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Di r ecci ó n:Di r ecci ó n: Biblioteca Central Dr. Luis F. Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires. Intendente Güiraldes 2160 - C1428EGA - Tel. (++54 +11) 4789-9293
Co nta cto :Co nta cto : [email protected]
Tesis de Posgrado
Estudio del ácido nucleico en elEstudio del ácido nucleico en elvirus de la fiebre hemorrágica devirus de la fiebre hemorrágica de
simiossimios
Sagripanti, José Luis
1983
Tesis presentada para obtener el grado de Doctor en CienciasQuímicas de la Universidad de Buenos Aires
Este documento forma parte de la colección de tesis doctorales y de maestría de la BibliotecaCentral Dr. Luis Federico Leloir, disponible en digital.bl.fcen.uba.ar. Su utilización debe seracompañada por la cita bibliográfica con reconocimiento de la fuente.
This document is part of the doctoral theses collection of the Central Library Dr. Luis FedericoLeloir, available in digital.bl.fcen.uba.ar. It should be used accompanied by the correspondingcitation acknowledging the source.
Cita tipo APA:Sagripanti, José Luis. (1983). Estudio del ácido nucleico en el virus de la fiebre hemorrágica desimios. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1811_Sagripanti.pdf
Cita tipo Chicago:Sagripanti, José Luis. "Estudio del ácido nucleico en el virus de la fiebre hemorrágica de simios".Tesis de Doctor. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Universidad de Buenos Aires. 1983.http://digital.bl.fcen.uba.ar/Download/Tesis/Tesis_1811_Sagripanti.pdf
Tesis 1811
53.2
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES
ESTUDIO DEL ACIDO NUCLEICO
EN EL VIRUS DEL-LA
FIEBRE HEMORRAGICA DE SIMIOS
Autor José Luis Sagripanti
Director: Dr. ManethGravell.
Tesis presentada para optar al Título de :
DOCTOR EN CIENCIAS QUIMICAS
181181.2.
A G R A D E C I M I E N T 0 S
A mi padre que con su vida de intenso sacrificio y con
tinuo esfuerzoywúesde los 7 años en que cargaba fardos pa
ra llevar al puerto hasta el importante puesto que ocupa
hoy en día fue siempre para mi un ejemplo de hombria de
bien, responsabilidad y absoluta honradez, y a quien siegpre trataré de imitar.
A mi madre, que por haber renunciado a sus actividades
durante mi primera infancia y dedicado en ese periodo to
do su tiempo y atencion me llenó de inquietudes que evita
ron me transformara en uno más de los productos masivos.. . ..Iproou01dos por la telev151on.
. u . I A mi companera y esposa, por haber seguido ocupandose
de mi y de nuestra casa aún cuando se desmoronara el Uni
verso, y haberme permitido seguir pensando en el UniverI - n .so, aun cuando se estuV1era desmoronando nuestra casa.
A mi Director de Tesis por haberme permitido trabajar
en su laboratorio.
A la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la
Universidad Nacional de Buenos Aires, gracias a cuya am. ° o . . Iplitud de criterio, se mepermite esta presentac1on.
Al Dr. Humberto A. Riccomi por su apoyo y estimulol . Iconstante aSi comopor su confianza en mi.
Al Dr. Eduardo H. Charreau, de quien tuve el honor de1 l . . . . .aprender la metodologia de la investigaCión Cientifica.
A mi consejera de estudios, la Dra. Leonor San Martin
de Viale por la paciencia y eficacia con que se ocupó de. l . .mis tramites y estudios.
Al Dr. Rubén Zandomenipor la valiosa colaboración en
los trabajos de CAP.
Al Dr. Jon Condra por los generosos consejos y la digo Í - . ucu51on de los trabajos de traducción in Vitro.
A los Dres.TMe13rIantos por el diligente manojodelosI . .tramites de esta Te51s.
A la Srta. Haría Angélica Gil por la responsabilidad
superlativa desempeñadaen la transcripción del manusqjto.
Vaya también mi más preciado reconocimiento a todosaquellos investigadores e investigadoras que tgdos losdias exponen sus vidas trabajando con drogas toxicas oradioactivas, manipuleandoorganismos infecciosos o e;trayéndose sangre para proseguir sus-experimentos, sinesperar ver sus nombres en plazas o aVenidas, ni contrcon privilegios por trabajo peligroso, dobles sueldos. . .I.._ .por estado de sitio o prerrogativas ecle51asticas o d;plomaticas, sino por el contrario recibiendo, cuandono el desprecio, la indiferencia de la mayoria de losgobernantes.
Sin privilegios, repito, que tampocoexigen porqueno necesitan bañarse de celeste y blanco en un desfileo una cancha de foot ball ya que no es patrioterismo sino amor a la Patria y a la Humanidadtoda, lo que loslleva dia a día a librar una batalla contra la incomprensión, la ignorancia y la mentira, en el convencimiento de'que por medio del conocimiento y la verdad,ayudan anonimamente a que el hombre aumente sus diferegcias con la animalidad, perfeccionando ese don Divinoque es el Espiritu Humano.
INDICE
Página
INTR ODUCCION GENERAL I . l
Conceptos generales de Genética Molecular I.h
Organización de la Cromatina I.5
Replicación del RNA 1.10
Organización del genomaeucariótico 1.15
Estructura de RNAmensajero 1.28
Expresión de la Información Genética I.h6
La duplicación de los virus 1.67
Características de los Togavirus I.83
El virus de la Fiebre Hemorrágica de Simios I.116
OBJETIVOS DE LA PRESENTE INVESTIGACION 1.130
MATERIALES y METODOS M.l
i. Cultivo de células MA-104 M.2
ii. Infección de células MA-lohcon virus
SH'F 14.3
. . . , . l ,1 3 . . ¡, 1+111. harcac1on del RuAcon H-urldlna u.. . I 11V. Extracc1on cel RNAde monocapas de
células infectadas M.5
vi.vii.
viii.
X.
Xi.
xii.xiii.
xiv.
xvi.xvii.
xviii.
Dosaje de la radioactividad prec;pitable con TCA
Dosaje del virus SHF
Purificación del virus SHF. t . . .Preparac1on del-Virus Sindbis pu
rificadoV . I . 32marcaCion del Virus SHF con P
Ultracentrifugación del virión deSHF
Estimación de la proporción deácido nucleico
Obtención de nucleocápsides
Digestión enzimática de las nuclegIcapsides
.1, ' ' 'harcacion de Virus SHFcon S. I .aminoa01dos
Determinación de la densidad de
la nucleocápsideExtracción enzimática de RNA
Ultracentrifugación del RNAdelvirus SHF
RNA de
iónicasUltracentrifugación delSHFa distintas fuerzas
ii
M.1O
M.ll
M.12
I'ÏoM.1h
M.1h
M.15
14015
M.16
M.17
M.18
xixg
xxii.
xxiii.
xxiv.
xxvi.
xxviii.
Densidad del RNAdel virus SHF
Composición del RNA de SHF
Electroforesis del RNAen geles
de agarosa con formaldehído
Detección de RNAen geles de aga
rosa por autorradiografía
Cromatografía de afinidad a colug
nas con oligo dT-celulosa
Hibridización de RNAde SHF a po
li uridina y poli citidinaMarcación de RNAde Virus SHF con
3H-adenina
Aislamiento enzimático de la se
cuencia poli A
Electroforesis en geles no acuosos de poliacrilamida
Detección autorradiográfica de3H en geles de poliacrilamida
Electroforesis en geles de poli Im
crilamida con urea 7bí
Recuperación del RNAde geles de
poliacrilamida
iii
Página
M.l9
M.20
4.23.
¿.25
M.26
í.27
H.28
Mo28
H.3O
H.3l
M.32
14.33
xxxi.
xxxii.
xxxiii.
xxxiv.
xxxvi.
xxxvii.
xxxviii.
xx>cix.xl.
X11.
Página. . ' .Comp051c1ondel fragmento resig
tente a RHAsas A + T1 del RNAde
SHF Mo35
Aislamiento del CAPdel RNAdel
virus SHF M.35
Marcación del virus SHFcon metíl
-metionina M.38
Análisis cromatográficos de ba
ses metiladas M.38
Estudios cinéticos de incorporacián de trazadores radioactivos M.HO
Extracción enzimática del RNAeglular M.41
Tratamiento del RNAcelular con
RNAsa y DHAsa M.42
Digestión del RNAcon nucleasa
sl 111.42
Tratamiento del RNAcon LiCl 21-: 14.43
Cinética de incorporación de am;noficidos radioactivos en células
infectadas con virus SHF H.hk
Preparación de polirribosomas H.H#
xlii. Ultracentrirugación de polirrihgSOElaS
xliii. Disgregación de polirribosomasxliv. Traducción de RNAin vitro
I. ANALISIS DEL VIRION DE SHF
RESULTADOS
a. Optimización de las condiciones de
marcaje isotópico del Virus SHF
b. Estudios del virión de SHF
c. Estudio de la nucleocápside deSHFDISCUSION
II. CARACTERISTICAS FISICOQUIMICAS DEL ACIDO
NUCLEICO DEL VIRUS SHF
RESULTADOS
a. Condiciones para la obtención delRNA de SHF
b. Coeficiente de sedimentación del
RBAdel Virus SHF
c. íaturaleza simple o doble hebradel REA del virus SHF
Página
M.hs
M.h6
M.h7
R.2
R.12
3.16
8.25
R.26
R.28
R.32
d.
e.Composición del RNAdel virus SHF
Peso molecular del RNAdel virus
SHF
DISCUSION
III. ESTUDIO DEL ACIDO POLIADENILICO EN EL RNA
DEL VIRUS SHF
RESULTADOS
a.
f.DISCUSION
Determinación de la presencia de
poliadenina en el RNAde 8h
Especies con y sin poli A de RNA
de virus SHF
Proporción del fragmento de poli
A en el RNA de SHF
Coeficiente de sedimentación del
fragmento de poli A en el RNAdel
virus SHF
Peso molecular del poli A del v;rus SHF
Composición del fragmento aislado
vi
Página
R-35
R-39
R.h#
RQh7
R.h8
Ro55
3-57
Ro59
td o 0‘ H
R.6%
R.68
Página
IV. ESTUDIO DEL CAP EN EL RNA DEL VIÉUS SHF R.72
RESULTADOS
a. Determinación e identificación
del CAPpresente en el RNAdel
virus SHF R.75
b. Estado de metilaci6n del RNAen
el virus SHF Ro79
DISCUSION R.81
V. SINTESIS DEL RNA DE SHF EN CELULAS INFECTA
DAS R.8h
RESULTADOS
a. Cinética de síntesis del RNAde
SHFen células infectadas R.88
b. Especies de RNApresentes en cé
lulas infectadas con virus SHF R.9l
c. Peso molecular de las especiesde RNAcelular R.96
d. Intermediarios de cadena doble
en la sintesis del RNA R.103
e. Caracteristicas de los intermediarios de doble cadena R.106
DISCUSION
VI. IDENTIFICACION DEL RNA MENSAJERO DEL VIRUS
SHF
RESULTADOS
a.
b
DISCUSION
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFIA
Cinética de la síntesis proteica encélulas infectadas con virus SHF
Presencia y análisis de secuencias
poliadeniladas en el RNAde célulasinfectadas con virus SHF
Estudios del RNAunido a polirribosomasen células infectadas con
virus SHF
Traducción in vitro del RNAgenóq;
co del virus SHF
Página
R.115
B.121
R.12k
R.126
R.136
R.1h5
R.1h8
R.153
SHF
DNA
RNA
mBNA
hnRNA
rRNA
tRNA
RHAdc
RNAsc
RNA +
RH —
RNApoli A(+)
RNApoli A(-)
RNP
DHAsa
RNAsa
poli A
oligo dT
A B R E V I A T U R A S
virus de la fiebre hemorrágica de simiosácido desoxirribonucleicoácido ribonucleico
RNAmensajero
RNAheterogéneo nuclear
RNAribosomal
RNAde transferencia
RNAde doble cadena o dúplex
RNAde hebra única o simple cadena
RNAcuya hebra es de la misma polaridad
que el RNAque actúa como mensajero
RNAde polaridad complementaria al RNA+
RNAque posee una secuencia poliadenilada
RNAque no posee una secuencia poliadenilada
ribonuclcoproteinadesoxirribonucleasaribonucleasa
poliadenosinaoligo desoxitimidina
PFU
PI
act. D
DRB
SAM
SAH
SDS
EDTA
TNE
RSB
PBS
U)
rpm
cpm
mm
gm
efecto citopático o citopatológicounidades formadoras de placas de lisis
post-infecoiónactinomicina D
5,6-dicloro-l-D-ribofuranosilbencimidasolS-adenosil metionina
S-adenosil homocisteina
dodecil sulfato de sodioácido etilendiamino tetraacético
buffer Tris-HCl 0,02M, NaCl 0,15M, EDTA
0,001lí.buffer estandard de reticulocitos! Tris-HCl
10 mM, NaCl 10 mMMg 012 3 mM, pH 7,5.
buffer salino de fosfatos 0,2M, pH 7,2
unidad Svedberg de sedimentacióndensidad
indice de refracción
revoluciones por minuto
cuentas por minutonanómetro
milímetros
gramos
9C
fuerza de gravedadmililitro
f I .centlmetro cublco
horas
minutos
molar
milimolar
grado centígrado
Introducción General
Desde siempre, el interés del autor fue intentar com
prender que es la Vida.
Obviamente tal objetivo parecerá a muchosvanidosameg
te ambicioso, quizás hasta blasfemo; o a alguien, queaqug
lla pregunta deberia haber quedadoen 1a pasada infancia
habiéndola reemplazado por objetivos más lógicos de 1a
madurez ...; en fin, sólo puede contestarse comoalguien
dijo, lo más importante quizás no sea llegar, sino la big
queda.
La primera aproximación a comprender la vida, quizás
sea estudiar como se desarrolla, comose perpetua, como
se regula; es decir, comofunciona.
De las muchas cuestiones que aqui podrían plantearse
sería, creo, de capital importancia preguntar:¿ Comose
determinan las características de los seres vivos?, esdecir, ¿comose regulan y perpetúan a través de la larga cadena de la vida?
En esencia,'esta pregunta es la mismaque se hacia
Tito Lucrecio un siglo antes de Cristo cuando en su Re
rum Natura escribia:
"Desde tiempos remotos el ganado lanar, la estirpe gue
rrera de los caballos y el ganado bovino han vivido bajo
una misma temperatura, han usado los mismos pastos, han
bebido en los mismossurtidores de agua y respirado los
mismos aires; no obstante, sus especies han sido siempre
muydistintas y cada individuo ha conservado por heren
cia los instintos y las costumbres de sus respectivos pgdres."
Dando un gigantesco salto en el tiempo, podemos releer
los trabajos de Charles Darwin(l, 2) y los naturalistasde mediados del siglo pasado, tratando de explicar la di
'versidad de los seres vivos. Asi comolos trabajos de Gre
gorio Mendel (3) sobre la herencia del color y forma de
sus arvejas, por el mismo tiempo en que Claude Bernard
publica su "Introducción al Estudio de la Medicina Expe
rimental" y Pasteur culmina sus estudios sobre la fermeg.' .l I
ta01on y la generac1on espontanea.
fi I. .. Iachadas las bases de la Genetica, la FiSiologia y laI. 1' . . IBioquimica, lo demas es de conoc1da consecuenc1a: prote;
I . . . Inas, ac1dos nucleicos, cromosomas,ribosomas, enzimas,l¿
pidos, glúcidos, hormonas, receptores, anticuerpos, mem
branas, núcleo, citoplasma, virus, plásmidos, un sinnúmg
ro de moléculas y orgánulos, mecanismosy respuestas, ig
teracciones y regulaciones; y todos apuntando a la lejae
na y filosófica meta de responder! ¿Qué es la vida¿
Conceptos generales de Genética Molecular
Comoel cúmulode la investigación realizada en el
campode la genética molecular está orientada en gene
ral, a su aplicación en sistemas formados por células
eucarióticas y en particular al hombre, se describiráprimero y en forma muyresumida, el conocimiento ac
tual sobre la organización y expresión genética en o;
ganismos superiores, indicando similitudes y diferen
cias con los sistemas virales, donde fueron muchas Vg
ces caracterizados previamente, dado su mayor simplicidad.
Esta parte de la introducción fue extractada en bug
na medida de los excelentes tratados de B. Lewin (h) y
de J. watson (5), siendo ampliada en puntos de especí
fico interés posterior, con las referencias que se indican.
Organizacion de la Cromatina
El material genético puede observarse en forma condeg
sada en el núcleo celular durante la mitosis, recibiendo
el nombre de cromosomas, mientras que durante la interfg
se, se encuentra formando una malla difusa conocida comocromatina.
Sabemosahora que este ciclo de condensación y dispeg
sión no es discontinuo, comopodria parecer al microsco
piofi que es un proceso continuo de manera que pode
mos cs sïderar cromatina y cromosomascomo términos dis
tintos para "estados" distintos de una mismacosa.
La mayoría del material comosómicoestá formado por la
denominada eucromatina, que es el que pasa por el ciclo
de condensación y dispersión en cada división celular su
cesiva, siendo el sitio de ubicación de los genes que SGI
expresados en cada tejido.
Algo del material genético no se dispersa al final de
la mitosis, permaneciendo en cambio condensado. Estas rg
giones son conocidas comoheterocromatina, encontrándose
los formandoregiones relativamente cortas de materialdensamente teñible (DNAfuertemente enroscado); que apa
rese constantemente en lugares característicos para cada
par de cromosomas, siendo esta denominada heterocromati
na constitutiva (para una revisión Ver (6)).
La heterocromatina facultativa se asemeja a la const;. I . .tutlva en su morfologla condensada, 1nact1vidad en su e;
.I I . . .I Ipre51on genetlca y su repllcac1on mas tardía que la eucrg
matina, caracterizándose por ser producida luego de cie;
tas etapas del desarrollo, comoocurre con la inactiva. I .c16n de uno de los 2 cromosomas X en celulas cc mamíferos
femeninos, proceso que se produce en estadios :pranosa l ade la embrlogene51s, permaneciendo luego fuertemente eg
rollada a lo largo de todo el ciclo celular y comportan. . I IL. ‘ .dose ademas como genetlcamente 1nerte.
(para una revisión consultar (7))
La información genética en los cromosomas se encuen
tra como complejos DNA-proteínas, donde el DNAlleva 1
información y los componentesproteicos determinan la es
tructura, siendo la relación entre estructura y funciong115m0de tales complejos, un tema de gran discusión durante los últimos años (8).
Estos complejos nucleoproteicos constaude DNAasociado
con aproximadamente una masa igual de histonas, que son
proteinas muy básicas y también con una cantidad, de mag
nitud silimar de proteinas no histónicas que son menos
básicas; pudiendo resumir que el DNAen cromatina consii
te en una doble hebra de DNAcubierto de proteinas, que
serían en gran medida, los responsables de la neutrali. ' .zac1on de sus cargas negativas.
La cantidad de proteinas histónicas asociada con DNA
parece ser invariante, aumentándosesu contenido a med;
da que el DNAva siendo replicado, lo que mantiene la
proporción DNA- histonas aproximadamente constante.
Hay sólo 5 tipos de histonas (H1, H2A, H2B, H3 y H)+),
lo que unido a la enormevariabilidad del DNAconstitu
yente de diferentes genomas, sugiere que las histonas es
tán relacionadas con algún aspecto estructural fundamen
tal, el que quizás sea independiente de la secuencia del
DNA(si se desea, pueden consultarse las excelentes rev;
siones 8, 9 y 10)
Esto es sustentado por el descubrimiento del nucleosg
ma, que es la subunidad básica de la cromatina y está for
madopor la interacción de alrededor de 200 pares de ba
ses de DNAcon un octámero de moléculas histónicas, con
sistente en 2 copias de cada una de cuatro histonas (H1,
H2A, H2By H3) y una copia única de la histona H4 asocia
da con cada par de nucleosomas (para más detalle consul
tar las revisiones 11 y 12).
El nucleosoma a su vez, estaría compuesto por un core
consistente en 1%0pares de bases y el octámero históni
co, formando una estructura esferoidal de unos 10 nm de
diámetro, y una región de unión compuesta por 60 pares de. . . .I. ,_bases y sen51ble a digestión enzimatica (9, ll, l¿)‘
En el core, el DNAde doble hebra (duplex), envolveria
la parte proteica con 1,75 vueltas, formandoeste enrollg
miento de la doble hebra lo que se conoce comosupernélice (ll).
Estas estructuras superenrolladas han podido ser estu
diadas mayormente en pequeñas moléculas de DNA,principa;
mente en DNAde virus SVHOy polioma, mediante el descu
brimiento de una enzima desenrolladora, que permite rela
jar estos sobreenrollamientos de DNA,mediante la ruptura
de una hebra y posterior regeneración del enlace roto(13).
Tanto la heterocromatina (inerte), como1a eucromatina
1-9
(que es transcripta) parecen presentar nucleosomaspor d;gestión con nucleasa micrococal y al microscopio electró
nico, lo que unido a la evidencia de que los mismos permg
necen inalterados durante la mitosis, permite atribuir susdiferencias funcionales y de apariencia a un cambio gene
ral en la organización de la cromatina; el cual ocurriría
a un mayor nivel de organización estructural, pudiendo és
te estar relacionado con la presencia de las proteinas nghistónicas.
Al tener menor afinidad por el DNA,las proteinas nohistónicas identificadas en la cromatina interactúan ma
yormente entre ellas y con las proteinas histónicas, pero
sin formar parte de los nucleosomas. Ésto las indica como
posibles responsables de estructuras de mayor complejidad
que el nucleosoma, o bien con roles regulatorios (10).
I-lO
Replicación del DNA
Para la duplicación del genomaeucariótico son necesa
rios dos eventosi la replicación del DNApor sintesis sg
miconservativa y que sea sintetizada otra serie de proteí
nas complementarias, lo cual en realidad ocurre, ya que
se conoce que la sintesis de DNAe histonas está coordi
nada (H).
La separación de las hebras para servir comotemplado
de las cadenas hijas en la replicación del DNA,presenta
ciertos problemas topológicos que involucran un reordena
miento considerable del nucleosoma, en el cual el DNAesI . . . ..Ita fuertemente empacadoen verlos niveles de organizacnxn
A medida que se van sintetizando las dobles hebras h;
jas, la cromatina debe rearmarse; por lo que este proce
so de desarme, resintesis y rearmado debe ocurrir conti
nuamente durante la fase S, pasando sucesivamente a tra
vés de cada secuencia de DNA.Más tarde, al llegar el mg
mento de la división, los cromosomashijos deben desenrg
darse antes de segregarse en ambascélulas hijas.
La enorme longitud del DNAen cada cromosoma y el tiem
po de replicación, implican que la duplicación del DNA
debe ocurrir simultáneamente en muchos puntos de sinte
sis, llamados replicones y que se visualizan al microscopio electrónico a lo largo de la doble hélice comopq;
ciones de DNAseparadas desde donde la sintesis del DNA
procede adoptando la forma de Y u horquilla, que se van
separando en ambas direcciones a medida que progresa laduplicación (14) .
La mayor evidencia sobre la estructura y función del. l . . . t . ..eplicon prov1ene de estudios autorradiograficos que ev;
d‘ncian que la replicación ocurre en forma simultánea en
ambas direcciones (15).
El tamaño promedio de los replicones se estima usual
mente por la distancia media entre origenes adyacentes
(punto equidistante de ambashorquillas), lo que requ'gre que al menosdos replicones adyacentes estén activos
durante el periodo de marcación radioactiva, lo cual pg
rece ser de ocurrencia común, ya que suelen verse a me
nudo, grupos de replicones activos, sugiriendo que todos
los origenes deben ser activados aproximadamente al mis
mo tiempo, al menos en las regiones de DNAque contienen
I-12
varios de ellos (16).
Los datos disponibles sobre el tamaño de estas unida
des de replicación del DNA,obtenidas tanto en célulassg
máticas de mamíferos comoen aVes, anfibios y p1antas,dg
ría un-tamaño en el orden de 100 a HOOkilobases y una
velocidad de replicación de 1.000 a 2.000 pares de bases
por minuto, lo que indicaría un proceso muchomás lento
que el encontrado en bacterias; ya que por ejemplo el crg
mosomade E.coli es un replicón único de 4,2 x 103 kilobg
ses que se duplica completamente en unos k0 minutos lo m2
corresponde a una velocidad de replicación de unos 50.000
pares de bases por minuto en cada dirección (unas 25 veces
más rápido que en eucariotes) (h).
El mecanismo de síntesis de DNAes por replicación se
miconservativa y parece ocurrir en forma similar a los cg
racterizados en virus y bacterias, mediante un proceso que
involucra la separación de las hebras de DNA,debiéndo és
tas desenroscarse en los extremos del replicón para servir
de templado a las hebras hijas.
Dado que la sintesis del DNAprocede sólo en la direc
ción 5‘ a 3', al menosuna hebra, (la sintetizada en di
I-13
rección general 3' a 5') deberia estar hecha por la sintesis discontinua de pequeños fragmentos de DNA(fragmen
tos de Okasaki), unidos sucesivamente.
La evidencia aquí es consistente con un proceso bastan
te rápido, en el cual la cantidad de DNAde cadena simple
(DNAcs) esperando ser replicado o DNAde cadena doble(DNA
cd) recién sintetizado es bastante pequeña, considerándg
se actualmente que sólo unos pocos nucleosomas están au
sentes a amboslados de la horquilla de replicación (17).
Por otra parte, en células eucarióticas de variado or;gen se han encontrado actividades enzimáticas análogas a
las descriptas previamente en virus y bacterias. Eviden
ciéndose recientemente la existencia de varias DNApoli
merasas (d,/3,F') (para una revisión del tema consultar18), hay actividades de ligasa (posiblemente para unirsag
mentos discontinuos), actividad de corte y unión, (lo que
permite relajar las superhélices), proteinas de unión ahebra simple, (posiblemente análoga a la proteina del gen
32 en el fago TH), varios tipos de DNAsasy ribonucleasas
(unacapaz de degradar el RNAde híbridos DI-ïA-RNA)(19,20,. l . . a21), para menc1onarsolo las meJores caracterizadas.
En base a todo ésto, la visión global de la replica
ción del DNAal presente, es la de un aparato bastante
complejo, consistente en varias actividades enzimáticas
coordinadas de una forma aún desconocida, el cual está
asociado con la cromatina. Ocurriendo la replicación en
el núcleo en interfase a través de una activación sumen
cial de un gran número de replicones, cada uno de los
cuales posee dos horquillas de replicación (esto es dos
copias del aparato de replicación), las cuales provocan
una perturbación transitoria de la estructura comatinica a medida que avanzan (4).
Organización del genomaeucariótico
Tiempoatrás los genes fueron definidos en términos del
ensayo de complementación genética o en virtud de su produg
to, tanto RNAcomoproteico; y aunque es bastante claro de
cir que un gene es una secuencia de ácido nucleico consti
tuido por una serie ininterrumpida de nucleótidos, los cua
les son leídos en tripletes para codificar una c: ynapol;
peptïdica, no hay un ensayo que permita identificarlo precisamente (22).
En la actualidad, ninguno de los conceptos anteriores
nos brinda una definición adecuada de la forma que los ge
nes pueden adoptar.
.. .I l. IClaramente, la unload de expreSion genetica debe ser mas
grande que la secuencia codificadora del producto, a fin de
incluir los elementosreguladores necesarios.
Propuesto hace ya algún tiempo, el modelo del oper6n(23)
incluye elementos de control adyacentes a los genes estruc
turales codificadores de proteínas. Estos elementos no cod;
fican producto alguno, pero serían reconocidos por la RNA
polimerasa o por proteínas reguladoras.
I-16
El término gene se reserva para las secuencias que or;. . l . .ginan productos detectables, mientras que el termino Cls
I . . . . .,.tron se introdujo para describir 1a secuenc1a de DRAque
codifica una sola cadenapolipeptïdïa(24).
Aunque los términos gene y cistrón pueden usarse a ve
ces indistintamente, son muchoslos casos de genes poli
cistrónicos, sin olvidar el hecho de que el RNA nsajero
(mRNA)del cual se transcribe una proteina dada es algo
mayor que la secuencia que codifica 1a proteina, por lo
que la porción completa de DNAinvolucrado es bastante ma
yor que la que se determinaría por el número de aminoáci
dos del producto final proteico.
La evidencia surgida recientemente en distintos organis
mos ha complicado enormemente el relativamente simple modgIlo de operon.
. ..I . I. .Cuando la unidad de transcr1pc1on contiene mas oe un ci;' . ... '
tron, aparecen varias p051b111dades segun el punto en que
se separen los distintos productos, comose ha tratado de
resumir en la figura A (modificada de h).
l . . .En el caso del operon c1ás1co (a), un mensaJero monOCigl. . l . .,tronico Simple se traduce en proteinas indiViouales.
GENE SIMPLE
OPERON CONPROCESADO DERNA
GENES CONPRODUCTOSPOLICISTRONICOS
1-17
.> secuencia traducida____n>secuencia transcripta
b
"mmm WW Pmteinasi
—*'*—*rr—— *—\z*««———fifiNAsindividuales
3 * . mRNAWWW/- . '* policistronico
DNA
C
proteinasW FW mm individualesW WW W Poüproteina
FIGURAA.-Relación entre los genes y sus productos.
1-18
GENECON ProteinaSECLIENCIAINTERVINEN'JE VVFA RNAañadido
I 'procesamiento
A "pz-mano¿m-DNA
secuenciainterviniente _e
GENEcon W proteinasdeigualpRODUCTos ‘ :teminaciónMULTIPLESWW
AUG Aus+ UAA _‘ RNA
DNA
«94' -- 4—_9.secuencia completa1'a subsidiaria
GENECON. WWW proteinasdeigual+M mm iniciación
MULTIPLES 'W RNAfAUG +UGA UAA
DNA_.É________+>secuencia subsidiaria+___ ,__> secuencia completa
FIGURA A.- Continuación .
I-19
9
'UmnïmGENES _ . / 1 3 .ïífiïÁBLEs . Plsm°=N-term%nal - . 1 3—- —— d.15t1ntoC—temlnal RNAsin región 2
1 2 UAA 3m1 2 3
GENEScon Wproteinas relacionadasporI —_ el marcodeSUPERPOSICION + l lee
AUGXAUG ÉRNA
m DNA..4. ‘ . xse iaq superpuestas
- fuera de fase
FIGURA A.- Cóntinuación.
I-20
En algunos fagos, el transcripto primario es policistrónico (b), pero antes de la traducción es procesado en
mensajeros individuales.
En algunos virus de eucariotes, el mRNApolicistróni
co es traducido en una poliproteina (c), la cual luego
es clivada en las proteínas individuales.
Debe mencionarse ahora, que el concepto original de
que la secuencia de DNAcodificadora de una cadena poli
peptidica es leida comouna serie ininterrumpida de tri
pletes nucleotidicos, puede no ser necesariamente cierto,
ya que recientemente ha resultado aparente, que al menos
algunos genes eucariótiw antienen secuencias "interv;
nientes", que son trozos de polinucleótidos presentesóbgtro de la secuencia codificadora en el DNAque no apare
cen expresados dentro de la secuencia de aminoácidos de
1a proteína (25).
Estas secuencias intervinientes pueden ser transcriptas con el RNApara luego ser quitadas durante los pasos
de procesamiento groducen el mRNAmaduro.
Comoilustra la figura A (d), quitar las svcuencias. . . . . I .1nterv1n1entes debe ser esenc1a1mente una reacc1on intra
molecular que involucra el corte y eliminación de éstas,
para luego añadir las secuencias que han de eXpresarse
en el producto J otcico.
Esto indica que aunque las secuencias codificadoras eg
tán en un orden lineal de DNA,ya no puede considerarse
las comonecesariamente contiguas.
Además, la presencia de secuencias intervinientes im
plica que en el mapa genético (5, H), las distancias en
tre mutaciones no coincidirian con la distancia correspog
diente a lo eXpresado a nivel proteico; a la vez que las
mutaciones que afecten una proteína caerán agrupadas en
los segmentos de secuencia codificadora y separados por
distancias correspondientes a las intervinientes; cuyaíun. I . . . - hClon a c1enc1a Cierta se ignora (¿6).
I . . nOtro concepto genetico Queha sufrido reCiente descré
dito, es que una secuencia de DNApuede codificar tan sóIlo una proteina.
En virus, tanto de eucariotes comode procariotes, se. . . I . .han identificado secuenc1as de ac1do nucleico capaces de
codificar más de un polipéptido (27).
I-22
En los casos más simples, mostrados en 1a figura A (e
y f), un gene representa parte de otro; aqui una proteí
na "completa" se produce a partir del gene completo, a la
vez que se produce también una proteina más pequeña, que
representa sólo parte de la secuencia, mediante el uso de
signos de iniciación (e) o terminación (f) ubicados dentro del gene.
. . .I .i.Esta Situac1on no es d1f1c11 de comprender ya que en. .. . .I
princ1pio se asemejaria a 1a producc1on de una proteina
más pequeña por degradación de un polipéptido precursor.
Un ejemplo bien estudiado de terminación parcial (f) es
la proteina de la cubierta del fago QB (28) (cuyo RNAes
usado en esta tesis comoestandard de tamaño). Mientras
que un ejemplo de iniciación interna (e) puede ser visto
en el gene A del fago px 17h (29).
Aparecen situaciones más complejas cuando variaciones
de ensamblaje permiten que la misma secuencia inicial sea. l , . . . Iunida a mas de una secuenc1a terminal, originando protei
nas con una secuencia N-terminal comúny diferentes C-te;
minales (figura A, g), o viceversa; comoha sido evidencg
do en el antígeno T del virus SV #0 (30), y de consecuen
1-23
cias similares a las que ocurren en la unión de las re
giones constante y variable de las inmunoglobinas (31,32)
Otra situación compleja ocurre cuando una misma secueg
cia nucleotidica se traduce en más de un esquemade lectg
ra, haciendo que una mutación puede afectar a sólo una o
a un par de proteinas diferentes, dependiendo de que el
cambio se produzca o no en la zona de superposición de la
secuencia (figura A, h); encontrándose ejemplos al respeg
to en genes del fago fix 17H (33). Esta situación podría
haber aparecido evolutivamente (especialmente en virus),qg
mo una necesidad especial de los genomas para lograr una. . I 'organizaCion mas compacta.
La explosiva evolución de los conocimientos relativos a
la organización interna de secuencias en el DNAque esbozg
remos brevemente, se basa en el desarrollo reciente de cig;tas técnicas como: la hibridización de ácidos nucleicos con
copias radioactivas de secuencias de DIA o mBHA(3h, 35),
ruptura especifica del DNAcon enzimas de restricción (36);inserción de fragmentos elegidos en plásmidos bacteriales o
fagos y su posterior duplicación (37, 38); lo que actualmegte hace posible obtener el DNAcorrespondiente a cualquier
gene estructural del que pueda aislarse su mRNA.Ya que me
I-Qh
diante el uso de transcriptasa inversa (39) puede prepa
rarse una copia en DNAdel mRNA(o algún precursor o cual
quier producto a RNAque pueda obtenerse del gene), que
por clonado en plásmidos o fagos puede suministrar sufi
ciente cantidad de DNAcomopara obtener la secuencia nu
cleotidica del DNAoriginal (MO,41).
En experimentos de este tipo, donde se estudiaba 1a ci
nética de rehibridización del DNA,se observó que en to
dos los genomas eucarióticos estudiados, aparecían componentes de distinta velocidad de reasociación (k2).
Una parte del DNA,de reasociación muylenta correspog
dia a un grupo de secuencias presente una sola vez en el
genoma, conociéndose comoDNAnorepetitivo. Intercalado
con éste, hay secuencias de DNAque muestran moderada re
petición de las secuencias, y también secuencias que deben
repetirse muchasveces por tener un corto tiempo de reasg
ciación; aunque a1 igual que los casos anteriores, siguen
evidenciando un tipo de reacción bimolecular.
Por lo que, a excepción del DNAno repetitivo, las reg
tantes secuencias (que son 1a mayoria), se repiten dentro
del genoma en forma de familias, donde cada miembro de la
1-25
familia posee secuencias relacionadas aunque no necesariamente idénticas.
l I . oReaccionando mas rapidamente aún, hay una fracc16n del
genoma que se encuentra formando dúplex aún a tiempo cero
del experimento, en toda condición examinada (k).
. . Í . . .La reasoc1a01on de esta fracc16n es de tipo unimolecu
. . Ilar, lo que implica que cada par complementario, esta en. I Iuna misma hebra de DNA;por lo cual este habra de poseer
. i . . .secuen01as que deberan repetirse en forma invertida y ce;canas entre si, lo que hace que se las conozca como"repg
ticiones invertidas" (en inglés 'inverted repeats').
Estas repeticiones invertidas parecen estar ampliamente distribuidas a lo largo del genomae intercaladas en
todas las clases de secuencias, siendo -a1 menos algunasde ellas- transcriptas.
La mayor parte de estos componentesaltamente repetit;
vos, se encuentra localizada en la cromatina constitutiva,o Í . :generalmente en regiones centromericas (resenado por H3).
Según la distancia entre repeticiones invertidas que
puede calcularse, pueden aparecer las situaciones mostra
I-26
das en la figura B', que ponen de manifiesto 1a poten
cial importancia estructural de las mismas (H4).
Las secuencias de repeticiones invertidas han sidoeg
tudiadas más facilmente en el pico secundario o satéi;
te, que aparece cuando se fracciona el DNA,especialmeg
te de ratón (#5) y también humano (H6), donde mostraron
consistir en secuencias bastante cortas repetidas mucni
simas veces, lo que unido al hecho de tratarse de frag
mentos de DNAbastante largos, implica que deben existü
repeticiones en fila, unas tras otras (en tandem), conzonas intercalares de al menosvarios cientos de paresde bases.
El DNAsatélite (como también se conoce a las repeticiones invertidas) humanomostró hibridización cruzada
con DNAde células de chimpancé, gorila y orangután, ev;
denciando que estas secuencias debieron aparecer evoluti
vamente antes que la diferenciación de estas especies(#7).
. I . . . .Acerca de la func1on de las repet1c1ones invertidas se
conoce poco, muchas parecen ser transcriptas, ya que apa
recen en el RNAnuclear, a 1a vez que 1a posición de éstas
1-27
.Estructura Estructura Estrpctura Microscopía.Original Desnaturaliz. Renaturaliz. Electrónica
DNA‘XhÏnfión :::::::—e> - -9É::I:i:: //"\—/cruzada. - '
G c
g G_ . ATCG CGAT A
Repeticiones ATCGCGAT “WW A T /l\Invertidas a_—___ +TAGCGCTANW' TInmediatas TAGCocn A 4‘
c cG G
G 8ce ticj-O ATCG CGAT T A
Invertidas —— ama" TAGCGCTA W T A
sep s TAGC GCTA A TG cC G
FIGURAB.- Posibles ubicaciones de las repeticiones invertidas.
é . . . .seria distinta en diferentes genomas,lo que implicaría
una gran velocidad de cambio de ubicación durante el prgceso evolutivo (1+).
I-28
Estructura del RNAmensajero
La expresión genética transcurre a través de varios
pasos: inicialmente se transcribe un RNAprecursor a par
tir de una matriz de DNA,luego esta molécula se procesa
(comodescribiremos más adelante) mediante la eliminación
de ciertas secuencias, para formar el mensajero maduro,
el cual es transportado_al citoplasma donde finalmente es
traducido en proteína (4, 5, 6)
H.a dificultad en el aislamiento de los mensajeros eu
carióticos provenía de la necesidad de aislar un compamag
te tan minoritario como el mRNAde la masa de RNAprove..{ente de fracción polisomal, donde el RNAribosomal
(rRNA) está en un enorme exceso.
El desarrollo de técnicas de marcación especifica del
mRNA,basadas en las diferencias que tiene su síntesis
comparada con la de rRHA, permitió observar que el mRNA
puede liberarse de polisomas en la forma de particulaszi
bonucleoproteicas (RNP), distinta de los RNAcontaminan
tes (48, #9)1
. l .Un método de marcac1ón espec1f1ca se basa en el uso de
I-29
pulsos cortos de marcación radioactiva, la cual alcanza
el mRNAdentro de los 5-10 minutos, pero sin entrar en
el rRNApor 25 a.h0 minutos (50), Mientras que otro má
todo se basa en la supresión de la síntesis de rRNApor
tratamiento con bajas dosis de actinomicina (Sl).
Por primera Vez se identificó como mRNA,una pequeña
proporcidn de RNAen el citoplasma de células Hela, deb;
do a su asociación con polisomas, por sus propiedades de
sedimentación correspondientes al tamaño esperado para
la codificación de proteínas y por poseer una composi
ción en correlación con el DNA(48, #9).
Las mRNPpueden distinguirse de otros componentes po
lisómicos por tratamiento con EDTAo Puromicina, los cuales disocian los ribosomas en subunidades con liberación
del mRNA,sin afectar los contaminantes (52, 53).
Las RNPpueden además separarse en sus componentes por
extracción del mRNAcon SDS y fenol (54), generando el
RNAobtenido de esta forma, un perfil bastante disperso
por ultracentrifugación, con un pico ancho alrededor de
los 10 S, que se puede extender hasta unos #0 S.
Las dificultades en el aislamiento del mRNA,fueron
I-3O
resueltas luego,por el descubrimiento de que la mayoría
de los mRNAposeen una secuencia de ácido poliadenilico
(poli A) en el extremo 3' terminal (55), lo que permite
el aislamiento del mRNApor cromatografía de afinidad
mediante esta cola de poli A a oligo dT u oligo U uni
dos a celulosa o sepharosa (56)
El problema de la pureza de los mRNAse pudo solucig
nar completamente mediante el uso de la técnica de clo
nado de DNA(37, 38), en el que una población dade de
mRNAse transcribe reversamente (usualmente mediante
transcriptasa reversa de neuroblastoma aviar) a una co
pia de DNA(cDNA), el cual es convertido en doble hebra
mediante DNApolimerasa, insertándolo luego al DNA de
plásmidos o fagos, en lugares especificados por enzimas. . l a de restricc1on adecuadas.
El clonado de estos vectores (plásmidos o fagos) en
bacterias permite obtener secuencias únicas de DNAcapa
ces de hibridizarse al mRHAoriginal, y por transcrip.I .. _ .‘Cion, originar el mensagero deseado.
Estas secuencias de DNAclonadas, pueden obtenerse en
cantidades tales que permitan su secuenciado, o bien ser
I-3l
empleadas para obtener por hibridización el mRNAdeseado
en estado puro y en cantidades adecuadas para estudios de
estructura o traducción (37).
Los mRNApurificados que codifican una proteina en pa;
ticular pueden caracterizarse demostrando que son capaces
de sintetizar el producto adecuado en un sistema heterolg
go, siendo los más usados para tal fin el sistema de lisa
do de germende trigo (57) o de reticulocitos de conejo
(58).
El desarrollo de estas técnicas de marcaciónradioact;
va, aislamiento y purificación del mRNA,permitieron laca
racterización general de las poblaciones de mRHAque a con. Itinuacion comentaremos.
Una de las observaciones fundamentales en el estudio. . o I . . .del mRNAfue determinar su contenido en aCido poliadenilib
co (poli A) por hibridización a poli dT-celulosa (55)
Estos primeros estudios mostraron que alrededor del 1%
del RNAcelular total es retenido en poli dT-celulosa, a
1a vez que indicaron que el poli A está ausente en la fra;
Ción nuCIGOlar (rRNA), pero presente en el nucleoplasma ycitoplasma (55, 59)
1-32
La ubicación del poli A en el mRNAfue determinada me
diante experimentos con exorribonucleasa purificada, es
pecífica para el extremo 3'-OH terminal, encontrándose
que esta enzima degrada el poli A del mRNA(tanto en cé
lulas Hela comoL) muyrapidamente en relación a otras
regiones, implicando que el poli A se encuentra en el e;tremo 3' (60).
En virtud de su resistencia a la digestión por ribonu
cleasa pancreática, el poli A pudo ser aisÍ-do (61, 62),
evidenciando ser alrededor del 2,5 a 5%de la masa nuclegtídica del mRNA.
Independientemente del tamaño del mensajero de que se
trate, el poli A (obtenido por su resistencia a ribonucleasa pancreática) tiene esencialmente la mismalongi
tud, sedimentando alrededor de un 10%más rápido que el
tRNA4 S, lo que corresponde a unos 200 nucleótidos de
longitud (59,61).
Mediante degradación alcalina del poli A, se detectó
un extremo 3'—OHpor cada 200 residuos de adenina (62),
concordants con la medición de la longitud de 190á:QOnu
cleótidos por electroforesis (63), demostrándose además
1-33
que en el tracto de poli A no hay -o hay en cantidades infimas- otras bases excepto adenina.
En experimentos realizados en células Hela, con marca
ción de 3H-uridina y en presencia de actinomicina para su
primir el rRNA,se evidenció una disminución de la longi
tud del poli A con el envejecimiento del mensajero a 1a
1,5 y 3 horas luego de la marcación de las células (63).
Este acortamiento no parece relacionarse con 1a traduccnñ
del mensajero, dado que ésta continúa a la mismavelocidah
a la vez que la velocidad con que el poli A es acortado,
no es constante para todos los mensajeros, ya que porefiem
plo, para los mRNAsde 2 adenovirus que sufren un rápido
recambio, el poli A se acorta a una velocidad algo mayor
quo 1a de los mensajeros de la célula huesped (6h). Habría. . . I .ev1denc1a de que este acortamiento podria ocurrir en pasos
sucesivos de lOO, 60 y 40 bases (65, 66)
Todos los trabajos coinciden en que la secuencia de po
li A.no esta codificada en el genoma, sino que es adiciona
da 21 transcripto en el núcleo, a la vez que la inhibición
de 1a poliadenilación previene la aparición del mRNAen el
citoplasma (67, 135). Sin embargo, las secuencias de poli A
1-34
se encuentran no solamente en el RNAnuclear y citoplásmi
co, sino también en mensajeros sintetizados por ciertosyi
rus que se reproducen en el citoplasma de células infecta
das, por lo que si el poli A tiene una función en los even
tos que posibilitan la aparición del mRNAen el citoplasma,I. I.este no puede ser su unico pr0p051to.
Dado que los mensajeros se traducen del extremo 5‘ al. . l .3‘, la term1nac16nde la Sintesis proteica debe ocurrir al
tes de que los ribosomas alcancen el poli A, lo cual hace
dificil concebir su función en esta etapa.
