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não
Determinar estrutura a partir das distâncias
1H-1H e outras restrições adicionais
Integrar picos e converter volumes em
distâncias
Assinalamento seqüencial
Assinalamento dos sistemas de spin
Identificar a maior quantidade de NOEs
Espectro COSY
Estrutura aceitável?
FIM
Identificar NOEs adicionais a partir da
estrutura já obtida
Recalcular NOESY a partir das estruturas obtidas e comparar
com espectro original
Picos inexplicáveis?
Reexaminar NOEs, integração, calibração,
larguras de linha
Espectro TOCSY Espectro NOESY
Assinalamento dos sistemas de spin
sim
sim
não
Simmulated annealing (SA): baseado em dinâmica molecular (MD) e minimizaçãode energia (EM)
baixo limite de distância (d 5Å) + dubiedade de muitos picos NOEs
família de estruturas
A acurácia das estruturas obtidas depende do número de restrições experimentais:a acurácia atinge um valor assintótico em 10-14 restrições por aminoácido.
A coerência entre modelo obtido e espectros medidos é essencial: o cálculoretroativo do espectro NOESY permite identificar erros em assinalamentos e aintrodução de NONOEs (d>5Å).
Cálculo de Estruturas
6
NOENOE dV
A energia do sistema de átomos pode ser descrita por:
• Eemp : energia da molécula segundo uma equação empírica (função de suas coordenadas);
• Eexp : termos de energia provenientes de informações experimentais.
expemppot EEE
Função para a Energia
Energia empírica - contém termos de energia de interação conformacionais e não-ligantes envolvendo 2, 3 ou 4 átomos:
• Ebond é a energia das ligações covalentes r;• Eangl a energia dos ângulos de valências;• Edihe a energia dos ângulos torcionais;• Eimpr a energia dos ângulos torcionais rígidos (quiralidade, planaridade);• Evdw a energia da interação de van der Waals;• Eelec a energia da interação eletrostática.
Os diversos wp são fatores de peso.
N
p
elec
p
elecvdw
p
vdwimpr
p
imprdihe
p
diheangle
p
anglebond
p
bondemp EwEwEwEwEwEwE1
Primeiros 4 termos da energia: termos conformacionais, descrevem a geometria daligação covalente da molécula.
Definidos por potenciais harmônicos, exceto dihe (periodicidade pode gerar váriosmínimos de potencial) que é representado for uma função coseno:
• r0, 0 e 0 : grandezas de equilíbrio (determinadas por difração de raios-X);• : ângulo de fase;• k : constantes de força (otimizadas de modo que a manter a estabilidade local do
sistema).
impropers
impr
torsion
dihe
angles
angle
bonds
bbond
kE
nnkE
kE
rrkE
2
0
2
0
2
0
)(2
1
1,)]cos(1[2
1
)(2
1
)(2
1
Dois últimos termos da energia: não-ligantes. A energia de van der Waals entredois átomos i e j separados por uma distância rij é descrita pelo potencial de Lennard-Jones:
• : definido pela energia mínima (Emin=- );• : definido pelo raio de van der Waals mínimo (rmin=21/6 ).
O termo de interação eletrostática é dado pelo potencial Coulombiano:
• q : carga dos átomos;• 0 : constante dielétrica do vácuo.
Os dois termos são, em geral, substituídos por um único termo simples epuramente repulsivo:
• Rmin : raio de van der Waals mínimo;• irexp e rexp : coeficientes ajustados.
])()[(42
1)( 6
)(
12
ijijpairs ij
vdwijvdwrr
krE
)( 04)(
ijpairs ij
ji
elecijelecr
qqkrE
0;]),0[max()( elec
rexpirexpirexp
min
rep
repijvdw ERRkCrE
Energia experimental - As restrições experimentais obtidas dos dados de NMRpodem ser descritas pela função:
• Enoe : restrições de distâncias;• Ecdih : restrições de constantes de acoplamento 3JNH (e portanto para ângulos
diedrais );• Ecoup : restrições de constantes de acoplamento J ;• Eshifts : restrições de deslocamentos químicos (comparados a um banco de dados
estrutural).
