Identification biochimiquedes espèces

d’ Entérobactéries

Mme KAIDI A.

Le test est surtout utilisé pour différencier entre les différents groupes genres et espèces des Enterobacteriaceae

Le but de ce test est de mettre en évidence cinq caractères :

La fermentation du glucose, La fermentation du saccharose La fermentation du lactoseLa production de gazLa production de sulfure d’hydrogène (H2S) à partir

du thiosulfate dans un environnement acide

La fermentation du glucose seul montrera un virage de la couleur au jaune du culot

Celle du saccharose et du lactose se manifestera par un virage de la couleur au jaune du culot et la pente

La production d’H2S conduira au noircissement du milieu

Recherche de l’utilisation du Glucose, saccharose et lactose, production de gaz et H2S sur milieu Triple Sugar Iron Agar (TSI)

Triple Sugar Iron Agar (TSI 1)

       

1

       

2

       

3

       

4

       

5

1 : Milieu non inoculé

2 : G+, S+, L+, Gaz+, H2S- : Klebsiella

3 : G+, S+, L+, Gaz-, H2S- Yersinia enteocolitica (18h)

4 : G+, S+, L+, Gaz-, H2S- Yersinia enteocolitica (48h)

5 : G+, S+, L+, Gaz+, H2S+ Citrobacter

6 : G+, S+, L+, H2S+, Gaz- Erysipelothrix rhusiopathiae Fermente faiblement le lactose

       

6

Triple Sugar Iron Agar (TSI 2)

       

1

       

2

       

3

       

4

       

5

1 : Milieu non inoculé

2 : G+, S+, L+ (alcalinisation), Gaz+,H2S+: Salmonella 18h 3 : G+, S+, L+, Gaz+, H2S+ Salmonella (48h)

4 : G+, S+, L+,(alcalinisation) Gaz+, H2S+ : Proteus 18h

5 : G+, S+, L+, Gaz+, H2S+ Proteus (48h)

Triple Sugar Iron Agar (TSI 3)

       

1

       

2

       

3

       

4

1 : Milieu non inoculé

2 : Attaque des sucres par voie oxydative (alcalinisation), Pseudomonas fluorescens 3 : Alcalinisation : Alcaligenes

4 : Alcalinisation production d’H2S Shewanella

Le but de cette recherche est la mise en évidence de la fermentation d’un sucre spécifique avec la production de gaz qui est récupéré dans une cloche de Durham. La fermentation du sucre aboutit à l’acidification se traduisant par le virage de l’indicateur de pH du bleu au jaune

Fermentation des Carbohydrates avec production de gaz

       

1

       

2

       

3

Fermentation des Carbohydrates avec production de gaz

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Escherichia coli 3 : Réaction négative Shigella (Acidification Glucose)

Test de l’Oxydation-Fermentation

Le but de ce test est de mettre en évidence l’attaque du sucre par voie fermentative ou oxydative

Deux tubes contenant le milieu Hugh et Leifson sont utilisés:

Ce milieu donne deux résultats : Le type respiratoire et la

Mobilité

Tube 1 : avec vaseline stérileTube 2 : sans vaseline

S’il y a oxydation, production d’acide dans le tube 2 S’il y a fermentation, production d’acide dans les tubes

1 et 2

Les bactéries aérobies peuvent transformer les peptones en

ammoniaque, entraînant une alcalinité dans la partie

supérieure du tube 2 (bleue)

       

1

       

2

       

3

       

4

       

5

Test de l’Oxydation-Fermentation

1 : Milieu non inoculé

2 + 3 : Fermentation avec gaz dans le tube fermé : Escherichia coli Mob+

4 + 5 : Fermentation avec gaz dans le tube fermé : Klebsiella Mob-

       

1

       

2

       

3

       

4

       

5

Test de l’Oxydation-Fermentation

1 : Milieu non inoculé

2 + 3 : Oxydation Pseudomonas fluorescens

4 + 5 : Réaction négative avec alcalinisation à la surface du tube ouvert Alcaligenes

Test de la mobilité

Le but de ce test est de déterminer si les bactéries sont mobiles à une température donnée

Le milieu utilisé est semi solide : Mannitol Mobilité

Sur ce milieu on peut avoir deux résultats distincts :

La mobilitéLa fermentation du mannitol

La mobilité se caractérise par une migration des bactéries de la piqûre centrale vers le reste du milieu entraînant ainsi une turbidité

La fermentation du mannitol se traduit par un virage de la couleur rouge au jaune

       

1

       

2

       

3

       

4

Test de la mobilité

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive : Shewanella

3 : Réaction négative : Acinetobacter

4 : Réaction négative : Klebsiella

Ce test permet de déterminer si la bactérie réduit les nitrates en nitrites ou en azote. Cette recherche peut être réalisée sur les milieux :

Mannitol mobilité Bouillon Nitrate

Après incubation, deux réactifs sont rajoutés NRI (acide sulfanilique) et NRII (alpha naphtol).

