岐阜県御嶽山の森林土壌から採取した菌核の培養法および非培養法による菌類群集解析

誌名誌名 土と微生物

ISSNISSN 09122184

著者著者

野々山, 弥坂上, 伸生成澤, 才彦太田, 寛行渡邊, 眞紀子

巻/号巻/号 70巻2号

掲載ページ掲載ページ p. 56-59

発行年月発行年月 2016年10月

農林水産省 農林水産技術会議事務局筑波産学連携支援センターTsukuba Business-Academia Cooperation Support Center, Agriculture, Forestry and Fisheries Research CouncilSecretariat

56 土と微生物 (SoilMicroorganisms) Vol. 70 No. 2， pp. 56~59 (2016)

岐阜県御嶺山の森林土壌から採取した菌核の培養法および非培養法による菌類群集解析

原著論文

野々山(佐々木)弥 1・坂上伸生 2，3*・成津才彦 2・太田寛行 2・渡遺員紀子け

1東京工業大学大学院総合理工学研究科，干 226-8502神奈川県横浜市緑区長津田 4259

2茨城大学農学部，干 300-0393茨城県稲敷郡阿見町中央3-21-1

3首都大学東京都市環境学部 干192-0397東京都八王子市南大沢 1-1

Fungal community analysis by isolation and clone library in sclerotia from forest soil in Mt. Ontake， Gifu Prefecture， Japan

YayaSasakiNonoyarna¥NobuoSakagarne.3 * ，KazuhikoNari田 wa2，日royt企iOh旬，2，and Makiko Wa岡田be1.3

11:抗terd訟i掛加γyGrad叩 iteSchωIlofSci開 ceandEngi鳩町i略 TokyoInstitute ofTechnology， Mi，伽ri-ku，Yo加'hama226-8502，Jaj争側2 College of Agriculture， Ibaraki University， Ami， Ibaraki 3

野々山・坂上・成浮・太田 .i度遅 57

2minを35cycle ; 72 't. 10 minでPCR反応をおこなった。電気泳

動により増幅したバンドのゲルを切り取り，精製した。この精製

増幅産物から. Nishizawa etal. (2010)が記載する方法でクローン

ライブラリーを調製した。塩基配列は. BigDye Terminator Cycle

Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems， Foster City， CA)

を用いて反応をおこない， Applied Biosystems 3130xlジ、ェネティッ

クアナライザーで分析した。塩基配列の相同性検索は.DDBJ-

blastnプログラムを用いた。

2.3 培養法による菌類の分離

次に，菌核から直接菌類を分離同定するため，培養試験をおこ

なった。 Narisawaet al. (1998)に従ぃ a∞5 % Tween20を用いて表面を洗浄した後，人工培地上に静置し菌類を分離した。分

離用培地には，コーンミールアガー (CMA)培地(Commeal

Agar (Difco)， 17 g L -1).硫酸により pH5.0に調整した CMA培地，

グルコース濃度を 0.5%とした ModifiedMelin -Norkrans (MMN)

培地を使用した。それぞれの培地に洗浄した菌核を静置して室温

条件 (24't)で培養した。ひとつの菌核からは， 1種の菌類のみが伸長してコロニーを形成した。いくつかの菌核ではコロニー

形成が見られず，結果的に 38菌株を獲得した。菌核から伸長し

た菌糸は.1/2CMMY培地 (Commeal Agar (Difco). 8.5 g ; Malt

extract (Difco)， 10.0g;蕊astextract (Difco). 2.0 g; Bacωagar (Difco).

図 1 供試菌核の顕微鏡写真A 洗浄した4つの菌核. B 菌核の断面. C:菌核の内部構造 (外皮層と帯数E織に分化)。スケールパー:AB5∞凶n.C50阿n

7.5gL-1) に移植し確立した。菌核から分離された菌類を同定す

るため，コロニーの一部を掻き取り. PrepMan叩 lntraSample

Preparation Reagent (アプライド・バイオシステムズジャパン)に

より DNAを抽出した。前述と同様の条件でPCR反応させた。精

製後， シークエンス反応をおこない，塩基配列を角軌庁した。

2.4 分離菌株の菌核形成能と形態観察

分離菌株の菌核形成能を検討するため. 3種の培地 (CMA.

