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Epigenetica:istruzioni per l’uso

Epigenetica: istruzioni per l’uso

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Introduzione

01 A,T,C,G: non e’ tutto qui. I meccanismi molecolari dell’epigenetica

Metilazione del DNA Codice istonico Non-coding RNA

02 Unconflittotrasessirisolto: l’imprinting genomico

Che cos’è l’imprinting genomico? Test molecolare per l’esclusione di UPD

03 Uomini e topi: epigenetica e ambiente

L’epigenetica nelle generazioni Farmaco(epi)genomica

04 Epigenetica senza segreti: i metodi di analisi

La metilazione del DNA Lemodificazionidellacromatina

Introduzione

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Epigenetica: istruzioni per l’uso

“La differenza fra genetica ed epigenetica può essere paragonata a quella che passa tra scrivere e leggere un libro. Una volta scritto, il testo (le infor-mazioni memorizzate nel DNA) sarà identico in tutte le copie; ma ogni lettore potrà provare emozioni personali e interpretare la trama in modo legger-mente differente da un altro lettore. In modo simile, l’epigenetica permette interpretazionidiversediunmodellofisso(lasequenzadelDNAgenomico)che possono esprimersi in letture diverse, a seconda delle condizioni con cui il modello viene interrogato”. 1

Mettendo a confronto la sequenza genomica di individui diversi, osservia-mocheesisteunavariabilitàche,seppurpiccola(<1%)giustificapartedelledifferenze fenotipiche tra le persone, compresa la suscettibilità alle malattie complesse, le attitudini, la risposta individuale ai farmaci e più in generale all’ambiente.Lavariabilitàinterminidisequenzadibasinonèperòsufficien-te a spiegare tutto. Ad esempio, i gemelli monozigoti, ovvero i “cloni genetici naturali” possono essere suscettibili in modo diverso alle malattie o essere non perfettamente identici nell’aspetto. Studi recenti hanno dimostrato che gran parte della variabilità tra gemelli è legata a differenze del loro assetto epigenetico,ovverodellastrutturatridimensionaleedellemodificazionichi-miche della cromatina e del DNA (metilazione del DNA): “signatures” che influenzanolatrascrizionedeinostrigeni,siaqualitativamentechequantita-tivamente. Allostessomodo,ilprofilodiespressionedellecelluleèilrisultatodispe-

cifichemarcature epigenetiche che “danno voce” o “silenziano” i geni: lasequenza genetica non cambia, ciò che varia è l’azione di “lettura” dei geni. Il silenziamento dei geni, così come la trascrizione, è un processo attivo, vitale che, come le pause di un’orchestra, partecipa all’armonia della composizione.

1 Thomas Jenuwein, Max-Planck-Institut, Freiburg.

Introduzione

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Sono le marcature epigenetiche del genoma che guidano e mantengono le differenze tra le cellule di uno stesso organismo pluricellulare. Le cellule dei diversi tessuti di un individuo, pur condividendo il medesimo patrimonio genetico della cellula di origine, lo zigote, hanno morfologia e funzioni molto diverse tra loro: un’ampia variabilità cellulare che è il risultato di complessi processididifferenziamentocheconduconoaspecifichemodulazionidell’e-spressione dei geni, silenziando quelli che non fanno parte del repertorio specificodiunadeterminatacellulaemantenendoneattiviquellispecifici.Così, confrontando il profilod’espressionedi un linfocita conquellodi unneurone, ci troviamo di fronte a differenze anche estreme riconducibili a dif-ferenze epigenetiche.

Oltre al differenziamento, l’epigenetica controlla altre funzioni biologiche fisiologiche:larigenerazionetissutale, ilsilenziamentodiuncromosomaXnelle donne, l’imprinting genomico e l’invecchiamento. Se l’ epigenetica è così importante nei processi vitali delle cellule e per la modulazione armo-nica dell’espressione genica, ci aspettiamo chemodificazioni del correttopattern epigenetico possano essere causa di dissonanze nell’armonia del re-pertorio dei loci espressi e avere effetti patologici. Numerose condizioni sia costitutive (malattie epigenetiche) (tab. 1) sia acquisite (come il cancro, le malattie neurodegenerative e autoimmuni) possono essere associate in di-versa misura a errori epigenetici. L’errato silenziamento di un gene, come nel caso di un gene oncosoppressore, o l’eccessiva espressione di un oncogene sono eventi patogenetici che possono scatenare o contribuire al processo di cancerogenesi (Tab. 2).

