Estudo biofarmacognóstico de Acanthospermum australe (Loefl.) O

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Frmaco e Medicamentos

rea de Insumos Farmacuticos

Estudo biofarmacognstico

de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

Asteraceae

Roberto Tsuyoshi Adati

Tese para obteno do grau de

DOUTOR

Orientador:

Prof. Dr. Vicente de Oliveira Ferro

So Paulo

2006

Roberto Tsuyoshi Adati

Estudo biofarmacognstico

de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

Asteraceae

Comisso Julgadora da

Tese para obteno do grau de

Doutor

Prof. Dr. Vicente de Oliveira Ferro

Orientador/Presidente

Prof. Dra. Elizabeth Igne Ferreira

1. Examinador

Prof. Dra. Adriana Lenita Meyer Albiero

2. Examinador

Prof. Dra. Ivana Barbosa Suffredini

3. Examinador

Prof. Dra. Helena Onishi Ferraz

4. Examinador

So Paulo, 21 de fevereiro de 2006.

Toshie!

Obrigado por sua bravura e o orgulho, que possibilitaram que eu e meus

irmos tivssemos a chance de estudarmos, e por provar a todos ns, que podemos

viver nesta sociedade com dignidade e respeito.

Obrigado por ter semeado em nossos coraes o esprito de unio entre

irmos e por mostrar que a vida pode ser muito bela, mesmo estando diante de

inmeras dificuldades.

Meus eternos agradecimentos a voc, por ter tido muito amor, f em Deus e

por ter acreditado e confiado na medicina popular, quando os profissionais da sade

j no criam mais em minha sobrevivncia.

Este trabalho , portanto, dedicado a voc, minha me, pois a voc eu devo

todo meu crescimento e a minha vida!

Tabelas Vll

Tabela 1: Classificao de Asteraceae, segundo 8entham e Hoffmann. 11

Tabela 2: Classificao de Asteraceae, com nmero de subtribos, gneros e 12

espcies.

Tabela 3: Ensaios para deteco de grupos de princpios ativos em partes 35

areas de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze.

Tabela 4: Grupos de princpios ativos em partes areas de Acanthospermum 60

australe (Loefl.) O. Kuntze.

Tabela 5: Componentes majoritrios do leo essencial de Acanthospermum 63

australe (Loefl) O. Kuntze, extrado por hidrodestilao da droga, constituda

de folhas e caules coletadas em janeiro de 2003, quando a planta encontrava-

se em fase final de frutificao.


australe (Loefl) O. Kuntze, extrado por hidrodestilao da droga, constituda

de caules coletadas em janeiro de 2003, quando a planta encontrava-se em

fase final de frutificao.


australe (Loefl) O. Kuntze, extrado por hidrodestilao de folhas frescas,

coletadas em outubro de 2005, quando a planta encontrava-se em fase de

florao.


australe (Loefl) O. Kuntze, extrado por hidrodestilao de folhas frescas,

coletadas em novembro de 2005, quando a planta encontrava-se em fase

inicial de frutificao.

Tabela 9: Composio percentual do leo essencial de Acanthospermum 67

australe (Loefl) O. Kuntze coletado em diferentes pocas do ano.

Tabela 10: Comparao dos diferentes mtodos de extrao e rendimento dos 68

extratos de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze.

Tabela 11: Comparao da rea total do estmago, rea total da leso e rea 85

relativa da leso do grupo de ratos controles tratados com gua, via oral, no

ensaio antilcera agudo, com modelo de induo por cido clordrico e etanol.

Tabelas Vlll

Tabela 12: Comparao da rea total do estmago, rea total da leso e 86

rea relativa da leso do grupo de ratos tratados com uma dose de 400

mg/kg de extrato hidroetanlico liofilizado (EHL), via oral, no ensaio antilcera

agudo, com modelo de induo por cido clordrico e etano!.

Tabela 13: Comparao da rea total do estmago, rea total da leso e 87

rea relativa da leso do grupo de ratos tratados com cloridrato de ranitidina

na dose de 100 IJg/kg, via oral, no ensaio antilcera agudo, com modelo de

induo por cido clordrico e etano!.

Abreviaturas

ARL - rea Relativa da Leso

AT - rea Total do Estmago

ATL - rea Total da Leso

CCD - Cromatografia em Camada Delgada

CG - Cromatografia Gasosa

CG/EM - Cromatografia Gasosa acoplada a Espectrometria de Massa

EHL - Extrato Hidroetanlico Liofilizado

EM - Espectro de Massas

1.1 - ndice de Intumescimento

PM - Peso molecular

UFC - Unidade Formadora de Colnia

USP - Universidade de So Paulo

WHO - World Health Organization! ! I

IX

Resumo x

Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze, conhecido popularmente no

Brasil como carrapichinho pertence famlia Asteraceae e utilizado na medicina

popular como hepatoprotetora, diafortica, antiblenorrgica, antimalrica, entre

outras funes. O objetivo do presente trabalho foi estudar a espcie sob o aspecto

botnico, qumico e farmacolgico. Assim, folhas e caules foram analisados macro e

microscopicamente, contribuindo no auxlio da diagnose da espcie. Os rgos em

estudo foram submetidos a ensaios preliminares para a pesquisa dos principais

grupos de princpios ativos provenientes do metabolismo secundrio dos vegetais.

Diferentes extratos foram obtidos por percolao e por decoco, sendo alguns de

seus componentes isolados por CCD preparativa e identificadas por CG/EM. O leo

essencial do vegetal, coletado em diferentes pocas do ano e variados estgios de

desenvolvimento, foi obtido em aparelho de Clevenger modificado, sendo que sua

composio tambm foi analisada por CG/EM. O extrato clorofrmico e o extrato

hidroetanlico liofilizado (EHL) foram avaliados quanto atividade antimalrica e

antileishmania. Com o EHL foi realizado tambm ensaio de atividade antilcera em

ratos Wistar Hannover fmeas e atividade antimicrobiana em bactrias e fungos. A

espcie em estudo, nas condies deste trabalho, apresentou flavonides, taninos,

saponinas, leo essencial e mucilagens. O extrato clorofrmico e hidroetanlico

liofilizado, nas concentraes de 100 IJg/mL, provocaram 100% de morte dos

protozorios de Plasmodium chabaudi AJ, porm ambos no apresentaram

atividade em promastigotas de Leishmania (L.) chagasi nesta concentrao. O EHL

na concentrao de 10 mg/mL demonstrou significativa atividade antifngica contra

o Aspergillus niger, no apresentando nenhuma atividade para Staphylococcus

aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia col e Candida albicans. O mesmo

extrato, na concentrao de 400 mg/kg, administrada por via oral, mostrou-se com

atividade antilcera aguda significativa, reduzindo a rea Total de Leso (ATL) em

49,13% em relao ao controle. O leo essencial, nas condies do experimento,

apresentou diferenas qualitativas e quantitativas quando comparado a estudos j

realizados, sendo constitudo em sua maioria por sesquiterpenos dos grupos

cadinano (a-cadinol e -cadineno), cariofilano (~-cariofileno) e, principalmente,

germacrano (globulol). As anlises permitiram concluir ainda que o ismero do

espatulenol o componente exclusivo e majoritrio do leo essencial de caule e o

ismero do globulol, o componente presente em maior quantidade no leo quando o

vegetal encontra-se em fase de florao.

Abstract Xl

Acanthospermum austra/e (Loefl.) O. Kuntze, known popularly in Brazil as

carrapichinho belongs to the family Asteraceae and it is used in the tradicional

medicine as hepatic protector, diaforetic, blenorragic activity, antimalarial activity

among others. The objective of the present work was to study this species under the

aspect botanical, chemical and pharmacological. Thus, leaves and stems were

analyzed macro and microscopic contributing in the aid of the diagnosis of species.

The aerial parts in study were submitted to preliminary phytochemical screening for

the research of the main groups of secondary metabolites of plants. Different extracts

were obtained by percolation and for decoction being some of their components,

isolated for TLC preparative and identified for GC/MS. The essential oil of the plants,

collected at different seasons of the year and different development stadiums, it was

obtained in a Clevenger apparatus, and it composition, was also analyzed by

GC/MS. The chloroformic extract and liofilized hidroethanolic extract (LHE) were

assayed for the antimalarial and antileishmania activities. Using LHE it was also

assayed for the anti ulcer activity in mice Wistar Hannover females and antimicrobial

activity in bacteria and fungi. The species in study, in conditions of this work,

presented f1avonoids, tannins, saponnins, essential oil and mucilages. The

chloroformic extract and LHE in the concentrations of 100 IJg/mL caused 100% of

death in the blood forms of P/asmodium chabaudi AJ, however nane of them

presented activity in blood forms of Leishmania (L.) chagasi in this concentration.

LHE in the concentration of 10 mg/mL presented significant antifungal activity against

the Aspergillus niger, and no activity against Staphy/ococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa, Escherichia col and Candida a/bicans. The same extract, in the

concentration of 400 mg/kg, administered orally, presented significant antiulcerogenic

activity, reducing the Total Area of Lesion (TAL) in 49,13% in relation to the control.

The essential oil, in the conditions of the experiment, presented qualitative and

quantitative differences when compared to previous studies and constituted in its

majority by sesquiterpenes of the cadinano groups (a-cadinol and -cadinene),

caryophyllano (13-caryophyllene) and mainly, germacrano (globulol). The analyses

still permit to conclude that the isomer of the spathulenol is the exclusive and mayor

component of the essential oil in the stem. Isomer of the globulol is the

representative present in mayor amount in the oil when the plant is in f10wer stadium.

Introduo 2

Doenas infecciosas causam grande sofrimento a milhes de pessoas em

todo mundo, principalmente em pases tropicais e subtropicais em desenvolvimento,

incluindo um forte impacto na economia e problemas Sade Pblica (TROUILLER

et ai., 2001). Dentre as principais doenas tropicais, as causadas por protozorios

apresentam alta morbidade e/ou mortalidade, sendo representadas pela

Leishmaniose, Doena de Chagas e Malria (REMME et ai., 1993). Afetam grandes

populaes marginais ao processo econmico globalizado e, desta forma, no so

vistas como mercados potenciais para indstrias farmacuticas (PECOUL et ai.,

1999).

o uso de compostos naturais extrados de plantas como matria-prima parasntese de novas substncias bioativas, especialmente frmacos, tem sido

amplamente relatado ao longo do tempo. As plantas so fontes importantes de

produtos naturais biologicamente ativos, muitos dos quais constituem-se em

modelos para a sntese de um grande nmero de frmacos (WALL & WANI, 1996).

De forma similar aos microorganismos, as plantas produzem uma grande

diversidade de compostos qumicos. Ao se considerar a perspectiva de obteno de

novos frmacos, dois aspectos distinguem os produtos de origem natural dos

sintticos: a diversidade molecular e a funo biolgica. A diversidade molecular dos

produtos naturais muito superior quela derivada dos processos de sntese que,

apesar dos avanos considerveis, ainda limitada. Alm disso, como produtos de

organismos que possuem muitas similaridades com o metabolismo dos mamferos,

os produtos naturais muitas vezes exibem propriedades adicionais s

antimicrobianas a eles associadas (NISBET, 1997).

A pesquisa fitoqumica tem por objetivos conhecer os constituintes qumicos

de espcies vegetais ou avaliar a sua presena. Quando no se dispe de estudos

qumicos sobre a espcie de interesse, a anlise fitoqumica preliminar pode indicar

os grupos de metablitos secundrios relevantes na mesma (SIMES et ai., 2004).