MMN， 1/2CMMY)上で分離菌株を室温条件 (24't)で培養した。

なお，外生菌根由来の CgeoPhilum AT353を対照として供試した。

供試培地上で菌核を形成した分離菌株は，スライドカルチャーを

作成し，その形態的特徴を光学顕微鏡 (OLYMPUSBX51)で観察

した。

3. 結果および考察

3.1 クローンライブラリー法による菌類種の推定

クローンライブラリー法により，合計で 14の菌種が確認された

(表1)。全45クローンのうち，森林土壌中に認められる菌核の形

成菌として報告されている Cglωphilumは1クローンのみであった。また，未同定菌根菌 (Youcheredmycorrhizae)はCgeoPhilum

との相同'性が高かった。その他の 41クローンの中には，菌核形成

が報告されている菌類は認められなかった。

3.2 培養法による菌類の分離

岐阜県御緑山の土壌から採取した菌核から， CMA (pH 6.2) .

CMA (pH 5.0) .およびMl¥町 (pH5.8)培地により分離された菌

類種と分離数を図2に示した。合計38株の菌類が分離され，その大部分 (34菌株)は子嚢菌類であった。 pH5.oに調整した CMA

培地において菌類が最も多く分離された。供試土壌がpH4.86の酸

性土壌であったことがその主な理由であると考えられた。分離株

の中で最も多かったのは， αdiod切dronPilicolaであった。同菌は，pH5.0のCMA培地と pH5.8の勘仏側培地から 7菌株分離された。

α'diodendron spp.は，今までに酸性土壌から多く分離されている(Baath et al. 1984)が，菌核を形成するという報告はない。菌核内部には低pH環境に生息する細菌Acidobacteriaが優占する場合が

ある (Nonoyamaet al. 2∞9)という報告があり，菌核内部は酸性環境である可能性がある。したがって，酸性環境を好む αPili，ωlaが多く検出されたことは，他の菌類が形成した菌核内に侵入し，

表 1 クローンライブラリー法による岐阜県御家山の菌核内部の菌類穫の推定とクローン数 (DDBJ-blastn検索による)

Phylurn Subphylurn Class Closest relatives Identity (%) NO.ofclone Ascomycota Pezizomycotina; Leotiomycetes Leohumi，ωla millimastrain DAOM 232587 94-98 17

Pezizomycotina; I却 tiomycetes Helotialessp. Bjelland 61 91-92 3 Pezizomycotina; Leotiomycetes Trichogl，側 umhi叩 dttmisolateAFTOL-ID64 90 1 Pezizomyco白la; Leotiomycetes Lophodermium sp. C1 96 2 Pezizomycotina; Leotiomycetes G問梯吃llarotula s凶 in130-1090 98 1 Pezizomyco白la; Dothideomycetes VOltchered mycorrhizae(l)othideom.四 tes)i鉛 lateSEQ10X 93-94 3 Pezizomycotina; Dothideomycetes 白11従VCCItmgeothilumisolate玲 -95-12 91 1

My，∞汀'hizalascomycete ofRhododen也'Ontype isolate E97023 92-93 2 As，ωmycetesp.olrim401 87-90 5 As，ωmycetesp.BC15 93 1

Basidiomycota Hymenomycetes Homobasidiomycetes Lactarius titeratus hue126 92-96 6 Hymenomycetes Homobasidiomycetesμ持taμYS011aωstrainIFO 7717 96 1 Hymenomycetes Homobasidiomycetes Tomelltella sublilacilla clone 20-45 89 1

Unid巴ntified Fungal sp. TRN36 89 1 Total: 45

58 森林土壌中の菌核内部の菌類群集解析

すみかとしていた可能性が高い。 また， Dark septate endophytic

fungi (DSE) に類別される Phialophara舟 land:必(Jumpponen，

2ω1)， Meliniomyces var必bilis(Ohtaka and Narisawa， 2∞8) が分離された。 DSEに類別されるいくつかの菌種は，菌核または微小菌

核の形成が報告されている (οdelleta1..1的3; Stoyke and Currah， 1伺3;Waggeta1..2ω8)。さらに，外生菌根菌種が7菌株分離された。一方，菌核形成菌として知られている菌核病の病原菌類は分離さ

