1

ENCIMSKA KINETIKA

• pridobitev informacij o delovanju nekega encima

• vpogled v vlogo encima pod pogoji, ki so v celici

• omogoča razlago, kako je lahko encim kontroliran

pridobivanje kinetičnih podatkov

• tvorba P (produkta)

• izginevanje S (substrata)

• specifični pogoji (S, pH, T, ligandi)• teoretični model

1 2A B Cv v⎯⎯→ ⎯⎯→

glukoza+ATP glukoza-6-fosfat + ADPheksokinaza⎯⎯⎯⎯→

• sprememba absorpcije pri določeni valovni dolžini• vezana reakcija

• pH-stat

6oks redglukoza-6-fosfat + NAD 6-fosfoglukonat + NADglukoza fosfat dehidrogenaza− − −⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯→

[ ][ ]

2

2

max2

m

BB

Vv

K=

+

diskontuirna metodakontinuirna metoda

2

ocenitev začetne hitrosti reakcije

ravnost progresivne krivulje

vpliv E

vpliv S

P

t

pogoji dela

• čistost reaktantov, pufrov• brez encimskih kontaminacij• E mora biti stabilen tekom reakcije• delo v stabilnih pogojih• merjenje začetnih hitrosti reakcij• analiza kinetičnih podatkov

REAKCIJE Z ENIM SUBSTRATOM

1 2

-1E + S ES E + Pk k

k⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯

[ ][ ][ ] [ ] [ ][ ]E S E S

ESESS

S

KK

= ⇒ =

2 1k k−

[ ] [ ] [ ]E E ESt

= −

[ ][ ] [ ]{ }[ ]

[ ] [ ] [ ][ ]S S

E ES S E SES ES

St t

K K

−= ⇒ =

+

[ ] [ ] [ ][ ]

2 t2

S

E SES

Sk

v kK

= =+

1. pristop hitre vzpostavitve ravnotežja (Henri 1902, Michaelis Menten 1913)

S E

[ ] [ ] [ ]S S ESt

= −

[ ][ ]

max

S

SS

Vv

K=

+

3

2. pristop dinamičnega ravnotežjaBriggs-Haldane, 1925

[ ] [ ] [ ]{ }[ ] [ ] [ ]1 1 2E ES S ES ESt

d ESk k k

dt −= − − −

[ ] [ ] [ ][ ]

1 t

1 2 1

E SES

Sk

k k k−

=+ +

[ ] [ ][ ]

[ ] [ ]

[ ]1 2 2t t

1 2 1 1 2

1

E S E SS

S

k k kv

k k k k kk

− −

= =+ + ⎡ ⎤+

+⎢ ⎥⎣ ⎦

[ ][ ]

max

m

SS

Vv

K=

+

1 2

-1E+S ES E+Pk k

k⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯

[ ] [ ]{ }[ ] [ ] [ ]1 1 2E ES S ES ES 0t

k k k−− − − =

[ ]max 2 tEV k=

1 2m

1

k k Kk

− +=

ES

tstanje predravnotežjem

dinamično ravnotežje

[ ]2 ESv k=

[ ][ ]

max

m

SS

Vv

K=

+V

V/2

Km

[S]

υ

obdelava podatkov

[ ]m

max max

1 1 1S

Kv V V= −

Lineweaver -Burk1/v

-1/Km 1/Vmax

1/[S]

naklon=-Km/ Vmax

[ ] [ ] m

max max

S S Kv V V

= +

Hanes-Woolf

-Km

[S]

[S]/vnaklon=1/Vmax

Km/Vmax

[ ]max

m mSVv vK K

= −

Eadie-Hofstee v

naklon=-Km

Vmax/Km

v/[S]

Vmax

4

direktni linearni grafEisenthal in Cornish Bowden

[ ]max mSvV v K= +

Km

Vmax

v1

-[S]1

V*

Km*-[S]1-[S]2-[S]3-[S]4-[S]5

υ1

υ2

υ3

υ4

υ5

V

Km

porazdelitev napakV

V/2

Km

[S]