Informaes obtidas junto populao constituem estratgias para

investigao de plantas medicinais, que permitem combinar dados adquiridos junto a

comunidades locais que fazem uso da flora medicinal, com estudo qumico e

farmacolgico realizados em laboratrios especializados. A seleo de espcies

vegetais para pesquisa e desenvolvimento de frmacos baseada na alegao de um

dado efeito teraputico em humanos, pode se constituir num valioso atalho para a

Introduo 3

descoberta de frmacos, j que seu uso tradicional permite que seja encarado como

uma pr-triagem quanto utilidade teraputica em humanos.

Aproximadamente 2000 espcies com ocorrncia no Brasil so empregadas

na medicina popular (DI STASI, 2002), sendo que muitas delas pertencem famlia

Asteraceae.

As espcies pertencentes a esta famlia so do tipo cosmopolita,

encontradas especialmente em regies montanhosas temperadas ou tropicais e em

campos abertos e/ou secos (JUOD, 1999). uma das mais importantes famlias de

plantas vasculares florescentes no mundo, compreendendo 1535 gneros e

aproximadamente 23.000 espcies (JUOO, 1999). No Brasil ocorrem mais de 180

gneros (BARROSO, 1991).

Por mais de 10 anos, HEGNAUER (1964) resumiu a qumica da Asteraceae

e discutiu as implicaes sistemticas gerando concluses muito importantes.

Segundo Hegnauer, a famlia Asteraceae quimicamente muito distinta, possuindo

substncias como frutose, leo em sementes, algumas contendo cidos graxos,

lactonas sesquiterpnicas, alcois triterpnicos pentacclicos, derivados do cido

cafico, f1avonas, flavonis metilados, leo essencial, flavonides, alcalides e

heterosdeos cianognicos.

Um estudo realizado por HEYWOOO, HARBORNE & TURNER (1977)

comprovou as informaes geradas por HEGNAUER (1964), concluindo que

Asteraceae compreende uma famlia com variedades de plantas com propriedades

medicinais. Alguns exemplos podem ser citados, tais como a Taraxacum officinalis,

Amica montana L., Artemisia absinthium L. (HEYWOOD, 1977) e Acanthospermum

australe (Loefl.) O. Kuntze, popularmente chamada de carrapichinho. Esta ltima

muito comum em nosso pas, conhecida pela medicina tradicional brasileira que

utiliza o extrato, proveniente de partes areas ou mesmo da planta inteira, visando

obteno de vrias atividades como antimalrica, antianmica, anti-sptica do trato

urinrio (MORS, 2000), antiblenorrgica e s vezes em caso de irisipela (CORRA,

1984; LORENZI, 2000; MORS, 2000).

A referida espcie explorada ainda por sua propriedade tnica, diafortica,

mucilaginosa, aromtica e antidiarrica (PENNA, 1941, CORRA, 1984; LORENZI,

2000; MORS, 2000), em casos de febres palustres e intermitentes (CORRA, 1984;

Introduo 4

LORENZI, 2000) e no tratamento da tosse, bronquite, distrbios do fgado e como

expectorante (PENNA, 1941).

Dentre todos os usos populares desta espcie citados anteriormente, a ao

antimalrica chama ateno, devido ao fato da doena ser ainda um problema

mdico-sanitrio com repercusses sociais e econmicas muito importantes

(FERREIRA, 2002), aliado ao fato que para esta doena no esto disponveis

ainda, vacinas.

A malria uma importante causa de doena e morte de crianas e adultos

em pases tropicais (WHO, 2006). Esta parasitose causada por protozorios do

gnero Plasmodium, sendo que o maior obstculo quimioterapia antimalrica o

aumento da incidncia de cepas resistentes de Plasmodium (BABIKER et aI., 2005,

BARNES et aI., 2005; WHO, 2006).

At o final de 2004, 107 pases e territrios apresentavam reas de riscos

para a transmisso desta doena. Aproximadamente 350 a 500 milhes de

episdios clnicos de malria ocorrem anualmente, sendo que a maior parte das

infeces causada por Plasmodium falciparum e Plasmodium vivax (WHO, 2005).

A malria causada por P. falciparum, concomitante a outras infeces e

doenas, leva a mais de um milho de mortes por ano, principalmente, em crianas.

Dentre os 60% dos casos de malria mundial, aproximadamente 75% causado por

P. falciparum, sendo que mais de 80% de mortes por malria, ocorrem na frica Sul,

no Sahara. Esta doena a maior causadora de anemia em crianas e mulheres

gestantes, assim como tambm pelo baixo peso infantil, partos precoces e

mortalidade infantil (WHO, 2005).

A atual resistncia do Plasmodium falciparum, principalmente aos

medicamentos mais utilizados na cHnica como a cloroquina ou associaes como

sulfadoxina-pirimetamina, vem provocando preocupao e ateno especial por

parte dos pesquisadores (BABIKER et aI., 2005, BARNES et aI., 2005; WHO, 2006).

A descoberta e desenvolvimento de derivados de artemisinina na China e sua

avaliao no sudeste da sia e outras regies originaram uma nova classe de

antimalrico altamente efetivo, que mudou a quimioterapia desta doena no sudeste

da sia. As terapias combinadas baseadas em artemisinina so, atualmente,

consideradas as melhores no tratamento para a descomplicada malria falcipariana

(WHO, 2006).

Estudos dos extratos de Acanthospennum australe (Loefl.) O. Kuntze, in vivo,

utilizando camundongos BALB/c infectados com Plasmodium berghei, apresentaram

considervel atividade antimalrica (CARVALHO et aI., 1991), porm nenhum

estudo foi realizado at o momento contra o clone AJ de Plasmodium chabaudi, o

qual se apresenta usualmente mais resistente a drogas que outros modelos

(MARTINELLI et ai., 2005).

Atravs de anlises genticas, vem sendo demonstrado que o Plasmodium

chabaudi pode ser considerado o modelo de malria de roedor para a malria

humana, com caractersticas importantes, como resistncia a drogas e imunidade

(MARTINELLI et ai., 2005).

Devido ao fato dos dois principais agentes antimalricos (quinina e

artemisinina), serem de origem vegetal, a busca por componentes ativos oriundos de

plantas tm sido uma constante mundial (SAXENA, et ai., 2003).

No presente trabalho, a atividade contra cepas da Leishmania (L) chagasi foi

testada devido ao fato de um membro da famlia, Jasonia glutinosa, ter apresentado

esta atividade, devido a um sesquiterpeno (VILLAESCUSA-CASTILLO et. aI.,

2000).

5Introduo

Publicaes relacionadas qumica dos compostos de Asteraceae, assim

como a do seu exemplar, Acanthospennum australe tm sido relatadas, porm

investigaes envolvendo os aspectos botnicos no existem na literatura. A

importncia em se caracterizar botanicamente uma espcie vegetal atravs de

estudos morfolgicos e anatmicos de seus rgos constitui uma ferramenta de

suma importncia na diagnose de drogas vegetais, influenciando tambm o controle

de qualidade de produtos a partir dela preparados.

As descries de morfologia e anatomia de uma determinada especle

vegetal permitem aos pesquisadores descobrirem se a mesma produz ou no certos

grupos de substncias, dentre eles, o leo essencial. Este grupo de princpio ativo

uma mistura complexa de muitas substncias simples, geralmente monoterpenos e

sesquiterpenos, onde cada um desses constituintes contribui para um efeito benfico

ou adverso do leo.

Apresentando esta comunicao, deseja-se tornar bem conhecida esta

espcie da famlia Asteraceae, uma planta medicinal pouco estudada e facilmente

adquirida em pastos e pomares ou ainda beira de trilhos de trem e que,

selecionada e cultivada poder ter grande aplicao industrial, pelo seu valor

medicinal.

Os leos essenciais so produtos naturais de grande valor, usados como

materiais brutos em muitos campos, incluindo perfumes, cosmticos, aromaterapia,

fitoterapia e alimentos (BUCHBAUER, 2000). Muitos estudos sobre as atividades

biolgicas dos leos essenciais tm sido publicados, relacionando as alteraes de

composio qumica, qualitativas e/ou quantitativas que ocorrem quando seus

respectivos vegetais produtores so provenientes de regies e estgios de

desenvolvimento diferentes, o que implica em aes biolgicas discordantes para os

leos da mesma espcie (PANIZZI, et aI., 1993).

Introduo 6

SOA!lafqo

Objetivos 8

Constituem objetivos desta tese:

- Estudar a espcie vegetal Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze, sob o

aspecto botnico, qumico e farmacolgico.

Sob o aspecto botnico:

- Caracterizar macro e microscopicamente as partes areas, constitudas de folhas e

caules da espcie em estudo.

Sob o aspecto qumico:

- Realizar a triagem fitoqumica com a droga constituda de partes areas deste

vegetal para os mais importantes grupos de princpios ativos;

- Descobrir por mtodos cromatogrficos, baseado no seu uso popular, a substncia

presente no extrato aquoso, obtido por decoco, que oferece ao antimalrica;

- Isolar alguns componentes dos extratos obtidos por percolao e identific-los por

cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas;

- Extrair, identificar e comparar a composio qumica do leo essencial de amostras

do vegetal coletado em diferentes pocas e estgios de desenvolvimento;

- Dosear o teor de taninos no p da droga e no extrato hidroetanlico liofilizado do

vegetal em estudo.

Sob o aspecto farmacolgico:

- Avaliar os extratos hidroetanlico liofilizado e c1orofrmico quanto s atividades

antimalrica e antileishmania;

- Avaliar o extrato hidroetanlico liofilizado quanto s atividades antilcera aguda e

antimicrobiana.

Reviso Bibliogrfica

3- Reviso Bibliogrfica

3.1- Reviso da famlia Asteraceae

3.1.1- Distribuio

3.1.2- Morfologia externa

3.1.3-lmportncia

3.1.4- Substncias do metabolismo secundrio de Asteraceae

3.2- Reviso do gnero Acanthospermum

3.3- A espcie Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

3.3.1- Estudos botnicos

3.3.1.1- Posio taxonmica

3.3.1.2- Denominao vulgar e cienUfica

3.3.1.3- Caracterlsticas morfolgicas de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

3.3.1.4- Propriedades medicinais de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

3.3.1.5- Componentes isolados e aes farmacolgicas de Acanthospermum australe (Loefl.)

O. Kuntze

3.3.1.6- Distribuio geogrfica de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

3.3.1.7- Agentes antimalricos de origem vegetal

3.1- Reviso da famlia Asteraceae

Segundo BREMER (1994), o botnico francs Henri Cassini foi muito

importante por definir a classificao da Asteraceae. Demonstrou habilidade em

examinar o material da famlia, descrever numerosos gneros e mostrar muitas

tribos que so reconhecidas hoje. Estes resultados foram publicados em jornais

franceses e dicionrios, e devido a este modo de publicao, o impacto de seu

trabalho foi severamente reduzido, apesar de que, muito do que ele props, aceito

hoje, na classificao desta famlia. Em 1816, publicou um diagrama mostrando as

inter-relaes das 19 tribos desta famlia.

O primeiro livro publicado sobre Asteraceae foi no ano de 1832, por Lessing

que apresentou uma classificao muito diferente de Cassini; inclua sete tribos,

algumas com circunscries bastante amplas e artificiais. Um esquema similar foi

adotado por De Candolle, em 1836.

