INTEGRANTES: CONTRERAS NAVA MARLEN LIRA LPEZ ANAY LORENA VARGAS RAMIREZ MIGDALIA ZAPEDA SOTO EDGAR ADAN Microbiologa General II

Objetivos:Adiestrar al alumno al manejo de las tcnica de la inoculacin del embrin de pollo por las vas ms utilizadas

El alumno conocer las diversas partes del embrin de pollo de 9 das de incubacin

MEDIOS DE CULTIVO DE VIRUSCultivo celular:

conjunto de tcnicas que permiten mantener las clulas in vitro conservando sus propiedades fisiolgicas bioqumicas y genticas

CLASIFICACINPrimarios. Clulas, tejidos u rganos tomados directamente de un animal

rganos

Tejidos

Embriones

Cultivo celular

Secundarios. Se realizan a partir de los primarios

Lneas celulares: clulas se mantienen en subcultivos

Cultivos continuos: las clulas han logrado sobrevivir a varios cultivos

El cultivo de clulas se fundamenta en que las clulas de cualquier rgano se pueden cultivar "in vitro". Para ello se toma aspticamente el rgano extrado del animalSe corta en pequeos fragmentos y se trata con enzimas (por ejemplo, tripsina) que desintegran la unin entre las clulas. Luego se colocan en un medio de cultivo que contiene sales minerales, aminocidos, fuentes de energa, vitaminas, antibiticos y suero

Durante la incubacin, las clulas sedimentan, se adhieren a la superficie y comienzan a dividirse hasta que se obtiene un crecimiento confluente que cubre toda la superficie del fondo de la placa (monocapa).

Esta suspensin de clulas se coloca en placas de vidrio o de material plstico, y se incuban bajo condiciones apropiadas.

Luego de obtenida la monocapa, las clulas no continan dividindose por un fenmeno que se conoce como "inhibicin por contacto".

CULTIVO PRIMARIO

Se aade el virus y se incuba bajo condiciones apropiadas. REPLICACION VIRAL

Se trata de nuevo con tripsina, que rompen la unin entre las clulas desprendindolas del fondo de la placa.

Luego se mezclan con el medio de cultivo a una concentracin adecuada y se colocan en placas y se incuban bajo las mismas condiciones

CULTIVO SECUNDARIO

Es relativamente econmico ya que se sustituye el uso de los animales y huevos.

Donde de nuevo las clulas se dividen hasta obtener una

capa confluente.

Mtodos de inoculacin de virusMtodo Utilidad Animalyoncognesis viral ypatologa de padecimiento s virales yaislamiento primario

Ventajasymenor costo que cultivo in Vitro ytcnica desarrollada yamplia gama de virus

Desventajas Se usa en conejos, ydifcil roedores, obtener un chimpancs estndar yimposible cultivar virus recombinant es

Mtodos de inoculacin de virusMtodo Utilidad VentajasyFcil manipulacin yNo es necesario el espacio y dar cuidado a los animales

Desventajas

Se usa en

yTitulacin de virus Huevo embrio- yIdentificacin nado yPreparacin de vacunas

yInestabilida d ycalidad

Pollo, pato

Mtodos de inoculacin de virus

Metodo

Utilidad

Ventajas

Desventajas

Se usa en

Como hosped Tejidos y ador de organos celulas in vitro

No se utiliza todo Debe haber selectividad un organismo. Exactitud en el tipo de Econmico tejido.

rin, prepucio, embriones de pollo o ratn

Las vas de inoculacin mas utilizadas son de la cavidad amnitica, cavidad alantoidea, membrana corioalantoidea y saco vitelino. Tambin puede inocularse por :Va intravenosa: para virus que ocasionan cambios hematolgicos como el virus de la leucemia, se emplean embriones de 10-15 das con un inoculo de 0.02-0.05ml. Intracerebral : Se emplean embriones de 8-14 das, especficamente para virus que producen alteraciones cerebrales: la rabia, herpes. Con un inoculo de 0.01-0.02ml. Intraperitonial: Una vez que se duplica el virus dentro del embrin puede liberarse a los lquidos vecinos lo cual constituye una fuente de virus.

1) Va intravenosa

2) Va intracerebral

3) Va intraperitoneal

EFECTO CITOPTICO (CPE),

Los virus invaden las clulas causando normalmente algn tipo de cambio visible en el crecimiento de las clulas . Ejemplo efecto citoptico (CPE), es un deterioro de las clulas del cultivo de tejidos causado por el virus. La CPE puede tener diferentes apariencias dependiendo de un virus particular y del tipo de clulas en el cultivo.

Cambios morfolgicos visibles en clulas infestadas con virus. Incluye la paralizacin del ARN celular y de la sntesis de protenas, fusin celular, liberacin de enzimas lisosomales, cambios en la permeabilidad de las membranas celulares, cambios difusos de las estructuras intracelulares, presencia de cuerpos de inclusin virales, y aberraciones cromosmicas

EFECTOS CITOPATOGNICOS

Los efectos citopatognicos virales aportan un valioso mtodo para la identificacin y clasificacin de los virus que producen la infeccin.