En coincidencia, la cola de poli A puede eliminarse del
mRNAmediante tratamiento con exorribonmfleasa 3‘-0H especí
fica, no mostrando efecto en la traducción in vitro, al mgnos en células L, Hela y en mensajero de globina purifica
do (68, 69, 70).
Otras posibilidades relacionadas con la estabilidad del
mRNA(68, 71) o su unión a membranas (72), también son dig
cutibles, dado que se ha demostrado que algunos mensajeros
celulares no poseen poli A, lo que indicaria: o bien quesu función podria no ser obligatoria o sinó que existiriandiferencias funcionales entre los mensajeros con y sin
1-35
poli A (poli A (+) y poli A (-).
En sintesis, 1a función del poli A permanece sin aclgrar.
La presencia de una fraccion de mRNAque no contiene
poli A fue demostrada primeramente en células Hela (73),
ya que alrededor del 30% del mBNAno se unía a oligo dT
celulosa en condiciones tales que un 96%del mRNApoli A
(+) aislado en las mismas columnas cromatográficas vdmia
a pegarse. A la vez que la resistencia a ribonucleasa de
mRNAmarcado con 3H-adenosina en las fracciones poli A(+)
fue de un 11%, mientras que la fracción poli A(-) retuvo
menos del O,k%de la marcación, obteniéndose resultados
similares en células L y en embriones de erizo de mar(7k,75).
Aproximadamente un tercio del mBNApoli A (-) usualmeg
t( es el RNAmensajero de las histonas, mientras que la
fi-cción restante no parece derivar de ruptura o degrgdación de los mensajeros poli A (+), dado que los perfil
les de sedimentación son similares en ambas poblaciones(e).
La exposición de polisomas a puromicina libera ambasfracciones, por lo que tanto el mRNApoli A (+) como
I-36
poli A (-) parecen ser activos en 1a sintesis proteica.
La posibilidad de que la ausencia de poli A pudiese
favorecer una más rápida disminución de 1a capacidad'ua
ductiva del mensajero de globina, fue propuesta median
te experimentos que mostraron que 1a traducción in vitro
de la fracción poli A (-) declinaba luego de largos penh
dos de tiempo (90 minutos) muchomas que la de la frac
ción poli A (+) (76).
Concordantemente, cuando el mRNApoli A (-) se polig
denila, es capaz de mantener la actividad por periodos
mas largos, demostrandse1u1efecto específico y no unacfig
minución de actividad en el poli A (-) por ruptura al
azar (77).
Debe mencionarse aqui que el mismo tipo de eXperimen
tos con el mRNApoli A (-) de interferón durante incuba
ciones de H8 hs. han conducido a resultados opuestos en
el ovocito de Xenopus (78); aunque aqui seria útil probar
que no hubo readenilación dentro del ovocito.
Analisis detallados han mostrado (79) que el mRNApoli
A (-) representa un subgrupo de las secuencias presentes
1-37
en el poli A (+0, a la vez que analisis de las proteinas
sintetiZadas in vitro mostraron que 1a mayoria de los pg
lipéptidos sintetizados por los mRNApoli A (-) también
son producidos por los poli A (+); pareciendo indicar que
el mRNApoli A (+) codificaria un número mayor de protei
nas, algunas de las cuales no serían codificadas por lafracción poli A (-).
Otra peculiaridad de la molecula del mRNAaparece en
el extremo 5' terminal, el cual es bloqueado por la for
mación de un enlace S‘-5' pirofosfato con la mayoría de
la metilación existente en la molécula agrupada en esta
estructura que se conoce comocap (80, 81, 82, 83).
A diferencia de lo que ocurre en RNAribosomal y de
transferencia, donde la metilación ocurre internamente
en la cadena polinucleotidica; en el mRNA,solo una muy
pequeña proporción de grupos metilo pueden encontrarseen esta forma.
La estructura del extremo metilado se dedujo primera
monte en RNAviral, (de vaccinia y reovirus (81, 82, 83),
que por poseer actividad de RNAmetilasa, eran capaces de
transferir grupos metilo radioactivo de la S-adenosil me
1-38
tionina (SAM) a1 mRNAviral.
Usando nucleótidos marcados con 32P, se probó, también
primeramente en virus, que solo ATPy GTP, intervenían en
la estructura,y que en ésta los grupos fosfato no eran 1;
berados por digestión con nucleasa de penicilium o perio
dato y anilina seguida de fosfatasa alcalina o T2 ribonu
cleasa, lo cual usualmente reduce el RNAa 5'-mononucle6
tidos (h; 95, 96).
La ubicación del cap en el extremo 5' se dedujo porque
la estructura obtenida luego de digestión enzimática o h;
drólisis alcalina no poseía un extremo 5‘ libre, dado que
no solo era resistente a fosfatasa alcalina, sino que tagpoco podia ser fosforilada con polinucleótido quinasa.Sinembargo, los grupos fosfatos involucrados podian liberar
se por tratamiento con pirofosfatasa, lo que unido a losanalisis cromatográficos definieron la estructura comouna
7 metilguanosina unida por un puente pirofosfato a 2'—0
metilguanosina o adenina, lo cual se abrevia 7mGpppG2to“
pr o 7mGpppA2'0m,donde N indica un nucleótido no determi
nado (83, 84, 85).
Los análisis cuantitativos de los grupos metilados en
1-39
células Hela, sugieren que habría aproximadamentel cap
cada 2200 bases, lo (yie_implicaria que todos los mens;
jeros poseen cap, lo cual se ha visto corroborado en va
rias otras especies, incluyendo eucariotes inferiores(h)
J; acuerdo a la ubicación de la metilación se han dg
te tado tres tipos de capa en levaduras y en el mohodel
11m0 el tipo de cap mas importante es el cap tipo 0, en
el que no ocurre otra modificación que el agregado de 7
-metil G al extremo ppp 5' terminal. Este cap también eg
ta presente, aunque en pequeña proporción en Drosophila.
El cap tipo 1 es el tipo de cap predominante, tantoi . l . oen celulas eucarioticas, comoen mensaJeros virales, prg
sentando una segunda metilación en la segunda posición,
1a cual con mayor frecuencia es una adenina, aunque tam
bién suele encontrarse guanina y en células animales has
ta pirimidinas (83, 84).
La metilación siempre es en la posición 2'-0 ribosa,
aunque cuando la penúltima base es adenina, puede ocurrir
una segunda metilación en la posición N6, originando 2'-0,
N6 dimetil adenosina (7mGppAm2pX)como se ilustra en la
figura C.
Nómetil ATmetil G n,"
\> ° .. sCHr0—P-O-P—O-P-O-CH¡ o NH:
o °_ |_ (¡T N
N/ I \>" A‘ HgOH on 2 C) o cil. N N
.l
I-O CH, oo.
«la cu
ï_o en,FIGURA C.- Estructura para un mRNA o
. ' \ l
ternnnado en TmetllG( 5)PPP( 5‘)A1216032%ÏÍPAPU
1--------o
Reacción Enzima
s'aflv fi'a' T'fi'a'Gppp * ppApNo- o pppAoNrJ
Guanvlyl transferase
S'afi'a's' 37 7’ 07GPDDADND- + DD. o p. + pp.
SAM 7.Methyl uansferase
SAH
7Me GpppAprSAM
SAH
7 Me 2'0MeGpopA pr—
SAM2'-0-Melhyladenosine Nsmethyl lransferase
SAH
FIGURA D.- Ruta biosintética del CAPen el mRNA.
(Comofue deducida en virus vaccinia y en células HeLa)
I-ll-l
En ciertos casos, la metilación ocurre no solo en la
primera y segunda posición, sino también en la tercera,
siendo esta última siempre en posición 2‘-0 y originando
el cap tipo 2, el cual es un componentemenor en células
animales y en Drosophila (siendo éste el único organismo
que hasta ahora presenta los tres tipos de cap) (k).
Ademásde la metilación en el cap, en células animales
y de erizo de mar puede encontrarse N6 metil adenina den
tro de la cadena del mRNA,a una frecuencia tal que cada
mensajero podria tener a1 menosuna metilación interna(80,8h).
La ‘nrmación del cap ocurre luego de iniciada la trans
cripc’ n y las reacciones involucradas han sido extensameg
te estudiadas, especialmente en dos sistemas: virus vaccinia y células Hela; y aparecen resumidas en la figura D
(para una revisión ver 87).
El s bstrato de la reacción parece ser la secuencia ini
cial de la cadena de RNA,dado que la guanilil transferasa
no funciona sobre nucleótidos individuales ( H, 97).
La adición de metil guanosina a un extremo trifosfato odifosfato luego de la remosión de un fosfato en.F, hace im
I-h2
posible la adición de cap a productos de clivage interno
del RNA,los cuales terminarían en 5' monofosfato.
La formación de cap l en células Hela, parece ocurrir
en el núcleo, a juzgar por su presencia en RNAnuclear y
la capacidad de los extractos nucleares para realizar 1aIreaccion.
La producción de cap 2 puede ocurrir en el citoplasma,
aunque no se sabe si la enzima responsable de la adición
en 2'-0 es la mismaque sintetiza el cap l.
En los mRNAvirales que poseen cap 2, el último grupo
metilo debe ser adicionado por enzimas celulares, en con
traste con la formación de cap l que ocurre solamente mgdiante enzimasvirales (k).
Aun cuando extractos citoplásmicos de células Hela con
tienen actividad enzimática capaz de hidrolizar puentes5‘-5' pirofosfato (88) parece que el cap es tan estable
como la molécula de RNAmensajero, en contraste con la
metilación interna en N6 adenina, que sufre un rápido rgcambio (89).
- l . . .El rol del cap en la Sintesis proteica en Sistemas de
I-HB
traducción in vitro, se ha estudiado por comparacióndemensajeros con y sin cap, los que pueden obtenerse por
remoción de la guanosina terminal del mRNApor trata
miento con periodato y anilina (82, 95), dejando trifogfato en el extremo. En ciertos casos puede sintetizarse
el RNAen condiciones que inhiban la formación de cap,comoocurre con la adición de S-adenosilhomocisteina
(SAH) en reovirus (H, 96).
. . . . IComolos Sistemas de sínte51s proteica libres de ce
lulas son capaces de la formación de cap en los mensajg
ros que no lo poseen, debe incluirse en estos experimeg
tos SAHpara prevenir la remetilacion (96).
La importancia del cap en la traduccidn ha sido estg
blecida por distintos tipos de experimentos: los mRNA
obtenidos sin cap por cualquiera de los métodos anterig
res se traducen con eficiencia menor (un 10 a 20%) que
los que poseen cap en una variedad de sistemas, mientras
que la adición de SAMrestaura en buena medida la activ;
dad perdida (90, 96).
. . . . IEn otra clase de experimentos, la adicion de análogos
como 7mGMPinhibe 1a traducción de mensajeros con cap, pg
ro sin afectar la traducción de ciertos mensajeros excep
cionales, (como lo de los virus STNVy EME) que no poseen
cap in vivo (91, 92).
Aunque 7mGMPes un efectivo inhibidor, GpppGes inefeg
tivo, lo que indica que la metilación terminal es necesa
ria para el funcionalismo, a la vez que la metilación en
2'-0 ribosa probablemente no es de importancia fundamen
tal aunque puede contribuir con aquella.
La diferencia en la capacidad traduccional entre los men
sajeros con y sin cap parece deberse a la capacidad de los
primeros de unirse a ribosomas, observándose en cambio,que
los mRNAssin cap son virtualmente incapaces de formar com
plejos #0 S en ribosomas de gérmen de trigo (90).
Por otra parte, la posibilidad de que el puente 5'-5'pirofosfato confiera al RNAresistencia a nucleasas, se
basa en experimentos en que el mRNAdel virus CPV, al cual
se le eliminó 7mGcon pirofosfatasa es degradado rápida
mente en extractos de gérmen de trigo (93), aunque existen
resultados opuestos para el mensajero de globina (9h).
Actualmente, las funciones más obvias del cap parecen
I-us
ser estas dos: proteger a1 mensajero de la degradación por
su extremo 5' y proveer un medio de reconocimiento para los
ribosomas; aunque al igual que con el poli A, el hecho de
que estas modificaciones ocurren dentro del núcleo, dejaabierta 1a posibilidad de algún rol en la selección y trans
porte de las secuencias de mRNAal citoplasma.
. ' . Í .EXDres1on de la InformaCión Genetica
La invariancia de la información genética n cada célg
la somática de un organismo implica que cada fenotipo ceh¿
lar resulta de la expresión de un subgrupoparticular degenes.
Esta conclusión se basa en que durante el desarrollo ,
no se ha observado pérdida de genes no expresados o ampli
ficación de los activos (H).
. I I . I .La expre51on genetica transcurre a traves de varios pg
sos, donde en cualquiera, en varios o en todos los cuales. Ipuede ocurrir la regulacion.
Inicialmente se transcribe un RNAprecursor a partir de
una matriz de DNA,luego esta molécula se procesa mediante
la eliminación de ciertas secuencias para formar el mensa
jero maduro, el cual es transportado a1 citoplasma, dondefinalmente el mRNAse traduce en proteina (4, 5, 6).
. I . . íQuizas la mayor 1nformac1on que se posee al respecto,
se refiere a la transcripción de las secuencias de DNAque
codifican el RNAribosomal, donde ha podido observarse al
microscopio electrónico, precursores de rRNAde distinta
longitud, más largos cuanto más alejados del sitio de ini
ciación se encuentran, unidos a un eje de DNAy separados
por una zona no transcripta (99).
Cada precursor se observó unido al eje de DNApor un
punto oscuro de unos 12 nm de diámetro y que se supone es
la RNApolimerasa.
. í .La conclus1on general de estos experimentos es que losl . nucleosomas estan presentes tanto en regiones transcriptas
. I .comoen no transcriptas, aunque en estas ultimas se los q;contraria en una frecuencia menor (100).
Este concepto pudo ampliarse usando el minicromosoma
del virus SVH0 comomodelo de transcripción in vitro, don
de pudo observarse la aparición de cadenas de RNAextendíq;
dose a partir de complejos que incluían el nucleosoma(lOl).
Ésto permitiría sacar la importante conclusión de que la
transcripcion, al menos in vitro, puede proceder en el DNA
(de SV #0) mientras éste está aun enrollado en los nucleo
somas o
. I .La func1on primaria en el aparato responsable para la
producción de RUAmensajero es la enzima RNApolimerasa
que sintetiza el transcripto primario; presentando las células de eucariotes tres clases de RNApolimerasas re5pog
sables de la síntesis de diferentes clases de RNA(102,
103).
. . I .La transcr1pc1on que es nuclear, ocurre en dos locali
zaciones: el nucleolo y el nucleoplasma.
Los genes que codifican el RNAribosomal están asocia
dos con el nucleolo, que es el responsable de la síntesis,
maduración y transporte del rRNA(103). A 1a enzima nucleg
lar, RNApolimerasa I, responsable de la transcripción del
rRNA, usualmente le compete más de la mitad de la actividad
transcripcional total del núcleo, siendo la más sensible aactinomicina.
La segunda enzima en actividad, algo menos de la mitad
de la actividad nuclear total, es la RNApolimerasa II, lamayor parte de la cual está asociada a cromatina, pudiendo
ser caracterizada en las fracciones nucleoplásmicas, luegode la remoción del nucleolo. Esta enzima es la responsable
de la síntesis del RNAheterogéneo nuclear (hnRNA)que prg
vee los precursores del mRNAy es muy sensible a ci amani
tina (101+, 105) .
I—l+9
A la tercer enzima, la RNApolimerasa III, que sólo re
presenta alrededor del 10%de la actividad total, le co
rresponde la producción de ciertos RNAspequeños, comoel
RNASS, el tRNA, algunas especies nucleares pequeñas y
pequeños RNAvirales (Para una revisión de polimerasasver 10k).
I
Aunquelos resultados más detallados se obtuvieron.con
células animales, esta división de las labores parece ser
común en todos los eucariotes, dado que se han detectado
actividades enzimáticas comparables en plantas, insectos
y hongos, apareciendo todas comocomplejos proteicos de
peso molecular en el orden de 500.000 (para una revisión
ver 103).
Actualmentese trata de elucidar si la especificidadde las polimerasas I y II se debe mayormente a su ubica
ción, o a que reconocen distintas clases de promotores(109.
En el caso de la polimerasa III, deben existir promotora;
reconocidos específicamente por ella, al menos para el gg
ne del RNAS'S, que es transcripto apropiadamente por es
ta enzima pero no por las otras (107, 108).
La transcripción que tiene lugar durante toda 1a inter
1-50
fasea cesa o es grandemente reducida durante la mitosis;. . . ideteniéndose antes de la de51ntegracion del nucleolo y
la membrananuclear para volver a comenzar antes de larg
formación de las estructuras nucleares (h, 5).
Aunquela síntesis de rRNAy los grandes precursores
de rRNAestán ausentes del núcleo en mitosis, los RNAs555
y h-S pueden ser detectados, lo que implica que la polimg
rasa III permaneceactiva, aunquelas I y II no lo estén-s cromosomas se encuentran condensados (109). Por lo
que esta coordinación debe involucrar algún tipo de con
trol específico más que una respuesta mecánica a la con.l l.densac1on cromosomica.
Durante la división de células de mamíferos, la velocg
dad de síntesis proteica cae al 20-30%del nivel en interfase, lo cual parece deberse a una disgregación de la es
tructura polisomal (110), dado que la caída en la proporición de polisomas durante la mitosis es paralela a la dig
mirución de síntesis proteica, mientras el númerode men
sajeros y ribosomas permanece constante, sugiriendo que
la traducción aqui es controlada por la capacidad de iniciación de la síntesis de los ribosomas (lll).
I-Sl
P0r lo contrario, los extractos celulares libres de células, provenientes de células en mitosis, son capaces de
iniciar y proseguir la sintesis proteica virtualmente conla mismaeficacia de las células en interfase, lo que ha
ce pensar que algún factor responsable de la inhibición
durante la mitosis, es eliminado durante la preparacióndel extracto (112); el cual podria ser un RNAnuclear pe
queño (ver más adelante).
La producción del RNAen el núcleo corresponde a dosqg
tegorias principales: transcripción del precursor del RNA
ribosomal y su maduración en el nucleolo, y transcripción
del RNAnuclear heterogéneo (hnRNA)y su degradación en el
citoplasma.
Aunqueocurriendo en distintas partes y catalizados por
distintas enzimas, amboseventos tienen en comúnla trans
cripción de un precursor nuclear mucho mayor que el RNAmg
duro encontrado en el citoplasma; en contraste con la pro
ducción de las pequeñas especies de RNAsintetizadas por
la RNApolimerasa III.
La evidencia de la relación entre hnRNAy mmmestá. f .esenc1almente basada en la naturaleza flsica de ambas mo
I-52
léculas ya que ambas contienen caps 5'metilados y poli A
en 3' (para una revisión ver 113). Dado que ambasmodif;
caciones se introducen en el núcleo, pero se encuentran
también en el citoplasma, la inferencia obvia es que elmRNAderiva del hnRNA.
La diferencia más evidente entre ambos es que el tamg
ño del hnRNAes varias veces mayor que el del mRNA,ésto
unido a que muchade 1a radioactividad incorporada al
hnRNAse recambia en el núcleo y no da lugar a mRNAen
el citoplasma (114), hace pensar que el mRNAdebe prove
nir de sólo una parte del hnRNA,lo que es confirmado
por comparaciónde las secuencias presentes en ellos(ll3,
118, 119).
I . . . .Ba51camente se cons1deran dos pos1bles mecanismos de. .l . . .I NeXplicac1on a este proceso de dism1nuc1on en tamano:
En el primero, el hnRNAya con el cap y el poli A in
corporado seria degradadohasta cierta distancia del ex
tremo, hasta el punto que corresponde al tamaño del mRNA,
luego de lo cual, la estructura terminal perdida, cap o
poli A según el extremo escindido, seria respuesta (k,
113, 117).
1-53
En la segunda posibilidad, ambos extremos de la molécu
1a de hnRNAse conservan, perdiéndose secuencias centrales
(ver figura A); todo 10 cual ha adquirido mayor sustento,
luego de la descripción de secuencias intervinientes y la
existencia de corte y empalmadoen el RNA(25, 26, h).
Los estudios sobre hnRNAhan tenido similares problemas
y soluciones que los de mRNA,pudiendo ser estudiados me
diante marcación radioactiva durante pulsos de 5 a 15 mi
nutos o en presencia de actinomicina (115, 116).
A pesar de la dificultad de que 1a vida media de los
hnRNAestá enelrango de 20 a 180 minutos, este tipo de es
tudios mostraron que el mRNAderiva realmente del hnRNA,
aún cuando representa no más que una pequeña parte de é;
te. Tainbier1 mostraron que si bien algo del poli A
puede recambiarse dentro del núcleo, la mayoria seguirá
presente en el mRNA;de igual manera que una gran prOpo;
ción, si no todo, el cap en 5' seria conservado y transportado al citoplasma. (113, 117, 120, 60).
La caracterización del hnRNArealizada primeramente en. . I . .ausencia de agentes desnaturalizantes, arroao un coef1c1en
te de sedimentación aparente de unos 100 S, y un tamaño
máximopor electroforesis en gel de poliacrilamida corres
pondiente a unas 50.000 bases, con un 1,5% de material de
cadena doble (116).
En condiciones desnaturalizantes, en que se elimina la
estructura secundaria, el rango de sedimentación de la mgyoria de las moléculas oscila entre 28 S y 45 S mostrando
también un contenido de cadena doble de 1,5% (121).
Una posibilidad podria ser que las grandes moléculas100 S obtenidas en condiciones no desnaturalizantes fue
ran realmente los transcriptos primarios; presentando éstos cortes internos debidos al procesado que redundarian
en moléculas más pequeñas a1 desnaturalizarse (122). Es
to tiene poco sustento actualmente ya que visualizadas al
microscopio electrónico, aparecen más bien comoagregados
de hnRHA, quedando esto último demostrado por experimen
tos de desnaturalización y renaturalización con hnRNAno
radioactivo o mediante el estudio de la longitud del transcripto naciente (121).
Estos experimentos arrojan para la mayoría de las molé
culas de hnRNA,un tamaño de 5.000 a 10.000 bases; cifras. a . Ique concuerdan con los valores obtenidos mediante la tec
1-5:
nica de determinación de tamaño por sensibilidad a la luz
ultravioleta (123).
El hnRNAtambién se encuentra en la forma de ribonucleg
proteína, aparentemente en una amplia variedad de organis
mos y en una relación proteina a RNAde aproximadamente 4,
con una masa total para la partícula de unos 1,5 x lO6 da;
tons (12H, 125).
El aislamiento del segmento de poli A en hnRNAque es
de unos 230 nucleótidos (126), parece contener una aprecia
ble proporción de residuos UMP(hasta un 20%) en segmentos
de unas 20 bases, cuya función podría ser formar regiones
dúplex capaces de unirse a proteinas (127,128).
En hnRNAse encuentran tanto caps (aproximadamente 0,1
cap por cada 1.000 bases comparado con 0,5 en mRNA), como
residuos H6metil adeninas internas (0,4 residuos por mil
bases comparado con 1,0 en mRNA)(129), siendo los caps en
contrados en hnRNAsimilares a los encontrados en mRNA(l20).
La complejidad de las secuencias del hnRNAes mucho ma
yor que la del mRNA,poseyendo una mayor proporción de se
cuencias derivadas de elementos repetitivos, a'la vez que
1-56
la complejidad de sus secuencias no repetitivas también es
mucho mayor (130, 131).
La fracción correspondiente a las repeticiones invertidas
en el DNA,cuando es transcripta, presenta secuencias similg
res al material de doble cadena aislado en hnRNA;sugiriendo
que algunos de los dúplex formados en el hnRNArepresentan
bucles derivados de las repeticiones invertidas presentes en
el DNA,lo que obviamente podria ser de gran importancia en
el procesado del hnRNA(132).
La comparación con mRNA,sugiere que el hnRNAcontiene tg
das las secuencias que muestra el mRNAen el citoplasma, lo
que indica que las secuencias del mensaje deben seleccionar
se para ser transportadas al citoplasma, teniendo que ser degradadas dentro del núcleo las que no son seleccionadas.
Este procesamiento parece involucrar 1a selección de se
cuencias para maduracion y transporte al citoplasma, ya queen algunos casos los mismostranscriptos primarios parecen
estar en más de un tipo celular, pero originan mensajeros mg
duros sólo en algunos tipos de células (h, 133), lo que ind;
ca que existe en realidad algún tipo de control transcripcignal, comopuede observarse en la producción especifica de cie;
1-57
tos transcriptos primarios sólo en células donde el mensg
jero primario debe ser traducido (13h).
La poliadenilación y transporte a1 citoplasma parecen
ser las etapas limitantes en la maduración del mRNA,ya
que el tiempo requerido para sintetizar una molécula de
hnRNA, puede ser del orden de 1 minuto por cada 5.000 nu
cleótidos, pero el tiempo de aparición del mRNAen cito
plasma que es de unos 20 minutos junto con la determina
ción de que la poliadenilación ocurre unos 7 minutos an
tes de la entrada del mRNAa polisomas (135), indica que
debe haber una demora entre transcripción y poliadenila. IClon.
En experimentos cuantitativos, asumiendo que cada hnRNA
posee la secuencia para codificar no más que un mRNA,se
observó que menos de la mitad (un 30%) de las moléculas de
hnRNAdaria origen a mRNAsiendo las restantes degradadas
integramente en el núcleo, mientras que experimentos en queel uso del inhibidor DRBinhibe la sintesis del hnRNAtotal
en un 70%, 1a producción del mRNAes inhibida en un 95%, su
giriendo que podria haber dos clases de hnRNA,una que sel . .7 . .ria sen51ble y precursora de mRmAy otra 1nsens1ble que no
originaria mRNA(136).
1-58
Quizás cumpliendoalgún rol regulatorio, se ha aislado
una fracción de moléculas de RNApequeño, unido por puen
tes de hidrógeno tanto a poli A (+) RNAcitoplásmico como
nuclear (137).
Este RNApequeño perteneceria a una fraccion de RNAque
sedimenta en el rango de 6 a 8 S, presente en el núcleo (y
quizás también en citoplasma) de células eucarióticas y que
da unas 10 bandas por electroforesis en gel (138), siendo
bastante estables y en un número de 104 a lO6 moléculas porcélulas.
La longitud seria de 100 a 200 nucleótidos, conteniendobases metiladas y pudiendo poseer estructuras similares a
cap (139). Aunqueparecen estar localizadas en el esqueleto
nuclear (lHO), algo de este RNApodria estar unido covalen
temente a DNAde doble cadena (lhl).
La complijidad de la población de RNAmensajeros puede
calcularse mediante la cinética de hibridización de un excgso de mRNAa cDNAradioactivo preparado a partir del mismo
mRNApor transcripción inversa (lh2).
El mRNApuede así resolverse en distintas clases, la pr;
1-59
mera de las cuales consiste en un número muy pequeño de gg
nes, a menudoen el orden de 10, representado varios miles
de veces por.cé1ula, los cuales en muchoscasos pueden re
lacionarse con alguna función eSpecializada de 1a célula ,
comopor ejemplo la sintesis de ovoalbfimina en el oviducto
(143) o actina en células Hela en crecimiento (133).
En todos los casos, algo menos de la mitad de la masa de
mRNAconsiste en un gran número de secuencias, en el orden
de 10.000, presente cada una en un pequeño número de copns,
en el orden de lO por células. Lo que indica claramenteuna
diferencia de 1.000 entre la frecuencia de los mensajeros
más y menos abundantes y muestra a 1a vez que 1a población
de mensajeros celulares consiste en un gran número de secueg. l .cClaS presentes en un numero bastante pequeno de copias por
I l .cada celula y un numero muchomenor de secuen01as represen
tadas muchasveces por célula (k, 133, lh2, lk3).
Al menos en células de Drosophila, la abundancia de los
mRNAsparece relacionarse más que con la producción (trans
cripción), con el recambio de éstos; ya que los mensajeros
abundantes pertenecen a la clase de vida media larga, mientras que los mRNAsescasos tienen una rápida velocidad de
recambio (144).
I-6O
En células Hela no se encuentra esta relación ya que la
clase abundante parece constar de mensajeros de vidas la;
gas y cortas, a la vez que en células L los mensajeros
abundantes, además de poseer vidas largas parecen ser de
longitud más corta comparada con los escasos (l#5), aunque
en la gástrula del erizo, ambostipos de mensajeros tienen
igual estabilidad (lso).
Los cálculos realizados, considerando: el tamaño del gg
noma, el porcentaje de éste que es transcripto y la longitud promedio de los mRNAs,(que en 1a gástrula embrionaria
son del orden de 8,1 x 108 pares de bases, 2%y 2.000 bases
respectivamente), indican un númeroestimado de genes exprg
sados en el orden de lO a 20.000 genes que seria similar pa
ra tejidos de vertebrados, plantas, levaduras e invertebra
dos (143, 1h7, 1MB, 1h9, 150).
Una posible excepción a estos niveles de expresión gené. ltica seria el cerebro de mamíferos, donde el rango de genes
xpresados alcanzaría los 70.000 (151, 152).
l — .El numero de genes expresados es similar en X.Laev¿ "'S.
purpuratus, a pesar de haber entre ambosorganismos, una di
ferencia de k veces en el tamaño de sus genomas (lh7, 153);
I-61
. I .lo que indica que los genomas mas grandes no poseen necg
sarianente un número mayor de genes.
Análisis comparativos de los mRNAen higado, riñón y
cerebro de ratón, mostraron que los tres tejidos eXpresan
tres clases de genes cada uno según su abundancia, los quemediante análisis de hibridización cruzada con los cDNA
obtenidos de los mRNAde cada tejido,indicaron que las sg
cuencias de mayor abundancia en hígado no son las de mayor
abundancia en riñón o cerebro y viceversa (152). A la vez
que las reacciones de hibridización cruzada entre las poblaciones de abundancia media y escasa indicarian que la
diferencia entre los tejidos radica en la expresión de 1.000a 2.000 genes presentes en la población de escasa abundan
cia (152, h). Resultados similares se observaron en el es
tudio comparativo entre mioblastos (eritropoyéticos) y ca;
cinoma embrional (pluripotencial) (15h).
Otra comparación interesante es la que se observa ( en
cultivo) entre células en reposo y en crecimiento, dondela transición del estado de reposo al de crecimiento es
acompañado por un aumento en la producción del mRïA, tan
to relativo al RNAcelular total (2 a 3 veces), como en
términos absolutos (3 a 5 veces) (133).
1-62
Aqui se encuentra que las clases de mRNAse presentan
en la mismaproporción, aunque es la abundancia absoluta
de cada una la que aumenta en el estado de actividad(133).
En este experimento, las secuencias específicas para el es
tado de reposo serian unas 500, valor similar para las cgracteristicas del estado de crecimiento.
Aunqueestos cálculos no pueden ser muy exactos, conan:
dan con resultados obtenidos en células AKRen reposo y
crecimiento, que arrojv" unas 1.000 secuencias adicionales
en crecimiento que no apareccv en las células en reposo(155).
Estos resultados son similares en general a los observa. Idos en las compara01ones entre celulas transformadas y no
transformadas (156, 157).
Comoconclusión general se sugiere que la superposición
entre secuencias de mRNAen células diferentes puede ser
considerable; por ejemplo en situaciones comola transnfión
entre el estado de reposo y crecimiento celular, la diferegciación de un precursor celular en un tipo de célula espe
cializado y en la transformación viral de células, dondemu
chas de las secuencias de RNApueden ser comunes a ambas si
tuaciones o tipos celulares y sólo una pequeña proporción
1-63
l .en el numerode genes expresados serian necesarios para1a transición de un estado celular a otro.
Los RNAmensajeros aislados pueden caracterizarse fug
cionalmente por el análisis de las proteinas que ellos
codifican, mediante su traducción in vitro en sistemas
reconstituidos libres de células, los cuales contienenlibosomas, factores de la sintesis proteica y tRNAs,pudien
do ser obtenidos de Varias fuentes, aunque los usados más
comunmentese obtienen de germende trigo o reticulocitos
de conejo (57, 58).
Usualmentela eficiencia de estos sistemas libres de cé
lulas no es alta, ya que cada mensajero se traduce unas pg
cas veces antes de que cese la actividad del sistema, gene
ralmente entre los 90 y 120 minutos; por lo que otra alter
nativa usada es el ovocito de Xenopus laevis, en el cual está asegurada la condición de in vivo del aparato de síntesis proteica.
Este sistema es más eficiente y puede mantener la tra
ducción de los mensajeros inyectados durante 2h a #8 horas,
permitiendo incluso, mediante la inyección de DNA,seguir
la transcripción y traducción combinadas (158, 159); aun
I-6h
que este sistema no es adecuadopara la identificación de
precursores proteicos que puedan ser inestables in vivo,
ya que a1 menos en algunos casos, es capaz de procesarlmg
teïnas precursoras, comola vitelogenina codificada por elmRNAdel higado de Xenopus y poliproteínas codificadas por
virus a RNA(160, 161).
En ningún tipo de sistema parece haber alguna especif;
cidad de especie o tejido, ya que los mensajeros de unaam
plia variedad de sistemas eucarióticos y procarióticos hanpodido ser traducidos con éxito, lo que demuestra en gene
ral, una ausencia de control traduccional capaz de discriminar entre distintos mensajeros (h).
. l . .Probablemente la func1on del aparato de sinte51s prote¿
ca consiste simplemente en traducir los templados que sele
proveen, independientemente de la especie que provengan.
Ésto por supuesto no niega la existencia de control tra
duccional a otro nivel anterior, comoevidencian ciertos
mRPAsinactivos en ciertas células pero que pueden ser tra
ducidos in vitro o en el ovocito, haciendo evidente laenis
tencia in vivo de ciertos elementos que previenen que estos
mBHAalcancen los ribosomas, a la vez que cierto control
1-65
traduccional, quizás de indole similar seria utilizado tem
pranamente durante la embriogénesis, donde el huevo posee
un acopio de mensajeros maternos sin traducir, los cuales
van siendo usados comotemplados para la sintesis proteica
a distintos tiempos a medida que aquella progresa luego dela fertilización (1+).
La unión del mRNAparece realizarse por hibridización
de secuencias cercanas al extremo 5' terminal, con secuen
cias complementarias en el rRNA,tanto en E.coli, comoen
sistemas de eucariotes (162, 163).
Las secuencias por las que se une el mRNAal ribosoma
pueden recuperarse por la protección que adquieren estos
segmentos a la degradación con ribonucleasa (16h). General
mente el ribosoma protege 30 a ho bases, que siempre inclg
yen el codón AUG,en el cual se inició 1a sintesis proteica (para uno revisión ver 165).
Con sistemas de sintesis proteica libres de células, losmensajeros que codifican ciertas proteinas (en especial lasque son secretadas, comopor ejemplo hormonas), pueden tra
ducirse, obteniendo productos mayores que los encontrados
in vivo. A menudoestas preformas son precursores de proprg
1-66
teínas que a su vez son precursores estables de la protei
na madura (166, 167), por lo que esta clase de eXperimen
tos además de ser sumamenteútiles para el estudio funcig
nal del mRNA,sirVen también para el estudio de 1a madurg
ción proteica (para una exposición detallada del mecanis
mode sintesis proteico pueden consultarse los excelentes
textos generales (S, 6, 168).
I-67
La duplicación ge los virus
Muchos, quizás la mayoria,de los avances de 1a genét;
ca molecular han sido realizados originalmente en siste
mas virales, debido a la mayor simplicidad de éstos, com
parados afin con el más simple de los organismos eucarióuticos.
Ésto resulta llamativo si se piensa que hasta unos pg
cos decenios atrás, reinaba gran confusión sobre la difg
rencia :ntre un virus y una célula. Entonces, un criterfi>
clave para la definición de virus, era su capacidad para
atravesar filtros de membranaque retienen a las bacterfis;
basado en este criterio, los pequeñistws elementos pató
genos conocidos comoRickettsiae, se trataban generalmen
te como si fuesen virus; pero hoy se sabe que poseen tan
to DNAcomo RNA, asi como un sistema de sintesis protei
ca, lo que claramente demuestra su naturaleza bacteriana.
Tanto el tamaño, comola complejidad estructural delos
virus, presentan grandes variaciones: algunos t enen pmws
moleculares de unos pocos millones, mientras que otros se
aproximan al tamaño de las bacterias más pequeñas. A pesr
de ésto, la diferencia fundamental entre los virus y las
1-68
células, es que éstas poseen tanto DNAcomo RNA, asi como
al aparato de biosintesis proteica, mientras que la esencia de un virus es la presencia de un solo tipo de ácido
nucleico y la carencia de un sistema sintetizador de pro
teinas, por lo que su multiplicación siempre debe involu
crar la interrelacián de su genomacon enzimas y ribosomas
celulares (5).
Con el auxilio del microscopio electrónico se ha obse;
vado que en general, el ácido nucleico se encuentra en la
zona central de la partícula viral o Virión, rodeado poruna capa de proteinas llamada cápside y cuyas unidades pg
lipeptidicas se llaman capsómeros. A la vez que a la es
tructura compuestapor el ácido nucleico y la cápside se
la conoce comonucleocápside.
Algunos tipos de virus contienen sólo l tipo de protei
na capsomérica, pero la mayoria son mas complejos, pose
yendo además, una envoltura o cubierta rodeando a la nu
cleocápside, formadapor varias capas de distintas protei
nas, incluyendo lípidos y carbohidratos. En estos casos ,al microscopio electrónico suele ser visible una zona in
terna más densa y que rodea a1 ácido nucleico, que recibe
el nombre de core y una zona periférica que corresponde a
1-69
la cubierta (168).
Las proteinas que forman parte del virión se conocen
comoproteinas estructurales, mientras que las proteínascodificadas específicamente por el virus luego de la in
fección celular, y que aunque cumplen un rol en la dupl;
cación del mismono llegan a integrar la estructura del. . lVirion, se conocen comoproteinas noestructurales.
La diversidad de los virus es tan grande, que gran pa;
te del tiempo transcurrido desde el desarrollo de la virg
logia comodisciplina, se ha empleadoen tratar de clasi
ficar sistemáticamente la gran variedad de cepas viralesque iban siendo aisladas. ‘
Los criterios de clasificación han sido tan variadoscomonuevas características virales se iban estudiando.
Afortunadamente y debido al gran desarrollo de los mé
todos de caracterización química y fisica de los virus.(169, 170), ha prevalecido en el comité Internacional de
Nomenclaturade Virus (ICNV), el criterio de clasificación basado en las características moleculares de los v;rus (171).
1-70
En la actualidad el esquemade clasificación generalmente aceptado es:
8-“hoi.
Naturaleza DNAo RNAdel genoma.
Simetría de la cápside (cubica, helicoidal, etc.)Si el virión posee una cubierta o está desnudo.
Sitio de ensamblaje de la cápside (nuclear o citg
plasmico).Sitio en que la nucleocápside es cubierta por laenvoltura.Reacción al tratamiento con éter (resistencia osensibilidad).
Número de capsómeros.Tamañodel virión.
Peso molecular del ácido nucleico en el virión.
Caracteristicas de la polimerasa responsable de lasíntesis del ácido nucleico viral (Si está presen
te en el virión o es inducida luego de la infecciónsi es una transcriptasa reversa, eth).
La clasificación propuesta por el ICNVy basada en estos
criterios se resume en el cuadro E (17‘), tanto para virus
a DNAcomo para virus a RNA.Aquí, las diferencias observadas a nivel molecular se correlac'nnan con la variedad de
1-71
Acido Nuclech M. __;_ 7Sinatríl den una. Cup“).dplidg
Vin-¡ón Dann o muerto Cubierta.emplean
IBlue d: Neko Núcleo cnoplnmanal-blue
Sitio de envol- Membranatun de la nuclearnucleocipnlde
hacclón a eur ¡Instante Sensible resultante
"¡Euro de r 12 252 162cupnberoo
Diámetro del 18-2 ¡3-53 70-90 100 asoxaooo'virión (In)
Peso molecular 1,I. 3-5 23 51.-92 150
del dcágo nucleco (xl
Grupo Phrvo- Pnpovn- Meno- Herpel- Poxvlrunvirus virus virus vlnm
Mie-bro típico Virus SV1.o Mino- Hellpea Vacclntn“una - virus suplex¡cocido
CUADROE. Criterio molecular de clasificaciónde virus.de animales.
I- '72
Acido Ruclsico RIMl
l lBL-u'h (hibiu "encan rI
Virih ¡Zn-mado muerto . abierto Cubierto
Bitio de citoplasma Citoplnm Citopl'sm CiloplunInssnblnge
__lanoltun de ln Super- Menbra- Superficie Superficie He-brsnssmeleocñpside ricie nes ei- membranas de membranas citoplís
de nen-toplls- nicssbruns ¡ica- |
Reaccións ¿ter Resistente slensible' Sensible Sensible Sensiblell° de cspsúneros 32 32 92 r 1
Dibtro de la 6-9 1a lB
hélice (m) IDidntro del - 20-3o 60-80 78 ¡oO-10 ¡00-50 90-120 150.300 103175 apr.109 50-150 10-120
viriñn (m) I | | I I.PH del ácido 2-2,B 15 15 h h 2-16 k-B 3-10 10-13 3,2 1
nuclelco (1.106) I I l I I I IGrupo Picom Orbi- Beo- Alfs Flsvi Orto- Psru- Rhnbdo Oncarns Arena- Corona
virus virus virus virus virus mo- nyxo- virus virus virus virus
hovirus Togsvirus I |I I | ' IMienbro Típico 'Polio Virus Reo- Sind- De ls Influ- Neuess- VBV Su'co- Carlo- ¡tranqui
de ls vi fiebre enu tle ¡e de nenlngi- tis infecle mri- ‘ Reus tis lin- eloss Avisrszül lle focitics
CUADROE . Continuación
esquemasde replicación viral.
En los virus a DNA,el ácido nucleico suele presenta;
se en el virión como una hebra de cadena doble, como en
las familias de los Papovavirus, Adenovirus, Herpesvirus
y Poxvirus, aunque también puede aparecer comouna cade
na simple como en los Parvovirus (168).
Al menos para una comprensión mecanicista de 1a repli
cación, no importa mucho que el DNAsea de cadena simple
o doble, ya que 1a hebra simple puede servir.rápidamente
de matriz para la sintesis de una hebra de DNAcomplemeg
taria y en la forma de doble cadena, gobernar el aparato
replicativo de la célula infectada.
Ya en la célula, los virus a DNAinducen o activan una
DNApolimerasa-DNA virus dependiente, que puede tomar el
control total de la sintesis de DNA,comoocurre con los
virus Herpes, donde el DNAviral es sintetizado en el ná
cleo, mientras la sintesis del DNAcelular es inhibida
completamente, pudiendo visualizarse al microscopio suagregación y desplazamiento a la periferia celular (172).
A diferencia de los virus cuya duplin ción y transcrip.I . . .I
oion ocurre en el núcleo, los Virus JNAde duplicaCion
1-7u
citoplásmica deben poseer la serie completa de enzimas ng
cesarias para estas etapas, ya que se verían imposibilitados de usar ninguno de los elementos del núcleo celular.
Ésto puede observarse en los Poxvirus, cuyo genoma es
DNAde doble cadena, donde en los estadios tempranos post
-infección, no hay evidencia del requerimiento de enzimas
celulares para la síntesis de mRNA,para la adición de cap
o para la poliadenilación. Por lo contrario, las enzimasvirales están empacadasdentro de la partícula viral infec_
ciosa y se liberan al citoplasma, donde inmediatamente ocg
rre la sintesis del mRNAviral (173, 17H).
En forma supersimplificada podriamosvisualizar la re
plicación de los virus a DNA,como un proceso en el que el
DNAes transcripto luego de la infección en uno o varios
mRHAs,que serían encargados de la sintesis de protei
nas, en general no :cturales, capaces de permitir la
rápida duplicación del UNAviral,con inhibición total oparcial de biosintesis de DNAcelular, que producirá la ag
plificación de la sintesis de proteínas virales, hasta llegar el momentoen que la acumulación de proteinas estructg
rales permitirá el ensamblaje de nuevos viriones, que habrán de volcarse a un nuevo ciclo infectivo.
El lugar dondese realice la replicación, la natural;za del DNAde simple o doble cadena, el hecho de incluir
la DNApolimerasa en el virión o inducir su sintesis luego
de la infección, son todos matices que complican la imagen
anterior y hacen que cada familia de virus tenga su ruta
biosintética particular, la cual por ser específica de v;rus que no estan estrechamente relacionados con los estu
diados en este trabajo, no se discutirán en detalle, pu. I .diendose en caso deseado consultar 175.
I . . I .Pero seria en los Virus cuyo material genetico es ela -. . l .RJA, donde aparecerían las características mas peculiares
. f . .en cuanto a biOSinteSis se refiere.
"1 av -' 'al RuApresente en el virion en general es de Simple
hebra como en los Picornavirus, Togavirus, Myxovirus, Arg
navirus y Coronavirus; aunque también puede ser de hebra
doble como en los Reovirus (168, 175).
. . IA diferenCia de las moleculas de RNAcelular, que nun. . . I .ca Sirven comonatrices para la formaCion de nuevas nebras
de REA, la duplicación de la mayoria de los virus a RNAde
manda la participación de una nueva enzima capaz de sinte- . l . . - . -.tizar nuevas nebras de ac1do nucleico soore matrices del
1-76
RNAprogenitor.
Esta enzima, RNApolimerasa - RNAdependiente, también
llamada RNAreplicasa, generalmente aparece poco después
que el RNAviral ha penetrado en 1a célula y unido a los
ribosomas del huésped (5).
A1 igual que las DNAy RNApolimerasas, la RNArepli
casa cataliza 1a formación de una hebra complementaria
sobre una matriz de una sola hebra; por lo que en conse
cuencia el mecanismofundamental de réplica de todas las
secuencias de ácido nucleico por apareamiento de bases
complementarias, sigue siendo el mismo.
Comose deducirá, en esta clase de virus, el RNAviral
debe jugar un doble rol, ya que además de actuar como men
sajero para 1a síntesis de enzimas y demás proteínas ne
cesarias, debe servir comomatriz para 1a sintesis de he
bras de RNAcomplementario. Estas hebras, una vez formadas,
sirven a su vez comomatrices para nuevos ciclos de sínte
sis de RNA, proceso en el que algunas de las hebras hijas
pasan a formar parte de particuias virales nuevas, mientrasque otras se emplean comomensajeros para 1a producción de
Í oproteinas específicas.