Uma reviso substancial sobre a classificao das tribos foi providenciada

por BENTHAM em Genera Plantarum (1873). Bentham desenvolveu um sistema, e

posteriormente, descobriu ser semelhante ao de Cassini. Por sua insistncia,

Tabela 1: Classificao de Asteraceae, segundo 8entham e Hoffmann.

8entham realizou algumas alteraes considerveis, descobrindo ainda, algumas

associaes errneas das tribos.

Em 1890, HOFFMANN mostrou em Die Natrlichen Pflanzenfamilien uma

classificao mais atualizada e com pequenos diagnsticos sobre todos os gneros;

seu esquema foi utilizado como referncia geral por mais de 100 anos (tabela 1).

Atualmente, a famlia Asteraceae compreende 3 subfamlias e 17 tribos,

como pode ser visto na tabela 2.

11Reviso Bibliogrfica

Bentham 1873 Hoffmann 1890

Vernoniaceae Vernonieae

Eupatoriaceae Eupatorieae

Asteroideae Astereae

Inuloideae Inuleae

Helianthoideae Heliantheae

Helenioideae Helenieae

Anthemideae Anthemideae

Senecionideae Senecioneae

Calendulaceae Calenduleae

Arctotideae Arctotideae

Cynaroideae Cynareae

Mustisiaceae Mutisieae

Cichoriaceae Cichorieae

Tabela 2: Classificao de Asteraceae, com nmero de subtribos, gneros e

espcies (JUDD, 1999).

Tribo Subfamilia GnerolEspcle Gneros representativos

Bamadesioideae 9/92 Bamadesia, Chuquiraga,1- Bamadesieae

Dasyphy/lum

'Cichorioideae" 76/970 Chapta/ia, Gerbera,2- Mutisieae

Gochnatia, Mutisia, Trixis

"Cichorioideae" 83/2500 Carduus, Centaurea,3- Cardueae (= Cynareae)

Cirsium, Cynara, Echinops

"Cichorioideae" 98/1550 Cichorium, Crepis,

Hieracium, Krigia, Lactuca,

4- Lactuceae (= Cichorieae) Pyrrhopappus, Sonchus,

Taraxacum, Tragopogon,

Youngia

5- Vernonieae "Cichorioideae" 98/1300 Elephantopus, Vemonia

6- Liabeae 'Cichorioideae" 14/160 Liabum

7- Arctoteae "Cichorioideae" 16/200 Arctotis, Ber/(heya

8-lnuleae Asteroideae 38/480 Inula, Pulicaria, Telekia

9- Plucheae Asteroideae 28/220 Pluchea, Sphaeranthus

Asteroideae 162/2000 Anapha/is, Antennaria,

10- Gnaphalieae Gamochaeta, Gnapha/ium,

Leontopodium

11- Calenduleae Asteroideae 8/110 Calendu/a, Osteospermum

Asteroideae 174/2800 Aster, Baccharis, Conyza,

12- Astereae Erigeron, Hap/opappus,

So/idago

Asteroideae 109/1740 Achillea, Anthemis,

13- AnthemideaeArgyranthemum, Artemisia,

Chrysanthemum, Tanacetum

Leucanthemum, Seriphidium,

14- Senecioneae Asteroideae 120/3200 Erechtites, Senecio

Asteroideae 110/830 Amica, F/averia, Gaillardia,15- "Helenieae"

He/enium, Pectis, Tagetes

Asteroideae 189/2500 Ambrosia, Bidens, Calea,

16- HeliantheaeCoreopsis, Cosmos, Dahlia,

He/ianthus, /va, Rudbeckia,

Ve~sma, V~u~ra,Zmnffl

Asteroideae 174/2400 Ageratum, Carphephorus,

17- Eupatorieae Eupatorium, Garberia,

Liatris, Mikania

Reviso Bibliogrfica 12

Reviso Bibliogrfica

3.1.1- Distribuio

A famlia Asteraceae, conhecida como lia famlia do girassol", distribui-se por

quase toda terra, envolvendo os mais variados ecossistemas, sendo, portanto,

cosmopolita (JUDD, 1999; BREMER, 1994; CRONOUIST, 1981; HEYWOOD, 1977).

Sua diversidade mxima est associada a reas abertas, freqentemente

temperadas, como pradarias e savanas das Amricas; estepes e gramados da

frica, sia, Austrlia e da Nova Zelndia. As mesmas ascendem muito nas

montanhas (por exemplo, AchiJIea, alquemilas tpicas dos Alpes) e crescem tambm

em desertos, praias, solos salgados e inspitos, contando sempre que a luz lhes

seja oferecida em toda sua plenitude (BREMER, 1994; CRONOUIST, 1981;

HEYWOOD, 1977).

De acordo com JUDD (1999), a famlia compreende 1535 gneros e cerca

de 23000 espcies. Os maiores gneros esto representados por Senecio (1500

espcies), Vemonia (1000), Cousinia (600), Eupatorium (600), Centaurea (600),

Hieracium (500), He/ichrysum (500), Arlemisia (400), Baccharis (400), Saussurea

(300), Mikania (300), Cirsium (270), Aster (250), Jurinea (250), Bidens (200),

Gnaphalium (150) e Solidago (100).

Muitos gneros ocorrem nos Estados Unidos e Canad, sendo

especialmente importantes os gneros Ambrosia, Antennaria, Arlemisia, Aster,

Baccharis, Bidens, Coreopsis, Erigeron, Senecio, Centaurea, Chrysothamnus,

Cirsium, Eupatorium, E/ephantopus, GaiJIardia, Gamochaeta, Gnapha/ium,

Hap/opappus, Helianthus, Hieracium, Liatris, Lactuca, Rudbeckia, So/idago,

Verbesina e Vemonia (JUDD, 1999).

3.1.2- Morfologia externa

As tribos e os gneros em que os botnicos subdividem esta famlia so

unicamente determinados pelo estudo de sua estrutura floral; suas folhas so muito

variadas, sejam inteiras ou fendidas, de disposio alterna ou oposta, podendo ser

latescentes ou no (JOLY, 1966).

A grande maioria dos gneros (aproximadamente 98%) constituda por

plantas de pequeno porte (ervas, subarbustos, trepadeiras ou excepcionalmente

Reviso Bibliogrfica

rvores). As flores so sempre reunidas em inflorescncia caracterstica, o captulo e

as flores so de simetria radial ou zigomorfas, at bilabiadas.

Os captulos podem conter s flores hermafroditas, s femininas nos bordos

e hermafroditas nos discos ou femininas nos bordos e masculinas nos discos ou

ento, s contm flores masculinas ou s femininas em plantas diicas, alm da

presena de brcteas externas, tambm bractolas para cada flor, como o caso,

por exemplo, em Calea, e a dizemos que o receptculo paleceo (JOLY, 1966).

As flores ainda so do tipo pentmeras com clice profundamente modificado,

transformado no papilho (Pappus) e servindo disseminao do fruto.

O papilho pode ser piloso ou s vezes espinhoso. A corola pentmera,

com 5 lobos iguais ou ento ligulada ou bilabiada e o androceu formado por 5

estames frteis, com filetes livres e anteras, introsas, soldadas em um tubo que

atravessado pelo estilete; o ovrio sempre nfero, bicarpelar, unilocular, com um

nico vulo ereto; o estilete apresenta-se freqentemente com um anel de tricomas,

logo abaixo da bifurcao e o fruto seco indeiscente, tipo aqunico, disperso pelo

vento ou excepcionalmente ficando encerrado no captulo, que ento tem brcteas

duras e espinhosas (Xanthium, Arctium) (JOLY, 1966).

Exemplos comuns entre ns so as inmeras espcies de Vemonia,

Piptocarpha, pequenas rvores dos campos; Elephantopus, ervas com folhas em

rosetas e escapo floral com captulos brancos; Helianthus, o popular girassol, com

sementes oleaginosas e enormes captulos, entre outras (JOLY, 1966).

3.1.3- Importncia

A famlia de grande importncia econmica, incluindo alimentos e plantas

agroindustriais (alface, chicria ou escarola, alcachofra, girassol), ornamentais

(dlia, crisntemo, margarida), ervas medicinais (camomila, tarxaco, pico,

artemsia), ervas daninhas importantes (dente-de-leo, cardo) incluindo a espcie

venenosa Senecio jacobaea, responsvel por muitas mortes de animais domsticos.

Algumas das poucas rvores maiores como Montanoa revealii so cortadas para

madeira (JOLY, 1966; BREMER, 1994).

Reviso Bibliogrfica

Os gneros Tanacetum e Pulicaria contm espcies com propriedades

inseticidas e o gnero Ambrosia apresenta as principais espcies causadoras de

febres (JUDD, 1999).

3.1.4- Substncias do metabolismo secundrio de Asteraceae

Entende-se como metabolismo o conjunto de reaes qumicas que

continuamente esto ocorrendo em cada clula, tendo as enzimas especficas

papis importantes no direcionamento dessas reaes, estabelecendo o que se

denomina de rotas metablicas.

Os compostos qumicos formados, degradados ou simplesmente

transformados so chamados de metablitos e as reaes enzimticas envolvidas

respectivamente so designadas como anablicas, catablicas ou de

biotransformao (SIMES, 2001; SIMES, 2004). Estas reaes visam,

primariamente, o aproveitamento de nutrientes para satisfazer as exigncias

fundamentais da clula: energia (derivada basicamente de ATP), poder redutor

(NADPH) e biossntese das substncias essenciais a sua sobrevivncia

(macromolculas celulares).

Substncias essenciais vida de um organismo como as macromolculas

de carboidratos, lipdeos, protenas e cidos nuclicos tm sido definidas como

integrantes do metabolismo primrio, constituindo, tradicionalmente, o contedo das

disciplinas de bioqumica.

Vegetais, microorganismos e, em menor escala, animais, entretanto,

apresentam todo um arsenal metablico (enzimas, coenzimas e organelas) capaz de

produzir, transformar e acumular inmeras outras substncias no necessariamente

relacionadas de forma direta manuteno da vida do organismo produtor. Neste

grupo, encontram-se substncias cuja produo e acumulao esto restritas a um

nmero limitado de organismos, sendo a bioqumica e o metabolismo

correspondente, especficos e nicos, caracterizando-se como elementos de

diferenciao e especializao (WINK, 1990).

A todo este conjunto metablico costuma-se definir como metabolismo

secundrio, cujos produtos, embora no necessariamente essenciais para o

Reviso Bibliogrfica

organismo produtor, garantem vantagens para a sua sobrevivncia e para a

perpetuao de sua espcie, em seu ecossistema.

Durante muito tempo, os metablitos secundrios foram considerados como

produtos de excreo do vegetal, com estruturas qumicas e, algumas vezes,

propriedades biolgicas interessantes. Atualmente, entretanto, sabe-se que muitas

destas substncias esto diretamente envolvidas nos mecanismos que permitem a

adequao do produtor a seu meio. De fato, j foram reconhecidas como funes de

vrias substncias pertencentes a essa classe de metablitos, por exemplo, a

defesa contra herbvoros e microorganismos, a proteo contra os raios

ultravioletas, a atrao de polinizadores ou animais dispersores de sementes (WINK,

1990) e em alelopatias (HARBORNE, 1988).

o aparecimento de metablitos biologicamente ativos na natureza, segundoRHODES (1994), determinado por necessidades ecolgicas e possibilidades

biossintticas, sendo que a co-evoluo de plantas, insetos, microorganismos e

mamferos conduz sntese de metablitos secundrios com funes de defesa ou

atrao, principalmente. Assim, os metablitos secundrios, por serem fatores de

interao entre organismos, freqentemente, apresentam atividades biolgicas

interessantes.