れなかった。また， C. geoPhilumは，クローンライプラリー法で

検出されたにもかかわらず，培養法では分離されなかった。その

理由としては，形成菌としては死滅してしまっていた，あるいは，

人工培地上での増殖速度が遅いため(LoBuglio，1倒的，内部に侵

入していた他の菌類に対して優占できなかったことが考えられる。

また，はじめからC.geoPhilum以外の菌類が菌核を形成した可能

性も否定できない。

3.3 分離菌株の菌核形成能

人工培地3種 (CMA，MMN， 1/2CMMY)上で分離菌株およびcgeophilum A T353株を培養した結果， C. geoPhilumは悶悶培地で

のみ菌核を形成した(図 3A)。一方，図 2において h皿A(Mycelium

radicis atrovirens) Complexに類別されていた未同定菌Sc-iωf02，

sc -iso-f06およびsc-iso-fllが全ての培地上で菌核を形成した(図 3B-D)。接種試験による確認が必要であるが，これら分

離株は DSEに含まれるとの報告もある(Jump伊 nenand Trappe，

1998)。この 3菌株は特に CMA培地でより多くの菌核を形成した。菌糸がプレート全体に広がり，菌糸伸長が制限されると菌核形成

を開始し，培地の乾燥が進むにつれて菌核量が増加した。

Obase etaL (2014) は971個の菌核のうち， 297個から cgωphilum， 427個からC.geoPhilum以外の菌類を分離した。一方，

Amasya etaL (2015)では C.geoPhilumに関わる T-RFsのピークが

検出されなかった。本研究では前述の通りクローンライブラリー

法で検出され，培養法では分離されなかった。これらのことから，c.

geoPhilum以外にも， DSEなどの菌種が菌核を形成した可能性も

Oidiodendron pilicola Gyoer:的，ellarotula

Cladophialophora sp. Hypocrea sp.

Lecythophora mutabilis Cryptosporiopsis ericae

Cadophora sp. Helotiales sp.

Meliniomyces variabilis Phialophora finlandia

MRAcomplex Ectomycorrhizal isolate Mycorrhizal ascomycete

Salal root associated fungus Phlebia sp.

Mortierella sp.

.CMAロpH5CMAロMMN

E ~

i FE Asco

Z Z口

Basidiomycota Zygomycota マ 附 酬 - 岬 - 制 的 制 附 州 叫-ωw

5

No. of isolates 10

ycota

図2 岐阜県御獄山の土壌から採取した菌核から分離された菌類種と分離数

CMA コーンミールアガー培地， pH5CMA: pH5.0に調整した CMA培地，島品目グルコース濃度を 0.5%とした ModifiedMelin -Noooans 培地

あると考えられた。

4. 結 論

本実験結果より，岐阜県御森山の土壌から採取された菌核の形

成には， DSEを含む多くの菌類が関わっていた。これらの菌類は，

発芽活性を喪失した後にC.geoPhilum菌核に侵入した菌類である

可能性も考えられるが，菌核がC.geoPhilumだけでなく，他の菌

種により形成された可能性も示唆された。今後，菌核形成菌の解

明のために，分離に用いる培地の種類や培養条件を詳細に検討す

る必要がある。

要 1::::. 国

岐阜県御巌山の土壌から採取した菌核において，菌核形成菌を

推定するためにクローンライブラリー法および菌類の分離をおこ

なった。クローンライブラリー法により，菌核形成菌として報告

されている αn従'.OCcttmg;ωphilumが認められた。分離された糸状菌は，その大部分が子嚢菌類であった。培養法ではC.geophilttm

が認められなかったものの， DSEに類別されると考えられる未

同定菌 3株が，人工培地上で菌核を形成した。本研究で供試した

菌核は， C. geophilttmだけでなく，他の菌種により形成された可

能性もあると考えられた。

謝 辞

本研究において，菌核の採取方法をご教授頂いた筑波大学生命

環境科学研究科の阿部淳一ビーター博士に感謝申し上げる。また，

C. geophilttm A T353株の提供を頂いた信州大学農学部の山田明義

博士に厚くお礼申し上げる。

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白ω，舟'10釘cc何町αω4仰mgeo.ψ榊Pμhilμ伽lωu仰m似』バ(帥制培地船)および菌核から分再離佐された未同定菌(にCMA培地)と培地上で形成された微小菌核

A : C geoPhilum A T353株， B: Sc-i世 f02，C: Sc-i骨 f06，D: Sc.iso-f11 スケールパー :1伽nm

野々山・坂上・成j畢・太田・渡透 59

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