La comprensione del tipo e del peso delle epimutazioni nell’eziologia in molte malattie non solo incrementa la conoscenza dei meccanismi pato-genetici, ma offre innumerevoli spunti per disegnare strategie terapeutiche innovative, mirate ed estremamente promettenti, per individuare farmaci che possano ristabilire un assetto epigenetico compromesso, o molecole naturali (ad es. micronutrienti) capaci di salvaguardare il nostro patrimonio epigenetico, contribuendo a prevenire patologie degenerative. L’idea si basa sul principio, estremamente incoraggiante che, a differenza delle mutazioni genomiche, le signature epigenetiche sono, per loro natura intrinseca, rever-sibili. Almeno in linea teorica, questa peculiarità fa immaginare lo sviluppo di farmaci in grado di indurre la reversione del danno epigenetico e quindi della malattia. In altre parole, conoscendo il danno a livello di conformazione della cromatina, è possibile utilizzare molecole in grado di rimodellare la cromati-nariportandolaalsuostatofisiologico.Unesempiodiquestotipoditerapiaèl’uso degli inibitori delle acetilasi degli istoni nella cura di tumori ( Vorinostat,

Introduzione

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un inibitore delle deacetilasi degli istoni impiegato nel trattamento dei linfomi a cellule T, rappresenta un esempio di questi nuovi farmaci).

Per quanto riguarda la prevenzione, studi recenti hanno dimostrato che al-cuni alimenti contengono molecole bioattive capaci di inibire la crescita delle cellule cancerose; alcuni esempi sono i polifenoli del tè verde, la genisteina presente nella soia, il resveratrolo nell’uva e nel vino e i sulforani, di cui sono ricche le crucifere. Studi in vitro su cellule tumorali hanno dimostrato che queste molecole sono in grado di ristabilire il corretto pattern epigenetico. L’epigenetica promette quindi di spiegare l’azione preventiva e protettiva della dieta vegetariana contro il cancro.

Che sostanze presenti nell’alimentazione possano avere un effetto sul feno-tipo è evidente dall’osservazione sull’effetto sorprendente che la pappa reale ha sulle larve delle api; solo le larve alimentate con pappa reale diventeranno api regine, le altre, operaie. Le prime sono fertili, di grosse dimensioni e vi-vonoalungo,leoperaiesonosteriliehannounavitasignificativamentepiùbreve delle api regine. Studi recenti hanno dimostrato che la pappa reale, che è secreta dalle ghiandole mandibolari delle api operaie, contiene una mole-cola capace di rimodellare la cromatina. Si tratta della molecola 10HDA, un inibitore della deacetilasi degli istoni (HDACi). E’ stato recentemente dimo-strato che 10HDA è in grado di riattivare nei mammiferi l’espressione di geni epigeneticamente silenziati. Api regine e operaie sono geneticamente uguali, eppure fenotipicamente ben distinguibili e la differenza è determinata da ciò di cui si sono nutrite all’inizio della loro esistenza.Va sottolineato, infine, che le variazioni epigenetiche non sono solo alla

base di malattie, ma cooperano, insieme alle variazioni di sequenza del DNA, adefinireilpatrimoniogeneticodiunindividuoe,quindi,lerisposteindivi-duali a farmaci (farmaco-epigenetica), nutrienti (nutrigenomica), ambiente (epigenetica ambientale) e suscettibilità alle malattie complesse.

A questo proposito, l’Editore dell’autorevole rivista Nature Review Genetics (vol 12, August 2011) scrive: “Applying the principles of genome-wide asso-ciation studies to variation in DNA methylation offers the exciting prospect of filling in someof the blanks in our understanding of commondisease.This new direction highlights the fascinating recent transition from epigenetic phenomena being largely viewed as isolated curiosities to being seen as an integral part of complex traits.”

Epigenetica: istruzioni per l’usoIntroduzione

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Introduzione

Tabella 1 Alcune patologie

congenite che comportano er-

rori epigenetici

Tabella 2 Esempi nei tumori

di geni silenziati per ipermeti-

lazione

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A,T,C,G: non e’ tutto qui.I meccanismi molecolari dell’epigenetica

Epigenetica è l’informazione contenuta nella cromatina determinata da eventi che non comportano cambiamenti nel codice del DNA, bensì variazio-nichimichedelDNAedegliistoni.Talimodificazionichimichehannolosco-po di modulare l’espressione genica; le più importanti sono la metilazione del DNA, la metilazione, l’acetilazione e ubiquitinizzazione degli istoni. Durante la divisione cellulare le marcature epigenetiche sono mantenute e quindi sono trasmesseallecellulefiglie.L’espressionegenicapuòessereinoltremodula-ta, principalmente a livello post-trascrizionale, dall’azione di piccole molecole di RNA non tradotto, i miRNA.

Nel loro complesso, le marcature epigenetiche determinano l’accessibilità fisicadelgenomadapartedicomplessimolecolarideputatiallatrascrizionegenica e quindi regolano il grado di funzionamento dei geni.