υ

porazdelitev napak

Eadie-HofsteeLineweaver-Burk

-1/Km

1/V

naklon = Km/V

0 1/[S]

1/υ

V

V/Km

0

naklon = -Km

υ/[S]

υ

5

Hanes-Woolf

porazdelitev napak

direktni linearni grafEisenthal in Cornish Bowden

-Km

Km/Vnaklon = 1/V

0 [S]

[S]/ υ

V

V*

Km*

srednja vrednost

Km

pomen MM parametrov

• kcat katalitična konstanta, pretvorbeno število [s-1]

• Km konstanta afinitete [µM]

• kcat/Km merilo encimske učinkovitosti ali konstanta specifičnosti [M-1s-1]

heksokinazi IV in I-III

100

50

hitrost kot % maksimalne hitrosti

[D-glukoza] (mM)post sitost

izoencim I-III Km=40 µM

izoencim IV Km=10 mM

5 103 9

6

8,0004.032.0Suc-Lys-Pro-Phe-pNA

66,0000.149.2Suc-Glu-Pro-Phe-pNA

120,0000.3137.0Suc-Leu-Pro-Phe-pNA

230,0000.1125.0Suc-Met-Pro-Phe-pNA

13,0000.0720.9Suc-Phe-Glu-Phe-pNA

90,0000.2018.0Suc-Phe-Lys-Phe-pNA

140,0000.1217.0Suc-Phe-Pro-Phe-pNA

310,0000.05417.0Suc-Phe-Leu-Phe-pNA

9,4000.535.0Suc-Val-Pro-Met-pNA

23,0000.245.6Suc-Val-Pro-Trp-pNA

65,0000.0845.5Suc-Val-Pro-Tyr-pNA

480,0000.1257.0Suc-Val-Pro-Phe-pNA

Kcat/Km (m-1s-1)Km (mM)kcat (s-1)P4 P3 P2 P1

kinetični parametrisubstrat

P4 P3 P2 P1 P’1 P’2 P’3 P’4S4 S3 S2 S1 S’1 S’2 S’3 S’4

substratencim

H2N COOH

IREVERZIBILNA INHIBICIJAi 2

Ea-EI I EI

E + I EI E 'K k

⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦

⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯

[ ] [ ][ ]2

i

IEI

IV

v kK

= =+

[ ][ ]

2nav

i

II

kk

K=

+

knav

[I]

[ ][ ][ ]i

Ea-EI IEI

K =

razred inhibitorja I/E razmerje E+I EI

klasični inhibitorji I››E hitroms

inhibitorji s tesno vezavo I~E in Ki hitro

inhibitorji s počasno vezavo I››E počasis,min

inhibitorji s počasno in tesno vezavo I~E in Ki počasi

klasični inhibitorji

P

t

inhibitorji s počasno vezavoP

t

7

REVERZIBILNA INHIBICIJA

1. kompetitivna inhibicija

2. mešana inhibicija

3. nekompetitivna inhibicija

substrat

kompetitivniinhibitor

substratnekompetitivniinhibitor

1. kompetitivna inhibicija[ ][ ][ ]ic

E IEI

K = [ ][ ] [ ]m

ic

SI

1 S

Vv

KK

⋅=

⎛ ⎞+ +⎜ ⎟

⎝ ⎠

navV V=

EI

S + E+I

ES E + P

Kic

KS k2

[ ]mm nav

ic

I1KK

K⎛ ⎞

= +⎜ ⎟⎝ ⎠

[ ]nav

m nav

m

ic

I1

VK

VK

K

=+

[I] = 0

[I] = 2Kic

V

V/2

Km Km nav

inhibitor vpliva samo na Km

[S]

υ

2. nekompetitivna inhibicija

[ ]i

nav

u

I1

VV

K

=+

nav

m n mav

VK

VK

=

[ ]m navm

iu

I1

KK

K

=+

S + E ES E + PKS k2

Kiu

ESI

+I

[ ] [ ]

[ ] [ ]iu

m

iu

1

1

V SI

Kv K SI

K

+=

++

V

Vi

Vi/2

V/2

KmKm nav

[I] = 0

[I] = 2Ki

inhibitor vpliva naV and Km

[S]

