하이라이트

440 … NICE, 제37권 제4호, 2019

1. 서론

분자진단(molecular diagnostics)은 인류의 건강, 식

품, 환경 등의 분야에서 매우 중요하다. 핵산(nucleic

acid, DNA 또는 RNA)은 이러한 분자진단의 주요

표적으로 이용되어 왔다. 특히 전염성 질병의 신속

한 진단은 전세계적으로 빠르게 확산되고 있는 바

이러스에 의한 감염병의 통제를 위해 매우 중요하

다. 2019년 초 나이지리아에서 바이러스성 급성출

혈열인 ‘라사열(Lassa Fever)’이 유행하면서 69명의

목숨을 앗아갔다. 라사열의 확산을 막기 위해 나이

지리아 과학자들은 제3세대 유전자가위인 ‘크리스

퍼(CRISPR-Cas)’를 이용하여 발병 초기에 라사열

을 진단할 수 있는 기술을 개발하고 있다. 온두라

스는 뎅기 바이러스(Dengue virus)와 지카 바이러스

(Zika virus), 암을 유발하는 인유두종 바이러스(HPV,

human papillomavirus)을 진단하기 위해 크리스퍼 유

전자가위 기술을 이용하고 있다. 또한 콩고에서는

에볼라 바이러스(Ebola virus)를 진단하기 위해 크리

스퍼 유전자가위 기술을 적용할 예정이다. 이처럼

최근 크리스퍼 유전자가위 기술은 전세계적으로 각

광받고 있는 유전체 교정 분야를 벗어나 질병의 진

단 분야에 빠르게 적용되기 시작했다.

이상적인 분자진단 검사는 전문 지식, 기술, 보조

장비, 전원 등을 필요로 하지 않으면서 현장에서 다

양한 시료에 저렴한 비용으로 적용가능 해야 하며,

정확하고 빠른 결과를 제공할 수 있어야 한다. 최근

차세대 분자진단을 위한 크리스퍼 유전자가위 기술, 셜록 홈즈

(Next-generation diagnostics with CRISPR, SHERLOCK HOLMES)

이 대 희

한국생명공학연구원 합성생물학전문연구단

dhlee@kribb.re.kr

그림 1. 크리스퍼 유전자가위를 이용한 차세대 분자진단 기술의 개발(참고문헌 [3]에서 발췌 및 수정).

하이라이트

NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 37, No. 4, 2019 … 441

분자진단에 본격적으로 이용되기 시작한 크리스퍼

유전자가위 기술이 이상적인 차세대 분자진단법을

개발하는 데 중요한 역할을 할 것으로 기대하고 있

다. 과학자들은 이미 지난 2010년부터 크리스퍼 유전

자가위 기술이 질병을 유발하는 바이러스를 검출할

수 있다는 사실을 보고하였다[1]. 그러나 2012년 크

리스퍼 유전자가위가 유전체 편집을 혁신할 수 있다

는 논문이 발표되자[2], 바이러스를 검출하려는 초기

의 시도들이 그늘에 가려 빛을 보지 못했다. 그러나

앞서 언급한 것처럼 크리스퍼 유전자가위를 각색하

여 새로운 질병의 진단기술로 개발하려는 노력이 최

근 유전체 편집만큼 주목받고 있다.

제3세대 유전자가위 기술은 미생물의 적응 면

역(adaptive immunity)의 일종인 크리스퍼(CRISPR,

Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic

Repeats)-크리스퍼 단백질(Cas, CRISPR-associated)

시스템에서 유래했다. 크리스퍼 유전자가위

(CRISPR-Cas)는 바이러스 감염 시 숙주 세포 게놈

에 바이러스 DNA 일부를 저장하고, 이 저장된 DNA

서열로부터 crRNA(CRISPR RNA)를 발현하여 특정

한 크리스퍼 단백질과 결합한 후 바이러스 DNA 혹

은 RNA를 파괴하는 시스템으로 박테리아가 바이러

스의 침입으로부터 스스로를 보호하기 위해 진화시

킨 면역시스템이다. 크리스퍼 유전자가위를 기반으

로 한 분자진단기술 개발의 간단한 역사를 그림 1에

나타내었다[3]. 크리스퍼 유전자가위가 분자진단에

최초로 사용된 것은 크리스퍼 유전자가위기술 개발

의 선구자 중 한 명인 미국 MIT의 Feng Zhang 교수

가 개발하여 2017년 사이언스(Science) 저널을 통해

발표한 셜록(SHERLOCK, Specific High-sensitivity

Enzymatic Reporter unLOCKing) 기술이다[4]. 이후

빠른 속도로 크리스퍼 유전자가위 기반 분자진단 기

술이 개발되어 홈즈(HOLMES)[5], 셜록2[6], 허드슨-

셜록(HUDSON-SHERLOCK)[7], 디텍터(DETECTR)

