Embed Size (px)
Citation preview
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
ESTUDO DO “GENOMIC IMPRINTING” NA PLACENTA DECLONES BOVINOS
Walt Yamazaki
Orientador: Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia
Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias eVeterinárias – Unesp, Campus de Jaboticabal, comoparte das exigências para obtenção do título de Doutorem Medicina Veterinária (Reprodução Animal).
JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL
Julho de 2006
ii
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
WALT YAMAZAKI – nascido no município de São Paulo – SP, aos 30 dias
do mês de dezembro de 1974, concluiu o curso colegial no “Colégio Integral”, na
cidade de Campinas – SP, em dezembro de 1992. Ingressou no curso de
graduação em Medicina Veterinária na Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias – FCAV, Campus de Jaboticabal da Universidade Estadual Paulista –
UNESP, em fevereiro de 1993. Concluiu, em dezembro de 1998, o curso superior
de Medicina Veterinária; ingressou, em março de 1999, no programa de pós-
graduação, ao nível de Mestrado, sob orientação do Prof. Dr. Joaquim Mansano
Garcia, no Programa de Medicina Veterinária, Área de Concentração em
Reprodução Animal, na FCAV – UNESP de Jaboticabal, com bolsa de Mestrado
da FAPESP e concluiu, em dezembro de 2001, com a defesa da Dissertação
“Clonagem em bovinos utilizando-se células somáticas de animais adultos:
avaliação comparativa da reconstituição de citoplastos pelas técnicas de
transferência nuclear e injeção nuclear intracitoplasmática”; ingressou, em março
de 2002, no programa de pós-graduação, ao nível de Doutorado, sob orientação
do Prof. Dr. Joaquim Mansano Garcia, no Programa de Medicina Veterinária, Área
de Concentração em Reprodução Animal, na FCAV – UNESP de Jaboticabal, com
bolsa de Doutorado da FAPESP.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE TABELAS......................................................................................... v
LISTA DE FIGURAS.......................................................................................... vi
LISTA DE ABREVIATURAS.............................................................................. viii
RESUMO........................................................................................................... x
ABSTRACT....................................................................................................... xi
I. INTRODUÇÃO............................................................................................... 01
II. OBJETIVOS ................................................................................................. 03
2.1. Objetivos Gerais...................................................................................... 03 2.2. Objetivos Específicos.............................................................................. 03
III. HIPÓTESES................................................................................................. 04
IV. REVISÃO DE LITERATURA........................................................................ 05
4.1. Produção de Indivíduos Geneticamente Idênticos.................................. 05 4.2. Histórico da Clonagem............................................................................ 05 4.3. A Técnica de Transferência Nuclear....................................................... 08 4.3.1. Obtenção e Maturação dos Oócitos Doadores de Citoplasma....... 09 4.3.2. Células Doadoras de Núcleo........................................................... 10 4.3.3. Coordenação do Ciclo Celular da Célula Doadora de Núcleo e do
Citoplasma Recipiente.................................................................... 11 4.3.4. Enucleação Oocitária...................................................................... 13 4.3.5. Introdução do Núcleo Doador.......................................................... 15 4.3.6. Ativação Oocitária........................................................................... 17 4.4. Cultivo in Vitro dos Embriões Reconstituídos.......................................... 19 4.5. Aplicações da Clonagem por Transferência Nuclear.............................. 21 4.6. “Genomic Imprinting”............................................................................... 22 4.6.1. “Genomic Imprinting” e a Reprogramação Epigenética no
Desenvolvimento............................................................................ 24 4.6.2. “Genomic Imprinting” na Gestação.................................................. 28 4.6.3. Regulação da Expressão dos Genes “Imprinted” Igf2-H19 e Igf2r.. 29 4.7. Reprogramação do Núcleo...................................................................... 30 4.8. Falhas no Processo de Clonagem.......................................................... 33 4.9. Problemas da Clonagem durante a Gestação........................................ 36
iv
V. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................. 41
5.1. Produção de Gestações a Termo de Clones Bovinos Reconstituídospor Transferência Nuclear...................................................................... 41
5.2. Obtenção das Amostras de Placenta...................................................... 42 5.3. Extração de RNA e Transcrição Reversa (RT-PCR)............................... 42 5.4. Avaliação dos Genes “Imprinted” pela PCR em Tempo Real................. 42 5.5. Análise Estatística................................................................................... 49
VI. RESULTADOS............................................................................................. 51
VII. DISCUSSÃO............................................................................................... 58
VIII. CONCLUSÕES.......................................................................................... 66
IX. REFERÊNCIAS............................................................................................ 67
v
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Componentes utilizados para a PCR em tempo real paraavaliação da especificidade da amplificação dos “primers” dos genesGAPDH, Igf2, Igf2r e H19.................................................................................. 44
Tabela 2: Componentes utilizados para a PCR em tempo real paraavaliação da expressão dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.......................... 47
Tabela 3: Eficiência média da reação, desvio padrão, limites inferior esuperior e determinação do “threshold” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r eH19.................................................................................................................... 48
Tabela 4: Taxas de estabelecimento de gestação (30d), mortalidadeembrionária (30-60d), abortos (60d-nascimento), nascimentos, mortalidadepós-nascimentos e eficiência da técnica de clonagem por transferêncianuclear para cada uma das linhas celulares utilizadas como fonte doadorade núcleo (*)...................................................................................................... 51
Tabela 5: Dados dos clones bovinos nascidos vivos: identificação,sobrevivência neonatal, sexo e peso ao nascimento (kg) (*)............................ 52
Tabela 6: Dados dos neonatos bovinos do grupo controle concebidos pormonta natural: identificação, sexo e peso ao nascimento (kg) (*)..................... 52
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Curva de Dissociação para avaliação da especificidade daamplificação dos “primers” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19..................... 45
Figura 2: Avaliação de amplificação específica de um único produto da PCRem tempo real dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19 (eletroforese em gel deagarose a 1,2%)................................................................................................ 46
Figura 3: Curva padrão correspondente aos genes GAPDH, Igf2, Igf2r eH19 em diferentes diluições.............................................................................. 47
Figura 4: Exemplo da determinação da eficiência das reações de PCR emtempo real para o gene GAPDH, utilizando o programa LinRegPCR:determinação dos limites superior e inferior (a), presença mínima de 4pontos na curva de regressão (b) e alta correlação (r2) das amostras (c)........ 48
Figura 5: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones em comparação a placentas de animais de monta natural (controle).(*, p<0,05).......................................................................................................... 53
Figura 6: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones fêmeas em comparação a placentas de animais de monta natural(controle). (*, p<0,05)......................................................................................... 56
Figura 7: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones machos em comparação a placentas de animais de monta natural(controle)........................................................................................................... 56
Figura 8: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones fêmeas em comparação a placentas de clones machos (controle).(*, p<0,05).......................................................................................................... 56
Figura 9: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones vivos em comparação a placentas de animais de monta natural(controle)........................................................................................................... 57
Figura 10: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones mortos em comparação a placentas de animais de monta natural(controle)........................................................................................................... 57
Figura 11: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones vivos em comparação a placentas de clones mortos (controle)............ 57
vii
Figura 12: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones nascidos com peso < 40kg em comparação a placentas de animaisde monta natural (controle)............................................................................... 58
Figura 13: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones nascidos com peso > 40kg em comparação a placentas de animaisde monta natural (controle).(*, p<0,05).............................................................. 58
Figura 14: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas declones nascidos com peso > 40kg em comparação a placentas clonesnascidos com peso < 40kg (controle)............................................................... 58
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
6-DMAP 6-Dimetilaminopurina
bp pares de base
BSA Albumina Sérica Bovina
cDNA DNA complementar
Ca+2 Cálcio
CIV Cultivo in Vitro
COC Complexo cumulus-oócito
CSF Fator Citostático
DNA Ácido Desoxirribonucléico
DEPC Dietilpolicarboneto
DMEM “Dulbecco’s Modified Eagle Medium”
DMRs “Differential Methylated Regions”
Dnmt DNA metiltransferases
ES Cells “Embryonic Stem Cells” (Células Tronco Embrionárias)
F Fêmea
FIV Fertilização in Vitro
FSH Hormônio Folículo Estimulante
GAPDH “Glyceraldehyde-2-phosphate dehydrogenase”
(Glutaraldeído-2-fosfato desidrogenase)
hCG Gonadotrofina Coriônica Humana
HSOF meio SOF com tampão Hepes
IC Centro “Imprint” Intergênico
ICSI Injeção Intracitoplasmática de Espermatozóide
ID Identificação
Igf2 “Insulin-like growth factor II”
(Fator de Crescimento Semelhante à Insulina Tipo 2)
Igf2r “Insulin-like growth factor II receptor” ou “cation-
independent mannose 6-phosphate receptor”
ix
(Receptor do Fator de Crescimento Semelhante à
Insulina Tipo 2 ou Receptor Cátion-Independente
Manose-6-Fosfato)
InsP3 Inositol 1,4,5-Trifosfato
kg quilos
LH Hormônio Luteinizante
LinRegPCR Analysis of Real Time PCR Data
LOS ”Large Offspring Syndrome” (Síndrome da Cria Gigante)
M Macho
M.E. Mortalidade Embrionária
MII Metáfase II
MCI Massa Celular Interna
MIV Maturação in Vitro
morta/e Mortalidade
MPF Fator Promotor de Maturação
N2L Nitrogênio Líquido
nc/o Nascimento
PBS Solução salina com tampão fosfato
PCR Reação em Cadeira da Polimerase
PIV Produção in Vitro
RNA Ácido Ribonucléico
RT-PCR Transcrição Reversa por PCR
mRNA RNA mensageiro
SFB Soro Fetal Bovino
SOF “Synthetic Oviduct Fluid”
TCM-199 “Tissue Culture Medium 199”
TN Transferência Nuclear
UV Ultra-violeta
Xist “X-Inactivate Specific Transcript”
x
ESTUDO DO “GENOMIC IMPRINTING” NA PLACENTA DE CLONES BOVINOS
RESUMO – Embora a transferência nuclear com células somáticas tenha sido
usada com êxito para produção de animais viáveis, a eficiência desta técnica
ainda é baixa. Diversos problemas no desenvolvimento têm sido observados nos
clones, com alta mortalidade embrionária, fetal e mesmo pós-natal. A principal
causa das mortes tem sido atribuída a distúrbios placentários e fetais. Uma vez
que os genes “imprinted” são importantes para o desenvolvimento da placenta e
do feto, o objetivo deste estudo foi avaliar os padrões de expressão dos genes
Igf2, H19 e Igf2r na placenta de clones bovinos recém-nascidos, em comparação
com animais controles produzidos por monta natural. Fragmentos da placenta
foram coletados de 15 clones (6 machos e 9 fêmeas) e de 3 animais controles.
Após a extração de RNA e RT-PCR, a amplificação dos transcritos dos genes Igf2,
Igf2r, H19 e GAPDH (controle endógeno) foi realizado em PCR em tempo real. A
placenta dos clones apresentou diminuição da expressão relativa dos genes H19
(41,5%) e Igf2 (42,9%) em comparação ao grupo controle. A placenta de clones
fêmeas apresentou diminuição de 72,6% dos transcritos de H19 quando
comparados a clones machos. Não houve diferença significativa entre clones vivos
e mortos. Na placenta de clones pesando mais que 40kg, uma diminuição da
expressão relativa do H19 (40,1%) e Igf2 (36,3%) foi observada, em comparação
ao grupo controle. Nossos resultados indicam que, mesmo em clones recém-
nascidos, uma reprogramação nuclear incompleta é observada na placenta dos
clones. Alterações no padrão de expressão dos genes “imprinted” H19 e Igf2
podem provocar distúrbios na placenta e no desenvolvimento do feto, o que pode
contribuir para a mortalidade pós-natal. Uma diminuição da regulação do gene
H19 na placenta de clones fêmeas, sugere que o processo de reprogramação em
alguns genes pode ser influenciado pelo sexo.
palavras-chave: clonagem, bovino, genes “imprinted”, transferência nuclear
xi
STUDY OF “GENOMIC IMPRINTING” IN THE PLACENTA OF BOVINE CLONES
ABSTRACT - Although somatic cell nuclear transfer has been successfully used to
produce viable offspring, the efficiency of this technique remains low. Several
developmental problems have been observed in clones, with high embryonic, fetal
and even postnatal mortality. The main cause of deaths has been attributed to
placental and fetal disturbs. As imprinted genes are important in the placenta and
fetal development, the aim of this study was to evaluate the expression patterns of
Igf2, H19 and Igf2r genes in the placenta of newborn bovine clones, in comparison
with control animals produced by natural mating. Fragments from the placenta
were collected from 15 cloned animals (6 males and 9 females) and from 3 control
animals. After RNA extraction and RT-PCR, the amplification of the transcripts of
Igf2, Igf2r, H19 and GAPDH genes (endogen control) were performed by real-time
PCR. Placenta of cloned animals presented a decrease in relative expression of
H19 (41.5%) and Igf2 (42.9%) genes in comparison with the control group.
Placenta of female clones presented a decrease of 72.6% in the frequency of H19
transcripts when compared with males. No significant differences were observed
between live and dead newborn clones. In the placenta of cloned animals weighing
over 40kg, a decrease in relative expression of H19 (40.1%) and Igf2 (36.3%) was
observed, in comparison with the control groups. Our results indicate that even in
newborn cloned animals, an incomplete nuclear reprogramming is observed in the
placenta of the clones. Alterations in the expression patterns of imprinted genes
H19 and Igf2 may cause disturbs in the placenta and in fetal development, which
may contribute to the postnatal mortality. Downregulation of H19 gene in the
placenta of female clones, in comparison to males, suggests that the process of
reprogramming in some genes could be influenced by the sex.
keywords: cloning, bovine, imprinted genes, nuclear transfer
1
I. INTRODUÇÃO
Nos mamíferos domésticos, o aumento dos índices produtivos bem como a
maior disseminação de material genético superior nos rebanhos tem sido alvo de
intensos estudos e investimentos, o que tem permitido um grande avanço e
desenvolvimento de diversas biotecnologias ligadas à reprodução animal. Desde o
relato do nascimento da ovelha Dolly (WILMUT et al., 1997), a clonagem passou a
ser uma das biotécnicas mais discutidas e estudadas, com um crescente interesse
tanto da comunidade científica como da indústria, uma vez que fora demonstrado
ser possível a produção de cópias genômicas a partir de células obtidas de um
animal adulto. Este grande interesse no desenvolvimento desta biotecnologia,
denominada de transferência nuclear, pode ser explicado devido às suas
potenciais aplicações, como a produção e multiplicação de animais geneticamente
idênticos e superiores, a preservação de espécies ameaçadas de extinção e a
produção de órgãos e tecidos para xenotransplantes (clonagem terapêutica). Além
disso, uma vez que as células doadoras podem ser mantidas em cultivo celular, a
clonagem possibilitou um grande avanço na produção de animais transgênicos, já
que as células podem ser modificadas geneticamente ainda durante o processo de
cultivo celular, antes da utilização destas células para reconstituição.
Embora a clonagem seja uma realidade, com vários animais clonados a
partir desta técnica em diferentes espécies, verifica-se ainda uma baixa eficiência
quanto à capacidade de desenvolvimento in vitro dos embriões reconstituídos e
obtenção de gestações de clones a termo, com altos índices de mortalidade
embrionária, fetal, peri e pós-natal. Dentre os diversos fatores que podem estar
contribuindo para estes baixos resultados envolvendo a clonagem, tem-se
atentado para questões ligadas à reprogramação do núcleo, especialmente ao
“genomic imprinting”. Os genes “imprinted” são caracterizados por apresentarem
expressão de apenas um dos alelos parentais em estádios específicos do
desenvolvimento. Uma vez que os genes “imprinted” são importantes no
2
desenvolvimento fetal e placentário, como o Igf2, Igf2r e H19, aliado ao fato de
que vários distúrbios placentários têm reflexo direto na taxa de sobrevivência fetal
e neonatal, torna-se importante investigar qual o comportamento destes genes
não apenas nos clones bovinos, mas também em sua placenta. Embora os
distúrbios placentários e fetais tenham sido bem caracterizados em bovinos, ainda
há uma carência de informações sobre a regulação e os padrões de expressão
destes genes “imprinted” nesta espécie.
3
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
Avaliar o padrão transcripcional de genes “imprinted” na placenta de
neonatos bovinos clonados com células somáticas em comparação a placenta de
neonatos produzidos por monta natural (grupo controle).
2.2. Objetivos Específicos
Estimar a freqüência dos transcritos dos genes “imprinted” Igf2 (“imprint” do
alelo materno e expresso pelo alelo paterno), H19 e Igf2r (“imprint” do alelo
paterno e expresso pelo alelo materno) em placentônios de animais clonados e
animais controle (monta natural), que se desenvolveram a termo.
Verificar a existência de correlação entre os genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e
H19 na placenta de clones.
Avaliar a existência de relação entre modificações dos padrões de
expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19 em placentônios de clones
bovinos e a mortalidade neonatal.
Verificar se a diferença de sexo entre os clones pode influenciar a
freqüência dos transcritos do Igf2r, Igf2 e H19 nas placentas destes animais.
Estudar se clones classificados em diferentes faixas de peso ao nascimento
podem apresentar modificação da expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e
H19 em suas respectivas placentas.
4
III. HIPÓTESES
1) Mesmo em clones bovinos produzidos a termo com sucesso, ocorrem
modificações na transcrição placentária dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19;
2) Assim como descrito em clones murinos, existe uma correlação entre os
genes “imprinted” Igf2 e H19 na placenta de neonatos clones bovinos;
3) Alterações placentárias dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19 estão
relacionadas à mortalidade neonatal;
4) O sexo do clone influencia o padrão de expressão dos genes “imprinted”
Igf2r, Igf2 e H19 na placenta;
5) Animais clonados classificados em diferentes faixas de peso apresentam
modificação placentária do padrão de expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2
e H19.
5
IV. REVISÃO DE LITERATURA
4.1. Produção de Indivíduos Geneticamente Idênticos
A palavra clone é originária do grego “klôn” e tem por significado “broto”,
sendo sinônimo de “indivíduo ou população de indivíduos proveniente da
reprodução vegetativa ou assexuada de um único indivíduo”. Inicialmente definida
para representar as técnicas assexuadas de enxertia e brotamento para a
multiplicação de plantas, a clonagem passa a ter um outro significado com o
aprimoramento das técnicas de manipulação de embriões.
No início da década de 80, com o objetivo de aumentar a eficiência nos
programas de transferência de embriões e propiciar a rápida multiplicação de
indivíduos valiosos, gêmeos monozigóticos foram produzidos através da bipartição
de embriões (WILLADSEN, 1979). Estes indivíduos geneticamente idênticos
foram, em essência, os primeiros clones produzidos utilizando-se técnicas
artificiais de reprodução em laboratório. Entretanto, após inicial entusiasmo
(WILLADSEN, 1980), dificuldades técnicas e comprometimento das taxas de
prenhez limitaram sua aceitação nos meios acadêmicos, embora tenha sido ainda
posteriormente aplicada em outras espécies (OZIL et al., 1982; LEIBO & RALL,
1987; LEWIS, 1994). Mesmo com aprimoramento da técnica e melhora dos
índices de gestação, a simples limitação matemática de criar, no máximo, quatro
indivíduos geneticamente idênticos, fizeram com que os cientistas concentrassem
seus estudos em uma outra técnica, denominada de “transferência nuclear”.
4.2. Histórico da Clonagem
Baseado no conceito de “equivalência nuclear”, proposto por SPEEMANN
(1938) num modelo auto-denominado de “fantástico”, devido às dificuldades
técnicas, foi possível obter clivagens de um citoplasma enucleado de um zigoto de
6
anfíbio contendo o núcleo de um embrião de 8 a 16 células. Amarrando um fio de
cabelo de uma boneca ao redor de um zigoto, houve a constrição do citoplasma
em duas metades: uma contendo núcleo e outro “enucleado”. A porção do
citoplasma contendo o núcleo se dividiu até 8-16 células, quando se desfez a
constrição e o núcleo deste blastômero passou então para a porção do citoplasma
“enucleado”, tendo ocorrido, posteriormente, a clivagem. O questionamento de
que “se o núcleo de células diferenciadas poderia retornar ao estádio funcional de
zigoto após transferência manual para um óvulo fecundado enucleado”, no
entanto, parecia algo impossível.
BRIGGS & KING (1952), em seu clássico trabalho de investigação da
totipotência nuclear, foram os pioneiros na microcirurgia e transferência de núcleo
em eucariotos. Através da enucleação de um zigoto de anfíbio seguido da injeção
do núcleo de uma célula embrionária no estádio de blástula diretamente no
citoplasma do óvulo fecundado, foi possível a retomada do desenvolvimento até o
estádio larval de girino. A totipotência destas células embrionárias foi comprovada
posteriormente com a repetição da experimentação e obtenção de anfíbios adultos
(Xenopus laevis, GURDON, 1961; Rana pipiens, McKINNELL, 1962). Embora
fêmeas adultas férteis tenham sido produzidas a partir da reconstituição com
células da endoderme do intestino de girinos (GURDON & UEHLINGER, 1966),
ainda não foi comprovada a viabilidade da técnica com células diferenciadas de
anfíbios adultos (DIBERARDINO, 1987; GURDON, 1999).
O nascimento dos primeiros mamíferos clonados com êxito utilizando-se
células embrionárias como fonte doadora de núcleo foi descrita por ILLMENSEE &
HOPPE (1981), com o nascimento de três clones de camundongos reconstituídos
a partir de direta introdução do núcleo de células da massa celular interna no
citoplasma de zigotos, que tiveram posteriormente removidos ambos os pró-
núcleos. Entretanto, como nenhum outro grupo de cientistas conseguiu repetir tal
experimento, o mesmo passou a ser questionado e dado como fraudulento,
levando a comunidade científica a declarar que a clonagem por microcirurgia seria
7
biologicamente impossível (MARX, 1983; McGRATH & SOLTER, 1984b;
McLAREN, 1984).
Foi somente após o aperfeiçoamento da técnica, passando-se a adotar um
método não invasivo de introdução do núcleo doador (fusão celular), denominado
de transferência nuclear (McGRATH & SOLTER, 1983), e, principalmente, em
decorrência da substituição de zigotos por oócitos em estádio de metáfase II como
fonte doadora de citoplasma, que os primeiros mamíferos clonados foram
produzidos (WILLADSEN, 1986) em ovinos. Seguido deste primeiro sucesso, o
uso de células embrionárias no processo de reconstituição também mostrou ser
viável na clonagem em outras espécies, como em bovinos (PRATHER et al.,
1987), coelhos (STICE & ROBL; 1988), suínos (PRATHER et al., 1989b), e
posteriormente em camundongos (KONO et al., 1991; CHEONG et al., 1993),
macacos (MENG et al., 1997) e caprinos (YONG & YUQIANG, 1998).
Avanços das técnicas de cultivo permitiram o estabelecimento de linhas
celulares, que mais tarde, mostrar-se-iam importantes na manutenção de células
doadoras de núcleo, podendo ser estocadas e guardadas mesmo após a morte do
animal. A partir de células da massa celular interna mantidas em cultivo in vitro por
quatro semanas, foi possível a obtenção de clones viáveis por transferência
nuclear (SIMS & FIRST, 1994). Posteriormente, com o estabelecimento de linhas
celulares a partir do disco embrionário de embriões de 9 dias e induzidas à
quiescência por privação de soro do meio de cultura por um período de 3 a 4 dias
antes da reconstituição, gestações a termo foram produzidas (CAMPBELL et al.,
1996a). Com base nestes resultados e observações, WILMUT e colaboradores
(1997) provocaram uma das maiores revoluções da ciência contemporânea
recente: utilizando linhas celulares estabelecidas de células da glândula mamária
de uma ovelha de 6 anos de idade, sincronizadas em fase G0-G1 do ciclo celular
pela privação de soro, foi possível, muito mais do que responder ao
questionamento de SPPEMANN (1938), demonstrar a viabilidade da clonagem de
indivíduos adultos para todo o mundo.
