Estudios de fotólisis e hidrólisis de metrafenona · combatir plagas de forma rápida y ... MINERALES Sales de cobre Compuestos arsenicales ... x Establecer medidas para el control

Diego-Augusto Cilla García

Estudios de fotólisis e hidrólisis de metrafenona

María Teresa Martínez Soria y Jesús Sanz Asensio

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informática

Máster en Química Avanzada

2012-2013

Título

Autor/es

Director/es

Facultad

Titulación

Departamento

TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Curso Académico

© El autor© Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2013

publicaciones.unirioja.esE-mail: [email protected]

Estudios de fotólisis e hidrólisis de metrafenona, trabajo fin de estudiosde Diego-Augusto Cilla García, dirigido por María Teresa Martínez Soria y Jesús Sanz

Asensio (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una LicenciaCreative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.

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Estudio de Fotólisis e hidrólisis de Metrafenona

Diego Augusto Cilla García

Máster en Química Avanzada Tutora: María Teresa Martínez Soria

Septiembre 2013

Estudio de fotólisis e hidrólisis de Metrafenona

Agradecimientos

Quiero agradecer, en primer lugar a mi tutora Mayte el haberme dado la oportunidad de realizar esta labor de investigación, por apoyarme, darme todas las facilidades posibles y ayudarme a lo largo del proceso.

A Nines y Ernesto por todo lo que me han enseñado durante estos meses, por lo que me han ayudado y todo el tiempo que me han dedicado a explicarme los programas, a resolver mis dudas… pero sobre todo me quedo con su paciencia, con su naturalidad, con su cercanía.

A mis compañeros de Laboratorio: Lara, Elvira, Pilar, Cristina, Josué por los buenos momentos que me llevo de todos ellos; pero en especial gracias a Elena y Marivel ya que hemos estado juntos desde el principio, nos hemos apoyado a lo largo del camino. Y no me olvido de José Miguel, gran persona, amigo, compañero. Gracias por su paciencia, por su ayuda (que ha sido mucha y lo sabe), por sus consejos, porque siempre estaba ahí con una sonrisa y eso facilita las cosas.

Al servicio de laboratorios: Txino, Amaia, y demás personal por la ayuda ofrecida.

A mis amigos por estar ahí en todo momento, y darme su total apoyo.

Pero sobre todo gracias a mis padres, Julia y Diego, sin los cuales yo no estaría ahora aquí escribiendo esto. Gracias por haberme enseñado a estudiar, a esforzarme desde pequeño, a ser una persona responsable. Gracias por haberme dejado la mejor herencia que a parte de la Carrera Universitaria son todos los consejos que me han dado a lo largo de todos estos años y eso es lo que en realidad me sirve en esta vida. Os quiero.

Resumen

En los últimos años, el uso de productos químicos en el mundo rural ha aumentado de forma considerable. El fin de estos productos (plaguicidas) no es otro que el control de plagas y enfermedades ya que estas afectan al rendimiento de la cosecha y a la pérdida de la misma.

Este uso, que en principio debería ser preventivo, en muchos casos no es correcto; y aparecen restos de plaguicidas en muchos alimentos al finalizar la cosecha. Esto implica que estas prácticas agrícolas hayan generado un problema de contaminación ambiental que compromete tanto a los ecosistemas como a la salud pública.

Los plaguicidas se acumulan en las aguas superficiales y subterráneas, entran a formar parte de la cadena trófica, pueden generar metabolitos incluso más tóxicos que los propios plaguicidas y a determinadas concentraciones, por ejemplo en el vino, pueden generar la aparición de malos olores y sabores o alterar de la actividad de las levaduras.

Ante esta problemática, conviene hacer estudios de de plaguicidas en laboratorio para conocer su evolución a lo largo del tiempo, sus vías de transformación, sus productos de degradación, su estabilidad, etc., en condiciones naturales.

En este trabajo se ha estudiado la fotodegradación y la hidrólisis a diferentes temperaturas y pH del plaguicida Metrafenona. Estas dos degradaciones son dos de los procesos de degradación más importantes que pueden ocurrir en el medio ambiente.

Metrafenona es un plaguicida de la familia de la benzophenone que actua controlando las enfermedades de Mildiu y Oídio, dos enfermedades muy comunes en el cultivo de la vid.

La técnica analítica empleada en estos estudios de degradación fue cromatografía líquida, con detector de red de diodos y con detector de espectrometría de masas.

La degradación de Metrafenona se realizó tanto en matriz acuosa como en mosto partiendo en ambos casos de disoluciones hidroalcohólicas de concentración 12 mg.L-1 de Metrafenona.

Índice

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN 11

1.1. Plaguicidas 13

1.1.1. Definición 13

1.1.2. Clasificación 14

1.1.3. Legislación internacional de residuos de plaguicidas en productos vegetales

15

1.1.4. Efectos de los plaguicidas en el hombre 16

1.1.5. Efectos en la vid y en el proceso de elaboración del vino. 16

1.2. Metrafenona 20

CAPÍTULO 2. OBJETIVOS 23

CAPÍTULO 3. DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS 27

3.1. Problemática ambiental 29

3.2. Degradación de plaguicidas 30

3.2.1. Tipos de degradación 30

3.2.2. Medios 31

3.2.3. Tipos de rupturas 32

3.3. Determinación e identificación de productos de degradación 33

3.4. Cinética de degradación. Ecuación de velocidad 34

CAPÍTULO 4. REACTIVOS, INSTRUMENTACIÓN Y MATERIAL 35

4.1. Reactivos y disoluciones 37

4.2. Instrumentación 38

4.3. Materiales 40

CAPÍTULO 5. DESARROLLO DEL MÉTODO 41

5.1. Estudios previos 43

5.1.1. Selección de longitud de onda 43

5.1.2. Selección del filtro para cromatografía liquida 44

5.1.3. Selección de la relación MeOH:H2O 46

5.2. Condiciones cromatográficas 47

5.3. Características analíticas del método 52

5.3.1. Calibración 52

5.3.2. Limite de detección y limite de cuantificación 53

5.3.3. Selectividad 54

5.3.4. Precisión 55

CAPÍTULO 6. ESTUDIO DE FOTÓLISIS E HIDRÓLISIS DE METRAFENONA 57

6.1. Fotólisis 59

6.1.1. Evolución de la materia activa 60

6.1.2. Cinéticas de fotodegradación de Metrafenona 61

6.1.3. Identificación de los productos de degradación en el proceso de fotodegradación

63

6.1.4. Evolución de los productos de degradación en el proceso de fotodegradación

82

6.2. Degradación hidrolítica/térmica 85

6.2.1. Evolución de Metrafenona en el proceso de degradación 86

6.2.2. Productos de degradación de la hidrólisis 87

CAPÍTULO 7. REACTIVIDAD DE METRAFENONA CON COMPUESTOS NITROGENADOS

89

6.1. Ciclo del nitrógeno 91

6.2. Legislación sobre nitratos y nitritos 93

6.3. Reactividad de Metrafenona con compuestos de nitrógeno 94

CAPÍTULO 8. CONCLUSIONES 99

CAPÍTULO 9. BIBLIOGRAFÍA 103

ANEXO I. CINÉTICAS DE DEGRADACIÓN DE METRAFENONA 107

CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN

INTRODUCCIÓN CAPÍTULO 1

13

1.1. Plaguicidas

1.1.1. Definición

Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), un pesticida o plaguicida es cualquier sustancia o mezclas de sustancias, de carácter orgánico o inorgánico, que está destinada a combatir insectos, ácaros, roedores y otras especies indeseables de plantas y animales que son perjudiciales para el hombre o que interfieren de cualquier otra forma en la producción, elaboración, almacenamiento, transporte o comercialización de alimentos, producción de alimentos, productos agrícolas, madera y productos de madera o alimentos para animales, también aquellos que pueden administrarse a los animales para combatir insectos arácnidos u otras plagas en o sobre sus cuerpos.

El término plaguicida incluye también los siguientes tipos de sustancias: reguladores del crecimiento de las plantas, defoliantes, desecantes, agentes para reducir la densidad de la fruta, agentes para evitar la caída prematura de la fruta y sustancias aplicadas a los cultivos antes o después de la cosecha, para proteger el producto contra el deterioro, durante el almacenamiento y transporte.

El empleo de plaguicidas ha sido beneficioso en el campo de la agricultura a la hora de combatir plagas de forma rápida y eficaz, pero también tienen una vertiente negativa al resultar tóxicos para las personas y contaminar el medio ambiente.

Por ello, el estudio sobre los plaguicidas, su persistencia, su eliminación y sus productos de degradación es actualmente una rama de investigación en auge ya que incluso los productos de degradación pueden presentar mayor toxicidad que los propios plaguicidas.


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1.1.2. Clasificación

Según la especie a combatir se establece la siguiente clasificación:

Tabla 1. Clasificación de plaguicidas según la especie a combatir.

INSECTICIDAS MINERALES O INORGÁNICOS

MINERALES

Compuestos arsenicales Compuestos fluorados

Azufre Derivados del selenio

ORGANICOS DE SINTESIS Organofosforados

Organoclorados Carbamatos

A BASE DE ACEITES MINERALES Aceites antracénicos Aceites de petróleo

DE ORIGEN VEGETAL Nicotina

Piretrina Rotenona

HERBICIDAS

MINERALES Sales de NH4+, Ca2+, Cu2+, Fe3+, Mg2+, K+, Na+, en forma de sulfatos, nitratos, cloruros, cloratos.

ORGANICOS

Fitohormonas Derivados de la urea Triazinas y Diazinas

Derivados de los fenil sustituidos y las quinoxalinas Derivados de la oxiquinoleína

Derivados de las tiadizinas y tiadiazoles

OTROS Parquat

Diquat Piclorame

FUNGICIDAS

MINERALES Sales de cobre

Compuestos arsenicales Aceites minerales

ORGANOMETALICOS Derivados órganomercuriales

ORGANICOS

Carbamatos y ditiocarbamatos Derivados del benceno

Amicidas Benzonitrilos

RODENTICIDAS Derivados cumarínicos Warfarinas

Sales de talio Inorgánicos

Insecticida mineral o inorgánico: la especie que se quiere combatir son insectos

Herbicidas: Atacan las malas hierbas

Funguicidas: Tóxico para hongos. Dentro de los fungicidas se encuentran los derivados del benzeno, que son compuestos orgánicos. Es, en este grupo, donde se encuentra clasificado el producto de estudio Metrafenona.

Rodenticidas: Causan la muerte a ratones y otros roedores


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1.1.3. Legislación internacional de residuos de plaguicidas en productos vegetales

La legislación española sobre plaguicidas surge con motivo de la transposición de la Directiva 78/631/CEE, de 26 de junio de 1978, del Consejo, junto con las sucesivas modificaciones posteriores y queda regulada principalmente por el Real Decreto 3349/1983, de 30 de noviembre de 1983, por el que se aprueba la Reglamentación Técnico Sanitaria (RTS) para la fabricación, comercialización y utilización de plaguicidas y el Real Decreto 162/1991, de 8 de febrero de 1991, por el que se modifica la RTS anterior.

No obstante, en el año 1999 se publicó una nueva Directiva, la 1999/45/CE, del Parlamento Europeo y del Consejo, 31 de mayo de 1999, sobre la aproximación de las disposiciones legales, reglamentarias y administrativas de los Estados miembros relativas a la clasificación, el envasado y el etiquetado de preparados peligrosos que incluye dentro de su ámbito de aplicación a los plaguicidas excluidos anteriormente.

Los objetivos principales que persigue este conjunto de regulaciones son los siguientes:

Definir claramente lo que se entiende por plaguicidas o productos fitosanitarios.

Establecer las normas para su fabricación, almacenamiento, comercialización y utilización así como su clasificación en todo lo referente a la salud pública.

Fijar las bases para establecer límites máximos de residuos (LMRs) admitidos en o sobre productos destinados a la alimentación.

Establecer las disposiciones con el fin de autorizar la ejecución de ensayos y experiencias con fines de investigación o desarrollo efectuados con productos fitosanitarios cuando impliquen su vertido en el medio ambiente.

Establecer medidas para el control efectivo de todos estos productos y de las sustancias activas de que se forman.

Actualmente están establecidos los LMRs de todos los países de la Union Europea (UE) en virtud de los Reglamentos que contienen los anexos II, III y IV del Reglamento 396/2005.

El anexo II recoge los LMRs ya establecidos mientras que el anexo III recoge los LMRs temporales para aquellos plaguicidas que, hasta ahora, no tienen LMRs establecidos.


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1.1.4. Efectos de los plaguicidas en el hombre

Los plaguicidas pueden entrar en el cuerpo por varias vías:

Dérmica. Esto ocurre cuando los brazos, las manos, la cara, el tronco, el cuello o los ojos entran en contacto con el plaguicida.

Nasal. El plaguicida entra por las vías respiratorias. Oral. Si el plaguicida se ingiere.

Algunos de los síntomas que se dan en el ser humano son:

Intoxicación Aguda: Rápida aparición de síntomas por una única exposición. Ejemplos son: excesiva sudoración de la piel, mareos, confusión, visión borrosa, vómito, diarrea, ardor en los ojos, pupilas del tamaño de un alfiler…

Intoxicación Crónica: Se observa a largo plazo; resultan de la exposición repetida. Algunos ejemplos son: pérdida del apetito, alteraciones del sueño, depresión, temblores, cáncer, dolores de cabeza, esterilidad en el hombre, problemas en el embarazo…

1.1.5. Efectos en la vid y en el proceso de elaboración del vino

El control de las plagas y enfermedades de la vid constituyen, junto con la poda y la fertilización, los pilares en los cuales se sustenta una producción vitícola rentable. De nada vale un eficaz combate de las malezas, un esmerado trabajo del suelo, una correcta fertilización o un sistema de poda racional, si se descuida la sanidad de las cepas.

La aparición de plagas y enfermedades son responsables en muchos casos, no sólo de la disminución en el rendimiento de una cosecha, sino también de la pérdida total de la misma.

Entre las principales plagas y enfermedades que afectan al cultivo de la vid cabe destacar, por su importancia y repercusión económica:

Plagas: insectos, ácaros, nematodos. Enfermedades:

o Debidas a hongos: Oídio y Mildiu o Debidas a bacterias: las podredumbres (en especial la ácida).


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Ello obliga al agricultor a utilizar los medios necesarios para la defensa de sus cepas.