Les nitrates ont été réduits en nitrites, il y a formation de diazonium, donnant une coloration rouge au milieu

Le nitrate n’a pas été réduit en nitrite, aucune coloration n’est observée

Le nitrate a été réduit mais a un stade encore plus avancé (stade azote)Une pincée de poudre de zinc est ajoutée ce qui lui permetde réduire les nitrates du bouillon en nitrite aboutissant àla formation du diazonium donc à la coloration rougeSi la bactérie a réduit les nitrates en azote libre, aucunchangement de couleur ne sera observé

Recherche de la Nitrate réductase

       

1

       

2

       

3

       

4

Recherche de la Nitrate réductase

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive : Escherichia coli

3 : Réaction négative : Acinetobacter

4 : Réaction négative après addition de poudre de zinc Acinetobacter

Recherche de l’uréase

Le but de la recherche est dedéterminer la présence d’une

uréase chez la bactérie.

L’uréase scinde l’urée en ammoniaque et oxyde carbonique sur mileux :

Urée-Indole De Christensen

       

1

       

2

       

3

Recherche de l’uréase

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Proteus 3 : Réaction négative Salmonella (Acidification Glucose)

Ce test est utilisé pour déterminer la production d’indole à partir du tryptophane

Le milieu utilisé : Milieu Urée-Indole

Après incubation, quelques gouttes du

réactif de Kovacs sont ajoutées. Laformation d’un anneau rouge

indique laprésence de l’indole

Recherche de la production d’indole

Recherche de la production d’indole

       

1

       

2

       

3

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Escherichia coli 3 : Réaction négative Salmonella

Recherche des Décarboxylases

Ce test est utilisé pour mettre en évidence la décarboxylation d’un acide aminé se traduisant par la formation d’un amine. Pour chaque réaction il est nécessaire de prévoire un témoin. Le milieu utilisé est :

Moeller avec acide aminé (lysine, ornithine, arginine)Moeller témoin (sans acide aminé)

Après ensemencement des tubes avec AA et tubes témoins, une

couche de vaseline stérile est ajoutée. Les résultats donnent :

Tube AA Jaune et tube témoin jaune : Pas de décarboxylase

Tube AA Violet et tube témoin jaune : DécarboxylaseTube AA violet et tube témoin violet

Recherche des Décarboxylases

1 2 53 4

1 : Milieu non inoculé

2 : Tube témoin : jaune

3 : Réaction positive LDC+ Salmonella

4 : Réaction positive LDC+ Klebsiella

5 : Réaction négative LDC- Citrobacter

Hydrolyse de la gélatine

Ce test est utilisé pour la mise en évidence de

la présence de la gélatinase chez une bactérie.

Après incubation, la boite de pétri est inondée

d’acide sulpho-salycilique, une zone claire

apparaissant sur la raie d’ensemencement

indiquerait l’hydrolyse de la gélatine

Aeromonas hydrophila sur gélose à la gélatine avant innondation avec l’acide sulphosalicylique

Réaction positive

Hydrolyse de la gélatine

Le but de ce test est de déterminer la présence de l’enzyme Béta-galactosidase à travers l’utilisation du substrat O-Nitrophényl-béta-D-galactopyranoside (ONPG)

L’ONPG est hydrolysé par l’enzyme en :

O-nitrophénol (jaune) Galactose

Recherche de la Béta-galactosidase

       

1

       

2

       

3

Recherche de la Béta-galactosidase

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Citrobacter 3 : Réaction négative Salmonella

Ce test permet de démontrer si la bactérie est capable de maintenir les acides issus de la fermentation du glucose malgré la présence de tampon dans le milieu Clarks et Lubbs

Après incubation, le réactif rouge de méthyle est ajouté

Test du Rouge de Méthyle

       

1

       

2

       

3

Test du Rouge de Méthyle

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Salmonella 3 : Réaction négative Klebsiella

Le but de ce test est de mettre en évidence la production de l’acétyl-méthyl-carbinol (acétoïne) à partir de la fermentation du glucose.

La recherche de l’acétoïne se fait sur milieu Clark et LubbsAprès incubation, deux réactifs sont additionnés :

Alpha-naphtol (VPI)

Hydroxyde de potassium (VPII)

La présence de l’acétoïne se traduit par un virage du milieu au rose rougeâtre

Recherche de l’acétoïne (Voges-Proskauer)

       

1

       

2

       

3

Recherche de l’acétoïne (Voges-Proskauer)

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Klebsiella 3 : Réaction négative Escherichia coli

Le but de ce test est de déterminer la croissance de la bactérie avec le citrate comme seule source de carbone.L’utilisation de ce substrat aboutit à l’alcalinisation du milieu qui vire du vert au bleu

Recherche de l’utilisation du citrate

       

1

       

2

       

3

Recherche de l’utilisation du citrate

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Klebsiella 3 : Réaction négative Escherichia coli

Hydrolyse de l’esculine

Ce test est utilisé pour déterminer l’hydrolyse d’un glycoside Esculine en esculétine et glucose

L’esculétine réagit avec le citrate férrique contenu dans la gélose à l’esculine formant un complexe phénolique de couleur brune

.

Hydrolyse de l’esculine

1 2

1 : Milieu non inoculé

2 : Réaction positive Enterococcus faecalis