Espansione di triplette

Corea di HuntingtonDistrofia miotonica

Atassie Spinocerebellari

Sindrome dell’x fragile

Corea di Huntinghton È una malattia

neurodegenerativa ereditaria DOMINANTE

E’ sufficiente che una sola delle due copie del gene sia mutata affinchè si sviluppi la malattia.

La regione dei gangli della base; i primi neuroni a degenerare sono gli SPINOSI MEDI DELLO STRIATO, che hanno il compito di inibire l’eccitazione corticale.

Colpisce una regione cerebrale Sintomatologia

IPERECCITAZIONE CORTICALE, che comporta disturbi motori, tra cui gesti involontari, disabilità motoria e più tardivamente stati depressivi, aggressivitàe disturbi psichici

Proteina mutata Huntingtina

Incidenza e decorso della patologia

L’età di esordio si colloca in età fertile, verso i 38 anni,e progredisce per circa 15-20 anni, portando all’invalidità totale1

2È una sindrome rara, con 5 casi ogni

100.000 abitanti.

Scoperta del gene-malattia…

Nel 1983 A. Boston e Jim Giusella identificano il tratto di DNA in cui è localizzato il gene responsabiledella malattia.Il gene fu chiamato “ IT15” ( Interesting Transcript 15 ),situato sul braccio corto del cromosoma 4 , che produceuna proteina chiamata “huntingtina”. Nel primo tratto delgene è localizzata una serie di tre nucleotidi “CAG” che risulta ripetuta una dopo l’altra.

NUMERO DI “CAG”

POPOLAZIONE SANA :Range compreso tra 9 e 35ripetizioni

POPOLAZIONE AFFETTA :Ripetizioni di triplette sempresuperiori alle 36 unità

A livello genico…Durante la replicazione del filamento di DNA un frammento neo-sintetizzato, costituito da una serie ripetuta di CAG si stacca dal filamento stampo e si ripiega su se stesso, formando un “hairping”, la cui porzione terminale si associa poi in una posizione

dello stampo più arretrata di quella attesa, così che verrà sintetizzato un numero eccedente di CAG.

L’espansione provoca una MUTAZIONE DELLA PROTEINA HUNTINGTINA

Per ogni tripletta di CAG presente nel gene viene aggiunto un amminoacido chiamato GLUTAMINA. La Corea di Huntington viene perciò detta “Malattia da poliglutamine”

Gain of functionL’ huntingtina mutata acquista tossicità

...il tratto poliglutaminico ne modifica la conformazione e quindi la sua funzione,

Provocando interazioni anomale con altre proteine cellulari

Modificandone la normale localizzazione

Rendendola suscettibile al taglio proteolitico

Provocando tossicità cellulare

...L’huntingtina mutata subisce un taglio proteolitico da parte delle caspasi, la cui attività aumenta in presenza della mutazione. L’azione delle caspasi porta alla formazione di diversi frammenti di huntingtina mutata, che sono in grado, così, di attraversare le membrane nucleari e di dare origine a inclusioni.Il frammento che ha destato maggior interesse è quello ammino-terminale che contiene il tratto poliglutaminico espanso; le poliglutamine si dispongono a formare una struttura a foglietto-beta che funge da collante, promuovendo la formazione di legami con altri frammenti di huntingtina mutata e con altre proteine. In questo modo hanno origine degli aggregati nucleari e citoplasmatici che alterano la normale architettura cellulare ed in cui viene inglobata l’huntingtina normale.

Infatti...