Utiliza de forma preferente los productos químicos de manera preventiva, en fechas casi siempre predeterminadas y respetando el plazo de seguridad. Si estos plazos de seguridad establecidos para cada materia activa no fueran respetados, podría implicar la presencia de residuos de plaguicidas en la vendimia y consecuentemente en el mosto, tras la realización de los procesos de estrujado, prensado, etc.

A determinadas concentraciones, sobre todo en el caso de los fungicidas, pueden provocar efectos indeseables en el vino como son, entre otros, la aparición de malos olores y sabores (efecto directo) o alteración de la actividad de las levaduras (efecto indirecto).

A continuación se realiza una descripción de cada una de las enfermedades más características que se pueden dar en los campos de viñedo de la Denominación de Origen Calificada Rioja:

Mildiu (Originada por el hongo Plasmopora vitícola)

Descripción: o El mildiu es una enfermedad que ataca todos los órganos verdes de

la vid: hojas, zarcillos, ramas jóvenes y racimos antes del cambio de color.

o Hojas: En primavera, los filamentos del hongo micelio avanzan entre las células y producen las «manchas de aceite»; estas manchas amarillentas, ligeramente traslúcidas, se cubren a continuación, en el envés de la hoja, de un polvo blanquecino (figura 3).

o Racimos: Antes o durante la floración, los ataques se traducen por un corrimiento parcial o total de las flores acompañado por un pardeamiento progresivo del pedúnculo (rama) del racimo joven. El grano se vuelve vulnerable como se ve en la figura 3.

Daños: o Los ataques en hoja son muy graves y pueden traducirse por una

defoliación prematura. o Las uvas mal alimentadas producen un vino de mala calidad. o Los mostos de los granos alcanzados por ataques tardíos son ácidos y

los vinos obtenidos se conservan mal. Medidas preventivas/culturales:


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o Manejo adecuado de la ventilación. o Poda de hojas con síntomas de enfermedad o Abonado nitrogenado equilibrado.

Daños en hojas Daños en frutos Figura 3. Daños en uvas y hojas por Mildiu.

Oídio (Originada por el hongo Erysiphe necátor)

Descripción: o En la época del desborre, los filamentos del hongo contenidos en las

yemas se desarrollan y contaminan los órganos verdes jóvenes. Se observa entonces un rizado ligero en el borde de las hojas jóvenes, que toman un aspecto arrugado, y la formación de manchas difusas de un gris apagado como se puede ver en la figura 2.

o Una invasión muy precoz puede también producir la aparición de brotes totalmente blanquecinos.

o Sobre los sarmientos se forma el mismo polvo grisáceo. Las flores pueden también ser contaminadas, para secarse y caer posteriormente.

o Los granos se cubren a su vez de un polvo blancuzco (fig. 2); su piel se endurece, se agrieta y acaba por romperse.

o En otoño y durante el invierno Se pueden observar durante esta época manchas sobre la madera, debidas al Oídio.

Daños: o Los daños más graves se producen sobre el racimo: los granos

pequeños se secan y caen.


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o En un estado más avanzado la rotura de la película de los granos permite los ataques de la podredumbre y de hongos. Altera la calidad de los vinos obtenidos. Reduce fuertemente la cosecha.

Medidas preventivas/culturales: o Sistemas de conducción que permitan una buena circulación de aire

y prevengan un sombreo excesivo. o Abonado nitrogenado equilibrado.

Daños en hojas Daños en frutos

Figura 2. Daños en uva y hojas por Oídio

Podredumbre Gris (Originada por la bacteria Botrytis cinérea)

Descripción: o El hongo inverna en madera enferma o en la corteza del tronco. o Las condiciones climatológicas óptimas para el desarrollo de esta

enfermedad son: temperatura entre 15 y 20ºC y una humedad relativa del 90%.

Daños: o En las hojas se producen lesiones pardo rojizas que a menudo se

localizan en los bordes como se observa en la figura 1. o Las vallas afectadas toman un color marrón y se cubren de un polvo

grisáceo (fig. 1). La calidad del vino queda muy afectada (perdida de color, reducción del grado e incremento de acidez volátil).

Medidas preventivas/culturales: o Sistemas de conducción que permitan aumentar la aireación y la

exposición de los racimos al sol. o Deshojado de las zonas próximas al racimo.


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Daños en hojas Daños en frutos

Figura 1. Daños en uvas y hojas por podredumbre gris.

1.2. Metrafenona

En este trabajo se ha estudiado la materia activa Metrafenona que actúa como fungicida y pertenece a la familia química de la benzofenona.

La fórmula química de este compuesto es 3'-bromo-2,3,4,6'-tetramethoxy-2',6-dimethylbenzophenone, y su estructura química se detalla en la tabla2 junto con las propiedades físico-químicas más relevantes del compuesto. Cabe destacar la baja solubilidad que presenta en agua (0.492 mg.L-1).

Tabla 2. Propiedades físico-químicas de Metrafenona Descripción general Fungicida utilizado para controlar Mildiu y Oídio

Introducción 2006 Grupo Químico Benzophenone

Fórmula Química C19H21BrO5 3'-bromo-2,3,4,6'-tetramethoxy-2',6-dimethylbenzophenone

Estructura Química

Peso Molecular 409.3 g.mol-1

Estado físico Sólido cristalino Punto de Fusión 100ºC

Punto de Ebullición Se descompone antes de la ebullición Punto de Degradación 310ºC

Coeficiente octanol-agua pH=7, 20ºC Log P= 4.3

Densidad 1.45 g. mL-1 Presión de vapor 25ºC (mPa) 0.153 LMR (mg.Kg-1) Reglamento

396/2005 en vid 5.0

Solubilidad en H2O (mg.L-1) 0.492 Solubilidad en MeOH (mg.L-1) 26100


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Este compuesto actúa controlando las enfermedades de Mildiu y Oídio (enfermedades más importantes que afectan a la vid).

En la bibliografía consultada se estudia el efecto de la materia activa Metrafenona sobre el hongo Oídio de la cebada y trigo.

Metrafenona es absorbida y transportada con la sabia reduciendo la proliferación del hongo y bloqueando su desarrollo; además penetra a través de la cutícula foliar y se acumula en los tejidos causando el debilitamiento de la pared celular y reduciendo fuertemente la esporulación.

Sin embargo no se ha encontrado referencias sobre su determinación o la identificación de productos de degradación de este fungicida.


22

CAPÍTULO 2. OBJETIVOS

OBJETIVOS CAPÍTULO 2

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Una vez dispersados en el medio, los plaguicidas sufren alteraciones en su estructura. Los procesos de transformación están influidos por distintos factores como temperatura, intensidad y duración de la luz solar, pH o composición del agua. La degradación bajo condiciones favorables, tiene lugar hasta la mineralización completa del pesticida, dando como productos finales CO2, H2O, NH4

+, NO3-, SO4

2-, etc., dependiendo de cada pesticida en particular. Pero en muchas ocasiones, esta transformación no es total sino que el pesticida es degradado a otros productos cuya toxicidad y persistencia puede ser mayor que la de la materia activa.

Por lo tanto, es necesario llevar a cabo estudios de laboratorio sobre la degradación de pesticidas, para obtener información sobre sus principales vías de transformación en condiciones naturales, así como estudios para identificar los metabolitos.

En sistemas acuosos los procesos abióticos de degradación principales son la degradación química y la fotodegradación. Las reacciones de degradación química más importantes son las de hidrólisis, que puede tener lugar en condiciones tanto ácidas como básicas. Dado que el pH en aguas naturales oscila entre 5 y 9, la hidrólisis es un proceso de menor importancia en aguas superficiales, aunque puede ser una vía importante de degradación de pesticidas en aguas subterráneas, donde la fotodegradación prácticamente no tiene lugar.

Para plaguicidas con baja solubilidad en agua se hace necesaria la adición de disolventes orgánicos para incrementar dicha solubilidad.

En este estudio, se ha trabajado con el fungicida Metrafenona.

Así, se plantean como objetivos generales:

I. Desarrollar una metodología cromatográfica para realizar el estudio de determinación de Metrafenona y de identificación de sus posibles productos de degradación.

II. Degradación fotolítica de Metrafenona en diferentes medios: ácido (pH 2.0, 3.6), neutro (6.0) y básico (pH 9.0 y 12.0), a temperatura ambiente, y en mosto.

III. Degradación hidrolítica de Metrafenona en diferentes medios: ácido (pH 2.0, 3.6), neutro (6.0) y básico (pH 9.0 y 12.0) a diferentes temperaturas (4ºC, 23ºC, 50ºC)

IV. Evaluación de la persistencia de Metrafenona y de sus productos de degradación.

V. Identificación de los metabolitos generados.

OBJETIVOS CAPÍTULO 2

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CAPÍTULO 3. DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS

DEGRADACIÓN DE PLAGUICIDAS CAPÍTULO 3

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3.1. Problemática ambiental

El incremento en la producción y uso de compuestos químicos en los últimos cien años ha dado origen a una preocupación creciente sobre el efecto que dichos compuestos pueden tener sobre los ecosistemas terrestre y acuático (Figura 4). Debido a sus características químicas, los plaguicidas son contaminantes persistentes que resisten en grado variable la degradación fotoquímica, química y bioquímica, por lo que su vida media en el ambiente puede ser elevada [1-3]. La aplicación de plaguicidas sintéticos ha sido una práctica rutinaria en la agricultura en los últimos cincuenta años. El uso indiscriminado que en el pasado se ha dado a estos compuestos, ha producido que en la actualidad se detecten residuos de estos en el ambiente y se asocien con riesgo potencial a la salud pública [4].

Figura 4. Procesos que afectan a los plaguicidas en el medio ambiente

Actualmente los residuos de estos plaguicidas han sido identificados en aire, agua y suelo, en todas las regiones geográficas incluyendo aquellas muy remotas al sitio original de su liberación ambiental, como océanos, desiertos y zonas polares; e igualmente se ha demostrado su presencia en organismos de todos los niveles tróficos, desde el plancton hasta las ballenas y los animales del ártico.

Estos compuestos se bioacumulan en numerosas especies y se han biomagnificado a través de las redes tróficas del mundo. Los seres humanos no están exentos de esta


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contaminación. Por ello el estudio de los plaguicidas y de sus productos de degradación supone de gran importancia.

3.2. Degradación de plaguicidas

Cuando un plaguicida es liberado en el medio ambiente interacciona con los componentes bióticos y abióticos de éste, sufriendo transformaciones en su estructura.

La degradación puede ser parcial (generando metabolitos que pueden presentar incluso una mayor toxicidad que el propio plaguicida) o total, llegando en algunos casos a la obtención de compuestos inorgánicos como H2O, CO2, haluros, amonio, fosfatos, etc. [5]

Por lo tanto, es necesario llevar a cabo estudios de laboratorio sobre la degradación de pesticidas en el medio ambiente, para obtener información sobre sus principales vías de transformación en condiciones naturales, sus productos de degradación, su estabilidad, su evolución a lo largo del tiempo, así como estudios para determinar la toxicidad de los productos de transformación.

3.2.1. Tipos de degradación

Las reacciones por las que un plaguicida puede degradarse son diversas. Las más importantes son las siguientes:

I. Degradación térmica: Se produce la ruptura de enlaces como consecuencia del aumento de la temperatura. Tanto si hablamos de fotodegradación como de degradación térmica, los mecanismos fundamentales de degradación de plaguicidas están basados en los mismos principios. La única diferencia es que la fotodegradación tiene lugar a una velocidad más rápida que la degradación térmica.

II. Fotodegradación: Ruptura de enlaces químicos en presencia de la radiación, generalmente ultravioleta. Las fuentes de luz y su intensidad regulan el grado de descomposición de un compuesto. Existen dos tipos: fotólisis y fotocatálisis [6-7] (en esta última se añade un catalizador para el comienzo de la reacción).


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III. Biodegradación: Efectuada por la acción de los microorganismos sobre los plaguicidas. Es probablemente el mecanismo de descomposición más importante. Bacterias, algas, hongos, obtienen alimento y energía para su crecimiento por descomposición de estos compuestos orgánicos sobre todo cuando carecen de otras fuentes. Puede llegarse a la mineralización completa del plaguicida. La velocidad de degradación de este proceso depende del pH (ideal entre 6-9), la temperatura y la humedad.

IV. Degradación química: Tienen lugar procesos de oxidación, reducción, hidrólisis y procesos de ruptura de enlaces. Se mencionan los más notable:

o Oxidación: Entre los oxidantes más habituales se encuentran el dióxido de cloro, peróxido de hidrógeno, y el ozono. Pueden oxidar plaguicidas hasta su eliminación total en forma de moléculas inorgánicas.

o Hidrólisis: Este proceso viene determinado por la reacción del plaguicida con el agua con ruptura de enlaces. Depende estrechamente del pH.

En sistemas acuosos los procesos abióticos de degradación principales son la degradación química y la fotodegradación [8]. Las reacciones de degradación química más importantes son las de hidrólisis, que puede tener lugar en condiciones tanto ácidas como básicas.

Dado que el pH en aguas naturales oscila entre 5 y 9, la hidrólisis es un proceso de menor importancia en aguas superficiales, aunque puede ser una vía importante de degradación de pesticidas en aguas subterráneas, donde la fotodegradación prácticamente no tiene lugar.

Este trabajo se centra en la degradación hidrolítica/térmica y en la fotólisis del plaguicida Metrafenona, en laboratorio a diferentes condiciones.

3.2.2. Medios

Cuando un plaguicida se aplica al campo, bien en forma de pulverización o en forma líquida, se distribuye en las distintas fases del medio ambiente donde se puede degradar:

o Suelo: debido a procesos de adsorción en el suelo tiene lugar principalmente la degradación química y la fotodegradación.


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o Agua superficial y subterránea: por procesos de escorrentía o lixiviación se dan lugar procesos de hidrólisis y fotodegradación.

o Aire: por volatilización del plaguicida la principal vía de degradación es la fotodegradación.

o Plantas: por absorción y degradación microbiológica tiene lugar la biodegradación y la degradación química.

3.2.3. Tipos de rupturas

La facilidad de degradación de un plaguicida depende de su estructura molecular.

En la fotodegradación los enlaces que se ven afectados especialmente por la radiación son aquellos que tienen los grupos -OH, -SH, C=O, -X (X=Cl, Br), -N=, C-H, N-H, así como dobles enlaces, sobre todo si están conjugados.