υ

8

3. mešana inhibicija

[ ]i

nav

u

I1

VV

K

=+

[ ] [ ]

[ ]

[ ] [ ]

iu

icm

iu

1

1

1

V SI

KvI

KK SI

K

+=

++

+

[ ]nav

m nav

m

ic

I1

VK

VK

K

=+

[ ]

[ ]

mic

i

av

u

m n

I1

I1

KK

K

K

⎛ ⎞+⎜ ⎟

⎝ ⎠=+

EI

S + E+I

ES E + P

Kic

KS k2

Kiu

EIS

+I

[I] = 0

[I] = 4Ki

V

Vi

Vi/2

V/2

KmKm nav

inhibitor vpliva naV and Km

[S]

υ

Dixon Cornish-Bowden

9

encimska aktivacija

S + EX

E

ESX EX + P

Kx

k’1 k’2

X+

k’-1

[ ]x

m

'S

' 1 SX

VvKK

=⎛ ⎞+ +⎜ ⎟⎜ ⎟

⎝ ⎠

inhibitorni vpliv substrataneproduktivna vezava substratna inhibicija

SE

S + E+S

ES E + P

Ki

K k2S + E ES E + P

K k2

Ksi

SES

+Sv

[S]

VPLIV OKOLJA NA ENCIME

pH– Km– V– kcat

T

10

ionizacijske skupine v proteinihvrsta skupine pKa lastnosti pri pH 7.0

C-konec karboksilna 3.4 bazičnaaspartat karboksilna 4.1 bazičnaglutamat karboksilna 4.5 bazičnahistidin imidazolna 6.3 pretežno bazičnaN-konec amonijeva 7.3 pretežno kislacistein tiolna 8.3 kislatirozin fenolna 9.6 kislalizin amonijeva 10.4 kislaarginin gvanidinjeva >12 /

pKa vrednosti so povprečne vrednosti pri 25oC v proteinskem okolju

vpliv na maksimalno hitrostena ionizirajoča skupina

+ +EH E+H⎯⎯→←⎯⎯

+ ++

a +a

E H E H= EH =

EHK

K

⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦⎡ ⎤⇒ ⎣ ⎦⎡ ⎤⎣ ⎦

EH+ neaktivna oblikaE aktivna oblika

a+

a

E=

E EH HKF

K +

⎡ ⎤⎣ ⎦ =⎡ ⎤ ⎡ ⎤ ⎡ ⎤+ +⎣ ⎦ ⎣ ⎦ ⎣ ⎦

a

a

'H

KV VK +

=⎡ ⎤+ ⎣ ⎦

vpliv na maksimalno hitrostdve ionizirajoči skupini

2

1

'H

1H

a

a

VVK

K

+

+

=⎡ ⎤⎣ ⎦+ +

⎡ ⎤⎣ ⎦

E

HX YH

neaktiven

E

HX Y-

aktiven

E

X- Y-

neaktiven

-H+

+H+

pKa1

-H+

+H+

pKa2

11

obdelava podatkov ena ionizirajoča skupina

'H

a

a

KV VK +

=⎡ ⎤+ ⎣ ⎦

[H+]>>Ka 'H

aKV V+

=⎡ ⎤⎣ ⎦

log log ' p pHaV V K= − +

[H+] <<Ka 'V V=

logV

pH

pKa

1

0

obdelava podatkov dve ionizirajoči skupini

2

1

'H

1H

a

a

VVK

K

+

+

=⎡ ⎤⎣ ⎦+ +

⎡ ⎤⎣ ⎦

Ka1<<[H+] >>Ka2[H+]>>Ka1

1 0

[H+] <<Ka2

-1

logV

pH

pKa1

1

0

-1

pKa2

encim z dvema disociacijskima skupinamaH2E

A + HE- HEA- HE- + P

KE1

k2

KEA1

H2EA

E2-

KE2

k1

k-1

KEA2

EA2-

logV

pH

pKEA1 pKEA2

pH

log(

V/K M

) pKE1 pKE2

pH

logK

M

pKEA1pKEA2

pKE1

pKE2

EA2

EA1

'