...Gli aggregati sono visti come causa della malattia

Loss of funcionOltre alla gain of function della huntingtina mutata, un’altra causa

della patologia è la perdita della funzione della huntingtina normale:

Funzione anti-apoptotica per le cellule dello striato

Stimolazione del promotore del gene del BDNF

Il BDNF è una sostanza prodotta dalla corteccia cerebrale che attraverso la via cortico-striatale arriva alle cellule dello striato proteggendole dall’azione tossica indotta dall’huntingtina mutata

In quanto interrompe la normale cascatadi eventi molecolari che portano allamorte cellulare di tipo apoptotico

Sindrome dell’x Fragile… sintomatologia

Ritardo mentale Ritardo dello sviluppo del linguaggio verbale Iperattività Sterilità I maschi si presentano alti, fisicamente forti, hanno naso e mandibola sporgenti, palato ogivale, orecchie di lunghezza superiore

alla norma, testicoli grossi, e sono predisposti a crisi epilettiche Circa un terzo delle donne portatrici mostra un certo grado di riduzione dell’ intelligenza. L’uomo high funtioning ha una sindrome molto simile alla donna Portatrice. Frequenti episodi di otite media, epilessia ed iperattività.

Questa forma colpisce circaUn maschio su 1500,una

Donna su 1000 ne è portatrice.

Modalità di trasmissione

Anomalia ereditaria del cromosoma x

Questa malattia ha un ereditarietà di tipo recessivo legato al sesso

Sebbene vengano colpiti soprattutto i maschi (1 su 4000), le femmine possono essere portatrici dell’anomalia genetica responsabile della malattia (1 su 6000) e trasmetterla ai figli maschi, che ne saranno affetti, ed alle figlie femmine, che diventeranno a loro volta portatrici.

papà

XY

Mamma

XX

XY oppure XY

XX oppure XX

50%

50%

MASCHI

FEMMINE

Possibilità di manifestare la malattia. 0% possibilità di Esserne portatore.

di essere portatrice della malattia. 0%Possibilità di manifestarla

A livello genetico

La mutazione FRAXA è il risultato di due eventi indipendenti:

L’espansione della sequenza ripetuta CGG nel primo esone del gene

FMR1

La metilazione a livello del promotore del gene

Primo fenomeno….• Nel primo esone il cromosoma X contiene una

sequenza ripetuta CGG, che viene trascritta ma non tradotta in proteina. La maggior parte delle mutazioni responsabili di questa sindrome consistono nell’amplificazione di tale sequenza ripetuta.

A seconda del numero di triplette ripetute si ha una condizione di…

o Normalità 6-55 triplette

oPremutazioni 56-200 Triplette

o Mutazione completa <200 triplette

Questa proteina (FMRP) ha la funzione dilimitare la sintesi di una serie di proteinepresenti nelle sinapsi, che, se presenti in eccesso, potrebbero causare difficoltà nella propagazione dell’impulso. Ed inoltre impedisce la traduzione di alcuni mRNA legandosi ad essi.

Metodo di Sanger: sequenziamento delDna

• Sequenziare il Dna significa leggere la successione di basi che esso contiene:• Il Dna a singola elica viene suddiviso in quattro provette separtate, ciascuna corrispondente

ad uno dei quattro nucleotidi (A,C,G,T), e trattato in modo da legarsi a un piccolo innesco di 20 basi.

• Necessaria per estendere la catena di DNA è la DNApolimerasi: essa procede lungo la catena incorporando oltre ai normali precursori nucleotidici (dNTP) anche particolari nucleotidi (ddNTP, cioè didesossi-nucleotidi, i quali differiscono dai primi per avere un atomo di H legato al terzo atomo di carbonio piuttosto che un gruppo OH).

• Il loro inserimento all’interno della stringa in crescita è casuale: questi ddNTP saranno responsabili dell’interruzione della crescita del Dna nel momento in cui verranno inserite nella provetta del corrispondente dNTP (es. ddATPs – dATPs). La concentrazione del secondo è l’1% rispetto al primo.

• Dunque, si genereranno frammenti di lunghezza scalare, con pesi molecolari differenti: utilizzando l’elettroforesi sul gel di poliacrilammide, ciascun frammento verrà caricato in una corsia del gel relativa al ddNTPs che l’ha tagliato (es: se il frammento è stato dal ddATPs, allora si troverà nella corsia A).Le corsie sono tra loro adiacenti ed i frammenti sono disposti dal basso verso l’alto in ordine crescente di lunghezza.

• Una volta terminata la separazione elettroforetica, il gel viene essiccato e messo a contatto con una pellicola radiografica.