En la hidrólisis los procesos más frecuentes de reacción que se dan [9] son los que se muestran en la figura 5:

Figura 5. Mecanismos de reacción química frecuentes


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3.3. Determinación e identificación de productos de degradación.

En todo proceso de degradación es necesario conocer en cada momento el grado de eliminación del producto de degradación. Esta información se obtiene a partir de análisis químicos que permiten conocer la concentración del compuesto y la aparición de nuevos iones.

Una completa caracterización de los procesos de degradación requiere la identificación de los principales productos de transformación generados en el transcurso de los mismos.

La determinación analítica, cuantitativa y cualitativa, de los productos de degradación es una tarea que requiere de la aplicación de técnicas sofisticadas como la espectrometría de masas (MS), generalmente acoplada a equipos de cromatografía de líquidos (LC) o gases (GC), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) o la espectroscopia de infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) (Amalric et al., 1995).

A continuación se detallan las más utilizadas en el estudio de degradación de productos fitosanitarios [10]: o Espectrometría de masas (MS): Se basa en la producción de iones a partir de

moléculas neutras y en el examen de la posterior descomposición de estos iones. Los iones obtenidos para cada sustancia son característicos y pueden proporcionar información cualitativa y cuantitativa de la misma a la vez que información estructural. Posee una gran sensibilidad.

o Cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS): Es la herramienta de análisis más frecuente para la identificación de productos de degradación. Las ventajas más importantes de los métodos basados en la GC-MS son su alta sensibilidad y eficiencia de separación, y su elevado potencial de identificación.

o Cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas (LC-MS): En los últimos años se ha convertido en una herramienta de gran utilidad en la determinación de compuestos de degradación. Pese a que esta técnica ofrece menor resolución y limitada información estructural, en comparación con la GC-


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MS, presenta sin embargo, importantes ventajas como son: mayor facilidad para analizar compuestos polares, de escasa volatilidad y térmicamente inestables, y la posibilidad de realizar el análisis directo de las muestras evitando así las pérdidas derivadas del proceso de extracción.

3.4. Cinética de degradación. Ecuación de velocidad.

Las reacciones de degradación de pesticidas pueden seguir cinéticas de distintos órdenes. Pero, de forma más general, se ajustan a mecanismos de reacción de primer orden; ecuación 1:

tkdtdc . (ecuación 1)

Donde c (mg.L-1) es la concentración de plaguicida a degradar, k (s-1) es la constante de velocidad de primer orden, y t (s) el tiempo de exposición al proceso degradativo.

Se puede relacionar la constante de degradación con el tiempo de vida medio (t1/2) que indica la estabilidad del compuesto a través del tiempo; ecuación 2:

kt 2ln2/1

(ecuación 2)

En las fotodegradaciones con luz solar, la comparación del tiempo de vida media con otros valores indicados en la literatura se debe hacer con cautela, ya que varía con la estación del año, hora, latitud, etc. En las fotodegradaciones con lámpara de Xenón, la comparación de los tiempos de vida media se puede hacer más fácilmente y de una manera estandarizada.

CAPÍTULO 4. REACTIVOS, INSTRUMENTACIÓN Y MATERIAL

REACTIVOS, INSTRUMENTOS Y APARATOS CAPÍTULO 4

37

4.1. Reactivos y disoluciones

La materia activa objeto estudio, Metrafenona, fue proporcionada por la casa comercial Riedel-de-Häen (Seelze, Germany) con una pureza superior al 99%. En la tabla 3 se detallan los reactivos y disolventes con el grado de calidad utilizados en este proyecto. Tabla 3. Reactivos y disolventes utilizados. Reactivo/Disolvente Grado de pureza Casa Comercial

Agua destilada Grado Milli Q Millipore Metanol Grado HPLC Scharlab Metanol Grado MS-MS/HPLC Scharlab

Ácido clorhídrico 37% Grado ACS, ISO Scharlau Hidróxido de sodio 98% Porlabo

KCl >99% Scharlau NH3 25% >99% Scharlab

Ácido acético >99% Scharlau KH2PO4 98-100.5% Panreac

KNa2HPO4 99-101% Panreac Ácido fórmico Grado MS Sigma-Aldrich

NaNO3 >99% Scharlau NaNO2 >99% Instruments S.L.

En primer lugar, se preparó una disolución de Metrafenona de concentración 600 mg.L-1 a partir de la materia activa solida pesando en balanza analítica y disolviéndola en MeOH. Esta disolución se etiquetó como “disolución patrón”.

A partir de ella se prepara disoluciones diluidas de 300 mg.L-1 y 150 mg.L-1 (siempre diluyendo en MeOH). Estas fueron etiquetadas como “disoluciones de trabajo”. A partir de estas se hicieron las posteriores disoluciones para el estudio del fungicida.

En la tabla 4 se detalla la composición de las disoluciones tampón utilizados para preparar los diferentes pH estudiados[11]:

Tabla 4. Preparación de disoluciones tampón. pH Método 2.0 25 mL KCl 0.2M + 6.5 mL HCl 0.2M en 100 mL 3.6 5 mL NaOH 1M + 65 mL CH3COOH 1M en 100 mL 6.0 16 mL 0.5 M KH2PO4 + 1.4 mL 0.5 M KNa2HPO4 en 100 mL 9.2 5 mL HCl 1M + 5.5 mL NH3 2M en 100 mL

12.0 2.5 mL KCl 0.2M + 6.5 mL NaOH 0.2M en 100 mL


38

4.2. Instrumentación

A continuación se detalla la relación de instrumentos y aparatos utilizados durante este estudio:

Simulador solar: lámpara de arco de xenón

Se utilizó un simulador de energía solar para el estudio de la fotólisis del plaguicida. Este simulador consta de una fuente de alimentación y una lámpara de arco de Xenón

(fig. 6) cuya longitud de onda es de 460-480 nm.

+Además se utilizó una celda de cuarzo (10.5 cm de longitud, 2.5 cm de diámetro y tiene 25 mL de capacidad) donde se introduce la disolución a degradar (fig. 7). En el estudio se sitúa a una distancia de 5 cm con respecto a la fuente de radiación.

Este sistema de simulación solar se encuentra en un cuarto totalmente

oscuro. Las disoluciones preparadas se protegen con papel de aluminio para evitar cualquier efecto de la luz solar durante el experimento.

Cromatografía líquida/diode array (HPLC/DAD)

Se utilizó un cromatógrafo 1200 Agilent Technologies HPLC (figura 8) equipado con:

Columna Ascentis® C18 HPLC Column (2.1 x 150 mm; 3 m)

Detector: DAD (diode array) Software: DataAnalysis

Este equipo es fundamental en la preparación inicial del método y en la hidrólisis del plaguicida.

Figura 8. Equipo HPLC

Figura 6. Equipo solar

Figura 7. Celda de cuarzo.


39

Cromatografía líquida/espectrometría de masas (UPLC-MS)

Cromatógrafo de la marca Bruker MicroTOF-Q (figura 9) equipado con:

Columna ACQUALITY UPLC BEH C18 (2.1 x 100 mm; 1.7 m).

Detector de espectrometría de masas con detección por tiempo de vuelo.

Fuente de ionización de electrospray. El software empleado para el tratamiento de los datos extraídos de los análisis fue Bruker Daltonics DataAnalysis.

Figura 9. Equipo UPLC-MS

Espectrofotómetro UV-VIS Se utilizó un espectrofotómetro UV-Visible 8453 Agilent Technologies (figura 10) para obtener los máximos de absorción del fungicida a estudiar.

Figura 10. Espectrofotómetro UV-VIS

Balanza analítica

Figura 11. Balanza analítica

Se utilizó una balanza digital Sartorius BL 120S (precisión de décima de miligramo; (figura 11) para pesar tanto el plaguicida como los reactivos.


40

pH-metro Se utilizó un pH-metro “pH meter GLP 21” CRISON (figura 12) para controlar el pH de las diferentes disoluciones preparadas a lo largo del estudio.

Figura 12. pH metro

4.3. Materiales

Los materiales utilizados en el uso cotidiano de laboratorio se detallan a continuación:

o Matraces aforados (2 ml, 10 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml) o Celda de cuarzo de 10 mm o Celda de cuarzo 10.5 cm longitud y 2.5 cm diámetro o Micropipetas GILSON o Micro viales con insertos. o Filtros (figura 13):

1. 0.22 m de TEFLON 2. PTFE 0.20 m CHROMAFIL® 3. PVDF 0.22 m Millipore Millex-GV 4. PVDF 0.45 m Millipore hydrophilic 5. PVDF 0.20 m UptiDisc.

Figura 13. Filtros estudiados de izquierda a derecha: 0.22 m de TEFLON, PTFE 0.20 m CHROMAFIL®, PVDF 0.22 m Millipore Millex-GV, PVDF 0.45 m Millipore hydrophilic y PVDF 0.20 m UptiDisc.

CAPÍTULO 5. DESARROLLO DEL MÉTODO

DESARROLLO DEL MÉTODO CAPÍTULO 5

43

5.1. Estudios previos

5.1.1. Selección de la longitud de onda

A partir de una disolución de fungicida de 15 mg.L-1 en MeOH (100% v/v) se midió los máximos de absorción del compuesto en el espectrofotómetro UV-VIS descrito en el capítulo anterior.

La bibliografía consultada indica que el máximo de absorción del compuesto es a 206 nm. A esta longitud de onda absorben muchos reactivos como es el caso del metanol o del agua. Estos reactivos podrían interferir en la señal cromatográfica del plaguicida. Por este motivo se buscó algún otro máximo de absorción donde solo absorbiera Metrafenona.

Para calibrar el equipo primeramente se usó un blanco para evitar lecturas erróneas. En este caso el blanco utilizado fue agua desionizada. Una vez calibrado se midió la absorbancia de la disolución de Metrafenona.

Las cubetas utilizadas fueron de cuarzo de 10 mm.

El resultado muestra dos máximos de absorción de Metrafenona: a 200 nm (máximo absoluto) y a 290 nm (máximo relativo) como se observa en la figura 14.

Como se ha descrito antes, a 200 nm absorben reactivos como el agua y el metanol. A 290 nm sin embargo estos reactivos no absorben. A pesar de que la señal de absorción a 290 nm es cinco veces menos intensa que la señal de 200 nm se

Name Peak (nm) Abs (AU) 1 200.0 0.71415 2 290.0 0.15381

290

Figura 14. Espectro de absorción UV-VIS Metrafenona.


44

selecciona la longitud de onda de 290 nm para trabajar y evitar interferencias de otros reactivos.

5.1.2. Selección del filtro para cromatografía líquida

Otro estudio previo que se realizó fue la elección de filtros. La cromatografía obliga a filtrar las muestras por filtros de diámetro máximo de 0.45 m, por ello se estudiaron filtros de diferentes porosidades (0.20 m, 0.22 m, 0.45 m), diferentes casas comerciales y diferentes materiales (polifluoruro de vinilideno (PVDF), politetrafluoroetileno (PTFE ó Teflón)) dado que pueden retener parte del fungicida a estudiar.

Inicialmente el filtro utilizado en el estudio fue el filtro PVDF 0.20 m UptiDisc. Con este filtro se registraba una señal cromatográfica constante, a tiempos de retención superiores al de Metrafenona, independiente de la concentración de plaguicida inyectada en el HPLC.

Para ver que era esta señal, se inyectó una muestra de Metrafenona en el espectrómetro de masas y se observó que la señal provenía del propio filtro, el cual causaba interferencias y no dejaba apreciar la señal del plaguicida, como puede verse en la figura 15.

En base a este hallazgo se estudiaron diferentes filtros para identificar cuál de ellos generaba un cromatograma más limpio obteniendo un máximo de señal para el plaguicida.

En la figura 15 se muestran las señales recogidas del espectrómetro de masas para el plaguicida Metrafenona filtrado con los diferentes filtros.

Las interferencias que aparecen al utilizar estos son significativas. Desde el primero de los filtros (0.22 m de TEFLON ) donde apenas existe ruido de fondo en la señal del plaguicida (433.06) hasta el último de los filtros (PVDF 0.20 m UptiDisc) en el que esta señal del plaguicida queda enmascarada y no se observa.

Con todos estos datos, el filtro que da una mayor señal de plaguicida y más limpia es el de 0.22 m de TEFLON, que es el filtro elegido para realizar este estudio.


45

L

Figu

ra 1

5. E

spec

tros

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mas

as e

n iy

ecci

ón d

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ra c

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filtr

o.

Filtr

o: 0

.22

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TFE

0.20

m

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m

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0.45

m

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o: P

VDF

0.20

m

Upt

iDisc


46

5.1.3. Selección de la relación MeOH:H2O

La solubilidad de Metrafenona en agua es de 0.492 mg.L-1, es decir, concentración máxima de Metrafenona en agua que podría prepararse sería de aproximadamente 0.5 mg.L-1. A esta concentración de Metrafenona el pico cromatográfica que se obtendría del plaguicida sin degradar serían muy pequeño (como se puede ver en la recta de calibrado del siguiente Capítulo).

A la hora de realizar la degradación, lo que interesa es observar los metabolitos que se van generando. Si la señal cromatográfica de la materia activa es pequeña, la de los nuevos metabolitos será menor y puede que no lleguen a observarse.

Ya que observar los productos de degradación es uno de los objetivos de este estudio, se establece una concentración más elevada de plaguicida (12 mg.L-1).

Para poder preparar esta concentración de Metrafenona solubilizando totalmente el plaguicida hubo que modificar el medio de trabajo.

Metrafenona es soluble en distintos disolventes orgánicos, uno de ellos, el metanol. Se realizan varias pruebas con diferentes relaciones metanol/agua como se indica en la tabla 5 para observar que relación daba la mayor señal cromatográfica, es decir, en qué relación metanol/agua Metrafenona se solubilizaba más.

Tabla 5. Relación Metanol: Agua (v/v) MeOH H2O

10% 90% 20% 80% 30% 70% 40% 60% 50% 50%

La relación que daba una mayor señal, es decir, más Metrafenona se solubilizaba, era la que tenía 50% MeOH y 50% H2O, por lo que se elige esta relación hidroalcohólica para el estudio.


47

5.2. Condiciones cromatográficas

Para estudiar la materia activa Metrafenona por cromatografía líquida es necesario encontrar unas condiciones cromatográficas idóneas en las que los picos cromatográficos aparezcan limpios y separados del frente de disolvente.