[8], 홈즈2(HOLMESv2)[9] 등의 개발로 이어졌다.

본 기고에서는 2017년부터 본격적으로 개발되기

시작한 크리스퍼 유전자가위를 이용한 차세대 분자

진단 기술의 연구동향을 셜록과 홈즈를 중심으로 소

개하고자 한다.

2. 본론

2-1. 크리스퍼 유전자가위 기반 차세대 분자진단

크리스퍼 유전자가위를 이용한 차세대 분자진단

기술의 개발은 크게 신호 증폭(signal amplification),

신호 변환(signal transducing), 신호 발생(signal

reporting)으로 구성되어 있다. 신호 증폭을 위해 주

로 사용되는 기술은 RPA(recombinase polymerase

amplification)이며, 신호 변환을 위해서는 크리스퍼

유전자가위 기술이 이용된다. 신호 발생을 위해서는

다양한 형광 단백질들이 많이 이용되고 있다. 또한

현장 적용성을 높이기 위해 시료에서 핵산을 추출

할 필요없이 바로 분자진단에 이용할 수 있게 해주

는 허드슨(HUDSON, Heating Unextracted Diagnostic

Samples to Obliterate Nucleases)도 개발되어 이용되고

있다(그림 2)[10].

2-2. 셜록(SHERLOCK)

그림 2. 크리스퍼 유전자가위를 이용한 차세대 분자진단 기술의 주요 과정 및 핵심 기술[10].

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442 … NICE, 제37권 제4호, 2019

크리스퍼 유전자가위가 유전체 편집에 사용될 때

가장 문제가 되는 것은 비표적(off-target)이다. 원하

는 위치가 아닌 곳에서 편집된 유전체는 원치 않는

결과를 초래할 위험성이 있기 때문이다. 하지만 셜록

은 이러한 크리스퍼 유전자가위의 단점인 비표적을

이용하여 개발되었다. 즉, 셜록은 크리스퍼 단백질

인 Cas13a(이전에는 C2c2라 불림)가 표적 RNA 또는

DNA에 결합했을 경우 주변에 존재하는 비표적 RNA

를 무작위적으로 절단하는 활성을 이용한다. 좀더 자

세히 살펴보면 셜록은 시료에 포함된 목적 DNA 혹은

RNA를 RPA와 RT-RPA (reverse transcription-RPA)로

각각 증폭시키고 이를 T7 RNA 중합효소로 증폭하는

단계와 CRISPR-Cas13a 시스템에 의해 증폭된 목적

RNA가 존재할 때 주변의 리포터 RNA(reporter RNA)

가 절단되어 형광 신호를 방출하는 단계로 구성된다(

그림 3)[4]. 극미량의 바이러스 혹은 암 유래의 DNA/

RNA 샘플을 RPA/RT-RPA로 증폭한 후 T7 RNA 중

합효소로 전사시킬 경우 피코몰(pM = 10-12 M)의 감

도가 아토몰(aM = 10–18 M)로 증가된다. 전사된 RNA

에 Cas13a가 결합할 수 있는 목적 RNA가 존재하면

Cas13a가 활성화된다. 활성화된 Cas13a는 주변의 리

포터 RNA를 무작위로 절단하여 형광 신호를 나타

낸다[4]. 이는 제6형 CRISPR-Cas13a 시스템이 제2형

CRISPR-Cas9 시스템과 다르게 DNA 대신에 RNA를

절단하고, 또한 목적 RNA를 절단한 후에 비특이적

으로 주변의 RNA를 절단하는 특성(collateral cleavage

activity)이 존재하기 때문이다.