I-77
I
El proceso exacto depende de si el virus maduro contig
ne RNAde una o dos hebras, aunque en ambos casos se uti
liza sólo una de las dos hebras complementarias comomen
sajero del gen de una proteina dada (5), pudiendo observa;
se que existe un estrecho paralelo entre la generación de.NNAen los sistemas de virus tanto a DNAcomo a RNA.
En la reproducción de la mayoría de los Virus a RNA(por
ejemplo Picnrnavirus, Togavirus, coronavirus, etc.) la ng
bra que aumpLela función de mensajero para la sintesis
proteica, es la mismaque se halla en los viriones maduros
(a la cual se le asigna polaridad (+)), lo cual permite que
la hebra infecciosa codifique directamente las moléculasdm
RNAreplicasa necesarias para iniciar la duplicación Viral
(175, 177, 178). No obstante, llamó la atención que el v_i_
rus de la estomatitis vesicular (VSV)(un rhabdovirus) ,
que a pesar de presentar RNAde hebra única, la hebra que
codifica la sintesis proteica es de polaridad complementaria a la presente en el virión. Esto planteó el problema
del origen de las moléculas de RNAreplicasa ya que no pg
dian ser sintetizadas sobre la hebra de RNApresente en la
partícula infecciosa (considerado (-)), encontrándose que. I .cada partícula de VSVcontiene una molecula de replicasa
1-78
sintetizada en el ciclo viral infeccioso.previo (5, 179).Los Arenavirus también tendrian su RNAde polaridad (-)
(180).
A diferencia de las células eucarioticas, donde en ge
neral su acepta que los mRNAsson - a1 menos predominantg
mente - monocistrénicos, los mensajeros que'se producen cgmoconsecuenc’é de 1a infección de ciertos virus, pueden
codificar 1a síntesis de varias proteínas distintas (177,181).
. .l .. I.El mecanismo de expre31on p011c1stron1co parece desarrg
llarse según uno de dos esquemas generales:
0 bien - como ocurre en los picornavirus - el mRNAcon
la misma longitud que el RNAgenómico, parece poseer un un;
co sitio de iniciación, dando lugar a un gran precursor prg
teico o poliproteina, que daría lugar a las distintas protei
nas maduras por clivage proteolitico (181, 182).
O sinó, otros virus a RNApresentarian evidencia de pun
tos de iniciación (o terminación) internos, sugerida por la
producción de mRNAsmás pequeños que el RNAdel virión, co
mo seria el caso de los alfavirus y coronavirus (177, 178,182). Estos virus podrían resolver los distintos requeri
1-79
mientos en tiempo y cantidad de las diferentes proteinas
virales, por amplificación de ciertas porciones del gang
ma, los cuales podrian originar las proteinas codificadas
por ellos en cantidades adecuadas. Dado que, deSpués que
un cromosomaviral penetra en una célula, por lo general
no todos sus genes comienzan a actuar a un mismo tiempo,
sino que su funcionamiento obedece a una programación de
"terminada: algunas proteínas virales aparecen inmediata
mente luego de la infección, en tanto que la sintesis deotras comienza luego de transcurrido la mitad del cicloviral (5).
Además, algunos genes comienzan a actuar tempranamente
y continúan operando durante todo el ciclo de crecimiento
y ensamblaje del virus, en tanto que otros funcionan du
rante algunos minutos y luego se inactivan. Esta apari
ción en secuencia tiene ventajas evidentes, ya que algu
nos de los productos genéticos tempranos son enzimas nc»
cesarias para encausar el aparato biosintético celu“ ¿a
cia la expresión de genes virales, por lo que obvi
deben ser activados desde un comienzo; mientras ¿me “LrOS,
tales comolas proteinas de la cubierta viral n Ea lisozi
ma, necesaria para la lisis celular y liberan ha del viius,
I-80
necesariamente deben comenzara operar tardiamente, cuan
do las partículas virales están maduras (5).
Por consiguiente, deben existir sistemas de cóntrol lo
suficientemente precisos comopara garantizar 1a aparicion
de las proteinas adecuadas en el momentooportuna Estos con
troles operarian generalmentea nivel de la transcripción ,
por lo tanto, y al menos en los virus que poseen más deeuna
molécula distinta de mRNA,ciertos mRNAsaparecerian temprg
namente luego de la infección, mientras otros lo harian.más
tarde. Asi, los genes que deben actuar primero, tienden a
presentarse en el comienzode los operones, pudiendo los
codificados en el extremo 5', ser traducidos completamente
antes de comenzar siquiera la transcripción de un gen situa
do en el extremo 3'- terminal (5).
Por otro lado, la sintesis de ácidos nucleicos y proteinas virales procede a veces en forma concertada con lasig
tesis celular normal, continuando a menudoel funcionamien
to de los cromosomasde la célula huésped, durante un lap
so prolongado del ciclo viral. En muchos casos, sin embar
go, poco después de la infección, la mayor parte del metabolismo celular es encausadohacia la sintesis de moléculas
. . . . írelac1onadas excluSivamente con la apar1Cion de nuevas par
I-81
ticulas virales. En los casos más eitremos, comomencio
namos para los virus Herpes, cesa la sintesis de DNA y
RNAcelular en forma total (172), degradándose las matr;
ces de RNApreexistentes y toda síntesis proteica subsi
guiente ocurre sobre matrices de RNAcodificadas por el
ácido nucleico viral (5).
Comovemos, el grado de control que puede ejercer un
virus sobre los mecanismosde síntesis de su huésped va
ría considerablemente, y dependetanto de la naturalezade la partícula infectante comodel tipo de células hueg
ped.
Se han realizado grandes esfuerzos para tratar de cqg. . . . I .prender el dominio eJer01do sobre las células por los aq;
dos nucleicos virales.
Una posible explicación podria darse para el caso de
ciertos fagos, como el Tu, cuyo DNA,por no contener c;
tosina sino la base rara S-OH-metilcitosina, seria resis
tente a una nucleasa codificada por Tu, que, por el con
trario, es capaz de degradar el cromosomade E. coli (5).
Por otra parte, aunquelas proteinas especificas delos virus se sintetizan básicamente de la mismamanera
I-82
queibsdecélulas normales; esto es: las moléculas del mRNA
viral se unen a ribosomas huéspedes, formandopolirribosg
mas a los cuales se ligan los AminoAcil-tRNAs,puede ha
ber cambios en la estructura de los ribosomas huéspedes,
de tal manera que operen mejor con el mensajero Viral que
con el propio; a la vez que se conocen casos en que luego
de la infeccion viral aparecerían especies de tRNAdife
PTÉZUSa los del huésped, tanto por modificación enzimáti
ca de las moléculas preexistentes, comopor sintesis de
tRNAscompletamente nuevos,lo que también podría explicarel triunfo de los mRNAsvirales sobre los del huésped en
la sintesis proteica (5, 165).
Comopodemosver, las estrategias desarrolladas por los
virus para cumplir con el cometido de su superv1Vencia,son
variadas. Gracias a ésto, su estudio ha iluminado el campo
de la genética molecular en forma insospechada.
I- 83
- Características de los Togavirus
Los Togavirus son una familia de Virus de animales,cog
sistente en una nucleocápside icosaédrica, donde se encueg
tra el RNAviral que es de hebra simple, rodeada por una
cubierta lipoproteica (para una revisión ver 183).
La mayoria de los miembros conocidos de esta familia son
arbovirus, los cuales son transmitidos en la naturaleza por
artrópodos hematófogos, (primariamente mosquitos), poseyen
do además la capacidad de crecer por igual en el insectol . l l . Ivector a51 como tambien en huespedes av1ares o mamiferos.
Por criterios serológicos, los Togavirus pueden subdiv;
dirse en alfavirus y flavivirus, los cuales eran conocidosanteriormente comoarbovirus A y B respectivamente (18k).
Además se han propuesto los subgrupos de los Rubivirus y
Pestivirus, acepténdose también la existencia de varios TQgavirus sin clasificar (239).
El grupo de los alfavirus incluye alrededor de 17 miem
bros que dan reacciones cruzadas en análisis de fijación
de complemento, pero pueden ser distinguidos por neutral;
zación serológica de infectividad (183). De este grupo,losvirus Sindbis y Semliki forest, han sido los más extensa
mente caracterizados.
Los alfavirus causan enfermedades que, aunque doloro
sas, generalmente no son fatales para el hombre. Varias
especies, comoSindbis y Semliki Forest, producen en ge
neral infecciones subclinicas. Por otro lado, en el caso
de las tres especies de virus que producenla encefalitis
equina (del este, del oeste y Venezolana), aunque la mavg
ria de las infecciones a humanosson subclínicas, en los
casos serológicamente confirmados se ha registrado de un
2 a un 15%de mortalidad (183).
Los flavivirus, por otra parte, son 33 miembroscono
cidos, definidos de manera análoga a los alfavirus. Estos
virus han sido mucho menos estudiados por su mayor peligrg. . . . ISidad y por un creeimiento en cultivos mas pobre;
En general causan en el hombre enfermedades mas severas
que los alfavirus, entre ellas, las causadas por los virusde la fiebre amarilla, del dengue, de la encefalitis japonesa-y de la encefalitis de Saint Louis, son los ejemplos
mas tristemente célebres de patologías causadas por Togav;
VLlS o
Ademásde los virus agrupados en alfa y flavivirus, se
1-85
encuentra una serie de virus con caracteres morfológicos
correspondient;- a la familia Togaviridae, pero sin mos
trar relación antigénica con ninguna de los dos grupos agtedichos.
Entre éstos están los virus: de la diarrea bovina vi
ral, artritis equina, lactato deshidrogenasa,el agentede fusión celular Aedes aegypti, el virus rubela (causan
te del sarampión (tipo alemán) en humanos) y el virus de
la fiebre hemorrágica de simios (185).
El gran interés despertado por los Togavirus en gene
ral, tanto a nivel clinico, comoen investigación básica,les ha merecido haber sido sometidos a varias y extensas
revisiones en estos últimos años (183, 18H, 186).
Estructura y Morfología
Una amplia variedad de Togavirus han sido examinados
al microscopio electrónico, en secciones finas o por tinción-negativa, evidenciando estos estudios que los Toga
virus son esféricos, con una cubierta no rígida y con uncore o nucleocápside electrodenso (186).
. . I r ..De la inspecc1on de un gran numero Qe reportes, se de;
prende que los alfavirus tendrian un diámetro de k5 a 70
nm, algo mayor que el de los flavivirus, de 35 a 50 nm
(187), mostrando ambosgrupos en la superficie del virión,
proyecciones de unos 4 a 7 nm de diámetro, compuestas prg
bablemente por glicoproteinas.
Las densidades de los Togaviriones han sido medidos por
ultracentrifugación en el equilibrio, mediante gradientes
de sacarosa o de tartrato de potasio, resultando el rango
de densidades para viriones de ambosgrupos, en el orden
de 1,12 a 1,18 g/ml. (188).
En concordancia con su mayor tamaño, los virtnes de los
alfavirus, parecen tener un coeficiente de sedimentación
mayor, alrededor de 280 S (189), que los flavivirus, de
apraxrmadamente 208 S (190).
Comola mayoría de los virus con cubierta, los :ogavirus
son lábiles. Por poseer lípidos en su envoltura, (especial
mente fosfolipidos y colesterol), todos los “ugavirus sonsensibles a detergentes y a éter; también un sensibles a
lipasas, proteasas y a agentes que reduzcan enlaces disu;
furo. A su vez, el aumento de temperatura produce Acti. l . - . .vac1on del Virus, Siendo los flav1v1rus los más termoláb;
I-87
les (186).
El tratamiento con detergentes noiónicos, (comoTriton
X-lOO, Nonidet NP-ho, etc.) o iónicos suaves, (como deox;
colato), remuevela envoltura, permitiendo separar la nu
cleocápside, generalmentepor ultracentrifugación. Por m;
croscopia electrónica, la nucleocápside tendría unos 30 o40 nmde diámetro y un coeficiente de sedimentación de leo
- 150 S, similar para ambosgrupos (189,191).
La densidad de la nucleocápside de ambos grupos - en los
pocos casos en que ha sido determinada - mostró estar en el
orden de 1,30 - 1,40 g/m (192). A su vez, la nucleocápside
de los Togavirus contiene el RNAviral y una sola clase de
proteína (193), sugiriendo la evidencia acumulada, una simetría icosahédrica (187).
. . lComD051c1on
La composición de alfa y flavivirus parece ser similar(aún considerando los escasos datos que se disponen sobre
el último grupo). Así, distintos trabajos parecen coincidir en que los viriones están compuestos por: entre 57 y
61% (en peSO) de proteínas, 5,5 a 6,5% de RNA, 27 a 31% de
1-88
lipidos (especialmente fosfolípidos y colesterol) y alrg
dedor de un 6%de hidratos de carbono (integrando glico
proteínas) (183).
El conocimiento actual de las proteinas de los alfavirus se ha logrado especialmente por análisis de electro
foresis en geles de poliacrilamida (194). Mediante el uso
de esta técnica, puede resolverse una proteina (C) que
forma parte del core o nucleocápside (peso molecular
30.000) y tres glicoproteinas presentes en la envoltura,
El, E2 y E3, con pesos moleculares las dos primeras en el
orden de 50.000 y E3 alrededor de 14.000; conteniendo ade
más El y EQ 8%y E3 45%de su composición en carbohidra
tos (195)
La estructura proteica de los flavivirus ha sido mucho
menos estudiada y aunque no aceptada totalmente, éstos
contendfián tres proteinas: V1, V2 y V3 con pesos moleculg
res aproximados de 9.Ó00, 1%.000 y 50.000 respectivamente,
estando V2 asociada a la nucleocápside, y V1 y V3 en la
cubierta (186, 196).
Los Togavirus contienen además una abundante cantidad
de lípidos que integran la cubierta y forman una bicapa de
1-89
un espesor cercano a 5 nm, como se ha demostrado por es
tudios dc difracción por rayos X (183, 197).
Estos estudios sugieren que la composición lipidica de
los Togavirus seria muysemejante a la composición lipid;
ca de la membranaplasmática de la célula huésped, a través
de la cual emergen los viriones maduros.
E1 RNAviral
Los Togavirus contienen un RNAde hebra simple, el cualal ser extraido en condiciones cuidadosamente controladas
- a fin de evitar su rotura - rinde una molécula, que por
“l’racentrifugación muestra, tanto para alfa comoflaviv;rus, un coeficiente de sedimentación del orden de k0 a 50
S (183, _l98).
'Gomoel cálculo del peso molecular de RNAsde simple cg
dena a partir del coeficiente de sedimentación en medio
acuoso no es de precisa confianza - debido a 1a persisrtencia de la estructura secundaria de la cadena nucleoti
dica -, la estimación de aquél se ha efectuado por otrastécnicas.
I . . .Los analis1s mediante electroforesis en geles - en con
I-90
diciones desnaturalizantes B dan valores de 4,0 a 4,7 X
lO6 daltons (199, 190), por la técnica del análisis de la"huella dactilar'oligonucleotidica se obtuvo un valor de
h.h x 106 (200), mientras que mediciones por microscopía
electrónica arrojaron valores de h.6 x lO6 (201). Estos
eXperimentos muestran que el RNAde los Togavirus consig
te en una cadena polinucleotidica simple y continua, com
puesta le ¿nos 12 a 15.000 nucleótidos de longitud (183);..
lsiendo a composiciónde Varios alfavirus bastante simi
lar con 29%de adenina, 25%de guanina, 25%de citosina y
21%de uracilo, mientras que los flavivirus mostrarian una
composicion algo más discimil con un promedio de 30% ade
nina, 27% guanina, 21%citosina y 22%de uracilo según 183.
El genoma de los Togavirus es infeccioso (186), lo que
implica que el RNAde polaridad positiva puede servir co
mo mRNA,tanto en células infectadas como en sistemas de
sintesis proteica libres de célula (177, 181).
En forma similar que los mRNAsde eucariotes, el geno
ma de los Togavirus contiene un tracto de poliadenina (pg
li A) en su extremo 3' terminal (202).
Estimaciones indirectas del tamañodel poli A sugieren
1-91
valores entre 50 y 120 nucle6tidos de longitud para los
alfavirus (203, 204) mientras que para los flavivirus
aún se dispone de datos escasos y contradictorios queles
asignan desde un tamaño similar a1 de los ‘alfavirus a
una ausencia completa de poli A (205, 206).
Nuevamente, a1 igual que la mayoría de los mRNAsde
eucariotes, el extremo 5‘-terminal del genomade los Tg
gavirus, presenta una estructura cap. (196, 207).
Habría evidencia (al menos en los virus Sindbis y Sem
liki Forest) que existirían secuencias complementarias
en ambos extremos del RNAgenómico, las cuales se visug
lizarian comoanillos con una región de doble cadena, cg
rrespondiente a las porciones hibridizadas (201).
El tamaño de estas regiones sería de unas 150 bases ,
aunque otros experimentos (de temperatura de disociación)
le adjudican sólo 10 a 20 nucleótidos de longitud (208).
Por otra parte, el estudio reciente de la secuencia debases de estas regiones parece confirmar la existencia de
complementaridad entre los extremos del RNA(207).
I-92
Ciclo de crecimiento
Dadoel considerable interés en el ciclo de replica
ción de los Togavirus en su huésped artrópodo, ya en los
primeros experimentos realizados se demostró que en vez
de ser transferidos pasivamente a aves y mamíferos, estos virus eran capaces de multiplicarse activamente en
vectores poiquilotermos (186). A pesar de esta activa rg
plicacién, la presencia del virus parece transcurrir asintomática y sin afectar ni el margende vida ni la repro
ducción del artrópodo.
Con el desarrollo de lineas de cultivo, derivadas de
células de mosquito, se pudo lograr la replicación de ng
merosos alfa y flavivirus. (Para una recopilación consu;tar 183).
En células de mamíferos por otra parte, el crecimiento
ue los alfavirus es rápido y ya a las 2 horas de infecta
das las células de vertebrados a temperaturas cercanas a
37QC, empiezan a eliminar virus infeccioso (186).
Luegode una fase de crecimiento exponencial, relativg
mente breve, la producción viral continua a velocidad con;
1-93
tante por 10 - 12'horas post-infección.
Durante esta fase lineal, la produccion de virus puedealcanzar 1.000 unidades formadoras de placa (PFU)/célula/
hora y el rendimiento total puede ser del orden de lOlo
PFU/ml (186).
Aunquelos alfavirus crecen en la mayoría de las célul .las de vertebrados, los mayorestitulos se obtienen en cé
lulas de embrión de pollo y en células BHK.
En cuanto el efecto citOpático se hace evidente al mi
croscopio, la Velocidad de producción viral cae marcadamen
te. Las células finalmente son destruidas, aunque se han
descripto casos de células BHKinfectadas crónicamente ,
siendo la infección persistente mediadapor interfer6n(186).
La infección con alfavirus es altamente citotóxica para
las célulasde vertebrados, siendo inhibidas tanto la sínte
sis del RNAcomo de las proteínas del huésped, rápidamente
luego de la infección (183).
En contraste con los alfavirus, los flavivirus crecenÍ
en general mas lentamente en las células de aves o mamífg. í . I .ros, y su infeccion es muchomenos c1topat1ca, a la vez que
1-9n
la sintesis macromolecularde la célula huésped es inhi
bida gradualmente y en menor magnitud que en la infección
de los alfavirus (183).
Cuandolas células son infectadas con flavivirus a a;
ta multiplicidad, el período de latencia es de alrededor
de 12 hs. y se requieren otras lO o 20 hs, para alcanzar
títulos máximosde virus en el liquido extracelular, loscuales son en general bajos, con un rendimiento del orden
de 106-107 PFU/ml (186). En ciertas clases de células de
cultivo, particularmente de linaje renal, las infecciones de los flavivirus producen un fuerte y evidente efeg
to citopático; sin embargo, en muchoscasos, la infección
transcurre sin que pueda detectarse dicho efecto al mi. I ocroscopio optico.
Ha resultado interesante también, poder establecer cu;
tivos de células de vertebrados, crónicamente infectadaspor flavivirus, siendo las células de estos cultivos, rgfractarias a la superinfección con virus no relacionados,lo cual podría ser mediadopor interferencia intrínseca opor interferón (186).
1-95
Sintesis del RNAviral
Las grandes diferencias encontradas a nivel de la sin
tesis, presencia de intermediarios y regulación del RNA
viral entre los alfa y flavivirus, hace necesaria unadiscusión separada de las caracteristicas manifestadas
por ambos grupos.
En común con otros virus de RNAde cadena simple y pg
laridad positiva (con excepciónde los retrovirus), lamultiplic: ‘3n de los alfavirus se considera que se ini
cia con la formacion de un RNAintermediario de polaridad
negativa, siendo el rol de esta especie la de actuar como
matriz para la sintesis del RNAde polaridad positiva(h75),
que es 1a única eSpecie encontrada en las particulas virgles (209)ï
El esquema general de replicación del RNAen los alfa
virus se muestra simplificado en la figura F.
Luego de la infección, se considera que del RNAM7s
de hebra positiva, presente en los virknes, son traduci
dos los polipéptidos no estructurales, algunos ( o todos)de los cuales son componentes de la RNApolimerasa-RNA de
pendiente, eSpecificada por el virus (210). Esta enzima
I"96
gyn m“;Y
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.m- Ím(...::::....).
49! PARENÏÁLVIRDL¡M IF
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Viale“.- 4,5(44nolwm)l.¿a-.'
FIGURAF.- Modelo para la replicación del RNAde losalfavirus.(Como se describe para. sindbisen 183)
1-97
seria responsable de la sintesis del RNA#7 s de polari
dad negativa, usando el RNA47/8 (+) como templado. (Al
gunos autores a estas especies les asignan un coeficien
te de sedimentacion de 42 o #9 S).
El RNAM7S(-), no se encuentra libre en la célula ,
sino asociado cen el aparato sintetizador de RNA,donde
funCiona como matriz en la sintesis de nuevo RNAde pola
ridad positiva.
El RNA47 S(-), cuando se aisla de células infectadas
mediante extraccion fenólica, puede encontrárselo en una
de dos formas: o consiste en un dúplex de moléculas de
RNAde 47 S con hebras de polaridad (+) y (-), unidas por
puentes de hidrógeno (llamada forma replicativa (BF)), o
bien aparece como una hebra de RNAk7 S(-), junto con va
rias hcbras (+) nacientes de longitud variable, cada una
unida al RNA(-) por regiones de unión por puentes de h;
drógeno (llaméndose a esta estructura, intermediario re
plicativo (RI)) (211, 215).
Dado que su rol es exclusivamente de templado, la can
tidad de RNA#7 s(-) sintetizado en células infectadas
con alfavirus es extremadamente pequeño comparado con la
I-98
cantidad de RNA(+); lo cual, unido a la dificultad en ai;
lar este RNA(-) de 1a hebra positiva, ha restringido suestudio y caracterización.
Por otra parte, las células infectadas con alfavirus contienen dos especies principales de RNAde cadena simple y
polaridad positiva: una es el RNA#7 s que es indistingu;
ble del RNAencontrado en el virus purificado y la otra, en
ciertas etapas en cantidad mayoritaria, es el RNAde 26 S
de coeficiente de sedimentación y un peso molecular de 1,6
x 106 (212).
Al igual que el RNAgenómico, el RNA26 S posee cap y
está metilado en su extremo 5‘ terminal (213), a la vez
que presenta un tracto de poliadenina en su extremo 3‘(202).
Se ha establecido mediante hibridización molecular (212)
y por mapeode oligonucleótidos (oligonucleótide finger
prints) (21h) que 1a secuencia nucleótidica del RNA26's
representa aproximadamente un tercio del RNA47 S presente
en la partícula viral, correspondiendoeste tercio a laporción 3'—terminal (212, 21k).
La relación molar entre RHAs47 S/ 26 S presente en las
I-99
células infectadas, varía en el rango de 0,2 a 0,8, depeg
diendo del virus que se trate, del tiempo transcurrido lug
go de la infección y de la célula huésped. (209).
De esta forma, la síntesis del RNA26 S, representa un
mecanismode amplificación selectivo del contenido genét;
co de un tercio del RNAviral, siendo los genes correqug
dientes a esta región amplificada, los responsables de lasíntesis de las proteínas estructurales, que habrán de fo;
mar parte de la partícula viral (216, 217).
Por su parte, el RNA#7 S cumple dos roles fundamenta
les, primero actuando comoRNAmensajero para los polipép
tidos no estructurales, entre los cuales se encuentra la
polimerasa viral (210, 218), y luego actuando comomatrizpara la síntesis del RNA47 S (-).
El RNA26 S por su parte, tendría la sola función de
actuar comomensajero para cubrir la demandade polipép. Í .tldOS estructurales que formaran los nuevos v1rus.
En el caso de los flavivirus, a pesar de ser el subgrg' . . I .
po mas numeroso, la 1nformac1on que se dlSpone sobre lal . I
Slnte51s de su RNA, es mucho mas escasa.
I-lOO
En las células infectadas con flavivirus el largo pg
riodo de latencia (12 horas o más), se asocia con una
casi indetectable síntesis de RNAvirus específico (198).
A pesar de ésto, se ha llegado a identificar - entre
6 a 12 horas postinfección - tanto RNAkh S como un RNA
de 20 S de coeficiente de sedimentación y resistente en
un 80%a la digestión con ribonucleasa pancreática (219,22o).
'.. . .Los analisis de Dases del RNA44 S intracelular mos
. . . . .ltraron que era equivalente a1 RNApresente en el Virion,
en todos los periodos postinfección en que pudo detecta;
se (219, 22o).
La naturaleza de RNAde doble cadena del RNA20 S qug
do demostrada tanto por su resistencia a RNAsa,como por
análisis de bases, que mostraron la presencia de bases
complementarias, e indicando la presencia de hebras de
polaridad positiva y negativa (219).
Además, aunque luego de la infección, - hasta las lO
o 15 horas -, la síntesis de RNAcomprende cantidades s;
milares de hebras (+) y (-); más tarde - luego de 16 ho
I-lOl
ras - se produce RNAde hebra (+) en exceso, acumulando
se una relativamente gran cantidad de RNAH%S en la cé
lula e incorporándose a los viriones liberados (219, 220).
Claramente, el RNA20 S de doble cadena (dc) está asg
ciado con la producción de RNA44 S de simple cadena (sc),
el cual luego del período de latencia predomina en la fo;
ma de hebra (+), funcionando en polirribosomas como mRNA
e incorporándose a los viriones maduros (53).
Aunque algunos autores mencionaron - en análisis de RNA
por ultracentrifugación - la presencia de un "hombro" en
la zona correspondiente a 26 S, éste nunca apareció en la
magnitud con que se observa en los alfavirus. Este hombro
a 26 S podría deberse a variantes conformacionales del RNA
20 S y varios reportes indican su rol comouna forma de
transición entre el RNAdc20 S a RNAkk S de cadena sim
ple (22o, 221, 222).
Actualmente se acepta que el RNAdc20 S es el complejo de
transcripción, habiéndoselo aislado en forma activa juntocon antígenos proteicos especificados por el virus (223).Lo
cual estaria corroborado por la presencia de RNA4h S (+) y
(-) de la longitud tota]. del genomaviral (219) y por la
1-102
inmediata incorporacion de radioactividad, 1a cual es lug
go transferida a las especies de RNAsc(220, 221, 222); a
la vez que parece ser la especie de mayor producción en en
sayos de sintesis con RNApolimerasa viral in vitro (22H,
225). Considerandose que el RNA20 S de los flavivirus con
siste en RNAHk S de cadena simple, apareado en la mayor
parte de su longitud con una hebra complementaria en cre
cimiento (138).
Se ha sugerido un mecanismopara la replicación de los
flavivirus compatibles con las observaciones realizadas,elcual se muestra en la figura G.
Traducción del mRNA
Se ha establecido que el RNA26 S es el RNAmensajero
mayoritario especificado por el grupo de los alfavirus enlas células infectadas por ellos (correspondiendo al 60-90%
del mÉHAviral presente) (226, 227). Io cual fue observado
en experimento que involucraban el aislamiento de polisomas,
seguido de liberación del nRïA por tratamiento con EDTA o
puromicina.
Mediante otra serie de experimentos se ha observado que
1-103
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Ehsamblageviral
FIGURA G.—Modelo de la transcripcción y traducción duranteel ciclo de replicación de los flavivirus-(:deacuerdo a 198)
I-loh
el producto de traducción del RNA26 S (in vivo) seria un
polipéptido único de un peso molecular aproximado a 150.000
que seria el precursor de las 3 (o k) proteínas estructura
les del virión (183).\
Este polipéptido seria clivado proteoliticamente en fo;
ma inmediata después de su sintesis - o aún durante ella-,
para originar la proteina de la cápside (peso molecular
30.000) y un nuevo precursor proteico (peso molecular cer
cano a 120.000) que por clivaje posterior daria lugar a.una
de las proteinas de cubierta (peso molecular 48.000) y al
precursor de la otra proteina de cubierta (de peso molecu
lar similar a la anterior) (183), y quizás también a una
tercera proteina de cubierta - de un peso molecular aproximado a JAHOOO-(228).
El RNAM7S de los alfavirus también tiene actividad de
mensajero pudiendo aislárselo de polisomas activos (226,
227), así comohacerlo dirigir la traducción de proteinasin vitro (229).
Los datos disponibles indicarian que al RNA#7 S le cg
rresponde de un 10 a un h0%de 1a actividad mensajera vi
ral en los estadios finales de la infección viral, a la vez
1-105
que se acepta que el RNA#7 S también debe servir como
mensajero viral de inmediato luego de la infección, yaque el RNAdesnudo de los alfavirus es infeccioso (183).
Además de la capacidad del RNAM7s de codificar las
proteinas estructurales (230, 214), este RNAdebe originar todas las proteinas noestructurales observables en
células infectadas, incluso una o más RNApolimerasas
(183).
La traducción del RNAM7s comenzaría en un sitio de
iniciación único cerca del extremo 5' y continuaría ha;ta un sitio también único de terminación situado a una
distancia equivalente a unos 2/3 de la longitud de lacadena de RNA.
El polipéptido precursor originado (de peso molecular
en el orden de 250.000) seria procesado proteoliticamente en etapas sucesivas para dar lugar en definitiva al
menosa k y quizás hasta 8 proteinas noestructurales(pg. o Íra una reV151on ver 228).
La identificacion de los polipéptidos inducidos por. . . I . .los flav1v1rus ha SldOmas dificultosa dado que estos v;. f .rus son incapaces de detener completamente la Sinte51s
I-106
macromolecular de la célula huésped (183).
Ademásde los 3 polipéptidos estructurales presentes
en los flavivirus, se han identificado 5 proteinas no es
tructurales, llamadas NV-l a NV-S,con pesos moleculares
aproximados de 10.500, 19.000, #5.000, 71.000 y 93.000
respectivamente, las cuales estarian presentes en'forma
similar en células infectadas con virus Kunjin, dengue,
de la encefalitis de Saint Louis, y de la encefalitisjgponesa (231).
Conbase en la estrategia conocida tanto para los a;
favirus como para otros virus animales de RNAde hebra. . I o . .pos1tiva, se espero encontrar alguna ev1denc1a de oliva
a . . . iJe postranscrip01ona1 y relac1on precursor-producto en
las proteinas especificadas por los flaviviruas. Sin em
bargo, ademásde las proteinas estables antes menciona
das, no se observaron otras proteinas adicionales o de
vida corta en células infectadas con virus Kunjin mediag
te experimentos con pulsos de marcación con aminoácidos
radioactivos durante tiempos tan breves comol minuto,I . .en la presencia de analogos de am1noác1dos, en presen
cia de inhibidores de enzimasproteoliticas y a altas(#lQC) o bajas (329G) temperaturas (231).
I-107
Tampocose encontró ninguna relación entre las protei
nas grandes y pequeñas especificadas por los flavivirus,
mediantedigestión triptica de cada proteina especificada por el virus Kunjin y posterior comparaciónde los oli
gopéptidos resultantes por electroforesis bidimensional
(232, 233)
Se mostró además que NVS, NVh, V3, NV2 y V2 eran todas
proteinas únicas sin relación una con otra, lo cual tam
bién fue observado para el virus West Nile (234).
A pesar de que virtualmente todas las proteinas espe
cificadas por flavivirus son estables durante largos pe
riodos de marcación, ellas no son producidas en propor
ción equimolecular (235, 236), lo que sugiere que, a1 no
haberse detectado ningún RNAde simple cadena menor que
el RNAgenómico, debe existir alguna forma de control ugduccional.
La primera evidencia directa de ésto fue observada por
el efecto inhibitorio de la puromicina sobre la sintesis
de NVS, NV? y NVl, acompañada de un aumento de la sinte
sis de rvz y V2 en relación a V3 (237, 235), lo cual ta:_n
bién pudo observarse usando cicloheximida durante el pe
I-108
ríodo de marcación (238).
Estos experimentos permitieron concluir que la síntesis de las proteinas virus-específicas no estructurales
y no glicosiladas era diferente funcionalmente de la sú;tesis de las estructurales o glicosiladas (238).
La interpretacion más lógica de todos los datos obte
nidos - particularmente con virus Kunjin - es que el ge
nomade los flavivirus funcionaria comoun mensajero p0
licistrónico presentando sitios internos de iniciación de
1a traducción, multiples e independientes (para una revisión consultar 198),
Los flavivirus serian asi el único ejemplo conocido de
virus animales de RNA(+) para los cuales la evidencia dig
ponible sugiere que todos los productos de traducción (con
excepcion posiblemente de una o dos proteinas muy pequeñas)
serian únicos, es decir sin relación entre si (232, 233,23h).
Ensamblaje y maduración
Se ha demostrado en una variedad de sistemas virales
animales, vegetales y bacterianos - que el proceso de en
1-109
samblaje del virus depende de la interaccion de sus compg
nentes estructurales en una forma específica y predecible
(2h0). Siendo esencial para la formación de una determina
da estructura viral las interacciones del tipo proteínaproteina, proteína-ácido nucleico, proteína-lípido y ac;
do nucleico-lípido. La interacción de estos componentesresulta en general, en la producción consistente de parti
culas virales idénticas, implicando que los componentes
del viru.;;gntendrian la informaciónesencial necesariapara la determinación de la morfología de los nuevos viriones (2Hl).
. . lComoya menc1onamos, los Togav1rus estan compuestos por
l .una nucleocapside o core electrodenso y una cubierta mem
branosa que presenta proyecciones - comopúas - en su su
perficie externa.
El RNAy las múltiples copias de la protima de la cáp
side (proteína C) de los alfavirus son de origen enteramen
te viral, pero la cubierta en contraste, es una estructurahíbrida derivada de lípidos preexistentes en la célula huégped y de glicoproteinas producto de 1a información genética
del virus (241).
I-llO
Aunque 1a secuencia de aminoácidos de las proteínas
de la cubierta de los alfavirus está determinadapor el
RNAviral, la glicosilación de ellas se realiza por gl;
cosiltransferasas preexistentes en la célula huésped, loque de este modorefleja la iniormación genética de la
célula mediante los carbohidratos presentes en las glicoproteínas virales (2hl).
Las investigaciones morfológicas y bioquímicas indi
can que el proceso de ensamblaje de los alfavirus tran;
curre de la siguiente manera: Primero el RNAviral y la
proteina de la cápside se agregan para formar la nucleo
cápside en el citoplasma de la célula infectada. (Al me
nos en algunos casos, en las etapas tardías de la infec
ción las nucleocépsides de los alfavirus pueden llegar a
acumularse dentro del núcleo celular, lo que ha sido de
mostrado para los virus de la encefalitis equin: ¿el Oeg
te y Venezolana, Bijou Bridge y Fort Morganen-vïiulas
Vero) (239).
I . I . .Luego, las cap51des morfologicamente completa, ;pero
no necesariamente maduras) migran y se asocian al. I . leitoplasmico de la membranacelular del huesped, la cual
ha sido modificada previamente por la inserción de pro
I-lll
teïnas virus-específicas que son las destinadas a conformarlas glicoproteínas de 1a cubierta viral.
La envoltura de la nucleocápside de los alfavirus en la
membranacelular modificada, involucra el cubrimiento pro
gresivo de aquella por la estructura de membrana,lo cual
está acompañado por cambios en 1a misma membrana y en el
peso molecular y ordenamiento topológico de al menos une.de
las dos proteínas de la cubierta. (para una detallada discusión del ensamblajede los alfavirus consultar 2kl).
Finalmente, se ha demostrado que la liberación del virióa
ocurre en un proceso que comienza luego de que la partículaviral en desarrollo se encuentra envuelta totalmente en la
membranacelular (187); fusionándose entre sí primero lascapas internas de la membranacelular por un lado y del v;
rus por otro, para luego fusionarse la capa extrena de la
membranacelular, dejando al virus completamente cubierto yfuera de la célula.
. .iAl 1gual que otras etapas ya expuestas, la madurac1on de
n o . .i -.los 11av1v1rus tamblen alfiere de lo observado en los alfa
virus.
En el caso de los flavivirus, la morfogénesis está asoclg
I-112
da predominantemente con membranasdel reticulo endoplás
mico celular ya que las partículas virales morfológicameg
te maduras se acumulanen vesículas con su superficie ex
terior tachonadas de particulas electrodensas parecidas a
ribosomas (2H2). En menor cantidad, los viriones también
se acumulan dentro de las membranas del complejo de Golgi,
aunqueno se visualizan posibles particulas precursoras
(2h2, 2h3).
Ocasionalmente los viriones maduros se encuentran dentro. . . i .de disten01ones de la membrananuclear y tambien aislados
en el citoplasma (198).
Comono se ha obtenido evidencia directa de brotación
(budding) de los flavivirus a través de la membranade cé
lulas infectadas, se ha postulado que la cubierta viral sgria formada por acrecion de las proteinas de la cubierta a
partir de un dominio lipoproteico modificado, en la membrg
na del reticulo endoplásmico (2Mh), lo que podría indicar
que la composiciónlipidica de los flavivirus seria tam
bién controlada por la composición presente en la célulahuésped (2h5).
Por otra parte, la evidencia bioquímica de partículas
1-113
precursoras en las células infectadas con flavivirus, no
sólo es limitada, sino también poco esclarecedora.
La nucleocápside no ha sido aislada directamente de cé
lulas infectadas, a 1a vez que los análisis comparativos
de la composiciónproteica y 1a infectividad especificade viriones purificados del medio extracelular e intrace
lular, mostraron que las formas intracelulares del viruspresentaban ademásde las proteinas V3 y V2 la proteina
no estructural NVl en mayor proporción que V1 y además que
su infectividad eSpecifica era de 0,00% comparadacon la
de las formas extracelulares (237, Zhó). En estos casos y
mediante electroforesis en geles, las formas intracelulares aparecieron libres de proteinas celulares.
Estos estudios sugirieron que la forma intracelular ma
duraría a la forma extracelular, ganando su actividad infegtiva por clivaje de HVlpara_dar V1; lo que actualmente tig
.I ... I . . .ne poca aceptac1on, ya que estquOS mas recientes indicarfini
que ambas formas tendrian infectividad similar y que la fa;
ta de actividad observada previamente se debería a la rude
za del método de extracción empleado en esos eXperimentos
(233).
I-1lh
Dado que no hay evidencia convincente de la existen
cia de partículas precursoras o de un fenómenode brota
ción en la maduraciónde los flavivirus en célulasinfq;
tadas, parece más probable que el ensamblaje ocurra rap;
damente por un proceso de acreción o agregación, bien en
"fábricas" citoplasmáticas que producirían acúmulos oagregados virales, o dentro de la luz de vesículas o rg
tículo endoplásmico modificado, adyacente o continuo QII
masas de microtúbulos cercanos al núcleo (para una rev;
sión consultar 198).
Los viriones se acumulandentro del reticulo endoplág
mico pareciendo moversehacia la periferia celular, pudiendo estar interconectados los sitios de acumulación
viral a fin de facilitar su movimientodesde la región
perinuclear a la periferia (198).
Antes de la lisis celular, las vesículas conteniendo
los viriones y que han migrado al perímetro celular, se
fusionan con la membranaplasmática produciendo una apg
rente invaginación de la cual escapan los viriones (247),
permitiendo este mecanismo,la liberación lenta y continua del virus.
I-llS
Cuandoocurre la lisis celular, la liberacion de virus
ocurre por la rotura de la membranaplasmática y la libg
ración del contenido citoplásmico, por lo que es bastan
te comúnencontrar los viriones formando agregados o ra
cimos extracelulares, o aún, dentro de las vesículas o
restos de retículo endoplásmico antes mencionado (2H2,2MB).
1-116
El Virus de la Fiebre Hemorrágica de Simios
Se sabe que virus diferentes y no relacionados causan
fiebres hemorrágicas en el hombre (2k9).
Varios de ellos son arbovirus, por ejemplo la fiebre
hemorrágica Soviética de Omsky la enfermedad India de
Kyasanur Forest, que son transportados por las garrapa
tas, asi comolos diseminados por mosquitos que incluyen
los virus de 1a fiebre amarilla, dengue, chikungunya, yfiebres hemorrágicas del sudeste asiático (250).
Los dos virus del grupo Tacaribe: Junin y Machupo,que
causan las fiebres hemorrágicas Argentina (251, 252) y
Boliviana (253) respectivamente, se considera que no son
transmitidos por artrópodos, sino que están involucradosen un ciclo zoonótico.
Temiendolos graves efectos de cualquiera de las patg
logías recién mencionadas, llamó poderosamente 1a aten
cion - en noviembre de 196%- la explosiva epizootia de
una enfermedad hemorrágica y febril en la colonia de monos mantenidos en cuarentena en los Institutos Nacionales
de Salud de los Estados Unidos de América (NIH) en Bethes
da, Maryland.
1-117
La enfermedad se'inició primeramente entre los monos
rhesus (Macaca mulatta) enviados poco antes desde la Ig
dia, propagándose luego rápidamente en toda la colonia
y afectando a tres eSpecies! rhesus, cinomolgus (Macaca
irus) y macacos (Macaca speciosa); mientras que otros mg
nos: 50 monos patas jóvenes (Erythrocebus patas), un pe
queño número de monosardilla (saimiri sciureus) y varios
chimpanzees pequeños (Pan satyrus) también estuvieronlmg
sentes en la colonia durante la epidemia (253).
De la colonia de 1050 animales mantenidos separadamen
te en 18 habitaciones no pudo evitarse que 223 enferma
ran y murieran en un periódo de 2 meses, siendo la mortg
lidad del 100%en los casos clínicamente evidentes (253).
Casi simultáneamente ocurrió una epizootia similar en
üfiemonosrhesus provenientes de la India en el Instituto
Sukhumide Terapia y Patología EXperimental en la U.S.S.R.
(254, 255).
El mismo proveedor habia despachado los monos de la Ig
dia al Instituto Sukhumiy a1 N.I.H. (Para una detallada
descripcidn de la epidemia referirse a 253).
.,I . . . . .mas tarde ocurrieron otras epidemias Similares en el
I-118
Centro de Biologia de Primatesen California (USA)y en un
comercio en Sussex, Inglaterra (260, 261).
Aunque los primeros casos de la enfermedad no se reco
nocieron en el NIH como una nueva entidad, a medida que
más animales se enfermaban y morían, fue emergiendo un
sindromeclinico distintivo, que si bien podia reproduci;se en monos por inoculación de la sangre de animales infeg
tados, no pudo detectarse el agente etiológico en otrosanimales de laboratorio ni en la sangre o excreciones de
ninguno de los humanos expuestos a los animales enfermos.
Las caracteristicas clinicas de la enfermedadincluyen:
rápido desarrollo, fiebre temprana, edemafacial, anorexia, adipsia, deshidratación, proteinuria, cianosis, patgquias, melena, epistaxis y ocasionalmente hemorragias re
trobulbares (256, 253).
Las medidas terapéuticas consistentes en la administra
cion de antibióticos de amplio espectro, vitaminas, alimegtación forzada y administracion de electrolitos por via
oral o parenteral fueron inefectivas, observándose una mo;talidad del 100%en los animales clínicamente enfermos(253).
Estos primeros estudios sugirieron que: la sangre de los
I-119
animales afectados en el estadio terminal de la enferme
dad contenía el agente causal en alta concentración; lasinfecciones subclinicas ocurrian con el desarrollo de
cierto grado de inmunidady que la transmisión de la en
fermedad estaba limitada a los primates simios (249, 253).
Esta última caracteristica permitió distinguir esteság
drome de la enfermedad de la selva de Kyasanur y condujoa la denominación de esta enfermedad con el nombre de El;
bre Hemorrágica de Simios (SHF) (256).
La potologia producida en la enfermedad de la fiebre hg
morrágica de simios se describe en 256, detallandose: hemg
rragias capilar-venosas en el intestino, pulmones,mucosa
nasal, dermis, bazo, subperitoneo renal y lumbar, glándulas adrenales, higado y tejido conectivo periocular y asg
ciadas con las hemorragias: vasodilatación, éstasis y trogbosis venosa, asi comofragilidad vascular y defectos de
. I ICoagulac ion Sanguinea o
Se detallan en el mismoinforme los cambios degenerat;.hl ..1 n .vos en el higado, rinon, cerebro, teaioo linfático, bazo
I Iy medula osea.
Muchas de las lesiones observadas en los monos son si
I-120
milares a las producidas en varios mamíferos por shock
irreversible (257, 258), el cual incluye éstasis y trqm
bosis capilar venoso, patequias, congestión gastrointeïtinal y hemorragia con ulceración así comodegeneración
isquémica del hígado, riñón y glándulas adrenales. Es de
interés recordar que el shock o colapso circulatorio se
ha descripto en la mayoría de las fiebres epidémicas v;
rales y especialmente en las de afección humana.
Establecida 1a presencia de una alta concentración
del agente infectivo en el suero de monosrhesus enfer
mos, se realizaron múltiples intentos en propagar y ai;lar el agente etiológico en animales de laboratorio,hug
vos y en una gran variedad de líneas celulares en cult;
vo, con resultados insatisfactorios hasta que finalmente pudo detectarse un efecto citopático (CPE)en cultivos de células MA-loh (249) - también conocidas como
USU-lobr (261) - derivadas de riñón de embrión de mono
rhesus.
l fluido de cultivo de sucesivos pasajes se inoculóL1]
- . I .a monos rhesus sanos, procu01cndo la tipica enfermedad
hemorrágica. Tanto los sueros patológicos comolos lí
I-121
quidos de cultivo resultaron negativos en cuanto al aislgmiento de organismos en medios bacteriológicos o para My
coplasmas; asi comoen embriones de pollo, hamsters, ratg
nes, ratas y cerditos de guinea; en adición, las tinciones realizadas no revelaron la inclusión de organismos(2%».