EFECTOS CITOPATOGENICOS

Efectos: Ltico: el virus rompe la clula por la gran masa de virus que se produce. Ejemplo: polio, herpes. Hiperplasia: la clula se transforma y multiplica aceleradamente. Ej: verruga. Mixto (ltico e hiperplasia): Ej: viruela. Induce una transformacin y luego se rompe. Formacin de sincicios (herpes): son clulas multinucleadas porque las membranas celulares se funden (unin). Oncognicos: transformacin en clulas malignas.

TIPOS DE VIRUS

QUE SE PUEDEN INOCULAR EN EL EMBRIN DE POLLO: *MIXOVIRUS: -Influenza

(causa el resfro comn, las paperas y el sarampin en los seres humanos )

*POXVIRUS -Viruela *HERPESVIRUS -Herpes simplex

CULTIVO VIRAL EN HUEVO EMBRIONADO

UTILIDAD: Es una fuente de tejido vivo conveniente y fcil de manipular que se utiliza en la propagacin, titulacin e identificacin de virus, as como en la preparacin de algunas vacunas virales.

Se tiliza embri as. La ca ti a . ml ei

es e

-

c l es e . -

Es ecialmente ara el aislamient y c ltiv e vir s vari lic , Vir s e laring tra eitis aviar, Enfermedad de Beyer (Pseudorrabia), mixovirus. Los cuales rovocan focos o stulas fcilmente visibles ( lesi n tisular local).

Se emplean embriones de 7-15 das Cantidad de inoculo es de 0.10.2ml. Se utiliza para aislar de forma primaria al virus de la influenza (desarrollo de hemaglutininas).

Se emplean embriones de 9-12 das. Cantidad de inoculo de 0.1-0.2 ml Los virus que se desarrollan son peste, New Castle, virus de bronquitis infecciosa, encefalitis equina occidental (provoca muerte del embrion), parotiditis, permite la duplicacin fcil del virus de la influenza. entaja: simplicidad de la inoculacin y toma de muestra.

Se emplean embriones de 5-8 dias. Cantidad de inoculo es de 0.2 1 ml. Sumamente adecuada para el aislamiento y cultivo de virus de enfermedades venreas, neumona y rickettsias y clamidias. El vitelo se emplea para la preparacin de vacunas y como antgeno para reacciones serolgicas de los virus ya mencionados

METODOLOGALos huevos utilizados para estudios virolgicos deben ser obtenidos de aves vigorosas, sanas, libres de infecciones bacterianas o virales Se pueden adquirir con facilidad Son baratos Tamao adecuado No se forman anticuerpos contra el virus inyectado porque carecen de respuesta inmune

Antes de ser inoculados, los huevos deben ser incubados durante el tiempo ptimo para que el embrin, las cavidades extraembrionarias y sus membranas posean el tamao necesario seg n la va de inoculacin a emplear

La va de inoculacin a seleccionar depender de la afinidad del virus por el tipo de clula constituyente del embrin y sus membranas

Las vas utilizadas para la inoculacin son: - Cavidad amnitica (7-15 das) - Cavidad alantoidea (9-12 das) - Membrana corioalantoidea (10-12 das) - Saco vitelino (5-8 das)

Los huevos que se utilizan: - Cascara blanca para facilitar la observacin - Incubacin a 37C - Humedad de 40 60% en una estufa - Concentracin de oxigeno normal del aire (2%)

ESTRUCTURA NORMALIluminar el embrin de pollo con el ovoscopio (foco) Identificar y marcar la cmara de aire y la mancha ocular Cortar el cascaron a la altura de la cmara de aire Depositar el contenido del embrin en una caja de petri Identificar las embrin de 9 das estructuras del

MEMBRANA CORIOALANTOIDEASe perfora sobre la cmara de aire y el punto de inoculaci n

Se succiona aire lo que da lugar a que el aire penetre en la membrana corioalantoidea y se forme una cmara de 1 cm de dimetro Se inocula en la membrana con una aguja del corta en posici n vertical y depositar .1 ml del colorante Se sella Se incuba

SACO VITELINOColocar el embrin en plano horizontal Localizar el saco vitelino inchar la membrana por encima de la cmara area Introducir una aguja del 22 larga a travs de la cmara de aire y depositar 0.1 ml del colorante

CAVIDAD AMNITICAMarcar un punto en la cima de la cmara de aire Marcar un punto de inoculacin exactamente donde se ve el embrin

Inocular con aguja del 22 0.1 ml del colorante

CAVIDAD ALATOINDEAMarcar la cmara de aire y marcar un punto en la cima Aprox. 5 mm por debajo de la cmara de are localice una zona libre de vasos (lado opuesto al embrin) Inocular 0.1 ml del colorante con un aguja del 27 corta

TIPOS DE VIRUS QUE SE PUEDEN INOCULAR

Una vez lograda la replicacin del virus, se recogen tejidos (necropsia) pertenecientes a las zonas correspondientes del organismo, se selecciona u homogeniza y se almacena (generalmente a baja temperatura para emplearlas des pues como fuente de virus.

La naturaleza del rgano o tejido que se va a colectar y examinar depender de la enfermedad en particular a los sntomas que exhibe el animal. CUIDADOS: Cada instrumento para la necropsia debe de ser esterilizado. El animal debe ser incinerado despus de la necropsia.