2018년 셜록 개발자들은 셜록의 감도를 3.5배 증

가시킨 셜록2를 사이언스 저널에 발표했다[6]. 이들

은 기존 셜록의 감도를 향상시키기 위해 제3형 크리

스퍼 단백질인 Csm6를 리포터 RNA에 결합시켜 형

광 신호를 증폭시켰다(그림 4)[6].

또한 4개의 서로 다른 유형의 크리스퍼 단백질을

사용하여 4채널 다중 진단 키트를 종이에 구현하여

제작하였다. 이를 통해 4개의 서로 다른 표적을 각각

의 형광 신호로 검출하여 다중 진단이 가능함을 입

증하였다(그림 5)[6].

그러나 셜록은 시료에서 핵산을 추출하여 사용

해야하는 단점이 있다. 이는 현장에서 신속하게 진

그림 3. 크리스퍼 유전자가위 기반 차세대 분자진단 시스템, 셜록(SHERLOCK)[4].

그림 4. 셜록2(SHERLOCKv2)[6].

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NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 37, No. 4, 2019 … 443

단해야 하는 경우 치명적으로 작용할 수 있다. 이

러한 단점을 극복하고자 셜록 개발자들은 허드슨

(HUDSON, Heating Unextracted Diagnostic Samples

to Obliterate Nucleases)을 개발하여 셜록에 적용하였

다. 허드슨은 일반적으로 지카 또는 뎅기 바이러스

등은 소변이나 타액으로 배출되어 진단을 위한 시료

채취를 위해 침습적인 방법을 사용할 필요가 없다는

것에서 출발한다. 즉, 소변이나 타액에 존재하는 바

이러스 입자를 직접 용해시키고, 이들 속에 일반적

으로 많이 존재하는 리보핵산 분해효소(RNase)를 열

과 화학적 환원을 이용하여 불활성화시키는 것이 핵

심이다. 허드슨의 개발을 통해 셜록은 시료에서 핵

산을 추출할 필요없이 직접 바이러스의 진단이 가능

해졌다(그림 6)[7].

셜록은 지카 바이러스, 뎅기 바이러스, 박테리아,

항생제 내성 유전자, 인체 세포주의 유전자형, 암을

유발하는 돌연변이 등을 성공적으로 진단할 수 있었

다. 또한 셜록은 아토몰 (10–18M) 수준의 극미량으로

존재하는 바이러스를 검출할 수 있으며, 단일 핵산

염기 다형현상(SNP, single nucleotide polymorphism)

을 구분할 수 있기 때문에 다양한 전염병 및 암을 진

단하는 기술로 활용될 것으로 전망되고 있다. 또한

셜록은 2시간 이내에 진단이 가능하고 재질이 튼튼

한 광섬유종이(glass fiber paper)를 이용하면 현장에

서 충분히 사용될 수 있을 것으로 기대하고 있다. 이

렇게 제작된 간편 진단법은 건당 비용이 61센트에

불과해 기존 진단 방법의 절반 가격이다. 셜록의 상

업화를 위해 개발자인 MIT의 Feng Zhang 교수와 셜

록의 공동 개발자인 같은 대학의 James Collins 교수

는 2019년 Sherlock Biosciences 회사를 설립하여 본

그림 5. 셜록2(SHERLOCKv2)를 이용한 4채널 다중 분자진단[6].

그림 6. 허드슨(HUDSON)을 접목한 셜록을 통한 시료 내 핵산의 직접 검출[7].

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444 … NICE, 제37권 제4호, 2019

격적인 분자진단 제품 개발에 착수하였다.

2-3. 홈즈(HOLMES)

셜록에 사용된 크리스퍼 단백질인 Cas13과 더불

어 클래스 II의 제5형 Cas12a(이전에는 Cpf1이라 불

림) 크리스퍼 단백질도 부수적인 절단 활성(또는 트

랜스 절단 활성, trans-cleavage activity)을 갖는 것으로

밝혀졌다. 그러나 RNA를 표적으로 하는 Cas13과 달

리 Cas12a는 DNA를 표적으로 하고 주변에 존재하는

ssDNA를 무작위적으로 절단한다[5, 8, 11]. Cas12a는

gRNA에 의해 표적 DNA에 결합하면 부수적인 절단

활성이 활성화되어 주변에 존재하는 ssDNA를 무작

위적으로 절단한다. 이러한 Cas12a의 부수적인 트랜

스 절단 활성을 이용하여 개발된 핵산 검출기술이 바

로 홈즈(HOLMES, one-HOur Low-cost Multipurpose

highly Efficient System)이다(그림 7)[5, 12].