8
Desde então, a clonagem utilizando-se células somáticas adultas
diferenciadas já foi relatada com êxito em diversas outras espécies, como em
bovinos (KATO et al., 1998), camundongos (WAKAYAMA et al., 1998), caprinos
(BAGUISI et al, 1999; ZOU et al., 2001), suínos (BETTHAUSER et al., 2000;
ONISHI et al., 2000; POLEJAEVA et al., 2000), gatos (SHIN et al., 2002; YIN et al.,
2005), cães (LEE et al., 2005), coelhos (CHESNE et al., 2002), ratos (ZHOU et al.,
2003), mulas (WOODS et al., 2003) e eqüinos (GALLI et al., 2003).
4.3. A Técnica de Transferência Nuclear
A técnica de reconstituição por transferência nuclear envolve, basicamente,
as seguintes etapas: obtenção das células doadoras de núcleo, obtenção oócitos
doadores de citoplasto, sincronização do ciclo celular, maturação in vitro, remoção
da cromatina do oócito (enucleação oocitária), introdução do núcleo doador no
citoplasto, ativação do oócito reconstituído, cultivo in vitro e inovulação dos
embriões. Como se trata de uma técnica relativamente complexa, com grande
número de variações entre cada uma das etapas envolvidas decorrentes de
diferentes metodologias empregadas pelos diversos grupos de pesquisa que tem
trabalhado com a clonagem, aliado ao fato de que existem diferenças espécies-
específicas, há uma ampla variação dos resultados no que diz respeito ao
desenvolvimento até o estádio de blastocisto (ROBL, 1999; WELLS, 1999;
WESTHUSIN et al., 2001). As variações existentes entre os métodos, células e
espécies empregados na clonagem dificultam a comparação entre os diferentes
resultados, o que, em muitas vezes, torna mais difícil o refinamento da técnica.
Deste modo, tem-se como importante avaliar e diferenciar os efeitos da técnica
com os eventos biológicos que ocorrem durante o desenvolvimento dos embriões
reconstituídos, para que seja possível uma correta interpretação dos resultados.
9
4.3.1. Obtenção e Maturação dos Oócitos Doadores de Citoplasma
De modo geral, têm-se utilizado no processo de reconstituição, oócitos
maturados in vitro em estádio de metáfase II. Nas espécies domésticas,
principalmente em bovinos, devido à disponibilidade de ovários de abatedouro,
usados nos procedimentos de fertilização in vitro, o emprego deste tipo de fonte
doadora de citoplasma tem sido rotina na grande maioria dos centros de pesquisa.
Em animais de laboratório, oócitos maturados in vivo de boa qualidade podem ser
obtidos de animais superovulados, mas no caso de grandes animais, como ovinos
e suínos, torna-se um procedimento muito caro, e em bovinos e eqüinos, embora
seja tecnicamente possível, é economicamente inviável. Acredita-se que oócitos
maturados in vivo sejam a melhor fonte doadora de citoplasma sob o ponto de
vista da qualidade, a partir de comparações de oócitos maturados in vitro ou in
vivo que se desenvolveram ao estádio de blastocisto após a fertilização
(DIELEMAN et al., 2002). Em contrapartida, o uso de oócitos maturados in vitro
oferece algumas vantagens técnicas, além de econômicas, incluindo a
possibilidade de escolher o tempo de maturação (MIYOSHI et al., 2002) e o uso
de oócitos em diferentes estágios do ciclo meiótico (MIYOSHI et al., 2001).
A heterogeneidade dos oócitos maturados in vitro é um ponto negativo do
uso de ovários de matadouro, pois variáveis como origem dos ovários (animal,
raça, condição nutricional) e estágio do ciclo estral podem ter influência sobre a
competência oocitária (HAGEMANN, 1999) e, deste modo, interferir no processo
de reprogramação nuclear. Problemas de implantação de blastocistos, bem como
desenvolvimento fetal anormal, podem ser reflexo de uma inapropriada maturação
oocitária (MOOR et al., 1998). A ocorrência de interações entre o oócito recipiente
e o núcleo doador a ser reprogramado são importantes para o início do
desenvolvimento embrionário de clones (FULKA Jr et al., 2001).
Além disso, deve-se atentar para as condições de homoplasmia ou
heteroplasmia que podem se estabelecer no novo indivíduo produzido pela
clonagem, uma vez que, no oócito receptor, existem mitocôndrias (mtDNA) que
podem diferir do haplótipo daqueles encontrados na célula doadora de núcleo
10
(EVANS et al., 1999; MEIRELLES et al., 1999, 2001; SMITH et al., 2000b;
TAKEDA et al., 1999; HIENDLEDER et al., 1999; FERREIRA, 2002) e, como
conseqüência, problemas de interação núcleo-citoplasmática podem implicar em
falhas no desenvolvimento embrionário e fetal (HIENDLEDER et al., 2005; LU et
al., 2005).
Considerando-se que no oócito existam estoques maternos de RNAm e
proteínas, bem como o ambiente citoplasmático é responsável pelo processo de
reprogramação nuclear, a identificação e seleção do mais apropriado oócito
doador de citoplasma certamente irá melhorar a eficiência da clonagem.
4.3.2. Células Doadoras de Núcleo
Atualmente, na clonagem somática, tem-se utilizado como fonte doadora de
núcleo, células obtidas de vários tecidos (OBACK & WELLS, 2002) e de animais
de várias idades (fetos, recém-nascidos, jovens, idosos e até mesmo de animais
mortos após um período relativamente curto). Uma ampla variedade de tipos de
células já foi empregada na clonagem, como por exemplo: células da glândula
mamária (WILMUT et al, 1997), leucócitos (GALLI et al., 1999), linfócitos B e T
(HOCHEDLINGER & JAENISCH, 2002), condrócitos (BEYHAN et al., 2000),
células do cumulus (WAKAYAMA et al., 1998; TAMASHIRO et al., 2000), da
granulosa (WELLS et al., 1999; POLEJAEVA et al., 2000), do oviduto (KATO et al.,
1998), de Sértoli (OGURA et al., 2000a), do fígado e uterinas (KATO et al., 2000),
dentre outras (BREM & KUHHOLZER, 2002; OBACK & WELLS, 2002). Entretanto,
tem-se verificado diferenças quanto às taxas de desenvolvimento dos embriões
reconstituídos de acordo com a célula doadora de núcleo utilizada (KATO et al.,
2000), indicando que algumas células são mais facilmente reprogramadas do que
outras. As células podem ser usadas diretamente após a coleta do animal doador
(GALLI et al., 1999) ou seguido de um período de cultivo celular (WILMUT et al.,
1997; KUBOTA et al., 2000), bem como frescas ou após criopreservação. Na
prática, diferenças entre os tipos células não seria maior do que a diferença entre
população de células originárias de um mesmo tecido (KUHHOLZER et al., 2001),
11
indicando que o status da cromatina é mais importante do que a origem do tecido
(GALLI et al., 2002). Sabe-se que o genoma da célula pode passar por
modificações que podem interferir no êxito da técnica antes de sua utilização na
reconstituição, tais como: recombinação genética (que ocorre em linfócitos B e T,
o que pode explicar sua baixa eficiência como fonte doadora de núcleo;
HOCHEDLINGER & JAENISCH, 2002), espontâneas mutações, alteração de
ploidia (KING et al., 2006), danos genéticos promovidos por stress oxidativo e
envelhecimento da cromatina. Estas modificações podem ser influenciadas pelas
condições de cultivo celular bem como pelo número de passagens (RENARD et
al., 2002).
Uma vez que a estrutura da cromatina e as modificações epigenéticas são
consideradas os principais fatores determinantes do sucesso da clonagem, parece
que quanto maior o estádio de diferenciação celular de uma célula, mais difícil e
complexo seria o processo de reprogramação do núcleo a um estádio embrionário
de zigoto. Mas as razões para estas diferenças ainda não são conclusivas.
O que se verifica na rotina, no entanto, é o uso de linhas celulares
estabelecidas de fibroblastos coletados da pele, principalmente devido a sua maior
praticidade, possibilidade de clonagem tanto de machos como de fêmeas,
condições de cultivo celular bem conhecidas com produção de linhas primárias
estáveis, homogêneas, de alta capacidade mitótica e resistentes ao processo de
congelação (HEYMAN et al., 2000).
4.3.3. Coordenação do Ciclo Celular da Célula Doadora de Núcleo e do
Citoplasma Recipiente
A sincronização do ciclo celular entre o núcleo da célula doadora com o
citoplasto do oócito receptor é importante para assegurar que seja mantida a
correta ploidia após a reconstrução. Esses conceitos foram fundamentados
inicialmente na clonagem utilizando-se células embrionárias como fonte doadora
de núcleo, baseados no efeito que o Fator Promotor de Maturação (MPF) teria
sobre o núcleo. O MPF é um complexo protéico composto por duas subunidades
12
catalíticas (proteína quinase p34cdc2, regulada por eventos de fosforilação e
desfosforilação de seus sítios catalíticos, e a ciclina B1, subunidade regulatória), e
na sua forma ativa, regula o processo de duplicação e divisão celular, numa
cascata de eventos (quebra do envelope nuclear, condensação dos cromossomos,
reorganização do citoesqueleto e alterações na morfologia da célula) que permite
que a célula entre em mitose ou meiose (NURSE, 1990; MASUI, 1992).
Na clonagem embrionária, onde há uma contínua duplicação do DNA dos
blastômeros para as sucessivas clivagens, o fato de que a maioria das células
encontra-se em fase S do ciclo celular (80%) exige um citoplasto pré-ativado
(oócitos enucleados em telófase II e, portanto, com baixos níveis do MPF) para
que a ploidia do embrião reconstituído seja mantida (CAMPBELL et al., 1996b), já
que em oócitos em metáfase II (alta atividade do MPF), a manutenção de um
núcleo diplóide só é possível com o uso de blastômeros em fase G1 do ciclo
celular. A sincronização do ciclo celular do núcleo doador pode ser realizada nas
fases G1, S ou G2 utilizando-se, respectivamente, as drogas afidicolina (inibidor
específico da DNA polimerase α que impede a replicação do DNA e início da fase
S; SAMAKÉ & SMITH, 1997b), nocodazole (inibidor da polimerização dos
filamentos de tubulina e interrompe o ciclo celular em metáfase; KATO &
TSUNODA, 1992; SAMAKÉ & SMITH, 1996) e 6-Dimetilaminopurina (6-DMAP;
inibidor de fosforilação que inibe a formação do complexo ativo do MPF; SAMAKÉ
& SMITH, 1997a).
Na clonagem envolvendo a transferência nuclear de células somáticas,
baseado nos experimentos que deram origem a ovelha Dolly (CAMPBELL et al.,
1996a; WILMUT et al., 1997), passou-se a adotar tal protocolo como rotina: uso de
citoplastos com alta atividade do MPF (enucleados em metáfase II) e células
doadoras de núcleo sincronizadas em presuntivo estádio G0 do ciclo celular,
mantidas em quiescência no cultivo celular por privação de soro (BAGUISI et al.,
1999; WELLS et al., 1998, 1999; TANI et al., 2001; DANIELS et al., 2000, 2001).
Acreditava-se que, com a quebra da vesícula germinativa e prematura exposição
da cromatina do núcleo doador ao citoplasma, a reprogramação do núcleo
13
ocorreria mais cedo e que a sincronização em fase G0 facilitaria a reprogramação
em decorrência de alterações na estrutura nuclear e redução da atividade
transcripcional.
Embora existam evidências de que a utilização de citoplastos não ativados
(oócitos enucleados em metáfase II) e células doadoras sincronizadas antes da
fase S proporcionam melhores taxas de desenvolvimento, corroborando com a
proposição de que quanto maior o tempo de exposição do núcleo doador ao
ambiente citoplasmático, melhor seria a reprogramação nuclear (TANI et al.,
2001), não se pode descartar a possibilidade do uso de citoplastos com baixos
níveis do MPF na clonagem, uma vez que já foi demonstrado sua viabilidade, com
a produção de clones a termo, utilizando-se oócitos envelhecidos (VIGNON et al.,
1998) ou pré-ativados (BAGUISI et al., 1999).
A sincronização do ciclo celular em fase G0, embora seja eficiente para
manutenção da ploidia, com desenvolvimento de embriões ao estádio de
blastocisto e obtenção de gestações a termo, parece não ser essencial para o
desenvolvimento (WILMUT et al., 1997), uma vez que, estudos posteriores
utilizando-se células em fase G1, pela manutenção das linhas celulares até
apresentarem-se sub-confluentes, tiveram êxito na produção de clones a termo
(CIBELLI et al., 1998; KASINATHAN et al., 2001). Células sincronizadas em outras
fases que não em G0-G1 também podem ser usadas na clonagem, como em fase
M, com tratamento por nocodazole (WAKAYAMA et al., 1999; ONO et al., 2001;
TANI et al., 2001) ou G2/M, com tratamento com colchicina (LAI et al., 2002).
4.3.4. Enucleação Oocitária
Para que o núcleo doador possa iniciar seu desenvolvimento no citoplasto,
é necessário a prévia remoção do DNA dos oócitos. Este processo, denominado
de “enucleação oocitária”, tem-se mantido ao longo dos anos, consistindo
basicamente de uma microcirurgia com auxílio de micropipetas acopladas a
microinjetores e micromanipuladores em meio contendo inibidores do
citoesqueleto (citocalasina B ou D), pré-incubação com um corante de DNA
14
(Hoechst 33342), com a aspiração, para o interior de uma micropipeta, do primeiro
corpúsculo polar e parte adjacente do citoplasma do oócito em metáfase II. A
confirmação da enucleação se faz através da exposição do material aspirado à luz
ultra-violeta (UV), permitindo a visualização da cromatina. Ao contrário da
enucleação de oócitos de camundongos, espécie onde não é necessário o uso de
corantes de DNA (WAKAYAMA et al., 1998), tal procedimento é adotado
especialmente em bovinos e suínos, em decorrência da presença de maior
quantidade de lipídeos no oócito, que dificultam a visualização da placa
metafásica. A irradiação de UV diretamente do oócito pode ser efetiva na
destruição dos cromossomos em metáfase, não havendo a necessidade de
removê-la, como descrito em anfíbios. No entanto, em mamíferos, procedimentos
semelhantes podem provocar danos às organelas citoplasmáticas e à membrana
plasmática, prejudicando a competência oocitária (SMITH, 1993; BRADSHAW et
al., 1995; LEAL et al., 1999).
A bissecção dos oócitos (WILLADSEN, 1986) não se mostrou eficaz, pois
há grande comprometimento do volume de citoplasma, com reflexos na
capacidade de desenvolvimento (ZAKHARTCHENKO et al., 1997) e qualidade dos
embriões reconstituídos (WESTHUSIN et al., 1996). Recentemente, utilizando-se
a bissecção de oócitos, uma nova técnica de enucleação foi proposta sem o
auxílio de micromanipuladores, denominada de “Handmade Cloning” (BOOTH et
al., 2001; VAJTA et al., 2001, 2003): fusão de duas metades de oócitos bipartidos
sem a placa metafásica juntamente com a célula doadora de núcleo, utilizando-se
fitohemaglutinina.
Um método alternativo à enucleação de oócitos em metáfase II e o uso de
corante de DNA, seria utilizar oócitos em telófase II, removendo-se o segundo
corpúsculo polar em processo de extrusão (BORDIGNON & SMITH, 1998). Menor
quantidade de citoplasma seria removida do oócito bem como se evitaria o uso de
corantes de DNA. Inicialmente desenvolvida para solucionar os problemas de
sincronização dos blastômeros na clonagem embrionária, a enucleação em
telófase II já foi utilizada com sucesso na clonagem somática (BAGUISI et al.,
15
1999). No entanto, citoplastos pré-ativados possuem níveis baixos de MPF, o que
poderia prejudicar o processo de reprogramação nuclear (TANI et al., 2001).
Oócitos de mamíferos podem também ser enucleados por ultra-
centrifugação, com remoção da placa metafásica após seu deslocamento para a
periferia do oócito (TATHAM et al., 1995). A enucleação química pode também ser
empregada utilizando-se etoposide, agente inibidor da enzima DNA-
topoisomerase II, que atua impedindo a separação das cromátides, sendo a
cromatina removida juntamente com o segundo corpúsculo polar após ativação
oocitária (FULKA Jr & MOOR, 1993; ELSHEIKH et al., 1997, 1998; KÁRNÍKOVÁ
et al., 1998). Outro agente químico, a demecolcine (despolimerizador de
microtúbulos), já foi usado para induzir a completa enucleação em oócitos pré-
ativados em camundongos (BAGUISI & OVERSTROM, 2000) e parcial
enucleação em coelhos (YIN et al., 2002a), suínos (YIN et al., 2002a) e bovinos
(RUSSELL et al., 2005), induzindo-se a protusão de membrana contendo toda
cromatina condensada, com subseqüente remoção mecânica. Utilizando-se a
demecolcine, clones viáveis já foram produzidos em camundongos, na enucleação
química completa (BAGUISI & OVERSTROM, 2000; GASPARRINI et al., 2003), e
em suínos, na enucleação química parcial (YIN et al., 2002b; KAWAKAMI et al.,
2003).
4.3.5. Introdução do Núcleo Doador
A introdução do núcleo doador no interior do citoplasto pode ser realizada
de duas maneiras: através de fusão celular ou por injeção nuclear
intracitoplasmática (YAMAZAKI, 2001). Na reconstituição por fusão celular, após a
transferência da célula doadora de núcleo para o espaço perivitelíneo do oócito
enucleado, deve ocorrer a fusão entre ambas as membranas citoplasmáticas,
permitindo que o núcleo, juntamente com o citoplasma da célula, seja introduzido
no citoplasma do oócito. Neste sentido, é importante a manutenção da integridade
e viabilidade das membranas, e que estas estejam em íntimo contato. Embora a
fusão celular possa ser realizada por outros métodos (vírus Sendai,
16
polietilenoglicol e lisolecitina; EGLITIS, 1980; SPLINDE, 1981; McGRATH &
SOLTER, 1983, 1984a), a eletrofusão tem sido a técnica mais rotineiramente
usada na clonagem animal, com exceção dos camundongos. Pulsos elétricos de
corrente direta promovem desestabilização temporária das membranas
citoplasmáticas da célula doadora e do citoplasto em sua região de contato,
induzindo a formação de poros nas membranas, que se reorganizam
posteriormente já fundidas (ZIMMERMANN & VIENKEN, 1982; SMITH, 1992).
Uma vez que, na fusão celular, juntamente com o núcleo doador é
introduzido todo o citoplasma da célula, incluindo todas as organelas, proteínas,
RNAs e mitocôndrias, deve-se atentar para os efeitos que esta nova condição de
interação núcleo-citoplasmas possa exercer sobre o potencial de desenvolvimento
do embrião reconstituído (SMITH & ALCIVAR, 1993; MEIRELLES & SMITH, 1998;
NAGAO et al., 1998; YAMAZAKI et al., 1999; FERREIRA, 2002).
Sob este ponto de vista de interação núcleo-citoplasmática, a injeção
nuclear intracitoplasmática seria mais vantajosa, pois é introduzido apenas o
núcleo no interior do citoplasto. Para tanto, o núcleo é isolado com ruptura da
membrana citoplasmática da célula doadora, e introduzido diretamente no interior
do citoplasma do oócito enucleado, em procedimento semelhante à injeção
intracitoplasmática de espermatozóide – ICSI (PALERMO et al., 1995). Os
primeiros camundongos clonados a partir de células somáticas foram produzidos
utilizando-se esta técnica (WAKAYAMA et al. 1998), além dos primeiros clones
machos (WAKAYAMA & YANAGIMACHI, 1999), bem como produzido por células
tronco embrionárias (WAKAYAMA et al., 1999). O uso de um sistema piezoelétrico
facilita o processo de isolamento do núcleo e a injeção intracitoplasmática
(WAKAYAMA et al. 1998; GALLI et al., 1999; ONISHI et al., 2000), embora não
seja essencial (ZHOU et al., 2000; LOI et al., 2001). Em bovinos, a direta
comparação entre as técnicas demonstrou menor taxa de desenvolvimento a
blastocistos com o uso da injeção nuclear intracitoplasmática (YAMAZAKI, 2001;
GALLI et al., 2002), mas com mesmo potencial de desenvolvimento a termo
(GALLI et al., 2002).
17
Recentemente, uma terceira técnica foi relatada não envolvendo
prolongada manipulação dos oócitos (fusão) ou células doadoras (isolamento do
núcleo doador). Nas duas técnicas anteriores, a eficiência da clonagem pode ser
afetada negativamente devido a baixos índices de fusão celular bem como a
danos nucleares provocados no momento do isolamento do núcleo. A direta
injeção citoplasmática de toda célula doadora de núcleo intacta mostrou-se viável
na produção de clones em suínos, demonstrando que, ao contrário do que
acreditava-se anteriormente, o ambiente citoplasmático é capaz de promover a
dissolução da membrana citoplasmática da célula doadora, permitindo que o
núcleo passe para o interior do citoplasto (LEE et al., 2003).
4.3.6. Ativação Oocitária
Na maioria dos mamíferos, oócitos são ovulados e mantidos em metáfase II
até a fertilização. Durante o processo de maturação, ocorre uma específica
reorganização e redistribuição das organelas citoplasmáticas, com uma série de
alterações morfofisiológicas complexas de moléculas sinalizadoras para assegurar
que o desenvolvimento embrionário prossiga após a fecundação (MIYAZAKI et al.,
1993; CARROLL, 2001). Com a fecundação, os oócitos retomam a meiose e
iniciam o desenvolvimento em decorrência de uma cascata de eventos celulares,
num processo denominado de ativação oocitária. Elevações transitórias e
periódicas do Ca+2 livre intracelular, permitem que o oócito saia do bloqueio da
meiose em decorrência da inativação do MPF e do fator citostático (CSF) (LORCA
et al., 1991, 1993; COLLAS et al., 1993), com exocitose de grânulos corticais,
descondensação do núcleo espermático, recrutamento de mRNA materno,
formação dos pró-núcleos e início da síntese de DNA.
Na clonagem, os atuais protocolos de ativação oocitária estão geralmente
fundamentados na indução da ativação partenogenética do oócito em metáfase e
nos dados do subseqüente desenvolvimento embrionário (FISSORE et al., 1999).
Diversas combinações de agentes indutores de ativação já foram testadas na
produção de partonotos em bovinos (MÉO, 2002, 2005; MÉO et al., 2004, 2005) e
18
subsequentemente avaliados na clonagem (YAMAZAKI, 2001; YAMAZAKI et al.,
2005). Ativações ineficientes ou não-fisiológicas podem levar a falhas do
desenvolvimento mesmo após a implantação, tornando-se importante avaliar qual
o efeito da adoção destes métodos de ativação partogenética na clonagem, no
que diz respeito à manutenção da competência oocitária na reprogramação
nuclear.