• L’immagine che ne deriva è caratterizzata da bande sequenziali.

utilizzando l’elettroforesi sul gel di poliacrilammide e poi fissando il tutto su lastra rediografica.…

Secondo fenomeno…• La metilazione del Dna è uno dei più

importanti meccanismi di regolazione dei geni, essa comporta, attraverso dei processi chimici,l’ inibizione del funzionamento degli stessi.Consiste dunque nel legame covalente dei gruppi metilici alle basi azotate del DNA.Negli eucarioti avviene principalmente la metilazione delle citosine. C’è una zona particolare nel promotore del gene che è chiamato “CpG island”, zona ricca di guanina e citosina in cui NON avviene metilazione. Questo fenomeno è più ricorrente nelle zone povere di C e G. Quando la metilazione viene estesa anche alla “GpC island”, il promotore viene bloccato, impedendo le fasi di trascrizione, traduzione e produzione della proteina.

Tornando al lucido precedente…

Ulteriore differenza tra:

Premutazione

Mutazione completa

il promotore è Attivato, dunque si ha la produzione di

Proteina FMRP (fragile mental Retardation protein.

Il promotore viene invece metilato, nonSi ha produzione della proteina, e

Compare il fenotipo clinico completoDella malattia

Mosaicismo…e preambolo all’High functioning

: È quel fenomeno per il quale in un individuo

coesistono due tipologie di cellule,con genotipi

differenti

in particolare parliamo di

mosaicismo di metilazione quando espansioni <di 200 CGG hanno un

promotore parzialmente metilato o non lo sono affatto per cui producono la proteina

FMRP.Il livello di proteina prodotta è variabile, dal 10% al 60% rispetto

all’allele normale, ciò dipende dal grado del mosaicismo di metilazione, cioè dal

rapporto tra le cellule in cui il promotore è metilato e quelle in cui non lo è.

Maschi High functioning

Individui con sindrome da x fragile che presentano un quoziente intellettivo nella norma (QI>70).

In questi casi il grado di metilazione è >del 10%,o più raramente,

il promotore è completamente non metilato. Dunque la proteina

FMRP sembra essere in quantità

sufficiente per garantire un adeguato sviluppo intellettivo.

Distrofia Miotonica

• Multisistemica

• Autosomica la mutazione è localizzatasui cromosomi non sessuali

• Dominante il fenotipo dei geni alterati si esprime sia in omozigosiche in eterozigosi

È una malattia:

interessa più apparati

Esordio in etàadulta

Esordio ingravidanza

Miotonia, debolezza,atrofia muscolare,

distubi al cuore,agli occhi ed al sistema endocrino

Più grave e ad insorgenza precoce.Riduzione dei movimenti fetali,

insufficienza respiratoria grave, ritardato sviluppo psicomotorio

Sintomatologia ed incidenza

Su 100 bambini nati da un genitore portante della malattia

50% sani

50% malati

10 bambini affetti su 10.000 nati

Esistono due tipi di DistrofiaMiotonica

DM1 DM2

DM1

• Per gli individui affetti da D.M il numero varia da 50 a 1000 per la forma classica, da 1000 a 3000 per la forma congenita

• Negli individui normali il numero delle triplette CTG è inferiore a 37

È causata dall’espansioni di ripetizioni di CTG nella regione ‘3 non tradotta del gene

DMPK sul cromosoma 19q13.3

I pazienti presentano nella seconda o terza decade di vita il sintomo caratteristico di capacità ridotta nel rilassare la presa di un pugno serrato.Questa difficoltà è legata ad un anomalo stato di eccitabilità della membrana muscolare.

Continua…

• Deficit di forza muscolare e depauperamento delle masse muscolari, con distribuzione caratteristicamente distale (cioè a carico dei distretti più distanti dal tronco,come mani, avambracci, piedi ecc.)

• Ipotrofia dei muscoli temporali e dei masseteri, con ptosi palpebrale

• Disturbi del ritmo cardiaco per difetti di conduzione cardiaca.