Os metablitos secundrios so de grande importncia ao homem, pois

permitem estudos de rotas biossintticas que podem trazer novos avanos em

conhecimentos tcnico-cientficos em reas diversas como de qumica, fsica e

biocincias. Favorecem ainda pesquisas de snteses de novos frmacos, baseados

em estruturas e atividades biolgicas.

Quimicamente, a famlia Asteraceae apresenta uma diversidade ampla de

metablitos secundrios, despertando assim um grande interesse econmico

mundial em seu estudo. Os f1avonides, as lactonas sesquiterpnicas baseadas em

terpenides, os poJiacetilenos derivados de cidos graxos e os frutanos

polissacardeos so alguns compostos que podem ser mencionados, caractersticos

desta famlia (HEYWOOD, 1977). Estes ltimos so distintivos na bioqumica de

Asteraceae, pois so polissacardeos incomuns que se baseiam em frutose em vez

de glicose, que mais comum em outras famlias de plantas; so conhecidos

tambm como inulinas.

:1I"

Entende-se como lactonas sesquiterpnicas, os terpenides com 15 tomos

de carbono, distinguveis quimicamente de outros sesquiterpenides pela presena

de um sistema a-metileno y-Iactnico (SEAMAN, 1982; IVIE e WITZEL, 1983;

HARBORNE e TURNER, 1984). Primariamente, so classificados de acordo com o

tipo de esqueleto carbocclico em: germacranlidos, pseudoguaianlidos,

eudesmanlidos e guaianlidos (PICMAN, 1986).

A estes terpenides, atribuem-se vrias atividades biolgicas, tais como:

antiinflamatria, citotxica, antitumoral, bactericida, fungincida e antilcera

(RODRIGUEZ, 1977; PICMAN, 1986; ROBLES et ai., 1995; HEINRICH et ai., 1998).

Os poliacetilenos correspondem a um amplo grupo de metablitos

secundrios no nitrogenados. Esses compostos esto relacionados a algumas

famlias como Asteraceae, Apiaceae, Pittosporaceae, Campanulaceae,

Goodeniaceae e Caprifoliaceae (JUDD, 1999).

Os terpenides tambm correspondem a um amplo grupo de compostos

secundrios de importncia em numerosas interaes biticas. So amplamente

distribudos e muitos tm funes fisiolgicas primrias, podendo ser originados a

partir de pigmentos carotenides e hormnios, como cido giberlico e cido

abcsico (JUDD, 1999).

A distribuio de alguns tipos de terpenides taxonomicamente importante.

Assim, monoterpenides e sesquiterpenides constituem os maiores componentes

do leo essencial, caractersticos de algumas espcies das famlias, Myrtaceae,

Rutaceae, Apiaceae, Lamiaceae, Verbenaceae e Asteraceae, que no ocorrem

somente em tecidos vegetais (em cavidades ou canais no tecido parenquimtico),

mas tambm em glndulas florais onde funcionam como atrativos para insetos

(JUDD, 1999).


As lactonas sesquiterpnicas so bastante conhecidas em Asteraceae (onde

so diversas e taxonomicamente teis) e podem ocorrer em outras famlias como as

Apiaceae, Magnoliaceae e Lauraceae (JUDD, 1999).

A figura 1 mostra as principais rotas de produo de metablitos secundrios

em Asteraceae, de acordo com BOHLMANN (1976). As figuras 2 e 3 ilustram as

lactonas sesquiterpnicas encontradas na famlia Asteraceae, segundo HERS


Figura 1: Rotas principais de produtos naturais de Asteraceae (BOHLMANN, 1976).

cumarinas

[ORI~

[ORI~oAo

carboidratos

e muitos outros

H2C(CEClr-G-C=C-CH=CH2S

e muitos outros

0--o:~1={

(1973) e HEGNAUER (1964), respectivamente. A figura 4 mostra algumas estruturas

triterpnicas comuns na famlia, de acordo com HEGNAUER (1964).

Reviso Bibliogrfica

..

Seco Helenanolfdeos (SHE)

O"cO

Seco Ambrosanoldeos (SAM)

I,III

~~

I

'o

Reviso Bibliogrfica

Guaianoldeo--matricina

Eremofilanoldeo-petasoldeo

OH

Yl"Figura 3: Lactonas sesquiterpnicas de Asteraceae (HEGNAUER, 1.964).

Figura 4: Algumas estruturas triterpnicas de Asteraceae (HEGNAUER, 1964).

3f:,

Ursanol

_/~

Shionona

23

O'

Em relao ao leo essencial, membros das Asteraceae, com exceo da

Cichorieae, produzem esta substncia que so depositadas no interior de tricomas

glandulares ou ductos esquizgenos em quantidades apreciveis. Alm dos

monoterpenides e dos sesquiterpenides como constituintes deste leo, fazem

parte da composio, os fenilpropanides, acetilenos e cromonas (HEGNAUER,

1964). A figura 5 ilustra alguns componentes do leo essencial de plantas

pertencentes a esta famlia, de acordo com o mesmo autor.

O cido 3,4-dihidroxicinmico, conhecido comercialmente como cido

cafico [(HO)2C6H3CH=CHC02H], um composto fenlico que est entre os

componentes em maior quantidade nesta famlia de vegetais. Est normalmente

presente como uma mistura de cidos clorognico, incluindo cinarina e algumas

vezes como cido chicrico (HEGNAUER, 1964). Alguns compostos fenlicos e

fenilpropanides de Asteraceae podem ser vistos na figura 6.

A partir de extratos de ervas medicinais de uso popular, utilizados no

combate aos mais diferentes tipos de doenas. podem ser isolados inmeros

metablitos com atividades biolgicas cientificamente comprovadas, como os

antivirais (Calendula arvensis, saponinas triterpenides), (TOMASI, 1991),

antitumorais (Helianthella quinquinervis, o benzofurano 6-metoxi-trimetil-ona),

analgsicos e antiinflamatrios (Cirsium subcoriaceum, o flavonide pectoliarina),

antibacterianos, antimalricos (Artemisia annua, a lactona sesquiterpnica

artemisinina; NGO et ai., 1997), antileishmaniose (Jasonia glutinosa, o

sesquiterpeno [11R]-eudesm-4 (14)-eno-5, 11-12-diol (VILLAESCUSA-CASTILLO et

aI., 2000) e antifngicos (Senecio pampae, furanoeremofilanos). Tais

metablitos servem como padres ou prottipos para desenvolvimento de seus

derivados, bem como de sua sntese.

So tambm comuns na famlia algumas ervas que agem como inseticidas

naturais, pois contm alcamidas especiais como a Spillanthes mauritiana,

(JONDICO, 1986); piretrinas e steres de piretrolona, substncias existentes nas

flores do Chrysanthemum (Pyrethrum) cinerariaefolium, valendo a pena ainda

mencionar que inseticidas piretrides so compostos sintticos que apresentam

estruturas semelhantes da piretrina: aletrina, resmetrina, decametrina, cipermetrina

e fempropanato.


Reviso Bibliogrfica

Diidrobenzofuranide(derivado timol)

I

O~~

I JI

I

HOH, H

22

COCH3

CH2--R

I~I I

~OH//l"R=H: TimolR=OH: Derivadotimol

r-\/ O Ic-/~OAA~CH'-O-

/I ~ 12-acetxi-10, II-deidrongaione", ./ (furano sesquiterpeno)

O

Figura 5: Alguns componentes do leo essencial de Asteraceae (HEGNAUER,

1964).

OH O II

1 yA OI

I ()I I

~,.-r::::- OHOR O O

R=H: Isoprenilato de cido

hidroquinona p-benzoquinona piromecnico

R= g1icosil:arbutin

H'W~OOc=o!O

ICH2

H'W'DBenzoato deDimetxiidroxibenzil

(H'CH(CH'"

HC.

IHCJ>\CH3

R=H: anol isovaleratoR= OCH3: epxido deisoeugenol

OHI

IA/OH

~ ':YiH

H3C-----COOH

IH-----COOH

ORR= cafeil:cido fuquinlicoR= H: cidohidroxipiscdico

O~H'WX)0H,W Y

CH2ICH

1ICH2

Dilapiol(fenilpropanide)

Figura 6: Alguns componentes fenlicos, fenilpropanides de Asteraceae

(HEGNAUER, 1964).

Reviso Bibliogrfica

3.2- Reviso do gnero Acanthospermum (INDEX KEWENSIS)

Espcies descritas do gnero Acanthospermum:

ACANTHOSPERMUM, Schrank, PI. Rar. Hort.

Monac, t. 53 (1819). COMPOSITAE, Benth. &Hook. F. ii. 349.

Centrospermum, H. B. &K. Nov. Gen. Et Sp. Iv. 270. t.397 (1820)

Echinodium, Poiteau, ex Casso In Dict. Sc. Nat. Lix. 235 (1829)

ORCYA, Vell. FI. Flum.344 (1825).

brasilium , Schrank, PI, Rar. Hort. Monac. li. 53.-Bras.

hirsutum, DC. Prod. V. 522 = brasilum.

hispidum, DC. I. c. 522-Bras.

humile, DC. I. c. 522-lnd. occ.

xanthioides, De. L c. 521 = brasilum.

3.3- A espcie Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

23

Figura 7: Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze.

Reviso Bibliogrfica

3.3.1- Estudos botnicos

3.3.1.1- Posio taxonmica

De acordo com o sistema de Cronquist (CRONQUIST, 1996), a espcie :11

Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze tem a seguinte posio taxonmica:

Diviso:

Classe:

Ordem:

Famlia:

Sub-famlia:

Tribo:

Sub-tribo:

Gnero:

Espcie:

Magnoliophyta Cronquist, Takhtajan,

Magnoliopsida ("Magnoliate") Cronquist

Asterales

Asteraceae (Compositae)

Asteroideae

Heliantheae

Helianthinae

Acanthospermum

Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

3.3.1.2- Denominao vulgar e cientfica

Denominao vulgar: carrapichinho, cordo de sapo, carrapicho mido, marto,

chifrinho, pico da prata (LORENZI, 2000), pico da praia e poejo da praia (MORS,

2000, PENNA, 1941), espinho de agulha, erva-mijona, erva-mineira (MORS, 2000),

carrapicho-rasteiro e amor de negro (LORENZI, 2000; MORS, 2000, PENNA, 1941),

carrapicho de carneiro e mata-pasto (LORENZI, 2000; MORS, 2000), retirante

(PENNA, 1941), tapecue (SHIMIZU, 1987).

Denominao cientfica: Acanthospermum brasilium Schrank, Melampodium

australe Loef., Centrospermum xanthioides H.B.K. e Oreya adhaerescens Vell.

(CORRA, 1984, LORENZI, 2000), Acanthospermum hirsutum OC., Echinodium

prostatum Poit. e Acanthospermum obtusifolium DC. (LORENZI, 2000),

Acanthospermum xanthioides DC (CORRA, 1984, PENNA, 1941, LORENZI,2000)

Melampodium divaricatum, Plumbago littoralis e Acanthospermum hispidum D.C

(PENNA, 1941).

Reviso Bibliogrfica

3.3.1.3- Caractersticas morfolgicas de Acanthospermum austra/e (Loefl.) O.