En base a estudios anteriormente realizados por el grupo de investigación se escoge una fase móvil constituida por Metanol (fase A) y H2O + 0.1% ácido fórmico (fase B).

Se estudian cuatro métodos diferentes, que se detallan a continuación:

HPLC Modo gradiente Modo Isocrático

UPLC Modo gradiente Modo Isocrático

Separación en gradiente mediante HPLC En primer lugar, se inyecta una disolución de Metrafenona con un gradiente tal y como se indica en la tabla 6, y con las siguientes condiciones cromatográficas:

Columna Ascentis®C18 HPLC Column (2.1x150 mm; 3 m) Horno a 35ºC Velocidad de flujo de la fase móvil de 0.5 mL.min-1. Volumen de inyección de 20 L.

Tabla 6. Gradiente de los disolventes (A: Metanol, B: Agua+0.1% Ac.Fórmico) empleados HPLC Tiempo (min) %A %B

0.00 30.0 70.0 1.00 30.0 70.0 2.00 60.0 40.0 5.00 60.0 40.0

22.00 85.0 15.0 34.00 85.0 15.0 35.00 30.0 70.0 40.00 30.0 70.0

La señal del plaguicida, con este método, se obtuvo a 20.3 minutos como se muestra en la figura 16.


48

Figura 16: Cromatograma en modo gradiente de Metrafenona (12 mg.L-1 50:50 MeOH:H2O). HPLC. tr=20.3 min

Separación en modo isocrático para HPLC Columna Ascentis® C18 HPLC Column (2.1x150 mm; 3 m) Velocidad de flujo 0.5 mL.min-1. Volumen de inyección 20 L Temperatura del horno 35ºC Tiempo de scan 7 minutos 65% de A y 35% de B.

Del mismo modo se inyectó el plaguicida en modo isocrático con la misma columna, misma temperatura de horno, misma velocidad de flujo y mismo volumen de inyección.

En este caso, sin embargo, hubo que fijar fue el porcentaje de A y B en la fase móvil. Metrafenona aparece a 20.3 minutos en modo gradiente, o lo que es lo mismo, cuando la fase móvil está constituida entre un 85-60%A y un 15-40%B.

En base a estos porcentajes de la fase móvil se realizaron tres pruebas fijando la fase móvil con los porcentajes que se muestran en la siguiente tabla:

Tabla 7. Porcentajes de fase A y fase B probados para fijar el modo isocrático HPLC %A %B 80 20 75 25 65 35


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Con los dos primeros porcentajes de A y B el pico cromatográfica de Metrafenona aparecía muy cerca del frente del disolvente (tr menores a dos minutos). El tercer porcentaje, en cambio, mostraba la señal del plaguicida a 5.6 minutos.

La ventaja de este porcentaje es que la señal de Metrafenona se encuentra alejada del frente del disolvente y además existe un margen entre la señal del disolvente y la señal del plaguicida libre de señal donde poder observar los posibles productos de degradación.

Otra de las condiciones que se tuvo que establecer fue el tiempo de scan o tiempo de barrido ya que los porcentajes de A y B de la fase móvil se mantienen constante. Este tiempo se fijó en un principio en 12 minutos. Como se observa en la siguiente figura (fig. 17) Metrafenona aparece a 5.6 minutos por lo que este tiempo de scan se redujo finalmente a 7 minutos.

Figura 17. Cromatograma en modo isocrático de Metrafenona (12 mg.L-1 50:50 MeOH:H2O). HPLC. tr=5.6 min

La técnica analítica HPLC se ha utilizado en este estudio para la selección del método cromatográfico inicial; para controlar la evolución a diferentes tiempos del plaguicida en las diferentes degradaciones, y fundamentalmente para el estudio de hidrólisis de Metrafenona.

Debido al tiempo que le costaba a la columna estabilizarse entre medidas, que el tiempo empleado con las condiciones establecidas en el gradiente era alto, y que la señal en ambos modos aparecían con igual intensidad, se decidió utilizar el método isocrático de HPLC para los estudios anteriormente mencionados.


50

Las condiciones establecidas en modo gradiente para HPLC (velocidad de flujo, volumen de inyección y gradiente) se adaptaron a UPLC-MS mediante un programa del Servicio de Laboratorios de la Universidad de la Rioja.

Con las condiciones modificadas para UPLC-MS la presión del equipo era muy elevada por lo que se decidió modificar también la temperatura del horno para poder trabajar a presiones menores.

Separación en gradiente mediante UPLC-MS Columna ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1 x 100 mm; 1.7 m) Horno calentado a 50ºC Velocidad de flujo de 0.4 mL.min-1. El volumen de muestra inyectado fue en todos los casos de 5.0 L.

Tabla 8. Gradiente de los disolventes (A: Metanol, B: Agua + 0.1% Ac. Fórmico) UPLC-MS. Tiempo (min) %A %B

0.00 30.0 70.0 0.99 30.0 70.0 1.24 60.0 40.0 1.97 60.0 40.0 6.14 85.0 15.0 6.5 85.0 15.0 7.0 30.0 70.0 7.5 30.0 70.0

De igual modo, se estableció el método isocrático en UPLC-MS

Separación en modo isocrático de UPLC-MS fueron: Columna ACQUITY UPLC® BEH C18 (2.1 x 100 mm; 1.7 m) Velocidad de flujo 0.4 mL.min-1. Volumen de inyección de 5.0 L Temperatura del horno de 50ºC. Tiempo de scan de 6 minutos 65% de A y 35% de B.

A continuación se muestra el cromatógrama y el espectro de masas de Metrafenona.


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Figura 18: (a) Cromatograma en modo isocrático de Metrafenona (12 mg.L-1) 50:50 MeOH:H2O. UPLC. (b) Espectro masas [Ion m/z 841.0979 dímero fotoinducido, Ion m/z 433.0434 [M+Na]+, Ion m/z 409.07 [M], Ion m/z 209.0809 radical generado).

En la tabla 9 se muestra el tiempo de retención de Metrafenona en estas condiciones.

Tabla 9. Tiempo de retención e ion de Metrafenona en UPLC-MS. Compuesto Tiempo (min) Ion (m/z)

Metrafenona 3.60 409.07

La técnica analítica UPLC-MS se ha utilizado para estudiar la evolución del plaguicida a los diferentes tiempos en las diferentes fotodegradaciones realizadas, estudiar la cinética de degradacion, observar los diferentes productos de degradación obtenidos, conocer sus masas moleculares, e identificarlos.

209.0809

433.0434

841.0979

21.9816

+MS, 3.57min #422

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10Intens.

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

Na

(a)

(b)


52

El modo isocrático de UPLC fue utilizado para el estudio de todas las fotólisis de Metrafenona. El modo gradiente de UPLC se utilizó para examinar las fotodegradaciones de mosto debido a la complejidad de la matriz.

5.3. Características analíticas del método

Validar un método consiste en verificar y documentar determinados parámetros que demuestran que el método es idóneo para un uso previsto tal como cita VIM, International Vocabulary for Basic and General Terms in Metrology: 2007. La validación de un método permite demostrar que un método analítico proporciona resultados fiables para su finalidad y propósito perseguido.

Los parámetros que permiten evaluar la validez de un método son: identificación de la señal del analito, respuesta lineal, límite de detección y límite de cuantificación, selectividad y precisión.

5.3.1. Calibración

La respuesta linealidad es la capacidad del método para proporcionar resultados que son directamente proporcionales a la concentración del analito en la muestra dentro de un intervalo de trabajo. Esta respuesta se tiene que ajustar a una determinada ecuación (ecuación 3).

xbay . (ecuación 3)

Donde, en este caso, y corresponde al área, x la concentración (mg.L-1), b la pendiente; a la ordenada en el origen.

Para realizar el estudio de calibración se prepararon muestras de diversas concentraciones: 0.6 mg.L-1, 1.5 mg.L-1, 3.0 mg.L-1, 5.25 mg.L-1, 7.5 mg.L-1, 10.5 mg.L-1, 12 mg.L-1 y 15 mg.L-1. Estas disoluciones se prepararon por dilución de las “disoluciones de trabajo” en la mezcla metanol: agua (50:50).

La figura 19 representa la curva de calibrado de Metrafenona.


53

Figura 19. Recta de calibrado Metrafenona.

En la tabla 10 se muestran los parámetros estadísticos que se recogen de la curva de calibración.

Tabla 10. Características analíticas del método de separación e identificación en matriz acuosa.

Ecuación* de la recta (mg.L-1)

Intervalo de linealidad

(mg.L-1)

Coeficiente de determinación (R)

LD (mg.L-1)

LC (mg.L-1)

A=[(3.72±0.13)E4]C+(1.03±1.06)E4 0.6 - 15 0.996 0.06 0.20 (*Área (A) vs. Concentración (C) mg.L-1.)

5.3.2. Limite de detección y límite de cuantificación

Según la IUPAC se define el límite de detección (LD) como 3 veces la desviación estándar de los blancos (el ruido producido por el instrumento) entre la pendiente de la recta de calibrado del instrumento. Es la concentración más baja de analito que puede ser detectada en la muestra.

El límite de cuantificación (LC) es la concentración más baja de analito que puede ser determinada en un nivel aceptable de precisión y exactitud. Se define como 10 veces la desviación estándar del blanco entre la pendiente de la recta de calibrado del instrumento.

En la tabla 10 se muestran las características analíticas obtenidas

La matriz hidroalcohólica presenta un coeficiente de ajuste lineal superior a 0.99 en un rango muy amplio de concentraciones. Desde 0.6 mg.L-1 hasta 15 mg.L-1. Este intervalo de linealidad incluye el LMR del plaguicida en vid y la concentración de analito utilizada para el estudio de degradación.

0

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

0 3 6 9 12 15 18

Área

Concentración (mg.L-1)


54

5.3.3. Selectividad

La selectividad expresa la capacidad del método para medir con exactitud el analito en presencia de otros compuestos que puedan formar parte de la matriz, sin producir interferencias.

Dado que uno de los objetivos es ver la evolución del plaguicida mediante fotodegradación en una matriz real (mosto) se decide comparar la señal analítica de la matriz sin analito con la matriz fortificada. Para esto se analizan muestras de mosto fortificadas y sin fortificar.

En la figura 20 se muestran los cromatogramas de mosto sin fortificar, y de mosto fortificado utilizando el método de HPLC en gradiente para una mejor observación.

Figura 20. Cromatograma de mosto sin fortificar (a) y mosto fortificado con Metrafenona, incluye ampliación pico cromatográfica de Metrafenona (b) ( = 290 nm). HPLC.

Puede observarse que en matriz mosto no aparece ningún pico al tiempo de retención en el que aparece Metrafenona. No hay señales cromatográficas que interfieran en la señal del plaguicida en esta matriz.

(a)

(b)


55

5.3.4. Precisión

Precisión es la capacidad de un instrumento de dar el mismo resultado en distintas mediciones realizadas en las mismas condiciones. Se estudia mediante la repetibilidad y la reproducibilidad y se expresa como desviación estándar relativa.

Para el estudio de repetibilidad se analizaron 6 muestras de materia activa en metanol 50%(v/v) y en matriz mosto a dos niveles de concentración (3.0 mg.L-1 y 12.0 mg.L-1) en un mismo día.

El estudio de reproducibilidad se realizó mediante la precisión intermedia. Para ello se analizaron 6 muestras en metanol 50% (v/v) de una concentración de 12 mg.L-1 y otras 6 muestras de la misma concentración en matriz mosto, en tres días diferentes a lo largo de un mes. Las muestras se inyectaron por duplicado.

Como se observa en la tabla 11 los valores de repetibilidad en matriz agua: metanol son inferiores a los obtenidos en mosto. Esto indica poca dispersión y con ello una gran precisión del método en esta matriz Los resultados se muestran en la tabla 12.

Tabla 11. Valores de repetibilidad y precisión intermedia. Matriz Repetibilidad (DER%) Precisión intermedia (DER%)

3.0 mg.L-1 12.0 mg.L-1 12 mg.L-1 Agua 1.31 1.09 6.49

Mosto 7.17 7.86 6.46

Si se observan los valores de las muestras en varios días, puede verse como los valores de DER% son similares para ambas matrices.


56

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CAPÍTULO 6. ESTUDIO DE FOTÓLISIS E HIDRÓLISIS DE

METRAFENONA

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ESTUDIO DE FOTÓLISIS E HIDRÓLISIS DE METRAFENONA CAPÍTULO 6

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6.1. Fotólisis

La fotodegradación es junto a la hidrólisis uno de los procesos más importantes en el proceso de descomposición de un plaguicida. Un estudio de degradación del plaguicida en el laboratorio ayuda a conocer la vida del plaguicida en condiciones medioambientales.

Para la fotólisis de Metrafenona se utilizó la irradiación de luz proveniente de un simulador solar que incorpora una lámpara de Xenón. En base a estudios anteriores realizados por el equipo de investigación se establecieron las condiciones de trabajo del simulador solar trabajando a una potencia de 80W [12].

Las disoluciones se prepararon a una determinada concentración de materia activa para poder obtener resultados óptimos y poder identificar la mayor cantidad de productos de degradación. Debido a esta concentración de plaguicida y a la baja solubilidad que presenta en agua, estas disoluciones se preparan con un contenido en metanol de 50% (v/v).

Las diversas disoluciones de plaguicida de 12 mg.L-1 en disolución hidroalcohólica (1:1), preparadas, a diferentes pH (2.0, 3.6, 6.2, 9.2, 12.0) fueron sometidas al proceso de degradación fotolítica. Durante el tiempo de estudio se tomaron muestras de 500

L a distintos tiempos hasta un máximo de 10 horas y se midió el pH a tiempo final.

Con la finalidad de comprobar la similitud de los resultados, es decir, que las disoluciones tampón no afectan ni a la cinética o evolución de la reacción, ni interfieren en la obtención de los productos de degradación, se preparan disoluciones a pH 2.0, pH 6.0 y pH 12.0 sin utilizar medio amortiguador, únicamente ajustando el medio con HCl, NH3 y NaOH.

En todos estos casos se trabajó a temperatura ambiente de laboratorio (23±2ºC), en ausencia total de luz. Cabe tener en cuenta que a lo largo de la irradiación la celda se puede calentar, por ello se midió la temperatura de la disolución de la celda al inicio, al final y a varios tiempos intermedios. La temperatura de la celda aumentó 2ºC (incremento no significativo), a lo largo del proceso degradativo.

