Espectrometría de masas - · PDF fileseparación en el cual los componentes de la muestra a ser ... debidos a la abundancia natural isotópica de los elementos ... (fuente de ionización)

Espectrometría de masasEspectrometría de masas

Junio 2013 - D’Amico Sistemas S.A.Diapositiva 1

Espectrometría de masasEspectrometría de masasD’Amico Sistemas S.ADaniel [email protected]

Agenda

� Breve Introducción a la Cromatografía y espectrometría de Masas

� Principios y fundamentos teóricos


� Ionización a Presión Atmosférica: Electrospray, Ionización Química, Fotoionización, APGC

� Analizadores: Cuadrupolo

� Alcances de la técnica, Aplicaciones de interés

Cromatografía

__

Definición IUPAC

Cromatografía es un método físico deseparación en el cual loscomponentes de la muestra a serseparados son distribuidos en dosfases, una de las cuales permanece


__

______

fases, una de las cuales permaneceinmóvil (fase estacionaria) mientras laotra (la fase móvil) se mueve en unadirección definida.

Cromatografía


Cromatógramas

El grafico resultante relaciona la señal

Cromatografía


El grafico resultante relaciona la señal

eléctrica (directamente proporcional a la

concentración del analito) con el tiempo

de retención de las sustancias de

interés

Espectrometría de Masas (MS)

Es un método utilizado para Medición de pesos moleculares de sustancias en fase gaseosa, que permite su identificación o

estudio estructural

Espectrometría de masas


La espectrometría de masas trabaja con Iones en fase gaseosa

Antes de obtener el espectro correspondiente, la sustancia debe ser ionizada (de no encontrarse en ese estado)



Las moléculas pueden ser ionizadas por adición o eliminación de un electrón (e-)

M + e- � M +. + 2 e-

(M + e- � M - . ) ---- raramente usado

En ambos casos, el ion obtenido posee una masa igual a su peso molecular

Alternativamente, las moléculas pueden ser ionizadas por adición (o substracción) de un ion

[ M + X ] + or [ M + X ] –

I_____________________________I

Ion quasi molecular



La masa del ion difiere del peso molecular del fragmento que le dio origen

Los iones son acelerados en el vacío a través de un campo magnético y/o electrico para ser separados de acuerdo a su relación masa / carga (m/z), donde

m/z = m porque generalmente, z = 1

Los iones con la apropiada relación m/z pasan a través delanalizador para impactar en el detector, generando la señalcorrespondiente



La señal obtenida se denomina espectro de masas, y en el segrafica la intensidad relativa de los iones vs. m/z




Todos los picos restantes, se reportan

Pico Base (pico de mayor señal en el espectro,

corresponde al fragmento principal o mas estable)


Generalmente se observa la presencia de pequeños picos adyacentes a los demayor intensidad, debidos a la abundancia natural isotópica de los elementos(12C, 13C o 1H, 2H, etc.)

Todos los picos restantes, se reportan

en relación al pico base

M+ Ion molecular


100

%

124.0

121.0

96.3

100.0

142.0

135.0

147.1

400.0O

HO

H H

H O

NO

OH

142H2O-

124

+

+ H

+[M+H]

21-Hidroxi Deflazacort


60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440m/z0

100

%

0

100.0 135.0

171.0 225.0

397.1

337.1

309.1

291.1

237.1147.1

319.1

327.2

355.1

379.1

415.1

435.2

+ H

HF H2O- -415 397

+

O

HO

F H

H

OHO

O

O +[M+H]

21-Aceto Dexametasona

MS por si sola, puede no ser ideal para el análisis de mezclas

Espectrometría de masas, Limitaciones


El espectro de masas de una mezcla, es la resultante de la superposición de los espectros individuales de cada componente

Mobile phase carrying mixture of components

LC - MS


Identificación de compuestos previamente separados

� Tres funciones básicas:

� transformación de una muestra a iones en fase gaseosa (fuente de ionización)



� separación de estos iones según su relación masa/carga (analizador)

� detección de los iones separados (detector)

Fuente de Ionización


Electrospray: Es una tecnica de ionizacion a presion atmosferica que permite elingreso de la muestra desde el LC y su ionizacion en forma conjunta

� Utiliza un campo eléctrico para producir la nebulización de la muestra

Electrospray (ESI)


� La muestra ingresa a través de un capilar, en cuyo extremo se aplica unpotencial negativo o positivo

� Este alto potencial sumado al pequeño radio de curvatura del capilar genera unfuerte campo eléctrico que causa que el liquido emergente sea una mezcla depequeñas gotas y vapor (nebulización)

Contraelectrodo

CapilarCaudal

LC

Electrospray (ESI): Overview


Fuente de alto voltaje

Mayor abundancia de

iones negativos

Electrospray (ESI)

Mayor abundancia de

iones positivos


Caudal

LC

Capilar a alto voltaje

Cono de TaylorGotas cargadas

positivamente

� Las gotas producidas en la nebulización tienen carga superficial

� Al evaporarse el solvente estas gotas reducen su tamaño, incrementando la repulsión de cargas

Electrospray (ESI)


� Cuando la repulsión de cargas es mayor que la tensión superficial se produce una fisión generando gotas muy pequeñas cargadas eléctricamente.

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

++

+

+

+

+

+FisiónCoulombica

+

+

+

Evaporaciónde solvente

�Mecanismo de desorción iónica

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+++

+++

++++

+

+

++

Electrospray (ESI)


� Mecanismo de carga residual

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ ++++

+

+

+

++

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+

+ +

NN C H3

O

CH 3

H

+ H+

Lidocaina

NN C H3

O

CH 3

H

+

H

Iones positivos - ESI

Electrospray (ESI): Formación de iones


CH 3 CH 3

C H 3

O

OH

C H 3

CH 3

C H 3

O

O

C H 3

CH 3

+ H+

Ibuprofen

Iones negativos - ESI

Muestra

Venteo

Gas de cono

ESIProbe

Presión atmosférica

Vacio moderado

Alto vacio

Electrospray (ESI): Fuente de ionización


Gas de nebulización

Gas de desolvatación

Bomba rotativa Bomba turbomolecularCono extractor

Cono de muestra

Válvula deaislamiento

Lentes RF(Hexápolo) Cuadrupolo

Fragmentos Multi-cargados

Electrospray tiene tendencia a producir iones multi-cargados, permitiendola determinación de pesos moleculares elevados que estarían fuera delrango de trabajo del sistema.