El virus SHFaislado en cultivos de células MA-loh, no sé
lo carecía de patogenicidad para los animales antes menea;
nados, sino también fallaba en la estimulación de la respuesta de anticuerpos de éstos.
Luegodel importantísimo logro que significó poder replicar in vitro el agente causal de la fiebre hemorrágica
de simios, los estudios se encaminaronhacia los análisisbiológicos y biofisicos que permitirían la primera etapa
. . I .de caracterizac1on del Virus.
Al inocular con suero de animales moribundos cultivos
de células HA-lOH,se obtuvieron ll cepas de virus SHF. La
cepa considerada prototipo (LVR42-0/M69kl) - por provenir
de un monocon un cuadro tipico de fiebre hemorrágica de
simios y por reproducir el cuadro también característico
de SHFcuando se la inoculaba en monos sanos - producía en
células MA-104un efecto citopático (CPE)de caracteristicas poco comunes (el cual se describe en 249) que progresa
I-122
ba a la totalidad de las células luego de 2H-k8horas dedetectado.
Vistas al microscopio electrónico, las lesiones temprgnas relacionadas con la infección de virus SHFen cultivo
de células, aparecían comofoci citoplásmicos electroden
sos conteniendo agregados de ribosomas.
Tambiénpudieron observarse numerosas vesículas peque
ñas con un diámetro medio de 100 nmy llenas de material
filamentoso densamente teñible (260). Algunas de estas vg
sículas también contenían partículas indiferenciables deribosomas.
En las 2h horas siguientes estas vesículas adquiríanuna membranalimitante, con su superficie interior llena
de partículas similares a ribosomas. A medida que progre
saba la infección, las membranasde vesículas vecinas pa
recieron fusionarse alcanzando longitudes de varios micrg(2,60).
Se vieron partículas virales por primera vez a las 72
horas luego de la infección y cuando las células ya hahfim
alcanzado una extensiva degeneración. Las partículas virgles fueron vistas dentro de las vacuolas citoplasmáticas
I-123
como formas esféricas de #0 a 45 nm conteniendo un core
de 22 a 25 nm. (La detallada descripción de lesiones cg
lulares y virus puedeconsultarse en 260).
A fin de proseguir los estudios de microscopía y asg
ciar las particulas virales observadascon la infectiv;dad de SHF, se desarrolló un método de concentración y
purificación del virus consistente en: ultrafiltración,ultracentrifugación sobre colchón de sacarosa, seguido
de bandeo por ultracentrifugacion en equilibrio en un
gradiente continuo de sacarosa, obteniéndose un pico un;
co de infectividad a una densidad de l,l9-l,20 g/ml,smgdo la infectividad de este material neutralizado en un
99%por el suero de monosconvalescientes (260).
El virus mostró ser sensible a cloroformo y lábil a
ácidos, siendo relativamente estable al calor (5090),
aunque aumentaba su inactivación en presencia de cationes divalentes (2h9).
7 . I . .ho hubo hemabsor010ndel Virus presente en los liqu;
dos de cultivo mediante glóbulos rojos de: monosrhesus. l . .y verde Africano, hamster, raton, rata, coneJo, cerdito
de guinea, humano(tipo 0), ganso y pollitos de un día;
I-12H
por otra parte, el antígeno de los cultivos - concentrado
20 veces - fue incapaz de producir la hemaglutinación de
los glóbulos rojos de esos mismos animales en un rango de
pH entre 6,8 y 7,H a temperaturas de h,24 y 37°C (2H9).
El suero de los monos sobrevivientes de algunos de los
estudios de transmisión de la enfermedad, fijaron comple
mento con el antígeno obtenido de los cultivos celulares
con títulos de hasta 1/512, mientras que los análisis decélulas infectadas con anticuerpos fluorescentes contra
SHFrevelaron la presencia del virus tanto en núcleo como
en citoplasma (2k9). En estos trabajos no pudo demostrar
se mediante estudios serológicos ninguna relación del virus SHF con otros virus a RNA.
Los estudios biofísicos iniciales revelaron mediante eg
perimentos de inhibición metabólica que el agente causal
de SHFcontenía RNA(2h9), y - con posterioridad - que el
ácido nucleico viral - marcadoradioactivamente y extraído
con fenol y SDS- era sensible a la digestión con RNAsae
insensible a DNAsa(262). Este RNAcuando fue analizado
por electroforesis en geles de poliacrilamida apareció cg
mo un amplio y difuso pico correspondiente a un tamaño prg
medio de 20 S, lo cual sugería la posibilidad de que: o
1-125
bien el genomade SHFera segmentado (bastante cuestiona
ble considerando las otras caracteristicas) o que éstefuese inusualmente frágil. (262).
La electroforesis en geles de poliacrilamida de las prg
teínas de SHFmarcadas con aminoácidos y glucosamina radig
activos mostraron H picos proteicos, mientras que el anal;sis de los fosfolípidos presentes en viriones de SHFpuri
ficados determinó un notable porcentaje de fosfatidilcolina (262).
Por lo tanto, hasta el inicio de esta tesis, las características asignadas al virus de la fiebre hemorrágicade
simios eran: el ácido nucleico viral era RNA,la simetría
de la cápside viral parecía ser cúbica, el virión teniacubierta y era sensitivo al tratamiento con éter, el sitiode ensamblaje de la cápside era citoplasmático, el sitiode envoltura de esta nucleocápside era dentro de membra
nas intracitoplasmáticas, la densidad del virión era delorden de 1,18 g/ml y su diámetro de 40 a SOnm,presentan
do 4 porteínas estructurales (262, 2h9, 260).
' . . . . . IEstos resultados permitieron sugerir una cla51f1cac1on
preliminar del virus SHFdentro de la familia de los Toga
I-126
'virus y probablementedentro del grupo de los flavivirus(262) o de los pestivirus (263).
El mayor conocimiento del agente etiológico no impidió
sin embargoque siguieran presentándose nuevas epizootiasde SHFcon resultados fatales en las colonias de simiosen
cautiverio (26h).
La recurrencia de estas epidemias pudo ser eXplicada
al detectarse que monospatas asintomáticos eran portado
res crónicos del virus SHF, sugirióndose que aquél podria
ser el huésped natural de éste y una fuente de infección
para los macacos (26h).
El desarrollo de un método rápido de detección de monos
patas infectados mediante la lisis de macrófagosperitonea
les de monos rhesus por sueros de monos patas portadores
del virus, permitió sugerir que la naturaleza altamente igtal de SHFen macacos se relacionaba a 1a sensibilidad ex
trema de sus células fagociticas mononucleadasa la infec
ción y lisis (265).
El estudio de poblaciones salvajes de monospatas mostró
que un alto porcentaje de éstos (h8,6%) poseía anticuerpos. - I . . Icontra el Virus SfiF, y ademas, que la infecc1on no era trans
1-127
mitida por animales enfermos a sus bebés por leche mate;
na o cuando aún estaban dentro del útero (266).
Se comprobó que el suero de monos patas infectados pe;
sistentemente contenía virus que producía un sindrome SHF
típico y muerte al ser inoculado en macacos, lo que sugi
rió que los animales infectados presentaban una viremia
continua (26h, 267). Pero a diferencia de la cepa protot;
po de SHF (LVRH2-O/M69kl), el virus proveniente de ani
males con infección persistente no podia ser aislado en
células MA-th, ni tampocoen otras células, implicando
que el virus presente en estos monospatas infectados pre
sentaba alguna diferencia con la cepa prototipo ya que se
descarto que este efecto se debiese a la presencia de an
ticuerpos bloqueantes u otras posibilidades (267).
Finalmente, se pudo aislar de los linfocitos de sangreperiférica de monospatas infectados crónicamente una nue
va cepa de virus SHF (P-2H8), la cual pese a mostrar el
mismotamaño, morfología y sitio de replicación que la cg
pa prototipo (LVR)- causaba una infección persistente sin
citopatologia evidente en las células MA-104,lo que esta
ba en contraposición con la infección intensamente liticade la cepa LVR(267).
1-128
Esta capacidad de la cepa P-2H8 de producir una infegción no litica e” células MA-th fue una caracteristica
muy estable, demostrándose además - por técnicas de inmg
nomarcación - que sólo un pequeño porcentaje de las célg
las de cultivo eran infectadas persistentemente (267).
El mecanismo de persistencia del virus SHF(P-2k8) en
células MA-lOko en monos patas crónicamente infectados
no ha podido ser aclarado, pero la evidencia aportada su
giere que no inVolucra interferón ni interferencia de pa;ticulas defectuosas (267).
Estos trabajos señalaron un interesante modelopara es
tudios de infectividad viral, persistencia y respuesta igmunológica, por ser el virus SHFcapaz de causar la muer
te en ciertos monos (rhesus) y mantener una infección pe;
sistente en otros (patas), a la vez que se cuenta con una
linea celular (MA-10H)capaz de ser lizada por una cepa y;
ral (LVR) de SHF, pero no por otra (P-2h8).
A-pesar de la importancia fundamental y de su posible
aplicabilidad tanto a otras zoonosis comoa patologías hu
manas de alto interés, aún no han sido aclarados los mecanismos de la sensibilidad diferencial de las distintas es
1-129
pecies animales (aún estre aquellas muyrelacionadas) a
1a infeccion del virus SHF, así comolas diferencias mg
leculares entre cepas (LVRy P-2h8) que explicarian los
dos cuadros patológicos de SHF, La falta de comprension
de estos puntos fundamentales se debe principalmente aldesconocimientode las características biofísicas o mo
leculares del virus en cuestion, lo que en buena parteestimuló el inicio de 1a presente tesis.
Ï-l30
o BTIVOS DE LA PRESENTE IN'VEQTIGACIQE
Se propone aquí un enfoque molecular para el estudio
del virus SHF; en especial de su RNA, dado que cualquig
ra de sus caracteristicas biológicas mencionadasen el
capitulo anterior - generalización válida también paralas de cualquier otro organismo- será reflejo de algu
na parte de la información codificada en el genomay de 1a
interacción de ésta con otros organismos y con el medioexterno.
. . . lPrev1amente se tratará de completar la informac1on
existente.sobre el virión y core de SHF, de manera que
estos datos sirvan de base firme para los estudios posteriores.
Teniendo en cuanta lo comentado en los capitulos prg
vios de genética molecular, se pretende determinar lascaracteristicas fisicoquímicas - en especial de aquellasde interés funcional como poli A y CAP- del RNApresen
te en el virión de SHF, comparado con uno de los Togavi
rus mejor caracterizados comoes el virus sindbis.
. f . . .Se intentara luego deduc1r el pOSible mecanismo de ig. .I I. .
plicac1on del ac1do nucleico de SHF, comparando las especies de RÑApresentes en células infectadas con controles
sin infectar, asi comola presencia de intermediarios dedoble hebra mediante distintos métodos de aislamiento.
Finalmente, se tratará de completar el esquemadel ci
clo replicativo del virus SHF,estudiando las especies capaces de actuar comomRNAen la biosintesis proteica y mg
diante el análisis de la presencia de poli A y CAPen el
RNA de SHF.
En base a estos estudios se intentará definir el RNA
mensajero del virus SHF, tanto por las evidencias quimi
cas comofuncionales, comoes su presencia en polirribo
somaso su capacidad de codificar proteinas "in vitro".
Además, la determinación de todos estos parámetros de
berá aportar 1a información básica y 1a formación técnicanecesarias para colaborar en el estudio de un amplio es
pectro de problemas de regulación y expresión genética en
cualquier disciplina cientifica, dondeuna funcidn biolégica quiera ser correlacionada con las caracteristicas de
I .los ac1dos nucleicos involucrados.
MATERIALES Y MÉTODOS
Ante las dos posibilidades de ordenamiento de esta.I . .. I. . .|secc1on - enun01anao los metouos completos para los oIt
jetivos comentadosen las respectivas secciones, o las
técnicas .ndividuales utilizadas en cada uno de ellosfi
en honor a la claridad fue elegido el primero, ya que
cada métododescripto en todo su desarrollo nerzitiráver la relación secuencial de las listintas técnicas
que lo componen, visualizéndolo comoun diseño e:peri—
mental unitario y con,leto.
Con la idea de no extender este sección más de lo n
cesario, todas las técnicas y la procedé;cia de los met
rieles descriptos en ellas, son tratados con todo detalle la primera vez que se mencionan, adjuaic
I . '_numero (romano en letras minúsculas) en toda otra opo
tunidad en que se hace referencia e las misnas.
i. Cultivo de células MA-loh
Las células HA-loh - también conocidas comoUSU-loh
(261) fueron cultivadas a 379Gcon circulación de aire
(h 1pm), 5% de CO2 y atmósfera húmeda (incubador FormaScientific modelo3185); en botellas plasticas de 150
cm2de superficie de cultivo (Costar, Corning o FalconL
usando ho m1 de medio esencial mínimo de Eagle con sales
según Earle (BMEM)(268) con 50 ug/ml de gentamicina(H;
crobiological Assoc. cat.nQ 09-733 B) y 1 5Mde L-glut;
mina - 146,5 mg/l - (Gibco cat.nQ 320-5030), suplement_
¿o con 10% de suero fetal bovino (FCS) (Gibco) y en con. . I .dlClones esterlles.
Las células MA-lOMfueron crecidas hasta confluencia
de la monocapay replicadas mediante tripsinización(trig
sina 0,05%, EDTA0,1% en buffer salino de fosfatos 0,2M,
pH neutro (PBS) sin calcio ni magnesio - Hemcat.n918JDH
a 379Gdurante lO minutos, distribuyendo las células rgsuspendidas a nuevas botellas de lSC cm2, sienfio la re
lación de replicación de una botella a 5 y hasta de l a10.
.. .l l , . ,11. Infecc1on de celulas hA-th con Virus SHF
En este estudio se empleó exclusivamente la cepa LVR
(M2-O/M69Hl) de virus SHF obtenida de la American Type
Culture Collection (269).
A las células MA-lohcrecidas hasta confluencia -unas
3 x 106 células (267)—se les quito el medio de cultivo,
luego de lo cual fueron infectadas con virus SEP en una
l(D\
.I . ... .re1a01on aprox1mada de l unload formacora de placa por c_ , .I . .lula. Luego de un periodo de absorc10n de 1 nora en incu
bador a 3790, se agregó 40 m1 de medio EEE! con gentami
cina y 2ï FCS. En los casos de estudios cinéticos dondeI . .I . . . Ise requeria una 1nfecc1on Sincronizada, el inoculo (unos
2 ml) se retiró previamente al agregado de medio de cultivo.
En cuanto pudo observarse al microsc0pio (de fase inve;
tida Carl Zeiss) un marcadoefecto citopático en las célu
las, se procedió a cosechar el medio de cultivo sobrenadag
te, recalcando que todo el material utilizado así comolas
manipulacion realizadas, se efectuaron en condiciones de
esterilidad. (campanade flujo laminar, seguridad clase IItipo A - Contamination Control Inc.-).
, .l ..111. Larcac1on del RNAcon 3H-.r1dina
Según las necesidades, el RNAde células HA-lOHcreo;
das a confluencia fue marcado con 3H-uridina según una de
las dos estrategias siguientes:a) Cuando el objetivo del estudio era el RNAintracelular,
las células se infectaron con aproximadamentel PFUde v;
rus SHFpor célula, retirando el inóculo luego de l hora
de absorción y agregando medio de cultivo con 5 ug (o can
tidades variables en los primeros estudios) de actinomic;
na D (Merk, Sharp & Dohme) por ml de medio.
Luego de 2 horas de incubación se agregaron 30 uCi de
3H-uridina (NewEngland Nuclear cat. nQ EST-367, activi
dad especifica en el orden de ho Ci/mmol) por m1 de medio
y se dejó proseguir la infección durante 18 hs., tiempo en
que el efecto citopético (CPE) alcanzaba aproximadamente
un 80%de las células infectadas.
b) Cuando el objetivo era la marcación del RNApresente en. .P . a. .el Virion liberado al mediode cultivo, las células se tr;
taron primeramente durante 2 hs. con act.D-5ug/ml- y luego
el medio con act. D fue quitado y las células infectadascon aproximadamente l PFUde virus/célula. Luego de una hr
de absorción - siempre en incubador a 379G - se agregónue
vo medio EHEBísuplenentado con 2% de FCS conteniendo 30
uCi/ml de 3H-uridina y se dejó transcurrir 1a infección
durante 20 hs, tiempo en que el CPE alcanzaba más de unïx%de las células.
. . I aiv. Extrac01on del RNAde Qpnocaoas de células infectadas
a) Cuandolas células infectadas en presencia de trazador
radioactivo y act.D alcanzaron el tiempo de incubación "e
seado - 18 hs-, se les quitó el medio de cultivo y fueron
lavadas con lO m1 de PBS frío. Luego de ésto, se procedióa la lisis celular incubandolO nin en heladera con buffer
hipotónico (BBS) (105€ tris-HCl, lOmHClHa, 3mHClQHg pH
7,5) "nl por botella. Las células fueron raspadas de lapared de las botellas de cultivos mediante varilla con pg
licïa de gomay el RBS(Sul) con las células resuspendidasihe
homogeneizado - junto con 2ml de BBSpor botella, usado pg
ra resuspender las células que pudiesen haber quedado - en
un homogeneizador tipo Dounce-vidrio-vidrio, mediante 15
golpes en baño de hielo.
El homogenadose centrifugó a 3.000 rpm durante 10 min I . .centrifuga refrigerada International -, usando para todo lo
3-6
. . i . . Ianterior material esteril (varillas con polic1a, homoge. lneizadores, tubos de centrifuga, etc.)
b) La extraccion del RNA(272) se realizo agregando SDS
al sobrenadante anterior (se empleo este método también
en otros casos) hasta una concentracion del 0,5% y BDTA
hasta lüflú, luego de lo cual se agregó igual volumende
fenol-BRL, redestilado y libre de nucleasas, saturado
previamente con buffer Tris-HCl 0,1K pH 7,# - agitando
por inversión suave durante l min seguido del agregado
de otro volumen de una mezcla de cloroformo (Cl3HC) con
alcohol iso*mïlico al 1%, agitando otro minuto de igualmanera.
Se centrifugó a 3.000 rpm durante 3nfin-luego de lo<1ml
en general los tubos debieron ser entibiados para que laT"aseinferior se volviese transparente - y con jeringa y
‘a estéril se aspiro la fase inferior-fenol-clorofórmica-descartándola y cuidando de no aspirar ni alterar la
interfase. Se agrega luego l volumen de cloroformo - 1%
alcohol amilico, agitando durante l minuto y se centrifgga 3 min a 3.000 rpm. descartando luego la fase inferior.
t - f .Se agrega otro volumen de Cl3CH- alconol isoamilico
... .._ .I .. .; Ly se repite la agloaClORy centrifugac1on, tomando esta
vez con aguja y jeringas estériles y limpias la faseacuosa superior cuidando de no arrastrar el material Egg
Se mide el volumen de la fase acuosa, se agrega AcNa
pH 5,1 hasta 0,2H y se mezcla con dos volúmenes de alco
hol absoluto (etanol), dejando precipitar el RNAa -209Cdurante toda la noche.
En los casos en que no fue eliminado previamente, el- .o .... .. .I .¡.RAapareCio en la super1101e de la solu01on alconolica
.- . . . . Icomouna masa flOTllar gelatinosa que fue eliminada fa
cilmente con una varilla de vidrio (170).
La solución alcoh6_ica fue centrifugada 20 min aIQOOO. l n — ..rpm a LQC- Centriluga :eckman d2-21, rotor JA-2O - y el
RNAen el pellet redisuelto en el buffer adecuado.
v. Dosaje de la radioactividad nrecinitable con TC
Las muestras a analizar - generalmente 0,1 ml - se se;
braron sobre filtros de fibra de vidrio (WhatmanGF/B),I ... . .- l.- . Ilos cuales habian Sido enoebloos con ac1Qo tricloroace
tico (TCA)al 10%y dejados secar al aire la noche anterior.
Luegode sembradas las muestras, los filtros fueron lavados
dos veces con nuevo TCAal 10%y una vez con etanol, deján
dolos secar durante 15 minutos bajo lámparas de 250 watts.
A continuación, los filtros se colocaron en viales plásticos(Kimble) y agregaron 10 ml de líquido de centelleo (econo
fluor-New England Nuclear). La radioactividad presente se dg
só con un contador de ccntelleo programado para el conteo de
los distintos radioisótopos (BeckmanLS-9000).
vi. Dosaje del virus SHF
.1 . _ I - .ul VlTuS SñF sc doso por conteo de las placas de 11515 pr_
ducidas por las particulas virales en diluciones adecuadas(266).
Para ésto, la infectividad de la muestra a analizar se'dgterminó en monocapas confluentes de células MA-lOHcultivadas
en placas de petri plásticas de 6 agujeros (Costar o Falcon),
e inoculadas con 0,2 ml de diluciones sucesivas l en 10 de la
muestra a titular. Luegode permitir la absorción del virus
durante l hr. a 3790, los cultivos fueron cubiertos con medio
EHÉMsuplementado con FCS al 2%y conteniendo metil-celulosa. . . .. . . lal 0,755 para aumentar su VisCOSidaoe impedir que una part;
. . I .. . .cula Viral diese mas ce una placa de lisis.
Luego de dos dias de incubación a 3790 en atmósfera ná
meda con 5%de C02, los cultivos se fijaron con formalina
-al 42-, se tiñeron con cristal violeta - al 0,1%- y secontaron las placas de lisis en las diltlciones de virus
que asi lo permitieron. Considerando el número de placas
contado, la dilución realizada y el volumende virus seg
brado, se pudo calcular las unidades formadoras de placa
por ml de muestra (PFU/ml).
. I .vii. Pur1f1cac1on del Virus SHF
El medio de cultivo - unos 33 ml por botella de 150 cm2
de superficie de cultivo - se cosechó de cultivos conflueg
tes de células EIA-10’4-cultivadas, infectadas con san?y me;
cadas radioactivamente comose describió (i, ii, iii) - de30 a #0 botellas por preparación -, eliminando los restoscelulares mediante centrifugación a 2000 g durante 15 ming
tos (centrífuga Beckman52-21 rotor Já-lh). Este sobrenadan
te - usualmente de 1 a 1,5 litros - es concentrado de 10 a
20 veces por ultrafiltración (aparato AKICONHollow Hl P100)
luego de lo cual es sembrado —de a 20ml - sobre un gradieg
(te discontinuo de sacarosa - 25%, (7ml¿ #O%(6ml) y 50% Sml)
- en tubos de nitrato de celulosa (1" x 3,5" Beckmancat.
nQ 302237) en buffer TNE(Tris-HCl 0,02 M, pH 7,8, 0,15 M
NaC1y 0,001 MEDTA). Los gradientes discontinuos con el
virus concentrado se centrifugan a 25000 rpm durante H hSe
en un rotor Beckman SW27 de cabezales vasculantes a hQC
(Centriiuga BeckmanL 8-55 o L 5-50), consechando el mate
rial que bandea en la interfase entre 25 y #05 de sacaro
sa. Este material -usualmente unos 2 ml por tubo - se di
luye en THEhasta una densidad apropiada - aproximadamen
te lzl - y se siembra sobre un gradiente continuo de saca
rosa 25-50% en THB.El virus bandea a su densidad cuando lle
ga al equilibrio, lo cual se logra cenarifugando durante 16
hrs y usando la velocidad y rotor entes mencionaddnluego
de lo cual los gradientes se fraccionan - con un fraccion;
dor ISCOModelo 6HO-registrando automáticamente la absor
vancia a 25h nn. Las fracciones correspondientes al picocn'
absorción se mezclan, presentando el virus así purificadouna infectividad usualmente en el orden de l a 5 x lO9 PFU/
... l , .Por su m“yor rendimiento se usaron celulas Efiï creeidas
en iguales condiciones que las descriptas para células
HA-lok. Cuando las monocapas de 33 botellas de 150 cm‘
fueron confluentes, se infectaron con virus sindbis yfimarcaron con 3H-uridina (37 uCi/ml) en la forma cescri d
- - . I . . .ta para SHF, salvo que la concentrac1on de actinomicina
usada fue l ug/ml.
. . I . .Al observarse un marcaoo efecto Citopatico - aprox1- . . I . . 'macamentea las 19 hs.-, el Virus se cosecho y puriflco
mediaate todos los pasos descriptos para SHF(vii); ob.' . . ... , n á. .r , , 7enienaose Virus puriiicaoo con una acuiv1oad Qe 6 i lOd'
.' . . l. cpm/ml, el cual apare01o como un pico aguoo y unico en
i . . .. .el ultimo paso ae pur1f1cac16n.
. . l .. . nix. Marcaczon Qe Virus SHF con 32r
Células F -lO# fueron crecidas en nonocapa hasta con
fluencia - unas H0 botellas de 150 cm2por preparacion
- como se ha mencionado (i), luego de lo cual fueron magtenidas durante 2k hrs en medio de cultivo libre de fos
fato - preparado con 100 ml de solución de sales balan
ceada segun Earle 10 x (Gibco cat. n9 3104055), lO al de
vitaminas 100 x (Flow cat. nQ 6-l2h D para medio basal de
Eagle), 2 ml de amino ácidos (Gibco cat. n9 320ll3OIEIí
502x sin glutamina), lO ml.L-glutaaina 200 mM(Gibco cat.
320 5030), Sul de Gentamicína (Geramycin reagent solution
Sharing Co cat. P65039)lOmg/nlgr20 ml suero fetal bovino
dializado contra medio sin fosfato, se agrega luego bica;
bonato de sodio 7,5% hasta pH 7,5, HÉOhasta un litro yo . . . Iesteriliza por f11trac1on-.
Luegode quitar el medio libre de fosfato (LP), las cé
lulas se incuban durante 2 hrs con act.D Bug/ml, se quita
ésto y se infecta con virus SHFcultivado en medio LP -a;
rededor de 3 x 106 PFU/ml- dejando absorber durante l hr.
A continuación se agrega medio LP - 30 nl - con 32P04H3JD
uCi/ml NewEngland Nuclear EEKO53), incubando, cosechag._,.. . , . .I ..do y purilicando el Virus comoya se descrlolo (111, V11).
x. Ultracentrifuaación del virión de SHE
Las muestras a analizar - en un volumen de l ml - se seg
braron sobre un gradiente lineal - ll ml - de sacarosa li
bre de nucleasas (Bethesda ResearchLab.), 5-20fl en THE-eg
terilizado por filtración - preparado mediante un formadorde gradientes (Buchler) y una bombaperistéltico de 3 cana
les (Pharmacia P-3) en tubos de poliialómero (Beckman3/16"
x 3¿-"cat. nQ 331372).
Luego de centrifugar a 30.000 rpm en un rotor SW41
(Beckman)hasta alcanzar una velocidad angular de 3,15
x lO10 rad 2/s (aproximadamente lhr) usando una cent-í
fuga programable (BeckmanL8-55), los gradientes se cglectaron pinchando el fondo del tubo plástico e inyec
tando un líquido inerte (Fluorinert) mediante un frac
cionador de gradientes (ISCO640).
Se colectaron unas 30 fracciones de 0,? ml por gra
diente siendo continuamente leida y registrada su abmm
vancia a 25% nm (ISCO UA-S Absorvance monitor). La li
nealidad de los gradientes se corroboró por medida delindice de refracción de las fracciones obtenidas (re
ffractometro Bush & Lomb) (279).
. .,.. . .I .I I. .Xi. estimac1on de la prooorc1on de a01do nucleico en el
virión de SHF
-! - - - 'OW "al Virus SHFobtenido y purificaoo como se menc1ono,
. I _ ‘ .I. . .se diluyo adecuadamente determinandose su aosorvanc1a a
280 nm y a 260 nm (espectrofotómetro Beckman DU-B). Me
diante el cociente obtenido (DO280/DO260), se obtuvo. I .. . .el percentage de acido nucleico presente a partir de va
lores tabulados previamente (277).
. . I I .x11. Obtenc1on de nucleocaD51des
El virus marcado radioactivamente y purificado comose
describió (iii, vii) - unas hO0.000cpm- se diluyó 1:3 en
THEpara disminuir la concentración de sacarosa, y se tra
tó con I‘Eonidet ITP-¡+0(Bethesda Research Lab.) al 0,5% du
rante 30 min a hQCcon agitación según 192. Luego de ésto
las muestras se diluyannl:5 en THEy se sembraron - lml
sobre gradientes - ll ml - de sacarosa 5-20fi en THEprepa
rados comose ha descripto (x), centrifugando durante 1,20
hrs (5,6 x lOlo rad2/s) a 30.000 rpm en un rotor swki, sien. . .. . . ldo los gradientes fraCCionados luego comose describio (x).
Los controles consistieron en virus obtenido y procesaI
mdo en forma simult ¡33..,l.. ..
e e identica excepto que en vez de IQmH-v. l . ,nidet HP-ho se agrego igual volumen de ira.
... . .I .I. I .x111. Digestion enzimatica de las nucleocao31des
Las nucleocápsides preparadas comose describió más arr;
ba o viriones intactos procesados comocontroles (en forma
idéntica pero sin 22-49), se diluyeron 1:5 en buffer estandard de reticulocitos (RSB)(iv) e incubaron con ribonuclea
I. . . -, -. sa pancreatica oov1na (RuAsa) (soneringer) l ug/ml a 379G
3-:-15
durante lO min de acuerdo a 193, o con desoxiribonucleasa
tipo I (DNAsa) (Worthington) 50 ug/ml durante igual tiem
po y misma temperatura comoha sido descripto (278). Luego
’del tratamiento enzimático, las muestras se analizaron porultracentrifugación en gradientes de sacarosa 5-20%en THE,
dosando la radioactividad de cada fracción comoya se men. I a oeiono (x11, v).
. .I . . . .1le. Marcac1on de Virus SEF con 35S-aminoác1oos
.l . .ILa marcacion de Virus con 358 se realizo en la forma des
cripta para la marcación con 3H-uridina (iii) excepto quese usó 35S-metionina (NewEngland Nuclear NBG-OO9T)5uCi/ml.
xv. Determinación de la densidad ge la nucleocáoside
La densidad de nucleocápsides de Virus SHF- marcado con
3H-uridina y purificado - preparadas comose ha descripto
(xii), se determinó por ultracentrifugación en el equilibrio
en gradientes isopicnicos de CsCl (280), analizando en gra
dientes idénticos y simultáneos nucleocápsides de sindbis y
viriones intactos de sindbis y SHFcomocontroles.
l . ILa muestra - unas 140.000 cpm - se mezclo con una soluc1on
de CsCl (Bethesda Research Lab) ajustando la densidad de
partida en 1,43 g/hl con THB,luego de lo cual se proce
O; ió a formar los gradientes por ultracentrifugación a
hC.OOOrpm en un rotor SW50.1 (Beckman) durante #8 hs;.i . .. l
habiendose probado preV1amente que era un tiempo mas que
suficiente para alcanzar el equilibrio.
Los gradientes fueron fraccionados (x), estimándose 1a
radioactividad precipitable con TCAal 10%(v) y 1a dans;
dad en cada fracción refractonétricamente, usando 1a ecug
cion de Hearst y Vinograd (280, 279).
.r._,. .I .0. .,.xv1. nrtracc1on enzimatica de Ru
Se obtuvo 3H o 32P-RNA- de SHF o sindbis - mediante
gestión exhaustiva de viriones purificados (vii) con pro
teinasa K (Boheringer) a una concentración de 0,2 mg/mlen
10 13MTris-HCl, 1+5¡nl-í NaCl, L:,_5 mi»:Na Citrato, 1 ¡nl-íEDTA
pH 7,h con 1% de SDS, - volumen de incubación 0,5 ml - du
rante 2 hrs a 379G de acuerdo a 281.
. . .I , . .Luego qe la incuba01on, el RNAse aisló por ultracenmr;fl 0' o l a-llugaCion en gradientes neutros de sacarosa p-20% —como se
... I . .. . .descrloira seguidamente (xv11) - o se extraJo rápidamente
12-17
con fenol-SDS-cloroformo realizando sólo un paso de exuag.0 . . .i I .Clon con tiempos de agitaCion de solo 30 seg como se oes
cribe en la primera parte de la técnica iv.b.
Al RNAse le agregó luego NaAcpH 5,1 hasta una concen
tración 0,2H y tRNA(Sigma tipo XI) cuando la baja concen
tración presente de RNAviral requería de RNAauxiliar (ca
rrier) para asegurar su precipitación —20 ug para 0,5 m1
de muestra -, precipitándolo con 2 volumenes de etanol ab
soluto 16 hrs a -2OQC,usualmente en tubos cónicos de pol;
propileno con tapa (Eppendorf) de 1,5 ml de capacidad.
. .l .El RNAse recuperó en el pellet por centrifugac1on 20nun
a 15 ooo ' L 's a r * su h '_ . g en una microcenoriluga (¿ppenuorf , l ), lavandg.I . .lo 2 veces por resuspen51on en etanol al 95%y centrifuga
.l . . .Clon, Siendo el alcohol luego eliminado en un evaporador r2
tativo (Savant) y el RNAdisuelto en el buffer adecuado.
zvii. Ultracentrifuaación del RNAdel virus SHF
32P-RïA de sar y 35-333 de sindbis (unas 250.000 CpmdeL 1.. .. ..r .I.. .c/u) expraioos por oigestion enzimatica (xv1) se mezclaron
n 0,25 ml - y diluyeron a 2 m1con buffer TIÏE estéril,I - . _,_ .sembrandolos luego sobre un graoienue lineal (de lO ml) de
sacarosa libre de nucleasas (Bethesda Research Lab.), 5.‘I a. I .20%en buifer TJE esteril.
En otro gradiente idéntico se sembró igual volumen de
3H-rRHA18 S y 28 S preparados a partir de células Hela
según el método de Summer (286) (obtenido de Bethesda Rg
search Lab.)
Luego de centrifugar durante 2,5 hrs a 40.000 rpm en un
rotor SW#1 (Beckman), los gradientes se colectaron enira;
ciones de 0,# ml y parte de las mismasfueron precipitaïs
con TCAal 10%comoya se describió (v), analizando la ra
dioactividad correspondiente a cada isótopo en un contador
de centelleo multicanal (BeckmanLS-9000).
xviii. Ultracentrifugación del RNAde SHFa distintas fue:.I .zas lOl'llCüS
35-3“ extraido (xvi) de virus SHFpurificado (vii)-200.0CD
cpmen l ml - se analizó por ultra centrifugación en grafieg
:es lineales de sacarosa 5-20fl disuelta en lmKEDTA,1 mN
Tris-HCl pH 7,k —baja fuerza iónica - o en lmH BDTA, ¿JI
ris-HCl pH 7,1'r con 0,1 I-IHaCl - alta fuerza iónica - (288)
a la velocidad y tiempo mencionados previamente (xvii), ana
lizando en gradiente idénticos al de alta fuerza iónica y. - I . . -Simuitaneos; 3H-rRNA16 S y 23 S de E.c01; (Miles) y 3n
sindbis comoestándares.
Los gradientes fueron luego colectados en fraccionesde
0,? m1, de las cuales 0,1 m1 se precipitó con TCA10% con
tando la radioactividad presente (v), a 1a vez que las ira;
ciones provenientes del gradiente de REASHFen alta fuer
za iónica se dividieron en 2 alícuotas de 0,1 ml c/u agre
gándoles a ambas 50 ul de buffer RSE con o sin 30 ug/ml de
ribonucleasa pancreática (Boheringer) respectivamente, lug
go de lo cual los 2 grupos de fracciones se incubaron 30
min a 379G, precipitando la radioactividad en forma macromg
lecular con TCA(v).
xix. Densidad del RNAdel virus SHF
, . .e - - . . _, A.ILa determ_nac10nde ia densidaadeleAkse realizo por fl_.I . l . -_ .1.
tac10n isopicnica en gradpntes de 052804 de acuerdo a erikson (290).
Para ésto, l m1 de 32P —RNAde SHF - unas 35.000 cpm - y
3H-RHAde sindbis - ho.ooo cpm - preparados por digestión
con proteinasa K (xvi) de viriones purificados (vii) se me;
claron con l ml de agua bidestilada estéril y 3 ml de solu
ción saturada de CSZSOM(Swarz Mann) en THBestéril, sien
do el indice de refracción de la mezcla 1,3860. Esta mezcla
fue centrifugada a 40.000 rpm en un rotor SW50 (Beckman) a
2090 durante 72 hs, siendo este tiempo mas que suficiente
para alcanzar el equilibrio (290).
Luego de colectar los gradientes en 22 fracciones igua
les de 0,2 ml c/u, se estimó inmediatamente en ellas la.den
sidad por refractometria (reíractómetro Bush y Lamb), usa;
do la ecuación (279) que relaciona densidad e indice de re
fracción para soluciones de Cs280n (290).
. .J - —xx. CODDOSlClon del RNA de SnF
Se empleó RNAmarcado con 32P obtenido de virus SHF pur;
ficado (vii) mediante digestión con proteinasa K y extraccion ¿enol clorofórmica seguida de precipitación etanólicacomoya se ha descripto (xvi). El pellet obtenido por centr;
fugación conteniendo el 32P-RIA,se disolvió en buffer de
íaAc ho mu pH 5,4 y fue procesado de dos formas distintas:
a) En una serie de exp rimentos se incubaron 20 ul de lo a;
terior - entre 20.000 y 50.000 cpm- con 0,5 unidades into;
nacionales (U.I.) de ribonucleasa T2 (E.C.3.1.M.23) proveniente de Aspergillus oryzae (Sigma) durante l hr a 3790,
luego de lo cual se agregaron 0,5 U. I; adicionales in. lcubando durante 20 nrs. mas.
La enzima se elimino por precipitación con 2 Volúmenes
de alcohol absoluto y los nucleotidos 3' monofosfato presea
tes en el sobrenadante se evaporaron a sequedad con un eva
porador rotativo (Savant), siendo luego redisueltos en lOul de agua destilada y analizados electroforética o croma. I . . ' tograficamente comose describe mas adelante.
b) En otros eXperimentos la enzima usada fue nucleasa P1(E.C.3.30.l) (Boheringer) en una concentración de 120 U.I.
/m1 incubando a 379Gdurante 2,5 hrs, seguido de precipita
cion etanólica y concentración de los nucleotidos 5' mono
fosfato en el sobrenadante en forma análoga a como se men. I I .c10no mas arriba.
A continuación, los nucleótidos producidos segun a) o b)
fueron sembrados en papel de filtro (Whatman 3 MM,Sho) de
23 X 57 cmy sometida a electroforesis de alto voltaje usa;
do como buffer 5%AcHen agua llevado a pH 3,5 con piridina
(291, 327) durante l hr a 2.000 volts y 60 m Amperes, tiempo
. ‘. l... .en que los colorantes naranJa Gy fucs1na ac1da p semorg
dos paralelamente - migraron 21 cm y 8 cm respectivamente.
Los nucleótidaspreparados por digestión enzimática tag
bién fueron analizados por cromatografía de intercambio
iónico en capa delgada de polietileneimino-celulosa (PEI
celulosa) (Brinkman, Polygram 300 de MOx 20 cm con capa
de 0,1 mmde espesor) según 292, usando LiCl 1M como so;
vente en'cubas de vidrio saturadas con humedady desarroé
llando la cromatografía hasta un ascenso del frente de unos30 cm (unas 5 hrs.)
Tanto en las electroforesis comoen las cromatografias
fueron sembradas 0,5 unidades de absorvancia a 260 nm delos distintos nucleótidos monofosfato (P.L. Biochemicals)
comoestándares - 3' o 5' según la enzima usada -, deteci q . . . . .tandolos luego del análisis mediante luz ultrav1oleta.
Los nucleótidos de la muestra —marcados con 32P - se
localizaron por autorradiografia sobre pelicula radiogréfica (Kodakzx-Omat),con pantallas intensificadoras (Ko
dak Lanex Regular Screens)(293) e identificaron por com“ . I l . L .parac1on con los estandares, mientras que el porcentaJe
de cada uno fue determinado luego de recortar del papel o. . . . . 'celuloide la manchacorrespondiente y contar la radiacion
presente por centelleo liquido (con .Econofluor, New En
gland Nuclear).
xxi. Electroforesis del RNAdel virus SHFen geleg ge agarosa con formaldehído
‘31 RNAmarcado con 32? o 3H proveniente de virus SHFpg
rificado (vii), se extrajo enzimáticamente(xvi), se prec;pitó con etanol y desecó como se ha descripto (xvi). El RNA
en el pellet se disolvió en 5 ul de agua destilada estéril
y se desnaturalizó 5 min a 609Gen buffer de desnaturalizg
ción - compuesto de 0,5 ml de formamida (Katheson, ColemanBell) desionizada mediante resina mixta de intercambio
d
C (Merck) y 0,1 ml de buffer de ¿m' ' "b irtroforeSis lO voces mas concentrado. (3.a. lO¿)-.
A fin de determinar el peso molecular del RNAde SHF,
además de la muestra (30 ul) se analizaron 3H-RNAde sind
bis (PH h,67 x 106-, rRHA18 s y 288 de timo de ternera(PM
0,68 x 106 y 1,75 x 106) (Bethesda Research Lab), rRNA16 s
y 23 s de E. coli (PM 0,5% x 106 y 1,07 x 106) (Boherin
ger) y tRNA de la levadura de Brewer (PH 0,03 x 106(Bohg
ringer) como estándares (287, 295) de tamaño conocido.
La electroforesis se desarrolló sobre un gel submari
no, horizontal y plano - de 25 x 20 x 0,5 cm - de agaro
sa (Sea Kem) al 1%en buffer de electroforesis - B.E. 1X:
20 mMácido, 3-(N-morfolino) propanesulfónico (MOPS)(Sig
ma cat n9 M 1251+), 5 121MNaAc, 1 mm EDTA pH 7 - con 2,2 M
de formaldehído (Merck) y l ug/ml de Bromuro de ethidio
(Sigma), a una tensión de 50 voltios durante 16 hs, tiem
po en que el azul de bromofenol (Bio Bad) y el cianol de
xileno (Bio Rad) sembrados - al 0,05% - como colorantes
marcadores nigraron 21,5 cm y 7 cm respectivamente (cuba
Bethesda Research Lab modelo H-l y fuente eléctrica LKB
modelo 2103).
Luegode la electroforesis, la posición de los estándgres sin marcar se determinó fotografiando la fluorescencia
del bromuro de ethidio (Sigma) con un equipo polaroid (Fo
todyne Modelo 3-3000) mientras que los RïAs radioactivos
se detectaron por autorradiografïa, comose describe seg idemente.
xxii. Qetección de RNAen ggle; de Agarosa_oor autorradio
grafía
a) Para detectar por autorradiografía 1a radiación B débil
-producida por 3H, 1MCo 358 - proveniente de análisis eng;
troforéticos (293), los geles de agarosa se embebieron du
rante 30 min en alcohol absoluto (en un volumen 10 veces mg
yor que el del gel) repitiendo 2 veces más con nuevo etanol
esta inmersión de 30 min para asegurar la eliminación total
de agua. Luego, el gel se embebe en una solución de PPO (2,5
-difeniloxazole, NewEngland Nuclear) al 3% en etanol duran
te 3 hrs, recordando que comolos ácidos nucleicos no difug
den en etanol cualquiera de estas etapas puede prolongarse
de ser necesario. Finalmente, el gel se sumerge en agua du
rante 1 hr para eliminar el etanol y precipitar "in situ" elPPO, luego de lo cual el gel se coloca sobre papel secante y
deshidrata al vacío (secador de geles chatos Bio Rad modelo
22H), exponiéndolo a -7OQCa pelicula radiográfica (Kodak
X-Omat) .
b) Cuando el RNAanalizado estaba marcado con 32P - emisor
[3 fuerte - el gel - tanto de agarosa comode poliacrilamida - en general desecado sobre papel secante - aunque en
ciertos casos también "en fresco" -, se expuso directameg
te a película radiográfica (KodakX-Omat)a -709C entrecbs
pantallas intensificadoras (KodakLanexRegular Screens)
(293).
xxiii. Cromatografía ge afinigag a columnascon oligo dTcelulosa
Las columnas usadas consistieron en trozos cilïdricos
de pipetas plásticas (Falcon) de l ml - Holmmde largo por
2,5 mmde diámetro - con un soporte de lecho de malla de
nylon sujetado en el extremo inferior por un tip de 0,2 ml(Gilson).
El lecho cromatográfico consistió o bien en 30 mg de cg
lulosa (Blank céflulose, Collaborative Research cat n92000#)
o sino en 30 mg de oligo dT-celulosa (Collaborative Research
cat n9 20003), la cual presenta unidos fragmentos de oligo
desoxitimidina de 14 a 16 nucleótidos de longitud.
Luego de armadas, las columnas se lavaron con l ml de bu
ffer de elución —10 mMTris-HCl, pH 7,5, 0,05% de sos y 1
mMEDTA- y equilibraron con l ml de buffer de unión - 10
mMTris-HCl, pH 7,5, 0,5% sos, lmM EDTAy 0,5 M NaCl -, prg
cediendo luego a sembrar la muestra diluída - 1:2 —en bg
ffer de unión y a 37°C de temperatura. Luego de la etapa
de siembra (S) se lava con buffer de unión (etapa W) has
ta ausencia de radioactividad eluída - unos 2 ml - proce
diendo a despegar el RNAunido con buffer de elución (E)
hasta elución completa de la radioactividad presente -unos
2,5 ml -, siendo este procedimiento adaptado de Pedersen yHaseltine (281).
Durante el transcurso de toda la cromatografía se coleg
tan fracciones de 0,5 ml - a un flujo de 2,25 ml/hr - don
de se detecta la radioactividad total presente mediante elagregado de liquido de centelleo (Biofluor, NewEngland N2clear).
xxiv. Hibridización de RNAde sm? a poli uridina y poli ¿:1tidina
Las muestras con 32P-RNAproveniente de virus SHFpurif;
cado (ix, vii, xvi) se precipitaron con etanol (xvi) resus
pendiéndolo en buffer TLE (SOmMTris-HCl, lOOmMLiCi, lmM
EDTA, 0,1% SDS, pH 7,5), e incubando - unas 50.000 cpm - con
50 ug de poli uridina o poli citidina (Collaborative Research
CHLn9 15005 y 15002) (202) en tubos de polipropileno con tapa
(Eppendorf) durante 9 min a SOQCy luego 30 min a 37QC(297)
en un volumen de l ml.