Diversos agentes de ativação têm sido empregados na clonagem, sendo os
principais:
• pulsos elétricos de corrente direta de alta voltagem e curta duração:
promovem aumento do Ca+2 intracelular através da abertura temporária de
poros na membrana plasmática do oócito, permitindo trocas de íons e
macromoléculas, com entrada de Ca+2 extracelular (ZIMMERMANN &
VIENKEN, 1982);
• ionóforos de Ca+2 A23187 ou ionomicina: aumentam o influxo de Ca+2 do
meio extracelular bem como mobiliza Ca+2 dos estoques citoplasmáticos
intracelulares (KLINE & KLINE, 1992; NAKADA & MIZUNO, 1998);
• etanol (7%): promovem uma rápida potencialização da liberação de Ca+2
mediado pela estimulação da formação de inositol 1,4,5-trifosfato (InsP3) na
membrana plasmática (ILYIN & PARKER, 1992). No entanto, a exposição a
soluções diluídas de etanol podem promover danos ao citoesqueleto
(O’NEILL et al., 1989) com aumento da taxa de aneuploidia em partenotos
(KAUFMAN, 1982; O’NEILL & KAUFMAN, 1989);
• injeção intracelular de CaCl2 no citoplasma: induz a exocitose de grânulos
corticais e declínio da atividade da histona quinase H1 (MACHATY et al.,
1996);
• cicloheximide e puromicina: inibidores de síntese protéica que atuariam em
conjunto (ativação combinada) no processo de ativação do oócito
prevenindo a produção da ciclina B1, componente do MPF, fazendo com
que este permaneça inativo (PRESICE & YANG, 1994; NUSSBAUM &
PRATHER, 1995; TANAKA & KANAGAWA, 1997);
19
• 6-Dimetilaminopurina (6-DMAP): inibidor de fosforilação de proteínas, atua
inativando a c-mos e a MAP kinase, reduzindo as atividades do MPF e do
CSF (VERLHAC et al., 1993, 1994). No entanto, pode aumentar a
incidência de poliploidia e mixoploidia por inibir, inespecificamente, a
fosforilação de proteínas kinases necessárias para a formação dos
microtúbulos (De La FUENTE & KING, 1998);
• estrôncio: induz repetitivos aumentos da concentração de Ca+2 livre
intracelular (KLINE & KLINE, 1992) de modo semelhante ao que ocorre na
ativação dos oócitos após a fertilização (BOS-MIKICH et al., 1997).
Rotineiramente usado na clonagem em camundongos (KISHIKAWA et al.,
1999; WAKAYAMA & YANAGIMACHI, 1999, 2000; WAKAYAMA et al.,
1998, 1999, 2000, 2001; OGURA et al., 2000a, 2000b; AMANO et al., 2001;
ONO et al., 2001; ZHOU et al., 2001), mostrou ser viável na clonagem em
bovinos (YAMAZAKI et al., 2005).
4.4. Cultivo in Vitro dos Embriões Reconstituídos
Após a reconstituição embrionária e ativação, tem-se adotado,
basicamente, as mesmas condições de cultivo de embriões produzidos in vitro
(PIV). O método de cultivo in vitro bem como o estádio de desenvolvimento no
qual os embriões reconstituídos são transferidos para receptoras é variável de
acordo com a espécie. Embora comparações entre embriões produzidos in vitro e
in vivo mostrem que existem diferenças significativas na morfologia dos embriões,
com reflexo nas taxas de prenhezes (FARIN et al., 2001), o cultivo in vitro ainda se
faz necessário devido às dificuldades técnicas e econômicas da implantação
prematura no oviduto. Mesmo sendo viável a produção de clones de suínos após
imediata transferência de embriões reconstituídos recém-fundidos para o oviduto
(POLEJAEVA et al. 2000), evitando-se assim, as possíveis influências negativas
que os sistemas de cultivo possam exercer sobre o potencial de desenvolvimento,
20
o alto custo inviabiliza esta tentativa, sendo os embriões geralmente mantidos em
cultivo in vitro até atingirem o estádio de blastocisto.
Apenas uma proporção dos embriões reconstituídos atinge o estádio de
blastocisto, e esta taxa é geralmente inferior em comparação a embriões PIV
(YAMAZAKI, 2001). Em bovinos, as taxas de desenvolvimento dos embriões
reconstituídos ainda durante o período de cultivo in vitro tem-se mostrado bastante
variáveis, desde inferiores a 5% até maiores que 65% de produção de blastocisto
(WESTHUSIN et al., 2001). Esta ampla variação de resultados é reflexo dos
diversos sistemas de cultivo in vitro atualmente existentes, bem como das
múltiplas variações que a técnica de clonagem pode apresentar em suas diversas
etapas para a reconstituição do embrião. Deste modo, é necessário uma análise
mais ampla e geral frente aos resultados da clonagem, para que seja possível
distinguir o que poderia ser um efeito da técnica e o que seria realmente um
evento biológico.
Sabe-se que o metabolismo embrionário de embriões PIV pode ser alterado
de acordo com as condições de cultivo empregadas, como: temperatura, pH,
osmolaridade, atmosfera, co-cultivo, fonte protéica e energética (THOMPSON et
al., 1990; THOMPSON, 1996, 2000; BAVISTER, 2000; KRUIP et al., 2000; FARIN
et al., 2001), refletindo-se em problemas durante a gestação, como hidroalantóide,
mortalidade embrionária precoce, mortalidade neonatal, aumento do peso ao
nascimento bem como má-formações fetais (KRUIP & DEN DAAS, 1997;
HASLER, 2000; JACOBSEN et al., 2000; VAN WAGTENDONK-DE LEEUW et al.,
2000; FARIN et al., 2006). Isto mostra que, embora tenha havido significativo
avanço nas pesquisas em embriões em estádio de pré-implantação bem como
sobre as condições de cultivo utilizadas, problemas ainda ocorrem, principalmente
de ordem gênica, com reflexos principalmente no estabelecimento de gestações e
produção de animais a termo. Considerando-se que a reprogramação nuclear é
um fenômeno complexo que tem seu início neste período do desenvolvimento
embrionário, aliado aos problemas ainda persistentes da PIV, embriões clones
21
reconstituídos devem ser muito mais susceptíveis a alterações gênicas, que
podem ser agravadas frente às condições de cultivo atualmente utilizadas.
4.5. Aplicações da Clonagem por Transferência Nuclear
Do ponto de vista científico, o sucesso da clonagem por transferência
nuclear utilizando-se células somáticas como fonte doadora de núcleo tem
contribuído com a ciência básica, no que diz respeito a melhor compreensão e
elucidação dos mecanismos genéticos e epigenéticos envolvidos na
embriogênese, bem como a complexa interação envolvendo a remodelação da
cromatina, metilação do DNA e expressão gênica durante o desenvolvimento
embrionário e fetal. Além disso, novos desafios no estudo da reprogramação das
células surgiram com o advento da clonagem somática, e estes conhecimentos
gerados com estas investigações podem ter importantes implicações no processo
de diferenciação celular, e transplante de órgãos e tecidos, importante ferramenta
na clonagem terapêutica e os xenotrasplantes (KIND & COLMAN, 1999; LANZA et
al., 1999; CAMPBELL, 2002; NIEMAMAN et al., 2003).
A clonagem pode ser usada comercialmente em rebanhos para produzir
cópias de animais de alto mérito genético, como vacas leiteiras de alta produção
ou touros com boa composição de carcaça (GALLI et al., 1999; PATERSON et al.,
2003; FABER et al., 2004). Além disso, esta biotecnologia tem sido usada na
tentativa de preservação de espécies ameaçadas de extinção (WELLS et al.,
1998; CORLEY-SMITH & BRANDHORST, 1999; WHITE et al., 1999; LOI et al.,
2001). No entanto, a grande aplicação da clonagem está aliada à modificação do
núcleo doador para produção de animais transgênicos (CIBELLI et al., 1998;
CHAN, 1999; PIEDRAHITA, 2000; POLEJAEVA & CAMPBELL, 2000), através da
modificação genética dos núcleos doadores, visando à produção de proteínas
específicas no sangue e no leite (BRINK et al., 2000), maior eficiência na
produção de carne e leite (PIEDRAHITA, 2000), produção de modelos animais
para estudo de doenças (KENT & LEWIS, 1998, PATERSON et al., 2003).
22
4.6. “Genomic Imprinting”
O “genomic imprinting” é caracterizado por uma expressão gênica
diferencial dos alelos parentais, determinada por modificações epigenéticas da
transcrição gênica sem que ocorram alterações na seqüência do DNA. O “genomic
imprinting” diferencia-se da genética clássica Mendeliana uma vez que regiões de
cromossomos homólogos não apresentam equivalência funcional. Embora tanto o
alelo materno como o alelo paterno estejam presentes, um estará funcionalmente
ativo enquanto que o outro silenciado ou inativo.
Diversas teorias foram sugeridas para explicar a ocorrência do “genomic
imprinting”. Uma das hipóteses mais aceitas é a chamada teoria do conflito,
também conhecida como “batalha dos sexos” (MOORE & HAIF, 1991; HURST &
McVEAN, 1997, 1998). Esta teoria baseia-se no interesse tanto do macho como
da fêmea em obter o número máximo de proles viáveis a fim de que fossem
mantidos seus genes na população. Quando a reprodução é poligâmica, o macho
teria o interesse em assegurar o máximo crescimento de sua prole, e assim
recrutaria o máximo de recursos da fêmea quanto possível visando beneficiar a
progênie, para que a mesma fosse maior e mais forte, aumentando as chances de
sobrevivência no ambiente, mesmo que isso ocorresse em detrimento da fêmea
pela utilização de mais nutrientes maternos. Em contrapartida, a fêmea deve
limitar o crescimento embrionário e fetal para que a mesma esteja apta a
reproduzir-se novamente, com outro macho. Isto necessitaria dividir seus recursos
em diferentes gestações. As fêmeas que conseguissem restringir o crescimento
fetal e produzir maior número de proles com a limitação de recursos conseguiriam,
a longo prazo, ter mais êxito em suas vidas reprodutivas. Além da teoria do
conflito, um “modelo de desenvolvimento” sugere que o “genomic imprinting”
ocorreria em resposta à pressão ambiental, induzindo a rápidas mudanças de
expressão ou inativação dos alelos parentais de acordo com a necessidade
(BEAUDET & JIANG, 2002). Existe ainda o conceito de “ovário bomba relógio”, o
qual propõe que o “genomic imprinting” protegeria a fêmea de patologias
23
ovarianas, limitando a partenogênese e prevenindo a formação de tumores
malignos do trofoblasto (VARMUZA & MANN, 1994).
A assimetria funcional dos genomas parentais foi descoberta em
experimentos realizados na década de 80 utilizando a transferência pró-nuclear
em camundongos para a produção de embriões ginogenéticos ou androgenéticos,
possuindo apenas cromossomos maternos ou paternos, respectivamente. Embora
fossem diplóides, falhas e mortalidade no desenvolvimento embrionário e no
estabelecimento de gestações foram verificadas em ambos os casos. No entanto,
diferenças marcantes foram descobertas: os ginogenéticos morreram antes da
metade da gestação, com poucos dias da implantação, com retardo de
crescimento devido a falhas no desenvolvimento dos tecidos extra-embrionários,
enquanto que os androgenéticos apresentaram um potencial de desenvolvimento
muito mais restrito, com melhor formação dos componentes extra-embrionários
(McGRATH & SOLTER, 1984a; SURANI et al., 1984, 1986; SOLTER, 1988). A
partir das evidências verificadas nestes experimentos, com a aparente
contribuição materna para o desenvolvimento fetal e paterna para o
desenvolvimento das estruturas extra-embrionárias, surgiu a proposta de que um
específico “imprinting” do genoma paterno e materno ocorreria durante o
desenvolvimento do oócito e do espermatozóide, sendo necessário a contribuição
de ambos os genomas parentais após a fertilização para um desenvolvimento a
termo normal.
Embora a ocorrência do “genomic imprinting” tenha sido relatada em outros
grupos, como plantas angiospérmicas e alguns marsupiais (TODER et al., 1996;
KILLIAN et al., 2000; O’NEIL et al., 2000; SPIELMAN et al., 2001), com a
descrição de fenômenos regulatórios epigeneticamente semelhantes de expressão
gênica restrita a alguns genes, parece que os mecanismos de controle gênico
usados em organismos inferiores adquiriram funções adicionais em organismos
superiores ao longo da evolução filogenética, incluindo o controle do “genomic
imprinting”. Em mamíferos eutérios, os genes “imprinted” representam menos que
0,1% dos genes em todo genoma, mas possuem funções determinantes de
24
restringir e alterar a expressão de um dos alelos parentais, importantes nos
mecanismos de desenvolvimento embrionário, fetal, placentário e mesmo pós-
natal. Aproximadamente 80 genes “imprinted” já foram identificados em
camundongos e cerca de 50 em humanos, espécies onde o “genomic imprinting”
tem sido mais estudado. No entanto, nas espécies de produção, poucos genes
foram identificados, sendo necessário o aprofundamento dos estudos ligados ao
“imprinting” em animais com placentação distintas.
A regulação epigenética diferenciada da atividade gênica do DNA para os
genes “imprinted” é caracterizada por uma série de modificações complexas, que
incluem a metilação do DNA em regiões do genoma geralmente ricas em
dinucleotídeos CpG (FERGUSON-SMITH & SURANI, 2001; BIRD, 2002) e
modificações das histonas, com acetilação ou metilação (RICHARDS & ELGIN,
2002), associadas com transcritos antisenso e RNA não codificado incluindo
microRNAs (SPAHN & BARLOW, 2003). Estas modificações conferem um estádio
diferenciado nos cromossomos homólogos, afetando a interação entre o genoma e
moléculas regulatórias da atividade gênica, permitindo a ativação ou inativação de
um dos alelos parentais.
4.6.1. “Genomic Imprinting” e a Reprogramação Epigenética no
Desenvolvimento
O DNA genômico passa por significativas mudanças de metilação do DNA
durante a embriogênese, reflexo da necessidade de que alterações de controle da
expressão gênica devam ocorrer no espermatozóide, oócito e embrião para que
seja possível o posterior desenvolvimento embrionário e fetal no que diz respeito
ao estabelecimento de padrões tecido-específicos no processo de diferenciação.
Estas modificações são estádio de desenvolvimento e sexo dependentes, sendo
importantes do estabelecimento e controle dos genes “imprinted”.
A gametogênese e o estádio de zigoto da embriogênese correspondem aos
únicos momentos em que os genomas paternos e maternos apresentam-se
separados. Uma vez que os alelos “imprinted” são diferentemente marcados para
25
permitir sua expressão sexo-específica, deve ser nestes dois períodos que os
eventos de marcação dos “imprints” ocorram. Antes que do estabelecimento
destas marcações sexo-específicas nas linhas germinativas, os “imprints” são
apagados. Uma ampla demetilação de todo genoma ocorre no início do
desenvolvimento das linhas primordiais germinativas. Em camundongos, esta
demetilação completa-se aproximadamente entre os dias 10,5 a 12,5 de
desenvolvimento, momento correspondente à entrada das células primordiais
germinativas na gônada (SZABO & MANN, 1995; KATO et al., 1999; REIK &
WALTER, 2001; HAJKOVA et al., 2002; LEE et al., 2002b, SZABO et al., 2002).
Esta fase de reprogramação coincide com o momento em que as marcações
específicas de origem parentais são apagadas, que incluem a demetilação do
DNA das regiões diferencialmente metiladas (DMRs – “differential methylated
regions”), associadas com expressão gênica de alelos específicos (TUCKER et
al., 1996).
Subseqüente a este evento de demetilação, o momento de aquisição dos
“imprints” genômicos é significativamente diferente entre as duas linhas
germinativas. Nos machos, o período de restabelecimento dos “imprints” ainda
não está muito bem definido, mas evidências indicam que ocorra em gonócitos
diplóides. A metilação do H19 em murinos, por exemplo, inicia-se no estádio pré-
natal de pró-espermatogônia e é completada no estádio pós-natal de paquíteno da
meiose (UEDA et al., 2000). Entretanto, ao contrário do que se acreditava
anteriormente, em que a remetilação ocorreria ao mesmo tempo para ambos os
alelos parentais, estudos realizados com o gene H19 mostraram que o alelo
paterno sofre metilação anteriormente ao alelo materno, sugerindo-se que outros
eventos epigenéticos além da metilação do DNA devam estar presentes (DAVIS et
al., 1999, 2000).
Nas linhas germinativas das fêmeas, diversos estudos mostram que a
aquisição do “imprint” pela metilação do DNA estaria restrita à fase pós-natal de
crescimento do oócito na foliculogênese, não estando relacionada à duplicação do
DNA, uma vez que as mudanças epigenéticas ocorrem no estádio de diplóteno da
26
prófase I da meiose (CHAILLET et al., 1991; UEDA et al., 1992; BRANDEIS et al.,
1993; STOGER et al., 1993; KONO et al., 1996; OBATA et al., 1998, 2002; BAO et
al., 2000; LUCIFERO et al., 2002; OBATA & KONO, 2002). Diversos genes
“imprinted” recebem a marcação “imprint” de metilação do DNA de modo
assincrônico em diferentes estádios do desenvolvimento folicular. Os padrões de
estabelecimento das metilações nos genes “imprinted” dos espermatozóides e
oócitos depende da atividade das DNA metiltransferases (Dnmt). A correta
regulação da atividade das Dnmts, como Dnmt1, Dnmt10, Dnmt3a e Dnmt3b, no
estabelecimento do status alelo específico de expressão em DMRs (LI et al., 1993)
dos alelos parentais torna-se importante para que não haja prejuízo do potencial
de desenvolvimento embrionário e fetal.
Uma vez que o genoma dos espermatozóides e oócitos maturos
apresentam-se altamente metilados, em comparação a metilação de células
somáticas, após a fertilização, o zigoto conterá, portanto, DNA metilado localizado
em genes “imprinted” (tanto paternos como maternos) e a maior parte posicionado
em seqüências não-“imprinted”. No início do desenvolvimento, o embrião perderá
sua metilação em seqüências de DNA não-“imprinted”. Entretanto, os eventos de
demetilação do DNA não ocorrerão de modo equivalente nos genomas parentais,
uma vez que no embrião as duas linhas germinativas (alelos parentais) possuem
diferenças de reprogramação epigenética. Enquanto que o genoma paterno pró-
nuclear é demetilado rapidamente no zigoto após a fertilização num mecanismo
ativo (MAYER et al., 2000; OSWALD et al., 2000; SANTOS et al., 2002), o
genoma materno permanecerá aparentemente protegido deste processo inicial,
sendo gradualmente demetilado durante as primeiras clivagens num processo
passivo de demetilação (MONK et al., 1987; ROUGIER et al., 1998; MAYER et al.,
2000). Embora haja no espermatozóide características que afetam os níveis de
demetilação, os principais fatores que determinam o momento em que o genoma
parental torna-se demetilado são oócito-específicos (BEAUJEAN et al., 2004b).
Neste início de desenvolvimento embrionário, enquanto ocorre uma extensiva
demetilação em seqüências de DNA não-“imprinted”, os genes “imprinted” seriam
27
resistentes a esse processo de demetilação, mantendo o estado inicial dos
“imprints” estabelecidos nos gametas. As células da linhagem germinativa deste
embrião irão perder estas metilações dos genes “imprinted” durante o
desenvolvimento gonadal, enquanto que as células somáticas manterão estes
padrões de metilação durante o desenvolvimento embrionário e fetal, e a maioria
se estenderá durante a vida do novo organismo formado (embora os padrões dos
“imprints” de alguns genes sejam perdidos ou alterados em alguns tecidos, como
por exemplo, no fígado; McLAREN & MONTGOMERY, 1999). As taxas de
metilação de genes não-“imprinted” atingirão seus níveis mínimos entre os
estádios de mórula a blastocisto, quando um novo processo de metilação (“de
novo methylation”) tem início. Este segundo evento de metilação varia de acordo
com a espécie: em camundongos, coincide com a primeira diferenciação celular
no estádio de blastocisto, enquanto que em bovinos esta nova metilação tem início
entre 8 a 16 células, na ativação do genoma embrionário (REIK et al., 2001). O
estabelecimento destas duas linhagens de células no embrião resulta em outra
assimetria: as células da massa celular interna (MCI), que darão origem a todos os
tecidos do novo indivíduo, tornam-se hipermetiladas, enquanto que as células que
compõem o trofectoderma, que formarão as estruturas placentárias, apresentam
menor metilação (DEAN et al., 2001; SANTOS et al., 2002). Esta diferença reflete-
se nos tecidos somáticos (altamente metilados) e tecidos extra-embrionários da
placenta (hipometilados).
A ampla demetilação do genoma parental durante o desenvolvimento
embrionário após a fecundação, verificada em estudos realizados em
camundongos e humanos, não é representativo de todos os mamíferos. Maior
limitação do evento global de demetilação ocorre no genoma de ovinos, bovinos e
coelhos entre o estádio de zigoto e 8-células (BOURC’HIS et al. 2001a;
BEAUJEAN et al. 2004a; SHI et al. 2004). A razão pela qual em algumas espécies
exista uma necessidade de rápida demetilação do pró-núcleo masculino no
estádio de zigoto ainda é uma questão a ser respondida, mas pode estar
relacionada à ativação do genoma embrionário, à composição do genoma,
28
diferentes estratégias reprodutivas ou mesmo ligadas ao “genomic imprinting”
(YOUNG & BEAUJEAN, 2004).
4.6.2. “Genomic Imprinting” na Gestação
A placenta de mamíferos eutérios possui células derivadas de dois
indivíduos: o concepto e a mãe. Durante o desenvolvimento da placenta, células
de origem embrionária e materna formam vários tipos celulares de íntima
associação anatômica, resultando em regiões especializadas conhecidas como
interface materno-fetal. Em decorrência da interação entre células desta interface
ocorrerão as trocas entre o feto e a mãe, necessárias para a viabilidade e
crescimento fetal. Estudos dos genes “imprinted” mostram que os mesmos são
importantes no desenvolvimento fetal, placentário e mesmo comportamental, com
expressão monoalélica sendo identificada durante o desenvolvimento pré-natal
(REIK et al., 2003). Dentre os diversos genes “imprinted” já descritos, o Igf2, o H19
e o Igf2r tem sido os mais estudados em camundongos devido à importância dos
mesmos durante o desenvolvimento da gestação.
O gene “imprinted” Igf2 (fator de crescimento semelhante à insulina tipo 2)
possui “imprint” materno e é expresso pelo alelo paterno (DINDOT et al. 2004). O
Igf2 é um potente mitógeno que desempenha importante função na diferenciação
celular, comportamento pós-natal, desenvolvimento do cérebro (REIK & WALTER,
2001) no crescimento fetal (De CHIARA et al., 1999; EFSTRATIADIS, 1998) e
desenvolvimento da placenta (CONSTANCIA et al., 2002), e está localizado no
cromossomo 29 em bovinos (GOODALL & SCHMUTZ, 2003). O Igf2 é altamente
conservado, e serve como um ligante para o receptor de Ifg1 e o receptor de
insulina tipo A (MURPHY & JIRTLE, 2003), atuando em uma regulação
autócrina/parácrina dose dependente. Estas funções de ligação ocorrem para
iniciar e propagar os sinais que induzem o crescimento e bloquear a apoptose.
Além de ser o principal fator de crescimento fetal, o Igf2 expresso na placenta
regularia a difusão e trocas de nutrientes com o feto, a disponibilidade de
29
glicogênio e o transporte de aminoácidos aniônicos e catiônicos (BAKER et al.,
1993; LOPEZ et al., 1996; MATTHEWS et al., 1999; SIBLEY et al., 2004).
Em contraste ao Igf2, o gene “imprinted” Igf2r (receptor do M6P/Igf2 –
manose-6-fosfato/fator de crescimento semelhante à insulina tipo 2) possui
“imprint” paterno e é expresso pelo alelo materno. A proteína do Igf2r não está
envolvida na tradução de sinais, mas atua seqüestrando o excesso de Igf2 (e
outras proteínas), evitando sua ligação ao receptor do tipo 1, principal via de
atividade (KENDREW, 1994). O Igf2r ligaria-se ao Igf2, transportando-o para o
interior de lisossomos para sua degradação (MURPHY & JIRTLE, 2003; JOHN &
SURANI, 2000). Desta maneira, corroborando com a teoria do conflito, o Igf2r,
expresso materno, atua restringindo o crescimento fetal enquanto que o Igf2,
expresso paterno, o promove, e o equilíbrio entre a expressão e disponibilidade de
proteínas para estes dois genes “imprinted” é que regula o desenvolvimento
embrionário e fetal (MOORE, 2001). Além disso, o Igf2r interage com VEGF
promovendo a neovascularização (VOLPERT et al., 1996).