Electrospray (ESI)


Cuando se forman iones multi-cargados m/z ≠ m debido a que z ≠ 1

Para z > 1 resulta m/z < m, la masa aparente del ion es mucho menor quela verdadera

Hemoglobina

1001681.6

A +9A chain (+10, +9, +8)A chain + Heme (+10, +9, +8)B chain (+10, +9, +8)B chain + Heme (+10, +9, +8)


1475 1500 1525 1550 1575 1600 1625 1650 1675 1700 1725 1750 1775 1800 1825 1850 1875 1900 1925 1950 1975 2000 2025m/z0

%

1587.6

1513.6

1575.2

1515.8 1649.31589.9

1764.0

1750.1

1684.1

1891.7

1832.41766.4

1968.81984.3

A +10

B +10

B +9A +8

B +8

A +8heme

B +9heme

A +9heme

B +10heme

A +10heme

� Desventajas

� Fragmentación limitada

� Limitada a bajos caudales de

trabajo

� Ventajas

� Confirmación de pesos

moleculares

� Indicada para analitos iónicos,

muy polares y proticos

Electrospray (ESI)


� Si bien las interfaces (ZSpray)

permiten el trabajo con buffer no

volátiles, altas concentraciones de

modificadores iónicos reducen la

sensibilidad

muy polares y proticos

� Buena sensibilidad

� Moléculas de alto peso molecular

pueden ser determinadas a través

de la formación de fragmentos

multicargados

� Acoplable a cromatografía

liquida, cromatografía capilar y

electroforesis capilar

APcI – Overview

� El liquido es forzado a pasar por un capilar de diámetro pequeño a efectos de proporcionarle una gran velocidad lineal

� La calefacción de la sonda combinada con el gas de nebulización vaporiza el liquido

� Los vapores del solvente y del analito pasan a través de la zona de descarga eléctrica para producir los iones en fase gaseosa


Caudal

LC


APcI Calefactor

(400-650°C)

Vaporizacion

Aguja de descarga

Cono de muestra

Corona de descarga

Vapores de

solvente y analito

APcI – Ionizacion en fase gaseosa

H2O+

H3O+

H2O

N

Region de descarga(Plasma)

Cono de muestra

e-


H2O+

N2+

++

++

+

e- e-

N2+

N2+ H2O

+

H3O+

N2+

H2O

H2O

N2

N2

N2

Corona de descarga2-5 µA

(Plasma)e-

Iones positivos APcI:Mecanismos de formación

1. Protón, transferencia: H3O+ + M (M+H)+ + H2O

CH3OH2+ + M (M+H)+ + CH3OH

CH3CNH+ + M (M+H)+ + CH3CNNH4

+ + M (M+H)+ + NH3+

2. Formación de aductos: NH + + M (M+ NH )+

Más probable


2. Formación de aductos: NH4+ + M (M+ NH4)

+

CH3CNH+ + M (M+ CH3CNH)+

CH3OH2+ + M (M+ CH3OH2)

+

H3O+ + M (M+ H3O)+

3. Intercambio de cargas: N2+. + M M+. + N2

H2O+. + M M+. + H2O

Menos probable

1. Protón, extracción: HO- + M (M-H)- + H2OCH3O

- + M (M-H)- + CH3OHCH2CN- + M (M-H)- + CH3CN

2. Formación de aductos: Cl- + M (M+ Cl)-

Iones negativos APcI:Mecanismos de formación

Más probable


2. Formación de aductos: Cl- + M (M+ Cl)-

CH3COO- + M (M+ CH3COO)-

3. Intercambio de cargas: O2-. + M M-. + O2

4. Captura de electrones: e- + M M-.

Menos probable

Muestra

Venteo

Gas de cono

APCI

Probe

APcI calefactorCorona de descarga Presión atmosférica

Vacio moderado

Alto vacio

APcI: Fuente de ionización




Gas de cono

Bomba rotativa Bomba TurbomolecularCono extractor

Cono de muestra

Válvula de

aislamiento

RF Lentes

(Hexápolo) Cuadrupolo

� Desventajas

� Fragmentación limitada

� Valores de ruido químico muy intensos para bajos valores de

� Ventajas

� Confirmación de pesosmoleculares

� Indicada para analitos neutros

Ionización Química a Presión atmosférica (APcI)


masas

� No es adecuada para moléculas muy poco volátiles

y polares

� Buena sensibilidad

� Robustez, la posición delcapilar y el pin corona no escritica

� Permite trabajar con caudalesde hasta 2 mL/min.

Fotoionización (APPI)

� APPI utiliza la misma punta de ionizacion que APcI con el agregado de una fuente de luz UV en lugar de la corona de descarga

� Al igual que en APcI:

� El liquido es forzado a pasar a traves de un capilar para obtener una alta velocidad lineal

� La calefaccion y el gas de nebulizacion vaporizan el caudal del liquido

� La ionizacion se produce en forma directa o quimica en la region de la luz UV


Caudal LCCalefactor

Vaporización

Fuente UV

Cono de muestra

Vapores de

Solvente y analito

Electrodo

Repeller

hν

� La ionizacion se produce en forma directa o quimica en la region de la luz UV


Direct APPI

M + hv → M+

M + S → MH + S[-H]

El analito M es ionizado a su ion

molecular M+. (Esto ocurre si el

potencial de ionización del analito esta

por debajo de la energía del fotón)


M+ + S → MH+ + S[-H]

Dopant APPI

D + hv → D+

D+ + M → MH+ + D[-H]D+ + M → M+ + D

En presencia de solventes proteicos

M+ puede extraer un átomo de

hidrogeno para formar MH+.