Las muestras se filtraron a través de los filtros seleccionados anteriormente de 0.22 m y se inyectaron en UPLC-MS donde se estudió la evolución del plaguicida a lo largo

del tiempo y la aparición de productos de degradación.


60

6.1.1. Evolución de la materia activa

La evolución de la materia activa Metrafenona se siguió a lo largo del tiempo, en los diferentes pH y diferentes medios (tamponados, no tamponados y mosto). El seguimiento de esta materia activa se realizó hasta que ésta había desaparecido entre un 80-90% de su concentración inicial. En ese momento el estudio se da por finalizado. Estos valores se obtuvieron en la mayoría de los casos entre las 6 y las 8 horas de irradiación. En las tablas 12, 13 y 14 se muestra la persistencia de Metrafenona en los diferentes medios.

Tabla 12. Persistencia de Metrafenona en medio tamponado (%). Porcentaje de persistencia de Metrafenona En medio tamponado

t (min) pH 2.0 pH 3.6 pH 6.0 pH 9.2 pH 12.0 0 100 100 100 100 100

30 79 100 89 - 95 60 - 107 75 84 81

120 53 94 64 62 70 180 40 - 56 48 59 240 20 61 43 35 39 360 10 39 32 17 34 480 - 15 15 14 21

Tabla 13. Persistencia de Metrafenona en medio no tamponado (%). Porcentaje de persistencia de Metrafenona En medio no tamponado

t (min) pH 2.0 pH 6.0 pH 12.0 0 100 100 100

60 85 81 75 120 62 58 69 180 60 41 36 240 58 27 26 360 38 12 15 480 29 9 12

Tabla 14. Persistencia de Metrafenona en mosto (%). Porcentaje de persistencia de Metrafenona Mosto

t (min) Mosto (pH 3.6) 0 100

60 113 120 109 180 86 240 107 360 90 420 91 480 89 540 91


61

Como se observa, Metrafenona se degrada en todo el rango de pH, y lo hace independientemente del medio en el que se encuentre ya sea el medio tamponado o no.

El intervalo de degradación de Metrafenona en todos los casos se encuentra entre un 10% y un 20% dependiendo del pH siendo la mayor degradación a pH 2.0.

En la matriz mosto, tras 8 horas de irradiación, Metrafenona sufrió una degradación de tan solo un 12%. Si comparamos este resultado con el obtenido en la disolución con pH 3.6, similar al mosto, puede observarse que para el mismo tiempo de irradiación (480 minutos), Metrafenona se degrada un 85%.

Al finalizar el proceso de degradación se midió el pH de las diferentes disoluciones, observando una disminución del mismo en todos los casos. La tabla 15 muestra los resultados obtenidos.

Tabla 15. pH inicial y pH final de las disoluciones en el estudio de fotólisis. Disolución pH inicial pH final

2.0 medio tampón 2.0 1.2 2.0 sin tamponar 2.0 0.8

3.6 medio tampón 3.6 2.7 6.0 medio tampón 6.0 5.25 6.0 sin tamponar 6.0 2.9

9.2 medio tampón 9.2 7.4 12.0 medio tampón 12.0 10.7 12.0 sin tamponar 12.0 9.7

En todos los casos estudiados el valor final de pH es inferior al valor inicial de la disolución. En los pH con disoluciones tampón el pH es amortiguado y desciende de manera suave con un máximo de 1.8 unidades a pH 9.2, mientras que cuando no se utiliza un medio amortiguador el pH desciende de forma más acusada con un máximo de 3 unidades en pH 6.0.

6.1.2. Cinéticas de fotodegradación de Metrafenona

A partir de los datos obtenidos de la evolución del plaguicida se llevó a cabo un estudio de las cinéticas de fotodegradación llevadas a cabo a distintos valores de pH y, distintos medios incluido mosto.

Los valores de la constante de velocidad, k, se calculan a partir de la ecuación 1 vista en el Capítulo 3. Para ello se integra esta ecuación y se representa -ln[A] vs. t obteniendo como ordenada en el origen -ln[A]0 (porcentaje de persistencia en el


62

tiempo cero de medida) y como pendiente k (min-1). Valor que tiene que ser transformado a unidades del sistema internacional (s-1).

Con el valor de k calculado y con ayuda de la ecuación 2 (Capítulo 3) se obtiene el tiempo de vida media para cada caso estudiado.

Todas las tablas correspondientes a las cinéticas de fotodegradación se recogen en el Anexo I.

En la tabla 16 se muestran los parámetros cinéticos de degradación de Metrafenona a diferentes pH en disoluciones tampón.

Tabla 16. Parámetros cinéticos de degradación en medios tamponados.

pH Ecuación de velocidad* tiempo (min) R k (s-1) t1/2 (h)

2.0 -ln[A]= (-4,6461±0.0688)+(0.0063±0.0004)t 0-360 0.995 1.05E-4 1.83 3.6 -ln[A]= (-4.9734±0.0576)+(0.0042±0.0006)t 0-480 0.965 7.00E-5 2.75 6.0 -ln[A]= (-4.6126±0.0556)+ (0.0037±0.0002)t 0-480 0.988 6.17E-5 3.12 9.2 -ln[A]= (-4.6125±0.0800)+(0.0046±0.0003)t 0-450 0.994 7.66E-5 2.51

12.0 -ln[A]= (-4.6905±0.1058)+(0.0039±0.0003)t 0-540 0.969 6,50E-5 2.96 *[A]=Persistencia en % (m/m); t=tiempo (min)

Se puede observar en todos los casos que la degradación se ajusta, con valores de r>0.96, a una cinética de primer orden.

El mayor valor de constante cinética se obtiene para pH ácido, pH 2.0. El valor más bajo corresponde a pH neutro, pH 6.0. El tiempo de vida media oscila entre 1.83 horas para pH 2.0 y 3.12 horas para pH 6.0. Esto indica degradación de Metrafenona a todos los pH siendo mayor la velocidad a pH ácido.

De igual modo, se muestra en la tabla 17 los parámetros cinéticos de la degradación del plaguicida, en este caso sin medio tamponado, para los diferentes pH estudiados.

Tabla 17. Parámetros cinéticos de degradación a pH 2.0, 6.0 y 12.0.

pH Ecuación de velocidad* tiempo (min) R k (s-1) t1/2 (h)

2.0 -ln[A]= (0.0362±0.0502)+(0.0026±0.0002)t 0-480 0.989 4.33E-5 4.44 6.0 -ln[A]= -0.0391±0.0759)+(0.0054±0.0003)t 0-480 0.993 9.00E-5 2.14

12.0 -ln[A]= (0.0485±0.1045)+(0.0045±0.0003)t 0-540 0.983 7,50E-5 2.56 *[A]=Persistencia en % (m/m); t=tiempo (min)

En matriz mosto real los resultados muestran que tras nueve horas de irradiación con lámpara de Xenón, Metrafenona se degrada un 12% sin haber obtenido producto de degradación alguno.


63

En la tabla 18, se muestra los parámetros cinéticos en mosto en el intervalo de 0 a 240 minutos. A partir de los 240 minutos la degradación en mosto se mantiene constante, En el ajuste de los datos a una cinética de primer orden se obtiene un valor de R de 0.526 siendo el tiempo de vida media 19.2 horas, superior al obtenido en la disolución con pH similar a mosto, pH 3.6.

Tabla 18. Parámetros cinéticos de degradación en disolución acuosa para mosto. Matriz Ecuación de velocidad* tiempo (min) R k (s-1) t1/2 (h) mosto -ln[A]= (-4.7098±0.0858)+(0.0006±0.0006)t 0 - 240 0.526 1.0E-5 19.2

*[A]=Persistencia en % (m/m); t=tiempo (min)

6.1.3. Identificación de los productos de degradación en el proceso de fotodegradación.

Uno de los problemas a la hora de detectar los productos de degradación es la disposición de las técnicas analíticas necesarias para detectar e identificar estos compuestos. En este estudio se dispone de un espectrómetro de masas para poder deducir la estructura química de los productos de degradación. Pero para poder confirmar estas estructuras haría falta el uso de técnicas más especificas como la Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Este es otro de los problemas porque esta técnica necesita una determinada cantidad de muestra, cantidad elevada si se compara con la baja proporción en la que se forman los productos de degradación y la dificultad a la hora de extraer y separar estos productos.

Para el estudio de los productos de degradación de Metrafenona se utilizó un UPLC (cromatografía liquida) acoplado a espectrometría de masas a tiempo de vuelo con ionización por electrospray (UPLC-ESI-TOF).

A partir de las disoluciones estudiadas, y observando la existencia de degradación en todo el rango de pH, se estudió los productos de degradación de Metrafenona en todos ellos.

De forma general, la identificación de los productos de degradación comienza a partir de los cromatogramas obtenidos a lo largo del tiempo de fotodegradación donde se observa la disminución de la señal correspondiente a la materia activa de Metrafenona y la aparición de picos cromatográficos a distintos tiempos de retención, como puede observarse en la figura 21.


64

Figura 21. Cromatogramas ejemplo que reflejan la evolución del plaguicida Metrafenona y la aparición del producto de degradación M2 (ej. pH 2.0). UPLC-MS.

Como se ha mostrado anteriormente el tiempo de estudio al que aparece el producto de degradación y su evolución a lo largo del mismo depende del pH en el que se esté realizando el estudio.

En todos los casos el metabolito mayoritario M2 comienza a aparecer después de una hora de irradiación.

De manera general, se toma el cromatograma inicial y el final. A partir de estos podemos obtener el tiempo de retención de nuestro producto de partida (tr=3.70) y del nuevo producto que se está formando (tr=1.84) como se observa en la figura 22.

Figura 22 Cromatograma t=0 min (rojo) y t=360 min (azul)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Time [min]0

1

2

3

44x10

Intens.

M2 T0_2-d,8_01_5728.d: BPC 49.0000-3001.0000 +All M2 T1_2-d,7_02_5727.d: BPC 49.0000-3001.0000 +All M2 T2_2-d,6_01_5724.d: BPC 49.0000-3001.0000 +AllM2 T4_2-d,4_01_5720.d: BPC 49.0000-3001.0000 +All M2 T5_2-d,3_01_5718.d: BPC 49.0000-3001.0000 +All M2 T6_2-d,2_01_5716.d: BPC 49.0000-3001.0000 +All

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

M2

Metrafenona (M1)

M2


65

Cada pico cromatográfico corresponde con un producto diferente. Con la ayuda del espectrómetro de masas, en este caso general, se obtiene la relación m/z del único producto de degradación obtenido, M2, siendo su valor de 330.7897..

Este ion corresponde a la molécula de materia activa Metrafenona sufriendo una pérdida de molécula del átomo de bromo y captando un protón, tal y como se muestra en la figura 23.

OMe OCH3

OCH3

OCH3O

OMe OCH3

OCH3

OCH3OBr

h

- Br

(M2)

Figura 23. Estructura propuesta para el metabolito M2 (PM= 330.3807 g.mol-1).

Esta propuesta puede confirmarse observando los espectros obtenidos en el espectro de masas dado que el compuesto de partida tiene Bromo; el cual tiene una relación isotópica por lo que aparece una señal doble, mientras que el nuevo compuesto formado no muestra esta doble señal correspondiente al bromo.

En la figura 24 se muestra el espectro de masas donde se ve esta doble señal isotópica del bromo para Metrafenona y la ausencia de esta doble señal en el metabolito M2.

115.0401

209.0831

409.0633

149.0620

209.0819

331.1525

0

500

1000

1500

Intens.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.24x10

4x10

(a)

(b)

Metrafenona

M2

(a)

(b)

Figura 24. Ampliación espectro de masas donde puede verse la doble señal isotópica de Bromo en Metrafenona (a) y la ausencia de esta doble señal en M2 (b)


66

Debido a la presencia de iones como K+, Na+, NH4+, provenientes de las disoluciones

tampón utilizadas como medios, los reactivos empleados para controlar el pH o por ionizaciones dentro del equipo, la relación m/z de los metabolitos (en este caso general M2) puede variar. La tabla 19 muestra los diferentes valores de relación m/z en función del ion formado para el mismo producto de degradación M2.

Tabla 19. Ion y relación m/z para el producto de degradación M2. Ion (m/z)

M2 [M2+H]+ 331.20

[M2+Na]+ 353.18 [M2+K]+ 369.15

De forma general, puede observarse en el espectro de masas de Metrafenona, junto con la señal principal del plaguicida aparece otra señal correspondiente a uno de los iones característicos, figura 24 (a). Este ion de relación m/z 209.1125 g.mol-1 podría corresponder a un posible radical formado por ruptura de Metrafenona. Este radical se muestra en la figura 25.

OMe

OMe

OMe

O

Figura 25. Radical propuesto molecular 209.1125 g.mol-1.


67

pH 2.0 en medio tampón

En el cromatograma a pH 2.0 tamponado (figura 26) se observa la aparición de un único producto de degradación (M2).

Figura 26. Cromatograma a t=480 min (a) y espectros de masas de los picos correspondientes (b). pH 2.0

En base a los espectros de masas obtenidos, puede confirmarse que M2 proviene de la materia activa Metrafenona la cual ha perdido un bromo (ya que no se observa el doble pico correspondiente a la relación isotópica de este) y ha capturado un potasio.

En la tabla 20 se muestra el tiempo de retención del producto de degradación M2, la formula molecular y la relación m/z. En este caso el metabolito M2 tiene potasio (PM K = 39.0983) en su estructura. Tabla 20. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 en UPLC-MS. [M+K]+

369.1570

6. +MS, 1.69-1.98min #(200-234), -Peak Bkgrnd

209.1106

449.0762

7. +MS, 3.51-3.86min #(415-457), -Peak Bkgrnd0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10Intens.

0

1000

2000

3000

200 400 600 800 1000 1200 m/z

Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z) Pdto de degradación M2 1.84 [C19H22O5K]+ 369.1570

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

M2

[M2+K]+

[METRAFENONA+K]+

(a)

(b)


68


En el medio pH 3.6 tamponado aparece un solo metabolito de fotodegradación correspondiente a M2 como se muestra en la figura 27.

Figura 27. Cromatograma a tiempo final de medición (a) y espectros de masas de los picos correspondientes (b). pH 3.6

La relación m/z que se obtiene en el espectro de masas para el ion es de 353.1797, es decir, el producto de degradación M2 esta sodiado (PM Na= 22.9897). La tabla 21 muestra el tiempo de retención del producto de degradación M2, la formula molecular y la relación m/z.