Assim como detectado em outras espécies (camundongos, BARTOLOMEI
& TILGHAMN, 1997; humanos, RACHMILEWITZ et al., 1992), em bovinos, o gene
H19 é caracterizado por apresentar expressão do alelo materno e “imprint” do
alelo paterno (ZHANG et al., 2004). O gene H19 codifica uma molécula de RNA
não traduzida (VERONA et al., 2003; ZHANG et al., 2004). A conservação do gene
H19 dentre diferentes grupos de mamíferos, e seu padrão similar de expressão
durante o desenvolvimento em ovinos e murinos (SASAKI et al., 1995; NAIMEH et
al., 2001; LEE et al., 2002b), sugere que seu RNA seria funcional (HURST &
SMITH, 1999). Estudos indicam que o RNA do H19 poderia atuar na regulação da
tradução de outro RNA, possivelmente o Igf2 (LI et al., 1998; RUNGE et al., 2000).
4.6.3. Regulação da Expressão dos Genes “Imprinted” Igf2-H19 e Igf2r
A regulação do H19 está relacionada com a do Igf2, uma vez que ambos
genes “imprinted” estão localizados no mesmo locus. A atividade recíproca
“imprint” do Igf2 e do H19 é regulada por um centro “imprint” intergênico (IC) ou
30
DMR, localizado numa região de 2 a 4kb upstream do H19. Este centro “imprint”
intergênico é diferencialmente metilado no alelo paterno durante a
espermatogênese (THORSVALDSEN et al., 1998). O fato de que seu alelo
materno não está metilado na sua região regulatória leva os promotores próximos
ao H19 a permanecerem em uma conformação aberta, permitindo que o mesmo
seja ativado por enhancers de cadeia longa localizados downstream (DAVIES et
al., 2002). Esta mesma DMR do alelo materno não metilada contém elementos de
marcação onde se ligam um fator protéico (CTFC), impedindo que os mesmos
enhancers de cadeia longa localizados downstream ativem os promotores do Igf2
localizados upstream. A metilação do DNA no alelo paterno impede a ligação de
CTCF a DMR localizada upstream do H19, permitindo que os enhancers
downstream interajam com os promotores do gene “imprinted” Igf2 paterno (BELL
& FELSENFELD, 2000; HARK et al., 2000).
O gene “imprinted” Igf2r é caracterizado por apresentar uma regulação a
partir de um RNA anti-senso alelo específico (REIK & WALTER, 2001). A
expressão deste gene é regulada por uma DMR intrônica. No alelo paterno não
metilado na DMR intrônica, a transcrição anti-senso se extende até o promotor ao
Igf2, reprimindo sua transcrição (WUTZ et al., 1997). No alelo materno, a
transcrição anti-senso é reprimida pela metilação intrônica da DMR, permitindo,
desta maneira, a transcrição materna a partir do promotor do Igf2r.
4.7. Reprogramação do Núcleo
Embora a produção de clones a partir de células de animal adulto tenha
sido devidamente comprovada em diversas espécies, sua eficiência ainda é
extremamente baixa, tendo já sido relatadas diversas anormalidades e problemas
durante todo o desenvolvimento embrionário, fetal e mesmo pós-natal. Não se
sabe exatamente se esses problemas são decorrentes da reprogramação nuclear
incompleta ou da técnica propriamente dita. A clonagem por transferência nuclear
envolve uma série de procedimentos técnicos complexos, que incluem o cultivo
31
das células doadoras de núcleo, sincronização do ciclo celular, maturação in vitro
dos oócitos doadoras de citoplasma, enucleação oocitária, introdução do núcleo
doador no citoplasto por fusão celular ou injeção nuclear intracitoplasmática,
ativação do oócito reconstituído, cultivo in vitro e transferência dos embriões.
Sendo a reprogramação nuclear um processo complexo e pouco compreendido, a
otimização de toda a técnica torna-se importante, pois qualquer alteração em um
desses procedimentos poderá influenciar negativamente a produção de embriões
e animais clonados (WELLS, 1999; WESTHUSIN et al., 2001; EDWARDS et al.,
2003; THIBAULT et al., 2003; CAMPBELL et al., 2005).
O termo reprogramação nuclear tem sido amplamente utilizado e, em linhas
gerais, indica o término de um “programa de expressão gênico somático” e início
de um “programa de expressão gênico embrionário”. Tudo isto se torna mais
complexo à medida que o ambiente citoplasmático está inicialmente programado
para promover todas as modificações epigenéticas de genomas parentais,
formados durante a gametogênese, necessárias para que o desenvolvimento
embrionário prossiga. A remodelação do núcleo, após sua introdução no
citoplasto, inclui uma fase de quebra do envelope nuclear com a condensação dos
cromossomos (BARNES et al., 1993; COLLAS & ROBL, 1991), descondensação
da cromatina após a ativação do oócito e reorganização do envelope nuclear
(STICE & ROBL, 1988). A ativação de genes durante o desenvolvimento ocorre
mediante a modificações epigenéticas, tais como: alteração dos padrões de
metilação do genoma, modificação e troca de histonas (somáticas por isoformas
embrionárias; GAO et al., 2004) e suas variantes nos nucleossomos (acetilação,
metilação, fosforilação, ubiquitinação e poli-ADP ribolisação), alterações na
morfologia nucleolar (CZOLOWSKA et al., 1984; KANKA et al., 1999),
modificações de lâmina nuclear (PRATHER et al., 1989a, 1991) e remodelação da
cromatina e de outras proteínas associadas à mesma (LATHAM, 1999;
CAMPBELL et al., 2005).
Na clonagem com células somáticas, espera-se que o núcleo seja
reprogramado ao estádio de zigoto, ou seja, o padrão de expressão gênica de
32
uma célula adulta diferenciada deve ser modificado no citoplasto, assumindo um
estado desdiferenciado, coerente com o estádio de desenvolvimento do embrião
reconstituído. Como a partir da transição materno-zigótica ocorre a ativação do
genoma embrionário, não dependendo mais apenas dos estoques de transcritos
de RNA e proteínas do citoplasma do oócito para prosseguir seu desenvolvimento
(MEIRELLES et al., 2004), é necessário que esta reprogramação nuclear ocorra
rapidamente, com a ativação dos genes ocorrendo tempo-padrão de expressão
semelhantes ao de um embrião produzido por fecundação normal. Para tanto, a
reprogramação nuclear necessita de grandes mudanças no padrão de expressão
de inúmeros genes, com reorganização da cromatina e reaquisição dos padrões
de metilação adequados para um embrião, já que este padrão de metilação do
espermatozóide (genoma paterno) e do oócito (genoma materno) durante a
fertilização normal não é análogo àquele encontrado no núcleo de uma célula
somática.
Numa contextualização teórica da reprogramação nuclear, esta pode ser
classificada em três níveis (RIDEOUT III et al., 2001): (i) sem reprogramação do
genoma, resultando na imediata morte do embrião; (ii) parcial reprogramação
nuclear, permitindo uma sobrevivência inicial dos clones, mas resultando em
fenótipos anormais e/ou apresentando mortalidade em vários estádios do
desenvolvimento embrionário/fetal/neonatal; (iii) completa reprogramação, com a
produção de clones normais e saudáveis. O que se verifica, no entanto, é que
mesmo com modificações da técnica propriamente dita e a experimentação da
clonagem em diversas espécies, a baixa eficiência e os inúmeros problemas
fenotípicos e genéticos dos clones sugerem que a reprogramação nuclear
completa é uma exceção.
Embora pesquisas tenham sido realizadas avaliando-se os efeitos nas
proteínas da matrix nuclear (MOREIRA et al., 2003), componentes do envelope
nuclear (KUBIAK et al., 1991), componentes nucleolares (KANKA et al., 1999) e
nas histonas (GAO et al., 2004), bem como estudos recentes mostram que vários
mecanismos epigenéticos, os quais desempenham importante função no
33
desenvolvimento normal, são interrompidos nos clones. O mecanismo preciso
molecular que envolve a base da reprogramação nuclear responsável pela
específica ativação e repressão dos genes nos embriões reconstituídos ainda é
um mistério a ser esclarecido (RIDEOUT III et al., 2001; HAN et al., 2003; SHI et
al., 2003; JOUNEAU & RENARD, 2003).
4.8. Falhas no Processo de Clonagem
Além da influência que variações da técnica de reconstituição oocitária para
a produção de embriões reconstituídos possam exercer sobre o potencial de
desenvolvimento dos mesmos (técnica de reconstituição empregada para
enucleação e introdução do núcleo doador, sincronização do ciclo celular do
núcleo doador com o citoplasto, método de ativação oocitária e condições de
cultivo in vitro), variações com o uso de diferentes tipos celulares em diferentes
estádios de diferenciação, número de passagens do cultivo celular das células
doadoras de núcleo e uso de citoplastos contendo mtDNA (DNA mitocondrial)
diferente do animal doador, podem ter reflexos na eficiência final do processo de
clonagem (WELLS, 1999; SMITH et al., 2000a, 2000b; WESTHUSIN et al., 2001;
FERREIRA, 2002; YAMAZAKI, 2002; EDWARDS et al., 2003; THIBAULT et al.,
2003; CAMPBELL et al., 2005).
Diversos estudos têm demonstrado que a reprogramação do núcleo doador
ocorre de maneira incompleta. A simples preferência dos embriões reconstituídos
(camundongos) por meios de cultura de células somáticas, apresentando
melhores taxas de desenvolvimento do que nos meios padrões rotineiramente
usados no cultivo in vitro, indicam que os embriões clones possuem
características que se assemelham mais a células somáticas do que a embriões
em processo de divisão celular (HEINDRYCKX et al., 2001; CHUNG et al., 2002;
GAO et al., 2003). Em clones murinos reconstituídos com células de mioblasto,
houve uma contínua expressão de transportadores de glicose (GLUT4), que é
tipicamente expresso no músculo, mas não em embriões em estádio de pré-
34
implantação (GAO et al., 2003). Outros estudos ainda mostraram que o gene
Oct4, que é expresso em células embrionárias pluripotentes e nas linhas
germinativas, mas é silenciado em células doadoras somáticas (PESCE &
SCHOLER, 2001), apresenta-se com alta variação nas células dos embriões
reconstituídos e padrão de expressão alterado, indicativo de falhas de
reprogramação em algumas células ou temporal heterogeneidade no processo de
reprogramação entre os blastômeros (BOIANI et al., 2003; BORTVIN et al., 2003;
ECKARDT & McLAUGHLIN, 2004). A presença de fatores de transcrição, como a
proteína de ligação TATA-box, associadas à cromatina da célula doadora após o
processo de reconstrução embrionária pela transferência nuclear é indicativo de
que alguns genes devem ainda permanecer “programados” para a expressão
gênica (SULLIVAN et al., 2004). Problemas no transporte citoplasmático-nuclear
de proteínas pode ainda afetar a reprogramação do núcleo (PARK et al., 2002).
Além dessas alterações, problemas com relação à inativação do
cromossomo X, regulado pelo gene “imprinted” Xist (EGGAN et al., 2000; XUE et
al., 2002; EGGAN & JAENISCH, 2004; SENDA et al., 2004), bem como o
restabelecimento do comprimento dos telômeros, progressivamente diminuídos
nas células somáticas em decorrência das divisões mitóticas, que pode não
ocorrer completamente, dependendo da espécie, do tipo celular usado para
reconstituição e da progênie dos clones (SHIELDS et al., 1999a, 1999b; LANZA et
al., 2000; BETTS et al., 2001, 2005; KÜHHOLZER-CABOT & BREM, 2002;
MIYASHITA et al., 2002; JIANG et al., 2004; JEON et al., 2005), evidenciam a
complexidade da reprogramação de todos os genes do núcleo doador.
Considerando-se que os eventos de demetilação e metilação do DNA são
importantes na regulação da expressão gênica, o que se tem observado na
clonagem são alterações significativas dos padrões de metilação do DNA em
análises de metilação global ou em regiões particulares do genoma, como as
regiões diferencialmente metiladas dos genes “imprinted” (KANG et al., 2001a,
2001b, 2001c, 2002; BOURC’HIS et al., 2001b, DEAN et al., 2001; OHGANE et
al., 2001, SHIOTA & YANAGIMACHI, 2002; CEZAR et al., 2003; CHUNG et al.,
35
2003; SANTOS et al., 2003; BEAUJEAN et al., 2004b; CHEN et al., 2004; SHI et
al., 2004b). Problemas ligados à localização e expressão de DNA
metiltransferases (ex: Dnmt1) aberrante nos embriões reconstituídos podem
contribuir para os problemas de metilação e aumentar as anormalidades
verificadas no desenvolvimento de clones (CHUNG et al., 2003). Como
conseqüência desta aparente resistência à reprogramação epigenética do núcleo
doador em decorrência destas alterações, genes podem manter sua atividade de
transcrição enquanto que outros apresentarem padrão de expressão anormal.
Problemas ligados à expressão errônea em momentos e padrões não
correspondentes àqueles verificados durante o desenvolvimento normal de
embriões produzidos por fecundação têm sido relatados para diversos genes e em
diferentes espécies, sendo estes genes “imprinted” (HUMPHERYS et al., 2001;
INOUE et al., 2002; MANN et al., 2003; OGAWA et al., 2003; YOUNG et al., 2001,
2003; YANG et al., 2005) ou não-“imprinted” (De SOUSA et al., 1999; DANIELS et
al., 2000, 2001; WRENZYCKI et al., 2001, 2002; NIEMANN, 2002; RAVELICH et
al., 2004a, 2004b, 2006). A alteração do padrão de expressão destes genes tem
levado a problemas de mortalidade embrionária, fetal e pós-natal, contribuindo
para diminuição da eficiência da técnica.
Além destes problemas verificados na reprogramação nuclear incompleta e
da influência que modificações da técnica possam exercer sobre o
desenvolvimento de clones, distúrbios cromossômicos com relação à incorreta
manutenção da ploidia (SLIMANE-BUREAU & KING, 2002; BOOTH et al., 2003;
BHAK et al, 2006; KING et al., 2006), alteração da relação entre as células da
massa celular interna e do trofectoderma (KOO et al., 2002, 2004), problemas na
organização de microtúbulos, fibras do áster e centrossomos (SIMERLY et al.,
2003, 2004; MIKI et al., 2004; ZHONG et al., 2005; MIYARA et al., 2006) nos
embriões reconstituídos podem contribuir negativamente nos resultados da
clonagem.
Como conseqüência de todas estas alterações verificadas nos embriões
reconstituídos com células somáticas, apenas uma pequena proporção dos
36
embriões manipulados atingem o estádio de blastocisto durante o processo de
cultivo in vitro, sendo estas taxas de desenvolvimento geralmente inferiores
àquelas alcançadas por embriões produzidos in vitro (YAMAZAKI, 2001). Embora
tenha-se usado as taxas de desenvolvimento ao estádio de blastocisto para
avaliação e comparação entre diferentes metodologias na reconstituição, não
significa que seja o melhor indicador para qualidade embrionária, especialmente
no caso de embriões clones. Muitas das alterações epigenéticas e de
reprogramação nuclear incompleta não podem ser detectadas apenas baseando-
se na avaliação morfológica do embrião. Infelizmente, devido à complexidade e
dificuldades técnicas que envolveriam uma avaliação mais detalhada do embrião
no que diz respeito à manutenção de um correto padrão de expressão gênica,
sem que haja prejuízo em relação à sua viabilidade, muitos embriões
considerados morfologicamente “normais” que atingem o estádio de blastocisto,
mas que apresentam problemas de reprogramação, acabam sendo transferidos
para receptoras. Problemas de reprogramação de alguns genes podem se
manifestar somente na gestação, como é o caso, por exemplo, dos genes
“imprinted” Igf2, Igf2r e H19, importantes na regulação do crescimento e
desenvolvimento fetal e placentário.
4.9. Problemas da Clonagem durante a Gestação
Como conseqüência de todos estes problemas detectados nos embriões
em estádio de pré-implantação, as taxas de mortalidade embrionária e fetal são
significativamente mais altas em clones em comparação aos controles,
independentemente da espécie (WELLS et al., 2004). Em camundongos, estudos
mostram uma alta taxa de implantação embrionária (57-71%), mas baixas taxas
de nascimentos (2-3% ou menos) na transferência nuclear com células somáticas
(WAKAYAMA et al., 1998; YANAGIMACHI, 2002). Em embriões clones bovinos,
espécie onde é mais fácil o monitoramento da gestação, os índices de
implantação, estabelecimento de prenhezes e desenvolvimento até os 30-35 dias
37
de gestação é quase semelhante a embriões fertilizados normalmente (GALLI et
al., 1999). Entretanto, no diagnóstico aos 90 dias de gestação, em mais da metade
das prenhezes estabelecidas ocorre o aborto (CIBELLI et al., 1998), e até o
nascimento a termo, mais de 40% das gestações restantes são perdidas
(HEYMAN et al., 2002a), limitando seu sucesso a 5-6% (CHAVATTE-PALMER et
al., 2004; WELLS et al., 2004).
Na espécie bovina, a alta taxa de mortalidade embrionária e fetal no terço
inicial de gestação de clones está geralmente relacionada à má formação da
placenta. Diversos distúrbios placentários já foram verificados, como:
anormalidades na vascularização dos tecidos extra-embrionários
(hipovascularização), principalmente dos vasos do cório-alantóide, reduzido
número de cotilédones associado com aumento de tamanho dos placentomas e
hidropsia das membranas fetais (HILL et al., 2000; HEYMAN et al., 2002b;
HASHIZUME et al., 2002). Estas anormalidades placentárias são provavelmente
as principais causas das perdas no período pré-implantação de fetos clonados,
devido à severa deficiência nutricional que acomete o feto, induzindo a retardo do
crescimento e finalmente à morte por restrição de nutrientes (HEYMAN et al.,
2002b). Problemas similares com alteração da função placentária e alta taxa de
aborto também já foram relatados em ovinos (DE SOUZA et al., 2001).
Problemas de placentomegalia têm sido marcantes na clonagem em
camundongos (WAKAYAMA et al., 1999, 2000, TANAKA et al., 2001, OGURA et
al., 2002; SINGH et al., 2004), com aumento da placenta de duas a quatro vezes
em comparação com grupo controle, independentemente da fonte doadora de
núcleo, tipo celular ou protocolo de reconstituição utilizado nesta espécie
(WAKAYAMA et al., 1999; OGURA et al., 2000a).
No terço final da gestação, a freqüência de aborto, limitada a menos que
5% na reprodução sexual de bovinos, é significativamente mais alta no caso de
clones (CIBELLI et al., 1998; VIGNON et al., 1998; WELLS et al., 1999; HEYMAN
et al., 2002a), e ocorreria devido a disfunções placentárias. Aumento do cordão
umbilical e de seus vasos, edemaciação das membranas placentárias e aumento
38
dos placentomas, que apresentam-se em menor número, são algumas das
alterações encontradas na gestação de clones (KRUIP & Den DAAS, 1997;
WELLS et al., 1999; HEYMAN et al., 2002a). Avaliações dos níveis plasmáticos da
PSP60 (“pregnancy serum protein 60”), secretada pelas células binucleadas da
placenta e um marcador de gestação em bovinos (MIALON et al., 1993), mostram
um aumento significativo nos primeiros quatro meses de gestação em receptoras
onde foram detectadas anormalidades no final da gestação (HEYMAN et al.,
2002a), indicativo de ocorrência de problemas placentários. As perdas neste
período da gestação ocorrem principalmente em decorrência de hidroalantóide
(KRUIP & Den DAAS, 1997; WELLS et al., 1999; HEYMAN et al., 2002a),
patologia que está frequentemente relacionada com hipóxia fetal seguido de
distúrbios hematológicos. As alterações placentárias, com redução da
vascularização podem estar relacionados com este desbalanceamento de fluídos.
Dificuldades no parto também são relatadas na clonagem, e estariam
relacionadas a distúrbios endocrinológicos com diminuição das concentrações
plasmáticas de cortisol, que seriam insuficientes para desencadear o sistema IGF
ligado à sinalização para a indução do parto (MATSUZAKI & SHIGA, 2002). A
administração de corticosteróides pode aumentar as chances de sobrevivência,
induzindo o parto ou em preparação à cesareana, bem como pode ser importante
na maturação pulmonar dos clones (WELLS et al., 1999; PTAK et al., 2002).
O nascimento e o período pós-natal também são críticos no processo de
obtenção de animais clones normais. Gestações prolongadas e distocia são
frequentemente relatadas na clonagem em bovinos (KATO et al., 1998; WELLS et
al., 1999; RENARD et al., 1999) e podem ser responsáveis por perdas pós-natais
durante os primeiros dias de vida do clone. Além das anormalidades placentárias,
verifica-se um aumento da mortalidade pós-natal de clones bovinos durante os
dois primeiros dias após o parto, com grande variação nas disfunções e
anormalidades observadas e confirmadas na necrópsia: problemas respiratórios,
alterações circulatórias, cardiopatologias, problemas de controle da temperatura
com casos de hipertermia e hipotermia, disfunções renais (hidronefrose),
39
hipertrofia do fígado, má formação cerebral, anemia, atrofia tímica, hipoplasia
linfóide, disfunções imunes, problemas gastrointestinais, deformações da
musculatura esquelética, etc (HILL et al., 1999, 2000; JONES et al., 2001;
HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-PALMER et al., 2004).
Um outro problema verificado na clonagem é a “Síndrome da Cria Gigante”
(LOS – “Large Offspring Syndrome”, YOUNG et al., 1998). Essencialmente, esta
síndrome é caracterizada pelo aumento do peso corpóreo do animal recém-
nascido e já foi relatada em clones de ovinos e bovinos (CHAVATTE-PALMER et
al., 2002; PACE et al., 2002; HEYMAN et al., 2002a). Embora a LOS tenha sido
relatada em animais produzidos in vitro, tendo sido atribuída às condições de
cultivo os distúrbios que levariam a este aumento do peso ao nascimento, está
claro que a taxa de ocorrência em clones é significativamente mais alta. Estudos
em ovinos que apresentavam a LOS mostraram uma correlação entre problemas
de metilação e expressão aberrante do gene “imprinted” Igf2r (YOUNG et al.,
2001). Em camundongos, embora tenham nascido com peso normal, alguns
clones apresentaram maior ganho de peso, com descrição de casos de obesidade
em decorrência de hiperleptinemia e hiperinsulinemia (TAMASHIRO et al. 2000,
2002, 2003).
Como evidenciado pelo grande número de problemas verificados durante
toda a gestação, com alta mortalidade embrionária e fetal em decorrência de
alterações placentárias e no próprio feto, a eficiência da técnica tem-se mostrado
muito baixa, indicando que a reprogramação do núcleo é incompleta. Mesmo após
o nascimento, a mortalidade de neonatos é alta. As alterações dos padrões de
metilação e de DNA metiltransferases nos clones só reforçam a idéia de que
genes essenciais para o crescimento e desenvolvimento podem ter seu padrão de
expressão e regulação comprometidos por falhas na reprogramação (KANG et al.,
2001a, 2001b, 2001c, 2002; BOURC’HIS et al., 2001b, DEAN et al., 2001;
OHGANE et al., 2001, SHIOTA & YANAGIMACHI, 2002; CEZAR et al., 2003;
CHUNG et al., 2003; SANTOS et al., 2003; BEAUJEAN et al., 2004b; CHEN et al.,
2004; SHI et al., 2004b). Uma vez que os genes “imprinted” são importantes no
40
desenvolvimento fetal e placentário, como o Igf2, Igf2r e H19, aliado ao fato de
que vários distúrbios placentários tem reflexo direto na taxa de sobrevivência fetal
e neonatal, torna-se importante investigar qual o comportamento destes genes
não apenas nos clones bovinos, mas também em suas placentas. Embora os
distúrbios placentários e fetais tenham sido bem caracterizados em bovinos, ainda
há uma carência de informações sobre a regulação e os padrões de expressão
destes genes “imprinted” nesta espécie.