Luegode la hibridización, las muestras se diluyeron 1:2
con buffer de unión y fueron cromatografiadas por columnas
de oligo dT-celulosa comose ha descripto (xxiii).
xxv. Marcacion de RNAde virus SHF con 3H-adenina
Cultivos confluentes de células MA-lok(i) se pretrata
ron durante 2 hrs con 5 ug/ml de actinomicina D y se infeg
varon con virus SHFcomoya se describió (iii.b, ix).
Luego de un período de absorción de l hr a 3790, se agrg
gó a los cultivos —35 botellas de 150 cm2 - 30 ml de medio
con 3o uCi/ml de [2,8 3K] -adenina (NewEngland NucleaI,NET063), cosechando y purificando el virus comose ha descrip
to previamente en métodos (iii.b, vii).
xxvi. Aislamiento enzimático de la secuencia boli A
a) RNAde virus SHF-marcado con 3H-adenina (xxv), purificado
(Vii), extraído con proteina K-SDSy precipitado con etanol
(xvi) fue disuelto - de 1 a 3 millones de cpm - en Tris-HCl
50GB, pH 7,5 y digerido con 10 ug/ml de ribonucleasa pan
creética A (RNAsaA E.C.2.7.7.16) (Boheringer cat anQflBQ
y ribonucleasa T1 (RNAsaT1 E.C.2.7.7.26) (Bethesda_Resemrh
Lab cat 8030 SA) 50 U.I./ml, en un volumen de 180 ul duran
te 30 min a 3790 de acuerdo a 202, deteniendo la incubación
con 1,8 m1 del buffer de union usado en xxiii - posee 0,5%de SDS -.
b) Para el aislamiento del fragmento de poli A, el RNAde
SHF- 1 milion de cpm - marcado con 3H-adenina (xxv) prove
niente de virus purificado (vii) se digirió con RHAsasA +
T1 comomencionamos(xxvi.a.), pero deteniendo la reacción
con 0,6 m1 de buffer de unión, Se diluyó a 2 ml con THBy
sembró sobre un gradiente lineal de sacarosa 5-205 en TSE,
centrifugando a h0.000 rpm - 195.700 g - en un rotor SW41,
(Beckman) durante 22 hrs. a SQC.
-.. .._I . .En gracientes paralelos e ieenticos se analizaron l mg
de RNA5 S y de tRNA (ambos Boheringer).
Luego de colectar los gradientes monitoreando la abso;
vancia a 254 nm, se midió la radioactividad precipitable
con TCA109 (v) en aquellos que contenían nuestras con ra. . íd10150t0p0¡
xxvii. Electroforegis en geles no acuosogde Doliacrilamida
Los fragmentos de poli A provenientes de RNAmarcado
con 3H-adenina, digerido con RNAsasA + T1 (xxvi) y erp
matografiado a oligo dT-celulosa - 1 ml con 5000 a 13000
cpm- se precipitó con etanol (xvi), redisolvíéndolo en"
25 ul de formamida (Matheson Coleman) deeionizada en el
día - por agitación durante 1 hr con resina mixta de ig
tercambio iónico (Bio RADAG 501-x8) al 5% —, se agregan
luego 5 ul de azul de bromofenol al 0,5% y 5 ul de cia
nol de xileno (ambos Bio RAD)y se hierve a lOOQCduran
te 2 minutos, sembrando las muestras en un gel chato ver
tical (sistema Bio RADmodelo 220) de 100 x lMOx 1,5mm,
preparado con acrilamida al 7%- acrilamida 4,48 g, BIS
-acrilamida 0,79 g (ambas Bio RAD), NaQHPOu-7H200,32g,
NaHQPOu 0,0% g'persulfato de amonio 0,10 g (Bio RAD) d;
sueltos.en 74 m1 de formamida desionizada, y polimerizg
do con 150 ul de TEMED(Bio RAD)-.
La electroforesis transcurre durante 3 hrs a 20 mAmpg
re - usando buffer 0,016 M de NagHPOu, 0,00% M de NaH2P0h
comobuffer de corrida - hasta que el azul de bromofenol
llega a 2 mmdel fondo del gel, luego de lo cual los RNA
sin marcar - tRNAy RNAS S (Boheringer), tRNA tipo XI
(Sigma)y'rRNA 16 S (Boheringer) con 85,120,63 y 15%1nu
cleótidos respectivamente usados comoestándares, se v;sualizan por fluorescencia a la luz ultravioleta (embee
biendo los geles en bromuro de etidio (Sigma) 10 ug/ml
en agua durante 15 min) o por tinción con azul de meti
leno - embebiendo el gel 15 min en AcHlN, y 1 hr en.azul
de metileno (Sigma) al 0,05% en buffer AcH-AcNa6,04 M
pH h,7 y lavando luego con agua -, mientras que las mues
tras radioactivas se ubicaipor autorradiografia comodetallamos a continuación.
xxviii. Detección autorragiggráfica Qe 3H en geles de Doliacrilamida
Para 1a detección de radiación.p.débil en geles de poliacrilamida se usó la técnica descripta por Laskey (293),embebiendo el gel con unos 20 volúmenes de dimetilsulfó
xido (DMS)(Sigma) durante 30 min,seguida por una segunda
inmersión otros 30 min. Luego de ésto, se equilibra el gel
durante 3 hrs en 1+volúmenes de PPO (2,5-difeniloxazole
NewEngland Nuclear) al 22% en DMS, seguido de 1 hr enegua
con posterior desecado al vacío (desecador Bio RADmodelo
H-32
22h).
Los geles impregnados en PPO y desecados sobre papel
secante se expusieron a -7OQCsobre película radiográf;
ca (Kodak X-Omat).
xxix. Electroforesis en geles de poliacrilgmiga con urea
ZM
A fin de realizar la recuperación posterior del RNAme
diante extraccion en medio acuoso, se utilizó el sistemade gel de poliacrilamida al 12%con urea 7 Mcomo lo de;
críben Maniatis y Efstratiadis (29h) - 8,5g de acrilami
da, 0,3 g Bis-acrilamida (Bio Bad), 31,5 g de urea (Betheg
da Research Lab), 7,5 ml de buffer TBE(Tris HCl 50mM,ac;
do bórico 30mM, EDTAlmMpH 8,k) concentrado lO veces, 0,5
m1 de persulfato de amonio al 10%y cantidad de agua dest;
lada estéril suficiente para 75 ml, gelificando luego dedesgasear la solución anterior con 25 ul de TEHED(Bio Bad).
Las muestras precipitadas con etanol (xvi) y redisueltas
en 25 ul de formamida desionizada, son desnaturalizadas a 100Q
C durante 2 min comoya se explicó (xxvii), sembrándolas en ggles de las mismas dimensiones.
La electroforesis se realiza a 20 m Amperepor gel du
rante 1 hr ho min - tiempo en que el azul de bromofenol
llega a 2 mmdel fondo del gel -, usando TBE1x como bu
ffer de corrida.
Los RNAno radioactivos y los marcados se detectan reg
pectivamente comoya se describió (xxvii) (xxii.b.)
xxx.- Recuperación del RNAde geles gg Doliacrilamida
E1 32P-RNAanalizado por electroforesis en gel de pdhg
crilamida al 12%con 7Mde urea (xxix), fue ubicado por
autorradiografia directa del gel en fresco (xxii.b) rece;tando con bisturí la zona - 18 x 18 mm- correspondiente
a la mancha radiográfica - unas 270 cpmmedidas por radigción CerenkoV-.
El trozo de gel se coloca dentro de un tip plástico de
1 ml preparado convenientemente de acuerdo a 307 - a un
tip estéril de pipeta automática (Gilson de l ml) se le nltroduce un bollito de lana de vidrio apretándolo suavemen
te contra el extremo agudo, luego se siliconiza con l mlde silicona acuosoluble (Silicad 12100) y se lava 2 veces
con 1 m1de agua destilada estéril-,seguido de incubación
a 56°C durante 2 hrs, luego de lo cual se cierra el tip ala llama.
El gel dentro del tip se rompe en trozitos con una pin
cita de cirugía estéril, en presencia de 0,6 ml de buffer
GEB - 0,5 M NHLAC, 0,1% SDS - y 20 ug de tRNA (Sigma tipo
XI, como carrier), incubando toda 1a noche a 3790. Se co;
ta el extremo del tip - que había sido cerrado a 1a llama
y se lo coloca dentro de un tubo de Kahn(estéril) centri
fugando 10 min a 2000 rpm, seguido de un nuevo lavado con
0,2 m1 de GEB, quedando el gel retenido en el tip por
1a iana de vidrio y —en el GEBeluido un 75% de la ra
dioactividad sembrada (unos 205 cpmmedida por radiación
Cerenkov con la mitad de eficiencia que las mediciones por
centelleo líquido).
El eluído se concentra a O,h ml en un evaporador rota
torio (Savant); se le agregan ho ul de NaAc2MpH 5,1 y
se precipita el RNAcon 2 volúmenes de etanol a -7OQCdu
rante 30 min en un tubo de propileno de 1,5 ml (Eppendorf),
mediante centrifugación 20 min a 15000 g en una microcen
trífuga (Eppendorf modelo Sklh).
K-35
xxxi. Composición del fragmento resistente a RNAsagA + .
El del RNAde SHF
El 32P-polinucleótido proveniente de la técnica anterior
se redisolvió en 7,5 ul de NaAcho mMpH 5,H y se digirió
con 1,5 U.I. - en 2,5 ul - de nucleasa P1 (E.C. 3.1.30.l)(Boheringer cat n9 236 225, 300 U.I./mg) a 379G durante 21hrs.
En forma idéntica y paralela se incubaron con nucleasa P1
20 ug - en lO ul - de los siguientes 5'-mononúcleótidos: ANP,
UMP, CMPy GM'P(P-L Biochemicals).
Luegode la digestión exhaustiva, la muestra - unas lhO
cpmcarenkov - y los estándares se cromatografian en placas
delgadas de PEI-celulosa (Brinkman, Polygram 300 de 20 cm
x H0 vcnl ) con l M de LiCl como solvente en la-forma
que ya se describió (xx). Luego de que el solvente ascendió
27,5 cm - unas 6 hrs - se ubicaron los estándares con luz
ultravioleta y los nucleótidos presentes en la muestra porautorradiografía directa (xxii.b, xx).
xxxii. Aislamiento del CAPdel RNAdel virus SHF
A partir de virus SHFmarcado con 32P04H3(ix) y parir;
M-36
cado o ya hemos descripto (vii), se obtuvo RNAmediag
te dig-ttión con proteinasa K y SDS(xvi) y posterior bag
deo por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa
(xvii), donde sedimento comoun pico fino y único de radig
actividad con el Valor de coeficiente_de sedimentaciánesperado.
Las fracciones del gradiente correspondientesal picorg
dioactivo fueron unidas y el RNAprecipitado con etanol a
-209C toda una noche (xvi), luego de lo cual el pellet se
redisolvió en 800 ul de THEy reprecipitó con etianCLl
a -709C durante 20 min, volviendo a ser redisuelto y re
precipitado una tercera vez hasta que en ésta, la radioactividad remanente en el sobrenadante etanólico fue despreciable.
El pellet - unas k80.000 cpmequivalente a casi toda
la radioactividad de partida - fue disuelto en 200 ul de
íaAc ho mMpH 5,h y digerido con 2h U.I. de nucleasa P1
(3.o. 3.1.3o.1) (Boheringer cat 236 225, 300 UI.mg), du
rante 2,5 hrs a 379G. Luego de esta digestión se elevó
el pH con 20 ul de buffer Tris 2MpH8 y se incubó duran
te toda una noche a 37°Ccon fosfatasa alcalina bacterial
(3.o. 3.13.1) (Sigmatipo III-R de E.coli).
M-37
. . . . ILas en21masse eliminaron por extracelon fenol-cloro
fdrmica (iv.b) sin precipitar 1a fase acuosa, la que encambio fue dividida en dos.
La mitad de la muestra - 110 ul - se incubó con piro
fosfatasa 9 a una concentración de lO UI/ml - provenien
te de veneno de Crotalus atrox (E.C. 3.6.1.9) (Sigma ti
po III cat no P-9138) durante 3 hrs a 37°C, luego de lo
cual ambaspartes de la muestra fueron precipitadas sep;
radamente con etanol y los sobrenadantes - unos 400 ul
se evaporaron a sequedad (en un evaporador rotativo Savent).
El residuo de cadasmbrenahnteeunas 135.000 cpm - se re
disolvió en etanol al 50%en agua - unos 100 ul -, sem
brando ambas muestras por duplicado en papel de DEAE-ce
lulosa (WhatmanDE 81 de #5 cm de largo). Simultáneamen
te se sembraron 0,5 unidades de absorvancia a 260 de es
tándares correspondiente;a posibles CAPSobtenidos de P-L.
Biochemicals: In7Gppme , m7GpppUm, m7GpppCm, m7GpppAm,
m7Gppp N91Am , m7GpppA y m7Gp.
A continuación, el papel de DEAEcon las muestras se
sometió a electroforesis de alto voltaje (en un equipo S_
vant con cuba refrigerada por versene) a pH 3,5 de acuer
do a la técnica descripta por Sanger (317, 327) durante
2,5 hrs a 2000 Volts y 60 mAmperes.
I . aLos estandares se detectaron con luz ultrav1oleta mieg
tras las muestras radioactivas se ubicaron por autorrafig
grafía directa (xxii.b, xx).
xxxiii. Marcación de virus SHFcon metil-metionina
Cultivos de células DIA-101+(i) se trataron durante 2 hrs
con actinomicina D 5 ug/ml, luego de lo cual fueron infecta
das con virus SHFcomose ha descripto (métodos ii, iii).
Luego del periodo de absorción se agregaron 20 ml por bg
tella de 150 cm2 del medio de cultivo suplementado con 2%
de suero fetal bovino dializado, conteniendo adenosina 10"5
My guanosina lO'EM (ambas Sigma) y 50 uCi/ml de L-(Metil
3H)-metionina (NewEngland Nuclear cat nQ NET061 H, de 15
Ci/mmol), de acuerdo a Dubin (315).
o I . . . .xxx1v. ¿na1;s1s cromatográfico ge bases metilagag
Las muestras con nucleósidos - unas 20.000 cpm- prove
nienies de hidrólisis de RNApor nucleasa P1 y defosforilación por fosfatasa alcalina bacterial en las condiciones
que ya describimos (xxxii), se extrajeron con fenol-cloro
formoy precipitaron con etanol (iv.b, xvi), evaporando el
sobrenadante - 0,6 ml - y redisolviendo la mezcla en 100
ul de agua destilada estéril. A continuación, la muestra
por duplicado - unas 7.500 cpmc/u - y paralelamente están
dares - 10 ug de c/u - obtenidos de P-L Biochemicals (ade
nosina, guanosina, uridina, citidina, Nómetiladenosina ,5-metilcitidina, N7—metilguanosina), se siembran sobre un
papel (Whatman 3MM)de 40 x 15 cm y cromatografian en fo;
ma ascendente usando una mezcla de 2-propanol y sulfato de
amonio al 1% en agua en una proporción de 2 a l según 328.
La ubicación de los estándares - determinada con luz ul
travioleta - coincidió con la esperada a partir de las relgciones de frente dadas en la bibliografia (328), mientras
que para la detección de las especies radioactivas, el papel se impregnó en un centelleador adecuado (EnHance, New
England Nuclear HEF970) y se expuso a pelicula autorradig
gráfica (Kodak X-Omat) a -7OQCdurante periodos de 7 a M5fdias.
. .I. . .Ixxxv. Estudios eineticos ge 1ncornorac1on ge tgazagozeg
radioactivos.
Las células MA-lohusadas fueron cultivadas, infecta
das con l PFU de virus SHFpor célula en 0,2mlracon 0,2
ml de medio-controles- y marcadas con 30 uCi/ml de 3H1g
ridina en presencia de actinomicina D S ug/ml comoya se
describió (métodos i), excepto que todo el proceso se reg
lizó en placas plásticas de cultivo de 6 agujeros de 3,5
cm de diámetro cada uno (Costar o Corning) pero respetan
do las proporciones de volúmenesy superficie estableci
das para los cultivos en botellas de 150 cm2.
A los tiempos post infección (PI) preestablecidos se
quitó el medio de cultivo, se lavo la monocapacelularcon 5 m1 de PBS a MQCcuidadosamente para no levantar las
células y se incubó lO min a 37°C con tripsina al 0,05%
(Hemcat nQ 18-104), tiempo suficiente para observar al
microscopio que todas las células se habían desprendido
de la superficie plástica.
Las células se resuspendieron cuantitativamente en bg
ffer hipotónico RSB- 0,4 ml -, congelándolas a -7OQCha;
ta que se contó con las muestras correspondientes a todo
::—l+1
el intervalo de tiempos en estudio.
Se estimó la uridina radioactiva incorporada en espe
cies macromoleculares por precipitación de 50 ul del li
sado celular con TCAa1 10% (v), mientras que el RNAen
el remanente - 350 ul —se extrajo con fenol-cloroformo
SDSen.la.fimma usual (iv.b), estimando la radioactividad
TCAprecipitable antes y después de precipitarlo con etan01.
xxxvi. Extracgion enzimática del RNAcelula;
Para los análisis del RNApor ultracentrifugacion o
electroforesis en los capítulos V y VI, el sobrenadantecitoplásmico del lisado celular (iv.a) fue incubado con
DNAsaTipo I (Worthington) 5 ug/ml a 3790 durante 30 min
en presencia de SDS 0,5% y EDTAl mM, seguido de proteó
lisis exhaustiva con proteinasa K (Boheringer) a una con
centración de 500 ug/ml durante 2 hrs a 379G, de acuerdo
al método descripto por Goshy col. (278); lo que permi;
tió extraer el RHA.presenbeen las células mediante el
método del fenol-cloroformo (iv.b) con un minimo de rup
tura, luego de lo cual el RNAse llevó a pH 5,1 con NaAc
y precipitó con 2 volúmenes de etanol a -2OQC, como ya
K-k2
se explicó (iv.b, xvi).
qxxxvii. Tratamiento del RNAcelular con RHAgay DNAsg
E1 3H-RNAobtenido a las 18 hrs PI de células infec
tadas en la formadescripta (iii, iv.a,b), de disolvió-unas 200.000 cpmen 205 ul de agua destilada estéril,
siendo desnaturalizado a 609Gdurante 5 min y luego en
friado a OQCde acuerdo a 208. Este material se fraccig
nó en 20 alícuotas - de 10 ul con 10.000 cpmc/u -, agrg
gándosele 80 ul de buffer RSBy 10 ul de una dilución de
enzima RNAsa A (Boheringer) o DNAsatipo I (WorthingtonL
para luego ser incubado a 379G durante 10 min, seguido de
la estimación de 1a radioactividad TCAprecipitable (v.)remanente.
xxxviii. Digestión del RNAcon nucleasa sl
Las hebras simples del 3H-RNApresente en células in
fectadas con virus SHF(iii, iv.a,b o xxxv.) y sin infeg
tar, fueron digeridas con nucleasa Sl (Bethesda Research
Lab., cat, nQ 8001 SA/SB) a una concentración de 700 UI/
m1 en buffer 3o mMNaAc, 5o mMNaCl, lmM ZnSOh, 5% glice
N-h3
rol pH h,6 (Buffer Sl), durante 15 min a 37°C de acuerdo
a las instrucciones del fabricante y en concordancia con336.
xxxix. Tratamiegtg del RNAcon LiCl ¿M
El 3H-precipitado con etanol, proveniente de células
infectadas o no con virus SHF(iii, iva,b, xxxv) fue rg
disuelto en 100 ul de TNE,luego de lo cual se le agrg
go igual volumen de LiCl HMincubándolo a -209C durante
#8 hrs de acuerdo 333. A continuacion, el RNAde hebra
única se precipitó por centrifugación a 15000 g durante
15 min. en una microcentrífuga (Eppendorf SHlk), separando el sobrenadante.
En los experimentoscinéticos el pellet fue disueltoen TNEy la radioactividad fue eStimada en éste y en el
material soluble)pI‘TCA al 10%como ya se mencionó (v);mientras que en los análisis electroforéticos, tanto elprecipitado del tratamiento con LiCl (P) comoel sobreng
dante (S) - que fue precipitado con etanol (iv.b) - fueron redisueltos en el buffer de desnaturalización adecuado.
2:44;
. I . I . . .xl. Cinetica de incorporacion ge aminoácidos radicactivosen células infectadas con virus SHF
Estos estudios se realizaron con células MA-lokcultiva
das en placas plásticas de 6 agujeros, que fueron o no in
fectadas con l PFU/célula de virus SHFy marcadas en pre
sencia de actinomicina D-S ug/ml - en forma igual a la de;
cripta en métodos xxxv, excepto que aquí el trazador radigactivo usado fue una mezcla de aminoácidos tritiados (New
England Nuclear, cat n9 NET-250) en una concentración de #
uCi/ml.
xli. Preparación de polirribosqgag
I . l l . .La tecnica usada se basó en el metodo cla31co descripto
por Penman (341), ajustando las condiciones según (53).
Para ésto, las células MA-lohcultivadas en botellas de
150 cm2 en la forma habitual (i) se infectaron con lPFU/cé
lula de virus SHF, se incubó durante l hr agregandose luego act.D -5 ug/ml - y 3H-uridina comoya describimos (iii.a).
A las 17 hrs 20min post infección se agregó al medio de cu;
tivo cicloheximida (Boheringer cat nQ 103675) hasta una CQB
centración final de H ug/ml, con el objeto de prevenir la
1-2-45
. . i .disgregac1on de los polirrlbosomasa
k0 min más tarde se retiro el medio de las botellas y
las células se lavaron con lO m1 de PBSfrío, cosechándg
las por raSpado con varilla de vidrio con policía de go
ma en condiciones de esterilidad, siendo luego lavadas 2
veces en PBS por centrifugación 3 min a 1800 rpm (Centri
fuga International IEC) y resuspension sucesiva.
Finalmente, las células fueron resuspendidas en 1,8 ml
de buffer hipotónico RSBe incubadas lO min a 490, siendo
lisadas con 0,2 ml de una mezcla 1:1 de deoxicolato (Sig
ma) al 10%y nonidet P-HO (Bethesda Research Lab.) también
al 10%durante 3 min, luego de lo cual se eliminaron los
núcleos celulares por centrifugación a 2000 rpm durante
2 min a #90, separándose en el sobrenadante la fracción
correspondiente a polirribosomas.
xlii. Ultracgntrifugacion de nolirribosomas
Los polirribosomas provenientes de la preparacion anterior (xli) se sembraron sobre gradientes de sacarosa lO a
40% disuelta en RSB (lOmM Tris-HCl, lOmMNaCl, 3mMM5012 ,
PH 7,k) y centrifugaron durante 130 min en un rotor SW27
(Beckman) a 22.500 rpm de acuerdo a NaeVe y Trent (53) ,
siendo analizada la distribución de radioactividad precipitable con TCAa lo largo del gradiente como se ha des
cripto.(v).
.. . .I . .xlili. Disgregac1on ge Dolirribosomas
El material correspondiente a polirribosomas preparados como se mencionó más arriba (método xli) se dividió
en 3 alícuotas de O,h ml c/u. A una de ellas se le agre
gó EDTA0,114 - 14+ul - hasta una concentración lOmM(53);
otra fue diluída con 600 ul de buffer compensante - KCl
1M, MgC12 0,01M, Tris-HCl 0,1M pH 7,5 - con puromicina
(Boheringer cat n9 108 952) lOmM, incubando 15 min a OQC
y 10 min a 379G (53), dejando la tercer alícuota comocontrol. El volumende todas las alícuotas se llevó a l ml
con RSBy fueron analizadas por ultracentrifugación en
gradientes de sacarosa en RSBcomose describió (xlii),
en forma simultanea con muestras correspondientes a pol;
rribosomas presentes en células sin infectar preparadassegún xli y muestras de virus sindbis purificado (viii).
M-k7
xliv. Traducción de Rua in vitro
a. El RNAse obtuvo de virus SHFpurificado (vii) extra
yéndolo enzimáticamente comose describió (xvi), precip;
tándolo con etanol y redisolviéndolo en KAcal 2%- unos
2 ug de RNA cada 20 ul -.
El sistema de lisado de reticulocitos de conejo (58)
se obtuvo de Bethesda Research Lab. (cat ng 8110 SA) y
fue usado de acuerdo a las recomendaciones del proveedor
(3ht).
Las condiciones óptimas de síntesis proteica dirigidapor el NAde SHF se obtivieron cuando 20 ul de la mezcla
de biosíntesis,[consistente en 50 ul con 450 uCi de 358metionina (New England Nuclear, cat nQ HWG-OO9Tde 1193
mCi/mmol), 30 ul de una mezcla de los 19 aminoácidos reg
tantes en concentracion 0,5 mMde c/u - en Hepes 0,25 M,
KCl O,h M,fosfato de creatina 0,1M - y 100 ul de lisado
de reticulocitos de conejo - 3x en Mng33,5 nN, EDTA
0,05 mM, KCl 25 mM, ditiotreitol 0,5 DH, hemina 0,025mM
creatinquinasa 50 ug/nl, CaClQl mM, EGTA2 mMy HaCl 70
mM%, 13 ul de KAc (acetato de potasio) 2 M y 7 ul de H20,se incubaron con 2 ug en lO ul de RNAdisuelto en acetato
n-hs
de potasio al 2% en agua durante 60 min a 30°C. Comocon
trol negativo se reemplazó el RNApor lO ul de KAc al 2%
y como control positivo por 0,5 ug en 10 ul de RNAmens;
jero de globina de conejo (Bethesda Research Lab. cat nQ
8103 SA).
Luego de la incubación se eliminó el RNApresente -pag
ticularmente el tRHAcargado con 35S-metionina -tratando
5 ul de las mezclas de biosíntesis diluidas en 15 ul de
agua estéril, con k ul de RNAsapancreática (Boheringer)500 ug/ml durante 15 min a 309G (3%5).
b) A continuación, 5 ul de las mezclas anteriores se des
naturalizaron con lO ul de buffer M-O,25M Tris-HCl pH
6,8 , 6% SDS, 30% glicerol, 15%mercaptoetanol y 0,003%
de azul de bromofenol-durante 2 min a 10090 y fueron anal;
zadas por electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS
similares a los originalmente descriptos por Laemli (19k).
Se empleó gel concentrador de acrilamida al 5%- 5 ml
por gel chato (cuba Bio Bad modelo 220) - preparado por me;
cla de 0,83 ml de acrilamida al 3ÓZ(P/V) - Bis-acrilamida
al 0,8% (P/V) (ambas Bio Rad) con 1,25 ml de buffer C
ql? M Tris pH 6,8 , 0,45 SDS - y 2,92 ml de agua destila
1:49
da, siendo polimerizado con 30 ul de persulfato de amonio
a1 10% y 5 ul de TEMED(Bio Bad).
El gel separador se preparó a distintas concentraciones
de acrilamida - 7, 10, 12 y 15%- mezclando volumenes va
riables de la mezcla acrilamida 30%—Bis acrilamida 0,8%
con agua hasta 18 m1 y 3 ml de buffer S - 1,5 M Tris pH
8,8 con O,h% SDS-, seguido del agregado de 120 ul de pe;
sulfato de amonio al 10%, para ser luego de desgaseado al
vacio,polimerizado con 12 ul de TEMED.
El buffer usado en los electrodos - Tris 6 g, glicina
28,8 g, SDSl g y agua hasta 1 litro - permitió que en eg
tas condiciones el azul de bromofenolmigrara hasta el ron
do del gel - 91,5 mm- en 2 hrs #0 min con 20 mAmpereporgel - a alrededor de 150 volt-.
Paralelamente se analizaron mezclas de proteinas - rihg
nucleasa A, quimotripsina A, ovoalbúmina, albúmina bovina,
aldolasa, catalasa, ferritina y tiroglobulina (Pharmacia)de peso molecular conocido t 13,7, 25, M3, 67, 158,
232, #40 y 669 kilodaltons respectivamente (3H6, 3%7) - 1
ug c/u -, las cuales fueron ubicadas por tinción durante
l hr. con azul comassie (Bio Bad) 0,05% en isopropanol 25%
II-5'0
y HAc a1 12,5%, destiñendo en isopropanol al 10% - HAc10%J
para luego detectar los polipéptidos sintetizados en presencia de 3SS-metionina mediante autorradiografía comoyase detallc')(mm) .
I. ANALISIS DEL VIRION DE SHF
Cuandose iniciaron los trabajos de esta Tesis, el vi
rus SHFya habia suscitado 1a atención de varios grupos de
investigacidn (259, 261, 262, 26h, 267) por lo que las con
diciones de cultivo habían sido establecidas (2%9).
Luego de intenso trabajo debido a la negativa proliferg
ción del virus en situaciones comunesde cultivo, pudo de
terminarse la capacidad de células MA-lok- derivadas de
riñón de monorhesus - de permitir el desarrollo del virus
sm" (21+9) .
El hecho de que el virus SHF(la cepa prototipo fue ut;lizada en toda esta Tesis)lisa las células de cultivo en
su estadio final de crecimiento, permitiá la posibilidaddel aislamiento de las particulas virales del mediode cu;tivo mediante 1a combinaciónde técnicas de ultrafiltrafifin
y ultracentrifugación en gradientes de sacarosa (260, 266)
Creo de obligación, en este punto, dejar establecido la
importancia y reconocimiento a estos trabajos previos, sincuya información basica el presente estudio a nivel molecg
. . . I .lar se hubiese Visto demorado enormemente o quizas no hmngse sido encarado.
Los datos diSponibles sobre las caracteristicas generales del virión de SHF- a1 inicio del presente estudio
lo describian comouna partícula esferoidal de un diámetro
promedio de #8 nm y una densidad cercana a 1,18 g/ml en
gradientes de tartrato de potasio (262) y l,19-1,20 g/mlen gradientes de sacarosa (260).
Los datos previos de microscópïa electrónica mostraban
que el virus SHFaparecía encapsulado y su nucleocápside
presentaba un diámetro promedio de 25 nm (260, 262), lo
que concordaba con la evidencia indicativa de que los To
gavirus poseen una cubierta membranosa que rodea un core
nucleoproteico (186).
. . . l . . . . .I. a. Optimizac1on de las cond1c10nes de marcage rad101soI . . tooico del Virus SHF
El mayor problema con que se tropezó inicialmente para.. '. .el estudio del ac1do nucleico Viral fue lograr una marca
. l . . . . .eion radioisotópica de alta act1v1dad especifica.
. . . .I i. . .Sl bien la 1ncorporac1on de aminoaCidosradioactivospá
ra el estudio de los polipéptidos virales podia realizarse
en condiciones adecuadas, los intentos previos de marcar él
RNAviral con uridina radioactiva habían«sid0 decepcionag
tes, dado que por las características particulares de este virus, aunque se hubiesen obtenido grandes volúmenes de
mediode cultivo infectado - del orden de litros - la ra
dioactividad cosechada correspondiente al virus era de sé
lo unas pocas decenas de miles de cpm, lo que imposibili
taba el estudio planeado.
Por la cantidad de trabajo y tiempo involucrado en el. . .I
cultivo de células, infec016n de las mismas, marcac1mncon. . .I . .rad101sótopos\y preparac1on del Virus purificado, asi co
mo el elevado costo de todos los pasos mencionados, resul
to de vital importancia el establecimiento de las condi. l . l. . .I . .
Clones optimas para la max1maootenc1on de Virus radioag. . . . ttivo por ClClO de infeCCion y cosecha.
Las condiciones de cultivo de las células MA-10%en mg
dio minimo esencial de Eagle con sales según Earle(BMEM)
«uplementado con 10%de suero fetal bovino (FCS) y gent;
ricina, asi como la infección con el virus SHF(cepa LVR
EH- 46941) fueron las establecidas previamente (266) yr'J.se detallan en I-¿etodos(i, ii).
En ensayos preliminares se siguieron esquemas de marca
ción de RNAsimilares a los descriptos para otros virus
(212, 222, 270, 271), analizando solamente la incorporación de 3H-uridina en células infectadas con SHFen Cog
paración con células sin infectar y en presencia de digtintos niveles de actinomicina D (act.D) en el medio de
cultivo, utilizada para inhibir selectivamente la sintg«is y por ende la incorporación de radioactividad en el
RNAribosomal celular (116, 51 ).
Cuando la infección de las células MA-lokinoculadas
con SHF, marcadas con 3H-uridina como se describe en má
todos (iii) y en presencia de distintas concentracionesde act.D progreso hasta el inicio de un marcado efecto
citopático (CPE), el líquido de cultivo fue eliminado ylas células adheridas al frasco lavadas con PESfrio,in
cubadas en medio hipotónico y lisadas en un homogeneizador
de fricción vidrio-vidrio tipo Douncecomose describe en
métodos (iv). Luego de eliminados los restos de membranas
celulares por centrifugación, se extrajo el RNAdel sobre
nadante mediante el difundido método que emplea fenol y
SDS(272) según se detalla en métodos (iv).
- . .. .'La incorporac16n de la 3H-uridina a RNAse estimo como
la radioactividad presente en el extracto anterior capaz
31:1l
W
de precipitar con ácido tricloroacético (TCA)a1 10%lo
que permitió eleiminar la interferencia de la 3H-urld1‘I
na no presente en forma macromolecular detallandose es
ta técnica y el dosaje de la radioactividad en métodos(v).
De esta forma pudo comprobarse la fuerte sensibilidad.. .I - - .
del rendimiento de marcaCion de RNAen el Sistema con reg
pecto a los niveles de act.D, ya que si bien en ausencia- - c 1 - 1 'de act.D la radioactiVianñ incorporada a RfAextraible y
precipitable con TCA=1 aüfi fue de 6 a 20 veces superior
en términos absolutos en presencia de-act.D, las di
ferencias entre la rvñíoactividad presente en RNAde cé. . . I . .lulas infectadas y no infectadas resulto inoetectable.
En el rango dc :oncentración de act.D estudiado - 0 a
20 ug/m1-, a la concentración de 5 ug/ml se observó lazmg
yor diferencia'de radicactividad (+ 113%)entre el RNA
proveniente de células infectadas respecto al de no infectadas.(Figura 1.1)
Si bien este esquemaexperimental en células infecta
das no garantizaba lo óptimo de las condiciones para la
marcación del virión liberado al medio de cultivo, al me..Í. .. . ' I.nos permitio ir fiJando Ciertos parametros optimos para
(A)
N
DLFERENCIAENTREIvN(cpmx10")
FIGURA I.l.
l l l l
2 4 1o 20
ACTINOMYCINAD (ug/ml)
Efacto de los niveles de actinomicina Dsobre la incorporación específica de3H-uridina en células infectadas convirus SHF. (Radioactividad presente encélulas infectadas (I)menos la encontrada en células no infecctadas (N) ).
R-7
el proceso de síntesis del RNAviral.
A fin de determinar en estas condiciones el tiempo 6ptimo de cosecha del virus marcado en el medio de cultivo
se realiy Jon estudios cinéticos de la liberación de virus
al medio ñ cultivo mediante el dosaje de la infectividad
viral,cont.ado el númerode particulas formadoras de placas de lisis (PFU) en monocapas de células MA-104(266)
Gnétodovi) y de la incorporación en el virus del sobre
nadante celular)de 3H-uridina comoradioactividad preci
pitable por TCAal 187 {v.), ambos en función de los tieg' . Ipos de incubación.(Ver ¿sto ultimo en capitulo V).
La figura Ï-2 muestra que la infectividad detectableen el sobrenanante de célulasMA-loh infectadas con virus
SHF,presenta una fase inicial de muybajo título - hasta
alrededor de las thrs PI -, seguida de una etapa de aumento logaritmico del númerode partículas infectivas - entre
lO y 20 hrs PI —, alcanzándose luego una estabilización
de la infectividad en su nivel máximo- 106 a 107 pFU/ml ..
lo cual persiste hasta las 32 hrs PI.
De acuerdo al perfil obtenido podemosrelacionar las eta. I . , l . .pas rec1en comentadas con un periodo de latenc1a, seguido
INFECTIVIDADVIRAL
PFU/ml'
l J l J
O 10 20 30 40
'.-HORASPOST-INFECCION
FIGURA 1.2. Cinética de liberación de virus SHFal medio de cultivo.
R--9
de una etapa de rápida liberacion vira1.que culminariaalrededor de las 20hrs PI, manteniéndose la cantidad de
Q
particulas infectivas al menosdurante otras lO hrs.
a _ IUna vez determinada la estrategia de infeccion y marcaa g o . Í Íc16n con radiOisótOpos, se centró la atenCion en el meto
do de aislamiento y purificación del virus del medio decultivo de células infectadas con SHF.
A pesar de haber probado varios métodos relativamente. .I . . . .ISimples de concentraCion Viral - comola preCipitaCion con
SO¡+(_Í'JH).¡_)22M (220‘ , 273) o polietilenglicol al 875 (27‘+)—1os. . . . L I . Imismos rindieron Virus de caraCueristicas poco homogeneas,
' . . .l . . ' . .asi comouna gran disminuc1on en los títulos de infectiVi
dad (PFU/ml) (vi), Debido a ésto, hubo de utilizarse en laq . .. . ' . . .mayoria de los experimentos, el laoorioso metoeo utilizado
previamente para el aislamiento de virus SHF (266) eSQuema. . . . .ltizado en la figura I.3 y conSistente en la eliminaCion de
a. . . .IIragmcntos celulares por centrifugaCión, concentraCion delvirus por ultrafiltracion seguido por bandeo en gradiente
discontinuo de sacarosa, con posterior purificación por u;J_ _._ . .I _ ... . .. ñtracentrifugaCion en gradiente continuo de sacarosa como
se detalla en métodos (vii). Luegode alcanzado el equil;
brio se obtuvo un pico de absorción óptica a 256 nm coinq;
R-lO
RECOIECCION
CULTIVO
/(1) - 5
REGISTRO
CLARIFICADO
AISLAMEENTO
SOCONCENTRACION
GRADIENTEDISCONTINUO
FIGURA1.3. Diagramade los pasos de purificación utilizados en elaislamiento del virus SHF.
R-11
INDIANA'OLI'. IN°.. U.S.Á.
FIGURA I.’+. Resultado final de la. purificación del virus SHFI por flotación en gradientes lineales de sacarosa.
(0.D.:densidad óptica. a 251+nm, ‘71:índice de refracción)
R—12
Í . . . . .dente con el max1mode radioactiv1dad incorporada como se
puede observar en la figura I.h así comocon el pico de
infectividad viral (métodosvi).
I. b. Estudios del virión de SHF
Buscando un método de purificación del virión de SHFque
fuese más rápido que el de ultracentrifugación en equilflmfio
usado normalmente (266), se pensó en adaptar el método de
velocidad de sedimentacion (275, 276); dado que, por el grantamañode las particulas virales y aún uSandomateriales si
. Í . umilares al metodo anterior, habría de ser muchomás rápido.
En este punto observamos que el coeficiente de sedimenta. . l . a . .. .c16n (S) del Virus SHFno habia SlQOinlormado preViamente,
I . . Ipor lo que se procedio a su determinac1on.
Para obtener una medida confiable de S se buscó otro Toga. . . . I . . . . . -.Virus a fin Qe realizar un analiSis comparativo, eligienoo
el virus sindbis por su facilidad dc crecimiento y por la upa.
fusa_informaci6n existe sobre él en la bibliografía(183,18h).
Para ésto el virus sindbis fue crecido en células BHK,mag
cado con 3H-uridina, seguido por posterior aislamiento y puri
R-13
o 0' ' o. a ' no.f1cac1on en las condiciones descriptas en metodos (V111).
El virus SHF utilizado fue marcado con 32P0hHá como sedetalla en métodos (ix) y purificado comose ha descripto(vii).
Se mezclaron cantidades similares de radioactividad cg
rrespondiente a ambosvirus (unas 30.000 cpm de cada uno
por experimento) y la muestra combinada (l ml) fue sembrg
da sobre un gradiente lineal de sacarosa estéril -5-20%
preparada en buffer TNEestéril pH 7,# comose describe en
métodos (x).
Luego de centrifugar a 110.000 g durante l hora.los gra
dientes fueron desarr los y colectados en fracciones deCkkml cada una (x).
0,1 ml de cada fracción fue precipitado con TCAsobre
filtros de papel de vidrio (v) y determinadala radioactividad correspondiente a cada radioisótopo en un contador de
centelleo liquido de dos canales, con ventanas de operación
compatibles con las radiaciones de 3Hy de 32P respectivamente.
Los resultados obtenidos pueden verse en la figura 1.5 que
R-1¡+
.mna
..0nsscMms.l_m.05.1mmmeimb
ns..e) c.11momoemn.na.mV.1.1S.msQ.hns0.n_1.1mzcesM
deb..1mmoy
eddülnormamm"wuaeeHnm.CdCS(SdSeoq.“
gwaIT.mmFF
¡SESUdUHmCOU.
—q._q-._smm.mm
1.I1.
.Mzm5XCIzCM/bknm.N.x111...1mf
SI¡911...
¡unnnullnn
9...;alll.nlunof/I¡lnltllnnnnnnnnnnnn
billlllll
\\
0
3.61....In...qb-xEnu.99xEnuI.
fracciones
3-15
son representativos &33experimentos, en los cuales sindbiscorrió siempre adelante de SHF.
Para eliminar la posibilidad de algún tipo de asociación
entre SHFy sindbis durante la ultracentrifugación, se corrieron ambosvirus en gradientes separados, obteniéndose
las mismasmovilidades relativas comolo demuestra la figgra 1.6.
Utilizando el valor de 280 S aceptado para el virión de
sindbis (189) se obtuVOpara el virión de SHFun coeficien
te de sedimentación de 21h 1 1 S ( 3 experimentos indepen
dientes), mediante el métodode estimacidn de S a partir de
las movilidades relativas descripto por Martin y Ames(275).
A fin de tener una idea al menos aproximada de la proper
ción entre el contenido de RNAy proteinas en el virus SHF
- necesaria para estudios subsiguientes -, se utilizó el mátodo espectrxnbmétrico que relaciona la absorvancia de la
muestra a 260 y 280 nmcon el contenido de ácidos nucleicos
y proteinas (277).
Cuandopreparaciones de virus purificado se analizaronde esta manera se obtuvieron relaciones de absorVancia 280/
. . I . .260 correspondiente a proporc1ones de aCido nucleico en el
virion, en el rango de 6 a 10%en h preparaciones de virusdistintas.
I. c. Estudio ge la nucleogáosige de SEE
Previamente se habian establecido las condiciones para
el aislamiento de la nucleocápside en otros Togavirus, me
diante el uso de detergentes comodeoxycolato (189) y Non;
det ATP-¡+0(192).
De los métodos probados - deoxycolato al 0,2%, Nonidet
NP-HOal 0,5% -, el tratamiento de virus purificado con.0¿%
de Nonidet NP-hOen las condiciones descriptas en métodos
(xii) fue el que produjo mejores resultados, al ser anali
zado el producto por velocidad de sedimentación en gradien
tes neutros de sacarosa -5-20%-(xii).
En estas condiciones, el tratamiento con detergente delvirus marcadocon 3H-uridina (iii) y purificadc (vii), rindió una estructura definida de menor tamaño que el virión
intacto e insensible a 1a digestión con DNAsa,pero a la
vez sensible a la digestión con RNAsa(xiii)(Figura 1.7).
. .I a . a -La determinac1on precisa del coef1c1ente de sedimenta
3-17
15 —
5 Ï SHF
I vumonI¡l
SINDBIS '1 SINDBISCORE g VIRIONI
lll
J lCORE + DNAse o;
1o — I:—— 3 — .
fi :n Ie 5 a : x '; ; 8E E \8 '8 e E,I ru a, ._a. É g 2 — r8
8 3_ rd un
5 a’ rd
1 .
CORE + RNAse
94°"bl W l 1 4o 10 20 30 o 1o 20 30
fracciones fracciones
FIGURA1.7. Identificación del core FIGURA1.8. Coeficiente de sedimeno nucleocápside del tación del core delvirus SHFpurificado. virus SHF.
(En ambas figuras la. sedimentación fue de izquierda a derecha)
R-18
ci6n de 1a nucleocápside de SHFse realizó por comparación
con Viriones intactos de SHFy sindbis, asi comocon nucleg
cápside de sindbis obtenida por tratamiento con Nonidet NP
ho de acuerdo a la bibliografia (189, 192). Se consideró pgra el virión de sindbis un coeficiente de sedimentación de
280 S (189), mientras que para el virión de SHFel valor recién estimado de 21k s (I.b).
De esta forma - en 3 experimentos independientes - la ng
cleocápside de SHFsedimentó en gradientes (5-20%) de saca
ros: neutra analizados según métodos (Xii), con una velocidad correspondiente a un valor de 17h t l S (Figura I. 8);
siendo este valor calculado mediante el método de Martin y
Ames(275) y la linealidad de los gradientes corroborada por
refractometria (279).
Los estudios referentes a 1a sensibilidad comparativa eg
tre nucleocápsides y Viriones de SHFa la digestián con ri
bonucleasa pancreática - Figuras I. 9 y I. 10 - estuvieronorientados a la deducciónde la disposición estructural del
RNAviral en el core mediante la accequibilidad de la enzimal . .al ac1do nucleico.
Para ésto, nucleocápsides (figura I. 9) y Viriones (Figu
3-19
4’ 4r
a¿Ría
3- l 3)llll
__ é: _ +RNase9 {-+RN&2 bx '¡ '; 'E 2- l E 2n lo l D.¡ 0
5’ ¡e ¿n| a ¡
'g :
". í
é 1- :Ill
#ilJ
A“ ‘ vw l lc 10 z) a) o 1o z) zw
fracciones fracciones
FIGURA I.9.. FIGURA_1.10.