Un dopante fotoionizable es agregado

en alta concentración para generar

iones D+

D+ provoca la ionización de M por

transferencia de un protón o electrón

PhotoMateTM

Kripton 10.0 eV, 10.6 eV

Potenciales de Ionización (IP)

Antraceno 7.4 eV

IP Dopantes (solventes)

Tolueno 8.82 eV



Antraceno 7.4 eV

Fluorantreno 7.8 eV

Cafeina 8.0 eV

4-Nitrotolueno 9.5 eV

Tolueno 8.82 eV

Acetona 9.70 eV

Metanol 10.85 eV

Acetonitrilo 12.19 eV

Agua 12.61 eV

10. eV

Muestra

Venteo

Gas de cono

APCI

Probe

Calefactor Luz UVRepeller

Electrodo

APPI: Fuente de ionización




Gas de cono

Bomba rotativa Bomba TurbomolecularCono extractor

Cono de muestra

Valvula de

aislamiento

RF Lentes

(Hexápolo) Cuadrupolo

Modo de Ionización vs Polaridad

ESI


APcI

APPI

Waters APGC/MS Interface


� APGC

— Atmospheric pressure GC interface

� Mayor rango de compuestos

— LC & GC en un solo instrumento



— LC & GC en un solo instrumento

— Rápido intercambio de la fuente de

ionización

— Espectro APCI

— APGC no es un reemplazo de los

modos tradicionales de ionización

EI o CI en GC/MS

� Transferencia de carga

� N2+ y N4+ se forma en la region del plasma

– N2++M > M+. + N2

– N4++M > M+. + 2N2

� Protonación

� En presencia de trazas de agua.

SOURCE ENCLOSURE

Ion Chamber Corona Discharge

Transfer Line Tip

Cone Column

Modifier Reference



� En presencia de trazas de agua.

�H3O+

– H3O+ + M > MH+ + H20

� modificadores (H2O o MeOH) pueden ser añadidos a efectos de favorecer la protonación

� Ionización mas “blanda” que EI, siendo el ion molecular generalmente predominante y

la fragmentación reducida significativamente.

� La fragmentación para análisis estructural se obtiene a través de CID o MSMS.

Biblioteca NIST

(mainlib ) Benzene, 1,4-dinitro-

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 1800

50

100

12 16

28

30

32

38

43 46

50

53

64

75

79 82 86

92

106

122

138152

168

O

N

O

N

OO

Ionización APGC: Protonación

1,4 Dinitrobenzene


EspectroObtenido M+

Teorico M+.

13:28:17

m/z50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200

%

0

100

%

0

100

APGC160408RUN007_8270 1358 (6.105) Cm (1356:1362-1300:1353) TOF MS AP+ 464169.0248

122.025275.0228

64.0296 76.028694.0407123.0290

152.0225170.0253

APGC160408RUN007_8270 (0.021) Is (1.00,0.10) C6H4N2O4 TOF MS AP+ 9.20e12168.0171

169.0199

1,4-Dinitrobenzene

(mainlib ) Phenol, 2,6-dimethyl-

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 1300

50

100

15 1826

27

29 31

38

39

40

41

42

43

45 47 49

50

51

53

55 60 62

63

64

65

6668 74 76

77

78

79

8082 86 89

91

93

95 98

103

107

122

OH

2,4-Dimetilfenol

Ionización APGC: Transferencia de cargas

Biblioteca NIST


13:28:17

m/z55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130

%

0

100

%

0

100

APGC160408RUN007_8270 998 (4.491) Cm (995:1001-(965:986+1007:1053)) TOF MS AP+ 2.98e3122.0723

107.0498

121.0658 123.0782

APGC160408RUN007_8270 (0.021) Is (1.00,0.10) C8H10O TOF MS AP+ 9.12e12122.0732

123.0766

2,4-Dimethylphenol

EspectroObtenido M+

Teorico M+.

�Mayor de 4 ordenes

�Ejemplo para benzo(g,h,i)perileno 2 pg to 10000 pg

Compound name: Benzo(g,h,i)perylene

Correlation coefficient: r = 0.998814, r^2 = 0.997629

Calibration curve: 0.104709 * x + 0.228912

Response type: External Std, Area

Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: Null, Axis trans: None

0.0

5.0

Compound name: Benzo(g,h,i)perylene

Correlation coefficient: r = 0.992916, r 2̂ = 0.985883

Calibration curve: 0.167382 * x + -82.0944


Curve type: Linear, Origin: Include, Weighting: Null, Axis trans: None

0.0

5.0

Waters APGC/MS Interface: Performance


pg0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Re

sp

on

se

0

20

40

60

80

100

pg

Re

sid

ua

l

-20.0

-15.0

-10.0

-5.0

pg0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000

Re

sp

on

se

0

250

500

750

1000

1250

1500

pg

Re

sid

ua

l

-25.0

-20.0

-15.0

-10.0

-5.0

�Los compuestos indicados exhiben LOD en el rango de fg a pg

�PAH’s

�Anilina y compuestos relacionados

�Halo aromáticos

�Halo carbonados

Waters APGC/MS InterfaceTipo de Compuestos


�Halo carbonados

�Ftalatos

�Nitroso-benzenos y productos relacionados

�Fenoles y clorofenoles

�Eteres fenilicos

�Dibenzofuranos

� Isophorone

�Azobenzenos

Luego que los iones son producidos, son separados de acuerdo asu relación masa / carga (m/z) por un analizador

Analizador


Tipos de Analizadores:

- Magneticos

- Electrostaticos

Analizador


- Tiempo de Vuelo (ToF)

- Cuadrupolos (Q)

- Trampa Iónica (IT)

Principales características

- Rango de trabajo: Rango de m/z que pueden separarse

Analizador


- Transmisión: relación entre el numero de iones producidospor la fuente de ionización y los que llegan al detector

- Resolución: capacidad para separar la señal de dos ionescon pequeñas diferencias de masa.