홈즈는 2017년 중국의 연구자들에 의해 최초로 개

발되었으며, 같은 해 중국에서 특허로 먼저 출원되

었다[13]. 2018년 동일한 중국 연구그룹에서 홈즈의

세부적인 기술을 소개하는 논문 2편을 발표했다(그

림 8)[5, 14].

그림 7. 셜록(b)과 홈즈(a)의 작용 기작 비교[12].

그림 8. Cas12a를 이용한 ssDNA의 무작위적 절단에 의한 분자진단, 홈즈(HOLMES)[14].

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NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 37, No. 4, 2019 … 445

같은 해 유전체 편집을 위한 크리스퍼 유전자가

위기술을 세계 최초로 보고한 UC Berkeley 대학의

Jennifer Doudna 교수 그룹도 Cas12a가 DNA를 표

적으로 하여 부수적으로 주변에 존재하는 ssDNA

를 무작위로 절단하는 활성을 발견하여 중국 그룹

과 동일한 분자진단 기술인 디텍터(DETECTR, DNA

Endonuclease-TargEted CRISPR Trans Reporter)를 개

발하여 사이언스 저널에 보고하였다(그림 9)[8].

홈즈는 DNA 또는 RNA 바이러스를 검출 할 수

있으며, 인간 유래 세포주나 임상 시료의 단일 핵산

염기 다형현상(SNP)를 1시간 내에 아토몰의 초고감

도로 검출할 수 있다. 디텍터 역시 바이러스에 감염

된 인간 세포주 또는 임상 환자 시료에서 바이러스

를 검출하고, 인간 유두종 바이러스(HPV)의 유전자

형을 식별할 수 있었다[5, 8].

클래스 II의 제5형 크리스퍼 단백질인 Cas12b 또

한 최근에 동일한 DNA 트랜스 절단 활성이 보고

되었다[9]. 이를 이용하여 홈즈 개발자들은 홈즈

2(HOLMESv2)(그림 10)[9]를 개발하였다. 홈즈2는

LAMP(Loop-mediated isothermal AMPlification)와 같

은 다양한 등온증폭법과 결합되어 다양한 온도 조건

에서도 진단이 가능하며, 지금까지 보고된 방법 중

에서 RNA 검출을 위한 가장 간단한 크리스퍼 유전

자가위 기반 진단 기술이다[9].

3. 결론 및 전망

크리스퍼 유전자가위는 계통학적으로 2개의 클

래스(class)와 6개의 유형(type)으로 분류되고 각 유

형은 다양한 구조와 기능을 갖고 있지만, 분자진단

에 이용되는 크리스퍼 단백질은 제2형 Cas9, 제5형

Cas12a, Cas12b, 제6형 Cas13a, Cas13b가 대표적이다.

현재까지 보고된 크리스퍼 유전자가위 기반 분자진

그림 9. 디텍터(DETECTR)[8].

그림 10. Cas12b를 이용한 홈즈2(HOLMESv2)[9].

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446 … NICE, 제37권 제4호, 2019

단 기술을 이에 사용된 크리스퍼 단백질의 유형에 따

라 분류하여 그 특징을 정리하면 표 1과 같다[3]. 크리

스퍼 단백질인 Cas9, Cas13, Cas12는 각각 RCH(Rolling

circle amplification-CRISPR-split-HRP)[15], 셜록, 홈

즈의 개발에 이용되었다. 이들은 모두 핵산 분해효

소(nuclease)이나 Cas9의 경우 dsDNA(double-stranded

DNA) 분해활성이 결여된 dCas9(dead Cas9)을 이용하

기도 한다. Cas13과 Cas12의 경우 표적 핵산에 서열 특

이적으로 결합하면 주변에 있는 RNA와 ssDNA(single-

stranded DNA)를 각각 분해할 수 있는 부수적인 핵산

분해 활성이 셜록과 홈즈에 이용되었다.