Kuntze

Trata-se de uma erva daninha muito comum em lavouras novas de cerrados

e campos e considerada como planta medicinal (LORENZI, 2000), desenvolvendo-

se ainda melhor em terrenos arenosos do litoral (CORRA, 1984).

Possui como caractersticas gerais ser uma planta anual, herbcea,

prostrada (CORRA, 1984, LORENZI, 2000), caules pubescentes e arroxeados

medindo 20 a 40 cm de comprimento (LORENZI, 2000) ou at 1 m (CORRA, 1984;

PENNA, 1941), com reproduo por sementes.

Suas folhas so opostas (CORRA, 1984; PENNA, 1941; LORENZI, 2000),

membranosas, denteadas e pilosas (CORRA, 1984), pubescentes e glandulosas

(LORENZI, 2000), medindo 1 a 4 cm de comprimento e 1 a 2 cm de largura

(LORENZI, 2000) ou at 3 cm de comprimento por igual largura (CORRA, 1984).

O pecolo curto, de aproximadamente 1 cm, pilosos na base (LORENZI,

2000; CORRA, 1984); suas inflorescncias so axilares, em forma de captulos

solitrios e curto-pedunculados, contendo pequenas flores amareladas (LORENZI,

2000).

3.3.1.4- Propriedades medicinais de Acanthospermum austra/e (Loefl.) O.

Kuntze

A parte empregada na medicina popular so as partes areas ou mesmo a

planta inteira, sendo a infuso e a decoco os mtodos de extrao mais utilizados

(PENNA, 1941).

As folhas apresentam propriedades amarga e aromtica (CORRA, 1984;

PENNA, 1941; LORENZI, 2000), tnica, diafortica, mucilaginosa e antidiarrica

(CORRA, 1984; PENNA, 1941; LORENZI, 2000, MORS, 2000), antiblenorrgica,

sendo usadas em casos de irisipela (CORRA, 1984; LORENZI, 2000; MORS,

2000), antimalrica, anemia e doenas do sistema urinrio (MORS, 2000). ainda

muito utilizada contra febres palustres e intermitentes (CORRA, 1984; LORENZI,

2000), assim como para tratamento da tosse, bronquite, molstias do fgado e como

expectorante (PENNA, 1941).

Reviso Bibliogrfica

GARCIA-BARRIGA (1975) informa em seu trabalho que o extrato da planta

inteira de A. australe tem sido usado na Colmbia, no tratamento do cncer.

Os homeopatas empregam as folhas para a tintura que, com o nome de

Plumbago Iiftoralis, tem sido usada nos casos de palpitaes, vertigens, reumatismo

articular e muscular e afeces do peito (PENNA, 1941).

3.3.1.5- Componentes isolados e aes farmacolgicas de Acanthospermum

austra/e (Loefl.) O. Kuntze

Partes areas contm numerosas lactonas sesquiterpnicas e diterpnicas

(HERZ, 1973; SOHLMANN, 1976; MORS, 2000). O flavonide, 5,7,4'-triidroxi-3,6-

dimetoxi-flavona, com atividade inibitria da aldolase foi isolado a partir do

fracionamento de um extrato hidroetanlico 70% de partes areas de A. australe,

proveniente do Paraguai (SHIMIZU et aI., 1987). Outras substncias obtidas pelos

mesmos autores foram o trifolina, hiperina rutina, quercetina e cido cafico.

Extratos brutos de A. australe testados em camundongos infectados com

Plasmodium berghei e testados in vitro contra Plasmodium falciparum mostraram ser

ativos (CARVALHO, 1991).

Extratos de A. australe forneceram muitos melampoldeos, um subgrupo de

germacranoldeo e flavonides (SOHLMANN et aI., 1984; ZDERO, et aI., 1987).

Alguns deles tm sido caracterizados por atividade antineoplsica (HERZ, 1975);

MATSUNAGA et aI. (1996) isolaram uma substncia antineoplsica

denominada de acanthostral (eis, eis, cis-germacranoldeo) a partir de um extrato

benznico de "Tapecu" (A. australe), coletada no Paraguai. Vrios diterpenos

(HERZ, 1981), acanthospermal A, timol, isotimol etc. tm sido isolados desta planta

(SOHLMAN et aI., 1984).

\1I

.II

Reviso Bibliogrfica

3.3.1.6- Distribuio geogrfica de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

No Brasil ocorre em Gois, do Piau at o Rio Grande do Sul e Minas Gerais

(PENNA, 1941). A correo das condies de fertilidade do solo geralmente leva

diminuio do nvel de infestao. Ocorre tambm em pastagens e em outros tipos

de solo, porm sua presena est sempre ligada a baixos ndices de fertilidade dos

mesmos (PENNA, 1941; CORRA, 1984; LORENZI, 2000).

Figura 8: Distribuio geogrfica do Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze

(LORENZI, 2000).

3.3.1.7- Agentes antimalricos de origem vegetal

A malria a doena que mais prevalece no mundo, dentre aquelas

causadas por insetos. um exemplo clssico de doena que afeta a produtividade

de indivduos, de famlias e de toda sociedade, sendo mais comum em pases

subdesenvolvidos e em vias de desenvolvimento (WHO, 1993; EKTHAWATCHAI, et

ai, 1999; SAXENA, 2003).

Na frica, seu impacto muito grande (WHO, 1993; EKTHAWATCHAI, et ai,

1999). Outras reas incluem o leste da sia, a China e a ndia. Pesquisadores

estimam que mais de 40% de casos de malria que ocorrem na ndia so causadas

por Plasmodium falciparum (KUMAR, 1994).

Reviso Bibliogrfica

A primeira droga antimalrica descoberta foi a quinina, isolada de cascas de

espcies do gnero Cinchona (Rubiaceae) em 1820. Em 1940, uma outra droga

antimalrica, a cloroquina, foi sintetizada (BHAREL et ai., 1996). Este antimalrico,

amplamente disponvel mundialmente que outrora foi considerado o principal

controlador da doena, hoje, ineficaz na maioria da malria provocada por P.

falciparum de reas endmicas (WHO, 2006).

Tratamentos da malria resistentes cloroquina, foram feitos com frmacos

alternativos ou combinaes de frmacos, que mostraram ter alto custo e algumas

vezes, txicos. Alm disso, essas combinaes no foram sempre baseadas na

farmacocintica dos princpios ativos devido aos poucos conhecimentos sobre o

mecanismo de ao da maioria dos frmacos antimalricos (SAXENA, et ai, 2003).

Por esta razo, grupos de pesquisa esto se desempenhando atualmente para

desenvolver novos compostos ativos como uma alternativa para a cloroquina.

A descoberta da Qinghaosu, conhecida como artemisinina, inspirou a

investigao de alguns outros perxidos de ocorrncia natural por suas atividades

esquizonticidas (KLAYMAN, 1985). Esta substncia uma lactona sesquiterpnica

com atividade antimalrica, isolada das folhas e inflorescncias da Artemisia annua

Linn (Asteraceae). A pouca hidrossolubilidade da artemisinina constituiu, talvez, o

maior problema das indstrias farmacuticas que desenvolveram vrias posologias,

vias de administrao e derivados mais potentes desta substncia no intuito de

solucionar o problema; o mais promissor o seu derivado ter metlico artemeter

(ROBBERS, et ai., 1997), que apresentou atividade tambm em Schistosoma

mansoni (ARAJO et ai., 1991).

A mortalidade anual, estimada a mais de um milho de pessoas, vem

subindo, provavelmente devido ao aumento da resistncia do protozorio aos

frmacos. controle da malria requer uma integridade aproximadacompreendendo preveno que inclui o controle do vetor e tratamentos com

antimalricos efetivos (WHO, 2006).

Devido ao fato dos dois principais agentes antimalricos (quinina e

artemisinina) serem de origem vegetal, a busca por componentes ativos oriundos de

plantas tm sido uma constante mundial (SAXENA, et ai., 2003).

Reviso Bibliogrfica

A seguir, apresentar-se-o alguns resultados de estudos com especles

vegetais que apresentaram alguma atividade contra o protozorio da malria:

- Em 1995, VALSARAJ et aI. avaliaram as espcies vegetais Garcinia gummigutta

(Guttiferae) e Mammea longifolia (Guttiferae) contra o parasita da malria, sensveis

e resistentes c1oroquina na concentrao de 100 mg/mL. A porcentagem da

inibio de crescimento induzida por Garcinia e Mammea foram, respectivamente,

99.5% e 86%.

- Uma atividade antimalrica in vivo do extrato alcalodico total de Golipea longiflora

tem sido confirmada em roedores infectados com P. vinckei patteri, quando do

tratamento oral com uma dose de 50 mg/Kg do extrato (GANTIER, et aI., 1996.).

- Um novo alcalide dibenzilisoquinolnico, nomeado como (+)-2-N-metiltelobino, foi

isolado de Stephania erecta (Menispermaceae), que inibiu o crescimento de cultura

de cepas sensveis e resistentes c1oroquina (VALSARAJ, et aI., 1995). Verificou-se

tambm que o alcalide augustina, isolado de Strychnopsis thouarsi e

Spirospermum penduliflorum exibiu significante atividade antimalrica

(RATSIMAMANGA-URVERG, et aI., 1992).

- Um extrato aquoso proveniente da decoco de cascas de razes de Uapaca nitida

(Euforbiaceae) usado na Tanznia no tratamento da malria. Extrato alcolico de

cascas de razes dessa espcie mostrou atividade antimalrica contra P. berghei em

roedores (KIRBY, et aI., 1993).

- Flavonides isolados de Artemisia annua no demonstraram ser ativos contra P.

falciparum, mas demonstraram um efeito de potencializao seletiva sobre a

atividade da artemisinina (LIU, et aI., 1992).

- O extrato etanlico de Garcinia dulcis (Guttiferae) forneceu 5 xantonas, sendo que

uma delas, a garciniaxantona, apresentou efeito inibitrio sobre o crescimento de P.

falciparum com valor de ICso igual a 0.961Jg/mL (LlKHITWITAYAWUID, et aI., 1998).

- O leo essencial de folhas e caules de Tetradenia ripari mostrou moderada

atividade antimalrica contra duas cepas de P. falciparum (CAMPBEL, et aI., 1997).

- LOPES, et aI. (1999) mencionam que o leo essencial de folhas de Virola

surinamensis, coletadas na ilha de Comb, prximo a Belm-Par, apresentou

Reviso Bibliogrfica

excelente atividade antimalrica in vitro, sendo esta atividade atribuda ao

sesquiterpeno nerolidol.

- MILHAN et ai. (1997) avaliaram os leos essenciais de Artemisia vulgaris,

Eucalyptus globulus, Myrtus comunis, Juniperus comunis, Lavandula angustifoia,

Origanum vulgare, Rosmarinus officinalis e Salvia officinaJis, contra duas cepas de

P. falciparum, FcB1-Columbia e uma cepa Nigeriana resistente cloroquina. Os

melhores resultados foram obtidos com leos de Myrtus comunis e Rosmarinus

officinaJis que inibiram 50% do crescimento do parasita, in vitra, nas concentraes

compreendidas entre 150 Jjg/mL a 270 Jjg/mL.

