大腸がんリスク因子物質コリバクチンの生産菌を

検出する分子プローブの開発 ○ 玉舟亮太，平山裕一郎，恒松雄太，渡辺賢二

（静岡県大薬）

D e v e l o p m e n t o f m o l e c u l a r p r o b e s s c r e e n i n g p r o d u c e r s o f c o l i b a c t i n t h a t i s t h e r i s k f a c t o r o f c o l o r e c t a l c a n c e r

R y o t a T a m a f u n e , Y u i c h i r o H i r a y a m a , Y u t a T s u n e m a t s u , K e n j i W a t a n a b e

D e p a r t m e n t o f P h a r m a c e u t i c a l S c i e n c e s , U n i v e r s i t y o f S h i z u o k a

C o l i b a c t i n h a s b e e n t h o u g h t a s a r i s k f a c t o r o f c a r c i n o g e n e s i s

i n c o l o r e c t a l c a n c e r . I t i s p r o d u c e d b y a p h y l o g e n e t i c g r o u p

B 2 c e l l l i n e E s c h e r i c h i a c o l i . D e s p i t e m a n y e f f o r t s , c o l i b a c t i n

h a s n e i t h e r b e e n i s o l a t e d n o r c h a r a c t e r i z e d i t s c h e m i c a l

s t r u c t u r e . W e f o c u s e d o n a n e n z y m e C l b P w h i c h h y d r o l y z e s

p r e c o l i b a c t i n t o g e n e r a t e N - m y r i s t o y l D - a s p a r a g i n e ( 1 ) a n d

c o l i b a c t i n a s a g e n o t o x i c m o l e c u l e . W e d e s i g n e d a n d

s y n t h e s i z e d C l b p r o b e Ⅰ , a t u r n - o n f l u o r e s c e n t p r o b e f o r

d e t e c t i o n o f C l b P a c t i v i t y . A n a l y s i s o f t h e r e s u l t s r e v e a l e d t h e

p r o b e c o u l d b e d e t e c t e d c l b c l u s t e r p o s i t i v e b a c t e r i a t o o b t a i n

f l u o r e s c e n c e . T h u s , w e d e m o n s t r a t e d t h e p r o b e i s p o w e r f u l

t o o l f o r p r e v e n t i o n o f c a n c e r .

K e y w o r d s ： c o l i b a c t i n , g e n o t o x i n , c o l o r e c t a l c a n c e r ,

f l u o r e s c e n t p r o b e , h i g h - t h r o u g h p u t s c r e e n i n g

ヒ ト 腸 内 細 菌 叢 の 一 部 の 大 腸 菌 が 産 生 す る コ リ バ ク チ ン （ c o l i b a c t i n ）

が 強 い 変 異 原 性 を 有 し て い る こ と が 報 告 さ れ 、 大 腸 が ん の リ ス ク 因 子 で あ

る こ と が 強 く 疑 わ れ て い る 1 ) 。 コ リ バ ク チ ン は 5 4 k b も の 巨 大 な

P K S / N R P S h y b r i d 型 の 生 合 成 遺 伝 子 ク ラ ス タ ー （ c l b ク ラ ス タ ー ） に よ

っ て 生 合 成 さ れ て い る 化 合 物 で あ る 。 し か し 、 現 在 に お い て も コ リ バ ク チ

ン は 単 離 さ れ て お ら ず 、 そ の 化 学 構 造 は 明 ら か に な っ て い な い 。 そ の た め 、

こ の 物 質 が 大 腸 が ん の リ ス ク 因 子 と し て 有 用 な マ ー カ ー と な る 可 能 性 を 秘

め て い る に も 関 わ ら ず 、 簡 便 な 検 出 方 法 が 存 在 し て い な い 。 我 々 は 化 学 構

造 が 不 明 で 検 出 困 難 な コ リ バ ク チ ン を 間 接 的 に 検 出 す る 方 法 と し て 、 コ リ

バ ク チ ン の 生 合 成 に お い て 必 要 不 可 欠 な 酵 素 C l b P に 着 目 し 、 そ の 存 在 を

検 出 す る 分 子 プ ロ ー ブ の 開 発 を 行 っ た 。

C l b P は 不 活 性 型 の コ リ バ ク チ ン 前 駆 体 か ら プ ロ ド ラ ッ グ モ チ ー フ で あ る

N - m y r i s t o y l D - a s p a r a g i n e ( 1 ) を 加 水 分 解 し て 、 活 性 型 の コ リ バ ク チ ン

へ と 変 換 す る 酵 素 で あ る （ 図 １ ）。 そ こ で 我 々 は こ の 1 を 基 質 と し て 蛍 光 基

と 結 合 さ せ た C l b p r o b e Ⅰ を 設 計 し 、 合 成 し た 。 こ の C l b p r o b e Ⅰ 自 体 は

蛍 光 を 発 し な い が 、 ア ミ ド 結 合 が 切 断 さ れ て 生 じ る 7 - a m i n o - 4 -

m e t h y l c o u m a r i n は 蛍 光 を 発 す る た め 、 蛍 光 検 出 に よ っ て C l b P 活 性 を 検

出 で き る と 考 え た 。

合 成 し た C l b p r o b e Ⅰ の 存 在 下 で 大 腸 菌 を 培 養 後 、 酢 酸 エ チ ル で 抽 出 し 、

抽 出 画 分 の 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。 c l b ク ラ ス タ ー を 持 た な い 大 腸 菌 （ c l b − ）