Un cuadrupolo consiste de dos pares de barras de molibdeno exactamenteparalelas entres si, controladas por la combinación de potenciales deradio frecuencia (rf) y corriente continua (dc).

Cuadrupolo

Solo un ion de una masa especificapuede pasar a través del cuadrupolo


puede pasar a través del cuadrupolocuando se aplica un campo oscilatoriode rf y dc, llegando al detector(generalmente un multiplicador deelectrones o un foto multiplicador).El tiempo de vida de un ion desde suformación hasta su detección es de 50 a100 microsegundos.

+ ++

Cuadrupolo


+

+

++

Los iones son orientados por variacion de voltajes DC/RF aplicados a las barras del cuadrupolo

Cuadrupolo


Cuadrupolo


Una vez que los iones de interés son separados, estos deben ser convertidosen una señal fácilmente interpretable por el sistema de adquisición dedatos. Esta función la cumplen los detectores

Tipos de detectores:

- Multiplicador de electrones (Dynodos)

Detectores


- Multiplicador de electrones (Dynodos)

- Multicanales

- Fotomultiplicadores

Fotomultiplicador Dynolite

�Los iones provenientes del analizador son convertidos en electrones (conversion dynode)

�Estos electrones colisionan con una placa de fósforo que al ser excitada emite fotones

�Los fotones colisionan con un foto cátodo, ubicado en el frente del fotomultiplicador,donde se liberan electrones y se amplifica la señal producida.

�El fotomultiplicador se encuentra encerrado en un ambiente de vacío a efectos deprevenir posibles contaminaciones e incrementar su tiempo de vida.


El software es el corazón del sistema

• Adquisición de datos

• Procesamiento

• Identificación de espectros

• Control absoluto del sistema

Adquisición y procesamiento de datos


Opciones orientadas a diferentes aplicaciones:

QuanLynx (Cuantificación)

ProteinLynx (Identificación y secuenciación de Proteínas

MetaboLynx (Identificación de metabolitos)

NeoLynx (screenig de neonatos)

TargetLynx (Cuantificación, confirmación y limites permitidos)

Cono demuestra

Enfoquede iones Prefiltro Posfiltro

ConversionDynode

API, Simple cuadrupolo MS


Cono deExtracción

Fuente de ionesZ-Spray

Cuadrupolo

DETECTOR

Fósforo

Fotomultiplicador

ACQUITY UPLC + SQD 2


LC-MS: Aplicaciones


Análisis de CarbamatosMonitoreo de residuos en aguas y suelos

Carbamatos: EPA M531.1


Carbamatos, derivatización


Derivatización postcolumna

Bomba

Columna

DetectorCamara mezcladora


Inyector

Bomba reactivo

Reactor

Carbamatos


LC – MS Condiciones


Cromatogramas, TIC y PDA


Methomyl, linealidad


Methomyl en diferentes matrices


m/z 233


Carbamatos, resumen



LCLC--MS/MS MS/MS Sistemas Sistemas TandemTandem

� Mayor Selectividad

� Reduce o elimina las interferencias debidas

a la matriz de trabajo

� Mayor Sensibilidad

LC-MS/MS vs LC-MS

� MS/MS Modos de trabajo

� Full Scan (Barrido)

� Single Ion Recording (SIR)

� Product Ion Scan


� Determinaciones a nivel de trazas, permite

alcanzar menores limites de detección y

confirmación

� Exactitud en análisis cuantitativos

� Reproducibilidad, estabilidad y rango

dinámico

� Cuantificación precisa a muy bajos niveles

de detección sobre matrices complejas

� Robustez

� Reducción del Clean Up de muestras, aun

en matrices complejas

� Precursor Scan

� Constant Neutral Loss

� Multiple Reaction Monitoring (MRM)

API, Cuadrupolo Tandem MS/MS


Cuadrupolo Tandem: Usos

Impurezas, sustancias de degradación

Targets

Confirmación- Compara los tiempos de retención con el Standard

- Relación entre iones específicos SIR/MRM vs Standard

- Cuantificación - trazas


Impurezas, sustancias de degradación Compara los tiempos de Retención con el Standard

- Screening de rutina

- Espectros MS de sustancias conocidas

(Biblioteca)

Confirmación de

estructuras

Sustanciasdesconocidas

Interpretación- Peso Molecular

- Composición elemental

- Elucidación de estructuras

- Secuenciación


Cuadrupolo Tandem: Full Scan Mode

Q1 Modo RF Q2 Scan

Celda de colisión(sin gas)


� El sistema esta operando como un sistema LC-MS de simple cuadrupolo

� Realiza un barrido dentro de un rango especificado m/z

306

250 300 350 400

321

380

200 500

306

250 300 350 400

321

380

200 500

Q2 Scan 200 - 500

Cuadrupolo Tandem: Single Ion Recording (SIR)

Celda de colisión(sin gas)

Q1 Modo RF Q2 Estático


� El sistema esta operando como un sistema LC-MS de simple cuadrupolo

� Se monitorean iones de relación m/z seleccionada

306

250 300 350 400

321

380 Q2 selecciona 306 m/z

306

Cuadrupolo Tandem:Multiple Reaction Monitoring (MRM)

Q1 Estático Q2 Estático

Celda de Colisión(Ar gas)

Fragmentación


� El sistema esta trabajando en modo selectivo, permite que solamente un ion determinado llegue a la celda de colisión para su fragmentación y un fragmento especifico sea detectado.

� Esto modo de trabajo se utiliza principalmente con fines cuantitativos

� Múltiples MRM pueden ser usados, también, como confirmatorios de la presencia de una sustancia.