현재까지 개발된 크리스퍼 유전자가위 기반 분자

진단 기술은 간단한 시각 신호로 표적에 대한 정량

및 다중 감지가 가능하다. 또한 아토몰 수준의 초고

감도로 표적만을 선택적으로 검출할 수 있으며, 1~2

시간 이내에 검출 결과를 얻을 수 있다. 이는 서론에

서 언급한 것과 같이 이상적인 분자진단 기술의 많은

부분을 충족시키고 있다. 따라서 크리스퍼 유전자가

위를 이용한 분자진단은 기존에 사용되던 현장진단

기술(POC, 예: PCR, hybridization)과 동등한 또는 더

우수한 성능의 현장진단 기술 개발을 가속화시킬 것

이다. 또한 더 신속하고 저렴한 진단이 가능해지면

현재 저개발국가를 중심으로 급속하게 퍼지는 바이

러스에 의한 감염병의 통제가 가능해질 것이다.

새로운 유형의 크리스퍼 단백질이 지속하여 발굴

되고 그 특성이 밝혀지면 4채널 이상의 다중 진단도

가능해질 것이다. 가장 최근에 보고된 새로운 크리

스퍼 단백질인 Cas14도 부수적인 절단 활성(collateral

cleavage activity)을 갖고 있어 조만간 핵산 검출에 이

용될 것으로 기대된다[16]. 크리스퍼 유전자가위 기

반 분자진단은 초고감도의 핵산 검출을 위해 적절한

신호 증폭 방법(예: RPA. RT-RPA 등)과 결합되어야

하는 단점을 갖는다. 이러한 증폭을 통해 초고감도

를 획득하지만, 표적 핵산을 직접 검출하지 못하고

변형(DNA를 RNA로, RNA를 DNA로)시키는 문제

도 야기한다. 또한 크리스퍼 유전자가위가 작동하기

위해 선결되어야 하는 알려진 DNA 또는 RNA 서열,

PAM(protospacer adjacent motif) 서열 등도 차세대 분

자진단 기술 개발과 적용에 있어 걸림돌이 될 수 있

다. 따라서 크리스퍼 유전자가위를 이용해 이상적인

표 1. 크리스퍼 유전자가위를 이용한 분자진단 기술의 분류 및 주요 특징 (참고문헌 [3]에서 발췌 및 수정)

ClassificationSystemName

EffectorSignal

AmplificationSensitivity Specificity Quantitative Multiplex Readout Time

SampleType

TargetType

Sensing Environment

Cas9-based class

RCH spdCas9 RCA fM 1 nt Y N Colorimetric ＜ 4hPretreated

/rawRNA In vitro

NASBACC spCas9 NASBA fM 1 nt N N Colorimetric ~ 3h Pretreated RNA In vitro

PC reporter spdCas9 PCR One copy NA N N Bioluminescent10min after PCR

Pretreated DNA In vitro

CAS-EXPAR spCas9 EXPAR aM 1 nt N N Fluorescent ＜ 1h PretreatedDNA/RNA

In vitro

Cas13-based class

SHERLOCK LwCas13a RPA aM 1 nt N N Fluorescent 2~5h PretreatedDNA/RNA

In vitro

SHERLOCKv2CcaCas13bPsmCas13bLwaCas13a

RPA zM 1 nt Y YFluorescent,Colorimetric

0.5h~3h PretreatedDNA/RNA

In vitro

HUDSON-SHERLOCK

LwCas13a RPA aM 1 nt N NFluorescent,Colorimetric

＜ 2h RawDNA/RNA

In vitro

Cas12-based class

HOLMES LbCas12aPCR; RT-

PCRaM 1 nt N N Fluorescent ~ 1h

Pretreated/raw

DNA/RNA

In vitro

DETECTR LbCas12a RPA aM 6 nt N N Fluorescent ~ 2h Pretreated DNA In vitro

HOLMESv2 AacCas12b

LAMP; RT-LAMP;

Asymmetric PCR

aM 1 nt Y N Fluorescent ~ 1hPretreated

/rawDNA/RNA

In vitro

하이라이트

NEWS & INFORMATION FOR CHEMICAL ENGINEERS, Vol. 37, No. 4, 2019 … 447

차세대 분자진단 기술 개발을 위해서는 이러한 문제

들을 해결할 필요가 있다.

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