Sensibilidad comparativa de nucleocápsides—(Figura9) y viriones (Figura 10)de virus SHFa la digestión con ribonucleasa pancreática.(RNAsa+ ¡digestión en presencia de enzima, RNAsa- : controles sin digerir)
ra I. 10) de SHFmarcados con 35S-aminoácidos (xiv) fueron
incubados en presencia o ausencia de ribonucleasa pancreá
tica a una concentración de 10 ug/ml comose describe en
métodos (xiii), luego de lo cual fueron sometidos a ultra
centrifugacion en gradientes "neutros de sacarosa 5-20%iden
ticos y en forma simultánea (xii).
Los resultados mostrados en 1a figura I. 9 indican cla
ramente la sensibilidad de la nucleocápside de SHFa 1a
RHAsa,mientras que ia figura I. 10 muestra la insensibili. . I . . . odad del Virion intacto en idénticas cond1c10nes.
¿erece mencionarse aquí que en los casos en que el RNA
del virión SHFestuvo marcado con 3H-uridina, si bien eltratamiento con detergente HP-HOdió lugar a la obtención
de la nucleocápside, no liberó radioactividad fuera del p;co de aparición de ésta (Figura I. 7). Por otra parte, cuando el virus estuvo marcado con 358 - luego del tratamiento
con detergente -, sólo un 38%de la radioactividad corres
pondiente a polipéptidos del virus/permaneció asociada a1pico de 17HS correspondiente a la nucleocápside (FigurasIo 9).
Para determinar la densidad de la nucleocápside del vi
CUI N ¡.1
rus SHFse utilizó el métodode ultracentrifugación isopicnica en gradientes de cloruro de cesio (280) en 1a forma
descripta en métodos (xv.), siendo 1a densidad de cadaírag
ci6n estimada por 1a medición de su indice de refracción
(279).
En estas condiciones se obtuvo para la nucleocápside del
virus SHFun valor de 1,33 g/ml en comparación con un valor
de 1,36 g/ml obtenido para la nucleocápside de sindbis pre
parada y analizada en forma idéntica (xv,). En estos exper;
mentos, viriones intactos de SHFy sindbis se trataron en
forma simulada con NP-HO(agregando igual volumen de buffer)
y fueron analizados en forma idéntica comosi se tratara de
nucleocápsides; pero aqui toda 1a radioactividad permaneció
a1 tope del gradiente de C1Cs comocorresponde a sus densi
dades de 1,18 g/ml para SHFy 1,19 g/ml para sindbis (189).
. . lDiscus1on
El presente capitulo deja establecidas las condiciones de
marcación del virus SHFcon 3H-uridina y 32P04H3poniendo demanifiesto 1a sensibilidad del sistema a la concentración deactinomicina D.
R-22
La sintesis de viriones maduros parece demandarun lapso de unas 10 hrs, luego de lo cual la liberación de virus
a1 medio de cultivo ocurre durante un periodo de crecimien
to logaritmico. Esto es seguido por la estabilización aproximadamentea las 20 hrs - de la infectividad vira1,lo
que seria reflejo del cese o marcada disminución de la liberación de nuevos viriones al medio de cultivo.
Nuestro valor de coeficiente de sedimentación para elvirión de SHFde 21%S se correlaciona con los valores de
densidad y tamaño asignados previamente a SHF(2k9, 262) y
concuerda con los valores aceptados para los viriones de
los Togavirus (186, 183), especialmente con el valor aprg
ximado de 208 S informado para el grupo de los flavivirus
(190).
...,.. . .ILa p031bilioao de bandear por ultracentrifugacion nucleg
I. . - . . .capSides de Virus SHF, confirma trabagos prev1os acerca de
la presencia de un core, visualizado por microscopía electrónica de células infectadas con virus SHF(262)
El valor de 170 S obtenido para la nucleocápside de SHF
fue similar al que observamospara la nucleocápside de sing
bis, considerando los viriones intactos comoestándares. Este valor para el core dc sindbis no parece discordar con el
tdI rx) U)
Valor de 177 S obtenido por cálculo directo a partir de
los resultados mostrados por Strauss y col. (189), a pg
sar de que estos autores insisten en usar genéricamente
la designación-de lhO S.
Nuestros resultados - mostrando velocidades de sedimeg
tación similarcu para las nucleocápsides de SHFy sindbis
concuerdan con ‘as similitudes en la sedimentación observa
das entre los cores de los alfa y flavivirus (190); lo cual
unido a nuestro valor de 1,33 g/ml para la densidad de la
nucleocápside de SHF- que es similar al valor de 1,30 g/ml
informado para distintos Togavirus (186) —, implica que lasdiferencias en la sedimentación de los distintos miembros
de la familia Togaviridae se debe en mayor medida, a diferencias en las cubiertas externas de los viriones.
En contraste con la nucleocápside de la mayoría de los
virus de animales que son resistentes a la acción de la r;
bonucleasa, la nucleocápside de los Togavirus es sensible
a RNAsa(186). Ésto concuerda con nuestros experimentos,
que muestran la degradación de la nucleocápside del virus
SHFcon RNAsapancreática a la vez que la resistencia de
los viriones intactos al mismotratamiento lo cual im liQ _
R-2h
ca que la cubierta protege al RNAviral - que comprende
ría alrededor de un 8%de la masa del virus - del ataqueI .enzimatlco.
Estos resultados sugieren la presencia de una estruc
tura de "core" que incluye todo el RNAviral y alrededor
del 38%de la masa de proteínas Virales dispuestas de tal
forma quet o permiten 1a penetración de las moléculas de
ribonucleasa hasta el RNAviral, o bien posibilitan el
ataque de porciones de la cadena de RNAubicadas en la su
perficie de la nucleocápside.
3-25
II. CARACTERISTICAS FISICOQUIMICAS DEL ACIDO NUCLEICO DEL
Con anterioridad a cualquier intento de manipulación gg
nética, fue evidente 1a necesidad de contar con el conoci
miento fisicoquímico adecuado del ácido nucleico en cues
tión asi como que cuanto más se conociese del mismo, más
elementos y herramientas podrian utilizarse con miras a1
cambio genético deseado. Teniendo en cuenta también, que de. .l . l. .. l.1a eluc1dac1onde Ciertas caracteristicas fisicoquimicas plo
I . . . . Idrian dedu01rse los p051bles esquemas de replicac1on y regu. I1a01on concordantes con aquellos.
CuandoSe inició el presente trabajo, la bibliografiaexistente sabre el ácido nucleico del virus SHF, aunque ig
dicaE: su naturaleza ribonucleica mediante experimentos de
inbibición metabólica (249) y digestión enzimática (262) ,no brindaba otras caracteristicas con excepción de un tra
bajo que informaba para el RNAde SHF la obtención de un
hombrodisperso al ser analizado por electroforesis en gg
les de poliacrilamida correSpondiente a un tamaño aproximado de 20 s (262).
Este último dato, por lo impreciso y en severa discordag
cia con el rango de valores aceptados para el RNAde los Ig
gavirus (183, 186) nunca fue aceptado comodefinitivo en
las revisiones de esta familia de virus (18H). Más adelan
te demostraremos lo erróneo de este valor y la causa por
la que probablemente fue obtenido.
II. a. Condiciones para la obtención del RNAge SHF
o -.'-\ -| tqu' o wPara eVitar ambiguedades, se QeClQlOrealizar toaos los. . I.experimentos de este capitulo en forma paralela con una
. . . . . - .¿_.l .muestra ue Virus SanblS comoestandard lo que pernitio ev;
denciar desde los primeros trabajos la marcada fragilidad
del RNAde SHF comparada con la de sindbis.
En realidad cuando el RNAde virus SHFpurificado y mag. . 7 ... 9
cado radioactivamente - con 3h-uricina o J2P04H3- fue exI . .traido con fenol-SDS y cloroformo por el procedimiento ea'l " HHpleado comunmentepara la extraCCion de RNA(¿7¿¡ detalla
1 ' -\ . . o - 1oo en metoaos (iv.b), Siendo luego analizado por velOCidao‘ 1- o, WO w n/ce sedimentaCion en gradientes neutros ue sacarosa 5-¿Op
.. I . a. .(XVll) mostro una amplia disperSión con un hombro central
en cierta concordancia con el valor de 20 S descripto prg-: na- 6') '1 ' unl- " -— 'viamente (2 a). Pero aqui -lamo la dbGnClon que la pOSi—.I .. f . . ..eion del homcro sufria variaCiones con el thnpO en quese
l . n .mantenia la muestra en contacto con el ienol, el tiempo en
3-27
que se almacenaba la muestra congelada y las veces que se
recongelaba la misma, a la vez que en condiciones idénti
cas el RNAde sindbis mostraba por ultracentrifugaciánsúeg
pre un agudo pico de radioactividad correspondiente a su
coeficiente de sedimentación de 1+7s (271), observándose
sólo variaciones en la altura del pico correspondiente a. l .la concentrac1on de RNAanalizado.
Aún sin la obtención de resultados dignos de ser repo;
tados, la etapa en que se trató de obtener intacto un RNA
de gran tamaño y fragilidad como el de SHFfue - a la vez
la que insumió la mayor cantidad de tiempo y labor asi co
mo(por la dificultad de la tarea) la que brindó quizás la. . . q I... .mayor eXperienc1a al autor en el maneJo oe acidos nucleicos.
. . . l . . .Durante la misma se ev1denc1o la nece51dad ca51 obse51
va de eliminar la presencia de ribonucleasas (detectadas.. . . .I . . . . . . ..or disminu1c1on ce la ra ioact1v1dad pr001p1table por TCA'U d
.' . . . ... I(v) en func10n del tiempo) en el material de VlGTlOaun rg
.I _ . .Cien lavado, en las soluc1oncs y por el contacto de las ma. . . . . Inos con tucos, tips y pipetas. Lo anterior se soluc1ono mg
diante el uso continuo de guantes descartablcs, agua y so
luciones autoclavadas asi comosacarosa y otras sustancias,certificadas comolibres de nucleasas.
3-28
Finalmente, el procedimiento descripto en métodos (xvi)
consistente en 1a digestión del virus purificado con.pmme1
nasa K - que digiere totalmente los péptidos presentes- en
presencia de SDSadaptado de 281, seguido inmediatamentedel
análisis por ultracentrifugacion permitio la obtencion del
RNAde SHF en un pico agudo y de posición reproducible.
En experimentos posteriores en que fue necesario separar
los aminoácidos y pequeños oligopéptidos remanentes de 1a
digestión proteásica en una forma más rápida que por ultra
centrifugación, pudo obtenerse RNAde SHFaceptablemente fi;
tegro mediante digestion con proteinasa K en 1a forma ya
descripta, seguida de una única y brevisima (30 seg) exügc
cion fenol-clorofórmica - usando fenol a pH cuidadosamentecontrolado mediante saturación del mismocon buffer - siendoa . . . ¿.I . .esto p051b1e grac1as a la digestion preVia con proteinasa.
Para evitar su ruptura, el RNAde SHFdebió ser almacena
de Pt etanol al 80%y a -2090, pudiendo ser recuperado en el
precipitado por centrifugación.
II. b. CoefiCiente de sedimentacion del Ramdel virus SHF
. .. ¡1.- .Lo primero que deseo definirse del RNAde SHF fue su cog
3-29
. . . .í lfielente de sedimentaCion, ya que ademas de ser un elemen
a . .' . . .to fundamental en 1a caracterizac1on y subclas1fica016nn a o .' Ídel Virus era indis ensable ara 1a evaluac1on de los mea _
.) .1 . .todos de extracelon dando una idea de la integridad del
genomay sirviendo al mismo tiempo como punto de referen
cia para los siguientes estudios.
I. .Para esto, se encararon nuevamente experimentos de do
.l 1 - - .. ble marcac1on donde el RNAde SHF fue marcado con 32? ya . . I .. ... .el de Slndbls - usado comopatron de tamano conoc1do -fue
marcado con 3H.
Ambosvirus, marcados, cultivados y purificados indepen
dientemente comose ha descripto (ix, viii, vii) y cuyos
RNAsfueron también extraídos separadamente (método xvi)
fueron mezclañ 5 - alrededor de 250.000 Cpmc/u-, sembra
dos en gradientes lineales de sacarosa neutra 5-20? y ul
tracentrifugados a 195.700 g durante 2,5 hs. comose det;
lla en métodos (xvii), luego de lo cual los gradientes fueron colectados y fraccionados analizando la radioactividad
TCAprecipitable correspondiente a cada isótopo en un con1 ° - 0 'tacor ce centelleo multican 1. Al mismotiempo y en iden
cf icos gradientes se analizaron muestras de RIAribosomal
18 S y 28 S marcados con 3H y provenientes de células HeLa
R-30
(286) utilizándolos también comoestándares de tamaño.
La figura II-l muestra los resultados de tales exper;
mentos en donde, considerando el coeficiente de sedimen
tación del RNAde sindbis como#7 S (271) puede calcula;
se mediante la relación de Martin y Ames(275) un valor
de 49 S para el coeficiente de sedimentación del RNAdel
Virus SHFoDebe mencionarse que - en 3 experimentos indg
pendientes - el RNAde SHFsiempre sedimentó ligeramente
más rápido que el RNAde sindbis.
Aún teniendo presente que las condiciones experimenta
les no producían 1a desnaturalización de los RHAs,setmg
tó de obtener una estimación del peso molecular del RNA
de SHFmediante la graficación del logaritmo del peso mg
lecular (PH) del RNAde sindbis (k,6 x 106) y de los
REAribosomales 28 s y 18 s (1,9 x 106 y 0,68 x 106)(287)
en función del logaritmo de la distancia sedimentada de;
de el meniscodel gradiente (271). De esta relación li
neal(Figura II.2) pudo obtenerse un peso molecular aprg
ximado de 5,3 x lO6 para el genoma del virus SHF.(Una prgcisa estimación del PMen condiciones desnaturalizantes
-. .I a ,se discutira mas adelante).
cpmx10"("pH)(’HG-O)
EL5.
4...
3v'32 e rE 9E x2 2’'d E-.-Iun D-a _C!o)'U
1_
05
FIGURAII.l.
FIGURAII .2.
FIGURA iI .1.
1 1.2
fracciones
Cosedimentación de 3213-va de SHF y 3H-RNAdesindbis obtenidos enzimáticamente de virionespurificados.(Las flechas indican la posiciónalcanzada por rRNA18 y 28 S en gradientesidénticos); (o—o SHF,‘o---o sindbis)
Gráfico del logaritmo del peso molecular (PM)de RNAestandares en función del logaritmo de
la. gistancia sedimentada(n : rRNA18 s,o,68x10 ;- : rRNA28 S,l,9x106; o :bis,h,6x106; A : RNAde SHF)
RNAde sind=ï'
¿-31
1.4
LOG MOV-RELATIVA
FIGURA II.2.
R-32
Para descartar la presencia de cualquier tipo de intgracción entre el REAde SHFy el de sindbis durante la
cosedimentacion, se realizaron también análisis con nue
vos lotes de RNAsen gradientes idénticos y paralelos,obteniendose idénticos resultados a los mostrados en la
figUra II.1.
II. c. Naturaleza simple o doble hebra del RNAdel virusSHF
La importancia de la naturaleza de simple o doble ca. .I . . .Idena del RNAen la replicacion Viral, la clasificaCion
. . l . .. .,oel Virus, aSl como en la elecc16n de RHASestandares _5.I . . ._,..t . . .I .ra una comparaCionpreCisa, JustlilCO la investigaCion oe
L IL. .. . . . .eSta caracteristica mediante varios criterios eXperimentgles o
El primero de los esquemas experimentales se basó en la
sensibilidad del RNAde cadena simple comparado con el de
doble cadena a la digestión con ribonucleasa pancreática
(271, 288, 289). Para esto, una muestra de RNAmarcado con
3H-uridina y extraído con proteinasa K (xvi) a partir devirus purificado (vii) fue analizado por ultracentrifugación
R-33
en gradiente de sacarosa en las condiciones definidas para
la determinación de su coeficiente de sedimentación(xvifl.
Luego cada fracción obtenida se dividió en dos, incubando
ambos grupos a 379G durante 10 min. en forma similar y pg
ralela, excepto que a uno de los grupos se le agregó ribg
nucleasa pancreática 10 ug/ml y a1 otro no (xviii). Segui
damente; las fracciones de ambosgrupos fueron precipita
das con TCAy la radioactividad remanente estimada como
se describió (v)
El tratamiento enzimático en las condiciones expuestas
digirió completamente el RNAdel virus SHF como puede ob
servarse en 1a figura ¿1-3 donde el pico correspondiente
al RNAviral ha desaparecido.
Para dar mayor fundamento a lo observado, se examinaron
las caracteristicas de sedimentación del RNAde SHFen me
dios con alta y baja concentración salina (282). Asi, el
RNAde virus SHFmarcado con 3H y purificado se analizógnr
velocidad de sedimentación en gradientes de sacarosa 5-20%
preparados en 1 mMEDTA,1 mMTris-HCl pH 7,4 con el agrega
do o no de NaCl 0.1M (métodos xviii). En estas condiciones
y de acuerdo a Van der Zeijst (283, 282), la disminuciádop. _ . . i .servada en la figura iI-k de la pos;c1on en que sedimenta
á-3n
4L T1“ ' ‘T T
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"'-—_-__°.‘.
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10 20C 3)
Fracciones Fracciones
FIGURA II.3. FIGURA II.’+.
FIGURAII.3. Sensibilidad del RNAde SHFa la digestión con ribonucleasapancreática.( o—-—c: RNAsin tratar; o--«o : RNAtratadocon la enzima, las flechas indican la posición alcanzada porestandares r RNA16 y 23 S)
FIGURAII.h. Variación de la sedimentación del RNAde SHFa alta (o---o)y baja (o-—-o)fuerzaiónica.(Las flechas indican las posiciones alcanzadas por rRNA23 S y RNAde sindbis en gradientes de alta fuerza iónica)
deus.(grn/cc)
el RNAde SHFa baja fuerza iónica (388) en comparación
con la que muestra en condiciones estandard (498), sus
tenta la hipótesis de que el RNAdel virus SHFse encueg
tra como una molécula de hebra simple.
A fin de confirmar definitivamente lo antedicho, se
determinó la densidad del RNAde SHFmarcado con 32P,por
¡ón isopícnica en gradientes de sulfato de cesio
u describe en métodos (xix). Los resultados mostrg
la figura II-S correspondientes a una densidaddhl
RNAde SHF de 1,63 g/ml(con un rango de 3 0,005 en 3 ex
perimentos) coincidente con el RNAde sindbis - marcado
con 3H y analizado en el mismo gradiente - el cual se sa
be que es de hebra simple (183, 186), indicaila naturalg
za de cadena simple del RNAanalizado (284) lo cual concuerda con nuestras evidencias anteriores.
II. d. Composición del RNAdel virus sar
. .l . . .La comp051c10nde bases ha Sido determinada para vacas
miembros de la familia Togavirus (186), donde los alfavi. .l . .rus por un lado, presentan una comp051c10nbastante Simi
lar (183), mientras que los flavivirus muestran una distr;
P=1.63 gm./cc_ ) 2.0
6 ‘ z»;1.8- \ri EA ¡ 2’
Ï 'I' ad a«E 1; 1.6- g
' m,: || Q
I 4 —- I l' :NQ g l1, n l
'7 .'9 Ix 1
E Í0- l0 2_ I
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I
0‘04).0 5
FRACCIONES
FIGURA 11.5. Densidad de 32P-RNAde virus SHF (o—o)comparado con 3H-RNAde sindbis (o---o)por flotación en gradientes de SOthg.
bución mayoren los porcentajes de las distintas bases.
Además,rubella, un Togavirus aun sin subclasificar, ha
mostrado valores inusualmente bajos y altos de uridina
y citidina respectivamente (285), aunque descartando en
todos los casos las proporciones de A y U asi como C y G,
la posibilidad de que el genomade estos Togavirus se en
cuentre como Eos hebras de RNAcomplementarias.
. . ..' 'rPñrn cctcrminar su comp051cion, el RNAde SdF se mar
a '32 l ..I . ..co con J P, cosecho y purifico comose ha descripto (Vifl,
luego de lo cual fue digerido con proteinasa K en presen. . Ioia de SDS, seguido de una breve extraccion fenol-cloro
fórmica y posterior precipitación comose ha detallado
previamente (xvi), siendo el RNAasi obtenido sometido a
uno de dos procedimientos distinos.
En uno de los esquemas experimentales, el RNAde SHF
(unas 20.000 c/m) se digirió con ribonucleasa T2- de
acuerdo a métodos r..- el tiempo suficiente comoparaaq;
gurar la completa degradación del RIAa nucleótidos 3'
fosfato, luego de lo cual la enzima- asi comocualquierotra macromolécula contaminante - se precipitó con etanol (zx). Los nucleótidos monofosfato en el sobrenadan
te etanólico, luego de ser concentrados en un evaporador
3-38
rotativo, fueron sembrados sobre papel y sometidos a eleg
troforesis de alto voltaje comose detalla en métodos(xx).
En el otro diseño experimental, el RNAmarcado con 32P
(en similar cantidad), se degradó a nuéleotidos 5'—monoqu
fato, mediante digestión exhaustiva con nucleasa P1 como
se explica en métodos (xx), seguido de precipitación eta
nólica y concentración de los nucleótidos monofosfatos en
el sobrenadante. A continuación, estas muestras se anali
zaron o bien por electroforesis de alto voltaje sobre pa
pel como se explicó o por cromatografía ascendente en pla
ca delgada de polietileneimino-celulosa (PEI) usando LiCl. I como solvente como se describe en metodos (X1).
'.-| W i C 0 ' 1un tooos los analisis menc1onaeos se sembraron 3‘ o 5‘e ‘ g) . - I .AMP, CHP, UMPy GMPcomo estandares, SlenQO estos ubicados
luego del desarrollo de las electroforesis o cromatografias. . . l . .por Visualizac1on baJo luz ultrav1oleta.
Los nucleótidos que componíanla muestra fueron ubica
dos por autorradiografia (xx), luego de lo cual las zonas
correspondientes a las manchasfueron recortadas del papel
o la placa de celuloide y estimada la radioactividad correspondiente a cada uno.
R-39
En la figura II-6 pueden observarse los resultados delas separaciones y la ubicaci6n de los distintos nucleo
tidos, a la vez que la tabla II-7 muestra el rango de losporcentajes relativos en que éstos se encontraron en los
distintos experimentos.
En 1a actualidad, el métodomás utilizado para la dete;
minacién de pesos moleculares de ácidos nucleicos es el de
electroforesis en geles en condiciones desnaturalizantes,lo cual mediante la eliminación de la conformacián tercig
ria de las cadenas polinucleotídicas, permite comparar la. . . i . .longitud de distintos ac1dosnucleicos.
. . . . q . .lSl bien las condiciones de oesnaturaliza01on no ofrecenl .. . a. . ...problemas para ac1eos nucleicos de pequeno o mediano tamano
I ... 1. .(hasta unos 200 nucleotioos) (29%)las conq1c1ones para de;
naturalizar un REAdel tamaño sugerido por el coeficiente.. .' -. . u.» . - .de seciaentac1on ootcnido para el RMAde SáF, y unido a su
R-LI-O
PEI HVE2.1.2:
UMP 4
CMP * UMP
O
J.51'Jiu',
' AMP
:GMP. . g
GMP
¿j AMPni
_v g CMP
0FIGURAII.6. Cromatografía ascendente en PEI-celulosa con LiCl
1Mcomosolvente (PEI) y electroforesis de altovoltaje (HVE),delos nucleótidos S‘monofosfato presentes en el RNAdel virus SHF.(En ambos casos UMP,GMP,AMP,yCMPindica la posición alcanzada por nucleótidos estandar)
TABLA. IILT. Composición del RNAdel virus SHF.
Nucleótido: AMP í IMP GMP [vor/[P
Porcentaje: 19,3-19;8 33;3-33;9 2h;8-26;h 19,5-1919(rango)
R-Hl
Aunque la determinación del peso molecular del RNAde'
SHFpor electroforesis en geles fue una de las primeras
series de experimentos que se efectuaron, no fue hasta
muchodespués y con la experiencia obtenida mediante el
método suave de extracción del RNAy 1a determinacion de
su coeficiente de sedimentación, que pudieron obtenerseresultados satisfactorios.
Ias técnicas probadas a lo largo de estos eXperimen
tos fueron varias: usando urea, formamida (23h) o glio
xal (295) comodesnaturalizantes en sistemas de geles hg
rizontales o verticales de acrilamida, agarosa y compueg
tos de ambas sustancias (29k, 295, 296, 297) pero en es
tos casos siempre se tropezó con problemas de falta de de
finición por ensanchado de las bandas (spreading), lx>cual
no se evidenciaba en los RHAsestandares que se usaban
conjuntamente y suscitados seguramente por el gran tama
ño y fragilidad del RNAde SHF.
nuestros resultados comenzaron a mejorar cuando se puso
en práctica la técnica que utiliza ácido OH-metilmercúrico
comodesnaturalizante en las condiciones descriptas por Ba;
ley y Davidson (287). A pesar de los resultados aceptables.. l ..I . .Iobtenieos por este metodo se dec1dio probar también una tec
R42
nica recientemente desarrollada que hace uso de formalde
hído 2,2 M en el gel de separación y desnaturalización de
la muestra previa a la siembra con formamiday-formaldehi
do (298, ¿99), resultando del uso de ésta bandas de RNA
más finas y nitidas, de despreciable arrastre y que daban
para el RNAde SHFtamaños similares al obtenido con áci
do OH-metilmercúrico pero con mejor definición, lo cual
unido a la peligrosidad tóxica de este último (300) volcaron definitivamente nuestra elección hacia la técnica
del f0rma1dehído (métodos xxi) comométodo de determina
ción del peso molecular del RNAdel virus SHFy rutinario. ,. .I l ,en las separa01ones que se alscutlran mas adelante.
El soporte de separación elegido fue un gel horizontal
de agarosa al 1%y los estandares usados: tRHA, rRNAs 16
y 23 S de E. coli, 18 y 28 S de timo de ternera y RNA47s
de sindbis; fueron procesados en forma idéntica al RNAdeSHFen estudio.
q w. . I , . . . .Iun estes conoic10nes (metooos xx1) la oeterm1nac1on de. .' -- - - . .la pos;c1on alcanzada por el 32P o 3n- RIA ostenido de Virus
_ . . -- ._ 1 . a - ÍSHFpurificado y por el BH-RHÁoe SanblS se realizo por a_l
a(xxii) (Figure 11-8), mientras que la posifiaï0.. (D ¡.1
- I a .os demas estandares se obtuvo fotogrnïïñsdo la fluoreg
FIGURA
¿ivan‘
:2
.uar.al
Lmuflfimig
FIGURAII.8.
11.8.
o—sm
PMx10"
0.5
3-18
.' FIGURA'.IÏ .9.
1 1
.5 0.6l J ' 1
0.1 . O._2 O3 0.4 . Omov1lidadrelativa
Electroforesis de 3H-RNAde virus SHFen geles deagarosa al l %con 2,2 Mde formaldheido.(Las flechas indican las posiciones alcanzadas por RNAdesindbis y rRNA28 8,23 8,18 S y 16 S; xc: cianolde xileno y Ó: origen)
FIGURA11.9. Logaritmo del peso molecular (PM) en función dela movilidad de RNAestandares (o) relativa a lamigración_de azúl de bromofenol,en geles de agarosa al l % con 2,2 M de formaldheido.(¿k : RNAde SHF)
R-hn
cenoia producida por el bromurode etidio incluído en el
gel y unido a RNA(xxi). Así se obtuvo una relación li
neal (295, 287) entre el logaritmo del peso molecular oel número de nucleótidos de los estandares y sus respec
tivas movilidades electroforéticas (Figura II-9) y de eg
ta relación pudo obtenerse gráficamente para el RNA del
virus SHFun peso molecular de 5,5 x lO6 correspondiente
a una hebra de RNAde unos 15.000 nucleótidos de longitud.
_ . IDiscu31on
El RNAdel virus SHFmostró ser extremadamente frágil
en comparación con el RNAde sindbis, por lo que la date;
minación del tamaño y otras características de este RNA
asi como de otros RNASgrandes —en general mayores de
3 X 106 daltons - puede conducir a resultados ambiguos o
erróneos si no se eligen precisamente las condiciones a. . . - lfin de eVitar la ruptura de estos.
Bajo condiciones apropiadas de extracción y usando mg
terial estéril, pudoobtenersepor ultracentrifugaciónun pico único y agudo de raiioactividad correspondiente
al RNAde SHF, el cual sedi:ent6 en todos los experimeg
tos ligeramente más rápido que el RNAde sindbis, asig
R-hS
nándosele un’coeficiente de sedimentacion de #9 S.
De varios métodos probados, la técnica que utiliza gg
les de agarosa con formaldehído 2,2M fue 1a que produjo
en nuestras manos la mejor resolución y menor rupturackfl
RNAde SHF, permitiendo obtener para él un peso molecular
de 5,5 x 106 (unos 15.000 nucleótidos) similar al que es
timamosa partir del coeficiente de sedimentación. Resu;
ta obvia la importancia de esta determinación no sólo pg
ra comprobación de la integridad del genomaviral y la
realización de cálculos estequiométricos, sino por la po
s’bilidad de estimar el tamaño máximode polipéptidos que
el genomadel virus SHFpuede codificar, así comopermiür
la comparación con otras especies de RNApresentes en cé
lulas infestadas y ayudar a deducir mecanismosde sínte. l
SlS, como veremos mas adelante.
,a composición de bases obtenidas para el RNAdel virus
SHF sugerirïa que el genoma de SHF es una cadena de RNA
de hebra simple dado que no hay similitud entre las pro
porciones de bases complementarias, a la vez que la difere_
cia de la composición del RNAde SHFcon los establecidos. . q l . . 1 .para miembros de los generos alfa y flaVi podría indicar
desde el punto de vista evolutivo, que SHFposee marcadas
diferencias genéticas con los integrantes de estos grupos
- en forma similar a lo informado para rubella (285)-, lo
cual explicaría la razón de que SHFno dé reacciones serg
lógicas cruzadas con otros Togavirus (2h9).
El hecho de que el RNAdel virus SHFresultó sensible a
la digestión con RNAsay con un comportamiento de sedimen
tación dependiente de la fuerza iónica de la solución en
que era analizado, concuerda con las caracteristicas espe
radas para un RNAde cadena simple (28M, 283). Este resu;
tado fue confirmado mediante 1a determinación de la dans;
dad del RNAdel virus SHFigual a 1,63 g/nl a 209G, simi
lar a la informada para otros RHAsde hebra simple. Esto
permitiría sugerir que la replicacidn'del RUAdel virusEEF
podria realizarse directamente sobre la hebra única de RNA
que habria de servir comomatriz, a diferencia de lo pro
puesto para ácidos nucleicos de cadena doble, donde la rg
plicación de los mismosdebe ser precedida por un desenrrg
llado total o parcial de ambashabras (M).
3-47
III. ESTUDIO DEL ACIDO POLIADENILICO EN EL RNA DEL VIRUS
SHF
La curiosidad despertadaxpor la existencia de secuen
cias repetitivas de adenina (poli A) en RNAscon capaci
dad de mensajeros ha ido en aumento desde las primeras qg
servaciones (301), demostrándose que la mayoría de los. . ImensaJeros eucarioticos poseen en su extremo 3' una se
cuencia de poli A, la cual no es codificada por el genoma
sino que es adicionada al transcripto en el núcleo (H).
También se ha demostrado que la inhibición de la poli;
denilacián previene la aparición del mRNAen el citoplasma
(67,135), aunque sin embargose encuentran secuencias de
poli A ru) sólo en RHASnucleares y citoplásmicos, sino tau
bién en el RNAde algunos virus como los Togavirus (183,
207) que se reproducen solamente en el citoplasma (183,
186) lo que sugiere que si el poli A tiene una función en
los eventos que proceden la aparición de mRNAen el cito'¿_ I I.plasma, espe no puede ser su unico prop051to.
En los Togavirus, el estudio del poli A originó intere
santes trabajos (202,20h, 302), especialmente sobre el RNA
de los alfavirus, don”; el tamaño informado para el poli A
3-48
oscila entre 50 y 120 nucleótidos (207). Para los flavimi
rus por el contrario, se d15pone de datos escasos y contra
dictorios que les asignan tractos de poli A desde tamaños
similares al de los alfavirus, hasta ausencia completadel
mismo (205, 206).
En realidad, la función del poli A sigue siendo algo mi;
teriosa, ya que al traducirse los mensajeros del extremo 5'
al 3', la terminación de la síntesis proteica debe ocurrir
antes de que los ribosomas alcancen la secuencia de poli A,
haciendo improbable alguna función en la traducción per se.
. .I , 1De todas maneras, aunque la fun01on del poli A no este
aún aclarada y quizás no llegara a ser clave en la compren.O . .. . . . I .Sion de la act1v1dad del RNAmensagero en la Sinte51s pro
teica, indudablemente el hecho de su amplia distribución yI .l l . .i
permanencia en celulas eucarioticas, a51 comosu apar1c1on
en ciertas y particulares especies virales, hace que su igportancia seguramente no sea poca.
_ . . I .lII. a. Determinac1on de la presenc1a de poliadening en elRNA de SHF
Estos experimentos se basaron en la capacidad de oligo
deoxi Timidina (oligo dT)-en hibridizarse a secuencias de
poliadenosina mayores de lO nucleótidos de longitud (303).
A este respecto, cierta experiencia previa del autor enel estudio de la unión de hormonasa receptores (30h) lle
vó al diseño de experimentos de unión de RNAde SHF a oli
go-dT-celulosa que permitieran deducir la unión no especí
fica, en forma tal que los valores obtenidos pudieran ser
comparativos y cuantificables, elementos estos de relevag
te importancia que en general estaban muypoco considera
dos en la literatura referida a1 estudio del poli A.
Para evitar ambigüedadeslos experimentos fueron diseñados de dos formas distintas:
En el primer diseño experimental el RNAde virus SHFma;
cado con 32?, purificado y extraído enzimáticamente(iX, vii,
xvi) fue dividido en dos alícuotas iguales y sembrados en
dos columnas cromatográficas de iguales características rg
llenas ambas con un lecho de fibras de celulosa, con la un;-. . I ..
ca QlfGTGnC1aque en unalla celulosa poseia uleOS fragmeg
tos de oligo dT (ver métodos xxiii).
luego de lavar las columnashasta la ausencia de radio. . I . ., . l .act1v1dad en el liquioo eluído, se oespego el material que
R-50
se hubiere unido estimando 1a radioactividad presente en
cada fracción de las distintas etapas - siembrats), lavado(W)v elucion(E) ' de la cromatografía.
El perfil de elución mostradoen la figura III-l - representativo de h experimentos - permite calcular latnfión
total del'RNA a las columnas con oligo dT-celulosa (barras
llenas) en la etapa E, asi comola unión inespecifica por
sumade la radioactividad eluida (barras Vacías) en lauig
ma etapasde las columnas compuestas unicamente de celulosa.
Cuando a la radioactividad total unida a la columna de
oligo dT-celulosa se le resta la radioactividad correspondiente a la unión inespecifica - que estuvo siempre en el
orden del 6 al 9% - se obtiene un valor de unión que podg
mos considerar específico para el sistema REAde SHF- ol;
go dT-celulosa del orden del 36%de la radioactividad sem
brada. (En k experimentos independientes el rango de la
unión específica estuvo entre el 33 y H2fi, obteniéndose
por comparación de la radioactividad sembrada,y la que se
unió a las columnas sumada a la que no lo hizo, una recupg
ración de más del 9551-).
En varios de estos experimentos se analizaron en forma
ZSí
j\ /\
FIGURA III.l. Cromatografía de afinidad del RNAde SHFa columnas con oligo dT-celulosa ( n ) o celulosa ( El ).( S siembra; w lavado; E : elución , de lascolumnas)
13-52
EXPERIMENTO ACIDO NUCLEICO UNION ESPECIFICA
1 32r-RNA de SHF ha 1
2 32P—RNA de SHF 33 fi
3 3H-RNA de SHF 35 %
u 32P-RÑA de SHF 33 fi
3H-RNAde sindbis 51 fi
3H-RNAde sindbis 53 fi
TABLA111.2. Resultados de la unión espécifica (union total - unión inespecífica. ) de RNAa aligo dT-celulosa.
R-53
idéntica y simultánea con el RNAde SHFrecién descripto,muestras de RNAde virus sindbis marcado con 3H-uridina
(viii) pudiendo compararse los resultados obtenidos con
ambosvirus sometidos a igual tratamiento en la tabla III-2.
El segundo diseño experimental fue realizado tanto para
corroborar los valores experimentales recién mencionados
comotambién para demostrar sin lugar a dudas que la unión
del RNAde SHFa oligo dT-celulosa se realizaba por la pre
sencia de una unión de poliadenina presente en el ácido nucleico.
Para ésto comparamosel efecto de la hibridización del
RNAdel virus SHFcon poliuridina (poli U) o con policit;
dina (poli C), en forma previa a la unión del RNAa colug
nas de oligo dT-celulosa comose detalla en métodos(xxiv).
Comose observa en la figura III-3, la preincubación
con poli U inhibe completamente la capacidad de unión del
RNAa oligo dT-celulosa, siendo éste un resultado consis
tente con el enmascaramiento de la secuencia de poli A en
el RNAdebido a su complementaridad con el poli U. El po
li C en el mismo experimento no mostró ningún efecto en. - -. . . - 1 cla unión del RAAa OllgO dT-celulosa, SlenQOesto expli
íFIGURA III.3. Cromatografía de afinidad a columnas
de oligo dT-celulosa del RNAde SHFincubado previamente con poli U (barras vacías) o con poli C (barrasllenas)(S: siembra; w: lavado)y E:elución de las columnas)
R-sn
3-55
cado por la imposibilidad de poli C en hibridizarse conadenina.
III. b. Especies con y sin poli A de RNAde virus SHF
Dado que mediante análisis de electroforesis en condi
ciones desnaturalizantes, el RNAde SHFmigró como una es
pecie única, resultó interesante investigar 1a existenciade alguna diferencia entre el material capaz de unirse a
oligo dT-celulosa y el que era incapaz de hacerlo.
Para ésto, 32P-RNA'devirus SHFmarcado, purificado y. .I . . .extraído comose describio (1x, vii, xv1), se sembró en
columnasde oligo dT-celulosa y de celulosa (xxiiil considerando al material que eluyó sin unirse comocarente de
poli A (poli A (-)) - en dos experimentos este material. I I . . .Ise reelclo a traves de nuevas columnas Sln observarse unnxl
alguna -.
Luego del lavado, el material unido a la oligo dT-celuI o closa.se eluyo y con51deró comopoli A (+).
Las fracciones poli A (+) y poli A (-) se precipitaron
con etanol (xvi), redisolvieron y analizaron por electrofgresis en geles de agarosa con formoldehído comoya se ha
R-56
PA+ PA
285 ___4
GB ___
238 __¿
18S ___165 ___
BB ___
FIGURAIII.h. Electroforesis en geles de agarosa al l %con2,2 Mde formaldehído,de las fracciones conpoli A ( PA+ ) y sin poli A (PA- ) del RNAdelvirus SHF.(Laslineas indican lá posición derRNAestandard 28 8,23 8,18 S y 16 S, y RNEdevirus QB; O : orígen; BB: posición del azfiï debromofenol)
R-57
descripto (xxi)
La figura III-k muestra que no hay diferencias de ta
maño entre el RNApoli A (+) y el RNApoli A (-) del vi
rus SHFya que ambas producen una banda única de 1a mis
ma movilidad.
III. c. Proporción del fragmento de poli A en el RNAde
SHF
La falta de acuerdo en 1a literatura existente sobre
el tamaño de la secuencia de poli A en los Togavirus(183,
205, 206) nos llevo a realizar distintos procedimientosexperimentales a fin de poder determinar la longitud del
poli A del RNAde SHFcon la suficiente confianza y precisión.
Para tener una primera y aproximada idea del tamaño
del poli A y por ende las técnicas que deberian usarse
en su medición, se preparó virus SHFmarcado con 3H-adg
nina-(métodos xxv), el que luego fue purificado (vii) y. I . . .extraido enZimaticamente comose na descripto (xvi).
El aislamiento del segmento de poli A se realizó me
diante el tratamiento combinado del RNAde SHFcon ribg
3-58
nucleasa pancreática (RNAsaA) - la cual digiere las unig
nes que involucran 3'-OH nucleótidos pirimídicos (305)
y de ribonucleasa T1 - la que a su vez corta los enlaces
en que interviene guanina en forma específica (297) —, lo
que en combinacián resulta en la hidrólisis de todos los
enlaces fosfodiester del RNAexcepto aquellos que involg
cran adenosina-3'-oxhidrilos (20%), permitiendo de este
modoque se mantenga la integridad sólo de la secuencia
del poli A.
De esta forma, el RNAmarcado con 3H-adenina fue dige
rido com ambas enzimas como se describe en métodos (xxvi),
siendo luego cromatografiado por Columnasde oligo dT-celg.I . . -..losa o celulosa de maneratambien descripta (XIiii), lo
. .l .I f. ..que permitio calcular una union espeCifica correSpondien—
o - - o 4,. --.7 'te a la porCión de RflAreSistente a miAsas pancreatica y
T1 en el rango de 0,8 a l,k% ( 3 experimentos independientes).
Considerando nuestros resultados previos indicativos de
que el RNAde SHF consiste en unos 15.000 nucloótidos de
los cuales un 20%son adeninas ( ver II. d.y e.), asi co
mo el hecho que de estas moléculas sólo el 365 presentaría. l .. . . .
poli Alsegun cemostraria su capac1dad de unión a oligo dT
R-59
celulosa (III-a), podemoscalcular en forma aproximada el
tamaño del poli A de SHFen el orden de los 100 nucleóti
dos de longitud (porcentaje obtenido x n9 de Adeninas/pq;
centaje de molécula con poli A).
III. d. Coeficiente ge sedimentación del fragmento de poli
A en el RNAdel virus SPE
La primera idea directa del tamaño del poli A en el RNA
de SHFla obtuvimos aplicando la técnica de ultracentrifu
gación, para lo cual el RNAde virus SHFmarcado con 3H ade
nina (xxv), purificado (vii) y extraido comose describió
(xvi), fue sometido a digestión combinadacon ribonucleasa
pancreática y T1 (xxvi¿fisiendo luego analizado por ultracentrifugación en un gradiente lineal de sacarosa neutra5-20% durante 22 hs. a 195.700 g (métodos xxviJ9.Al mismo
tiempo y en gradientes idénticos, se analizaron también.. I. .tRJA y RNASS como estandares de referenCia.
\
Luego de fraccionados los gradientes monitoreando la ab
sorvancia a 254 nm para ubicar los estándares no marcados,
se midió la radioactividad TCAprecipitable en cada frac
cion, obteniéndose el perfil de la figura III-5 que permi.I ¿I . .Ite - por comparaCion con los estandares - la as1gnac1on de
R-6O
l I AAJ
O 10 20 30
FRACCIONES
FIGURAIII.5. Sedimentación del fragmento de poli Apresente en el RNAdel virus SHF.(Las flechas indican la posición alcanzada por los estandares tRNAyRNA5 S.La sedimentación fue de izquierda a derecha)
R-61
un coeficiente de sedimentación de alrededor de 3S para el
fragmento RNAsaA + Tl resistente del RNAde SHF (correspon
dería a unos 80 nucleótidos de longitud). Consistentemente,
se observó también la aparición de un pequeño pico por de
trás del pico principal.
III. e. Peso Molecular del noli A del RNAdel virus SHF
Con los datos previos y a fin de determinar en forma con
tundente el peso molecular del poli A en el RNAde SHF, se
decidió realizar la técnica de electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes que, al mn;lar toda variación conformacional de las moléculas de ácido
nucleico, permitiría la comparaciónprecisa con estándaressólo en base al peso molecular o al número de nucleótidos
que lo conponen.
Para ésto, RNAde SHFmarcado con 3H-adenina provenien
te de virus purificado (XXV,vii), fue digerido con ribong
cleasa A y T1 luego de lo cual se sometió a cromatografíade afinidad en columnas de oligo dT-celulosa, todo lo cual
fue realizado en las condiciones descriptas en métodos(xxvi,xxiii).
R-62
Las Fracciones correspondientes al poli A unido a la
oligo J-celulosa, luego de eluidas fueron reunidas, pre
cipitadas con etanol, resuspendidas en formamiday desng
turalizadas comose detalla en métodos, siendo seguidameg
te sembradas en geles no acuosos de 7%de acrilamida en
formamida, preparado de acuerdo a 29h como se explica en
métodos(xxvii), En forma idéntica se desnaturalizaron y
sembraron también rRNA 16 s, tRNA, RNA5 s y RNA tipo XI
de 1541, 85, 120 y 63 nucleótidos de longitud respectiva
mente (287, 29H).
1 . . . iLuegode desarrollada 1a electroforeSis, la posic10nde los estándares se determinó por tinción o fluorescen
cia y la del 3H-poli A por autorradiografia, comose de;. ' ...cribe en metodos (xxv111).
Por el bajo contenido de 3H presente en la muestra, las
bandas obtenidas por autorradiografia durante largos tiegpos de exposición, aunque fueron claramente identificables
a simple vista no tuvieron suficiente nitidez y contrastepara brindar fotografias de suficiente calidad, por locnese prefirió documentar la posición alcanzada por el frag
mento poli A en forma densitométrica.
R-63
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FIGURA III .6. Densitograma del análisis del poli,A en el RNAdel virus SHFmediante electroforesis en gelesen poliacrilamida al 7 fi en formamida.(¿standaresz tRNAy RNA5 S; OD : densidad óp
Lica; S : punto de siembra; XC : cianol de xileno; BB : azúl de bromofenol )
R-6h
E1 densitograma mostrado en la figura III-6 - que es
representativo de 4 experimentos independientes - perm;
"te por comparacióncon los estándares calcular para la
secuencia de poli A en el RNAdel virus SHFuna longitud
de 82 3 H nucleótidos.
III. f. Composiciándel fraggento aislado
Aunque 1a digestién combinada de un RNAcon ribonucleg
sa pancreática y T1, asi comola unión a oligo dT-celulosa se aceptan en la bibliografia comoprueba suficiente<k
1a naturaleza poliadenílica del fragmento en estudio (204,
202, 306), se creyó conveniente someter esta aseveracióna un análisis definitivo comoes la determinación de la
. .' .. .comp051c10nnucleotiaica del fragmento aislado.
I ... .. . . aPara esto, el elseno experimental realizado Iue una Cog. .I . .binac1on secuenc1al de los experimentos comentados antaño;
.t .I . .mente, a excepc1on de que en este caso debio utilizarseipPcomotrazador radioactivo.