Il DNA dei mammiferi può essere metilato dagli enzimi DNMT (DNA Metil-Transferasi)alivellodellaCitosinadeidinucleotidiCpGproducendola5‐me-tilCitosina,(5‐mCyt),senzachequestoeventomodifichil’appaiamentoconla Guanina durante la replicazione del DNA.

A,T,C,G: non e’ tutto qui. I meccanismi molecolari dell’epigenetica01

La metilazione del Dna

Fig. 1.1 Citosina e 5-metil Citosina

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IldinucleotideCpGèsimmetricorispettoaiduefilamentidelDNA,edèsolitamente metilato su entrambi i fronti della doppia elica. Dinucleotidi CpG si trovano spesso all’interno di regioni di DNA altamente ripetuto, che sono definitegeneralmenteCpGrepeats.Questesonoulteriormenteclassificabiliin base alla localizzazione e ai livelli di metilazione. In prossimità o all’interno dei promotori di molti geni si possono osservare regioni ricche in ripetizioni CG,definite“isoleCpG”(CpGislands).Sistimacheil40-70%deigeniabbiaunpromotorericcoin isoleCpG.Questeisolearricchite inCpGrispettoalresto del genoma si sono originate perché, nei dinucleotidi CpG la citosi-na metilata è chimicamente instabile e può subire eaminazione spontanea, conconseguentemodificazioneinTimina.Durantel’evoluzionesièverificatauna selezione negativa con conseguente scomparsa progressiva delle coppie CpG, ad eccezione delle regioni dove questo dinucleotite è generalmente de-metilato, cioè a livello dei promotori di geni sempre espressi: principalmente igeniHousekeepingmaanchealcunigenitessuto‐specifici.

Le isole CpG sono generalmente demetilate, in particolar modo i livelli di metilazione si attestano intorno al 10- 15%, tuttavia, un incremento della metilazione, gioca un ruolo importante nel controllo della trascrizione genica attraverso vari meccanismi:- la presenza di gruppi metile funge, in particolari regioni del genoma, da sito di legame per proteine MBDs (methyl binding proteins). Il legame di queste proteineallasequenzabersaglioèingradodiindurreulteriorimodificazionidellafibracromatinica,favorendonelacondensazione;- i gruppi metilici inducono il legame con altre proteine che riconoscono il DNAmetilato.Questopuòimpedireillegamedeifattoriditrascrizioneconipromotori dei geni.La metilazione delle isole CpG, quindi, è coinvolta nel silenziamento genico, infattiilivellidimetilazionegene‐specificicorrelanoinversamenteconl’attivi-tà trascrizionale. Accanto alle isole CpG troviamo altri tipi di CpG repeats che comprendono un insieme estremamente eterogeneo di sequenze, tra queste si possono distinguere gli elementi trasponibili come le sequenze LINE e SINE e il DNA satellite caratteristico delle regioni cromosomiche telomeriche e centromeriche. Contrariamente alle precedenti, queste regioni ricche in CG si trovano in uno stato di estesa metilazione ed i livelli possono raggiungere il 40-60%. La metilazione di queste regioni gioca un ruolo importante a vari livelli, permettendo il mantenimento dello stato eterocromatico di numerose regioni del genoma e favorendo la stabilità del genoma bloccando la capacità di trasposizione dei numerosi elementi trasponibili.Il meccanismo che porta alla metilazione del DNA è molto semplice, il grup-

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po metile viene legato alla citosina in posizione 5’ ad opera di enzimi noti come DNA metiltransferasi. Le metiltranferasi sono una famiglia di enzimi che intervengono in ambiti differenti:- DNMT1 ha il compito di mantenere lo stato di metilazione del DNA. Ad ogni ciclo di replicazione del DNA l’enzima è in grado di riconoscere l’elica neosintetizzata e di copiare più o meno fedelmente lo schema di metilazione presente sull’elica stampo;- DNMT3a e DNMT3b hanno una attività metil-transferasica de novo che è importante nei primi stadi di sviluppo embrionale, quando ad esempio viene ristabilito il pattern di metilazione o nelle cellule germinali per determinare il correttolivellodimetilazione,spessosesso-specifico.- DNMT3L non possiede attività enzimatica, ma può associarsi alle altre DNMTincrementandonel’affinitàperilDNAnelprocessodimetilazionedenovo.Il ruolo della metilazione del DNA nella regolazione genica è noto da tempo e non solo negli animali. Esperimenti chiave che hanno svelato il suo ruolo sonostatieseguitidabotanicichelavorandopermodificaregeneticamentelepiantedipetuniaottennerofioribluintensooscreziati(Fig.1.2).L’“incon-sapevole” scoperta, così come fu per Fleming con gli antibiotici, aprì nuovi orizzonti.