306

250 300 350 400

321


150 300

158

306

158

158

Q2 selecciona 158 m/z

Fragmentación

Multiple Reaction Monitoring: Selectividad

� MS/MS reduce o elimina las interferencias de matriz

MRM


SIR

Celda de colisión: Cambios de energía

100

%

0

100

%

275

275

230

Energía de colisión = 5 eV

(M + H)+


150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290m/z0

100

%

0

100

%

0

% 230

230

275

230




100

0

100

%

230

Energía celda de colisión = 17 eV

(M + H)+

Celda de colisión: Cambios de energía


150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290m/z0

100

%

0

100

% 167230

201180 202

167

201180 194 230



Product Ion Spectrum: Pirimiphos-methyl

Transición de confirmación

Transición de cuantificación

305 → 290


confirmación305 → 180

TargetLynx: Relación de iones

Peak Area Ratio 0.616

272 → 237Transición de cuantificación

Criterios de confirmación

• Dependiendo de la abundanciarelativa de dos transiciones

(Heptachlor)


Ratio 0.616

274 → 239Transición de confirmación

� > 0.5 ± 10%

� > 0.2 < 0.5 ± 15%

� > 0.1 < 0.2 ± 20%

• Esta relación es usada para confirmar o rechazar resultados positivos

Relación : 0.554 – 0.678 (0.616 ±±±±10%)

Cuadrupolo Tandem: Product Ion Scanning

Q1 Estático Q2 Scan

Celda de colisión(Ar gas)

Fragmentación


� El sistema permite seleccionar un ion de m/z definida, el cual es fragmentado en lacelda de colisión y se detectan todos los fragmentos (product ions).

� Se utiliza principalmente con fines cualitativos

306

250 300 350 400

321


150 300

158

306Q2 Scan 100 -310

150 300

158

306

Fragmentación

Product ion scan

Espectro de fragmentación de la reserpina 609m/z

� Puede ser usado en el

desarrollo de métodos para

identificar los fragmentos de

cuantificación y confirmación

en el modo MRM

Parent Ion


Fragmentos: Péptidos

100286.12

340.17

R SDY F I A T M Y" MAXI


100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200m/z0

%

215.08

160.08

86.09

157.13

802.36

800.39

689.29389.21

417.21

542.24

487.07

418.22

455.22

609.29

608.77668.32

690.28

785.36

986.48803.36

915.43

913.44

804.39

916.47987.48

1087.55

1088.52

(M+2H)2+

MS/MS of m/z 608.8/609.8 (M+2H)2+ peptide annotated with y" ion sequenceFigure 2.

Cuadrupolo Tandem: Precursor Ion Scan

Q2 EstáticoQ1 Scan



� El primer cuadrupolo permite pasar todos los iones (dentro de un rango de barrido especificado)para su fragmentación y luego se detecta un ion de m/z determinada (product ions).

� Se utiliza principalmente con fines cualitativos o screening de sustancias estructuralmenterelacionadas

Se ven todos losIones que producenEl fragmento m/z 79

OH

NH2+

OH

NH2+

OH

NH2+

Iones de m/z = 116 producido por la ruptura del enlace indicado por

Precursor Ion Scan


OH

O

O

OH

O

OH

O

NH

PropranololMW=259

MetoprololMW=267

PindololMW=248

Precursor Ion Scan

100

%

MIX_MS 1 (1.025) Scan ES+ 1.56e9235

268

260249267

280

295

MS Scan de la mezcla


230 240 250 260 270 280 290 300m/z0

100

%

0MIX_PAR 1 (2.070) Parents of 116ES+

5.63e7249

260268

Iones precursores del ion m/z=116

Metoprolol

PropranololPindolol

Cuadrupolo Tandem: Constant Neutral Loss

Q2 ScanQ1 Scan



� El primer y segundo cuadrupolo trabajan en el modo de barrido dentro de un rango determinado demasas, pero el segundo cuadrupolo permite que únicamente los iones que difieren en una determinadamasa (equivalente a la perdida de un fragmento neutro) respecto de Q1 sean transmitidos hacia eldetector.

� Se utiliza principalmente para el screening de familias de compuestos

� Los ácidos carboxílicos se fragmentan perdiendo una molécula neutra de dióxido de carbono CO2

equivalente a una variación de masa de 44 Da o unidades de masa atómica.

� Principalmente utilizado con fines cualitativos

� Se utiliza estratégicamente en trabajos de screening

NN

O

SO O

O

N

O

O

Glu Cys Gly

Glutathione 307.33 daltons

Constant Neutral Loss


NN

O

SO O

O

N

O

O OH

NCOCH3

NN

O

SO

O

OH

NCOCH3

ON

O

O

Perdida de una molécula de

Acido piroglutámico: –129.0426

Interferencias isobáricasPerdida de acido piroglutámico –129.0426

Constant Neutral Loss


GSH Adduct


Análisis de Análisis de OcratoxinaOcratoxina en vinosen vinos

Ocratoxina en vino tinto

ONH

OO

O

OH

Cl

OH

CH3


� Toxina producida por hongos de los géneros Penicillium y Aspergillus

� Frecuentemente encontrada en cereales, uva, café, cerveza y vino

� Se han demostrado efectos carcinogénicos en ratas

� Propiedades nefrotóxicas, teratógenas, inmunotóxicas y posiblemente neurotóxicas en humanos

� MRL de 5 µg/kg en cereales (USA) y 2 µg/L en vinos (CE)

Cl

Método HPLC

� Sistema UPLC H-Class (gradientes cuaternarios e inyector automático)

� Fase móvil A = Agua con 0,1 % de acido fórmico

� Fase móvil B = Acetonitrilo con 0,1 % de acido fórmico

� Gradiente

� Tiempo 0 min 5% B





� Caudal = 0.4 mL/min,

� Los primeros 3 min. se envían a descarte

� Volumen de inyección: 50 µL vino tinto, previa filtración por 0,22 µm

� Columna = Xterra 2,1 x 30 mm, 3.5µ

Método MS

�Detector Cuadrupolo Tandem XEVO TQD

� Ionización: Electrospray, iones positivos

�Se monitorean las siguientes transiciones


Precursor Ion(m/z)

Product Ion(m/z)

Dwell Time(sec)

ConeVoltage

(V)