Tabla 21. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 en UPLC-MS. [M+Na]+

353.1797

683.3649


209.1090

431.0988

841.2012

2. +MS, 3.51-4.03min #(415-477), -Peak Bkgrnd0

1

2

3

44x10

Intens.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.04x10

200 400 600 800 1000 1200 m/z

Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z) Pdto de degradación M2 1.83 [C19H22O5Na]+ 353.1797

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

M2

[M2+Na]+

[METRAFENONA+Na]+

(a)

(b)


69


En medio tamponado pH 6.0 se obtiene un producto de degradación correspondiente al metabolito M2 como se observa en el cromatograma UPLC de la figura 28.


La relación m/z del ion es 369.15. En este caso el metabolito M2 tiene un átomo de potasio en su estructura. En la tabla 22 se muestra el tiempo de retención, la fórmula molecular y la relación m/z.

Tabla 22. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 en UPLC-MS. [M+K]+ Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z)

Pdto de degradación M2 1.87 [C19H22O5K]+ 369.1554

122.9426209.1086

290.8832

449.0735

+MS, 3.71min #439

369.1554

+MS, 1.87min #2210

500

1000

1500

2000

2500

3000

Intens.

0

1

2

3

4

54x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

M2

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

[METRAFENONA+K]+

[M2+K]+

(a)

(b)


70

pH 9.2 tamponado

Con un medio tampón básico de pH 9.2 tamponado se obtienen dos productos de degradación, el correspondiente a M2 y un nuevo metabolito, M3 como puede observarse en la figura 29.


149.0827

179.0969

209.1112

331.1981


209.1115

227.0033

411.1171

433.1026

2. +MS, 3.56-4.03min #(421-477), -Peak Bkgrnd0

1

2

3

4x10Intens.

0.00

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10

100 200 300 400 500 600 m/z

163.0602

345.1770

+MS, 1.24min #1460

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

4x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z

M2

M3 OCH3

OCH3

OCH3

OCH3O

Br

[M2+H]+

[METRAFENONA]

[M3]

(a)

(b)


71

El producto de degradación M2 aparece con la relación m/z 331.1981. En este caso, el compuesto está protonado. Esto quiere decir que M2 en realidad tiene un peso molecular de 330.7897 g.mol-1.

El metabolito M3 aparece a un tiempo de retención 1.08 min y tiene una relación m/z 345.1770. En la tabla 23 se muestran los productos de degradación a pH 9.2, el tiempo de retención, la formula molecular y su relación m/z.

Tabla 23. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 en UPLC-MS. [M+H]+ y M3 Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z)

Pdto de degradación M2 1.84 [C19H23O5]+ 331.1981 Pdto de degradación M3 1.08 [C19H23O5N] 345.1770

El metabolito M3, no tiene bromo en su estructura ya que no aparece la doble señal de la relación isotópica del bromo, figura 29 (b). Además, difiere en su peso molecular de M2 en 15 g.mol-1. Teniendo en cuenta que está en disolución amoniacal, no es de extrañar que un átomo de nitrógeno y otro de hidrógeno hayan entrado a formar parte de la estructura de la nueva molécula. Se postulan las posibles estructuras que se muestran en la figura 30.

O

OMe

OMe

OMe

OMe

H2N

M3.1

NH

OOMe

OMe

OMeOMe M3.3

N

OMe

OMe

OMe

OMe

OH

M3.2

Figura 30. Estructuras propuestas para el metabolito M3.

Para obtener más información sobre este producto se provocó su ruptura mediante la técnica masas-masas (MS-MS).

Para ello se seleccionó a través del cuadrupolo el ion deseado (M3) y a continuación se aplicaron diferentes voltajes (20 y 25 eV) para provocar su fragmentación.

En ambos casos de energía, se produce la ruptura del compuesto M3 (PM=345.1770). Los picos que se pueden apreciar por una parte son los correspondientes a los pesos


72

moleculares 165.0798 y 209.1125 g.mol-1, si se aplican 20 eV y 163.0640 g.mol-1 si son 25 eV.

La figura 31 muestra los espectros MS-MS correspondientes a ambas fragmentaciones.

Figura 31. Espectro MS-MS del ion 345.1770 a 20 eV(a) y a 25 eV(b).

En base a estos resultados se intentó deducir cuál de las posibles estructuras expuestas anteriormente (M3.1, M3.2, M3.3) podría ser realmente el compuesto que se genera.

Una de las rupturas del metabolito M3, la correspondiente a 209.1125 g.mol-1 podría coincidir con el radical de la figura 25, ion característico de Metrafenona.

La otra ruptura podría provenir de los radicales derivados de las estructuras (M3.1, M3.2, M3.3) como se muestra en la figura 32.

O

H2N

OMe

N

OMe

OH

NH

OMe

O

Figura 32. Radicales derivados de las estructuras M3.1, M3.2 y M3.3.

165.0798

209.1125

0

200

400

600

800

1000

1200

Intens.

100 200 300 400 5

163.0640

0

200

400

600

800

1000

1200

Intens.

100 200 300 400 5

(a)

Radical M3.1 Radical M3.2 Radical M3.3

(b)


73

El radical proveniente de M3.2 queda descartado debido a que si este fragmento se enlazara con el otro fragmento (radical figura 25) no se obtendría la relación m/z de 345.1 sino una mucho mayor.

Podría pensarse que antes de la unión de los dos fragmentos el radical de la figura 25 podría perder su grupo carbonilo, en ese caso la relación m/z de 345.1 coincidiría, pero si se aplicará el voltaje anteriormente citado a esta posible estructura sin grupo carbonilo, ésta no generaría las dos rupturas mostradas en la figura 31 porque no tendría grupo carbonilo y el radical 209.1 no podría formarse.

Los radicales provenientes de M3.1 y M3.3 encajan con la estructura del radical de PM=209.1 g.mol-1.

En ambos casos la primera reacción que ocurriría sería la ruptura homolítica del enlace carbono-bromo del compuesto inicial Metrafenona formando un radical bromo y un radical carbono al que podría entrar tanto un radical hidrógeno del medio como un radical nitrógeno debido al medio amoniacal. Para que entre un radical de tipo nitrógeno se necesita irradiar con longitudes de onda inferiores a las de la lámpara de arco de Xenón.

Descartados los radicales M3.1 y M3.2 se propone la formación del tercer radical (M3.3). En presencia de un grupo cetona en la estructura, con iones amonio en el medio y en presencia de oxigeno se daría el ataque nucleofilo del amoniaco al grupo cetona formándose la imina derivada que podría llegar a formar la oxima.

Una vez formada esta oxima, y ayudada por la incidencia de luz, se postula una trasposición de Beckmann (figura 33) que generaría la amida, y finalmente el radical.

N

R R'

OH

HN

R R'

OH2

-H2OR N C R'

R N C R'

H2O

N

R

OH2

-H

N

R

R'

OH

NH

R

R'

O

R'

Figura 33. Mecanismo de Beckmann propuesto para la formación de M3.


74

Así, se propone que la estructura para el producto de degradación M3 sea la que se muestra en la figura 34.

NH

OOMe

OMe

OMeOMe

M3.3

Figura 34. Estructura propuesta para el metabolito M3 con m/z 345.1770


En disolución pH 12.0 con medio tampón aparecen dos productos de degradación, los correspondientes a M2 y M5 como puede observarse en la figura 35.

84.9570

209.0812

433.0414

841.0959

+MS, 3.64min #431

149.0599

209.0800

353.1327

683.2746

+MS, 1.87min #2210

500

1000

1500

Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 m/z

M2

M5

84.9571

437.1890

+MS, 2.16min #256

0

500

1000

1500

Intens.

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

[METRAFENONA+Na]+

[M2+Na]+

[M5+Na]+

(a)

(b)



75

Uno de los metabolitos corresponde a M2 con un átomo de sodio en su estructura (PM Na= 22.9897). A tiempo de retención 2.16 min aparece M5 cuya relación m/z es 437.1890 g.mol-1. En realidad, este compuesto esta sodiado, por lo que su relación m/z es de 414.2 g.mol-1.

En la tabla 24 se muestra el tiempo de retención y la relación m/z de los metabolitos obtenidos a pH 12.0 tamponado.

Tabla 24. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 en UPLC-MS. [M+Na]+ Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z)

Pdto de degradación M2 1.87 [C19H22O5Na]+ 353.1327 Pdto de degradación M5 2.16 [C22H22O8Na]+ 437.1890

La formación del metabolito M5 se propone desde el radical de la figura 25.

La figura 36 muestra la posible reacción que se propone para deducir la formación de M5.

OMe

MeO

MeO

O

H H

H

OMe

MeO

MeO

O

H

OMeMeO

MeO

O

HOMe

MeO

MeO

O

H

OMeO

H

h

OMe

MeO

MeO

O

H

OMe

OMe

OMe

O

H

OMe

MeO

MeO

O OMe

OMe

OMe

O

OMe

MeO

MeO

HO OMe

OMe

OMe

OH

[O2]

OMe

MeO

MeO

O OMe

OMe

OMe

O

INTERMEDIO M5

Figura 36. Mecanismo fotoquímico propuesto para la formación de M5.


76

La reacción comienza con un acoplamiento entre dos radicales. Tras este acoplamiento, los grupos carbonilos, que además están conjugados, formarán nuevos radicales en la nueva molécula. Los radicales carbono se acoplan. Se forman en primer lugar los enoles y debido al equilibrio cetoenolico las cetonas. Se forma así un intermedio de masa 416.2 g.mol-1. Este, en presencia de oxigeno, que actúa como oxidante ayudaría a formar el compuesto más estable M5.

pH 2.0 (HCl)

En disolución pH 2.0 ajustando el medio con ácido clorhídrico, aparece un único metabolito de degradación, M2, como se observa en la figura 37.

Figura 37. Cromatograma a t=480 min (a) y espectros de masas de los picos correspondientes (b). pH 2.0 (HCl)

209.0815

411.0620

+MS, 3.65min #432

149.0606

209.0817

331.1540

683.2814

+MS, 1.86min #2200

200

400

600

800

1000

Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000 m/z

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

M2

[METRAFENONA]

[M2+H]+

(a)

(b)


77

M3

M2

M4

El producto de degradación M2 tiene una relación m/z= 331.1540, que se corresponde con el metabolito protonado.

En la tabla 25 se muestra el tiempo de retención de M2, la relación m/z, y la fórmula molecular.

Tabla 25. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 en UPLC-MS. [M+H]+ Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z)

Pdto de degradación M2 1.86 [C19H23O5]+ 331.1540

pH 6.0 (NH3)

En disolución pH 6.0 sin tamponar se preparó regulando el pH con NH3. Aparecen dos productos de degradación, los correspondientes a M2 (sodiado) y M3 como puede obervarse en la figura 38.

En ese medio amoniacal aparece también un pico cromatográfica a un tiempo de 2.14 min correspondiente al ion m/z= 239.1614 (M4).

(a)


78

Figura 38. Cromatograma a t=480 min (a) y espectros de masas de los picos correspondientes (b). pH 6.0 (NH3)

En la tabla 26 se muestra el tiempo de retención, la formula molecular y la relación m/z de los metabolitos a pH 6.0 en medio amoniacal.


Pdto de degradación M2 1.86 [C19H22O5Na]+ 353.1326 Pdto de degradación M3 1.08 [C19H23O5N] 345.1313 Pdto de degradación M4 2.14 [C11H13O5N] 239.1614

Se intentó realizar un MS/MS al metabolito M4 (m/z=239.1614), pero debido a la mínima intensidad con la que aparece el compuesto, no se pudo provocar ninguna ruptura.

209.0798

409.0605

+MS, 3.65min #432

149.0604

353.1326

+MS, 1.86min #2200

100

200

300

400

500Intens.

0

500

1000

1500

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 m/z

163.0384

345.1313

711.2352

+MS, 1.08min #128

111.1158

239.1614

+MS, 2.14min #2530.0

0.5

1.0

1.5

4x10Intens.

0

200

400

600

800

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 m/z

[METRAFENONA]

[M2+Na]+

[M3]

[M4]


79

M5

M2

En base al medio en el que se forma este compuesto, con los pocos datos que se tienen y con la ayuda del programa DataAnalisys se propone la fórmula molecular C11H13NO5 y la estructura química que se muestra en la figura 39. Aunque habría que comprobar su estructura por RMN.

O

HN

OMe

OMe

OMe

O

M4

Figura 39 Estructura propuesta para M4 relación m/z 239.1614

pH 12.0 (NaOH)

La disolución de pH 12.0 se preparó ajustando el medio con hidróxido de sodio. En esta disolución aparecen dos metabolitos, los correspondientes a M2 y M5 como puede verse en la figura 40.

(a)


80

Figura 40. Cromatograma a =480 min (a) y espectros de masas de los picos correspondientes (b). pH 12.0 (NaOH)

M2 tiene un átomo de sodio en su estructura (PM Na=22.9897 g.mol-1) y M5 también esta sodiado. Su relación m/z corresponde en realidad a 414.2 g.mol-1.

En la tabla 27 se muestran los tiempos de retención, la formula molecular y la relación m/z para los metabolitos que aparecen a pH 12.0


Pdto de degradación M2 1.85 [C19H22O5Na]+ 353.1334 Pdto de degradación M5 2.16 [C22H22O8Na]+ 437.1899

En base a estos resultados, se puede concluir que el producto de degradación mayoritario que se forma a todos los pH es el de masa molecular 330.3807 g.mol-1 (M2).

84.9562

209.0813

431.0446

+MS, 3.63min #430

209.0808

353.1334

683.2770

+MS, 1.85min #2190

100

200

300

Intens.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10

250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 m/z

84.9576

437.1899

+MS, 2.16min #255

0

500

1000

1500

2000

2500

Intens.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 m/z

[METRAFENONA+Na]+

[M2+Na]+

[M5+Na]+

(b)


81

A modo de resumen se puede indicar que a pH ácido únicamente se forma el metabolito M2. A pH neutros y básicos empiezan a aparecer otros metabolitos que no aparecen a pH ácido como es M5 y diversos compuestos de M2 con sodio y potasio.

En presencia de amoniaco se forma el compuesto M3 por reacción química, y el metabolito M4.

En la figura 41 se detalla una posible ruta de fotodegradación propuesta para Metrafenona, y los tiempos y pesos moleculares de todos los metabolitos.