Material e Mtodos

4- Material e Mtodos

4.1- Aspectos botnicos

4.1.1- Coleta e identificao

4.1.2- Caracterizao macroscpica de folha

4.1.3- Caracterizao microscpica de folha e caule

4.2- Aspectos qumicos

4.2.1-Triagem fitoqumica

4.2.2- Ensaios para o leo essencial

4.2.3- Preparao dos extratos

4.2.3.1- Extratos aquosos

4.2.3.2- Extrato hidroetanlico 70% e Extrato Hidroetanlico Liofilizado (EHL)

4.2.3.3- Extratos hexnico e clorofrmico

4.2.3.4- Extrato acetona:gua

4.2.4- Aplicao dos extratos em CCO

4.2.5-lsolamento do componente comum a todos os extratos por CCO preparativa

4.2.6- Isolamento de um componente comum aos extratos clorofrmico e hexnico por CCO

preparativa

4.2.7- Ooseamento de taninos na droga vegetal e no extrato hidroetan6lico liofilizado (EHL)

4.2.8- Determinao de gua no p da droga e no EHL

4.3- Aspectos farmacolgicos

4.3.1- Atividade antimalrica e antileishmania dos extratos hidroetan61ico liofilizado (EHL) e

clorofrmico

4.3.2- Atividade antilcera aguda

4.3.3- Atividade antimicrobiana do EHL em bactrias, leveduras e bolor


4.1.1- Coleta e identificao

O material vegetal correspondente s partes areas de Acanthospermum

australe (Loefl.) O. Kuntze utilizada para os estudos botnico, qumico e

farmacolgico foi coletado em trs momentos diferentes, no Stio Toyota, permetro

urbano da cidade de lacri, situada a 540 Km da cidade de So Paulo, em janeiro de

2003, outubro e novembro de 2005. O vegetal em questo apresentava-se em fase

de florao e frutificao. As condies do tempo, assim como o horrio da coleta

foram levadas em considerao (OLIVEIRA e AKISUE, 1991).

O vegetal foi identificado pelas botnicas, Ora. Rosngela Simo Bianchini,

do Instituto Botnico de So Paulo, Seo de Curadoria do Herbrio e por Rejane

Esteves, do Departamento de Botnica do Horto Florestal - SP, e tambm pelo

professor da Universidade de So Francisco, Bragana Paulista, SP, Dr. Fernando

de Oliveira. A exsicata foi depositada no Instituto Botnico de So Paulo sob nmero

SP 366743.

Material e Mtodos 33

O material foi dividido em duas partes, sendo uma destinada ao estudo

morfolgico e anatmico e a outra destinada aos ensaios qumicos e farmacolgicos.

4.1.2- Caracterizao macroscpica de folha

Folhas adultas, frescas e secas, de vrios tamanhos, foram analisadas

quanto dimenso, forma, aspecto da superfcie, cor, odor, sabor, entre outras

caractersticas consideradas importantes para a diagnose da droga (OLIVEIRA e

AKISUE, 2000). Para tanto, o material foi observado a olho nu ou atravs de lupa de

pequeno aumento e as medidas foram obtidas com rgua e paqumetro.

4.1.3- Caracterizao microscpica de folha e caule

Executou-se o estudo anatmico da folha mediante a elaborao de cortes

mo livre, no tero mdio inferior do rgo conservado em etanol 70%, de acordo

com as tcnicas usuais (OLIVEIRA e AKISUE, 2000). O estudo do caule foi obtido a

partir de cortes realizados em brotos apicais, na regio de estrutura primria

(OLIVEIRA e AKISUE, 2000).

Material e Mtodos

Os cortes foram submetidos dupla colorao com azul de astra e fucsina

bsica (ROESER, 1962) ou com azul de toluidina (O'BRIEN et aI., 1965). Testes

histoqumicos foram tambm realizados, empregando-se as solues de floroglucina

clordrica (SASS, 1951) para estruturas lignificadas; lugol (BERLYN e MIKSCHE,

1976) para amido; reagente Sudan IV (FOSTER, 1949) para substncias lipoflicas;

azul de metileno (OLIVEIRA e AKISUE, 2000) para mucilagem; cloreto frrico

(JOHANSEN, 1940) para compostos fenlicos e cido sulfrico (OLIVEIRA e

AKISUE, 2000) para evidenciar a natureza qumica dos cristais. As fotomicrografias

foram obtidas atravs de aparelho Nikon, utilizando-se escalas nas seguintes

condies pticas: 40 vezes: barra de 0,4 cm equivalendo a 100 jJm; 100 vezes:

barra de 1,1 cm equivalendo a 100 jJm; 200 vezes: barra de 1,1 cm equivalendo a 50

jJm; 400 vezes: barra de 1,1 cm equivalendo a 25 jJm.


As folhas e caule do vegetal foram submetidos secagem, em estufa, com

circulao de ar, temperatura de 40-45 C, por 24 horas, sendo posteriormente

pulverizadas em moinho de facas e martelos, obtendo-se p semi-fino

(FARMACOPIA BRASILEIRA, 1988).

4.2.1- Triagem fitoqumica

Realizaram-se os ensaios fitoqumicos em triplicata com folhas e caules do

vegetal pesquisa de alcalides (COSTA, 1978, DOMINGUES, 1973,

FARMACOPIA BRASILEIRA, 1959), saponinas (COSTA, 1978), glicosdeos

cardiotnicos (COSTA, 1978, DOMINGUES, 1973), antraderivados (COSTA, 1978,

DOMINGUES, 1973), flavonides (COSTA, 1978, GRAYER, 1989), mucilagens

(COSTA, 1978), taninos e outros compostos fenlicos (COSTA, 1978, GRAYER,

1989, FARMACOPIA, 1959, SPENCER, 1988), alm de leo essencial (COSTA,

1978). Os mesmos procedimentos foram realizados com as drogas-padro contendo

altas concentraes de cada grupo de princpio ativo.

A tabela 3 mostra todos os ensaios fitoqumicos realizados com as partes

areas da espcie em estudo.

Material e Mtodos

Tabela 3: Ensaios para deteco de grupos de princpios ativos em partes areas

de Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze.

Grupos de princpios ativos Reaes

- Reao de Bertrand

Alcalides - Reao de Mayer

- Reao de Dragendorff

- Reao de Bouchardat

- Reao de Shinoda

Flavonides - Reao com cloreto de alumnio

- Reao com hidrxidos alcalinos

Saponinas *- Teste de espuma

*- Adstringncia

- Reaes com sais de ferro

- Reao com acetato de chumbo

Taninos e compostos fenlicos - Reao com acetato de cobre

- Reao com alcalides

- Reao com gelatina

- Pesquisa de compostosAntraderivados antraquinnicos livres e combinados

- Do ncleo esteroidal:

- Reao de Liebermann-Burchard

- Do anellactnico pentagonal:

Glicosdeos cardiotnicos - Reao de Kedde

- Reao de Baljet

- De 2-desoxiacares:

- Reao de Keller-Killiani

Mucilagens *- Indice de Intumescimento (LI)

Oleo essencial *- Verificao de odor

* Foram obtidos sem o uso de reativos qurmicoso

0,,1

~,

11

t;~ ,I

Material e Mtodos

4.2.2- Ensaios para o leo essencial

O leo essencial das folhas frescas proveniente de duas coletas

(outubro/2005 e novembro/2005), assim como da droga pulverizada, constituda de

folhas e caules e droga pulverizada constituda somente de caule, coletadas em

janeiro de 2003, foi obtido por hidrodestilao em aparelho de Clevenger modificado

(WASICKY e AKISUE 1969), por aproximadamente 6 horas. Para estes

procedimentos foram hidrodestiladas 400 g de folhas frescas e 150 g de droga.

Os rendimentos foram calculados e o leo foi acondicionado em frasco mbar

e conservado em geladeira, sendo posteriormente submetido a ensaios em

cromatografia em camada delgada (CCO), cromatografia em camada delgada

preparativa (CCO preparativa) e anlise de seus componentes em cromatgrafo a

gs acoplado a espectro de massa, com banco de dados (CG/EM).

Os dados do aparelho e as condies de anlise deste trabalho de pesquisa

so mostrados a seguir:

A- Anlise do leo essencial da droga constituda de folhas e caules coletadas em

janeiro de 2003, quando o vegetal encontrava-se em fase final de frutificao:

- Dados do aparelho:

Marca Shimadzu QP 5050 A (CG/EM);

- Condies da anlise:

Solvente: Oiclorometano (CH2CI2);

Temperatura do forno: 100C;

Temperatura do injetor: 230C;

Temperatura da interface: 280C;

Gs carreador: Hlio;

Coluna: 08-5 (5% fenil, metil polisiloxano, 30 m x 0,32 mm);

Rampa: incio a 100C por 3 minutos e velocidade de 5C/min at alcanar 280C,

permanecendo por mais 10 minutos; tempo total da anlise: 49 minutos.

L'

Material e Mtodos

8- Anlise do leo essencial da droga constituda de caules coletados em janeiro de

2003, quando o vegetal encontrava-se em fase final de frutificao:


Marca Shimadzu OP 5050 A (CG/EM);


Solvente: Diclorometano (CH2CI2);




Gs carreador: Hlio;

Coluna: D8-5 (5% fenil, meti! polisiloxano, 30 m x 0,32 mm);

Rampa: incio a 100C por 3 minutos e velocidade de 5C/min at alcanar 280C,

permanecendo por mais 10 minutos; tempo total da anlise: 49 minutos.

C- Anlise do leo essencial de folhas frescas coletadas em outubro e novembro de

2005, quando o vegetal encontrava-se, respectivamente, em fase de florao e incio

de frutificao:




Solvente: Diclorometano (CH2Cb);




Gs carreador: Hlio;

Coluna: D8-5 (5% fenil, metil polisiloxano, 30 m x 0,32 mm);

Rampa: incio a 60C por 1 minuto e velocidade de 10C/min. at alcanar 280C,

permanecendo por mais 5 minutos; de 280C at 320C na velocidade de 20C/min.,

permanecendo a 320C durante 10 minutos.

Material e Mtodos

4.2.3- Preparao dos extratos

4.2.3.1- Extratos aquosos

Os extratos aquosos foram obtidos de duas formas: 1_ a frao aquosa

utilizada na extrao do leo essencial, conforme citado no item 4.2.2, foi reservada

para estudo de composio qumica. Este extrato foi submetido a um processo de

liofilizao e o seu rendimento calculado; 2_ uma amostra de 100 g de droga

pulverizada foi levada fervura por 30 minutos, em 1 litro de gua. Deixou-se

resfriar naturalmente o produto, sendo em seguida filtrado por papel de filtro. A

operao foi efetuada por mais duas vezes, utilizando-se 1 litro de gua, em cada

uma. Os lquidos assim obtidos foram reunidos num mesmo frasco e,

posteriormente, liofilizados. O rendimento do liofilizado foi calculado e ambos os

extratos foram submetidos anlise em CCD.

4.2.3.2- Extrato hidroetanlico 70% e Extrato Hidroetanlico Liofilizado (EHL)

Uma amostra de 100 g de droga constituda por partes areas de

Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze foi percolada segundo o mtodo

descrito na Farmacopia Brasileira (1959), empregando-se como lquido extrator,

etanoI70%. O extrato hidroalcolico assim adquirido foi concentrado em evaporador

rotativo, sendo posteriormente submetido a um aparelho de liofilizao,

conseguindo-se finalmente o extrato hidroetanlico liofilizado (EHL), cujo rendimento

foi calculado.

o EHL foi acondicionado em vidro mbar e conservado em dessecador at omomento dos ensaios farmacolgicos; o extrato hidroetanlico 70% foi submetido

anlise em CCD e CG/EM.