CollisionEnergy

(eV)403.9 238.9 0.1 21 25403.9 357.9 0.1 21 15405.9 240.9 0.1 21 25

Cromatogramas: Estándar ocratoxina

Ochratoxin, 2.39 ug/L

0

100

%

16May_042 Sm (Mn, 1x2) MRM of 3 Channels ES+ 405.9 > 240.9

7.34e3Area

3.66;322


3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40Time0

100

%

0

100

%

016May_042 Sm (Mn, 1x2) MRM of 3 Channels ES+

403.9 > 357.91.87e4

Area

3.66;823


2.32e4Area

3.67;1033

Ochratoxin, Wine Spiked at 1.0 ug/L

0

100

%


4.39e3Area

3.66;198

16May_045 Sm (Mn, 1x2) MRM of 3 Channels ES+

Cromatogramas: Ocratoxina en vino tinto


3.20 3.40 3.60 3.80 4.00 4.20 4.40Time0

100

%

0

100

%


1.07e4Area

3.66;467


1.32e4Area

3.66;567


Análisis de pesticidas en pasas Análisis de pesticidas en pasas de uvasde uvas

Federal Institute for Risk Assessment, Berlin, Germany

Preparación de muestra

� Muestra: Pasas sin semillas secadas al sol (Variedad Thompson -California)

� Molienda

� Una alícuota de 5 gramos es homogeneizada

� Se añaden 9 mL de agua

� Después de 10 min. se añaden 20 mL de metanol


� Después de 10 min. se añaden 20 mL de metanol

� 6 mL del extracto se mezclan con 2 mL de una solución de Cloruro de sodio

� 5 mL de la mezcla son transferidos a una columna conteniendo tierra de diatomea

� Después de 5 min. la columna es eluida con 16 mL. de diclorometano.

� Se lleva a sequedad y se reconstituye con 250 uL de metanol

� Se adicionan 1 mL de agua, se homogeniza y se filtra a un vial

� Matriz blanco: Pasas sin semillas secadas al sol cultivadas organicamente (Variedad Thompson - California)

Preparación de matrices y blancos


� Para la preparacion, extraccion y clenup se utiliza el mismo procedimiento que para las muestras

� Todos los analitos son agregados a la matriz en un rango de concentracion equivalentes a 1, 2, 5, 10, 20 µg/kg

Metodo UPLC

�Sistema HPLC Acquity H-Class

� Fase móvil A = Metanol/Agua (1:4 v/v) + 5mM Acetato de Amonio

� Fase móvil B = Metanol/Agua (9:1 v/v) + 5mM Acetato de Amonio

� Columna = Waters ACQUITY UPLC BEH C18 2.1 mm id × 100 mm con partículas de 1.7µm


� Caudal = 0.45 mL/min

� Volumen de inyección = 20 µL

� Temperatura de columna = 40 °C

� Gradiente: Tiempo total 13,5 minutos

Tiempo (min.) %’ B

0 0

8.5 100

11.0 100

11.1 0

Método MS

�Detector Cuadrupolo Tandem XEVO TQ-S

� Modo de ionizacion: ES+/ES-

� Voltaje del capilar: 0.8 kV (ES+ y ES-)

� Caudal del gas nitrogeno: 800 L/hr


� Caudal del gas nitrogeno: 800 L/hr

� Temperatura de la fuente: 120 C

� Temperatura de desolvatacion: 400 C

� Voltaje de cono: Compuesto dependiente

� MS/MS: En modo MRM

� Voltaje de la celda de colision: Compuesto dependiente

Método MRM

�Funciones MRM distribuidas en 26 ventanas de tiempo

� Cambio de polaridad (iones negativos y positivos)

� Permite la obtención de mayor sensibilidad para todos los analitos


Listado de 100 pesticidas incluidos

5-Hydroxy-clethodim-sulfon Clethodim-sulfon Imazalil Propoxur

6-chloro-4-hydroxy-3-phenyl-pyridazin Clethodim-sulfoxid Imidacloprid Prosulfuron

Acephate Cyprodinil Indoxacarb Pymetrozin

Aldicarb Daminozid Ioxynil Pyridate

Aldicarb-sulfoxid Demeton-S-methyl-sulfon Iprovalicarb Pyrimethanil

Aldoxycarb Desmedipham Isoproturon Quinmerac

Amidosulfuron Difenzoquat methylsulfate Isoxaflutole Quizalofop-ethyl

Atrazin Diflubenzuron Linuron Rimsulfuron

Azoxystrobin Dimethoat Metalaxyl Spiroxamine

Bendiocarb Diuron Metamitron Tebuconazol


Bendiocarb Diuron Metamitron Tebuconazol

Bensulfuron-methyl Ethiofencarb Methamidophos Tebufenozide

Bromoxynil Ethiofencarbsulfon Methiocarb Teflubenzuron

Butocarboxim Ethiofencarbsulfoxid Methomyl Thiabendazol

Butoxycarboxim Fenhexamid Metolachlor Thiacloprid

Butoxycarboxim-sulfoxid Fenoxycarb Metsulfuron-methyl Thifensulfuron-methyl

Carbaryl Fenpropimorph Monocrotophos Thiodicarb

Carbendazim Flazasulfuron Nicosulfuron Thiofanox

carbofuran Florasulam Omethoat Thiofanox-sulfon

Carbofuran-3-hydroxy Fluazifop-P-butyl Oxamyl Thiofanox-sulfoxid

Chlorsulfuron Fludioxonil Oxydemeton-methyl Triasulfuron

Cinosulfuron Flufenoxuron Phenmedipham Triflumuron

Clethodim Formetanate Pirimicarb Triflusulfuron-methyl

Clethodim-imin-sulfon Furathiocarb Primisulfuron methyl Vamidothion

Haloxyfop-ethoxyethyl Promecarb

Parámetros MRM

Pesticide ResiduePrecursor

Ion (m/z )

Product Ion

(m/z )

Cone

Voltage (V)

Collision

Voltage (V)

Dwell Time

(ms)