The colour comes from the blue-

Nel 1990 due diversi gruppi di ricerca che studiava-no la selezione delle piante pubblicano dati sorpren-denti ottenuti da esperimenti condotti per seleziona-repiantedipetuniadaifioribluintenso.Iricercatori,introdussero nelle cellule di petunia rosa alcune co-pieaggiuntivedelgenechecodificaper lachalconesynthase, un enzima chiave per la pigmentazione di questifiorichegeneralmentesonorosaoviolapalli-do. Inspiegabilmente, molte piantine transgeniche non avevanoilcoloreatteso,mafioridaipetaliparzialmen-te o completamente bianchi. Piuttosto che aumenta-re ilcolorvioladelfioredellapetunia, l’aumentodelnumero di copie del gene responsabile della pigmen-

Fig. 12 La screziatura

delle petunie e il colore

bianco sono determina-

ti dalla metilazione del

promotore del gene della

calcone sintasi.

A,T,C,G: non e’ tutto qui. I meccanismi molecolari dell’epigenetica01

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tazioneprovocavaunasplendidavarietàdifiori,alcunivariegatidiviolasusfondo bianco, altri completamente bianchi. Misurando la quantità di mRNA delgenemanipolato,sièosservatocheifioribianchiavevanounlivellomol-to basso, perché le copie in più del gene determinavano lo spegnimento del gene endogeno attraverso la metilazione delle regioni regolatrici. Si è dimo-strato che questo fenomeno,detto della co-soppressione del gene endogeno è dovuto ad un effetto di RNA interference.

Nella maggior parte degli eucarioti la metilazione del DNA è il processo epigenetico meglio studiato. La molecola donatrice del gruppo metile è la di S-adenosylmethionine (SAM), molecola sintetizzata dalla metionina adeno-siltransferasi a partire da adenosina trifosfato (ATP) e metionina. I precursori della SAM devono essere assunti attraverso l’alimentazione (Fig.1.3).

L’aspetto peculiare dei difetti epigenetici è che un metilazione inadeguata può essere ripristinata da molecole anche presenti in natura e che possiamo assumere con l’alimentazione; un esempio tra tutti è l’effetto sorprendente di una sostanza che si trova nel tè verde, la epigallocatechina-gallato (EGCG), capace di riattivare (demetilare) nelle cellule tumorali i geni oncosoppressori RAR-alfa, p16, MGMT e hMLH1.

Alterazioni nella metilazione delle citosine possono essere causa di ma-lattia, perché alterano i livelli di espressione. Pensiamo, ad esempio, ai geni

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Figura 1.3 Esemplificazione

dei processi metabolici per

la metilazione del DNA che

evidenzia la correlazione tra

alimentazione ed epigenetica.

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A,T,C,G: non e’ tutto qui. I meccanismi molecolari dell’epigenetica

oncosoppressori: il lorosilenziamentone impedisce la funzionefisiologicache è quella di protezione contro la crescita incontrollata o di preservare le cellule dall’accumularsi di errori del DNA.

Difetti congeniti della metilazione sono anche causa di malattie epigene-tiche presenti già alla nascita o talvolta diagnosticabili in epoca prenatale, comeisindromiBeckwithWiedemann(BWS),caratterizzatadaiper-accre-scimento corporeo e degli organi, difetti di chiusura della parete addominale e suscettibilità allo sviluppo di tumori durante l’infanzia. Il difetto patogene-tico principale riguarda un’anomala metilazione nella regione cromosomica 11p15, a livello di regioni che regolano l’espressione di geni regolati dall’im-printing genomico. Squilibri della metilazione determinano uno alterato do-saggio tra geni che inibiscono la crescita (es. H19) e geni che la stimolano (es.: IGF2).

Gli istoni sono proteine basiche ricche in lisina e arginina, le cui cariche positive sono in grado di neutralizzare le cariche negative del DNA, consen-tendo il compattamento della cromatina. Ogni tratto di DNA contenente 146 paia di basi è avvolto su un ottamero proteico, formato da due molecole di ciascunodeiquattroistoniH2A,H2B,H3eH4.QuestastrutturadiDNAeistoni costituisce il nucleosoma, unità elementare della cromatina (Fig. 1.4).

Come concetto generale, il rimodellamento della cromatina consente di neutralizzare le cariche positive delle code istoniche, l’effetto che ne conse-gue è la riduzione dell’attrazione tra istoni e cariche negative del DNA che porta ad un’apertura della struttura della cromatina che diventa accessibile alla macchina trascrizionale.

Codice istonico