41
V. MATERIAL E MÉTODOS
5.1. Produção de Gestações a Termo de Clones Bovinos Reconstituídos por
Transferência Nuclear
A produção in vitro de embriões reconstituídos por transferência nuclear
bem como a obtenção das amostras utilizadas para a avaliação da expressão
gênica foi realizada pelo laboratório do Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP-
Pirassununga-SP).
De modo resumido, no processo de reconstrução embrionária, oócitos
bovinos obtidos de ovários de matadouro foram utilizados como fonte doadora de
citoplasma enquanto que linhas celulares de fibroblastos, estabelecidas a partir de
biópsias de pele de cinco animais adultos da raça Nelore (2 machos e 3 fêmeas),
foram usadas como fonte doadora de núcleo. Após a maturação in vitro (MIV), os
complexos cumulus-oócitos foram desnudos em hialuronidase, incubados por
30min em 5µg/mL de bisbenzimide (Hoechst 33342) e 7,5µg/mL de citocalasina B,
enucleados em estádio de metáfase II em microscópio óptico invertido equipado
com luz epifluorescente, removendo-se o primeiro corpúsculo polar e parte do
citoplasma adjacente, confirmando-se a enucleação expondo-se o material
aspirado no interior da pipeta à luz ultra-violeta. Oócitos enucleados com êxito
tiveram inserido no espaço perivitelíneo uma célula somática (fibroblasto). O
processo de fusão celular da célula doadora de núcleo com o citoplasto foi
realizado por eletrofusão em solução de mannitol (0,28M) utilizando-se eletrofusor
da Eppendorf. Oócitos reconstituídos foram ativados em protocolo padrão de
ionomicina (5µM / 5min) e cicloheximide (10µg/mL / 4h). Após o cultivo in vitro, no
sétimo dia de desenvolvimento, foram inovulados para receptoras previamente
sincronizadas, embriões no estádio de blastocisto. As gestações foram
monitoradas em intervalos de 30 dias através de ultra-sonografia e palpação
transretal até o momento do parto.
42
5.2. Obtenção das Amostras de Placenta
Imediatamente após o parto (cesariana), placentônios foram colhidos em
condições assépticas (fragmentos de aproximadamente 1cm3), preservando-se a
interface materno-fetal, depositados em criotubos e submersos em nitrogênio
líquido, sendo posteriormente estocados a -80ºC, onde permaneceram até a
extração de RNA.
Para avaliação da expressão dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19, foram
utilizadas amostras de 15 clones e de 3 animais concebidos por monta natural,
sendo estes últimos usados como grupo controle.
5.3. Extração de RNA e Transcrição Reversa (RT-PCR)
A extração de RNA das amostras de placentônios do grupo clonado e do
grupo controle (monta natural) foram desenvolvidas a partir do método fenol-
clorofórmio, utilizando-se o reagente Trizol® (Invitrogen, EUA), seguindo as
recomendações do fabricante: imersão da amostra em nitrogênio líquido,
pulverização com pistilo, homogeneização com 1mL de Trizol, centrifugação a
12.000xg por 10min a 4ºC, nova centrifugação após acréscimo de 0,2mL de
clorofórmio, remoção da fase aquosa superior do gradiente formado, precipitação
em 0,5mL de álcool isopropílico, lavagem em etanol 75% e ressuspensão em
50µL de água tratada com DEPC.
Após a extração de RNA, procedeu-se a síntese de DNA complementar
(cDNA) por transcrição reversa (RT-PCR), utilizando-se alíquota de 3µg de RNA
total em reação de 20µL contendo tampão 1X RT (Invitrogen), oligo(dT) (5mmol/L),
dNTPs (1,25mmol/L cada), RNAse OUT (40UI – Invitrogen) e Superscript II (200UI
- Invitrogen). A reação foi realizada a 42ºC por 50min, seguido por desnaturação a
70ºC por 15min, sendo as amostras de cDNA armazenadas a -20ºC.
5.4. Avaliação dos Genes “Imprinted” pela PCR em Tempo Real
Para avaliação da expressão dos genes imprinted H19, Igf2 e Igf2r, foram
realizadas análises de quantificação relativa de expressão gênica através de PCR
43
em tempo real utilizando o sistema de detecção ABI Prism® 7500 e tecnologia
SYBRTM Green (Applied Biosystems®), molécula fluorescente empregado nos kits
de amplificação que emitem sinal de fluorescência ao intercalar com DNA dupla-
fita. O corante ROX foi usado como referência passiva do equipamento.
Uma vez que a quantificação relativa baseia-se na freqüência relativa dos
transcritos do gene alvo em comparação com um gene de expressão constitutiva,
foi utilizado o gene GAPDH (“glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase”) como
controle endógeno para normalização dos dados. Para amplificação dos genes,
foram empregados os seguintes “primers” ou seqüência de oligonucleotídeos
iniciadores (5’ • 3’):
• GAPDH: 118 pares de base (Genbank: AB098979)
♣ GCGTGAACCACGAGAAGTATAA
♣ CCCTCCACGATGCCAAAGT
• Igf2: 323 pares de base (YASEEN et al., 2001; Genbank: X53553)
♣ CTTCAGCCGACCATCCAGCCGCATAAAC
♣ TCAGCGGACGGTGACTCTTGGCCTCTCT
• Igf2r: 293 pares de base (YASEEN et al., 2001; Genbank: JO3527)
♣ CGCCTACAGCGAGAAGGGGTTAGTC
♣ AGAAAAGCGTGCACGTGCGCTTGTC
• H19: 156 pares de base (Genbank: AY849926)
♣ GACACCCAGAACCCTCAAGA
♣ CCTTCCAGAGCTCATTCCTG
Para avaliar a especificidade da amplificação com os “primers” acima
descritos, foi utilizado cDNA de placentônio de um dos animais clonados para a
PCR em tempo real, analisando-se a Curva de Dissociação. A PCR em tempo real
foi realizada em volume de 20µL para cada gene, sendo que a composição final
dos reagentes está descrita conforme a Tabela 1.
44
Tabela 1: Componentes utilizados para a PCR em tempo real para avaliação da especificidade daamplificação dos “primers” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.
GAPDH Igf2 Igf2r H19Água 4,0µL 4,2µL 3,0µL 4,0µLMaster Mix 10,0µL 10,0µL 10,0µL 10,0µL“Primer” F 0,5µL
(0,25µM)0,4µL
(0,20µM)1,0µL
(0,50µM)0,5µL
(0,25µM)“Primer” R 0,5µL
(0,25µM)0,4µL
(0,20µM)1,0µL (0,50µM) 0,5µL
(0,25µM)cDNA 5,0µL
(535ng)5,0µL
(535ng)5,0µL
(535ng)5,0µL
(535ng)Total 20,0µL 20,0µL 20,0µL 20,0µL
As condições de amplificação empregadas na PCR em tempo real foram: 1
ciclo inicial de 2min a 50°C (etapa 1), 1 ciclo de 10min a 95°C (etapa 2), seguido
de 45 ciclos de 30seg a 95°C (desnaturação) e 1min a 60°C (anelamento e
extensão) (etapa 3). Os valores de emissão de fluorescência foram determinados
ao término de cada ciclo. A Curva de Dissociação foi realizada após o último ciclo
de amplificação normal: 15seg a 95°C, 1min a 60°C e 15seg a 95°C (etapa 4). A
Curva de Dissociação de cada um dos genes está apresentada na Figura 1.
Com o aumento gradual de temperatura de 60°C para 95°C, verificou-se
que a emissão da fluorescência do SYBRTM Green diminuiu em um único
momento, com a desnaturação dos produtos da PCR em tempo real ocorrendo
quando atingiu uma temperatura específica para cada um dos genes, não
havendo, portanto, amplificação inespecífica. Tal afirmativa pôde ser comprovada
submetendo-se os produtos da PCR a eletroforese em gel de agarose (1,2%)
corado com brometo de etídio (Figura 2).
Após a confirmação de que os “primers” eram específicos para amplificação
dos transcritos dos genes de interesse, procedeu-se a determinação da
concentração de cDNA para a reação, avaliando-se a eficiência da amplificação
utilizando-se diferentes diluições de cDNA (curva padrão). Foram feitas cinco
diluições seriadas para cada gene, partindo de uma concentração inicial de cDNA
de 270ng/ì L (mis tura de cDNA de 3 clones): 1:1 (270ng), 1:2 (135ng), 1:4
(67,5ng), 1:8 (33,75ng) e 1:16 (16,875ng).
45
GAPDH Igf2
Igf2r H19
Figura 1: Curva de Dissociação para avaliação da especificidade da amplificação dos “primers”dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.
Após a PCR em tempo real (mesmas condições da reação anterior),
estabeleceu-se uma curva padrão para cada um dos genes com base nos Cts
(“threshold cycle”: ponto de cruzamento na curva de amplificação que atravessa a
linha arbitrária na fase exponencial ou “threshold”, onde todas as amostras
possuem a mesma intensidade fluorescente/mesma quantidade de produto de
PCR). Com base na análise da curva padrão (Figura 3) e da curva de dissociação
dos genes, definiu-se a concentração de 40ng/ì L para as reações.
46
350 bp
125 bp
GAPDH Igf2 Igf2r H19 25bp
350 bp
125 bp
GAPDH Igf2 Igf2r H19 25bp
Figura 2: Avaliação de amplificação específica de um único produto da PCR em tempo real dosgenes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19 (eletroforese em gel de agarose a 1,2% corado combrometo de etidio).
Para a análise de quantificação relativa dos transcritos dos genes Igf2, Igf2r
e H19 nos placentônios dos clones e dos animais controle, quantificou-se
inicialmente o cDNA de todas as amostras em Biofotômetro (Eppendorf),
ajustando-se a concentração final para 40ng/ì L . A compos ição final da reação
está descrita na Tabela 2. Cada amostra analisada foi conduzida em duplicata,
seguindo as mesmas condições da reação anterior: 1 ciclo inicial de 2min a 50°C ,
1 ciclo de 10min a 95°C, seguido de 45 ciclos de 30seg a 95°C (desnaturação) e
1min a 60°C (anelamento e extensão) (etapa 3). O nível de expressão relativa
para cada gene foi calculado baseado na expressão de um calibrador, no caso
amostra do animal controle N3, que foi usado em todas as placas.
47
GAPDH Ifg2r Ifg2 H19GAPDH Ifg2r Ifg2 H19GAPDH Ifg2r Ifg2 H19
Figura 3: Curva padrão correspondente aos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19 em diferentes
diluições.
Tabela 2: Componentes utilizados para a PCR em tempo real para avaliação da expressão dosgenes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.
GAPDH Igf2 Igf2r H19Água 6,6µL 6,6µL 6,6µL 6,6µLMaster Mix 10,0µL 10,0µL 10,0µL 10,0µL“Primer” F 1,2µL
(0,60µM)1,2µL
(0,20µM)1,2µL
(0,50µM)1,2µL
(0,25µM)“Primer” R 1,2µL
(0,60µM)1,2µL
(0,20µM)1,2µL
(0,50µM)1,2µL
(0,25µM)cDNA 1,0µL
(40ng/µL)1,0µL
(40ng/µL)1,0µL
(40ng/µL)1,0µL
(40ng/µL)Total 20,0µL 20,0µL 20,0µL 20,0µL
48
Figura 4: Exemplo da determinação da eficiência das reações de PCR em tempo real para ogene GAPDH, utilizando o programa LinRegPCR: determinação dos limites superior einferior (a), presença mínima de 4 pontos na curva de regressão (b) e alta correlação(r2) das amostras (c).
Tabela 3: Eficiência média da reação, desvio padrão, limites inferior e superior e determinação do“threshold” dos genes GAPDH, Igf2, Igf2r e H19.
GAPDH Igf2 Igf2r H19eficiência média da reação 0,93 0,825 0,719 1,0desvio padrão da eficiência 0,055 0,045 0,053 0,056limite inferior 0,020 0,020 0,020 0,010limite superior 0,590 0,300 0,780 0,490“threshold” 0,305 0,160 0,400 0,250
(a)
(limite inferior)
(limite superior)
(b)
(c)
49
50
Ao término das reações, com base nos valores detectados de fluorescência
de cada ciclo das amostras analisadas para cada gene, determinou-se a eficiência
média da reação de cada amostra utilizando-se o programa LinRegPCR –
Analysis of Real Time PCR Data, versão 7.5 (RAMARKERS et al., 2003),
estabelecendo-se limites inferior e superior (“janela de linearidade”) em que as
amostras estejam em fase logarítmica, mínimo de 4 pontos incluídos na regressão
e alta correlação (Figura 4). A partir dos dados da eficiência da reação de cada
uma das amostras, calculou-se a média da eficiência da PCR para cada gene bem
como a “threshold”, pela média do limite inferior e superior (Tabela 3).
Com base na eficiência média da reação para cada gene e da “threshold”,
determinou-se os valores dos Cts de cada amostra em cada ciclo no programa
“7500 System SDS Software”. A quantificação final da expressão relativa dos
genes de interesse foi realizada utilizando-se a de comparação dos Cts de acordo
com a eficiência da reação, conforme descrito por PFAFFL e colaboradores
(2001). Os cálculos foram realizados pelo método REST© - “Relative Expression
Software Tool” (Pfaffl et al., 2002), baseado na razão da expressão do gene alvo
(Igf2, Igf2r e H19) e do gene controle endógeno (GAPDH), com normalização dos
dados realizada com os transcritos do gene GAPDH, de acordo com a seguinte
fórmula:
Razão de expressão = )(
)(
amostracontroleCtref
amostracontroleCtalvo
ref
alvo
EE
−∆
−∆
,
onde: E = eficiência da reação;
Ct = ciclo em que cada curva de amplificação passa pelo “threshold”,
servindo como base para comparação entre as amostras;
Ä = diferença entre amostra versus controle.
5.5. Análise Estatística
A expressão relativa dos genes de interesse Igf2, Ifg2r e H19, bem como do
controle endógeno GAPDH foram comparadas utilizando-se um teste não
paramétrico de modo pareado fixo de relocação ao acaso (“Pair Wise Fixed
51
Reallocation Randomisation Test®”), descrito por PFAFFL e colaboradores (2002),
considerando-se p<0,05 como nível de significância.
52
VI. RESULTADOS
As taxas de nascimentos de clones, eficiência da técnica e de mortalidade
pós-nascimento, obtidas das cinco linhas celulares empregadas como fonte
doadora de núcleo, assim como os dados dos clones (identificação, origem da
linha celular, sexo, peso ao nascimento e sobrevivência neonatal), estão
apresentados nas Tabela 4 e 5, respectivamente. Com base nas diferenças de
peso ao nascimento, bem como das variações encontradas nos resultados de
sobrevivência neonatal de acordo com o sexo (eficiência da técnica foi 123%
superior na clonagem de machos do que em clones fêmeas), além da análise
individual de cada clone bem como de todo grupo clonado em comparação ao
grupo controle concebido por monta natural (Tabela 6), avaliou-se também a
influência do sexo (macho ou fêmea), da sobrevivência neonatal (morto ou vivo) e
do peso ao nascimento (maior ou menor que 40kg).
Tabela 4: Taxas de estabelecimento de gestação (30d), mortalidade embrionária (30-60d),abortos (60d-nascimento), nascimentos, mortalidade pós-nascimentos e eficiência datécnica de clonagem por transferência nuclear para cada uma das linhas celularesutilizadas como fonte doadora de núcleo (*).
ID do animalgestação
30dM.E.
30-60dabortos 60d-
nc/onasci-mentos morta/e
pós-nc/oEficiênciaclonagem
linha 2 F 33,3% 71,4% 75,0% 02,4% 00,0% 2,4%linha 3 M 21,9% 00,0% 14,3% 18,8% 50,0% 9,4%linha 4 M 38,2% 61,5% 60,0% 05,9% 00,0% 5,9%linha 5 F 26,4% 21,4% 45,5% 11,3% 66,7% 3,8%linha 6 F 18,0% 11,1% 62,5% 06,0% 33,3% 4,0%média 27,0% 38,6% 48,6% 08,5% 44,4% 4,7%
Linhas F 25,5% 25,5% 37,8% 06,9% 50,0% 3,4%linhas M 30,3% 30,3% 40,0% 12,1% 37,5% 7,6%
ID = identificação; F = fêmea; M = macho; M.E. =mortalidade embrionária; nc/o = nascimento;morta/e = mortalidade.(*) dados gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP/Pirassununga-SP).
Avaliando-se a expressão relativa dos transcritos dos genes “imprinted” nas
placentas dos clones em comparação ao grupo controle concebido por monta
natural (Figura 5), verificou-se diferença significativa nos valores encontrados para
53
os genes Igf2 e H19. As placentas de animais clonados apresentaram redução na
expressão relativa de 41,5% para o H19 (P<0,03) e de 42,9% para o Igf2 (P<0,05),
quando comparada ao grupo controle. Não houve diferença (P>0,05) com relação
à expressão de Igf2r, que se mostrou similar entre o grupo clonado e o grupo de
monta natural.
Tabela 5: Dados dos clones bovinos nascidos vivos: identificação, sobrevivência neonatal, sexo epeso ao nascimento (kg) (*).
linha celular Identificação doclone
sobrevivêncianeonatal
sexo peso ao nascimento(kg)
linha celular 2 2.1 vivo fêmea 42,0linha celular 3 3.1 morto macho 51,0linha celular 3 3.3 vivo macho 37,0linha celular 3 3.4 morto macho 14,0linha celular 3 3.5 morto macho 56,0linha celular 3 3.6 vivo macho 37,0linha celular 4 4.1 vivo macho 57,0linha celular 6 6.1 morto fêmea 62,0linha celular 6 6.3 morto fêmea 29,2linha celular 6 6.4 morto fêmea 51,0linha celular 6 6.5 vivo fêmea 43,0linha celular 6 6.6 vivo fêmea 48,5linha celular 7 7.1 vivo fêmea 39,0linha celular 7 7.2 morto fêmea 37,0linha celular 7 7.3 vivo fêmea 50,0
(*) dados gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP/Pirassununga-SP).
Tabela 6: Dados dos neonatos bovinos do grupo controle concebidos por monta natural:identificação, sexo e peso ao nascimento (kg) (*).
Identificação do clone sexo peso ao nascimento (kg)N2 macho 40,0N3 fêmea 36,0N4 fêmea 35,2
(*) dados gentilmente cedidos pelo Prof. Dr. Flávio Vieira Meirelles (USP/Pirassununga-SP).
54
0,7560,571 0,585
0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone
**
0,7560,571 0,585
0,00,20,40,60,81,01,21,41,61,8
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone
**
Figura 5: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones em comparaçãoa placentas de animais de monta natural (controle). (*, p<0,05).
Uma vez que acredita-se que o H19 regule a expressão de Igf2 em
camundongos e humanos, determinou-se a correlação entre a expressão destes
dois genes, além do Igf2r (Correlação de Pearson). A expressão de Igf2 e de H19
apresentou uma correlação positiva de 0,96 (P<0,001). No entanto, não foi
possível estabelecer uma correlação significativa entre as expressões relativas de
Igf2r-H19 (0,63) bem como de Igf2r-Igf2 (0,62).
Quando separou-se o grupo clonado por sexo (placenta de clones machos
e fêmeas), verificou-se diferença significativa na expressão dos genes Igf2 e H19
nas placentas de clones fêmeas em comparação com o grupo controle por monta
natural (Figura 6). Houve uma diminuição da expressão relativa de 64,6% para o
H19 e de 56,5% para o Ifg2 nas placentas de clones fêmeas. Não houve diferença
para os valores de expressão relativa de Igf2r (P>0,05). De modo interessante,
quando comparou-se a expressão relativa dos genes “imprinted” nas placentas de
clones machos em relação ao controle por monta natural, a diferença significativa
verificada nas placentas de clones fêmeas não foi detectada no caso dos machos,
nem para o gene Ifg2 bem como para o gene H19 (P>0,05; Figura 7).
Comparando-se os grupos clonados entre si separados por sexo (Figura 8), o
gene H19 mostrou-se cerca de 3,6 vezes mais expresso nas placentas de clones
machos em relação à placenta de clones fêmeas (P<0,05). Esta diminuição
significativa na expressão do gene H19 nas fêmeas clonadas (72,6%) em relação
55
aos clones machos não foi verificada para os genes Igf2 e Igf2r (P>0,05). Esta
diferença com relação à expressão do gene H19 entre os grupos clonados macho
e fêmea foi detectada na avaliação individual da expressão relativa de cada clone
em comparação com o grupo controle por monta natural. Das nove fêmeas
clonadas analisadas, nada menos que oito placentas (88,9%) apresentaram
diminuição significativa para a expressão do H19. Em todas estas oito fêmeas, o
gene H19 manteve-se sempre pelo menos 3 vezes menos expresso nas placentas
destes animais em relação ao grupo controle. Apenas uma fêmea clonada (clone
2.1) não teve alteração em relação à expressão dos genes “imprinted” (P>0,05).
Já na análise individual dos clones machos em relação ao grupo controle,
não houve diminuição significativa da expressão gênica relativa para o H19 em
nenhum caso, pelo contrário. Das seis placentas de clones machos analisadas,
em dois animais (clones 3.3 e 3.5) houve aumento significativo da expressão do
gene H19.
Na análise realizada em que o grupo de clones são separados de acordo
com a sobrevivência neonatal, não houve alteração na expressão dos genes
“imprinted” Igf2, Igf2r e H19 tanto no grupo de clones vivos (Figura 9) bem como
no grupo de clones mortos (Figura 10) em comparação ao grupo controle por
monta natural (p>0,05). Do mesmo modo, não foi detectada variação significativa
na expressão relativa dos mesmos genes entre os grupos de clones vivos (8
animais, sendo 3 machos e 5 fêmeas) em comparação ao grupo de clones mortos
(7 animais, sendo 3 machos e 4 fêmeas), como mostra a Figura 11.
Tomando-se como referência o peso ao nascimento dos clones, verificou-se
que nos clones nascidos com menos de 40kg (6 clones, sendo 3 machos e 3
fêmeas), nenhuma alteração na expressão dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19
(P>0,05) foi detectada na placenta destes clones em comparação a placenta dos
animais do grupo controle por monta natural (Figura 12). Já no caso dos clones
com peso ao nascimento superior a 40kg (9 clones, sendo 3 machos e 6 fêmeas),
a análise da expressão relativa dos genes “imprinted” de interesse em
comparação ao grupo controle mostrou uma diminuição significativa para os genes
56
Igf2 e H19 (Figura 13), sendo, respectivamente, de 40,1% e 36,3%. Não houve
diferença com relação à expressão do gene Igf2r (P>0,05). Quando comparou-se
a expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 entre o grupo de clones com peso
inferior e superior a 40kg, não foi possível detectar nenhuma alteração significativa
com relação à expressão destes genes “imprinted” (Figura 14).
57
0,699
0,435 0,354
0,00,20,4
0,60,81,01,21,4
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
**
monta natural (controle) x clone fêmea
0,699
0,435 0,354
0,00,20,4
0,60,81,01,21,4
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
**
monta natural (controle) x clone fêmea
Figura 6: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones fêmeas emcomparação a placentas de animais de monta natural (controle). (*, p<0,05).
0,8210,8791,292
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone macho
0,8210,8791,292
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone macho
Figura 7: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones machos emcomparação a placentas de animais de monta natural (controle).