1

VV h KK h

=+ +

m

E2m

E1

''

1

VV K

h KKK h

=+ +

E2

E1m m

EA2

EA1

1'

1

h KK h

K K h KK h

⎛ ⎞+ +⎜ ⎟

⎝ ⎠=+ +

12

pH odvisnost kcat/Km za pepsinkatalizirano hidrolizo

acetil-L-fenil-alanil-L-fenilalanilglicina (1.1 in 3.5)

acetil-Lfenil-alanil-L-fenilalanilamida(1.05 in 4.75)

pH

240

160

80

0

320

1 2 3 4 5

pK1 pK2

k cat

/Km

(M-1s-

1 )

pH

25

20

10

5

0

15

1 2 3 4 5

pK1 pK2

k cat

/Km

(M-1s-

1 )

ionizacija substrata

vpliv temperature

a- R= e E Tk Ak hitrostna konstantaA faktorR plinska konstantaT Ea aktivacijska energija

aln lnT

Ek AR

= −

1/T

lnk

-Ea/2.3R

Arrheniusova enačba

temperaturna odvisnost encimsko katalizirane reakcije

[ ][ ]E S1

kv

K=

+

0' 0' 0'T ln TR K G H S− = ∆ = ∆ − ∆E’

S + E E + P

K

k

[ ][ ]E Sopazv k=0 ' 0 '

T

T

e

1 e

aER

opaz S HR R

Ak−

⎛ ⎞∆ ∆+⎜ ⎟⎜ ⎟

⎝ ⎠

=

+

0 ' 0 '

TeS HR RK

⎛ ⎞∆ ∆+⎜ ⎟⎜ ⎟

⎝ ⎠=

a- R= e E Tk A

13

ln vizguba aktivnosti oblika z nižjo Ea

oblika z višjo Ea

1/T

ln v izguba aktivnosti povečevanje

hitrosti

1/T

izguba katalitične aktivnosti vsled povišanja T

vključena ena oblika encima

vključeni dve obliki encima

Arrheniusov graf

REAKCIJE Z DVEMA SUBSTRATOMA

• reakcije v katerih se tvori trojni kompleks– kompleks, ki nastane po urejeni poti– kompleks, ki nastane po naključju

• reakcije, ki sledijo encimski substituciji(ping-pong mehanizem)

14

trojni kompleks, ki nastane po urejeni poti

E + A + B → E + P + QE + A + B → EAB →EPQ → E + P + Q

E + A → EA E + B → EBEA + B → EAB

E

A

EA

k1 k-1

EAB

B

k-2k2

k-3

k3 EQ

P

k4 k-4

E

Q

k-5k5

EPQ

trojni kompleks, ki nastane po naključju

E + A → EA ali E + B → EBEA + B → EAB EB + A → EAB

EA

EEPQ EAB

B

A

E

A

B

EB EQ

EP

P

Q

Q

P

substitucijski mehanizem (ping-pong)

E + A → E’ + PE’ + B → E + Q

P

E

A

(EA E’P) E’

B

(EB EQ) E

Q

15

trojni kompleks po urejeni poti

trojni kompleks po naključni poti

substitucijski mehanizem

opis sistemov[ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ]A B B A

A B' A B A B

Vv

K K K K=

+ + +trojni kompleks

substitucijski mehanizem[ ][ ]

[ ] [ ] [ ][ ]B A

A BA B A B

Vv

K K=

+ +

KA, KB sta KM za substrata A in BK’A disociacijska konstanta k-1/k1

E

EA

EB

EAB E+P

K’A

K’BKB

KA

16

poenostavitev enačbe

[ ]

[ ][ ]

[ ] [ ]

[ ][ ]B AA B

A

A AA A' A

B B

V Vv

K KK K K= =

++ + +

[ ][ ]B

BB

Vv

K=

+

obdelava podatkov – trojni kompleks

[ ][ ][ ] [ ] [ ][ ]A B B A

A B' A B A B

Vv

K K K K=

+ + +

[ ][ ] [ ]