Daminozid 161.1 143.1 18 12 200

93.8 22 14 80

124.9 22 13 80

Acephate 184.1 143.0 16 8 40

Butoxycarboxim-sulfoxide 207.1 132.1 17 6 30

183.0 20 12 30

154.9 20 15 30

132.0 16 10 30

89.0 16 14 30

Methamidophos 141.8

Omethoate 214.0

Aldicarb-sulfoxide 207.1


89.0 16 14 30

Butoxycarboxim 240.1 106.1 10 14 30

Aldoxycarb 240.1 86.0 15 20 30

Oxamyl 237.1 71.9 12 10 30

102.0 25 17 30

144.0 25 12 30

Oxydemeton-methyl 247.0 169.0 20 13 10

Pymetrozin 218.0 105.0 25 17 10

77.0 35 30 10

104.0 35 21 10

87.8 15 8 10

105.9 15 10 10

169.1 28 16 10

121.2 28 16 10

Quinmerac 222.0 141.0 22 33 10

Monocrotophos 224.0 126.9 20 15 10

109.0 18 18 10

167.1 18 9 10

Propamocarb 189.1

6-chloro-4-hydroxy-3-phenyl-

pyridazin207.1

Methomyl 162.9

Demeton-S-methyl-sulfon 263.1

Bendiocarb 224.1


Ion (m/z )

Product Ion

(m/z )

Cone

Voltage (V)

Collision

Voltage (V)

Dwell Time

(ms)

Nicosulfuron 411.0 182.1 22 18 10

Amidosulfuron 370.0 261.2 18 14 10

Metsulfuron-methyl 382.0 167.0 22 15 10

Thifensulfuron-methyl 388.0 167.1 22 15 10

Ethiofencarbsulfon 275.1 107.1 10 20 10

Rimsulfuron 431.9 182.1 30 22 10

Ethiofencarbsulfoxide 242.1 107.0 18 18 10

Thiofanox-sulfoxide 252.1 104.0 10 12 10

209.2 22 16 10

Parámetros MRM


209.2 22 16 10

175.1 22 20 10

Florasulam 360.1 129.0 30 20 10

5-Hydroxy-clethodim-sulfon 408.2 204.2 22 16 10

Thiofanox-sulfon 268.1 76.0 10 10 10

Clethodim-imin-sulfon 302.2 98.1 35 30 10

Metamitron 203.0 175.1 28 16 10

Cinosulfuron 414.1 183.1 25 18 10

141.1 25 16 10

167.1 25 16 10

Bromoxynil* 273.9 78.9 40 25 30

125.1 17 20 10

199.1 17 10 10

Clethodim-imin-sulfoxide 286.2 208.2 25 17 10

Vamidothion 288.1 146.1 17 12 10

Carbofuran-3-hydroxy 220.1 163.1 25 10 10

Flazasulfuron 408.1 182.1 25 22 10

Imidacloprid 256.1

Chlorsulfuron 358.1

Dimethoate 230.1


Ion (m/z )

Product Ion

(m/z )

Cone

Voltage (V)

Collision

Voltage (V)

Dwell Time

(ms)

Nicosulfuron 411.0 182.1 22 18 10

Amidosulfuron 370.0 261.2 18 14 10

Metsulfuron-methyl 382.0 167.0 22 15 10

Thifensulfuron-methyl 388.0 167.1 22 15 10

Ethiofencarbsulfon 275.1 107.1 10 20 10

Rimsulfuron 431.9 182.1 30 22 10

Ethiofencarbsulfoxide 242.1 107.0 18 18 10

Thiofanox-sulfoxide 252.1 104.0 10 12 10

209.2 22 16 10

Parámetros MRM


209.2 22 16 10

175.1 22 20 10

Florasulam 360.1 129.0 30 20 10

5-Hydroxy-clethodim-sulfon 408.2 204.2 22 16 10

Thiofanox-sulfon 268.1 76.0 10 10 10

Clethodim-imin-sulfon 302.2 98.1 35 30 10

Metamitron 203.0 175.1 28 16 10

Cinosulfuron 414.1 183.1 25 18 10

141.1 25 16 10

167.1 25 16 10

Bromoxynil* 273.9 78.9 40 25 30

125.1 17 20 10

199.1 17 10 10

Clethodim-imin-sulfoxide 286.2 208.2 25 17 10

Vamidothion 288.1 146.1 17 12 10

Carbofuran-3-hydroxy 220.1 163.1 25 10 10

Flazasulfuron 408.1 182.1 25 22 10

Imidacloprid 256.1

Chlorsulfuron 358.1

Dimethoate 230.1


Ion (m/z )

Product Ion

(m/z )

Cone

Voltage (V)

Collision

Voltage (V)

Dwell Time

(ms)

167.1 25 17 10

141.0 25 20 10

Clethodim-sulfon 392.1 300.2 20 12 10

Clethodim-sulfoxide 376.1 206.2 22 15 10

160.1 25 18 10

132.1 25 30 10

Thiacloprid 253.0 126.0 28 22 10

Difenzoquat methylsulfate 249.2 193.1 45 28 10

Butocarboxim 213.1 75.0 20 14 10

Triasulfuron 402.0

Carbendazim 192.1

Parámetros MRM


Butocarboxim 213.1 75.0 20 14 10

Aldicarb 208.1 116.0 7 7 10

Ioxynil* 369.8 126.9 40 30 20

Carbofuran 222.3 165.2 25 15 10

Iodosulfuron 508.2 167.2 25 18 30

175.1 40 25 20

131.0 40 32 20

Propoxur 210.1 111.0 14 15 10

Formetanate 222.1 165.2 20 12 10

141.1 25 20 10

167.0 25 18 10

Carbaryl 202.1 145.0 18 10 10

Bensulfuron-methyl 411.1 149.1 25 22 10

107.1 15 15 10

164.1 15 8 10

Primisulfuron methyl* 466.9 226.2 20 15 10

Triflusulfuron-methyl 493.0 264.2 28 20 10

Thiodicarb 355.1 87.9 15 16 10

Thiofanox 219.0 56.9 15 18 10

Thiabendazol 202.0

Prosulfuron 420.0

Ethiofencarb 226.1


Ion (m/z )

Product Ion

(m/z )

Cone

Voltage (V)

Collision

Voltage (V)