0,850
0,4950,274
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
clone macho (controle) x clone fêmea
*
0,850
0,4950,274
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
clone macho (controle) x clone fêmea
*
Figura 8: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones fêmeas emcomparação a placentas de clones machos (controle). (*, p<0,05).
58
Figura 9: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones vivos emcomparação a placentas de animais de monta natural (controle).
Figura 10: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones mortos emcomparação a placentas de animais de monta natural (controle).
Figura 11: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones vivos emcomparação a placentas de clones mortos (controle).
0,6880,583 0,600
0,00,20,40,60,81,01,21,41,6
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone vivo
0,8250,559 0,571
0,0
0,5
1,0
1,5
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone morto
1,1190,959 0,952
0,00,51,01,52,02,53,03,54,0
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
clone vivo (controle) x clone morto
59
Figura 12: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones nascidos compeso < 40kg em comparação a placentas de animais de monta natural (controle).
Figura 13: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones nascidos compeso > 40kg em comparação a placentas de animais de monta natural (controle).(*, p<0,05).
Figura 14: Expressão relativa dos genes Igf2, Igf2r e H19 nas placentas de clones nascidos compeso > 40kg em comparação a placentas clones nascidos com peso < 40kg (controle).
0,861
0,582 0,510
0,00,20,4
0,60,81,01,21,4
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone < 40kg
0,8321,0291,250
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
clone < 40kg (controle) x clone > 40kg
0,6370,599 0,716
0,0
0,5
1,0
1,5
Igf2 Igf2r H19
Fato
r de
Exp
ress
ão
monta natural (controle) x clone > 40 kg
**
60
VII. DISCUSSÃO
Contrastando com o grande interesse e as intensas pesquisas realizadas
no uso da técnica de transferência nuclear para a produção de clones a partir de
células somáticas adultas, os resultados da clonagem ainda são extremamente
ineficientes (SOLTER, 2000; WESTHUSIN et al., 2001, THIBAULT et al., 2003;
CAMPBELL et al., 2005). Altas taxas de perdas durante toda a gestação e mesmo
após o nascimento têm sido observadas em diversas espécies clonadas devido a
anormalidades fetais e placentárias (HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-PALMER
et al., 2004; WELLS et al., 2004), indicativo de falhas no processo de
reprogramação nuclear. Os genes “imprinted”, caracterizados por apresentarem
um padrão de expressão gênico diferenciado de seus alelos parentais, devem
também ser corretamente reprogramados, pois estes mesmos genes exercem
função essencial na regulação do crescimento e desenvolvimento do feto, bem
como da placenta (REIK et al., 2003).
Em nosso estudo, avaliamos o padrão de expressão dos genes “imprinted”
Igf2, Igf2r e H19 na placenta de clones nascidos a termo em comparação à
placenta de animais controle produzidos por monta natural, uma vez que a
estrutura placentária tem grande importância no que diz respeito ao processo de
implantação, estabelecimento de uma interface para troca de nutrientes e gases
entre a circulação materna e fetal, início do reconhecimento materno da gestação,
alteração imunológica do ambiente uterino bem como em funções metabólicas
através de produção de hormônios endócrinos e fatores parácrinos (CROSS,
2006). Além disso, distúrbios placentários na gestação de clones têm sido
frequentemente relatados, como hipovascularização (cório-alantóide), redução do
número de cotilédones, hidroalantóide, edemaciação das membranas placentárias
e hipertrofia dos placentomas (HILL et al., 1999; De SOUSA et al., 2001;
HASHIZUME et al., 2002; HEYMAN et al., 2002a).
61
Na avaliação do gene “imprinted” Igf2r, caracterizado por apresentar
“imprint” do alelo paterno e expressão do alelo materno, e que atua inibindo o
crescimento fetal mediante seqüestro de Igf2 para o interior de lisossomos, onde é
degradado (MURPHY & JIRTLE, 2003; JOHN & SURANI, 2000), verificou-se que
não houve alteração em seu padrão de expressão, detectado na placenta de
clones nascidos, em comparação à placenta de animais do grupo controle. Em
estudos anteriores realizados em camundongos, o padrão de expressão do gene
“imprinted” Igf2r na placenta de clones apresentou-se de modo semelhante ao
controle, utilizando-se como fonte doadora de núcleo, tanto células somáticas
(INOUE et al., 2002), como células tronco embrionárias - “ES cells” (HUMPHERYS
et al., 2002), corroborando com nossos resultados. Na espécie bovina, até o
momento, não há relatos da descrição deste gene na placenta de clones nascidos.
Em estudo recente realizado por YANG e colaboradores (2005), não houve
alteração dos níveis de expressão do gene “imprinted” IGF2r em tecidos coletados
pós-mortem de neonatos bovinos clonados com células somáticas em
comparação ao grupo de recém-nascidos controle.
Importante fator de crescimento fetal (De CHIARA et al., 1999;
EFSTRATIADIS, 1998) e desenvolvimento placentário (CONSTANCIA et al.,
2002), o gene “imprinted” Igf2 (“imprint” do alelo materno e expressão do alelo
paterno; CURCHOE et al., 2005) mostrou-se sub-expresso na placenta dos clones
neonatos quando comparado ao grupo por monta natural. Diminuição dos níveis
de RNAm de Igf2 também já foram detectados na placenta de camundongos
clonados a partir de células tronco embrionárias (OGAWA et al., 2003). Já em
placenta de clones murinos reconstituídos com células somáticas, não houve
diferença nos níveis de expressão deste mesmo gene em comparação com grupo
controle reproduzido naturalmente (INOUE et al., 2002). Embora não haja relato
do estudo deste gene na placenta de neonatos bovinos clonados, a análise de
tecidos de clones recém-nascidos e mortos logo após o nascimento nesta espécie
revelam que os padrões de expressão do gene “imprinted” Igf2 encontravam-se
significativamente mais elevados do que nos bezerros controles (YANG et al.,
62
2005). Em clones murinos, os dados são conflitantes em estudos envolvendo o
Igf2: alguns animais clonados com células tronco embrionárias apresentando
aumento dos níveis de expressão (HUMPHERYS et al., 2001), redução em fetos
reconstituídos com estas mesmas células (OGAWA et al., 2003) e sem alteração
dos padrões de expressão em clones reconstituídos com células somáticas
(INOUE et al., 2002). A alta variação verificada tanto na placenta como nos fetos e
clones murinos produzidos a partir de células tronco embrionárias pode estar
ligada à maior instabilidade epigenética destas células doadoras de núcleo
(HUMPHERYS et al., 2001). Em ovinos nascidos clonados com células somáticas,
não foi detectada diferença para expressão deste gene “imprinted”.
O gene “imprinted” H19, expresso alelo materno e “imprint” do alelo paterno
(ZHANG et al., 2004), apresentou diminuição significativa dos níveis de expressão
na placenta dos clones em relação ao grupo controle. Assim como no caso do
gene “imprinted” Igf2, verifica-se uma alta variação em estudos realizados em
placentas e animais clonados a termo. Em clones murinos reconstituídos com
células tronco embrionárias, observou-se diminuição dos valores de expressão do
H19 tanto na placenta como em fetos (OGAWA et al., 2003). Em outro relato em
camundongos utilizando esta mesma fonte doadora de núcleo, alguns clones
apresentaram expressão anormal (diminuição da expressão na detecção em
fígado), sendo o gene “imprinted” H19 até mesmo “silenciado” em alguns casos
(HUMPHERYS et al., 2001). Na clonagem com células somáticas, não houve
diferença em relação aos valores encontrados na placenta de clones murinos em
comparação ao controle (INOUE et al., 2002). Em estudos realizados em clones
bovinos nascidos com mortalidade neonatal, metade dos animais apresentou
aumento significativo do padrão de expressão do H19 (YANG et al., 2005), bem
como expressão bialélica deste mesmo gene já foi relatada (ZHANG et al., 2004).
Em ovinos, no entanto, a avaliação em tecidos de animais clonados produzidos a
termo a partir de células somáticas não revelou alteração no nível de expressão
do gene “imprinted” H19 (YOUNG et al., 2003).
63
Esta alta variação dos resultados em estudos realizados para avaliação dos
genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19 na placenta e animais clonados a termo, indica
a ocorrência de uma incompleta reprogramação gênica. Diferentes tipos de linhas
celulares utilizadas como fonte doadora de núcleo podem ter reflexo sobre a
reprogramação nuclear (RIDEOUT III et al., 2003; ECKARDT et al., 2004), com
sensíveis alterações dos padrões de expressão gênica ocorrendo mesmo em
neonatos vivos após o nascimento bem como em seus anexos placentários, de
acordo com a estabilidade genética e epigenética da célula doadora
(HUMPHERYS et al., 2001). Além da influência do núcleo doador, existem
divergências nos resultados em diferentes espécies clonadas. Em nosso estudo,
observou-se diminuição dos valores de expressão detectados na placenta de
neonatos clones bovinos, para os genes “imprinted” H19 e Igf2, não sendo
detectada tal sub-expressão destes mesmos genes na placenta de clones murinos
igualmente reconstituído com células somáticas (INOUE et al., 2002), o que indica
que diferenças espécies específicas devam existir, já que o processo de
placentação também difere entre bovinos e camundongos.
Em humanos e camundongos, o gene “imprinted” H19 contém elementos
que controlam a regulação do gene Igf2 (WUTZ et al., 1997; YOUNG et al., 2003).
Em bovinos, embora se saiba que o gene H19 também apresenta-se ligado
próximo ao gene Igf2 (LARKIN et al., 2003), ainda não foi estabelecido o
mecanismo de controle entre estes dois genes “imprinted” nesta espécie. Uma
correlação negativa é verificada entre o H19 e o Igf2 em camundongos na
reprodução natural (LI et al., 1993). Em clones murinos reconstituídos com células
tronco embrionárias, esta mesma relação negativa foi detectada na maioria dos
animais, mas não em todos (indicativo de variação individual da reprogramação
nuclear), com aumento da expressão relativa do Igf2 e sub-expressão do gene
H19 (HUMPHERYS et al., 2001). Em nosso estudo, foi possível estabelecer uma
correlação entre os genes Igf2 e H19, mas ambos apresentaram-se sub-expressos
na placenta de clones nascidos em comparação ao valores encontrados na
placenta de animais controle produzidos por monta natural. Uma correlação
64
positiva foi estabelecida também em animais clonados produzidos a termo, mas
com aumento dos padrões de expressão do Igf2 e H19 (YANG et al., 2005). Estes
resultados da correlação positiva entre estes dois genes, verificados tanto na
placenta de clones como nos neonatos produzidos por transferência nuclear com
células somáticas na espécie bovina, sugerem que, possivelmente, exista
diferença no mecanismo de regulação do gene “imprinted” Igf2, não sendo
regulado apenas pelo H19, mas provavelmente por outros fatores, já que a
diminuição do H19 não leva a um aumento dos valores de Igf2, como ocorre nos
modelos de regulação Igf2-H19 existente em camundongos (BELL &
FELSENFELD, 2000; HARK et al., 2000).
Em análise realizada separando-se o grupo de clones de acordo com o
sexo, notada diferença foi verificada na placenta de fêmeas em relação à de
machos. Assim como em todos as análises feitas nos diferentes sub-grupos de
placentas de clones, o gene “imprinted” Igf2r não mostrou alteração em seu
padrão de expressão. No entanto, avaliando-se os genes H19 e Igf2, uma
significativa diminuição foi verificada na placenta de clones fêmeas em relação ao
grupo controle, o que não foi observado no caso da placenta de clones machos. O
gene “imprinted” H19 apresentou-se pelo menos três vezes menos expresso na
placenta de clones fêmeas em comparação à de machos. Embora diferenças
entre gestações de machos e fêmeas já tenham sido verificadas, com maior média
de período de gestação para machos Nelore do que fêmeas (ROCHA et al., 2005),
bem como recente estudo mostrou que a expressão de alguns genes ocorre
diferencialmente na placenta, em humanos, em gestações com sexos diferentes
(SOOD et al., 2006), a avaliação do grupo controle por monta natural não mostrou
diferença significativa nos valores de expressão destes genes “imprinted” quando
separados por sexo, o que mostra que esta diferença não ocorre na placenta de
bovinos em gestações normais. Esta variação verificada especificamente no caso
do gene “imprinted” H19 na placenta de clones fêmeas, sub-expressa em relação
aos valores detectados na placenta de clones machos, indica que fatores ligados
ao sexo podem influenciar a reprogramação nuclear. Entretanto, as razões para
65
esta diferença ainda não são claras, em virtude do desconhecimento dos
mecanismos envolvidos na regulação deste gene “imprinted” em bovinos bem
como dos eventos controladores da reprogramação do núcleo.
Mesmo sendo possível a produção de clones nascidos, verifica-se ainda
uma alta mortalidade de neonatos logo após o nascimento (HEYMAN et al.,
2002a; CHAVATTE-PALMER et al., 2004; WELLS et al., 2004). Das 15 placentas
analisadas neste trabalho de clones produzidos a termo, houve uma taxa de
46,6% de mortalidade neonatal. Entretanto, nenhuma alteração significativa no
que diz respeito aos padrões de expressão dos genes “imprinted” Igf2r, Igf2 e H19
foi detectada na análise separando-se o grupo de placentas de clones de acordo
com a sobrevivência dos animais, tanto para clones vivos como para mortos. As
altas taxas de mortalidade pós-nascimento (HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-
PALMER et al., 2004) devem ser resultado de problemas na reprogramação de
diversos genes, “imprinted” e não-“imprinted”, que se refletem em diversas
anomalias descritas tanto na placenta como nos neonatos clonados (HILL et al.,
1999, 2000; JONES et al., 2001; HEYMAN et al., 2002a; CHAVATTE-PALMER et
al., 2004).
A diferença verificada na expressão dos genes “imprinted” H19 e IgfF2, com
diminuição do padrão de expressão de ambos os genes na placenta de neonatos
clones, em nosso trabalho, comparado ao aumento do Igf2 e H19 em clones
bovinos nascidos (YANG et al., 2005), indicam possível diferença no mecanismo
de reprogramação nuclear de acordo com o tipo celular (células da placenta e do
concepto/neonato), já que um comportamento oposto destes genes é observado
na placenta e nos neonatos (tecidos coletados pós-mortem). As alterações e
patologias, verificadas em necrópsias de neonatos clones, podem ser agravadas
devido aos problemas placentários, e consequentemente, promover maior
comprometimento da regulação gênica bem como da reprogramação nuclear no
feto. Isto torna-se mais evidente à medida que em clones quimeras, onde
blastômeros tetraplóides foram misturados a embriões reconstituídos, com a
66
contribuição das células tetraplóides na formação do trofoblasto, houve uma
melhora das taxas de gestação bem como da condição de alguns clones, tanto em
estudos em camundongos (EGGAN et al., 2001) como em bovinos (IWASAKI et
al., 2000).
Na avaliação das placentas de clones separados por peso ao nascimento,
não foi possível detectar diferenças entre os padrões de expressão dos genes
“imprinted” Igf2r, Igf2 e H19. Comparando-os com o grupo controle, houve
diminuição da expressão do gene Igf2 e H19 em ambas as faixas de peso, sendo
significativo, porém, apenas no grupo em que os clones pesavam acima de 40kg.
Esta diminuição da expressão do gene Igf2 na placenta de animais mais pesados
não deve estar correlacionada com o peso do neonato, já que haveria menor
quantidade de Igf2, que é um dos principais fatores de crescimento fetal (De
CHIARA et al., 1999; EFSTRATIADIS, 1998). Talvez o Igf2 produzido na placenta
possa ter um efeito mais parácrino, localizado, do que sobre o feto propriamente
dito, já que o mesmo atua também regulando o crescimento e o desenvolvimento
placentário (CONSTANCIA et al., 2002) Esta diminuição do Igf2 na placenta dos
clones poderia resultar em distúrbios placentários, como hipovascularização da
placenta, diminuição do número de placentomas bem como desenvolvimento
rudimentar de alguns anexos placentários. Os problemas fetais devem ser
resultado da reprogramação nuclear incompleta das células que compõem o feto,
de genes importantes no crescimento e desenvolvimento, bem como devem ser
influenciados pelos problemas detectados na placenta, os quais, por não serem os
ideais, comparado a uma gestação normal, podem agravar ou prejudicar ainda
mais o processo envolvido na regulação da expressão gênica e reprogramação do
núcleo no feto, resultado de uma troca ineficiente de metabólitos e fluídos entre o
concepto e a mãe.
Problemas associados com aumento do peso ao nascimento fazem parte
da “Síndrome da Cria Gigante” (LOS – “Large Offspring Syndrome”, YOUNG et al.,
1998). Em ovinos produzidos por fertilização in vitro que apresentavam LOS, foi
67
verificado uma redução da expressão do Igf2r em diversos órgãos (YOUNG et al.,
2001), mas não do Igf2, e esta diminuição do Igf2r diminuiria seu efeito inibitório
de crescimento fetal, contribuindo para o aumento do peso ao nascimento. Em
bovinos clonados recém-nascidos que apresentavam sintomatologia semelhante à
LOS, houve um aumento da expressão do Igf2, mas não do Igf2r (YANG et al.,
2005). Em nosso estudo, embora alguns animais clones tenham morrido
apresentando alguns sinais semelhantes àqueles descritos na LOS, não houve
alteração para o gene “imprinted” Igf2r na placenta. Estes resultados indicam que
a LOS deve ocorrer em decorrência da alteração de diversos genes de modo
complexo, não podendo-se atribuir tal síndrome a desregulação de apenas poucos
genes.
Nossos resultados confirmam a hipótese de que mesmo em clones viáveis
bovinos nascidos a termo, uma reprogramação nuclear incompleta ocorre na
placenta destes animais clonados com células somáticas. Uma significativa
alteração no padrão de expressão foi verificada em genes “imprinted” importantes
no crescimento e desenvolvimento placentário e fetal, com sub-expressão dos
genes Igf2 e H19 na placenta dos clones neonatos, o que pode contribuir para
aumento da mortalidade pós-natal devido a distúrbios placentários. Ao contrário do
que foi observado em camundongos, em que há uma correlação negativa entre os
genes Igf2 e H19, nosso estudo mostra que esta correlação não ocorre na
clonagem em bovinos, indicativo de que diferenças espécies-específicas possam
existir no mecanismo de regulação destes genes “imprinted”. Além disso, maiores
alterações foram detectadas no padrão de expressão do gene “imprinted” H19 em
placentas de clones fêmeas do que em machos, apresentando-se três vezes
menos expresso no caso das fêmeas, o que sugere que o processo de
reprogramação e controle da expressão de alguns genes pode ser influenciado
pelo sexo.
68
VIII. CONCLUSÕES
Mesmo em clones nascidos com êxito pela técnica de transferência nuclear,
ocorre uma reprogramação nuclear incompleta nos placentônios destes animais.
Genes “imprinted”, importantes no desenvolvimento da placenta e no
crescimento fetal, apresentam diferenças com relação aos padrões de expressão
gênica na placenta em relação a animais produzidos sob condições naturais.
Os genes “imprinted” H19 (“imprint” paterno) e Igf2 (“imprint” materno) são
expressos diferencialmente em placentas de clones recém-nascidos em relação à
placenta de animais não clonados, indicativo de erros de expressão gênica.
Há uma correlação positiva dos genes “imprinted” Igf2 e H19 na placenta de
clones bovinos, indicativo de que diferenças espécies-específicas, com relação a
camundongos, deve existir no mecanismo de regulação destes genes “imprinted”.
O gene “imprinted” Igf2r (“imprint” paterno) foi expresso corretamente na
placenta de clones recém-nascidos.
Alterações placentárias dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19 não estão
relacionados à mortalidade neonatal.
O gene “imprinted” H19 não foi reprogramado adequadamente na placenta
de clones fêmeas em comparação a placenta de clones machos, indicativo de que
alguns eventos ligados ao processo de reprogramação e controle da expressão de
alguns genes podem estar ligados ao sexo.
Não há uma relação direta aparente entre modificações do padrão de
expressão dos genes “imprinted” Igf2, Igf2r e H19, detectado em placentônios,
com relação ao peso dos clones.
69
IX. REFERÊNCIAS
BAGUISI, A.; OVERSTRÖM, E.W. Induced enucleation in nuclear transfer procedures to producecloned animals. Theriogenology, v.53, p.209, 2000 (abstract).
BAGUISI, A.; BEHDOODI, E.; MELICAN, D.T.; POLLOCK, J.S.; DESTREMPES, M.M.;CAMMUSO, C.; WILLIAMS, J.L.; NIMS, S.D.; PORTER, C.A.; MIDURA, P.; PALACIOS, M.J.;AYRES, S.L.; DENNISTON, R.S.; HAYES, M.L.; ZIOMEK, C.A.; MEADE, H.M.; GODKE, R.A.;GAVIN, W.G.; OVERSTRÖM, E.W.; ECHELARD, Y. Production of goats by somatic cell nucleartransfer. Nat. Biotechnol., v.17, p.456-461, 1999.
BAKER, J;. LIU, J-P.; ROBERTSON, E.J.; EFSTRATIADIS, A. Role of insulin-like growth factors inembryonic and postnatal growth. Cell, v.75, p.73-82, 1993.
BAO, S.; OBATA. Y.; CARROLL, J.; DOMEKI, I.; KONO, T. Epigenetic modifications necessary fornormal development are established during oocyte growth in mice. Biol. Reprod., v.62, p.616-621,2000.
BARNES, F.L.; COLLAS, P.; POWELL, R.; KING, W.A.; WESTHUSIN, M.; SHEPERD, D. Influenceof recipient oocyte cell cycle stage on DNA synthesis, nuclear envelope breakdown, chromosomeconstitution and development in nuclear transplant bovine embryos. Mol. Reprod. Dev., v.36, p.33-41, 1993.
BARTOLOMEI, M.S.; TILGHMAN, S.M. Genomic imprinting in mammals. Annu. Rev. Genet., v.31,p.493-525, 1997.
BAVISTER, B.D. Interactions between embryos and the culture milieu. Theriogenology, v.53,p.619-626, 2000.
BEAUDET, A.L.; JIANG, Y.H. A rheostat model for a rapid and reversible form of imprinting-dependent evolution. Am. J. Hum. Genet., v.70, p.1389-1397, 2002.
BEAUJEAN, N.; HARTSHORNE, G.; CAVILLA, J.; TAYLOR, J.; GARDNER, J.; WILMUT, I.;MEEHAN, R.; YOUNG, L. Non-conservation of mammalian preimplantation methylation dynamics.Curr. Biol., v.14, p.R266-R267, 2004a.
BEAUJEAN, N.; TAYLOR, J.E.; McGARRY, M.; GARDNER, J.O.; WILMUT, I.; LOI, P.; PTAK, G.;GALLI, C.; LAZZARI, G.; BIRD, A.; YOUNG, L.E.; MEEHAN, R.R. The effect of interspecific oocyteson demethylation of sperm DNA. Proc. Natl. Acad. Sci., v.101, p.7636–7640, 2004a.
BEAUJEAN, N.; TAYLOR, J.; GARDNER, J.; WILMUT, I.; MEEHAN, R.; YOUNG, L. Effect oflimited DNA methylation reprogramming in the normal sheep embryo on somatic cell nucleartransfer. Biol. Reprod., v.71, p.185-193, 2004b.
BELL, A.C.; FELSENFELD, G. Methylation of a CTCFdependent boundary controls imprintedexpression of the Igf2 gene. Nature, v.405, p.482-485, 2000.
70
BETTHAUSER, J.; FORSBERG, E.; AUGENSTEIN, M.; CHILDS, L.; EILERTSEN, K.; ENOS, J.;FORSYTHE, T.; GOLUEKE, P.; JURGELLA, G.; KOPPANG, R.; LESMEISTER, T.; MALLON, K.;MELL, G.; MISICA, P.; PACE, M.; PFISTER-GENSKOW, M.; STRELCHENKO, N.; VOELKER, G.;WATT, S.; THOMPSON, S.; BISHOP, M. Production of cloned pigs from in vitro systems. Nat.Biotechnol., v.18, p.1055-1059, 2000.