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

Br

OCH3OCH3

OCH3

OCH3O

OMe

OMe

OMe

OOMe

MeO

MeO

O

NH

OOMe

OMe

OMeOMe

O

HN

OMe

OMe

OMe

O

Compuesto tiempo (min) Peso molecular (g.mol-1) Metrafenona M1 3.64 409.20

Pdto de degradación M2 1.84 330.38 Pdto de degradación M3 1.08 345.17 Pdto de degradación M4 2.14 239.16 Pdto de degradación M5 2.16 414.18

Figura 41. Ruta de degradación propuesta para Metrafenona, tiempos de retención de los metabolitos y pesos moleculares.

NH3/NH4+

h

M1

NH3/NH4+ (pH 12)

M2

M3 M4

M5

h


82

6.1.3. Evolución de los productos de degradación en el proceso de fotodegradación

Una vez estudiada la evolución de Metrafenona en el tiempo, se estudia la evolución de los diferentes productos de degradación a los diferentes pH.

FOTÓLISIS A PH ÁCIDOS

Según avanza la degradación de Metrafenona en medios ácidos, pH 2.0 y 3.6, aparece un producto de degradación (M2), como se muestra en la figura 42.

Este metabolito comienza a aparecer a los 60 minutos de irradiación y va aumentando su concentración según avanza la degradación. La aparición de este compuesto tiene un comportamiento diferente en función del medio en el que realice la degradación.

Así en medios ácidos tamponados se alcanza un máximo de concentración del 25% y 56% a un tiempo de 3 y 4 horas para pH 2 y pH 3.6 respectivamente. A partir de este tiempo su concentración se estabiliza (figura 42 a) y c)).

En medio no tampón (pH 2), el máximo de concentración, entre 62% y 67% se alcanza a un tiempo de 6 horas manteniéndose constante en este rango hasta el final. En este medio, la concentración del producto de degradación es la más elevada (figura 42 b))

Figura 42. Evolución de fotodegradación de Metrafenona irradiando con lámpara de arco de Xenón a 80 W a pH 2.0 tampon (a), pH 2.0 no tampon (b), y pH 3.6 tampon (c).

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)

Metrafenona pH2 M2+H (331.1)

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)

Metrafenona pH 2 [M2+K] (369.1)

(b) (a)

0

20

40

60

80

100

120

140

0 100 200 300 400 500

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)

Metrafenona pH 3 M2+Na (353.1)


83

En todos los medios aparece el producto de degradación M2 desde el comienzo del estudio hasta alcanzar un máximo de concentración a un tiempo determinado según el medio y a partir el cual se estabiliza su concentración hasta la finalización del estudio.

FOTÓLISIS A PH NEUTROS

Como pH neutro se eligió el pH 6.0, el cual fue estudiado en disolución tampón y ajustando el pH con NH3.

Metrafenona tardó en degradarse un 85%, 6 horas en medio tampón y 8 horas en medio amoniacal.

En la figura 43 se muestra la evolución de los metabolitos y de la materia activa en el tiempo a pH 6.0

Cuando el plaguicida se encuentra a pH 6.0 en medio tampón aparece el metabolito M2 a partir de la primera hora de irradiación y va aumentando hasta un 46% a las 3 horas y parece estabilizarse con un máximo de 56% apartir de 6 horas. En cambio, cuando el medio no es tampón, sino que se ha ajustado con amoniaco, la concentración de este producto de degradación M2 crece hasta un máximo de 51% a las 3 horas para disminuir la concentración en la siguiente toma hasta el final del estudio a un 16%. Al mismo tiempo, tal y como se puede observar en la figura 43 b), se va generando un nuevo producto de degradación (M3) que llega a alcanzar un porcentaje superior al 80% al finalizar el estudio a las 9 horas de irradiación.

Figura 43. Evolución de fotodegradación de Metrafenona irradiando con lámpara de arco de Xenón a 80 W a pH 6.0 tampón (a) y pH 6.0 no tampón (b).

En el caso de pH 6.0 no tampón el comportamiento del producto de degradación M2 es diferente a partir de 3 horas observando un brusco descenso en su concentración

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)

Metrafenona pH 6 M2+K (369.1)

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)

Metrafenona pH 6 M2+H (331.1) M3 (345.1)

(a) (b)


84

como consecuencia de la aparición y aumento progresivo de M3 hasta el final del estudio.

FOTÓLISIS A PH BÁSICOS

La materia activa también fue estudiada en medio básico (pH9.2 tampón, pH12 tampón y no tampón) donde también sufre degradación.

En estos medios el tiempo necesario de irradiación para que el plaguicida se degrade un 80-85% es de 6-8 horas según el pH.

De igual modo, según avanza el tiempo de irradiación Metrafenona va disminuyendo su concentración y aparecen los metabolitos que van aumentando su presencia a lo largo del tiempo.

Las figuras 44 y 45 muestran la evolución de los productos de degradación o metabolitos que aparecen en el tiempo de irradiación en estos pH.

A pH 9.2, aparece el producto M2 durante la primera hora de irradiación hasta alcanzar un máximo del 46% a las 4 horas y parece estabilizarse hasta el final del estudio con un máximo de 58%, figura 44. El producto M3 aparece a las 2 horas de irradiación y va aumentando su persistencia hasta alcanzar un 22% al finalizar el estudio.

Figura 44. Evolución de fotodegradación de Metrafenona irradiando con lámpara de arco de Xenon a 80 W a pH 9.2 en medio tampo.

A pH 12.0 (figura 45 a) y b)), aparece el metabolito M2 a partir de los 60 primeros minutos y va aumentando llegando a estabilizarse a las 4 horas en ambos casos en torno al 80%. Junto a M2 a parece también el producto M5 a partir de la primera hora que se mantiene estable durante todo el proceso de degradación.

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)


(a)


85

Cabe destacar que a pH 12.0 tampon, M2 corresponde a la suma de dos series, la correspondiente a [M2+H]+ y [M2+K]+ ya que ambas series pertenecen al mismo metabolito aunque están ionizadas con diferente elemento, en un caso M2 esta protonado y en el otro tiene un potasio en su estructura.

Figura 45. Evolución de fotodegradación de Metrafenona irradiando con lámpara de arco de Xenón a 80 W a pH 12.0 en medio tampón (a) y 12.0 (no tamponado) (b).

En medio básico M2 aparece en la primera hora y va aumentando su concentración hasta estabilizarse a partir de las 3 horas. Mientras que M5 se mantiene constante a lo largo de todo el estudio.

6.3. Degradación hidrolítica/térmica

La hidrólisis es otro de los procesos importantes en la degradación de un plaguicida. Las reacciones químicas que suelen darse en este proceso son sustituciones de grupos activos (carbonilos, halógenos, etc.) por grupos hidroxilo. La acidez del medio ambiente (pH) influye considerablemente en este proceso y la temperatura incrementa la velocidad de degradación.

Para realizar este estudio se prepararon disoluciones de plaguicida en concentración de 12 mg.L-1 en disolución hidroalcohólica MeOH (50% (v/v) a pH 2.0, 3.6, 6.2, 9.2 y 12.0 utilizando disoluciones tampón y cada una de ellas fue sometida a diferentes temperaturas (4ºC, 23ºC y 50ºC) y en total oscuridad.

El plazo de seguridad para Metrafenona (días que deben esperarse después de haber hecho un tratamiento para consumir un fruto o una planta) es de 28 días. En base a

0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500 %

per

sist

enci

a

tiempo (min)


0

20

40

60

80

100

120

0 100 200 300 400 500

% p

ersi

sten

cia

tiempo (min)

metrafenona pH 12 M2+H (331.1)

M2+K (369.1) M5 (437.2)

(b)


86

este dato, se establece que el periodo de estudio hidrolitico debe durar como mínimo el tiempo que marca este plazo de seguridad. Para obtener unos resultados más completos se decide estudiar la evolución del plaguicida durante un margen de tiempo mayor, por ello este estudio se realiza durante 40 días.

Durante el tiempo que duró el experimento se tomaron muestras de 500 L en diferentes días. Las muestras se filtraron en filtros de TEFLON 0.22 m y se analizaron directamente por HPLC en las condiciones establecidas.

6.3.1. Evolución de Metrafenona en el proceso de degradación.

Se siguió la evolución de la materia activa Metrafenona a lo largo del tiempo, a los diferentes pH y diferentes temperaturas. En la tabla 28 se muestra la persistencia de Metrafenona durante el periodo de estudio.

Tabla 28. Degradación de Metrafenona a 4±2ºC, 25±2ºC, 50±2ºC en disoluciones tampon Porcentaje de persistencia de Metrafenona 4ºC±2ºC

Día pH 2.0 pH 3.6 pH 6.0 pH 9.2 pH 12.0 0 100 102 100 100 100 5 94 100 96 94 96

17 90 93 93 93 94 28 89 90 102 95 92 40 91 102 102 94 87

23ºC±2ºC Día pH 2.0 pH 3.6 pH 6.0 pH 9.2 pH 12.0 0 100 102 100 104 100 5 95 85 93 101 96

17 92 109 108 96 88 28 82 101 105 90 86 40 81 102 97 92 81

50ºC±2ºC Día pH 2.0 pH 3.6 pH 6.0 pH 9.2 pH 12.0 0 99 102 100 104 105 5 100 92 103 107 96

17 95 96 100 104 103 28 90 93 93 92 97 40 71 92 95 95 83

A las diferentes temperaturas (4ºC, 23ºC y 50ºC) no se aprecia degradación en el intervalo de pH 3.6 a 9.2. Metrafenona se comporta como un plaguicida estable a la hidrólisis en este rango de pH.

A pH 2.0 y a pH 12.0, la concentración de Metrafenona disminuye entre un 9 y 13% a la temperatura de 4ºC, un 19% a 23ºC, y hasta un 21 a 29% a la temperatura de 50ºC.


87

En estos casos sí que se puede decir que hay degradación de la materia activa Metrafenona.

6.3.2. Productos de degradación en el proceso de hidrólisis.

Las muestras analizadas por HPLC se llevaron a UPLC-MS para estudiar los diferentes productos de degradación que la hidrólisis pudiera generar.

Durante esta degradación química aparecieron metabolitos a pH 12.0 de naturaleza transitoria, es decir, metabolitos que aparecen a un tiempo de estudio determinado y que pasados unos días, en la siguiente toma de muestra ha desaparecido y aparece otro, de masa molecular y tiempo de retención diferentes.

Solo han podido observarse productos de degradación a pH 12.0, en el resto de pH no se han visto señales cromatográficas pertenecientes a ningún producto de degradación. Parece ser que los metabolitos a lo largo del proceso de hidrólisis siguen degradándose hasta la mineralización total (CO2, H2O, etc.)

Las señales cromatográficas obtenidas para los productos de degradación a pH 12.0 fueron de muy baja intensidad, por lo que no pudo hacerse un MS-MS para determinar las rupturas y así obtener la posible estructura molecular de cada metabolito. En la figura 46 se muestran los cromatogramas a pH 12.0 superpuestos en los que aparecen los metabolitos M6 y M7.

Figura 46. Cromatogramas superpuestos a pH 12.0 donde aparecen los metabolitos de la hidrólisis M6 y M7.

Metrafenona

M6 M7


88

En la figura 47 se muestran los espectros del masas para los dos metabolitos que han podido verse a pH 12.0 en la hidrólisis.

En la tabla 29 se detallan los tiempos de retención y la relación m/z de los iones que aparecen en la hidrólisis.

Tabla 29. Tiempos de retención e ion de los metabolitos encontrados en la hidrólisis de Metrafenona. Compuesto tiempo (min) Ion (m/z)

Pdto de degradación M6 1.34 387.1808 Pdto de degradación M7 2.14 415.2109

De estos espectros se puede determinar que en ninguno de los dos metabolitos el bromo está presente en su estructura ya que no se observa la doble señal correspondiente a la relación isotópica de este elemento.

El ion de m/z 415.21 protonado que aparece a tiempo de retención 2.14 min podría corresponderse con el metabolito M5 visto en la fotodegradación, también a pH 12.0 y el cual aparecía al mismo tiempo de retención que este, pero no se ha podido confirmar.

Es necesario un estudio más exhaustivo para la identificación de estos productos de degradación.

(a) (b)

267.1232

387.1808

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10Intens.

100 200 300 400Figura 47. Espectro de masas del metabolito observado a t=17 días pH 12.0 50ºC (a) y del metabolito a t=28 días pH 12.0 50ºC (b).

119.0848

415.2109

851.3936

0

500

1000

1500

2000

2500

3000Intens.

200 400 600 800


89

CAPÍTULO 7. REACTIVIDAD DE METRAFENONA CON COMPUESTOS

NITROGENADOS


90

REACTIVIDAD QUÍMICA DE METRAFENONA CON COMPUESTOS NITROGENADOS CAPÍTULO 7

91

Durante el desarrollo de este trabajo se ha observado que en presencia de un compuesto nitrogenado, amoniaco, el plaguicida Metrafenona reacciona químicamente con el nitrógeno del medio.

En base a que este producto es un plaguicida, y por lo tanto puede entran en contacto con frutas, verduras, plantas, aguas, suelos… que pueden contener compuestos nitrogenados, ya sea proveniente de bacterias, del propio suelo, de fertilizantes o abonos, etc. se decidió estudiar esta reactividad con diferentes compuestos que contuvieran nitrógeno en su estructura y que pudieran estar presentes en el medio ambiente para observar el efecto sobre este fungicida.

7.1. Ciclo del nitrógeno

La figura 48 muestra la relación existente entre los diferentes niveles en el ciclo que el nitrógeno tiene en el medio ambiente.

Figura 48. Ciclo del nitrógeno en el medio ambiente


92

La reserva principal de nitrógeno es la atmósfera (el nitrógeno representa el 78 % de los gases atmosféricos). La mayoría de los seres vivos no pueden utilizar el nitrógeno elemental de la atmósfera para elaborar aminoácidos ni otros compuestos nitrogenados, de modo que dependen del nitrógeno que existe en las sales minerales del suelo. Por lo tanto, a pesar de la abundancia de nitrógeno en la biosfera, muchas veces el factor principal que limita el crecimiento vegetal es la escasez de nitrógeno en el suelo. El proceso por el cual esta cantidad limitada de nitrógeno circula sin cesar por el mundo de los organismos vivos se conoce como ciclo del nitrógeno.