[ ][ ] [ ]

[ ][ ]

nav

B

A B A m

B

BA

B A' B A

AB

nav

VK V

vK K K K

K

⎛ ⎞⎜ ⎟⎜ ⎟+⎝ ⎠= =

+ ++

+

[ ][ ]B

BBnav

VV

K=

+

[ ][ ]nav

A B Am

B

' BB

K K KK

K+

=+

( )[ ]

( ) [ ]nav

A

A BmA

B

' Bnav

VKV

K KKK

=+

obdelava podatkov – trojni kompleks

[ ] [ ] [ ][ ]A B A B1 ' 11

A B A BK K K K

v V⎡ ⎤

= + + +⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦linearizacija enačbe

[ ]A B

A1 '

BK Knaklon K

V⎡ ⎤

+⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦

[ ]B1 1

BKpresečišče na y osi

V⎡ ⎤+⎢ ⎥

⎢ ⎥⎣ ⎦

[ ]

[ ]

B

A BA

1B

'B

K

presečišče na x osi K KK

+

+

primarni graf

[ ]1A

1v

[ ]B

A

1K

−

17

obdelava podatkov – trojni kompleks

[ ]B 1

BKpresečišče y

⎡ ⎤= +⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦

sekundarni graf

[ ]1B

AKV

nakloni A B' K KnaklonV

A

A B'K

K K−

presečišče y

B

1K

−[ ]1B

B KnaklonV

[ ]A B

A1 '

BK Knaklon K

V⎡ ⎤

= +⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦

1V

obdelava podatkov – mehanizem substitucije

[ ] [ ]A B1 11

A BK K

v V⎡ ⎤

= + +⎢ ⎥⎢ ⎥⎣ ⎦

linearizacija enačbe

primarni graf

A KnaklonV

[ ]B1 1

BK

V⎛ ⎞+⎜ ⎟⎜ ⎟

⎝ ⎠

[ ]B

A

1 1B

KK

⎡ ⎤− +⎢ ⎥

⎢ ⎥⎣ ⎦

1v

[ ]1A

[ ]B

obdelava podatkov – mehanizem substitucije

sekundarni graf

[ ]1B

1V

B KnaklonV

B

1K

−

presečišče y

18

IUBMB

[ ] [ ] [ ][ ]0 1 2 12

0 A B A Bev

Θ Θ Θ= Θ + + +

00

eV

Θ =

0 A1

e KV

Θ =

0 B2

e KV

Θ =

0 A B12

'e K KV

Θ =

kompetitivnakompetitivnaQ

kompetitivnakompetitivnaPnaključenBi-Bi

mešanakompetitivnaQ

mešanamešanaPurejenBi-Bi

B variraA variraprodukt kot inhibitor

laktat dehidrogenaza+ +L-laktat + NAD piruvat + NADH + H⎯⎯⎯⎯⎯⎯→←⎯⎯⎯⎯⎯⎯

+ +L-malat + NAD oksalacetat + NADH + H⎯⎯→←⎯⎯

[ ][ ][ ] +

oksalacetat NADH

L-malat NAD⎡ ⎤⎣ ⎦

+ ++ NAD NAD NADH NADHmalat oksalacetatE + NAD E E E E E + NADH⎯⎯→ ⎯⎯→ ⎯⎯→ ⎯⎯→←⎯⎯ ←⎯⎯ ←⎯⎯ ⎯ ←⎯⎯⎯→←⎯⎯

19

konformacijske spremembe makromolekul

encimsko katalizirane reakcije

10-12

ps10-9

ns10310-6

µs 1min10-3

ms1s 1h

reakcije prenosa protona

reakcije prenosa elektronov

ultrazvočna metoda

temperaturni preskok

preskok v pritisku

ustavljen pretok

ugasnjena reakcija

ravnotežne reakcije

relaksacijske metode

pretočne metode

20

nitrogenazaA420

t20 ms

0.02

t (ms)50 100 150 200

sproščanje fosfata (nmol)

8

4