で は 蛍 光 強 度 の 増 加 は 認 め ら れ な か っ た が 、 c l b ク ラ ス タ ー を 有 す る 大 腸

菌 （ c l b + ） と 培 養 す る と 、 時 間 経 過 と と も に 明 確 な 蛍 光 強 度 の 増 加 が 検 出

さ れ た （ 図 ２ a ）。 同 様 の 実 験 を 、 c l b P を 破 壊 し た 大 腸 菌 で 行 う と 蛍 光 は 検

出 さ れ ず 、 一 方 で c l b P を 強 制 発 現 し た 大 腸 菌 で は 強 い 蛍 光 が 検 出 さ れ た

こ と か ら 、

C l b p r o b e Ⅰ

は C l b P の 酵

素 活 性 を 検 出

で き る プ ロ ー

ブ で あ る こ と

が 確 認 さ れ た

（ 図 2 b ）。

図 1 . C l b P に よ る c o l i b a c t i n お よ び C l b p r o b e Ⅰ の活 性 化

O OHN

ONH

C13H27

CONH2O

ClbP probe

O OH2N

7-amino-4-methylcoumarin

colibactinHN

ONH

C13H27

CONH2

OcolibactinH2NClbP

Precolibactin

Genotoxicity

Fluorescence

(1)

Cleavage

OH

ONH

C13H27

CONH2O

続 い て C l b p r o b e Ⅰ を 多 検 体 の ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ に 適

応 す る べ く 条 件 検 討 を 行 っ た 。 2 µ M の C l b p r o b e Ⅰ を 加 え た L B 培 地 を

9 6 穴 プ レ ー ト に 分 注 し 、 そ こ に 寒 天 平 板 培 地 上 の 大 腸 菌 の コ ロ ニ ー を 植 菌

し 、 一 晩 静 置 培 養 し た 後 、 直 接 蛍 光 測 定 し た （ 図 3 ）。 被 験 菌 株 と し て 、 大

腸 が ん 組 織 よ り 分 離 し た c l b + 株 お よ び c l b − 株 そ れ

ぞ れ 約 1 0 0 株 を 用 い て 、 上 記 の 試 験 に 供 し た と こ ろ 、

c l b + 株 群 と c l b − 株 群 で は 明 確 な 蛍 光 強 度 の 差 が 認 め

ら れ 、 簡 便 に c l b 遺 伝 子 の 有 無 を 評 価 で き る こ と が 明

ら か に な っ た （ 図 2 c ）。

我 々 は 大 腸 菌 と C l b p r o b e Ⅰ を 混 ぜ て 培 養 す る の

み と い う 、 非 常 に 簡 便 な 方 法 で コ リ バ ク チ ン 生 産 菌 を

判 別 で き る こ と を 明 ら か に し た 。 こ れ ま で コ リ バ ク チ

ン 生 産 菌 の 特 定 に は P C R 法 に よ る c l b 遺 伝 子 の 検 出

が 用 い ら れ て い た が 、 専 用 の 装 置 や 煩 雑 な 操 作 が 必 要

で あ る な ど 、 臨 床 現 場 に お け る 検 査 法 と し て 実 用 性 に

欠 け て い た 。 C l b p r o b e Ⅰ を 用 い て 、 コ リ バ ク チ ン 生

産 菌 を 容 易 に 同 定 す る こ と に よ り 、 大 腸 が ん リ ス ク マ

ー カ ー を 用 い た が ん 予 防 法 の 確 立 が 期 待 さ れ る 。

1 ) N o u g a y r è d e , J . P . e t a l . S c i e n c e , 2 0 0 6 , 3 1 3 , 8 4 8 - 8 5 1 .

図 3 . 検 出 の 方 法

培地＋Probe　in 96穴プレート

コロニーピッキング

培養

蛍光測定

A

B

C

D

E

F

G

H

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

図 2 . a . C l b p r o b e Ⅰ 存 在 下 に お け る 大 腸 菌 c l b + / − 株 培 養 時 の 蛍 光 強度 b . C l b P 遺 伝 子 欠 損 及 び 強 制 発 現 株 培 養 時 の 蛍 光 強 度 , c . c l b − 株( 1 1 4 株 ) と c l b + ( 1 1 1 株 ) の C l b p r o b e Ⅰ に よ る 蛍 光 強 度 の 分 布

c . a .

0

200

400

600

800

1,000

clb− clb+

Intensity

12 h 24 h 48 h

b .

0

1000

2000

6000

clb− clb−/ ClbP導入株

clb+ clb+/ ClbP欠損株

Intensity

0

200

400

600

800

clb− clb+

Intensity