BETTS, D.H.; BORDIGNON, V.; HILL, J.R.; WINGER, Q.; WESTHUSIN, M.E.; SMITH, L.C.; KING,W.A. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned cattle. Proc.Natl. Acad. Sci., v.98, n.3, p.1077-1082, 2001.
BETTS, D.H.; PERRAULT, S.D.; PETRIK, J.; LIN, L.; FAVETTA, L.A.; KEEFER, C.L.; KING, W.A.Telomere length analysis in goat clones and their offspring. Mol. Reprod. Dev., v.72, p.1-10, 2005.
BEYHAN, Z.; MITALIPOVA, M.; CHANG, T.; FIRST, N.L. Developmental potential of bovine nucleartransfer embryos produced using different types of adult donor cells. Theriogenology, v.53, p.210,2000.
BHAK, J.S., LEE, S.L., OCK, S.A., MOHANA KUMAR, B., CHOE, S.Y., RHO, G.J. Developmentalrate and ploidy of embryos produced by nuclear transfer with different activation treatments incattle. Anim. Reprod. Sci., v.92, p.37-49, 2006.
BIRD, A. DNA methylation patterns and epigenetic memory. Genes Dev., v.16, p.6-21, 2002.
BOIANI, M.; ECKARDT, S.; SCHOLER, H.R.; MCLAUGHLIN, K.J. Oct4 distribution and level inmouse clones: consequences for pluripotency. Genes Dev., v.16, p.1209-1219, 2003.
BOOTH, P.J.; TAN, S.J.; REIPURTH, R.; R., HOLM, P.; CALLESEN, H. Simplification of bovinesomatic cell nuclear transfer by application of a zona-free manipulation technique. Cloning StemCells, v.3, p.139-150, 2001.
BOOTH, P.J.; VIUFF, D.; TAN, S.; HOLM, P.; GREVE, T.; CALLESEN, H. Numerical chromosomeerrors in day 7 somatic nuclear transfer bovine blastocysts. Biol. Reprod., v.68, p.922-928, 2003.
BORDIGNON, V.; SMITH, L.C. Telophase enucleation: an improved method to prepare recipientcytoplasts for use in bovine nuclear transfer. Mol. Reprod. Dev., v.49, p.29-36, 1998.
BORTVIN, A.; EGGAN, K.; SKALETSKY, H.; AKUTSU, H.; BERRY, D.L.; YANAGIMACHI, R.;PAGE, D.C.; JAENISCH, R. Incomplete reactivation of Oct4-related genes in mouse embryoscloned from somatic nuclei. Development, v.130, p.1673-1680, 2003.
BOS-MIKICH, A.; WHITTINGHAN, D.G.; JONES, K.T. Meiotic and mitotic Ca+2 oscilations affectcell composition in resulting blastocysts. Dev. Biol., v.182, p.172-179, 1997.
BOURC’HIS, D.; XU, G.L.; LIN, C.S.; BOLLMAN, B.; BESTOR, T.H. Dnmt3L and the establishmentof maternal genomic imprints. Science, v.294, p.2536-2539, 2001a.
BOURC’HIS, D.; LE BOURHIS, D.; PATIN, D.; NIVELEAU, A.; COMIZZOLI, P.; RENARD, J.;VIEGAS-PEQUIGNOT, E. Delayed and incomplete reprogramming of chromosome methylationpatterns in bovine cloned embryos. Curr. Biol., v.11, p.1542-1546, 2001b.
BRADSHAW, J.; JUNG, T.; FULKA, J., JR; MOOR, R.M. UV irradiation of chromosomal DNA andits effect upon MPF and meiosis in mammalian oocytes. Mol. Reprod. Dev., v.41, p.503–512,1995.
71
BRANDEIS, M.; KAFRI, T.; ARIEL, M.; CHAILLET, J.R.; McCARREY, J.; RAZIN, A. The ontogenyof allele-specific methylation associated imprinted genes in the mouse. EMBO J., V.12, p.3669-3677, 1993.
BREM, G.; KUHHOLZER, B. The recent history of somatic cloning in mammals. Cloning StemCells, v.4, p.57-63, 2002.
BRIGGS, R.; KING, T.J. Transplantation of living nuclei from blastula cells into enucleated frogs’eggs. Proc. Natl. Acad. Sci., v.38, p.455-463, 1952.
BRINK, M.F.; BISHOP, M.D.; PIEPER, F.R. Developing efficient strategies for the generation oftransgenic cattle which produce biopharmaceuticals in milk. Theriogenology, v.53, p.139-148,2000.
CAMPBELL, K.H.S. A background to nuclear transfer and its applications in agriculture and humantherapeutic medicine. J. Anat., v.200, p.267-275, 2002.
CAMPBELL, K.H.S.; McWHIR, J.; RITTCHIE, W.A.; WILMUT, I. Sheep cloned by nuclear transferfrom a cultured cell line. Nature, v.380, p.64-66, 1996a.
CAMPBELL, K.H.S.; LOI, P.; OTAEGUI, P.J.; WILMUT, I. Cell cycle co-ordination in embryocloning by nuclear transfer. Rev. Reprod., v.1, p.40-46, 1996b.
CAMPBELL, K.; ALBERIO, R.; CHOI, I.; FISHER, P.; KELLY, R.; LEE, J.H.; MAALOUF, W.Cloning: eight years after Dolly. Reprod. Domest. Anim., v.40, p.256-268, 2005.
CARROLL, J. The initiation and regulation of Ca2+ signalling at fertilization in mammals. Semin.Cell Dev. Biol., v.12, p.37-43, 2001.
CHAN, A.W.S. Transgenic animals: current and alternative strategies. Cloning, v.1, p.25-46, 1999.
CHAILLET, J.R.; VOGT, T.F; BEIER, D.R.; LEDER, P .Parental-specific methylation of an imprintedtransgene is established during gametogenesis and progressively changes during embryogenesis.Cell, v.66,p. 77-83, 1991.
CEZAR, G,G.; BARTOLOMEI, M.S.; FORSBERG, E.J.; FIRST, N.L.; BISHOP, M.D.; EILERTSEN,K.J. Genome-wide epigenetic alterations in cloned bovine fetuses. Biol. Reprod., v.68, p.1009-1014, 2003.
CHAVATTE-PALMER, P.; REMY, D.; CORDONNIER, N. Health status of cloned cattle at differentages. Cloning Stem Cells, v.6, p.94-100, 2004.
CHEN, T.; ZHANG, Y.L.; JIANG, Y.; LIU, S.Z.; SCHATTEN, H.; CHEN, D.Y.; SUN, Q.Y. The DNAmethylation events in normal and cloned rabbit embryos. FEBS Letters, v.578, p.69-72, 2004.
CHEONG, H.; TAKAHASHI, Y.; KANAGAWA, H. Birth of mice after transplantation of early cell-cycle-stage embryonic nuclei intro enucleated oocytes. Biol. Reprod., v.48, p.958-963, 1993.
CHESNE, P.; ADENOT, P.G.; VIGLIETTA, C.; BARATTE, M.; BOULANGER, L.; RENARD, J.P.Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol., v.20, p.366-369, 2002.
72
CHUNG, Y.G.; MANN, M.R.; BARTOLOMEI, M.S.; LATHAM, K.E. Nuclear-cytoplasmic ‘tug-of war’during cloning: effects of somatic cell nuclei on culture medium preferences in the preimplantationcloned mouse embryo. Biol. Reprod., v.66, p.1178-1184, 2002.
CHUNG, Y.G.; RATNAM, S.; CHAILLET, J.R.; LATHAM, K.E. Abnormal regulation of DNAmethyltransferases expression in cloned mouse embryos. Biol. Reprod., v.69, p.146-153, 2003.
CIBELLI, J.B.; STICE, S.L.; GOLUEKE, P.J.; KANE, J.J.; JERRY, J.; BLACKWELL, C.; PONCE DELEON, F.A.; ROBL, J.M. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts.Science, v.280, p.1256-1258, 1998.
COLLAS, P.; ROBL, J.M. Relationship between nuclear remodeling and development in nucleartransplant rabbit embryos. Biol. Reprod., v.45, p.455-465, 1991.
CONSTANCIA, M.; HEMBERGER, M.; HUGHES, J.; DEAN, W.; FERGUSON-SMITH, A.;FUNDELE, R.; STEWART, F.; KELSEY, G.; FOWDEN, A.; SIBLEY, C. Placental-specific IGF-II is amajor modulator of placental and fetal growth, Nature, v.417, p.945-948, 2002.
CORLEY-SMITH G.E.; BRANDHORST, B.P. Preservation of endangered species and populations:a role for genome banking, somatic cell cloning, and androgenesis? Mol. Reprod. Dev., v.53,p.363-367, 1999.
CROSS, J.C. Placental function in development and disease. Reprod. Fert. Dev., v.18, p.71-76,2006.
CURCHOE, C.; ZHANG, S.; BIN, Y.; ZHANG, X.; YANG, L.; FENG, D.; O’NEILL, M.; TIAN, X.C.Promoter-specific expression of the imprinted IGF2 gene in cattle (Bos taurus). Biol. Reprod., v.73,p.1275-1281, 2005.
CZOLOWSKA, R.; MODLINSKI, J.A.; TARKOWSKI, A.K. Behavior of thymocyte nuclei in nonactivated and activated mouse oocytes. J. Cell Sci., v.69, p.19-34, 1984.
DANIELS, R.; HALL, V.; TROUNSON, A.O. Analysis of gene transcription in bovine nuclear transferembryos reconstructed with granulosa cell nuclei. Biol. Reprod., v.63, p.1034-1040, 2000.
DANIELS R., HALL V.J., FRENCH A.J., KORFIATIS N.A., TROUNSON A.O. Comparison of genetranscription in cloned bovine embryos produced by different nuclear transfer techniques. Mol.Reprod. Dev., v.60, n.3, p.281-288, 2001.
DAVIES, K,; BOWDEN, L,; SMITH, P,; DEAN, W,; HILL, D,; FURUUMI, H,; SASAKI, H,;CATTANACH, B,; REIK, W. Disruption of mesodermal enhancers for Igf2 in the minute mutant.Development, v.129, p.1657-1668, 2002.
DAVIS, T.L.; TRASLER, J.M.; MOSS, S.B.; YANG, G.J.; BARTOLOMEI, M.S. Acquisition of theH19 methylation imprint occurs differentially on the parental alleles during gametogenesis.Genomics, v.58, p.18-28, 1999.
DAVIS, R.L.; YANG, G.J.; McCARREY, J.R., BARTOLOMEI, M.S. The H19 methylation imprint isearesd nad re-established differentially on the parental alleles during male germ cell development.Hum. Mol. Genet., v.9, p.2885-2894, 2000.
De CHIARA, T.M.; EFSTRATIADIS, A.; ROBERTSON, E.J. A growth-deficiency phenotype inheterozygous mice carrying an insulin-like growth factor II gene disrupted by targeting, Nature,v.345, p78-80, 1990.
73
De LA FUENTE, R.; KING, W.A. Developmental consequences of karyokinesis during the firstmitotic cell cylce of bovine parthenotes. Biol. Reprod., v. 58, p.952-962, 1998.
De SOUSA, P.A.; WINGER, Q.; HILL, J.R.; JONES, K.; WATSON, A.J.; WESTHUSIN, M.E.Reprogramming of fibroblast nuclei after transfer into bovine oocytes. Cloning, v.1., n.1, p.63-69,1999.
De SOUSA, P.A.; KING, T.; HARKNESS, L.; YOUNG, L.E.; WALKER, S.K.; WILMUT, I. Evaluationof gestational deficiencies in cloned sheep fetuses and placentae. Biol. Reprod., v.65, p.23-30,2001.
DEAN, W.; SANTOS, F.; STOJKOVIC, M.; ZAKHARTCHENKO, V.; WALTER, J.; WOLF, E.; REIK,W. Conservation of methylation reprogramming in mammalian development: aberrantreprogramming in cloned embryos. Proc. Natl. Acad. Sci., v.98, p.13734–13738, 2001.
DIBERARDINO, M.A. Genomic potential of differentiated cells analysed by nuclear transplantation.Am. Zool., v.27, p.623-644, 1987.
DIELEMAN, S.J.; HENDRIKSEN, P.J.; VIUFF, D.; et al. Effects of in vivo prematuration and in vivofinal maturation on developmental capacity and quality of preimplantation embryos.Theriogenology, v.57, p.5-20, 2002.
DINDOT, S.V.; FARIN, P.W.; FARIN, C.E.; ROMANO, J.; WALKER, S.; LONG, C. Epigenetic andgenomic imprinting analysis in nuclear transfer derived Bos gaurus/Bos taurus hybrid fetuses. Biol.Reprod., v.71, p.470-478, 2004.
ECKARDT, S; MCLAUGHLIN, KJ. Interpretation of reprogramming to predict the success ofsomatic cell cloning. Anim. Reprod. Sci., v.82-83, p.97-108, 2004.
EDWARDS, J.L.; SCHRICK, F.N.; MCCRACKEN, M.D.; VAN AMSTEL, S.R.; HOPKINS, F.M.;WELBORN, M.G.; DAVIES, C.J. Cloning adult farm animals: a review of the possibilites andproblems associated with somatic cell nuclear transfer. Am. J. Reprod. Immun., v.50, p.113-123,2003
EFSTRATIADIS, A. Genetics of mouse growth. Int. J. Dev. Biol., v.42, p.955-976, 1998.
EGGAN, K.; JAENISCH, R. Micromanipulating dosage compensation: understanding X-chromosome inactivation through nuclear transplantation. Semin. Cell. Dev. Biol., v.14, p.349-358,2004.
EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT III, W.; YANAGIMACHI, R.;JAENISCH, R. X-chromosome inactivation in cloned mouse embryos. Science, v.290, p.1578-1581, 2000.
EGGAN, K.; AKUTSU, H.; LORING, J.; JACKSON-GRUSBY, L.; KLEMM, M.; RIDEOUT III, W.M.;YANAGIMACHI, R.; JAENISCH, R. Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived bynuclear cloning and teraploid embryo complementation. Proc. Natl. Acad. Sci., v.98, p.6209-6214,2001.
EGLITIS, M. Formation of tetraploid mouse blastocysts following blastomere fusion withpolyethylene glycol. J. Exp. Zool., v.213, p.309-313, 1980.
74
ELSHEIKH, A.S.; TAKAHASHI, Y.; KATAGIRI, S.; KANAGAWA, H. Developmental ability of mouselate 2-cell stage blastomeres fused to chemically enucleated oocytes in vitro. J. Vet. Med. Sci.,v.59, p.107-113, 1997.
ELSHEIKH, A.S.; TAKAHASHI, Y.; KATAGIRI, S.; KANAGAWA, H. Functional enucleation ofmousemetaphase II oocytes with ectoposide. Jpn. J. Vet. Res., v.45, p.217-220, 1998.
EVANS, M.J.; GURER, C.; LOIKE, J.D.; WILMUT, I.; SCHNIEKE, A.E.; SCHON, E.A. MitochondrialDNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nat. Genetics, v. 23, p.90-93, 1999.
FABER, D.C.; MOLINA, J.A.; OHLRICHS, C.L.; VANDER ZWAAG, D.F.; FERRÉ, L.B.Commercialization of animal biotechnology. Theriogenology, v.59, p.125-138, 2003.
FARIN, P.W.; CROSIER, A.E.; FARIN, C.E. Influence of in vitro systems on embryo survival andfetal development in cattle. Theriogenology, v.55, p.151-170, 2001.
FARIN, P.W.; PIEDRAHITA, J.A.; FARIN, C.E. Errors in development of fetuses and placentas fromin vitro-produced bovine embryos. Theriogenology, v.65, p.178-191, 2006.
FERGUSON-SMITH, A., SURANI; M.A. Imprinting and the epigenetic asymmetry between parentalgenomes. Science, v.293, p.1086-1089, 2001.
FERREIRA, C.R. Produção de embriões bovinos com mtDNA heterólogo de B.t.indicus eB.t.taurus e estudo da segregação mitocondrial durante a pré-implantação. 2002. 93f.Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2002.
FISSORE, R.A.; LONG, C.R.; DUNCAN, R.P.; ROBL, J.M. Initiation and organization of eventsduring the first cell cycle in mammals: applications in cloning. Cloning, v.1, p.89-100, 1999.
FULKA Jr, J.; MOOR, R.M. Noninvasive chemical enucleation of mouse oocytes. Mol. Reprod.Dev., v.34, p.427-430, 1993.
FULKA Jr, J.; LOI, P.; LEDDA, S.; MOOR, R.M.; FULKA, J. Nucleus transfer in mammals: how theoocyte cytoplasm modifies the transferred nucleus. Theriogenology, v.55, p.1373-1380, 2001.
GALLI, C.; DUCHI, R.; MOOR, R.M.; LAZZARI, G. Mammalian leukocytes contain all the geneticinformation necessary for the development of a new individual. Cloning, v.1, n.3, p.161-170, 1999.
GALLI, C.; LAGUTINA, I.; CROTTI, G.; COLLEONI, S.; TURINI, P.; PONDERATO, N.; DUCHI, R.;LAZZARI, G. Pregnancy: a cloned horse born to its dam twin. Nature, v.424,p.635, 2003.
GALLI, C.; LAGUTINA, I.; LAZZARI, G. Introduction to Cloning by Nuclear Transplantation. CloningStem Cells, v.5, p.223-232, 2002.
GALLI, C.; LAGUTINA, I.; VASSILIEV, I.; DUCHI, R.; LAZZARI, G. Comparison of microinjection(piezo-electric) and cell fusion for nuclear transfer success with different cell types in cattle. CloningStem Cells, v.4, p.189-196, 2002.
GAO, S.; CHUNG, Y.G.; WILLIAMS, J.W.; RILEY, J.; MOLEY, K.; AND LATHAM, K.E. Somatic cell-like features of cloned mouse embryos prepared with cultured myoblast nuclei. Biol. Reprod., v.69,p.48-56, 2003.
75
GAO, S.; CHUNG, Y.G.; PARSEGHIAN, M.H.; KING, G.J.; ADASHI, E.Y.; LATHAM, K.E. Rapid H1linker histone transitions following fertilization or somatic cell nuclear transfer: evidence for auniform developmental program in mice. Dev. Biol., v.266, p.62-75, 2004.
GASPARRINI, B.; GAO, S.; AINSLIE, A.; FLETCHER, J.; McGARRY, M.; RITCHIE, W.A.;SPRINGBETT, A.J.; OVERSTROM, E.W.; WILMUT, I.; DE SOUSA, P.A. Cloned mice derived fromembryonic stem cell karyoplasts and activated cytoplasts prepared by induced enucleation. Biol.Reprod., v.68, p.1259-1266, 2003.
GOODALL, J.J.; SCHMUTZ, S.M. Linkage mapping of IGF2 on cattle chromosome 29. Anim.Genet., v.34, p.313, 2003.
GURDON, J.B. The transplantation of nuclei between two subspecies of Xenopus laevis. Heredity,v.16, p.305-315, 1961.
GURDON, J.B. Genetic reprogramming following nuclear transplantation in amphibia. Semin. CellDev. Biol., v.10, p.239-243, 1999.
GURDON, J.B.; UEHLINGER, V. ‘Fertile’ intestine nuclei. Nature, v.210, p.1240-1241, 1966.
HAGEMANN, L.J. Influence of the dominant follicle on oocytes fom subordinate follicles.Theriogenology, v.51, p.449-459, 1999.
HAJKOVA, P.; ERHARDT, S.; LANE, N.; HAAF, T.; EL MAARRI, O.; REIK, W.; WALTER, J.;SURANI, M.A. Epigenetic reprogramming in mouse primordial germ cells. Mech. Dev., v.117, p.15-23, 2002.
HAN, Y.M.; KANG, Y.K.; KOO, D.B.; LEE, K.K. Nuclear reprogramming of cloned embryosproduced in vitro. Theriogenology, v.59, p.33-44, 2003.
HARK, A.T.; SCHOENHERR, C.J.; KATZ, D.J.; INGRAM, R.S.; LEVORSE, J.M.; TILGHMAN, S.M.CTCF mediates methylation-sensitive enhancer blocking activity at the H19/Igf2 locus. Nature,v.405, p.486-489, 2000.
HASHIZUME, K.; ISHIWATA, H.; KIZAKI, K. Implantation and placental development in somatic cellclone recipient cows. Cloning Stem Cells, v.4, p.197-209, 2002.
HASLER, J.F. In vitro culture of bovine embryos in ménézo's B2 medium with or without cocultureand serum: the normalcy of pregnancies and calves resulting from transferred embryos. An.Reprod. Sci., v.60-61, p.81-91, 2000.
HEINDRYCKX, B.; RYBOUCHKIN, A.; VAN DER ELST, J.; DHONT, M. Effect of culture media onin vitro development of cloned mouse embryos. Cloning, v.3, p.41-50, 2001.
HEYMAN, Y.; CHAVATTE-PALMER, P.; LEBOURHIS, D.; CAMOUS S.; VIGNON, X.; RENARD,J.P. Frequency and occurrence of late-gestation losses from cattle cloned embryos. Biol. Reprod.,v.66, p.6-13, 2002a.
HEYMAN, Y.; ZHOU, Q.; LEBOURHIS, D.; CHAVATTE-PALMER, P.; RENARD, J.P.; VIGNON, X.Novel approaches and hurdles to somatic cloning in cattle. Cloning Stem Cells, v.4, p.47-53,2002b.
76
HEYMAN, Y.; VIGNON, X.; RENARD, J.P. Manipulação e estocagem de linhagens celulares paraclonagem somática em bovinos. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DETECNOLOGIA DE EMBRIÕES, 15, Rio Quente, 2000. Arq. Fac. Vet. UFRGS, Porto Alegre - RS,v.28 (Supl.), n.1, p.72-84, 2000.
HIENDLEDER, S.; SCHMUTZ, S.M.; ERHARDT, G.; GREEN, R.D.; PLANTE, Y.Transmitochondrial differences and varying levels of heteroplasmy in nuclear transfer cloned cattle.Mol. Reprod. Dev., v.54, p.24-31, 1999.
HIENDLEDER, S.; ZAHKARTCHENKO, V., WOLF, E. Mitochondria and the success of somatic cellnuclear transfer cloning: from nuclear-mitochondrial interactions to mitochondrial complementationand mitochondrial DNA recombination. Reprod. Fert. Dev., v.17, p.69-83, 2005.
HILL, J.R.; ROUSSEL, A.J.; CIBELLI, J.B.; EDWARDS, J.F.; HOOPER, N.L.; MILLER, M.W.;THOMPSON, J.A.; LOONEY, C.R.; WESTHUSIN, M.E.; ROBL, J.M.; STICE, S.L. Clinical andpathologic features of cloned transgenic calves and fetuses (13 case studies). Theriogenology,v.51, p.1451-1465, 1999.
HILL, J.R.; BURGHARDT, R.C.; JONES, K.; LONG, C.R.; LOONEY, C.R.; SHIN, T.; SPENCER,T.E.; THOMPSON, J.A.; WINGER, Q.A.; WESTHUSIN, M.E. Evidence for placental abnormality asthe major cause of mortality in first-trimester somatic cell cloned bovine fetuses. Biol. Reprod.,v.63, p.1787-1794, 2000.
HOCHEDLINGER, K.; JAENISCH, R. Monoclonal mice generated by nuclear transfer from matureB and T donor cells. Nature, 415, 1035–1038, 2002.