Dwell Time

(ms)

72.0 28 18 10

182.1 28 15 10

Atrazin 216.1 174.1 30 17 10

Isoproturon 207.1 72.1 25 18 10

Isoxaflutole 377.1 251.2 15 20 10

220.2 20 13 10

192.2 20 17 10

Diuron 233.1 72.1 25 18 10

3,4,5-Trimethacarb 194.1 137.1 18 10 10

Pirimicarb 239.1

Metalaxyl 280.1

Parámetros MRM


3,4,5-Trimethacarb 194.1 137.1 18 10 10

Clethodim 360.2 164.1 20 19 10

Desmedipham 318.2 182.2 17 12 10

Phenmedipham 301.1 168.0 25 10 10

160.0 28 16 10

182.1 28 15 10

107.0 42 22 10

82.0 42 25 10

372.2 22 15 10

329.2 22 30 10

Methiocarb 243.1 121.0 10 22 10

180.1 45 28 20

126.1 45 35 20

151.0 20 9 10

109.0 20 15 10

Iprovalicarb 321.2 119.1 15 18 10

97.0 35 25 10

55.1 35 35 10

Linuron 249.1

Pyrimethanil 200.1

Azoxystrobin 404.1

Fludioxonil* 247.0

Promecarb 208.1

Fenhexamid 302.1


Ion (m/z )

Product Ion

(m/z )

Cone

Voltage (V)

Collision

Voltage (V)

Dwell Time

(ms)

176.1 20 25 10

252.1 20 15 10

133.0 13 20 10

297.2 13 8 10

Fenoxycarb 302.1 88.0 20 20 10

93.1 45 33 10

108.1 45 25 10

Tebuconazol 308.1 70.0 30 20 10

159.0 30 20 10

Metolachlor 284.1

Tebufenozide 353.2

Cyprodinil 226.2

Imazalil 297.1

Parámetros MRM


69.1 30 20 10

156.0 25 18 10

139.0 25 37 10

Haloxyfop-methyl 376.1 316.2 30 18 10

Indoxacarb 527.9 218.1 28 20 10

Hexaflumuron* 459.1 276.1 22 22 30

Quizalofop-ethyl 373.1 299.2 30 19 10

282.2 32 22 10

328.2 32 16 10

Haloxyfop-ethoxyethyl 434.0 316.2 25 20 10

Spiroxamine 298.3 144.1 30 20 10

Furathiocarb 383.1 195.1 20 16 10

Diflubenzuron 311.0 158.1 30 14 10

196.0 18 25 10

339.1 18 15 10

Flufenoxuron 488.9 158.1 25 18 10

Pyridate 379.1 207.1 25 16 120

Fenpropimorph 304.2 147.2 45 30 120

Imazalil 297.1

Triflumuron 359.1

Fluazifop-P-butyl 384.1

Teflubenzuron* 379.0

TIC 10 µg/kg en matriz

100100


Time0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

%

0 Time0.00 1.00 2.00 3.00 4.00 5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00

%

0

Compound name: Carbendazim




Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

80000

100000

Carbendazim

%

0

100

F9:MRM of 12 channels,ES+

192.1 > 160.1

1.092e+005

acquityraisin201204_013

1 ppb matrix matched standard Carbendazim

2.97

2.853.06


ppb0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0

Re

sp

on

se

0

20000

40000

60000

80000

10 µg/kg

1 to 20 µg/kg

min2.40 2.60 2.80 3.00 3.20 3.40

%

0

100


192.1>132.1

1.784e+004


1 ppb matrix matched standard Carbendazim

2.97

2.48 2.86

3.11

3.193.35 3.51

min0

Compound name: Cyprodinil




Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None

12000

14000

Cyprodinil

%

0

100


226.2 > 93.1

1.952e+004


1 ppb matrix matched standard Cyprodinil

7.17

6.82 7.067.27

7.507.42 7.59


ppb0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0

Re

sp

on

se

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

min6.800 7.000 7.200 7.400 7.600

%

0

100


226.2>108.1

1.532e+004


1 ppb matrix matched standard Cyprodinil

7.17

7.016.88 7.29 7.37 7.407.49 7.57

min0

10 µg/kg

1 to 20 µg/kg

Muestras reales


256.1 > 209.2

1.414e+004


californian raisin sample

Imidacloprid


353.2 > 133

3.078e+004



Tebufenozide

2.2 µg/kg 1.7 µg/kg

La presencia de imidacloprid y tebufenozide fue confirmada a través del presente método


min1.800 1.900 2.000 2.100 2.200 2.300 2.400

%

0

100


256.1>175.1

1.875e+004



Imidacloprid

1.971.76

1.881.842.07 2.372.28

min

%

0

1001.414e+004Imidacloprid

2.09

min6.800 7.000 7.200 7.400 7.600

%

0

100


353.2>297.2

3.059e+004



Tebufenozide

min

%

0

1003.078e+004Tebufenozide

6.86

7.36

7.15 7.227.637.547.497.47

Conclusiones

�Metodo rapido para la deteccion de 100 pesticidas en forma conjuntaaplicable al analisis de pasas de uvas

�Especificidad y rendimiento

� Resolucion y tiempos de analisis cortos (UPLC)

� Metodos MRM en funcion del tiempo que permiten la incorporacion detransiciones de confirmacion


transiciones de confirmacion

� Deteccion conjunta de iones positivos y negativos

�La sensibiliadad obtenida, acorde a los mayores requerimientosinternacionales existentes, permite aplicar esta metodologia adiferentes matrices.

�En la actualidad la metodologia presentada se ha extendido a 400pesticidas ¡¡¡¡¡¡

Listado de 400 pesticidas


Aplicaciones de interés

�Natamicina y antibióticos en general

�Aminoácidos

�Antocianinas


�Polifenoles

�Antioxidantes

�Resveratrol

�Certificación de origen

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Espectrometría de masas - · PDF fileseparación en el cual los componentes de la muestra a ser ... debidos a la abundancia natural isotópica de los elementos ... (fuente de ionización)