Las tres principales etapas del ciclo son:

Amonificación: Gran parte del nitrógeno del suelo consiste en compuestos orgánicos complejos (proteínas, aminoácidos, etc.). Estos compuestos suelen ser degradados a compuestos simples por los organismos que viven en el suelo (bacterias y hongos). Estos microorganismos utilizan las proteínas y aminoácidos y liberan el exceso de nitrógeno como amoníaco (NH3) o amonio (NH4

+).

Nitrificación: Un grupo de bacterias comunes en el suelo oxida el amoníaco (o amonio) a nitrito (NO2

-) tóxico para las plantas. Otras bacterias oxidan el nitrito a nitrato (NO3

-), que es la forma en que la mayor parte del nitrógeno pasa del suelo a las raíces.

Asimilación: Una vez que el nitrato está dentro de la célula de la planta, se

reduce de nuevo a amonio. Este proceso se denomina asimilación y requiere energía.

Los nitratos pueden almacenarse en el humus en descomposición o desaparecer del suelo por lixiviación. Otra posibilidad es convertirse en nitrógeno mediante la desnitrificación y volver a la atmósfera según el ciclo que se muestra en la figura 49.

Figura 49. Ciclo del nitrato hasta convertirse en nitrógeno.

N2

NO3-

NO2-

NO

N2O


93

En las aguas superficiales la concentración de nitratos es habitualmente baja, de algunos mg/l (excepto que exista un nivel importante de contaminación). En los acuíferos la concentración es superior a la que encontramos en aguas superficiales. La utilización de fertilizantes nitrogenados, que se infiltran en el suelo, y los vertidos de deshechos sanitarios e industriales contribuyen al aumento de la concentración de nitratos en los acuíferos subterráneos. Estos terminan oxidándose a nitritos.

En general, la concentración de nitritos en el agua superficial es muy baja, pero puede aparecer ocasionalmente en concentraciones elevadas debido a la contaminación industrial y de aguas residuales domésticas (Albert, 1990; Gray, 1996; Prado y Marañón, 1997; Prat et al., 1999).

Las aguas superficiales bien aireadas generalmente contienen poco amoníaco (0.10 mg.L-1). Niveles superiores de amoníaco son indicativos de contaminación debida principalmente a las aguas residuales (proveniente de la descomposición de la urea por parte de las bacterias ureasas). El agua de lluvia, debido a la disolución del nitrógeno de la atmósfera, puede presentar algunas trazas.

Así, los compuestos nitrogenados con los que se decidió trabajar fueron nitrato y nitrito con sales de sodio, y amoniaco.

7.2. Legislación sobre nitratos y nitritos.

Los nitratos (NO3-) y los nitritos (NO2

-), pueden encontrarse en pequeñas cantidades en el suelo, los alimentos, o las aguas (superficiales y subterráneas). Algunos vegetales, fundamentalmente los de hoja, tienen gran capacidad de acumulación de nitratos y escasa de nitritos. En función del tipo de vegetal la cantidad de nitratos suele oscilar entre 200 y 2500 mg.kg-1 (m/m).

La ingesta diaria admisible según la FAO/OMS (JEFCA) en el año 2002 estableció los valores de nitrato y nitrito en función del peso corporal (tabla 30).

Por lo tanto una persona que pese 70 kg, no puede ingerir al día más de 259 mg de nitratos, y tampoco más de 4.9 mg de nitritos.

En las aguas de consumo, la Organización Mundial de la Salud (OMS), señaló como valor máximo orientativo la cantidad de 50 mg.L-1 de “ion nitrato”. Este límite se


94

estableció para prevenir el principal problema toxico de los nitratos/nitritos que se produce en los niños menores de cuatro meses (metahemoglobinemia)

En la tabla 30 se muestran los valores establecidos por la legislación española (Real Decreto 140/2003 de 7 de febrero).

Tabla 30. Ingesta diaria admitida 2002 JEFCA de nitratos y nitritos para el ser humano; y valor máximo orientativo de aguas de consumo por la legislación española.

ION Ingesta diaria admitida (IDA) Valor máximo orientativo nitrato (NO3

-) 0 – 3.7 mg.kg-1 de peso corporal 50 mg.L-1 nitrito (NO2

-) 0 – 0.07 mg.kg-1 de peso corporal 0.5 mg.L-1 amonio (NH4

+) 0.2 mg.L-1

7.3. Reactividad de Metrafenona con compuestos nitrogenados

Para el estudio, las concentraciones de nitratos/nitritos y amonio/amoniaco, se establecieron en base a la normativa española vigente. El estudio se realizó a concentración cien veces superior a la establecida en la ley y a dos niveles de pH: 4.0 y 9.0, que fueron ajustados con pHmetro con ayuda de HCl y NaOH. Se eligieron estos dos valores de pH dado que la reducción de nitratos a nitritos que se da en el medio natural es pH dependiente, no dándose en valores inferiores a 4.0 y superiores a 9.0; además este rango de pH es el que se encuentra, normalmente, en las aguas naturales.

El método experimental se basa en la fotólisis de disoluciones de Metrafenona (12 mg.L-1) en presencia de disoluciones de NaNO3 (0.8 mmol.L-1), NaNO2 (0.015 mmol.L1) y NH3 (0.015 mmol.L-1), utilizando irradiación de luz proveniente del simulador solar con lámpara de Xenón descrito en el Capitulo 6.

La irradiación de las diferentes muestras se realizó durante un periodo de tiempo de 9 horas, a temperatura de 23±2ºC. Se tomaron muestras de 500 l a tiempo cero y a tiempo final para ver la aparición de los productos de degradación o de reacción obtenidos.

Mediante las técnicas analíticas UPLC y espectrometría de masas se obtuvieron los siguientes resultados:


95

209.0811

409.0621

+MS, 3.62min #428

149.0608

209.0822

331.1510

+MS, 1.86min #220

0.25

0.50

0.75

1.00

1.25

4x10Intens.

1000

2000

3000

4000

5000

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

NITRATOS:

En la figura 50 se muestra el espectro de masas a tiempo final de medición de Metrafenona tras sufrir una fotodegradación en presencia de iones nitrato en el medio donde se observa el ion Metrafenona y el ion de m/z 331.15.

Figura 50. Espectro de masas a t= 480 min que muestra los iones encontrados y sus tiempos de retención con nitratos en el medio.

Tanto en medio ácido, como en medio básico, el único producto de degradación que se obtiene es el metabolito M2 como se muestra en la tabla 31.

Tabla 31. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 (con nitratos en el medio) en UPLC-MS. [M+H]+ Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z)

Pdto de degradación (NO3-) M2 1.86 [C19H23O5]+ 331.1510

[METRAFENONA]

[M2+H]+


96

209.0824

409.0633

+MS, 3.64min #431

149.0613

209.0817

331.1523

+MS, 1.85min #2190.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

4x10Intens.

0.0

0.5

1.0

1.5

4x10

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

NITRITOS:

En presencia de nitritos en el medio, solo se obtiene un producto de degradación como se muestra en el espectro de masas de la figura 51.

Figura 51. Espectro de masas a t= 480 min que muestra los iones encontrados y sus tiempos de retención con nitritos en el medio.

Al igual que ocurre con los nitratos, independientemente del medio en el que se provoque la fotodegradación (pH4, pH 9) el único metabolito que se obtiene es M2 como se observa en la tabla 32.

Tabla 32. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 (con nitritos en el medio) en UPLC-MS. [M+H]+ Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z)

Pdto de degradación (NO2-) M2 1.85 [C19H23O5]+ 331.1523

[M2+H]+

[METRAFENONA]


97

115.0401

209.0831

409.0633

+MS, 3.63min #430

149.0620

209.0819

331.1525

+MS, 1.86min #220

345.1311

+MS, 1.08min #128

0

500

1000

1500

Intens.

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.24x10

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.24x10

100 200 300 400 500 600 700 800 m/z

AMONIACO:

En la figura 52 se muestra el espectro de masas obtenido al hacer la fotodegradación de Metrafenona con amoniaco en el medio. Se observa que en este caso se forman dos productos de degradación.

.

Los metabolitos que se obtienen, al igual que en los casos anteriores, independientemente del medio en el que se encuentre la disolucion son los correspondientes a M2 y a M3 como se muestran en la tabla 35. Tabla 33. Tiempo de retención e ion del producto de degradación M2 [M+H]+ y M3 (con amoniaco en el medio) en UPLC-MS.

Compuesto tiempo (min) Fórmula molecular Ion (m/z) Pdto de degradación M2 1.86 [C19H23O5]+ 331.1525 Pdto de degradación M3 1.08 [C19H23O5N] 345.1311

No se observaron reacciones químicas de Metrafenona con nitratos ni nitritos en los diferentes medios. Esto significa que este plaguicida no reacciona con estos compuestos, bien por su naturaleza, o bien debido a que estos compuestos no son reactivos a la longitud de onda emitida por la lámpara de Xenón (los nitratos absorben a 220 nm).

Sin embargo, en un medio amoniacal Metrafenona si que reacciona químicamente dando M3 como producto de reacción.

[METRAFENONA]

[M2+H]+

[M3]

Figura 52. Espectro de masas a t=480 min de estudio que muestra los iones encontrados y sus tiempos de retención con amoniaco en el medio


98

CAPÍTULO 8. CONCLUSIONES

CONCLUSIONES CAPÍTULO 8

101

A partir de los datos obtenidos en los procesos de degradación (tanto fotoquímica, como por hidrólisis) y los resultados obtenidos del estudio con los reactivos nitrogenados, se recogen las siguientes conclusiones:

I. El plaguicida Metrafenona tiene un máximo de absorción a 200 nm, y un máximo relativo a 290 nm cinco veces menor en intensidad.

II. Se desarrolló un método cromatográfica basado en cromatografía líquida tanto HPLC como UPLC. Este método propuesto para el estudio sigue una tendencia lineal, es selectivo, y preciso, dando valores aceptables tanto de repetibilidad como de precisión intermedia.

III. La degradación de Metrafenona se ajusta una cinética de primer orden en todos los casos de pH estudiados, con disoluciones tampón y sin ellas. Los valores de correlación lineal son superiores a 0.99 en todos los casos (excepto en matriz mosto).

IV. A pH 6.0 no tampón existe una reacción química con amoniaco de tal modo que disminuye en concentración y por ello disminuye el valor de pH de 6.0 inicial a 2.9 final obteniendo además la cinetica mas elevada de todos los medios no tampón, y superior a la obtenida para pH 6.0 en medio tampón.

V. En el estudio de fotolisis todas las disoluciones estudiadas de Metrafenona se degradan un 80% entre las 6 y las 8 horas (excepto en mosto cuya degradación es del 12% a las 9 horas de irradiación). En el estudio de hidrólisis durante 40 días (a diferentes pH y temperaturas) se observa que Metrafenona es estable a la degradación en el rango de pH (3.6 a 9.2) mientras que a pH 2.0 y pH 12.0 existe degradación aunque ésta es inferior a la producida en la fotolisis.

VI. En la fotodegradación se obtienen cuatro metabolitos. El metabolito mayoritario de degradación es M2 que aparece en todos los casos independiente del pH. Este metabolito tiene un PM=330.38 g.mol-1. Cuando el plaguicida se encuentra en medio amoniacal sufre reacción química con el medio generando los productos de degradación M3 (PM= 345.17 g.mol-1) y M4 (PM= 239.16 g.mol-1). Sin embargo, en otros medios o con otros reactivos nitrogenados como sales de nitrito o nitrato no hay reacción química de este plaguicida.

CONCLUSIONES CAPÍTULO 8

102

A pH 12.0 se obtiene el producto de degradación M5 (PM= 414.18 g.mol-1) proveniente de una reacción fotoquímica. Los metabolitos se han podido identificar mediante empleo de espectrometría de masas, y MS-MS gracias a la información obtenida de la fragmentación de los iones precursores.

VII. En el estudio de degradación hidrolítica se observa la formación de metabolitos de vida transitoria. Algunos de esos metabolitos tiene relación m/z= 387.1808 y 415.2109. Estos no pudieron determinarse debido a la baja concentración en la que se encontraron.

VIII. La fotodegradación de Metrafenona no pasa por ninguna vía hidrolítica puesto que ambos procesos dan metabolitos diferentes.

CAPITULO 9. BIBLIOGRAFÍA

BIBLIOGRAFÍA CAPÍTULO 9

105

1. C.D.S. Tomin, “The Pesticide Manual, a World Compendium”, 11a Edición. British Crop Protection Council. Croydon, UK, 1997.

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4. E.R. Bandala, J.A. Octaviano, V. Albiter y L.G. Torres, “Designing and Applying Treatment Technologies 1998”, 177-182. G.B. Wickramanayake, y R.E. Hinchee (Eds). Battelle Press. Columbus, Ohio, USA, 1998.

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CINÉTICAS DE FOTODEGRADACIÓN DE METRAFENONA ANEXO I

107

ANEXO I. CINÉTICAS DE FOTODEGRADACIÓN DE METRAFENONA

Cinética de fotodegradación de Metrafenona irradiando con lámpara de arco de Xenón a 80 W en los diferentes pH, diferentes medios y en mosto.

-ln[A]= (-4,6461±0.0688)+(0.0063±0.0004)t pH 2 tamponado

-ln[A]= (0.0362±0.0502)+(0.0026±0.0002)t pH 2 no tamponado

-ln[A]= (-4.9734±0.0576)+(0.0042±0.0006)t pH 3.6 tamponado

-ln[A]= -0.0391±0.0759)+(0.0054±0.0003)t pH 6.0 tamponado

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400

-ln A

rea

tiempo (min)

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400

-ln A

rea

tiempo (min)

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400 500

-ln A

rea

tiempo (min)

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400 500

-lnAr

ea

tiempo (min)


108

-ln[A]= (-4.6126±0.0556)+ (0.0037±0.0002)t

pH 6.0 no tamponado



-ln[A]= (0.0485±0.1045)+(0.0045±0.0003)t pH 12.0 no tamponado

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400 500

-ln A

rea

tiempo (min)

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400 500

-ln A

rea

tiempo (min)

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400 500

-ln A

rea

tiempo (min)

-5

-4

-3

-2

0 100 200 300 400 500

-ln A

rea

tiempo (min)


109

-ln[A]= (-4.7098±0.0858)+(0.0006±0.0006)t Mosto (0-240 min)

-4,8

-4,7

-4,6

-4,5

-4,4

0 50 100 150 200 250

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