El virus SHFfue marcado con 32P04H3 (ix), purificadodel sobrenadante de cultivo de células MA-lohinfectadas
. _,_ .l .... .I - .(i), seguido de la eItrac01on y pur111cac1on del REAViral
3-65
— I .comose detalla en metodos (xv1).
- -. - - Icolumnas de 01150 dT-celulosa, conservanco - luego ce elui. . - . i .do - el material unico a ellas cono ya se descrioio (xxv1,
xxiii).
El material resistente_a RïAsas A + T1 y purificada porunion a oligo dT-celulosa, fue repurificado mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%con 7 K de urea
comose detalla_en métodos (xxix), luego de lo cual se so
metió a autorradiografia directa del gel húmedosin ningún
tipo de tratamiento, siendo ésto posible por la naturalezapenetrante dc la radiación del 32? (293).
Luego de 3 cias de exposición a -7OQC, el revelado de la
placa radiográfica permitió detectar la presencia de una nitida banda de radiocctividad con la mismaubicación respecto al azul de bromofenol usado comoindicador del desarrollo
electroforético, que la observada previamente en los exper;- - . . I - , . _mentos ce ceterm1nac1on del peso mOLeculercel poll A(iII.e)
gs I bFJ l)¡H C) cl m C); 0 (n O o"S It) l_.l c.) "3Im\: . . .I .mediante suporp051c1on del ¿el a... I -..) ....
elogrefiu, se delimito un cuaoraco ce 1€ x 18 nn corrcs.on—
R-66
diente a la radiactividad presente en el gel, el cual fuecortado con bisturí y sometido a extracción del polinucleé
tido radioactivo - 5to cpm- con buffer de elución compueg
to de AcNHh, SDS y RNA- tipo XI como carrier - como se de
talla en métodos (xxx),recuperando la radioactividad pre
viamente sembrada en el gel con un rendimiento del 75%.
El RNAfue luego precipitado con etanol, resuspendfib en
AcNa #OmMpH 5,# y digerido con fosfatasa P1 con el fin dedegradar el fragmento a nucleótidos monofosfato (308)(xxxi)
A este nivel, paralelamente y en forma idéntica se tra
taron nucleótidos monofosfato de adenosina (AMP),de guang
sina (GMP), de uridina (UMP)y de citidina (CMP), como esltandares.
Luego de digestión exahustiva - 21 hs. -, las muestrasfueron sometidas a comatografia de intercambio iónico en
placa delgada de PBI-celulosa usando LiCl 1Mcomosolven
te y en la forma ya detallada (xx).
Luego de alcanzar el frente del cromatograma 275 mmsm.. .I ..I .determino la p081c1onde los estándares mediante luz ultra
. . .Ívioleta y la de las muestras por autorradiografia, obtenmg;. - . . ldose la figura III-7, uonde se puede observar la aparicion
R-67
o-¡---—¡-—
FIGURAIII.7. Composición del fragmento considerado poli Amediante cromatografía ascendente en placadelgada de PEIácelulosa y LiCl l Mcomosolvente. ( A, U, C y G indican la posición a1canzada por los estandares AMP,UMP,CMPy GMP;o : orígen ) ‘
’JJl
O\ CO
' I . C o 'de una mancha unica 001ncidente con la ubicaCion corres
pondiente a AMP.
. lDiscuSion
Al igual que el RNAde otros Togavirus (183, 18H), en
contramos que el RNAdel virus SHFdebe poseer una secueg
cia poliadenilada al ser capaz de hibridizarse a oligo dT
-celulosa, la cual a su vez es inhibida por preincubacióncon poliuridina.
Entre un 33 Y 42%de la radioactividad presente en el
RNAde SHF fue capaz de unirse específicamente a columnas
de oligo dT-celulosa en condiciones tales que el RNAde
sindbis se unió en un 5Hfl, valor similar al de 67%encon
trado por Clegg y Kennedy(202) para virus Semliri Forest
considerando que estos autores no dedujeron la unión inespecifica. El haber incluído en nuestros análisis el RH
de sindbis —ampliamente estudiado —permitirá referir a
éste,resultados de estudios similares de poli A en otrossistemas virales o eucarióticos realizados sin tener en
. .I .I . I.consieerac1on la union inespeCifica.
I .- -._¡ . . .Las moleculas de 33A de Sur capaces de unirse a oligo
dT-celulosa (Poli A (+)) y las incapaces de hacerlo aún
luego de recicladas por nuevas columnas (Poli A (-)), no
presentaron diferencias de tamañoapreciables por electro
foresis en geles de egarosa en condiciones desnaturalizan
tes, a pesar de que quizás puedan diferir funcionalmente
comose ha sugerido para sindbis (303).
El tamaño que encontramos para la secuencia de poli A
&3HAsaA 4 T, resistente - en el RIA de SÏF de alrededor
de 3 S es ligeramente menor que el descripto para el poli
A de nRHAseucarióticos - h a 5 s- (20k, 309), pero está
en el rango de 2 a 4 S encontrado para otros Togavirus
(302, 305, 20k). El análisis por electroforesis en condiciones desnaturelizantes arroja una longitud promedio de
82 nucleótidos para la secuencia de poli A en el RNA de
SHF,valor que concuerda perfectamente con el coeficiente
de sedimentación obtenido (lo que indice que quizás el pg
queñohombroobservado en la ultracentrifugación corresng
da a una variación conformacional del poli A).
\.' . .. .La proporczon en que el fragmento resistente a BsAsas
.. .1. . IA + T1 es capaz de nibriaizarse a oligo dT-celulosa estadentro del rango informado para otros Togavirus - de 0,73
a 1,703 - (306, 303) y corresponde a un tamaño concordan
te con los valores comentadosanteriormente.
La detección de una mancha única correspondiente a AMP
mediante la combinación de las técnicas que permitieron de
terminar la Composición del RNAcorrobora en forma directa
que el fragmento estudiado - que es capaz de P.hridizarse
a oligo dT-celulosa y resistir la digestión combinada de
ribonulceasas pancreática y T1 - está compuesto- al nivelde detección del método - exclusivamente por una cado:
. l .poliadenilica.
La demostración de una secuencia de poli A en el virus
SHFque tendria un ciclo replicativo en el citoplasma ce
lular (260) plantea la inquietante cuestión de su funcig
nalismo, dado que aqui se descartaria el rol del poli A
en el transporte de RNAdel núcleo al citOplasma (67, 135).
Además, la presencia de poli A en el RNAdel virión de
SHF, implicaría la existencia de u.a secuencia de poliur;dina complementaria en el RNAde polaridad negativa sintg
tizado en las células luego de 1a infección - comohabria
sido detectado en otros Togavirus (306, 303)-. La existen
cia de una secuencia de poli U en el extremo 5' de la ma
triz sintetizadora de RNAde virus SHFpodria ser de una
3-71
importancia impredescible en el proceso de infección ce
lular producida por el virus SHF, comoen la comprensión
del control de 1a maquinaria biosintética celular por drcssistemas virales.
IV. BSTUDÏO DEL CAP SÍ EL RNA EL VIRUS SHF
Desde hace años, es conocida 1a presencia de grupos
metilo a lo largo de la secuencia del RIAribosoaal ye transferencia tanto de eucariotes comode procarioDa
cl
. I .es, en la proporc1on de 1 o 2 grupos metilos por cada
100 nucleótidos (310, 31h).
.—. . . . . . .I . .al descubrimiento oe la met11ac1on en RnÁSmensage. .IL. . . ¿. . . .íros Virales y eucarloticos conduJo a ia ioentificaC1on
. .... .I .de un nuevo tipo de modizicaCion del RflA, en el que el
. .I .extremo 5'-termina1 es bloqueado por formac1on oe una
.' . . I .union pirofosfato dinucleotido, a la vez que una serie. . . .Ide metilos son adicionados en esta region, que se cong
ce con el nombre de CAP (80, 81).
La estructura metilada terminal fue deducida originalmente en RNAde reovirus y virus vaccinia mediante
el uso de S-adenosil metionina (SAU)radioactiva (82)
e identificando los nucleótidos metilados por digesüón
del mRNAviral con fosfatasa alcalina, la cual cataliza la remoción de grupos 5'-fosfato de cadenas polinu
cleotidicas. Coneste tratamiento el CAPno resulta de
fosforilado, a la vez que ampocopuede ser fos;
R-73
do por 1a enzima polinucleótido guinasa, aunque sin emba;
go, el CAPes degradado por nucleotido pirofosfatasa (311,
206, 312).
Este tipo de estudios indican que el CAPconsiste en
una estructura en la que un nucleotido - que ha resultado
ser 7-metil guanosina (m7G)en todos los casos analizados
se encuentra unido por un puente 5'-5' pirofosfato a 2'
metil adenina o guanina en la mayoria de los casos (h)(ver
figura C de la introducción).
De acuerdo a donde se producen las sucesivas metilacig
nes se reconocen tres tipos principales de CAP:Tipo 0
(7mGppr) que es el encontrado con mayor frecuencia anhog
gos y levaduras; Tipo l (7mGpprmp) es el tipo más común
de CAPen mensajeros virales y eucarióticos donde muestra
predominantemente adenina en la segunda posición; cuando
ésto ocurre, además de la metilación que siempre es en 2'
-O ribosa puede ocurrir otra metilación adicional en pos;
cién N6 para generar 2'-0, Nó-dimetil adenosina; Tipo 2
(7mGpprmmep) con metilaciones en la segunda y tercera
base se lo encuentra en bajo porcentaje en células animales y de Drosophila (h).
R-7H
El CAPparece estar presente en todas las moléculas de. . . l . . .mRflAque codifican la Sinte51s proteica en el eitoplasma
¡1de células lucarióticas, a la vez que algunas de sus fun
ciones podrían-ser proteger a1 mensajero contra la degrg
dación a partir de su extremo 5' o bien proveer una es
tructura de reconocimiento para los ribosomas; adenás,cg
“O el CAPen eucariotes es introducido en el núcleo celu
lar, tamoién cabe la posibilidad de que en estos sistemas
esté relacionado con la selección y transporte de las se
cucncias del mRNAal citoplasma (4). A1 mismo tiempo cie;
tos experimentos sugieren la necesidad del CAPpara una
traducción eficiente, ya que mRïAssin CAPserian mucho
menoseficientes en la codificación de la sintesis prote;ca (313, 90, 96). y
Los estudios de CAPy estado de metilación efectuados
en el RÏA de Togavirus - aunque poco numerosos - han sido
sumamenteinteresantes.
En el alfavirus sindbís, las especies de RIAintracelular especificadas por el'virus presentan CAPSque posan
tanto m7Gcomom2 2,7G y m3 2,2,7 G, en contraste con ela . . I ICAr presente en ol Virion que solo posee m7G(315). Por
otra parte, el RIAviral intracelular presenta netilacion
interna en residuos mSC, ausentes en el RNAdel virion y
distintos del componente mayoritario en el mRNAde célu
las no infectadas que es móA(213, 315).
A su vez, en los flavivirus West Nile y Dengue tipos 2
y 3 se ha encontrado una estructura de CAPm7GpppAmp,no
tando en el primero la presencia también de algunas molé
culas con estructura m7GpppAmpHmp.(206, 205, 316)
Por todo lo anterior, la investigación de 1a existenciade CAPen el RNkdel virión de SHF, asi como su identifica
ción resultaba de interés no solo para la completa caractg
rización fisicoquimica del RNAy su auxilio en la clasifi
cación definitiva de SHF, sino también por la posibilidadde que aportara un dato de importancia a las poco numerg
'eferencias disponibles sobre el CAPde los Togavirus.
. . .I . . . .I ..v. a. Determinacwon e identificaCion cel CAPpresente en
el RNAdel virus SHF
-. . ..I., . Comoen eStUfllOS anteriores, se utilizo RuAde Virus SflF
3á 2 o n - Ñ -¡ omarcado con P (ix), obtenido del soorenadante de culti' QI o a nvo de celulas nA-loh infectadas y purificado comose ha
descripto (vii).
. . . . leste Virus purificado por digestionn; mEl RNA se obtuvo
con proteina a K en presencia de SDS(xvi), apareciendo q_
moun pico agudo y único de un coeficiente de sedincntación
de #9 S (xvii), luego de lo cual fue extraido con fenol-cl;
roforno-SDS y precipitado con etanol comoya se describió
(xvi). A c ntinuacián, el REA- unas 500.000 cp: -se redi
solvió en ïaAc HOnKpH 5,k y fue digerido exhaustivamente
con nucleasa P1, la cual es capaz de escindir los enlaces3'-5' fosfodiester del RNA,dejando nucleótidos 5'-monoqu
fato (308), siendo incapaz de digerir el puente pirofosfa
to presente en el CAP(96, 206), por lo que este conserva
su integridad estructural. (xxxii)
A fin de eliminar el 32? de los mononucleótidos produciÜ
dos, la mezcla de reacción fue llevada a pH8 e incubada.con
Íosfatasa alcalina bacterial EAP)comose detalla cn métg
dos (xxxii). Comoel CAPtambién es resistente a esta ene;
ma (96, 206), las bases que lo componenserán las únicas
unidas a grupos ¿osfato y por ende capaces de portar marca
. . .O . . . . I .A continuaCion se eliminaron las proteinas enzinaticas. . ... .I Iadic1onadas, meciante una nueva extracelon fcnol-clorofq;
mica (iv.b) dividiendo la fase acuosa con el CAP, fosfato”
3-77
. I . . . .inorganico libre y basesribonucleicas en dos porc1ones,
una de las cuales fue incubada con pirofosfatasa de Veng
no de Crotalus atrox, capaz de digerir el puente pirofog
fato del CAP(205), durante 3 hs.
’abas porciones fueron precipitadas separadamente con
etanol para eliminar en el pellet tanto la proteina adi
cionada comocualquier macromolécula remanente, mientras
que los sobrenadantes etanólicos con el material de int_
rés fueron evaporados a sequedad y redisuoltos en etanol
al 505 en agua para ser analizados - unas 80.000 cpm por
punto de siembra - por electroforesis de alto voltaje en
papel de DÉaE-celulosa a pH 3,5 de acuerdo a 317, con la
presencia de estíwdares correspondientes a posibles CAPS,sembrados simultáneamente (método xxxii).
. . . I lLuego de ubicar la p051c1on de los estandares con luz
ultravioleta, se detectó la muestra radioactiva por autgrradiografïa directa (xxii.b, xx)
— c - - . . l«ad debida a 32P reelstente a la digestion con nucleasa
Pa y fos atasa alcalina - presente en el RIAdel virus Sí?..- .I ‘I. ¿1purificaco - ¿parcelo comouna nancna unica, comportancose
R-78
m’GpppUm __
Ï __ m7G NsAmm’GpppAm__ ppp
. ,K — m7G"VGPPPA -—— p
m7Gppme_
.W...<...«._,,_._.........-fl_.
R+BAP R+BAP+Pko
FIGURAIV.l. Aislamiento e identificación del CAPen. el RNAde virus SHFpurificado,mediante
electroforesis de alto voltaje en DEAEcelulosa y en presencia de los estandae._res indicados. ( P1 : nucleasa P1 gBAP: fosfatasa alcalina bacterial ;
’Piro : pirofosfatasa'; O : orígen )
R-79
en tres experimentos independientes en forma similar al
estandard m7GpppAm,a la vez que la porción de la mues
tra procesada en forma idéntica pero con la digestión
adicional por pirofosfatasa, pasó a ubicarse en la pos;ción correspondiente a m7Gp.
Iv. b. Estado de metilación del RNAdel virus SHF
Las evidencias que sugieren el rol regulador de bases
metiladas fuera del CAPencontradas en mRNAsde virus que. lreplican en el nucleo, pero en general ausentes en aque
llos mRHAsque son sintetizados en el citoplasma (318,
205), así comolos interesantes trabajos realizados eIITQ
gavirus (315, 205, 213), motivaron el estudio de la pre
sencia de bases metiladas, a lo largo de la cadena polinucleotídica del RN; del virus SHF.
Para ésto el virus SHF se marcó usando<3H-metil)— me;
tionina comodonante de 3H-metilos y en presencia de adg
nosina y guanosina para evitar 1a entrada de grupos met;
lo dentro del anillo de las purinas (31%), de acuerdo a
Dubin y colaboradores (315) comose describe en métodos
(xxxiii).
El virus fue luego cosechado y purificado (vii) aislcn1 . -. . .I . -- -'co el RnAmediante digestion con protennsan y extracelon
fl' I l- - NU l, Wfenol-clor010rm1ca, seguida ae digesticn con nucleasa r1y fosfatasa alcalina bacterial (EAP)comose ha descripto
.. .-. .' ... .' I(xxx11), seguida de nueva extraCCion y prec1p1tac1on etanglica. El sobrenadante etanólico con los nucleósidos fue
evanorado r resusocndido en a ua destilada estéril anal- 3 - g a ¡H
zindolo junto con estándares de A, G, U y C y nucleósidos
metilados de A, G y C por cromatografía ascendente en pa
pel conza-propanol- SOHCHH4)2al fi (2:1) (319) como des
cribimos en métodos (xxxiv). (En estas condiciones aunque
el CAPpermanece íntegro, sus bases metiladas no interfig
ren en el sistema cromatográfico empleado dadas las cargas
presentes en los grupos fosfato).
.Dos experimentos independientes resultaron incapaces de
detectar radioactividad proveniente de una base metilada
fuera del CAPy por ende ubicada internamente en el RNAthl
virus SHF, aunque bien pueden haber pasado inadVertidas,dg
do que la bajisima incorporación de radioactividad en elRNAobservada en estos eXperimcntos - del orden de unas 1000
veces menor que con los otros radioisótopos usados -, impi-.l . . . .. .lQlOtrabagar con una cantidad de raciac1on que asegurara la
sensibilidad del métodoy 1a negatividad de los resultados observados.
La ausencia de radioactividad correspondiente a algún
nucleósido metilado hizo innecesario todo intento de idea
tificacidn, mejorando la capacidad del método - por una
segunda cromatografía a 90Q o análisis en otro sistema de. lmayor renlu01on.
. . IDiscu51on
La determinación en el RNAde SHF - marcado con 32P
de una estructura resistente a nucleasa P1 y fosfatasa alcalina, hace presumir, la existencia de una estructura confósforo no accequible a estas enzimas, comoes la estruc
tura 5'-terminal conocida comoCAP.Esta suposición se ve
corroborada cuando 1a molécula desaparece al ser tratada
con pirofosfatasa de 1a posición en que se ubica al ser analizada electroforéticamente.
La posicion alcanzada por el CAPde SHFdurante la eleg
troforesis es coincidente con 1a observada para el estankud
m7G(5')ppp(5')Amp en esas mismas condiciones, indicando es
te hecho que el RNAdel virus SHFcuenta con dicha estructu
R-82
ra, lo que concuerda con lo observado para.1os flavivirus
West Nile y Dengue tipos 2 y 3 (206, 205, 316).
Esta secuencia indicaria un CAPtipo 1, descartando un
CAPtipo 0 o cualquier otro CAPconsiderado poco común, a
la vez que la única mancha obtenida correspondiente a CAP
coincide con la idea de un tipo único de RNAmensajere
ral ya que, de ser válido el criterio de que cada menSP‘
ro aparece con un tipo unico de CAP(320), el haber det“;
tado más de una clase de CAPhubiese implicado la e 7steg
cia de más de una especie de RNAcon capacidad de mensajer0.
Los virus de RNAcon hebra de polaridad positiva y re
plicación en el citoplasma previamente examinados, presea
taron un CAPtipo O - como sindbis (315) y varios virusde
plantas (321, 322, 323) - o ausencia de CAP- como en los
picornavirus (32h, 325)-, Mientras que por otra parte, tgdos los virus que exhibieron metilación en la penúltima.ri
besa-CAPStipo l - con excepción de los flavivirus ante
mencionados, fueron virus con RNAde polaridad negativa
(326, 205) o bien este tipo de CAPapareció en el LENAde. . . l .. IVirus que presentan etapas de replicaCion dentro del nufleo
R-83
de las células infectadas - comoadenovirus, SV-HO,virus
del sarcoma aviar y B77, (315)-.
De esta forma el virus SHF, junto con los virus Dengue
y West Nile y quizás los flavivirus en general (205)- fo;marian una clase particular de virus de replicación cito
plásmica (186) y RNAde polaridad positiva con CAPtipo l.
Esto último sugeriria una mayor similitud a n1Vel molecular
de SHFcon los virus del género flavi que con los alfaviI'llSo
La razón de que SHFy los flavivirus estudiados difienml
con el alfavirus sindbis en la naturaleza de sus CAPS,aún
perteneciendo a la mismafamilia Togaviridae, todavia no
ha sido eXplicada.
Nuestros estudios indicativos de ausencia de metilación
interna en el RNAdel virión de SHF, aunque deben ser con
siderados cautelosamente, coincidirían con lo informado pg
ra sindbis (315) y para dengue (205), correlacionándose con
la localizacion citoplásmica de la replicación del virus
SHF (260)9 dado que el mRHAviral producido en el núcleo
generalmente contiene residuos de m6A(318), mientras que
el mRHAsintetizado en el citoplasma usualmente no (205).
V. SINTESIS DEL RNA DE SHF EN CELULAS INFECTADAS
La síntesis del RNAviral en células infectadas por IQ
gavirus se ha estudiado utilizando un precursor radioact;vo del ácido nucleico - tal como3H-uridina - en presenam
de activomicina D. (186). En estas condiciones, la infección de los alfavirus suprime la síntesis de RNAde origen
celular, aunque en infecciones producidas por flavivirusdicha sintesis es inhibida sólo parcialmente (183).
La cinética de sintesis en ambosgéneros de Togavirus
también es distinta, ya que en los alfavirus la sintesisdelRNAespecificado por el virus dentro de las células infecta
das (RNAC)- medida por incorporación de precursores radkfig
tivos - aumenta continuamente durante las dos primeras hcmas
luego de la infección, alcanzando el máximoen la próxima
hora y manteniéndose aproximadamente a ese valor durante t_
do el período de liberación del virus (270, 186).
En los flavivirus los datos son más dispersos aunque coig
ciden en mostrar una cinética más lenta, y mientras los pri
meros trabajos no detectaban incorporación de 3H-uridina ha;
ta el final del periodo de latencia -lO a 12 hrs - (219),trg. I . . . - . IbaJos mas rec1entes muestran una aprec1able incorporac1on de
R-85
precursores aún a 5 hrs post infeccion (PI) (53), la cual
alcanzaría el máximoalrededor de las 30 hrs PI(219, 53).
Las diferencias en la cinética de sintesis del RNAson
reflejo del distinto esquemade replicación que presentan
ambosgéneros de Togavirus, los cuales han sido tratados
en detalle en la introduccion (ver Capítulo sobre caractgrïsticas de los Togavirus).
Resumidamente recordemos aqui que en las células infeg
tadas con alfavirus se encuentra el RNAgenómico (denomi
nado 42 o #7 S) de polaridad positiva, que codifica protgí
nas no estructurales entre las que se encuentra la RNApol;
merasa - RNAvirus dependiente (210, 218) que usará este
RNAgenomico como templado, para sintetizar un NA47 S de
hebra negativa. Éste tendrá dos funciones: sirviendo como
templado de nuevo RNAgenómico hijo y además, el tercio cg
rrespondiente al extremo 3' de este (que en el RIA (—) es
tá ubicado en el extremo 5') (214, 328) codificará en for
ma amplificada el RNA26 S que será el responsable de la
síntesis de las proteínas estructurales necesarias para elensamblaje de nuevas particulas virales (183, 186, 209).
En los alfavirus el RNA#78 (-), aunque se encuentra en
3-86
pequeñisima cantidad, ha sido aislado comodos tipos de
complejos multicatenarios o bien consistente en un RNAk7
S dúplex compuesto por hebras (+) y (-) unidas por puentes
de hidrógeno (llamadas formas replicativas (RF); o formado
por un RNA#7 S (-) y varias cadenas de RNA(+) naciente
de longitud variable, unidos también por puentes de hidré
geno (llamados intermediarios replicativos (RI) (329,209).
En mucha menor proporción que los RNAk7 S y 26‘s, han
sido informadas otras especies de RNA(333) especificadas
por virus - 38 S y 33 S - en células infectadas con alfavi
rus, aunque ahora ha quedado claro - mediante técnicas de
hibridización molecular y electroforesis en geles desnaturalizantes - que no se trata de moléculas distintas sino
que son variantes conformacionales de los RNAs47 S y 26 S
Debido principalmente a la dificultad en eliminar la sin
tesis del RNAcelular con dosis de actinomicina que no inn;
ban la replicación viral, lo que se conoce acerca del procg
so de transcripción del RNAen los flavivirus es muchomás
incompleto que lo conocido para alfavirus (198).
En células infectadas con virus Dengue-2 y tratadas con
actinomicina D, se encontro que la 3ï-uridina fue incorpg
rada predominantemente en 2 especies de RNAcon coeficieg
tes de sedimentación kh o #9 S - según se considere el
RNAde los alfavirus 42 o 47 S respectivamente - y 20 S
(219), lo cual fue luego confirmado por otros autores(279,
221, 225, 219, 331).
VSLa forma denominada #9 S fue sensible a RÏAsa pancre' í‘
tica y por ende considerada de cadena simple, a la vez quesu. o q o ' cv ' osu identidad correspondiente al RnAgenomico encontrado en
. .I - . .. . Iel Virion fue sustentada por Similitud en la comp051Cionde
bases y por electroforesis en geles (331, 53, 206).
El RNA20 S en células infectadas por virus de la ence
falitis del'West Nile fue RNAsaresistente, luego de locualfue convertido en la forma #9 S por desnaturalización, ind;
cando - mediante estudios de hibridización a HAgenómico y
por análisis de huellas de nucleótidos (fingerprints) - que
está formadopor hebras de polaridad positiva y negativa(206)
lo que confirma lo postulado en los primeros trabajos (219)
n . . . .- . .ÍEn ilaViVirussanainformado l p03101e incorporac1on deCJ
.l.radioactividad en un hombroo pico incompletanente resuelto
a 26 S (220), pero que no ha podido ser identificaco por ele
3-88
troforesis en geles y que se estima pudo haber sido confun
dido con incorporación radioactiva en el rRNA28 S (53,331).
En las células infectadas con flavivirus también se ha rg
portado un pico de RNAcorrespondiente a 8-12 S que resulto
ser sensible a RNAsa(225, 221) o resistente a dicha enzima
(332), Este RNA8-12 S permanece cerca del tope del gradieg
te de sacarosa en análisis por ultracentrifugación y-segúnestudios usando electroforesis en geles - estaria compuesto
por especies de cadena simple con pesos moleculares en el o;
den de 40 a 70 x 103 daltons (206). Aunque se ha especulado
que podria tratarse de productos de degradación del RNAgel. .Í . .
nomlco, su func1on permanece inolerta.
V.a. Cinética de sintesis del RNAde SHFen células infectadas
El desconocimiento del grupo al cual se iba a asemejar la
síntesis del RNAde SH? y la necesidad de contar con estima
ciones de los tiempos luego de la infección a que esta con
vendría ser estudiada, nos llevaron a analizar la incorporación de 3H-uridina en células HA-loh infectadas con virus
SHFcomparada con células tratadas en forma idéntica pero
sin infectar, usadas comocontroles.
I(D xo
ÑLuego de varias pruebas, el esquema de infección 3 ma;
cación elegido para el estudio de la sintesis del RIAde
SHFfue similar al usado para el estudio del efecto de ag
tinomicina D en el sistema (1.a), infectando células ïA-lOk
crecidas en monocapadurante l hr con virus SEF, retirando
luego el inóculo y tratando con act. D-S ug/ml - durante 2
hrs para agregar luego la 3H-uridina en la forma descriptaen métodos (XXXV).
A los distintos tiempos, el mediode cultivo fue retira
do mientras que las células en la monocapase lavaron cui
dadosamente con PBS y fueron despegadas por incubación con
tripsina, seguido de lisis celular por resuspcnsión en mediohipotónico de RSE (xxxv.)
‘
En una alícuota del lisado correspondiente a cada tiempo
estudiado se determinó la radioactividad correSpondiente a
3H-uridina presente en forma macromolecular por precipita
ción en papeles embebidos en TCAal 10% (v) -, observándose
el perfil de esta incorporación en función del tiempo en la
figura V-l. Esta figura muestra que tan pronto comopuede es
tudiarse la incorporación dc 3H-uridina en el sistema ( Hhs.... . I . . uPI), hay una pequena pero eV1dente Sinte51s neta oe BLAde
R-9O
-5
cpmx10
HORAS
FIGURA V.I. Cinética de incorporación de 3H-uridina encélulas infectadas con virus SHF( o ) ysin infectar ( o
bida a la presencia del virus comparadacon los controles.
La incorporación de trazador en las células infectadas org
ce rápidamente alcanzando un máximoalrededor de las thrs
PI, que cuadruplica 1a incorporación presentada por las cé
lulas control, para luego caer también bruscamente hasta
las 30 hrs PI, tiempo en que c1 efecto citopatológico es
ya muymarcado y las células comienzan a despegarse de la
placa de cultivo.
Los resultados mostrados coinciden con los obtenidos cuan
do el RNApresente en una alícuota del lisado fue extraído
con fenol-cloroformo (iv,b) y la radioactividad TCApreci
pitaole medida antes o después de ser precipitado con eta
nol en la forma usual (xxxv.), aunque en estos casos la d' Im
versión de los valores resultó algo mayordebido probableI omente al mayor numero de paso: técnicos involucrados.
_". . l .V. b. Esoec1es ce RNApresentes en colulas in ectadas con
'Bl objetivo de esta estepa fue determinar las especies del “.1. l . .. .moleculas de ash presentes en celulas iniectadas con Virus
- la. q. . n . Sar y espe0111cas de QlCha lnleCClón, para lo cual se tuvo. l , . . ala precauCion ae realizar tocos los estudios en iorma comp;
3-92
rativa con el RNAsintetizado por células sin infectar. I o . apero procesadas en identicas cond1c1ones.
A fin de correlacionar los resultados que se obtuvigsen con la información preexistente en la bibliografia
de estudios similares en otros Togavirus, el pr'mer mé
todo usado para el análisis del RNAfue la ultracentriig. Igac1on.
Para ésto se cultivaron_células MA-loh,se infectaron
con virus SHF- o igual volumen de medio de cultivo - y
marcaron con 3H-uridina en presencia de act. D comoya
se describió (métodos iii). Teniendoen consideración los
resultados cinéticos recién mostrados figura V-l), se eligió estudiar las especies dc RNApresentes a las 10, 18 y
24 ¿rs PI, para lo cual a los tiempos antedichos se retiró el sobrenadante de los cultivos y las células fueron
lavadas, incubadas en medio hipotónico (ZSB), resuspendi
das con varilla y policia de gomay homogeneizadas comoya
se mencionó (iv.a), luego de lo cual el REApresente fue ezI ..¿_ L. .traido y prec1pitado con etanol (metouoxxxv1).
Las especies de RIA - entre 100.000 y hoo.ooo cpm por e;
perimento - fueron luego rcoisucltas en TÏE y sometidas a
3-93
ultracentrifugación de velocidad en gradientes neutros.de
sacarosa 5-20%, seguido de precipitación de las fraccio
nes con TCAen la misma forma en que se determinó el cog
ficiente de sedimentacidn del RNApresente en el virión de
sar (xvii) y usando RNAde sindbis y rRNA18 y 28 s como
estandares - indicéndose su ubicación alcanzada mediante
flechas -, pudiendo observarse los resultados obtenidos en
las figuras V-2, -A , B y C - correspondientes al RNApre
sente 10, 18 y 2h hrs post infección respectivamente.
Los resultados de dichos experimentos indican que a las
lO hrs luego de la infección con SHF, aunque se observa una
mayor captación de uridina extraible comoRNAen comparación
con los controles, la mismaaparece dispersa a lo largo delgradiente sin poder resolverse ninguna especie en particular.
1 . l .A las 18 hrs PI pueden observarse GOSpicos espeCificos
l-l1 o .I . a! w Aoe a infeCCion Viral; uno correspondiente a un RxAde alre
dedor de MOa 50 S y otro a especies del orden de 7 S.
.I . - .Dada la poca resoluCion oe las pOSibles especies presen. . . l . .ltes y a fin de Visualizar mas claramente la incorporaCion
.1. . l . .de urioina relaCionada en forma espeCifica con la infeCCión
viral, se incluye la figura V-3 cuyos puntos se obtienen de
cpmx10-3
I.—a"""
‘o-o-o-o-o-o-oo.o-‘
R- 91+
'o.°.q‘
o.“so-0.a -°
FIGURA V.2.
fracciones
Sedimentación del RNApresente en células MA-lohinfectadas ( o ) con virus SHF,osin infectar( o ) a las 10 (A), 18 (B) o'2h hrs luego de lainfección.(Las flechas indican las posicionesalcanzadas por los estandares: RNALT S de sindbis, y rRNA18 y 28 s)
FIGURA V.3.
Rl95
-JE?xEo.u
l I'n fH
—1 l l 3 l
0 5 10 15 20FRACCIONES
Perfil de sedimentación correspondiente en formaespecífica a la infección viral.( Obtenido de V.2-B por diferencia entre la radio
actividad en células infectadas menosla de loscontroles)
R-96
graficar 1a radioactividad incorporada en las células in
fectadas menos la correspondiente a los controles, a lo
largo de cada fracción del gradiente.
Los resultados obtenidos a las 2k hrs PI indican nueva
mente que mediante el método empleado no es posible evideg
ciar claramente especies particulares de RNA.
V. c. Peso molecular de las esoecies ge RNAcelular
Aunquetanto los experimentos de cinética de incorpora
ción de 3H-uridina cOmolos análisis por ultracentrifuga
ción indicaban una sintesis neta de RNA- virus especifi
ca, la insuficiente resolucion de esta última técnica nosdecidio a analizar las eSpecies de RNApresentes luego de
la infeccion con virus SHF,mediante electroforesis en geles.
Comoantes, las células infectadas o no con virus SHF,
marcadas con 3H-uridina (iii), a las 18 hrs PI se lisaron
con RSBy homogeneizaron comosc describió (iv.a), luego
de lo cual se extrajo y precipitó con etanol el RNApresea
te en la forma comentadapara el análisis por ultracentri. I I .fugaCion. (metodo xxxv1).
3-97
Los RNAsredisueltos y desnaturalizados en formamida
más formaldehído se sembraron en cantidades similares de
radioactividad en geles de agarosa al 1%con formaldehí
do y fueron sometidos a electroforesis, comoya se descr;
bio en métodos (xxi) para el estudio del RNApresente en
el virus SHFpurificado (II.e).
Las bandas originadas autorradiográficamente por laa;
tividad incorporada al RNAde células infectadas (I) con
virus SHFy no infectadas (H), puede compararse en la f;
gura v-k con la posición alcanzada por el RNAproveniente
de viriones de SHFpurificados (vii, xvi); a la vez que
las flechas indican las posiciones alcanzadas por RNAde
sindbis (PMk,67 x 106), rRHAs 28 y 18 S de timo de terng
ra (PI-I 1,75 y 0,68 x 106), rRNAs 16 y 23 s de s. coli (PI-I
0,54 y 1,07 x 106) (287, 295) analizados comoestándares,
y azul de cianol (xc) comoindicador de la migración elegI .troforetica.
En el RNApresente en las células infectadas (I) se a;
dencia claramente una especie de alto peso molecular - s;
milar al RNAviral (RHAv)-, totalmente ausente en las cé
lulas sin infectar (N). Curiosamente, este RHAcelularl . . . í .solo presente en células infectadas (RhAc)migro ligera
I
¿v0r-" fl.
' 't
ándbkr->- :5
2885:: 5,23;;
23‘s»183-»des»
ÁFIGURAV.h. Electroforesis en geles de agarosa al 1 %enformaldehído,de1 RNAen células infectadas( I ) con SHF, sin infectar ( N ) y en el virión purificado de SHF( V ).(Las flechas indican posición migrada por Tosestandares: RNAde sindbis y rRNA16,18,93 y28 S; O: orígen; y xc: cianol de xileno)
R-99
mente - de un 10% a un 15% - más lentamente que el RNA
presente en el Virión (RNAV),a pesar de que en relaflói
a los estándares éste mostró siempre un tamaño similar
al determinado previamente (5,5 a 6 x 106) (II.e)
En estos experimentos analizados mediante electrofol .resis en agarosa, se observo para I y N Siempre une.abqn
dante presencia de radioactividad en la zona de pobre
resolución del sistema correspondiente a especies de'mi
jo peso molecular, que migraban por adelante del rRNA
16 S.
A fin de analizar el RNAde peso molecular inferior a
500.000 mediante un sistema que pudiese resolver adecua
damente esta zona de tamañoisNA preparado como reciénse mencionó(iii, iv.a, xxxvi) se extrajo de células ig
fectadas y sin infectar a las 10 y 24 hrs PI, sometiendocantidades similares de radioactividad - unos 200.000
rpm - a electroforesis en geles de poliacrilamida al 7%
con 7Mde urea como se ha descripto (xxix).
. - — . IA pesar de detectarse varias espe01es de RMAinespeci
ficas de la infección viral, la figura V-S denota la preI
sencia de un par de bandas - X1 y X2 - presentes en ce
R-lOO
Q . -- - _,_,,O
¿á
xl ¿‘_5 SX2 ‘ r
, ¿.. ____XC- v
k _BB
FIGURAV.5. Electroforesis en geles de poliacrilamida al 7 %con.7 Mde urea,del RNAproveniente de célulasinfectadas ( I ) o no ( N ) con virus SHFy extraidos a las 10 hrs ('NS e IS ) o 2h hrs ( NL o IL )post-infección. ( estandar : RNA5 S; BB : azúlde bromofenol; XC : cianol de xileno; O : orígen)
3-101
lulas infectadas con virus SHFtanto luego de un corto(IS)
comode un largo (IL) período post infección, pero ausen
tes en las células control sin infectar (HSy NLrespect;vamente).
De acuerdo a un peso molecular aceptado para el RNA5 S
de #3200 - 120 nucleótidos (33H) -, puede adjudicarsele a
las especies X1 y X2 atribuibles al virus pesos molecula
res aproximados de #1.500 y 37.600 - unos 115 y 10k nucleé
tidos - respectivamente, lo que indica para ellos un tamaño mayor que el generalmente considerado para los tRNA
85 nucleótidos, PM30.600 (294) -.
A fin de demostrar claramente que las eSpecies analizadas
eran de naturaleza RNAy no otra clase de moléculas presen
tes en las células, se disolvió en agua parte del material
obtenido comose describió en el experimento previo (iii,
iv.a, xxxvi) desnaturalizéndolo a 609Gdurante 5' (208). Acontinuación se dividió este material en 20 alícuotas - de
10.000 cpm c/u - y se trató con RNAsapancreática o DHAsa
tipo I, ambas en RSBpH 7,h, incubadas a 3790 durante lO
min y a concentraciones progresivas desde 0 a SCug/ml(xxxvii).
La sensibilidad a RNAsay resistencia a DNAsaen las mis
R-102
.L
cpmx10
FIGURAV.6. Sensibilidad del material extraido de célulasinfectadas a la digestión con cantidades variables de DNAsa ( o ) o RNAsa ( o ).
3-103
mas condiciones confirma, en la figura V-6, la naturale
za RHAdel material que hemos estudiado previamente.
V. d. Intermediarios gg cadena doble en la sintesis gg RNA
. i . qLuego de infectadas las celulas por el Virus SEF, oebe
ocurrir en algún momentola replicacion del RNA,la cualnecesariamente involucraria intermediarios de cadena do
ble correspondiente a las hebras madre e hija._A fin deL .. . o .tratar oe esclarecer este mecanismo,resulto necesario es
. . . Itudiar la presenc1a de RNAViral de doble cadena a51 comoI . . l . osus caracteristicas y eVOluc1onen el tiempo que Sigue a
la infección.
La primera serie de experimentos fue orientada a dete;
minar la cinética de aparicion de estos intermediarios de
RHAdc,para lo cual se realizaron experimentos similaresa los descriptos previamente para el estudio cinético de
1a incorporación de 3H-uridina en células infectadas con
virus SHF (V.a), solo que aqui el RNAextraido del lisado
celular antes de ser contado, fue sometido a digestión
exhaustiva con nucleasa Sl comodescribimos en métodos
xxxviii, la cual - por ser especifica para ácidos nuclei
cos de cadena simple (335, 336) - dejaria intectas aque
llas porciones en que las hebras de RNAse encontraran. . l.‘ ..
apareadas, recuCiendo a mononucleotioos no preCipitablescon TCAlas restantes.
La figura V-7 muestra la incorporación de 3H-uridinaa RBAextraido de células infectadas o no con virus SHF
y tratadas con act.D (ï'ïv), que resulto resistente a la
d gestión con nucleasa Sl en las condiciones descriptasen métodos xxxviii, pudiendo observarse que las especies
resistentes a nucleasa Sl - aunque se encuentran en menor
proporción - siguen una evolución - en el tiempo - simi
lar a la observada para la incorporacion total de 3H'ulldina (Figura V-l). Es interesante observar en la figura
V-7 que luego de 20 hrs PI, la presencia de especies reSistentes a nucleasa S disninuve hasta icualar el nivel
l U La .
presente en los controles.
El mismoperfil general de resultados se obtuvo cuando. . I . .el tratamiento con nucleasa Sl se sustituyo por digestión
.. . -. fcon rioonucleasa pancreática de acueroo a 212, aunque aqui... .l .. . .la ¿lSDGTSlOlde los cuplicados fue oastante mayor.
-. . . . . ..'Resultaoos Similares se ootuVieron tonoien cuando el
FIGURA V.7.
3-105
10 20 30HORAS
Cinética de incorporacioñ de 3H-uridina. en RNAresistente a nucleasa Sl,proveniente de célulasinfectadas ( o ) con SHF, o controles sin ininfectar ( o )
B- 106
RNAextraido de células sin infectar o infectadas con vi
rus SHF, fue incubado en presencia de LiCl 2Men las con
diciones descriptas en métodosxxxix y tales que precipitan
los ácidos nucléicos que se encuentran comohebras simples
mientras permanecen disueltos lo que están formando dobles
hebras (333, 288). En la figura V-8 puede observarse 1aewg
lución de las especies de RNAsolubles en LiCl 2Men fun
cion del tiempo, la cual se encuentra en buena concordan
cia con los datos obtenidos mediante digestión Connucleg
sa Sl,
. I . . . . .Al igual que en analisis prev1os, el primer estudio se
basó en la identificación de especies de RNAmediante ultra. .l . , . .centrifugaCion de ve1001dauen gradientes lineales de sacg
rosa.
Para tenor idea de lo que ocurría en las di
pas luego de la infeccion, el RNAmarcado con
iii) fue extraído enzimáticanente y con fenol-cloroformo
(xxxvi) de células ligadas (iv.a) a las lO, 18 y 2h hrs PI,
luego de lo cual fue precipitado con etanol, redisuelto enbuffer adecuado (buffer Sl) y digerido con nucleasa Sl como
FIGURA V.8.
HORAS
Cinética de incorporación de 3H-uridina aespecies de RNAsolubles en LiCl 2 Mprovenientes de células infectadas con SHF( o ) o sin infectar ( o ).
3-107
R-108
. . I - ...se describe en netoaos (xxxv111).
A continuación, las nuestras (0,5 ml con MO0.000a
1.500.000 cpm) fueron sembradas en gradientes lineales
(de 11,5 nl) de sacarosa 5-205, centrifugados 2 hrs H0
min - A y C - o 3 hrs 3C nin - B - a 105.700 g, siendo
le radioectivided precipitable por TCAen ceda fracción,. - . .l ..estimada como ya se QeSClelO (XVll).
\
. q. . .ILa figura V-9 A, E y C muestra la distribuc1on de las
porciOnes de RIA que se encuentran protegidas a la .igeIm
tión con nucleasa Sl en células infectadas con virus SH?y sin infectar a las lO, 18 y 2h hrs post infección reg
pectivamente, mientras que las flechas indican la posi
ción alcanzada por rRHA18 y 28 s y RNAL+75de virus sing
bis purificado, analizados paralelamente en gradientesidénticos. Estos resultados indican que las secuencias
de RHA.qucse encuentran formando dobles hebras no pue
de: atribuirse facilmente e eSpecies moleculares bien deH) inidas, a excepción del importante pico entre 6 y 8 S
observado claramente a las 18 y 2%hrs PI.
estudiar el tamaño de las regiones ind' O CU (DCon el objen -l .I -.I Ivolucradas en le formaCion de duplex, s; nroceuio al ana
3-109
0 10 20 30fracciones
FIGURAV.9. Perfil de ultracentrifugación del RNAresistente anucleasa Sl proveniente de células infectadas conSHF( o ) y de células control ( o ),a las lO hrs( A ), 18 hrs ( B ) y 2h hrs ( C ). (Las flechasindican la posición alcanzada por los estandaresrRNA 18 y 28 s, y RNAde sindbis)
lisis del RNAobtenido y digerido o no con nucleasa Sl c2
mo se acaba de comentar, mediante electroforesis en geles
de poliacrilamida al 7%con 7 Mde urea como desnaturali
zante, en las condiciones ya descriptas (métodos xxix).
La figura V-lO muestra la posición alcanzada por las es
pecies de RNApresentes en células infectadas con SHF(I)
o sin infectar (N) sin ningún tratamiento enzimático (NO
E) o digeridos con nucleasa Sl (Sl), presentes en célulasinfectadas o no infectadas a las lO y 2h hrs luego de la
infección (IS, NS, IL. y NLrespectivamente).
Luego del tratamiento con nucleasa Sl desaparece todoRNAmayor de 16 S —tanto para células infectadas como sin
infectar - comose puede observar comparandola radioacti
vidad ausente de los puntos de siembra luego de la diges
tión enzimática (Sl) con la presente previamente (H0E).
Las bandas X1 y X2 comentadas anteriormente (V. c) también
son eliminadas por tratamiento con Sl, mientras que la radioactividad resistente a dicha enzimaaparece distribuida
entre el fondo del gel y la zona correspondiente al REA
5 S, concentréndose en dos bandas presentes también en células no infectadas.
3-111
FIGURAV.lO. Electroforesis en gel de poliacrilamida al7 % con T M de urea,del RNAproveniente decélulas infectadas ( I ) con SHFo sin infectar ( N ), obtenido a las lO hrs ( NS,IS ) o 2h hrs ( NL,IL ) post-infección ytratado con nucleasa Sl ( Sl ) o no ( NOE )( O; orígen; 5 S: RNA5 S; Xc: cianol de xi
leno; BB: azúl de bromofenol)
Intentando esclarecer la información evidenciada por
los experimentosanteriores, se trató de identificar cuáles eran las especies de RNAoriginales que poseían las
regiones dúplex involucradas en el proceso de replica. i .eion del RNA.