4.2.3.3- Extratos hexnico e clorofrmico

Para se chegar aos extratos hexnico e clorofrmico, uma amostra de 50 9

da droga pulverizada de partes areas de Acanthospermum australe (Loefl). O.

Kuntze foi submetida a um processo de percolao, como no item anterior. Os

extratos assim obtidos (percolados) foram concentrados em evaporador rotativo, e

os rendimentos, calculados. Posteriormente, alquotas foram aplicadas em

cromatografia em camada delgada (CCO) preparativa, alcanando-se os respectivos

perfis cromatogrficos. O extrato clorofrmico foi ainda submetido anlise em

CG/EM.

- Sistema cromatogrfico 2:

Suporte: placa de vidro 20 X 20 cm

Adsorvente: slica gel G254 de espessura 300 f.!

Adsorvente: slica gel preparativa PF 254 de espessura 1mm

Fase mvel: acetato de etila:cido actico:cido frmico:gua (100:11:11 :26)

Saturao: completa; percurso: 12 cm ascendente; Revelador: NP/luz UV 366 nm

4.2.3.4- Extrato acetona:gua

Uma amostra de 300 9 de droga pulverizada foi percolada com uma

associao de solventes, acetona:gua (1:1) (HAGERMAN, 1988) de acordo com a

mesma tcnica empregada para obteno dos extratos dos itens anteriores. O

percolado foi concentrado at secura, por evaporador rotativo, sendo calculado o

seu rendimento; alquotas deste extrato foram aplicadas em CCO e CG/EM

39Material e Mtodos

4.2.4- Aplicao dos extratos em CCO

Os perfis cromatogrficos dos extratos c1orofrmico e hexnico foram

obtidos a partir da aplicao das respectivas amostras em CCO, no sistema

cromatogrfico 1 e os perfis cromatogrficos dos extratos aquoso, acetona:gua,

c1orofrmico e hidroetanlico, no sistema cromatogrfico 2, conforme so

apresentadas a seguir.

- Sistema cromatogrfico 1:

Suporte: placa de vidro 20 X 20 cm

Adsorvente: slica gel preparativa PF 254

Fase mvel: tolueno e acetato de etila (85:15)

Saturao: completa; percurso: 12 cm ascendente

Espessura da slica: 800 f.!

Revelador: anisaldedo sulfrico

Material e Mtodos

4.2.5- Isolamento do componente comum a todos os extratos por CCO

preparativa

Aps aplicao dos extratos aquoso, acetona:gua, clorofrrnico e

hidroetanlico no sistema cromatogrfico 2, com espessura de slica de 300 1-1,

observou-se a existncia de um componente comum a todos os extratos. Assim,

isolou-se o mesmo por cromatografia em camada delgada preparativa a partir da

aplicao do extrato acetona:gua 1:1 no sistema cromatogrfico 2 com espessura

de slica de 1mm.

A frao isolada, assim como todos os outros extratos, foi analisada em

CG/EM. Os dados do aparelho e as condies da anlise so mostrados a seguir:




Coluna: D8-WAX (30 m x 0,25 mm);

Rampa: incio a 60C por 2 minutos e velocidade de 10C/min. at 230C.

4.2.6- Isolamento de um componente comum aos extratos clorofrmico e

hexnico por CCO preparativa

Aps aplicao dos extratos clorofrmico e hexnico no sistema

cromatogrfico 1, isolou-se um componente comum a esses extratos. Esta

substncia foi aplicada em aparelho CG/EM e seus espectros foram analisados. Os

dados do aparelho e as condies da anlise so mostrados a seguir:




Coluna: 08-5 (30 m x 0,25 mm);

Rampa: incio a 60C por 1 minuto e velocidade de 20C/min. at 280C,

permanecendo por mais 10 minutos;

Fluxo da coluna: 4,9 mUmin.

Material e Mtodos

4.2.7- Doseamento de taninos na droga vegetal e no extrato hidroetanlico

liofilizado (EHL)

o doseamento de taninos na droga vegetal e no extrato hidroetanlicoliofilizado foi realizado conforme preconizado pela EUROPEAN PHARMACOPOEIA

(2001). O resultado foi expresso em porcentagem de taninos e o mtodo baseia-se

na reao colorimtrica dos polifenis com o cido fosfomolibdotngstico, utilizando-

se como referncia o pirogalol (Sigma).

Os ensaios foram realizados em triplicata.

Doseamento

0,750 g de droga vegetal foram adicionados 150 mL de gua destilada. O

conjunto foi aquecido em banho-maria por 30 minutos, resfriado e transferido

quantitativamente para um balo volumtrico de 250 mL. Aps a decantao dos

slidos, o conjunto foi filtrado por papel de filtro, e foram descartados os 50 mL

iniciais do filtrado (F1). O mesmo procedimento acima descrito utilizando-se 0,300 g

de extrato hidroetanlico liofilizado (F3), tambm foi feito.

Polifenis totais

Quantidade de 5 mL de F1 foram diludos com gua destilada em um balo

volumtrico de 25 mL. 2 mL desta soluo foram adicionados 1 mL do reagente

fosfomolibdotngstico e 10 mL de gua destilada em balo volumtrico de 25 mL e o

volume foi completado com a soluo de carbonato de sdio. Aps 30 minutos, fez-

se a leitura da absorbncia a 760 nm (A1), usando gua como branco.

Desenvolveu-se o mesmo procedimento utilizando-se o filtrado obtido a

partir do extrato hidroetanlico liofilizado (F3).

Polifenis no adsorvidos pelo p de pele

Quantidade de 10 mL de F1 foram adicionados a 0,10 g de p de pele

Merck. O conjunto foi levado agitao em agitador magntico durante 1 hora e, em

seguida foi filtrado atravs de papel de filtro. Cinco mililitros deste filtrado foram

Padro

Clculo

o teor de taninos foi calculado em porcentagem atravs da equao:

42Material e Mtodos

% taninos = 62,S (A1 - A~'> mgA3 m1

Onde: A1= valor de absorbncia dos polifenis totais a 760 nm; A2= valor de

absorbncia dos polifenis no adsorvidos pelo p de pele a 760 nm; A3= valor de

absorbncia do padro de pirogalol a 760 nm; m1= massa da amostra analisada

(droga vegetal ou extrato hidroetanlico liofilizado) em gramas; mr massa dopirogalol em gramas.

Imediatamente antes do uso, 50,0 mg de pirogalol (Merck) foram diludos em

gua em um balo volumtrico de 100 mL. 2 mL desta soluo foram adicionados

1 mL do reagente fosfomolibdotngstico e 10 mL de gua destilada em balo

volumtrico de 25 mL e o volume foi completado com a soluo de carbonato de

sdio. Aps 30 minutos, realizou-se a leitura da absorbncia a 760 nm (A3) , usando

gua como branco.

o mesmo procedimento foi realizado utilizando-se o filtrado obtido a partir doextrato hidroetanlico liofilizado (F3).

diludos com gua destilada em balo volumtrico de 25 mL. 2 mL desta soluo

foram adicionados 1 mL do reagente fosfomolibdotngstico e 10 mL de gua

destilada em balo volumtrico de 25 mL e o volume foi completado com a soluo

de carbonato de sdio. Aps 30 minutos, fez-se a leitura da absorbncia a 760 nm

(A2) , usando gua como branco.

Pd = mfx 100mi

Quantidade de 2 g de droga vegetaJ e 2 g do extrato hidroetanlico liofilizado

foram levados estufa a 100 C, separadamente, por 6 horas. Aps resfriamento do

cadinho de porcelana em dessecador, os mesmos foram pesados at que a massa

entre as pesagens no diferisse em mais de5 mg, em 3 pesagens consecutivas. A

determinao de gua foi calculada em porcentagem em relao massa da

amostra inicial atravs da frmula:

Material e Mtodos


43

Onde: Pd = determinao de gua em porcentagem; mi = massa inicial da amostra

em gramas; mf = massa final da amostra, aps a secagem, em gramas.


4.3.1- Atividade antimalrica e antileishmania dos extratos hidroetanlico

liofilizado (EHL) e clorofrmico

- Atividade antimalrica

Animais

O biotrio da Faculdade de Medicina da Universidade de So Paulo

ofereceu os animais que foram mantidos em caixas esterilizadas com material

absorvente, recebendo gua e alimento ad Iibitum. A infeco com Plasmodium

chabaudi AJ., ocorreu em camundongos BALBlc fmeas. Todos os procedimentos

realizados tiveram aprovao prvia das comisses de tica em Pesquisa do

Instituto de Medicina Tropical de So Paulo e do Instituto de Cincias Biomdicas da

Universidade de So Paulo.

Ensaio para determinao da CEso

Camundongos BALBlc foram infectados com 1x 107 P. chabaudi AJ e

avaliados diariamente quanto parasitemia, utilizando-se esfregaos sanguneos

corados com Giemsa e visualizados em microscpio ptico. Quando se verificou a

parasitemia de 15%, os animais sofreram sacrifcio em cmara de C02 e o sangue

Cultura dos Parasitas

- Atividade antileishmania

Analisaram-se os dados pelo softaware Graph Pad Prism 3.0, servindo-se de

uma curva do tipo sigmide dose-resposta.

'",11'1

44Material e Mtodos

A contagem da radiao foi determinada em triplicata em um Espectrmetro

Cintilador Rack Beta WALLAC 1209. Utilizou-se o sulfato de cloroquina (16 ~g/mL)

como controle positivo do ensaio. Parasitas incubados na ausncia de frmacos

serviram como controle de viabilidade do ensaio. DMSO foi incubado nas mesmas

concentraes com os parasitas para se verificar a ausncia de toxicidade e

conseqentemente interferncia no ensaio.

Aps a contagem das hemcias em cmara de Neubauer, determinou-se a

parasitemia e houve a aplicao de 5x106 de Plasmodium/poo em placas de cultura

de 96 poos, com volume final de 150 ~L. Os compostos (5 mg), correspondente aos

extratos hidroetanlico liofilizado e clorofrmico, foram previamente dissolvidos em

DMSO e diludos em meio de cultura RPMI 1640 na concentrao de 100 ~g/mL em

triplicata. A placa foi incubada a 37C em sistema "candle jar" (5% Oz. 5% COz, 90%

Nz) por 6 horas e aps este perodo adicionou-se 1 ~Ci/poo de eH] Hipoxantina

(Amersham) por mais 18 h. Ao final, a placa foi lavada em Cel! Harvester e o

material radiativo aderido ao DNA foi coletado em fibra de vidro no mesmo aparelho.

foi coletado atravs de puno cardaca em tubo contendo soluo de 50 ~L de

liquemine (anticoagulante). O material foi diludo em 3 mL de meio RPMI 1640,

suplementado com 10% de soro fetal bovino e posteriormente centrifugado a 200 G

por 8 minutos, para separao das hemcias.

Cultivaram-se promastigotas de Leishmania (L.) chagasi (cepa M 6445) em

meio M199 suplementado com 10% de soro fetal bovino, 0,25% de hemina e a 24C.

Hamsters Gold foram infectados periodicamente para manuteno da cepa, sendo

utilizados nos ensaios as formas promastigotas de no mximo trs passagens em

cultura.

