DOCUMENTS

Raccomandazione 1

1. Il traguardo dell'errore totale è ±6,7% (espresso in

termini di frazione percentuale sul valore assoluto di

HbA1c).

2. L'imprecisione del metodo (CV), valutata sul lungo

periodo, deve essere contenuta entro il 2%.

3. La partecipazione a programmi di VEQ, nei quali

vengono utilizzati materiali commutabili e con valori

di HbA1c assegnati mediante il metodo di riferimento

IFCC, rappresenta il modo corretto per poter valuta-

re quanto le misure effettuate rispondano ai requisiti

di errore totale sopra definiti.

Refertazione della glicemia media calcolata in

base al valore di HbA1c

Concettualmente, poter convertire un valore di

HbA1c in un equivalente di glicemia media potrebbe

migliorare la comprensione e l'interpretazione del risul-

tato stesso dell'HbA1c. Uno studio clinico recentemente

concluso ha proposto di introdurre come parametro una

glicemia media stimata sulla base del risultato di HbA1c,

coniando l'acronimo eAG (“estimated Average

Glucose”) (13). Si ritiene, tuttavia, che tale studio soffra

di una serie di limitazioni, quali la mancata inclusione di

adolescenti, donne in gravidanza e pazienti nefropatici,

oltre a soggetti di origine asiatica. Inoltre, i limiti fiducia-

ri della eAG sarebbero così ampi da rendere l'utilizzo di

tale dato di scarso valore clinico. Infine, a differenza di

altri parametri di laboratorio calcolati (ad es. la velocità

di filtrazione glomerulare calcolata in base a concentra-

zioni di creatinina sierica, sesso ed età del soggetto,

oppure il LDL colesterolo calcolato da colesterolo totale,

colesterolo HDL e trigliceridi), la semplice trasformazio-

ne dell'HbA1c in eAG attraverso un'equazione che non

include altri parametri ma solo fattori numerici non

aggiunge alcuna informazione supplementare al dato

dell'HbA1c, che possa essere di utile supporto alla clini-

ca.

Raccomandazione 2

La refertazione della eAG sulla base dell'HbA1c,

attraverso l'equazione proposta a conclusione dello stu-

dio ADAG, è soggetta a troppe limitazioni perchè se ne

possa consigliare l'utilizzo sistematico.

Unità di misura e nuovi numeri per HbA1c

Il metodo di riferimento IFCC permette di misurare

direttamente e specificatamente la porzione dell'emoglo-

bina che è glicata, in particolare gli esapeptidi terminali

delle catene β dell'emoglobina. Come conseguenza

della precisa definizione dell'analita, è stata proposta l'in-

troduzione di una nuova unità di misura (mmol/mol)

essendo la precedente (%) non allineata con il Sistema

Internazionale di misura (SI) (14). L'adozione del nuovo

sistema di riferimento IFCC, oltre a comportare un cam-

bio di unità di misura, comporta quindi nuovi intervalli di

riferimento, quando confrontati con quelli attualmente in

uso:

- intervallo di riferimento (soggetti non diabetici) (risul-

tati allineati al DCCT): 4,0-6,0%;

- intervallo di riferimento (soggetti non diabetici) (risul-

tati allineati all'IFCC): 20-42 mmol/mol.

La relazione tra i due modi di espressione del risulta-

to è la seguente: HbA1c "allineata DCCT" (%) = 0,0915 x

HbA1c "allineata IFCC" (mmol/mol) + 2,15 (8). La relazio-

ne tra i valori della HbA1c, quando espressi nelle relative

unità di misura, viene esemplificata nella Tabella 1.

L'aspetto rilevante che va sottolineato è che la stan-

dardizzazione secondo il sistema di riferimento IFCC

riduce l'incertezza del risultato finale, perchè la succes-

siva trasformazione del risultato con l'equazione prima

menzionata introduce una ulteriore incertezza, che è

stata anche calcolata (15) e successivamente dimostra-

ta (16). Ad esempio, se un campione misurato col siste-

ma IFCC presenta un valore di HbA1c pari a 53 mmol/mol

ed a tale valore si associa una incertezza di 0,42

mmol/mol (pari allo 0,8%), la successiva trasformazione

in unità NGSP/DCCT aumenterà l'incertezza a 0,47

mmol/mol (pari allo 0,9%). L'aumento dell'incertezza è

piccolo, ma non trascurabile.

Un ulteriore vantaggio che deriva dall'utilizzo delle

unità di misura in mmol/mol è che si ottiene una amplifi-

cazione numerica di circa 10 volte e che quindi piccoli

cambiamenti dell'HbA1c dovrebbero risultare maggior-

mente identificabili.

Raccomandazione 3

1. L'HbA1c deve essere misurata con metodi calibrati al

sistema di riferimento IFCC.

2. Il risultato deve essere riportato in mmol/mol ed in

unità % derivate, usando l'equazione di conversione

sopra riportata.

3. Nel referto di laboratorio, per comodità degli utilizza-

tori, il valore di HbA1c sarà espresso, per un periodo

limitato di tempo, mediante le unità convenzionali (%)

seguite dalle unità IFCC (mmol/mol). Successiva-

mente, le unità convenzionali saranno abbandonate.

Tabella 1

Corrispondenza tra i valori della HbA1c allineati secondo il sistema

NGSP usato nello studio DCCT ed i valori standardizzati IFCC

Valori attuali(allineati al DCCT)

%

Valori nuovi(allineati all'IFCC)

mmol/mol

4 20

5 31

6 42

7 53

8 64

9 75

10 86

R. Paleari - UniMI 56

Lenters-Westra et al, Diab Technol Therap 2011; 13:1-5

N = 220 labs 99 % within TE

EQAS FRESH WHOLE BLOOD

6.5

7.0 9.0 DCCT 1993

4.0-6.0

int. rif.

NGSP units, %

A. Mosca - UniMI 57

48

53 75

30

20 42

SI units, mmol/mol

A. Mosca - UniMI 58

Kilpatrick et al, Clin Chem 2013;59:1457-60

ANALYTICAL GOALS GA

CVI CVG Women 2.5 8.2 Men 1.4 11.2 All 2.1 10.6

Montagnana et al, 2013 in press A. Mosca - UniMI 6

1

ANALYTICAL GOALS GA

Desirable analytical goal for imprecision: CVa ≤1.1 %

Desirable analytical goal for bias: bias ≤ ±1.4 %

Desirable analytical goal for total error: TE ≤ ±6.1 %

Montagnana et al, 2013 in press A. Mosca - UniMI 6

2

CONTENUTI

1. I riferimenti

2. HbA1c e diagnosi del diabete

3. Gap di glicazione

4. Standardizzazione e compiti del

professionista di laboratorio

5. Conclusioni

A. Mosca - UniMI 63

Conclusioni 1. ≈50 % dei pazienti ha un diabete non diagnosticato

2. HbA1c utilissima per il pre-diabete

3. Molte variabili pre-analitiche, ma piccola variabilità biologica

4. Traguardi analitici per l’HbA1c e per l’albumina glicata allineati almeno agli standard minimi basati sulla variabilità biologica

5. Necessità di applicare bene le raccomandazioni del documento di consenso in collaborazione tra team diabetologici, professionisti di laboratorio, medici di medicina generale, operatori sanitari, agenzie del SSN (tutti gli stakeholders)

64

A.

Mo

sca -

Un

iMI

A. Mosca - UniMI 65