• Problemi respiratori

• Eccessiva sonnolenza diurna

• Deficit del cognitivo, alterazione della memoria,disturbi del tono dell’umore

• Alterazioni endocrine (resistenza all’insulina)

• Cataratta e calvizie precoci (anche nella donna)

Sintomatologia

Esordio e severità clinica

• La severità clinica e la precocità dell’esordio sono proporzionali all’amplificazione della tripletta CTG…

50-99

Intorno ai 100

Superiori a 100

Uguali o superiori a 1000

Esordio tardivo, lieve

Esordio in età adulta, moderata

Esordio in età infantile/giovanile, grave

Esordio neonatale, gravissima

Espansioni:

DM2

Il numero di quadriplette può

variare da un minimo di 70 ad un massimo di

11000, con una media di 5000 ripetizioni.

La maggior parte di queste famiglie sono state diagnosticate come affette da miopatia miotonica prossimale, per sottolineare le modeste peculiarità cliniche rispetto alla forma DM1.

È causata da espansione di quadripletteCCTG sul cromosoma 3q21.

Le sequenze CTG e CCTG si sono rivelate NON CODIFICANTI, ed è stato ipotizzato che nel loro espandersi, prendano il posto delle ripetizioni di sequenze CUG, le quali contribuiscono alla sintesi di proteine responsabili di importanti funzioni cellulari.

A livello cellulare…

Atassia spinocerebellare

autosomica dominante Malattia neurodegenerativa caratterizzata da atassia cerebellare

progressiva…

Perdita progressiva della capacità di eseguireun movimento volontario propriamente orientato nella direzione, nella forza e nella Coordinazione dei muscoli necessari alla sua corretta esecuzione..

’’

Col passare delle generazionila malattia diviene più grave el’insorgenza più precoce.

A Livello genetico …

‘’

Tipologie…Il processo degenerativo può essere limitato al cervelletto (ADCA di tipo III)

Includere anche la retina (ADCA di tipo II)

O anche il nervo ottico, la regione ponto-midollare, i gangli della base, la corteccia cerebrale,i nervi spinali o periferici (ADCA di tipo I).

Sintomatologia…

• Anomalie della pupilla

• Atassia/incordinazione

• Atrofia ottica

• Agenesia/ ipoplasia/ anomalie del cervelletto

• Nistagmo

• Disturbi del comportamento

• Disturbi del linguaggio

• Insensibilità al dolore/ disturbi sensitivi

• Ipertonia/ rigidità/ spasticità

• Miatrofia/ agenesia muscolare

• Iperglicemia/ diabete mellito

• Oftalmoplegia

Un’altra forma di atassia molto diffusa….

Atassia di Friedreich• Autosomica recessiva (genitori asintomatici).• Incidenza: 1/30000-1/50000 nati vivi.• Insorgenza solitamente prima dei 20 anni.• Durata della vita ridotta

Mutazione del gene FRDA che codifica la proteina Fratassina

locus genetico 9q13

numero di copie normale = 6-34 Tripletta GAA numero di copie nell’A.F.= 67-1700

• La Riduzione dei livelli di fratassina ed il fenotipo sono entrambi proporzionali alla lunghezza dell’espansione GAA;

con ripetizioni <500 si ha un insorgenza più tardiva e un fenotipo più

lieve

con lunghezze 500 si ha un’insorgenza più precoce, decorso più rapido, maggiore incidenza di diabete, cardiomiopatia e scoliosi, maggiore alterazione dei riflessi.

È molto espressa nel Pancreas, nel rene, nel SNC (midollo spinale, cervelletto, corteccia cerebrale) cuore, muscolo scheletrico, fegato.

Il suo ruolo:Trasportare il Ferro dai

mitocondri al citosol.

Il suo deficit:causa un dannoossidativo per eccesso di ferronei mitocondri.

Come il genotipo influisce sul fenotipo…

Dove agisce la Fratassina SNC

Pancreas

Muscoli

Cuore

Fegato

Rene

Grazie…

Anna Del Prete eVincenzo Caputo