Para ésto, se decidió separar el RNAque presentaba 22
nas de doble hebra en base a su solubilidad en LiCl 2 K,
(333, 288), a fin de someterlo luego a análisis mediante
electroforesis en geles de agarosa al lfl con formaldehído
2,2 H en las condiciones desnaturalizantes descriptas en
métodos(iii, iv.a, xxxvi, xxxix, xxi).
La figura V-ll correSponde a una autorradiografïa pro
veniente del análisis de RNAmarcado con 3H-uridina obtg‘
nido de células MA-lok, tratadas con act. D, infectadas o
no con virus SHFy extraido a las lO y 2%hrs PI como se
ha descripto (xxxvi). Luego de redisuelto, el RNA- unas
800.000 cpm - se incuba con LiCl 2M a -2OQCdurante #8 hrs
en condiciones tales que precipita. (P) el RNApresente
comonebra única, permanecienco en el sobrenadante (S) el
RNAque presenta regiones dúplex (238, 333) (zoofi30.
El RÏA en los sobrenadantes fue precipitado con dos vo
3-113
S LiCl P
10h 24h 10h 24h.N I N ¡rs ¡V
):
' FIGURAV.ll. Electroforesis en gel de aga? sa al l %con 2,2 Mde formaldehído, ü: las especies de RNAsolubles ( S ) y precipita
'bles ( P ) en presencia de LiCl 2 Mprovenientes de células infectadas con SHF( I ) o sin infectar ( N ) a las lO hrso 24 hrs post-infección.( Las flechas .indican el orígen (o) y las posiciones alcanzadas por rRNA16,18,23 y 28_S, y porcianol de xileno (xc).En S se sembró 3H-rRNA 16 y 23 s como estandard.)
R-llh
lúmenes de etanol a pH 5,# como se mencionó previamente
(iv.b), siendo tanto este material proveniente del sobrenadante (S) comoel del precipitado (P) de la incubación
con LiCl redisueltos y desnaturalizados para ser luego
analizados por electroforesis en gel de agarosa con fo;maldehído (xxi) en la forma ya descripta y en presencia
de RNAS5, 16, 18, 23 y 28 S como estándares - 16 y 23 S
radioactivos -.
Comopuede observarse en la figura V-ll, tanto en cé
lulas infectadas (I) comono infectadas (N) cuyo RNAse
obtuvo a 2k hrs PI, no se detecta ninguna especie defini
da ni en el precipitado (P) ni en el sobrenadante (S) del
tratamiento con LiCl. Por otra parte, en el RNAproveníante de lO hrs luego de la infección celular se observa en
el sobrenadante una especie de RNAde gran tamaño que en
el material precipitado con LiCl también se presenta en
la misma ubicación, pero acompañadaademás por otra espe
cie de movilidad ligeramente mayor - con una diferencia
de tamaño en el orden de unos mil nucleótidos menos - ng
tando que a su vez, todas estas especies están ausentesdel RNAen P y S proveniente de células no infectadas.
3-115
Discusión
Nuestras observaciones sobre la cinética de incorporación de 3H-uridina en células infectadas con virus SHFen
presencia de act. D comparadacon controles sin infectar,
indicarïan un pronto inicio de la síntesis de RNAvirus-es
pecífico a una velocidad tal que se alcanzaría a cuadripl;car a las 12 hrs PI la radioactividad incorporada por loscontroles. La brusca disminución de la uridina radioactiva
presente en las células infectadas que se produce a conti
nuación, puede relacionarse con la fase logaritmica de liberación de virus y por ende de RNAal líquido extracelukr
n , I(ver Figura I.2) que ocurre Simultaneamente.
Estos resultados no concuerdan con los informados para. Í n Í . 1 ' - nla einetica de SlnteSlS de RJAen los alfav1rus (¿11, 270),
. I . I . .Siendo mas acordes con el perfil de Sinte51s descripto paraH os flavivirus (219, 220), eSpecialmente con los resultadosODtcniGOSpara la síntesis de RNAen células infectadas con
virus de la encefalitis de Saint Louis (SLE) y en presencia
Q1 Hs E): lve actinomicina D. (220); pudiéndose quizás atribu r las
fereucias entre uno y otro trabajo al uso de distinta multi. . . . I - ÍpliCidad de infecc15n (50 o 100 PFU/celula contra l PFD/ce
lula usada en nuestros experimentos).
á "v- o yLos resultados oe nuestros analis1s de nhA presente enI . - . .celulas infectadas con SiF por ultracentrifugac15n en gra
dientes neutros de sacarosa, guardan similitud con los á
formados para análisis similares del RNAobtenido de cél_
las infectadas con los virus SLE(53) y Western File (206);
siendo ambosfalvivirus (en donde las especies mayoritaias
son el RNAgenóaico y también un RIA de bajo peso molecular
(RNA-BPM).Por otra parte, nuestros resultados no concordg
ríen con resultados anteriores (219, 220, 221), que inforOmabanpara los flavivirus la presencia de un intermediari
resistente a RïAsa de alrededor de 205, cuya existencia e;
bría sido recientemente desacreditada (53, 331).
Los resultados obtenidos mediante gradientes de ultrab
. .o e t . . .centrifuga01on, a51 comolos analisis mediante electrofo
presente en células infectadas con virus SHF, al no reve. í . . ... .lar ningun componente mayoritario de tamano correspond1e_
. . . . Ite a 26 S en tres etapas distintas luego do la infec01on,
lar; ya que 1a ausencia de una esnecie ineortante cuantitg. .. I . . ..tivamente de 33A 26 S descartaria la su;051c16n ae que la
Rail?
replicación del RNAde SHFtranscurre mediante un esque
ma similar al de los alfavirus, donde esta eSpecie se ha
obtenido invariablemente en análisis similares (209) yafianzaría nuestras sospechas - basadas en los resulta
dos de capitulos anteriores - de que el mecanismode re
plicación de SHFpodría ser quizás similar a1 de los flavivirus.
Los análisis cinéticos de la presencia de secuencias
de doble cadena resistentes a nucleasa Sl y de eSpeciesde RNAcon regiones dúplex solubles en LiCl 2M, concue;
dan con las etapas de aumento,de máximoy de disminución
de la síntesis de RNAviral evidenciadas por la cinética
de incorporación de 3H-uridina mostrada en la figura V-l.
Los análisis elcctroforéticos de los digestos con nu
cleasa Sl demuestran la ausencia de una forma replicativa (RF) de importancia, lo que concuerda con lo propues
to por Naeve y Trent (53); a la vez que las autorradiogrgrías de las electroforesis del material de cadena doble
simple - soluble y precipitado en LiCl 2 M- apoyarian‘<.'
. . .V- . .I .la sup051016nanterior, demostrando que la replicaCion del< . a- . , , I.irus oflF involucra espec1es de RJA baSicamente de un solo
a. Q ' ntamano correspondiente al de RNAgenomico - aunque puedan
ser de polaridades Opuestas, (+) y (-), y quizás con la'u' 'r 1oexcepCion de los RhA-BPm-.
Los dos RNAsde bajo peso molecular (RUA-BPM)especiï;
cados por SÏF, resueltos mediante electroforesis en gele U)
de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y que
corresponderian a las especies de 6 a 8 S observadas por
ultracentrifugación, presentaron pesos moleculares dentrodel rango informado para los 2 RNA-BPMdel virus West Hi
le (WH)(206) que hasta ahora era el único flavivirus cu
yo RNAhabía sido analizado en la región de pequeños tangños.
La función de los RNA-BPMes desconocida tanto para SHF
como para WH, aunque sus tamaños - comparados con el deb
las proteínas virales - descartarían su función comoRIA
mensajero, pudiendo quizás tratarse de productos de degrg
dación del RIA genómico, en cuyo caso la ruptura debería
producirse en forma especifica, dada la homogeneidaddetamaño de los mismos.
. . . . . I . .Le ligera diferenc1a de nOVilidad electroforetica (Figu. Í a ora V-k) observada entre c1 RJA genonico proveniente del v
R-119
del orden de unos mil nucleótidos; y si bien no es sufi
ciente evidencia para sugerir la existencia - luego de
la infección - de un precursor de mayor tamaño que el RNA
maduropresente en el virión, deja planteada esa intrigante
posibilidad. Esta estaría también apoyadapor la presenciade una segunda banda de RNA- obtenida por electroforesis
en geles de agarosa en condiciones desnaturalizantes (Figg
ra V-ll) - para el RNAde aparición temprana (10 hrs PI)
en células infectadas con virus SHFy soluble en LiCl 2M
(RNAdúplex), estando ausente en el RNAprecipitado corres
pondiente a RNAde cadena simple. Ésto podria sugerir que
se trataría: uno del RNAgenómico y el otro del RNAde pg
laridad negativa, lo que de ser cierto implicaría que alguns de las especies carecería de una porción de la secueg
cia total —indicando algún tipo de procesado - o bien pp
seeria una secuencia extra, - la cual y sólo a nivel de
hipótesis podria tratarse de la secuencia de poli A que deI . .beria ser agregada postranscr1p01onalmente.
. . .I y I.En el mecanismo de replicac1on del RNAgenomico k9 S. -m .. I .del Virus Snr - como en el de los demas Togav1rus - se su
I . .. .. .pone que la Sintesis del RNAhlJO debe ocurrir sobre una
copia de RNAde polaridad negativa que sirva como templa
3-120
do (183, 18k). Ahora bien, como en el virus SHFal igual
que en SLE (53) no se encontraron trozos de RÏA de doble
cadena, es posible que el RNAnaciente sea recubierto rá
pidamente con las proteínas de’la nucleocápside (53) o que
el nuevo REA- una vez elongado por una polinerasa - sea
separado prontamente de la hebra madre (por ejemplo por
una nueva polinerasa que viene avanzando por la secuencia
a pocos nucleótidos de distancia de la anterior), lo que
mantendría unas pocas bases apareadas de una determinada
molécula de RïA durante todo el proceso.
R-121
VI. IDENTIFICACION DEL RNA MENSAJERO DEL 7IRUS SHF
El estudio de la identidad de los mRHAen Togavirus se
desarrolló primeramente en los alfavirus, ya que - mediag
te experimentos que involucraban aislamiento de polirribg
somas, seguido de la liberación del mRHApresente en ellos
con EDTAo puromicina- varios laboratorios demostrann1 queen células infectadas con distintos alfavirus cl RNA26 S
era el mensajero mayoritario, corresponiéndole de un 60 a
un 90%de la actividad traductiva viral(226,227,183,209).
Se determinó también que el producto de la traducción
del RNA26 S era un precursor - de un PM alrededor dei? ¡OOO
- que por clivaje secuencial daba lugar a las H protein"estructurales del virión (183) (ver en la introducción
capitulo sobre las caracteristicas de los Togavirus), ind;cando estos estudios que la sintesis del polipéptido precursor ocurre a partir de un sitio único cerca del extremo
5' de este RNA(337, 338, 183, 209, 228).
31 RNA#7 s ha sido aislado tambiénckapanzribosomas(3ho,
228) evidenciando su rol de mensajero, pero, en contraste
con la traducción in vitro del RIA 26 S - gue produce pol;I . . .. .peptidos estructurales de tamano igual o cercano a los ob
tenidos in vivo -, la traducción del RNA1+7s de los alfa
virus produce un espectro de polipéptidos en el rango de
PM20.000 a 200.000, en donde prácticamente ninguno corre;
ponde a las proteinas encontradas en las células infectadas
(228, 229); a la vez que estos experimentos indican que la
traduccion de los genes noestructurales (NS) se inicia en
un sitio unico, implicando que al igual que los polipéptidos estructurales, los NSson formados por clivaje postrang
cripcional de una proteina precursora (228, 229, 230).
Por otra parte, el efecto de la infección de los flavi
virus en la biosintesis de proteinas es menosconocida, yaque los polipéptidos eSpecificos de la infección viral han
sido más dificiles de identificar por la incapacidad de estos virus de detener la sintesis macromolecularde la celu
la huésped luego de la infección (183), de tal manera que
ésta continúa siendo una de las áreas más difíciles de es
tudiar dentro de los mecanismosde replicación de los Toga
virus. A esto'se le sumala naturaleza poco comúnde los re
sultados obtenidos en estos virus, comparados con otros v;
.rus animales de RNA(+) (ver en la introducción el capitu
lo referente a los Togavirus).
La estrategia conocida para otros virus animales a RNA
de hebra positiva, condujo a la búsqueda de alguna eviden‘
cia de clivaje postranscripcional y de relación precursorproducto entre las proteinas especificadas por los flavi
virus; sin embargo, no se observaron proteinas de vida
corta o especies adicionales en células infectadas , con
distintos procedimientos (235, 231), ni tampocorelaciones entre proteínas virales de mayor y menor tamaño mahag
te mapeos con tripsina (232, 233, 23k). a.
Esta incapacidad para establecer alguna relación entre
las proteinas especificadas por flavivirus en células in
fectadaslcontrasta con las relaciones precursor-productoreconocidas para las proteínas sintetizadas en células ig
fectadas con alfavirus (186, 228) o con picornavirus (339).
La evidencia aportada en el capitulo anterior refer;
da a la ausencia de un RNAmayoritario de tamaño 26.8 encélulas infectadas con virus SHFe indirectamente los re
sultados de capitulos previos, hacian poco probable quelas proteínas codificadas por el virus SHFfuesen sinte
tizadas en un esquemasimilar al mostrado por los alfavi
rus, donde la traducción de los genes estructurales es agplificada mediante la síntesis del RNAmensajero 26 S -que
o ampliamente en varios virus de es
. ' g q O .VI. a. Cinetica Qe la sintesis proteica en células infectadas con virus SHF
Antes de la realización de experimentos más elaborados
para identificar el mRNAdel virus SHF, se deseó investi
gar primero si 1a sintesis proteica virus-especifica presentaba etapas particulares en las cuales convenía ser egtudiada.
Para ésto, y en condiciones de infección con virus SHF
y marcación en presencia de actinomicina D en condiciones
similares a las usadas en los experimentos previos (XXXV),
se estudió la cinética de Sintesis proteica en células 'gfectadas con SHFy sin infectar mediante 1a incorporaciónen forma macromolecular de una mezcla de aminoácidos tri
tiados - para lo cual, en reemplazo de 3H-uridina se usav? ' --¡ - 'ron 3n-aminoa01dos (3H-AA)comose explica en metodos x1.
Comopuede observarse en la figura VI-l, 1a infección
del virus SHFno modifica apreciablemente el perfil de
incorporación de 3H-AAobservado en células sin infectar,
2-125
ISí
10
ÉEXEo.U
5..
l l 1
o 10 20 30horas
FIGURAV1.1. Cinética de incorporación de 3H-aminoácidosen células infectadas con SHF( o ) o controles sin infectar ( o )¿
al menos nasta las 12 hrs PI, tiempo en el cual comienza.. . l n I- . .. - . ._ n ¿. fla disminuir en las ceiulas iniectadas mientras COHUlHUG
aumentando en los controles.
. I . . . . .VI. b. Presenc1a y analisis ge secuenc1as poliadenilagag- ' . . 7en el RNAde celulas infectadas con Virus gáE
La presencia de segmentos de poliadenina (poli A) en
RNAmensajeros (55, 62, 4), asi comolas evidencias obtg
nidas por nosotros en el RNAde virus SHFpurificado (ca
pitulo III), nos llevaron a investigar la existencia de dicha secuencia en el RNAde células infectadas con virus
SHF, a fin de que su presencia nos señalara las especies
de RNAcon probable actividad de mensajero en la sintesisl .de proteinas Virales.
Siguiendo un esquemasimilar al descripto para el estui
dio del RNAde virus purificado (III.a), lo primero que serealizó fue la determinación de la existencia de poli A en
RNAmediante cromatografía de afinidad a migo dT-celulosa(xxiii).
Para ésto se infectaron (I) o no (N) células MA-lohcon
virus SHF, siendo marcadas con 32P04H3en presencia de ac
3-127
tinonicina D (ix); a las 18 hrs PI las células se lisaron
(iv.a), obteniendo el RNAmediante digestión con DHAsa+
Proteinasa K seguida de extracción fenol-clorofórmica cg
mo se describe en métodos (xxxvi). A continuación, se seg
bro RNAproveniente de células infectadas - RNA(I) - en
una columna compuesta de oligo dT-celulosa, e idéntica
cantidad en otra columnaigual pero rellena con celulosa
desnuda que habría de servir para descontar la unión ines
pecífica. Al mismotiempofue sembrada la misma cantidad de ra
dioactividad proveniente de RNAde células sin infectar
RNA(N) - en otras dos columnas iguales a las anteriores,
una con oligo dT-celulosa y otra con la mismacelulosa pg
ro sin oligo dT unido.
Las k columnas fueron sembradas - con 1.150.000 cpm c/u-,
lavadas hasta ausencia de radioactividad y el RNAunido eluido
en las condiciones descriptas previamente (xxiii), pudiendo
observarse el perfil obtenido para el RNA(I) y el RNA(H)
en la figura VI-2, A y B respectivamente.
En estas condiciones, 1a unión especifica del RNApresente
en células infectadas en presencia de act. D resultó del 31%
- siendo la unión total del 70%y la inespecifica hasta 39%). I . - .quizas por mayor cantidad de RHAscontaminantes fragmentados
R-128
cpmx10-S
NI
FIGURA V1.2. Cromatografía de afinidad a columnas deoligo dT-celulosa (barras llenas) o decelulosa (barras vacías), del RNAproveniente de células tratadas con act.De infectadas con virus SHF ( A ) o decontroles sin infectar ( B ).
3T
B
2.-.
“éX
EO.U
1_
o L j\5_ j\ 1o j
FIGURA V1.2. Continuación
Í - c .' a. N * 'en las celulascomparaoocon el Virion purificado:,mientrasI . .I l.que en las celulas no infectadas la union especzfica fue
' . . . . . . . Ipracticamente indetectable - la unión total y la ineSpec¿
fica fueron similares y del orden del h al 6%-.
Por la relevante importancia de la presencia de poli A
como evidencia del posible rol mensajero del RNAposeedor
de la misma, se intentó esclarecer la naturaleza de las e;pecies que presentaban dicha caracteristica en células in
fectadas con virus SHF, comparándolas siempre con los RNAsencontrados en células sin infectar consideradas comocontrol.
Para este fin, 32P-RNAobtenido de células infectadas(I)
y sin infectar (H) con Virus SHF en la forma mencionada ag
tes (ix, iv,a.,xxxvi) se cromatografió en columnascon ol;
go dT-celulosa - en la.forma descripta más arriba en este
mismopunto (métodoxíiii)3 juntando el material que pasó
por la columnade oligo dT-celulosa sin unirse aún durante
una segunda recromatografia - el cual fue considerado RNA
poli A (-) -, y mezclando el material unido a la columna
de oligo dT-celulosa y eluido en 1a última etapa de la org
matografïa - siendo este considerado RNApoli A (+)-.
R-131
Junto con RNA(I) y (N) sin cromatografiar - It y Ht y RNAestándares, las 3 muestras de RNA: (I) poli A (+)
I (+) -; (I) poli A (-) - I (-) -; y N poli A (-) - N (-)-;
(el RNA(N) no se unió a oligo dT-celulosa), fueron precipi
tadas separadamente con etanol, redisueltas en buffer desng
turalizante y analizadas medianteelectroforesis en gel dcagarosa al 1%en presencia de formaldehído 2,2M, en las con
diciones ya descriptas (xxi).
En la figura VI-3 - aunque con regular resolución - pue
de observarse la presencia de RNAsde gran tamaño correspog
dientes a las muestras It, I (-) e I (+) totalmente ausen
tes en las células sin infectar - Nt y H (-) -. En It y I(-) aparecerian dos especies de RNAcon tamaños del mismo
orden que el del RNApresente en viriones purificados,uno
de los cuales muestra capacidad de hibridizarse a oligo dTcelulosa apareciendo en I (+).
En la zona de tamaños menores no se alcanza a resolver
-en las condiciones usadas - ninguna especie particular,
aunqueen It, I (-) y Ut aparece radioactividad distribuida entre unos 8 y 16 S en forma difusa pero de todos modos
ausente de I (+).
FIGURA V1.3.
R-l32- r:
Electroforesis de RNAen geles de agarosa al l %con 2,2 Mde formaldehído.It: RNAtotal de células infectadas con SHF.Nt: RNAtotal de células no infectadas.I+: RNAde células infectadas que se unió a oli
go dT-celulosa.I-z Idem que no se unió a oligo dT-celulosa.N-z RNAde células no infectadas que no se unió
a oligo dT-celulosa.(No hubo unión de N a oligo dT-celulosa.Las flechas indican 1a posición de los estandares:I‘RNA28,23,18 y 16 s, RNA.5 s y del virus QB;O: orígen, XC: cianol de xileno y BB: azúl debromofenol.)
La existencia de secuencias de poli A en el RNAobte. l . - . - .nido de celulas infectadas con Vl"us SHFdeterminada por
dïS. I .union a oligon “—celulosa, hizo interesante conocer
1a similitud o diferencias de estas secuencias con la pre
sentada por el RNAdel virión. (capitulo III).
Aprovechando la especificidad de la RNAsaA por los
enlaces que incluyen pirimidinas y la RNAsaT1 por los
residuos de guanosina (305, 297, 204) se analizó el tamaño de 1a fracción del RNAde células infectadas resisten
te a ambas enzimas.
Con este.objeto, se preparó RNAmarcado con 3H-adenina
(xxv.) obtenido de células infectadas con SHFo silinfec
tar, lisadas a las 18 hrs PI (iv.a) y extraido comoya de;cribimos (xxxvi); luego de precipitado con etanol se redi
solvió en THEy se digirió con RHAsasA + T1 según métodosxxviúupara ser analizado a continuación - 1 millón de cpm
por ultracentrifugación en gradientes neutros de sacarosa
5-203 durante 22 hrs a 195.700 g en forma similar al des
cripto previamente (xxvi.b).
En la figura VI-Mpuede observarse el perfil de la radig
actividad precipitable con TCAy RNAsaA + T1 resistente
H-13H
FRACCIONES
FIGURAVI.h Sedimentación de la secuencia de RNAresistentea RNAsasA+T1:: Proveniente de células infectadas ( o ), de células no infectadas ( o ) y delvirus purificado ( x ). ( Las flechas indicanlas posiciones de tRNAy RNA5 S analizados comoestandares.La sedimentación fue de izquierdaa derecha.)
presente en el RNAde células infectadas con virus SHE
(I) y sin infectar (H), en comparación con el observado
para la fracción resistente en el RNAde virus purifica
do (V), asi como con tRNAy RNA5 S analizados simultá
neamente en gradientes idénticos.
Considerando el tamaño de los estándares - 85 y 120
nucleótidos para tRHAy RNA5 S (29k)-, el pico de ribg
nucleótidos resistentesa RFAsasA + T1 en células infegtadas correspondería aproximadamente a unos 30 o #5 nu
cleótidos de tamaño, el cual coincidiria con el pico depequeña magnitud - a pesar de haber procesado iguales ca;
tidades de muestra - en las células control y también con
el pico secundario observado en los análisis del RNAen. . lel Virion.
Dado el carácter aproximativo de estimaciones de tamgño realizadas en las condiciones no desnaturalizantes del
experimentoanterior, se decidió establecer definitivamente la longitud del tracto poli A en el RNAde células
infectadas con virus SHF, marcados con 3H-adenina y obtg
nido comose describió (xxv, iv.a, xxxvi), mediante elegtroforesis en geles de poliacrilamida al 7%- en mediorm
_ .1 .. n' .I acuoso oo formanioa (xxv11) - de la 1racc:on RHAsaA + T1
resistente,que fue unida y eluida de columnascon oligodT-celulosa.
La figura VI-S muestra 1a autorradiografia obtenida del
análisis del 3H-RNA(H.#O0.000 cpm) proveniente de células
infectadas (xxv), lisadas a las 18 hrs PI (iv.a) -, extraido y precipitado con etanol (xxxvi), que fue digerido con
RNAsasA 4 T1 y cromatografiado a oligo dT-celulosa, en fo;
ma idéntica a 1a descripta en métodos (xxvi, xxiii), luegofue sometido a electroforesis en condiciones desnaturalizq;
tes (xxvii), simultáneamente con RNAde células infectadas
sin digerir enzimáticamente ni cromatografiar y RHAsestán
dares visualizados por'tinción con azul de metileno, como
ya se describió (xxvii); correspondiéndole a la secuenciade poli A un tamaño de 72 a 75 nucleótidos de longitud en
relación a los estándares tRHAy RNA5 S de 85 y 120 nu
cleótidos respectivamente (294).
. , . . IVI. c. Estugig gel RNAgnigo a pelirribosomas en celulas
infecta‘as con virus SHE
I . . . . .Aun cuanoo indirectamente la presenc1a de poli A en la
R"137
XC'55
. __v tRNA
'Xl__.__
___BB
FIGURA VI. 5. Electroforesis . n gel de poliacrilamida al 7 9Len formamida, de la secuencia de RNAprovenientede células infectadas con SHF,queresultó resistente a RNAsasA+T1y que se unió a oligo dT-celulosa; comparado con el mismo RNAsin procesar.(Las líneas indican de arriba a abajo: origen,
cianol de xileno, RNA5 S, ïRNA, RNAtipo XI yazúl de bromofenol.)
1-3?’especie-de nHAvirus-especifico de tamaño similar al RNA
genómico daba un indicio de la funcion de esta especie cg
momensajero viral, una prueba fehaciente de dicha activ;
dad la daria el estudio del RNAasociado a los polirribo
somasde la célula infectada, considerados ser los cen
tros de la sintesis proteica (h, 5, 6).
Para estos estudios se infectaron o no células MA-lok
con virus SHF, marcándolas con 3H-uridina en presencia de
act. D, comoya se mencionó (iii.a). A las 17 hrs, 20min
post infección las células se trataron con cicloheximida
a una concentración final de e ug/ml con el objeto de ig
pedir la disgregación de los polirribosomas (53, 182), pg
ra ser a las 18 hrs PI lavadas , resuspendidas en RSBy
lisadas con-una mezcla 1:1 de deoxicolato y nonidet NP
HOambos al 10%, obteniendo los polirribosomas de acuerdo
al método descripto por Haevey Trent (53) que se detallaI .. .en metooos x11.
Luegode eliminar los núcleos celulares por centrífuga
ción a baja velocidad, se analizó el sobrenadante que contiene los polirribosomas por ultracentrifugación de velocidad en gradientes lineales de sacarosa lO-k0%disueltaen RSBde acuerdo a (53) (xlii) en un rotor SW27a 22.500
R-139
20 í
-1J15 F o
13
o E'; 1o- E?g aU 2
-1.06 Ésindbis
q Vlrlon5 _ |\
ff. —1.04
\b‘\
s D“0--3“°-'°'-ñ -o_- .-[1.A A * A!
O 5 10 15FRACCIONES
FIGURAV1.6. Aislamiento de polirribosomas por ultracentrifugaciónen gradientes lineales de sacarosa lO-hOfi en RSBdurante 130 minutos a 22500 rpm en un rotor SW27, provenientes de células infectadas con SHF( o ) O de Células sin infectar ( o ).(La flecha indica la posicióndel virión de sindbis purificado analizado simultaneamente.Sedimentaci6n de izquierda a derecha.)
i.V.'1pm durante 130 min a #QC, pudi ndose comparar el perfil
de radioactividad presente en células iniectadas y en cé
lulas sin iniectar en la figura VI-6. AqLÍse puede obsg;
var nítidamente con pico atribuible a polirribosomas deun coeficiente de sedimentación de alrededor de 1HhS
rango observado 1%0a 150 S - respecto a 1a posición a1I o o u o I 'canzada por Virus Sindbis purificado analizado simulta
. . ' .neamente y en gradientes identicos.
A continuación, el material en el pico del gradientecorrespondiente a polirribosomas + unas #5.000 cpm- fue
digerido exhaustivamente con proteinasa K en presencia de
SDSy precipitado con etanol comoya ha sido descripto
(xvi) . 31 pellet se redisolvió en 1 m1 de“THEy se anal;
zó por ultracentrifugación en gradientes de sacarosa 5-20%
en TNE, de manera exactamente igual a como se describió
para la determinación del coeficiente de sedimentacióntiel
RNAdel virión de sar (capítulo ILb) (métodos xvii), cen
trifugando¿imultáneamente 3H-RNAde virus sindbis como egtándard .
El resultado obtenido en esta clase de experimentos pue
de observarse en la figura VI-7, donde a pesar de la pobre
R-lkl
50 ’
30 _
1o *
5 _ SHFRNA
6 _
ÏexEQ.U
4 _ SINDBIS p
RNA ¡Éó, '.
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2 .'ó 5‘
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l 1 l 1 J
o 1o 20 30
FRACCIONES
FIGURA V1.7. Sedimentación del RNAproveniente de polirribosomasobtenidos de células infectadas conSHF ( o ). ( o ): analisis simultaneo de RNAde virus sindbis purificado.
n-1M2
. I a . . . .resoluc1on lograda puede identificarse la presenc1a de una
especie de RNAde tamaño ligeramente mayor que el RNAde
sindbis.
A pesar de que estos experiuentos se realizaron con el
material del pico (figura VI-ó) obtenido mediante un procg
dimiento general de obtención de polirribosomas y cuyo Cog
ficiente de sedimentación coincidió con el esperado para
éstos, antes de sacar alguna conclusión respecto a la natg
raleza del RNApresente y su acción comomensajero en la
síntesis.proteica, se consideró necesario asegurar fehmfiegtemente la naturaleza de la fracción considerada,de manera
de descartar la posibilidad de que el material atribuido apolirribosomas estuviese contaminadoo se tratara de nucleé
capsides de virus SHFaún sin recubrir y presentes en el o;
toplasma de las células infectadas (Ver capítulo I.c).
Estos estudios se basaron en el criterio ampliamente acep
tado de la sensibilidad de los polirribosomas a la presencia
de EDTAo puromicina (52, 53, 3H2) en condiciones tales que
producen la liberación del RNApresente en ellos.
A este fin se infectaron o no células MA-lokcon virus SHF
marcandolas con 3H-uridina en presencia de act.D (iii.a) y
t“atánáolas con cicloheximida #0 min antes de la prepar_
ción de polirribosomas mediante detergentes comose des
cribió en los experimentos anteriores (métodos x11). Luggo de esto el material se dividió en tres partes iguales
- o a . ly fue sometido a distintos tratam1entos, detallados en metodos (xliii).
La primera fracción (E) fue tratada con EDTA10 mM;la
segunda (P) fue diluida 1:1 en buffer de compensación —
Tris-HCl 0,1H pH 7,5, KCl 1My Hg012 0,01M - y tratada con
puromicina 15 min a OQCy 10 min a 3790; y se dejó 1a ter
cera comocontrol sin tratar (C).
Estas 3 muestras, la preparación de polirribosomas corres
pendientes a células no infectadas (H) y virus sindbis puri
ficados, se sembraronen respectivos gradientes de sacarosa
10 a h0% en RSBy se analizaron por ultracentrifugación co. l .. . .mo ya menCionamos (metouos x111).
En la figura VI-8 puede observarse que tanto el tratamieg
to con puromicina (P) comola presencia de EDTA(E), afecta
el pico de radioactividad presentado por la preparación con
trol (C), disminuyendo su magnitud en la forma en que se sa
be afectan a los polirribosomas por disociación del RNApre
'ln
cpmx10
FIGURA VI .8.
IIIl
sindbisvirion
‘o 05-828“4» ¿0.4.2 n _. _J + .¿nTwm+ +O 5 10 15
FRACCIGBS
Sedimentación de polirribosomas de células infectadas con virus SHF,sometidos a tratamientocon Puromicina. ( P ), EDTA( E ) y sin tratar( C (N indica polirribosomas de ccntrolessin infectar y la. flecha la posición ¿el viriónde sindbis.)
sente en los mismos (52, 53, 3k2).
- , .I . .. - _- . . -,VI. d. TraduCCion in Vitro del RSAFenómico del Virus S:F
Llegados a este punto de las investigaciones, eran nu
merosas las evidencias que indicaban que una especie de
RNAde similar tamaño que el encontrado en el virión pu
rificado de SHF, era el RNAmensajero responsable de la
-síntesis de los polipéptidos virales.
Por ésto, se encaró 1a demostración definitiva de lacapacidad del RNA49 S de actuar como el mRNAdel virus
SHF, mediante la demostración de su habilidad en dirigir
la síntesis de proteinas en un sistema libre de células(58,98).
Por la seguridad de ausencia de contaminación con men
sajeros celulares, se prefirió trabajar con el RNAextraido enzimáticamente (xvi) a partir de virus purificado(vii),comose ha mencionadopara la caracterización del nismo(cgpítulo II).
El RNAasi obtenido, fue precipitado con etanol (xvi) y
las muestras (con unos 2 ug) fueron-redisueltas en 20 ul
de acetato de potasio al 25 en agua destilada estéril° Lug
go se analizé su capacidad de estimular la sintesis pro
teica por incubación, con 20 ul de una mezcla de reacción
compuesta de: lisado de reticulocitos de conejo, 358-39
tionina y los 19 aminoácidos restantes sin marcar; duran
te 60 min a 309G en las cantidades y soluciones que se de
tallan en métodosíxliv).
Después de la incubación, se eliminó la interferenciaproducida por la 358- metionina unida a su RNAde trans
ferencia, mediante la digestión de la mezcla de reaccióncon ribonucleasa pancreática (xliv). Esto mejoró enorme
mente la resolución de los polipéptidos producidos - es
pecialmente en 1a zona correspondientes a bajos pesos m9
leculares r cuando a continuación los productos se anal;zaron mediante electroforesis en geles de poliacrilamida
- al 7, 10, 12 o 15% - con SDS, de acuerdo a Laemli (194)
comose detalla en métodos (x1iv.b). Se sembraron también
ribonucleasa A, quimotripsina A, ovoalbúmina, albúmina
bovina, aldolasa, catalasa , ferritina y tiroglobulinacomoproteinas estándares de pesos moleculares: 13,7, 25,
#3, 67, 158, 232, ##Oy 669 kilodaltons respectivamente
(9%,9WL
En la fioura VI-9 puede observarse 1a autorradiografia
P200P91
P45
P29P24
FIGURAV1.9. Electroforesís en gel de poliacrilamida' al'lE 96con sus, de los polipéptidos
sintetizados por un sistema libre de células en presencia de RNAde virus SHF( SHF ), de mRNAde globina ( 'GL ) y enausencia de RNA( NO). (Se muestran también las proteinas estructurales presentes en el virión purificado de SHF(virion)y el peso molecular en kilodaltons de lospolipéptidos específicos observados)
obtenida de uno de tales eXperimentos, donde pueden com
pararse los polipéptidos sintetizados por el RNAdel vi
rus SIF (SH?) con la sintesis endógena del sistema en "g
sencia de RNA(NO) y los productos del reemplazo de RNAde
SHF por mRHAde globina (G1) usados como control negativo
y positivo respectivamente.
Mediante gráficos de Ferguson —log PMen función de la
relación de frente de la proteína_respecto al azul de brgmofenol (3h6, 3%7) - para geles de 7, lO, 12 y 15%de aer;
lamida y los estándares mencionadosrecién,se pudo deterqinar la presencia de proteínas virus-específicas de pesos
moleculares 200, 91, #5, 29 y 2h kilodaltons (P200, P91,
P45, P20 y P2? en la figura), asi comovarias otras de ta
maños intermedios y menorimportancia cuantitativa (indica
das con barras en 1a figura), las cuales en general no co
rresponden a ninguno de los polipéptidos extructurales presentes en el virión de SHFanaliZado simultáneamente (vi
rión).
. . lDiscu51on
Los mRNAbacteriales son usualmente policistrónicos y
las unidades de los ribosomas pueden pegarse directamente
. "l. . ......a secuenc1as nucleotidicas internas a 11n oe 1n1c1ar la
síntesis polipeptidica (177).
La amplia mayoria de los mRHAde organismos superiores pg
recen ser monocistrónicos, es decir, 1a sintesis de polipé_tidos empieza en un sitio único cerca del extremo 5‘ term;
nal (165, 3%8) donde la mayoria de las moléculas posee una
estructura CAP(H, 96), asi como una secuencia de poli A
en el extremo 3‘ (h, 55, 62, 309).
Los mensajeros policistronicos que aparecen en sistemas
eucarióticos por 1a infección de ciertos virus, siguen unade dos estrategias de traducción diferentes: o bien dirigen
la sintesis de un precursor polipéptidico de gran tamaño,el cual es clivado para formar los distintos productos prg
teicos - comoen el caso de los picornavirus (3%9, 177)-;
o se sintetiza una especie de mRNAmás pequeña - como en el
caso del mRHA26 S de células infectadas con alfavirus (183,228)“.
El grupo de los flavivirus - a los cuales el virus SHFI . . .l
podria asemeJarse al menos en su esquema de replicacion -p9.' .
dría ser una excepc1on o estos esquemas generales, al codi
ficar las distintas proteinas virales por un mRNApolicistré
nico único con múltiples sitios internos de iniciación y
terminación (S3, 198), o sinó por un solo sitio de inifia
ción y múltiples sitios débiles de terminación - aunque
recientes experimentos (181, 53) se opondrian a esta á;
tima posibilidad —.
A1 igual que en las infecciones por flavivirus (183,
186), el virus SHFno detuvo la sintesis proteica de 1a
célula.huésped, a1 menosdurante las primeras 12 hrs PI
comoindicarian nuestros experimentos cinéticos de incq;.l . I. . .porac1on de aminoaCidosradioactivos.
El máximode incorporación de aminoácidos en células
infectadas con SHFcoincide con el pico de sintesis de
RHA-según el perfil de incorporación de 3H-uridina (cg
pitulo V.a) - , donde al menos parte del mismodebe ac
tuar comomRLA,La declinación de la sintesis proteica en
las células infectadas - luego de las 12 hrs PI - mientras
prosigue aumentandoen los controles, coincide con lo in
formado por 220 para el virus dengue; mientras que el pe;fil cinético obtenido se diferencia profundamentedel informadopara los alfavirus-(350).
Nuestros estudios del RNApresente en las células infeg
tadas con SEPmediante cromatografía de afinidad a oligo
dT-celulosa, indicarian la presencia de una abundante can
tidad de moléculas poliadeniladas que está ausentes en loscontroles sin infectar. Ésto ocurre cuando en 1a infección
por SEF se estaria en plena etapa de ensamblaje y libera
ción de virus; al mismotienpo que -según se ha informado
en el citoplasma de células infectadas con flavivirus, seestaria completandola sintesis de las proteinas estructgrales del virus (198).
En estos eXperimentos, la única especie poliadenilada
presente correspondió a un RNAde tamaño similar al RNA
encontrado en el virión - que también posee poli A - (ca
pitulo III), siendo la longitud del poli A similar en agbas especies-.
El fragmento de poli A en células infectadas aunque c9
rreSpond16 a un tamaño de unos 75 nucleótidos - similar aRHAV- en las condiciones desnaturalizantes usadas en las
electroforesis, mostró un tamaño bastante más pequeño median
te ultracentrifugacion en condiciones que mentienen la con
formación tridimensional original y los posibles apareamieg
to de bases con secuencias complementarias. Esto sugiere la
posibilidad de que las diferencias entre la forma nativa y
3-152
la desnaturalizada del poli A sean de bastante magnitud
o bien que el fragmento se encuentre formando dúplex con
poli U, comoha sido sugerido para otros Togavirus (303,
306).
Entre las especies de RNAfuncionalmente activas como
RNAmensajero, pudimos identificar la presencia de un RN.
de tamaño similar al genómicoliberado de la fracción co
rreSpondiente a polirribosomas, siendo la identidad de estos últimos verificada según su sensibilidad a puromicina
y EDTA,que además, los diferencia de las nucleocápsides
virales de tamaño algo similar (capitulo I.c) - recordemos
además que las nucleocápsides de SHFeran analizadas por
ultracentrifugación en gradientes de sacarosa preparadoen TNB-.
La identidad del RNAgendmico - poseedor de CAP (capitg
lo IV), aislado de polirribosonas y única especie poliad_nilada en células infectadas en presencia de actinomicina
comoRNAmensajero del virus SHF, fue corroborada por su. . ..... I. . -. I_-_..capaCidad de COGlIlcar la Sintesis de pOLlpepulQOS en un
l
R-153
CONCLUSIONES GENERALES
Estos estudios completarían la informacion existente. . . I . . 'soore las características del Virion de SHF, adJudicandg
le a la partícula un coeficiente de sedimentación de 21h
S y una densidad de 1,18 gm/ml.
n. a. . lSe conïirman los estucios previos de microscopia elegI . I .tronica que sugerian la preseLc1a de un core electroden
. . I . so, al aislar rcproduc1blemente la nucleocap31de de SfiF. .i . ...
en una p05101on correspondiente a un tamano de 170 S y- . - .I
una cen51dao 1,33gm/m1. Ya que la obtenCion de la nuclegl - - _ ' W. :1: 1 .‘cap31de no involucra perdida de urlulna marcada, parecaua
estar concucst: por la totalidad del RNAviral, al que co. c - , . ..Irrcsponaeria alreuee r del 8h de la masa total del Vlrlon,
...-, l. .. . .-.La son51bilixao espeCifica de; core a ribonucleasa, indica
n-w- o ..' -'. n -\ lla neceSLQac de una dispOSiCion topOlogica adecuada de RH
l .I . Iy pI‘OoelïlCS para la aCClOÏl enZL-natica.
peso molecular de 5,5 X lO6 en condiciones desneturalizanves o
R-lsh
La dependencia de su coeficiente de sedünentación con
la fuerza iónica del medio, su sensibilidad a ribonucleg
sa y una densidad de 1,63 gm/ml indican que el genomadel
virus SHF consiste en un RNAde hebra simple de unosJEQOOO
nucleótidos de longitud.
Encontramos que a1 igual que el RNAde otros Togavirus,
el RNAde SHFposee una secuencia de poliadenina -capaz de
hibridizarse especificamente a oligo dT-celulosa y a poli U
en aproximadamente el ¿OS de las moléculas presentes en los
viriones purificados. Ambasclases de moléculas de RIA - _Q
li A (+) y poli A (-) - mostraron tamaños similares en con
diciones desnaturalizantes.
.íios permiten asignarle a la secuencia ¿013;
denilada del RIA presente en cl virión de SHF, un coeficieg
te de sedimentación de alrededor de 3 S y un tamaño - en con
(¿ciones desnaturalizantes - de unos 80 nucleótidos. Además,
esta secuencia estaria compuesta exclusivamente por nucleotidos de adenosina.
En el otro extremo, el RNAde SHF presentó un CAPde es. - Í .tructura m7G(5')ppp(5')Amppero no mostró metilac1on interna
fuera de esa estructura.
3-155
La ausencia de un RNAintermediario de 26 S en células
infectadas con virus SHFdescarta un mecanismode replica
ción viral similar al de los alfavirus, indicando que lasúnicas especies virales en células infectadas poseen un tg
maño similar al del virion. Aunqueaparecen también un par
de especies especificas de RNAde cadena simple con tamaños
correspondientes a 115 y 10%nucleótidos, su función es desconocida.
La ausencia de intermediarios de doble cadena sugiere. . I 1 - p .que la duplicaCion del RNApodria ocurrir en la forma de vg
rios trozos de RÏA (+) naciente unidos sucesiVamente a la
matriz de RNA(-).
El proceso de traducción proteica en SHFinvolucraria una
sola especie de ¿NAmensajero de un tamaño similar al genóa;
co. Esta especie pudo detectarse en polirribosomas de células
iniectadas y una apreciable población de la mismamostró po
seer una secuencia de poli A de tamaño similar a la del REA. .Ien el Virion.
. l . . . ' Estos Xperinentos, aSi comoel aislamiento oe una unica- . .- . l... ueSpeCie oe RNAVirus-espeCiiico capaz de actuar como mRnAenI ... , _ .. .. ,- .las celulas iniectacas con un tamano Similar al RMAdel V1
R-156
rión purificado, indican que ésta última - poseedora deCAPy poli A - o sus copias sintetizadas en la célula in
fectada, seria el RNAmensajero del virus SHF, lo cual
fue corroborado por su capacidad de sintesis polipeptídica en un sistema libre de células.
Podemosasi visualizar el proceso general de replica
ción de SHFde la siguiente manera: luego de un período
de unas 10 hrs PI (para 1a multiplicidad de infección usa
da) en el cual presumiblementela partícula infecciosa
sea desarmada y el RNAviral codifique las primeras cqfias
de enzimas necesarias, se produce una fase de rápido aunen
to en la sintesis de nuevo RNAcorrelacionada por el aune;
to de intermediarios con regiones de doble hebra. En esta
etapa debe ocurrir la traducción de un buen número de mRÏA
virales, evidenciado por la abundante cantidad de especies
poliadeniladas y el aumentologaritnico de particulas infegtivas maduras en el medio de cultivo. La simultaneidad de
estos últimos eventos indicarian que la maduración, ensamblaje y liberación de virus debe ser un proceso bastanterápido.
. . . iFinalmente luego de unas 20 hrs PI ocurre la declinac1onI. . . .i l . e?cel proceso con disminuCion de la SinteSis de RnAy protei
R-157
. . . . I . . .nas, así como la crunï1112nc1on de la 1nfcct1v1dad en c1
audio de cultivo, lo nun inflica el ceso de la libcración
virus, coincifl nte con un profundo daño celular.
Todos estos estudios hacen que cl virus SHF, de sercasi desconocido a nivel molecular se convierta en uno
de los Togavirzs mejor caracterizados, lo que es de esgg
rar ayuda 2 resolver algunos de lou interrogantes planteg
dos sobre las peculiarida es de la infección de este vi: 1rus - y quizus dc otros en mastintas especies animales.
WM. .. . . .- IT, -‘,_.'__.Jr. uanoth Grhvcll ¿ong uuLS Da-TlpdntlL)
1.2.
3.4
5
6.
7.
9.
10.
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1
lá.16.17.
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