São pseudo-potenciais podendo ser definidos pelo usuário de acordo com a formada molécula e da confiabilidade dos parâmetros estruturais.
shiftscoupcdihnoeexp EEEEE
Os melhores resultados são, em geral, obtidos com os potenciais bi-harmônicos:
• rmax e rmin : limite superior e inferior para as distâncias obtidas a partir dos NOEs;• knoe : pode ser colocado como dependente da temperatura e dos limites dos erros.
Os outros termos podem ser definidos analogamente.
minij
maxijmin
maxij
minijnoe
maxijnoe
ijnoe
rr
rrr
rr
rrk
rrk
rE2
2
)(
0
)(
)(
Algoritmo utilizado para calcular a trajetória de uma molécula de N partículassegundo as equações clássicas de movimento. Pela equação de Newton, a partícula ide massa mi e posição ri estará sujeita, no tempo t, a uma força Fi:
A solução numérica das equações de movimento é obtida computacionalmente apartir de uma escolha de incremento de tempo, t. O cálculo das coordenadas dapartícula i no tempo (t+ t) é obtido das coordenadas nos dois tempos anteriores (t) e(t- t), pela soma das duas séries de Taylor para (t+ t) e (t- t) até terceira ordem:
O objetivo dos cálculos de dinâmica molecular é encontrar uma conformação da molécula que se aproxime do mínimo global de energia total.
potii
i Et
tmt
2
2 )()(
rF
2
2
2
)()(
)()(2)( tt
tttttt i
iii
rrrr
Dinâmica Molecular (Verlet)
Utiliza o método de gradiente conjugado, minimizando a energia total Etot utilizandoas coordenadas cartesianas como variáveis. Esse método costuma ser utilizado ao finalde uma dinâmica molecular, a fim de regularizar a estrutura.
Minimização de Energia (Powell)
A fim de evitar que a conformação da molécula caia em um mínimo local sãocriados protocolos, como o SA, nos quais a dinâmica molecular seja direcionada comdiferentes fatores de escala para os diversos termos de energia. Segundo esseprotocolo, o sistema pode alcançar valores de energia superiores de acordo com adistribuição de Boltzmann:
A “temperatura efetiva” T do sistema é obtida do valor médio para a energia cinética
A energia cinética é lentamente diminuída durante os cálculos através da redução davelocidade vi com a temperatura. Para tal, as equações de movimento são acrescidasde um fator de amortecimento, a fim de evitar oscilações de alta freqüência dosátomos que poderiam levar a uma dissociação da molécula:
Protocolos de Simmulated Annealing (SA)
Tk
E
BeEP )(
TNkvmE B
N
i
iic2
3
2
1
1
2
)1()(
)(2
2
curr
iiipotii
iT
TmE
t
tmt v
rF
A velocidade será, portanto, alterada de acordo com a temperatura desejada T, atemperatura atual Tcurr e do coeficiente de fricção i. Paralelamente ao resfriamento dosistema são aumentados gradativamente os pesos dos termos de energiaexperimentais, de modo a restringir as estruturas calculadas ao espaço conformacionalque mais se adapte às restrições por NMR.
Esse procedimento é aplicado sobre uma estrutura inicial desenovelada, sendocriadas diversas estruturas a partir de velocidades iniciais distintas. Ao final dadinâmica essas estruturas deverão ser semelhantes (convergir), o que só acontecerá seexistirem restrições experimentais suficientes e, em sua maioria, corretas. Parâmetrospara avaliar a qualidade da estrutura são as energias e seus desvios e o número deviolações de restrições experimentais. As subunidades flexíveis da molécula serãovistas, por NMR, em uma conformação média-temporal que, em geral, nãocorresponde a um mínimo de energia, não convergindo a uma única conformaçãofinal.