Material e Mtodos

Ensaio de Viabilidade Celular- MTT

A viabilidade das formas promastigotas e macrfagos nos ensaios "in vitro",

foram verificados pejo mtodo do MTT (TADA et aI, 1986). O MTT (3-[4,5-

Dimetiltiazol-2-i1]-2,5-difenil-tetrazoJium brometo) um cromgeno que age como

substrato no processo respiratrio oxidativo de mitocndrias. Devido s

desidrogenases mitocondriais da clula, este produto reduzido a seu subproduto

formazan. Assim, atravs da leitura da densidade ptica (0.0.) a 570 nm possvel

quantificar as clulas viveis do sistema utilizado.

O MTT, na forma de um p amarelo fino, foi dissolvido em meio RPMI-PR

na concentrao de 5mg/ml, e posteriormente esterilizado por filtrao em

membrana de 0,22~m. O MTT (20~lIpoo) foi aplicado e a placa incubada na sua

respectiva temperatura (24C Leishmania e 37C macrfagos peritoniais) por 4

horas. Aps este perodo, adicionou-se 1OO~lIpoo de SOS 10% (dodecil sulfato de

sdio), e aps 18 horas realizou-se a leitura da 0.0. a 570nm, em espectrofotmetro

Labsystems Multiskan MS.

Determinao da Concentrao Efetiva 50% (CEso)

Utilizando-se promastigotas de Leishmania (L.) chagasi determinou-se a

CEso dos extratos, hidroetanlico liofilizado e c1orofrmico, que indica a

concentrao necessria para matar 50% dos parasitas na cultura.

Diluiu-se o composto em anlise (triplicata) em meio RPMI-PR 1640, nas

concentraes iniciais de 1OO~g/mL em placa de 96 poos. Aplicou-se 1x1 06

promastigotas/poo e em seguida incubou-se a placa 24 C por 24 horas.

Verificou-se a viabilidade dos promastigotas atravs do ensaio com MTT,

conforme descrito anteriormente. Os dados foram analisados pelo Softaware Graph

Pad Prism 3.0, utilizando-se uma curva do tipo sigmide dose-resposta.

Material e Mtodos


Animais

Ratos Wistar Hannover fmeas, pesando entre 150g a 180g, provenientes

do Biotrio da Faculdade de Cincias Farmacuticas da Universidade de So Paulo,

foram mantidos em gaiolas apropriadas recebendo rao e gua ad libitum por 5

dias antes do incio do experimento; o ciclo de claro-escuro de 12/12h foi obedecido.

Os testes realizaram-se com lotes de 8 animais controle e 8 animais teste; o

experimento baseou-se na metodologia de MIZUI & DOTEUCHI, (1983) e BACCHI,

(1988).

Ensaio

A avaliao da atividade antilcera do extrato hidroetanlico liofilizado (EHL)

ocorreu atravs do modelo de induo com cido clordrico e etano!.

Respeitado o perodo de adaptao, os ratos foram mantidos em Jejum

durante 24 horas. Em seguida, administrou-se o EHL, via oral, na dose de 400

mg/kg de massa corprea do animal, em suspenso aquosa na concentrao de 40

mg/mL.

Para o grupo controle foi administrado o mesmo volume de gua (10 mLlkg

ou 1 mL por 100g do animal). O c1oridrato de ranitidina, administrado via oral, na

dose de 100 ~g/kg serviu como controle positivo. Aps 30 minutos, usou-se, por via

oral, o agente indutor de lceras HCI 0,3 M em etanol 60%.

Decorrido uma hora, os animais foram anestesiados e mortos com ter. Os

estmagos foram retirados e abertos pela curvatura maior e fixados entre placas de

vidro para avaliao das ulceraes.

Realizou-se a avaliao das ulceraes atravs de dois parmetros: rea

Total de Leso (ATL) e rea Relativa de Leso (ARL). A ATL foi calculada somando-

se as reas de todas as lceras, sendo expressa em mm2. Para a medida das reas

utilizou-se o programa Image Pro Plus. A ARL foi calculada atravs da frmula

conforme descrita a seguir:

Anlise dos Resultados

Candida albicans (ATCC 10231)

Escherichia col (ATCC 10536)

47Material e Mtodos

Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)

Aspergillus niger (ATCC 16404)

Staphy/ococcus aureus (ATCC 6538)

Na avaliao da atividade antimicrobiana do extrato hidroetanlico liofilizado

empregaram-se os seguintes microrganismos:


Microrganismos empregados

Avaliaram-se os resultados atravs de anlise de varincia, com nvel crtico

igualou menor a 0,05 (5%) para rejeio da hiptese de nulidade, seguido de Tukey

(SOKAL e ROHLF, 1969). Os dados expressos em porcentagem (rea Relativa de

Leso) foram previamente transformados em arcosseno, para posterior anlise

estatstica.

I ARL = ATUAT x 100

Onde, ARL = rea Relativa de Leso expressa em porcentagem; ATL = rea Total

de Leso em mm2; AT= rea Total do Estmago em mm2.

Determinao da atividade antimicrobiana

Preparao das solues padres dos antibiticos

Para os meios de cultura utilizados, caldo e gar de casena soja (TSS e TSA)

e gar de sabouraud dextrose a 4%, seguiu-se as instrues do fabricante.

48Material e Mtodos

Os padres secundrios de c1oranfenicol, amicacina e nistatina foram

dissolvidos com gua destilada at obteno da concentrao de 1mg/mL.

Utilizaram-se o c1oranfenicol no ensaio para Staphylococcus aureus e Escherichia

col, a amicacina em Pseudomonas aeruginosa e a nistatina em Candida albicans e

Aspergillus niger.

A partir de culturas estoques, as bactrias foram repicadas em estrias na

superfcie de meio de cultura gar casena soja inclinado e incubadas a 30-35 Co por

24 horas. Repicou-se a levedura em meio de gar sabouraud dextrose a 4%, sendo

incubada a 20 - 25Co, por 48 horas.

A massa celular resultante do crescimento foi recolhida em 9mL de soluo

salina 0,85% (p/v) estril e a suspenso obtida foi padronizada conforme

metodologia para padronizao da suspenso microbiana.

Meios de cultura

O procedimento do teste para determinao da concentrao mnima inibitria,

pela tcnica de microdiJuio em caldo uma adaptao do procedimento que se

serve de tubos, adaptando-se os volumes de inculo, amostra e meio de cultura

para 200 f.tL. A partir da suspenso padronizada de cada microrganismo, efetuaram-

se as diluies necessrias com soluo salina estril e caldo casena soja (TSS),

para se obter solues com 104 a 105 UFC/mL.

Material e Mtodos

A microplaca utilizada possui 96 alvolos divididos em 12 colunas, com 8 poos

cada. As quatro primeiras colunas serviram como controles (controle do meio de

cultura, controle do solvente, controle do crescimento e controle positivo).

Na primeira coluna foram adicionados 200J.lL de meio de cultura TSB ou SOB;

na segunda coluna, 180-190J.lL de meio de cultura sem microrganismo e 10-20J.lL de

solvente (etanol 70%); na terceira coluna foram adicionados 200J.lL de meio de

cultura inoculado com o microrganismo e na quarta coluna foram adicionados 10J.lL

do antibitico e 190J.lL de meio de cultura inoculado com o microrganismo.

As colunas restantes serviram ao teste propriamente dito, sendo uma coluna

destinada ao controle da tintura e as outras trs colunas para cada tintura testada.

Em cada coluna adicionou-se 10-20 J.lL da amostra e 180-190J.lL de meio TSB ou

SOB inoculado.

Aps incubao de 24-48 horas a 35C ou 5-7 dias a 25C, foi realizada a

leitura das microplacas por espectrofotometria, com detector de Elisa a 630 nm.

Resultados

5 - Resultados


5.1.1- Caracterizao macroscpica de folhas

5.1.2 - Caracterizao microscpica de folhas e caule

5.1.2.1- Folha

5.1.2.2- Caule


5.2.1- Triagem fitoqumica

5.2.2- Rendimento do leo essencial

5.2.2.1- Cromatografia em fase gasosa do leo essencial

5.2.2.2- Composio qumica do leo essencial

5.2.2.3- Espectro de massas dos componentes majoritrios identificados no leo essencial de

A. austra/e de diferentes coletas da regio de lacri - SP.

5.2.3- Comparao dos rendimentos de diferentes extratos de Acanthospermum austra/e

(Loefl.) O. Kuntze

5.2.4- Perfil cromatogrfico dos extratos clorofrmico e hexnico

5.2.5- Isolamento da frao F4 CHCls por cromatografia em camada delgada preparativa e

identificao por Cromatgrafo a gs/Espectro de massa

5.2.6- Perfil cromatogrfico dos extratos aquoso, acetona:gua, clorofrmico e hdroetanlico

70% e isolamento da substncia F3.

5.2.7- Cromatgrafo a gs/Espectro de massa dos extratos acetona:gua, etanol 70%,

clorofrmico e da frao isolada F3

5.2.8- Doseamento de taninos no p da droga e no EHL



5.3.1- Atividade antimalrica e antileishmania do EHL e do extrato clorofrmico



Resultados


5.1.1- Caracterizao macroscpica de folhas

A

52

BFigura 9: Acanthospermum australe (Loefl.) O. Kuntze: A- folhas frescas; B- droga

vegetal.

As folhas podem se apresentar inteiras ou fragmentadas, de consistncia

membrancea, superfcie lisa, pilosa, possuindo colorao verde em ambas as

faces, sendo um pouco mais escura na epiderme superior. Quando transformadas

em drogas, apresentam-se enroladas e so friveis; a colorao marrom-castanha. 111

Apresentam fraco odor aromtico, com leve sabor mucilaginoso e amargo.~I

O contorno foliar romboidal a oval, apresentando de 1,5 a 4,5 cm de I!I

comprimento, por 1,0 a 3,0 cm de largura, sendo que em muitos casos, comprimento

Resultados

e a largura so equivalentes. A base foliar geralmente simtrica, o pice obtuso,

a margem denteada a sinuosa e a nervao peninrvea (figura 9A).

O pecolo (figura 9A), piloso na base, de insero lateral, sendo reto e

achatado. A seco transversal canaletada (cncavo-convexa).

5.1.2- Caracterizao microscpica de folhas e caules

5.1.2.1- Folha

- Lmina fotiar

A epiderme de face adaxial, em corte paradrmico, mostra clulas poligonais

de contorno levemente ondeado (figura 10C) com estmatos bastante freqentes,

sendo do tipo anomoctico (figuras 10A e 10C). Na face abaxial, as clulas

poligonais apresentam contorno sinuoso (figura 10B); os estmatos, tambm

freqentes, so anomocticos. H certo grau de espessamento celulsico nas

paredes celulares de ambas as epidermes, sendo a cutcula lisa em ambas as faces

(figuras 10A, 10B e 10C).

Anexos epidrmicos como os tricomas tectores de forma cnica podem ser

observados no mesofilo (figura 11C), na regio de nervura mediana (figuras 11A e

12B), no pecolo (figura 13C) e no caule (figura 14A), podendo ser do tipo bicelulares

unisseriados (figura 11 C) a pluricelulares unisseriados (figuras 100 e 13C); o

espessamento de suas paredes reduzido e a superfcie externa lisa.

Atravs da figura 11C possvel observar que o mesofilo dorsiventral,

apresentando uma nica camada de parnquima palidico (figura 110) e seis a

sete camadas de parnquima lacunoso (figura 11 E); as clulas do parnquima 11

palidico esto voltadas para a face adaxial (figura 11 B), enquanto que as do ~I

parnquima lacunoso (ou esponjoso) para a superfcie abaxial.

Resultados 54

Documents

Estudo biofarmacognóstico de Acanthospermum australe (Loefl.) O