HUMPHERYS, D.; EGGAN, K.; AKUTSU, H.; HOCHEDLINGER, K.; RIDEOUT III, W.M.;BINISZKIWICZ, D.; YANAGIMACHI, R.; JAENISCH, R. Epigenetic instability in ES cells and clonedmice. Science, v.293, p.95-97, 2001.
HURST, L.D.; McVEAN, G.T. Growth effects of uniparental disomies and the conflict theory ofgenomic imprinting. Trends Genet., v.13, p.436-443, 1997.
HURST, L.D.; McVEAN, G.T. Do we understand the evolution of genomic imprinting? Curr, Opin.Genet. Dev., v.8, p.701-708, 1998.
HURST, L.D.; SMITH, N.G. Molecular evolutionary evidence that H19 RNA is functional. TrendsGenet., v.15, p.134-135, 1999.
ILLMENSEE, K.; HOPPE, P.C. Nuclear transplantation in Mus musculus: Developmental potentialof nuclei from preimplantation embryos. Cell, v.23, p.9-18, 1981.
ILYIN, V.; PARKER, I. Effects of alcohols on responses evoked by inositol trisphosphate inXenopus oocytes. J. Physiol., v.448, p.339-354, 1992.
INOUE, K.; KOHDA, T.; LEE, J.; OGONUKI, N.; MOCHIDA, K.; NOGUCHI, Y.; TANEMURA, K.;KANEKO-ISHINO, T.; ISHINO, F.; OGURA, A. Faithful expression of imprinted genes in clonedmice. Science, v.295, p.297, 2002.
IWASAKI, S.; CAMPBELL, K.H.; GALLI, C., AKIYAMA, K. Production of live calves derived fromembryonic estem-like cells aggregated with tetraploid embryos. Biol. Reprod., v.62, p.470-475,2000.
77
JACOBESEN, H.; SCHMIDT, M.; HOLM, P.; ANGILD, P.T.; VAJTA, G.; GREEVE, T.; CALLESEN,H. Body dimensions and birth and organ weights of calves derived from in vitro produced embryoscultured with oe without serum and oviduct epithelium cells. Theriogenology, v.53, p.1761-1769,2000.
JEON, H.Y.; HYUN, S.H.; LEE, G.S.; KIM, H.S.; KIM, S.; JEONG, Y.W.;, KANG, S.K.; LEE, B.C.;HAN, J.Y.; AHN, C.; HWANG, W.S. The analysis of telomere length and telomerase activity incloned pigs and cows. Mol. Reprod. Dev., v.71, p.315-320, 2005.
JIANG, L.; CARTER, D.B.; XU, J.; YANG, X.; PRATHER, R.S.; TIAN, X.C. Telomere lengths incloned transgenic pigs. Biol. Reprod., v.70, p.1158-1593, 2004.
JOHN, R.M.; SURANI, M.A. Genomic imprinting, mammalian evolution, and the mystery of egg-laying mammals. Cell, v.101, p.585-588, 2000.
JONES, K.L.; HILL, J.; SHIN, T.Y.; LUI, L.; WESTHUSIN, M. DNA hypomethylation of karyoplastsfor bovine nuclear transplantation. Mol. Reprod. Dev., v.60, p.208-213, 2001.
JOUNEAU, A.; RENARD, J.P. Reprogramming in nuclear transfer. Curr. Opin. Genet. Dev., v.13,p.486-491, 2003.
KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y.H.; LEE, K.; HAN, Y. Influence of the oocyte nuclei ondemethylation of donor genome in cloned bovine embryos. FEBS Lett., v.499, p.55-58, 2001a.
KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y. H.; CHUNG, A.S.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. Aberrantmethylation of donor genome in cloned bovine embryos. Nat. Genet., v.28, p.173-177, 2001b.
KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y. H.; KIM H.N.; CHANG, W.K.; LEE, K.K.; HAN, Y.M.Typical demethylation events in cloned pig embryos. Clues on speciesspecific differences inepigenetic reprogramming of cloned donor genome. J. Biol. Chem., v.27, p.27, 2001c.
KANG Y,K.; KOO, D.; PARK, J.S.; CHOI, Y. H.; KIM H.N.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. Limiteddemethylation leaves mosaic-type methylation states in cloned bovine pre-implantation embryos.EMBO J., v.21, p.1092–1100, 2002.
KANG, Y.K.; KOO, D.B.; PARK, J.S.; ET AL. Aberrant methylation of donor genome in clonedbovine embryos. Nat. Genet., v.28, p.173-177, 2001.
KANKA, J.; SMITH, S.D.; SOLOY, E.; HOLM, P.; CALLESEN, H. Nucleolar ultrastructure in bovinenuclear transfer embryos. Mol. Reprod. Dev., v.52, n.3, p.253-263, 1999.
KÁRNIKOVÁ, L.; HORSKÁ, M.; TOMÁNEK, M.; KANKA, J.; URBAN, F.; MOOR, R.; FULKA Jr, J.Chemically enucleated mouse oocytes: ultrastructure and kinetics of histone H1 kinase activity.Reprod. Nutr. Dev., v.38, p.643-651, 1998.
KASINATHAN, P.; KNOTT, J.G.; WANG, Z.; JERRY, D.J.; ROBL, J.M. Production of calves fromG1 fibroblasts. Nat. Biotechnol., v.19, p.1176-1178, 2001.
KATO, Y.; TSUNODA, Y. Synchronous division of mouse two-cell embryos with nocodazole in vitro.J. Reprod. Fert., v.95, p.39-43, 1992.
KATO, Y.; TANI, T.; SOTOMARU, Y.; KUROKAWA, K.; KATO, J-Y.; DOGUCHI, H.; YASUE, H.;TSUNODA, Y. Eight calves cloned from somatic cells of a single adult. Science, v.282, p.2095-2098, 1998.
78
KATO, Y.; TANI, T.; TSUNODA, Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male andfemale adult, newborm and fetal cows. J. Reprod. Fert., v.120, p.231-237, 2000.
KAUFMAN, M.H. The chromosome complement of single-pronuclear haploid mouse embryosfollowing activation by ethanol treatment. J. Embryo. Exp. Morphol., v.71, p.139-154, 1982.
KAWAKAMI, M.; TANI, T.; YABUUCHI, A.; KOBAYASHI, T.; MURAKAMI, H.; FUJIMURA, T.;KATO, Y.; TSUNODA, Y. Effect of demecolcine and nocodazole on the efficiency of chemicallyassisted removal of chromosomes and the developmental potential of nuclear transferred porcineoocytes. Cloning Stem Cells, v.5, p.379-387, 2003.
KENT, S.J.; LEWIS, I.M. Genetically identical primate modelling systems for HIV vaccines. Reprod.Fert. Dev., v.10, p.651-657, 1998.
KILLIAN, J.K.; BYRD, J.C.; JIRTLE, J.V.; MUDAY, B.L.; STOSKOPF, M.K.; MacDONALDS, R.G.;JIRTLE, R.L. M6P/IGF2R imprinting evolution in mammals. Mol. Cell, v.5, p.707-716, 2000.
KIND, A.; COLMAN, A. Therapeutic cloning: needs and prospects. Sem. Cell Dev. Biol., v.10,p.279-286, 1999.
KING, W.A., COPPOLA, G., ALEXANDER, B., MASTROMONACO, G., PERRAULT, S., NINO-SOTO, M.I., PINTON, A., JOUDREY, E.M., BETTS, D.H. The impact of chromosomal alteration onembryo development. Theriogenology, v.65, p.166-1772, 2006.
KISHIKAWA, H.; WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Comparison of oocyte-activating agents formouse cloning. Cloning, v.1., n.3, p.153-160, 1999.
KLINE, D.; KLINE, J.T. Repetitive calcium transients and the role of calcium in exocytosis and cellcycle activation in the mouse egg. Dev. Biol., v.149, p.80-89, 1992.
KONO, T.; OBATA, Y.; YOSHIMZU, T.; NAKAHARA, T.; CARROLL, J. Epigenetic modificationsduring oocyte growth correlates with extended parthenogenetic development in the mouse. NatureGenet., v.13, p.91-94, 1996.
KONO, T.; KWON, O.Y.; NAKAHARA, T. Development of enucleated mouse oocytes reconstitutedwith embryonic nuclei. J. Reprod. Fertil., v.93, p.165-172, 1991.
KOO, D.B.; KANG, Y.K.; CHOI, Y.H.; PARK, J.S.; KIM, H.N.; OH, K.B.; SON, D.S.; PARK, H.P.;LEE, K.K.; HAN, Y,M. Aberrant allocations of inner cell mass and trophectoderm cell in bovinenuclear transfer blastocysts. Biol. Reprod., v.67, p.487-492, 2002.
KOO, D.B.; KANG, Y.K.; PARK, J.S.; PARK, J.K.; CHANG, W.K.; LEE, K.K.; HAN, Y.M. A paucityof structural integrity in cloned porcine blastocysts produced in vitro. Theriogenology, v.62, p.779-789, 2004.
KRUIP, T.A.M.; DEN DAAS, J.H.G. In vitro produced and cloned embryos: effects on pregnancy,parturition and offspring. Theriogenology, v.47, n.1, p.43-52, 1997.
KRUIP, T.A M.; BEVERS, M.M.; KEMP, B. Environment of oocyte and embryo determines health ofIVP offspring. Theriogenology, v.53, p.611-618, 2000.
KUBIAK, J.Z.; PRATHER, R.S.; MAUL, G.G.; SCHATTEN, G. Cytoplasmic modification of thenuclear lamina during pronuclear-like transformation of mouse blastomere nuclei. Mech. Dev., v.35,p.103-111, 1991.
79
KUBOTA, C.; YAMAKUCHI, H.; TODOROKI, J.; MIZOSHITA, K.; TABAR, N.; BARBER, M.; YANG,X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. Proc. Natl. Acad.Sci., v.97, p.990-995, 2000.
KÜHHOLZER-CABOT, B; BREM, G. Aging of animals produced by somatic cell nuclear transfer.Exper. Gerontology, v.37, p.1315-1321, 2002.
KUHHOLZER, B.; HAWLEY, R.J.; LAI, L.; KOLBER-SIMONDS, D.; PRATHER, R.S. Clonal lines oftransgenic fibroblast cells derived from the same fetus result in different development when used fornuclear transfer in pigs. Biol. Reprod., v.64, p.1695-1698, 2001.
LAI, L.; PARK, K.W.; CHEONG, H.T.; KUHHOLZER, B.; SAMUEL, M.; BONK, A.; IM, G.S.; RIEKE,A.; DAY, B.N.; MURPHY, C.N.; CARTER, D.B.; PRATHER, R.S. Transgenic pig expressing theenhanced green fluorescent protein produced by nuclear transfer using colchicine-treatedfibroblasts as donor cells. Mol. Reprod. Dev., v.62, p.300-306, 2002.
LANZA, R.P.; CIBELLI, J.B.; WEST, M.D. Human therapeutic cloning. Nat. Med., v.5, p.975-977,1999.
LANZA, R.P.; CIBELLI, J.B.; BLACKWELL, C.; CRISTOFALO, V.J.; FRANCIS, ,K.; BAERLOCHER,G.M.; MAK, J.; SCHERTZER, M.; CHAVEZ, E.A.; SAWYER, N.; LANSDORP, P.M.; WEST, M.D.Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells.Science, v.288, p.665-669, 2000.
LARKIN, D.M.; EVERTS-VAN DER WIND, A.; REBEIZ, M.; SCHWEITZER, P.A.; BACHMAN, S.;GREEN, C.; WRIGHT, C.L.; CAMPOS, E.J.; BENSON, L.D.; EDWARDS, J.; LIU, L.; OSOEGAWA,K.; WOMACK, J.E.; DE JONG, P.J.; LEWIN, H.A. A cattle-human comparative map built with cattleBAC-ends and human genome sequence. Genome Res., v.13, p.1966-1972, 2003.
LATHAM, K.H. Epigenetic modification and imprinting of the mammalian genome duringdevelopment. Curr. Top. Dev. Biol., v.43, p.1-49, 1999.
LEAL, C.L.; LEE, C.; MOOR, R.M. UV irradiation of pig metaphase chromosomes: maturation-promoting factor degradation, nuclear cytology and cell cycle progression. J. Reprod. Fertil., v.116,p.363-371, 1999.
LEE, B.C.; KIM, M.K.; JANG, G.; OH, H.J.; YUDA, F.; KIM, H.J.; SHAMIM, M.H.; KIM, J.J.; KANG,S.K.; SCHATTEN, G.; HWANG, W.S. Dogs cloned from adult somatic cells. Nature, v.426, p.641,2005.
LEE, J.; INOUE, K.; ONO, R.; OGONUKI, N.; KOHDA, T.; KANEKO-ISHINO, T.; OGURA, A.;ISHINO, F. Erasing genomic imprinting memory in mouse clone embryos produced from day 11.5primordial germ cells. Development, c.129, p.1807-1817, 2002b.
LEE, J.W.; WU, S.C.; TIAN, X.C.; BARBER, M.; HOAGLAND, T.; RIESEN, J.; LEE, K.H.; TU, C.F.;CHENG, W.T.K.; YANG, X. Production of cloned pig by whole-cell intracytoplasmic microinjection.Biol. Reprod., v.69, p.995-1001, 2003.
LEE, R.S.; DEPREE, K.M.; DAVEY, H.W. The sheep (ovis aries) H19 gene: genomic structure andexpression patterns, from the preimplantation embryo to adulthood. Gene, v.301, p.67-77, 2002a.
LEIBO, S.P.; RALL, W.F. Increase in production of pregnancies by bisection of bovine embryos.Theriogenology, v.27, p.245, 1987.
80
LEWIS, I.M. Splitting cattle embryos: effect of sucrose, embryo stage, and duration betweenembryo recovery and bissection. Theriogenology, v.41, p.237, 1994.
LI, E.; BEARD, C.; JAENISCH, R. Role for DNA methylation in genomic imprinting. Nature, v.366,p.362–365, 1993.
LI, Y.M.; FRANKLIN, G.; CUI, H.M.; SVENSSON, K.; HE, X.B.; ADAM, G.; et al. The H19 transcriptis associated with polysomes and may regulate IGF2 expression in trans. J. Biol. Chem., v.273,p.28247-28252, 1998.
LOI, P.; PTAK, G.; BARBONI, B.; FULKA, J. JR; CAPPAI, P.; CLINTON, M. Genetic rescue of anendangered mammal by cross-species nuclear transfer using post-mortem somatic cells. Nat.Biotechnol., v.19, p.962–964, 2001.
LOPEZ, M.L.; DIKKES, P.; ZURAKOWSKI, D.; VILLA-KOMARKOFF, L. Insulin-like growth factor IIaffects the appearance and glycogen content of glycogen cells in the murine placenta.Endocrinology, v.137, p.2100-2108, 1996.
LU, F.; SHI, D.; WEI, J.; YANG, S.; WEI, Y. Development of embryos reconstructed by interspeciesnuclear transfer of adult fibroblasts between buffalo (Bubalus bubalis) and cattle (Bos indicus).Theriogenology, v.64, p. 1309-1319, 2005.
LUCIFERO, D.; MERTINEIT, C.; CLARKE, H.J.; BESTOR, T.H.; TRASLER, J.M. Methylationdynamics of imprinted genes in mouse germ cells. Genomics, v.79, p.530-538, 2002.
MACHATY, Z.; FUNAHASHI, H.; MAYES, M.A.; DAY, B.N.; PRATHER, R.S. Effects of injectingcalcium chloride into in vitromatured porcine oocytes. Biol. Reprod., v.54, p.316-322, 1996.
MANN, M.R.W.; CHUNG, Y.G.; NOLEN, L.D.; VERONA, R.I.; LATHAM, K.E.; BARTOLOMEI, M.S.Disruption of imprinted gene methylation and expression in cloned preimplantation stage mouseembryos. Biol. Reprod. v.69, p.902-914, 2003.
MARX, J.L. Swiss research questioned. Science, v.220, p.1023, 1983.
MASUI, Y. Towards understanding control of the division cycle in animal cells. Biochem. Cell Biol.,v.70, p.920-945, 1992.
MATSUZAKI ,M.; SHIGA, K. Endocrine characteristics of cloned calves. Cloning Stem Cells, v.4,p.261-267, 2002.
MATTHEWS, J.C.; BEVERIDGE, M.J.; DIALYNAS, E.; BARTKE, A.; KILBERG, M.S.; KAUFMAN,P. Placental anionic and cationic amino acid transporter expression in growth hormoneoverexpressing and null IGF-II or null IGF-I receptor mice. Placenta, v.20, p.639-650, 1999.
MAYER, W.; NIVELEAU, A.; WALTER, J.; FUNDELE, R.; HAAF, T. Demethylation of the zygoticpaternal genome. Nature, v.403, p.501-502, 2000.
McGRATH, J.; SOLTER, D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microcirurgy and cellfusion. Science, v.220, p.1300-1302, 1983.
McGRATH, J.; SOLTER, D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal andpaternal genomes. Cell, v.37, p.179-183, 1984a.
81
McGRATH, J.; SOLTER, D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotesto support development in vitro. Science, v.226, p.1317-1319, 1984b.
McLAREN, A. Methods and success of nuclear transplantation in mammals. Nature, v.309, p.671-672, 1984.
McLAREN, R.J.; MONTGOMERY, G.W. Genomic imprinting of the insulin-like growth factor 2 genein sheep. Mammalian Genome, v.10, p.588–591, 1999.
MEIRELLES, F.V.; SMITH, L.C. Mitochondrial genotype segregation during preimplantationdevelopment lineage produced by embryonic karyoplast transplantation. Genetics, v.148, p.877-883, 1998.
MEIRELLES, F.V.; BORDIGNON, V.; WATANABE, Y.F.; WATANABE, M.R.; DAYAN, A.; GARCIA,J.M.; LÔBO, R.B.; SMITH, L.C. Troca completa do genoma mitocondrial em um bezerro Neloreproduzido por transferência interespecífica de núcleo. Implicações na interação núcleo-citoplasmática e seleção genética. Rev. Bras. Reprod. Anim., v.23, n.3, p.250-252, 1999.
MEIRELLES, F.V.; BORDIGNON, V.; WATANABE, Y.; WATANABE, M.; DAYAN, A.; LOBO, R.B.;GARCIA, J.M.; SMITH, L.C. Complete replacement of the mitochondrial genotype in a Bos indicuscalf reconstructed by nuclear transfer to a Bos taurus oocyte. Genetics, v.158, n.1, p.351-356,2001.
MEIRELLES, F.V.; CAETANO, A.R.; WATANABE, Y.F.; RIPAMONTE, P.; CARAMBULA, S.F.;MERIGHE, G.K.; GARCIA, S.M. Genome activation and developmental block in bovine embryos.Anim. Reprod. Sci., v.82-83, p.13-20, 2004.
MENG, L.; ELY, J.J.; STOUFFER, R.L.; WOLF, D.P. Rhesus monkeys produced by nucleartransfer. Biol. Reprod., v.57, p.454-459, 1997.
MÉO, S.C. Ativação partogenética e desenvolvimento embrionário inicial de oócitos bovinostratados com estrôncio, ionomicina e 6-dimetilanopurina. 2002. 86f. Dissertação (Mestrado emMedicina Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade EstadualPaulista, Jaboticabal, 2002.
MÉO, S.C. Interação núcleo-citoplasmática em embriões e expressão de genes “imprinted”em fetos bovinos produzidos in vivo, in vitro e partenogenéticos. 2005. 115f. Tese (Doutoradoem Medicina Veterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade EstadualPaulista, Jaboticabal, 2005.
MÉO, S.C.; LEAL, C.L.V.; GARCIA, J.M. Activation and early parthenogenesis of bovine oocytestreated with ethanol and strontium. Anim. Reprod. Sci., v.81, p.35-46, 2004.
MÉO, S.C.; YAMAZAKI, W.; LEAL, C.L.V.; OLIVEIRA, J.A. DE; GARCIA, J.M. Use of strontium forbovine oocyte activation. Theriogenology, v.8, p.2089–2102, 2005.
MIALON, M.M.; CAMOUS, S.; RENAND, G.; MARTAL, J.; MENISSIER, F. Peripheral concentrationof a 60-kDa pregnancy specific protein during gestation and after calving in relationship toembryonic mortality in cattle. Reprod. Nutr. Dev., v.33, p.269-282, 1993.
MIKI, H.; INOUE, K.; OGONUKI, N.; MOCHIDA, K.; NAGASHIMA, H.; BABA, T.; OGURA, A.Cytoplasmic Asters Are Required for Progression Past the First Cell Cycle in Cloned MouseEmbryos. Biol. Reprod., v.71, p.2022-2028, 2004.
82
MIYARA, F.; HAN, Z.; GAO, S.; VASSENA, R.; LATHAM, K.E. Non-equivalence of embryonic andsomatic cell nuclei affecting spindle composition in clones. Dev. Biol., v.289, p.206-217, 2006.
MIYASHITA, N.; SHIGA, K.; YONAI, M.; KANEYAMA, K.; KOBAYASHI, S.; KOJIMA, T.; GOTO, Y.;KISHI, M.; ASO, H.; SUZUKI, T.; SAKAGUCHI, M.; NAGAI, T. Remarkable differences in telomerelengths among cloned cattle derived from different cell types. Biol. Reprod., v.66, p.1649-1655,2002.
MIYAZAKI, S.; SHIRAKAWA, H.; NAKADA, K.; HONDA, Y. Essential role of the inositol 1-4-5-triphosphate receptor/Ca2+ release channel in Ca2+ -waves and Ca2+ oscillations at fertilization ofmammalian eggs. Dev. Biol., v.158, p.62-78, 1993.
MIYOSHI, K.; RZUCIDLO, S.J.; GIBBONS, J.R.; ARAT, S.; STICE, S.L. Development of porcineembryos reconstituted with somatic cells and enucleated metaphase I and II oocytes matured in aprotein-free medium. BMC Dev. Biol., .v.1, p.12, 2001.
MIYOSHI, K.; RZUCIDLO, S.J.; PRATT, S.L.; et al. Utility of rapidly matured oocytes as recipientsfor production of cloned embryos from somatic cells in the pig. Biol. Reprod., v.67, p.540–545,2002.
MONK, M.; BOUBELIK, M.; LEHNERT, S. Temporal and regional changes in DNA methylation inthe embryonic, extraembryonic and germ cell lineages during mouse embryo development.Development, v.99, p.371-382, 1987.
MOOR, R.M.; DAI, Y.; LEE, C.; FULKA Jr, J. Oocyte maturation and embryonic failure. Hum.Reprod. Update, v.4, p.223-236, 1998.
MOORE, T. Genetic conflict, genomic imprinting and establishment of the epigenotype in relation togrowth. Reproduction, v.122, p.185-193, 2001.
MOORE, T.; HAIG, D. Genomic imprinting in mammalian development: a parental tug-of-war.Trends Genet., v. 7, p.45-49, 1991.
MOREIRA, P.N.; ROBL, J.M.; COLLAS, P. Architectural defects in pronuclei of mouse nucleartransplant embryos. J. Cell Sci., v.116, p.3713-3720, 2003.
MURPHY, S.K.; JIRTLE, R.L. Imprinting evolution and the price of silence. BioEssays, v. 25,p.577-588, 2003.
NAGAO, Y.; TOTSUKA, Y.; ATOMI, Y.; KANEDA, H.; LINDAHL, K.F.; IMAI, H.; YONEKAWA, H.Decreased physical performance of congenic mice with mismatch between the nuclear andmitochondrial genome. Genes Genet. Syst., v.73, p.21-27, 1998.
NAIMEH, L.G.; SCHUTTE, B.C.; HAMILTON, W.S.; TSALIKIAN, E. Ontogeny of the H19 gene insheep and effect of maternal fasting on its expression in the fetus. Endocr. Res., v.27, p.417-431,2001.
NAKADA, K.; MIZUNO, J. Intracellular calcium responses in bovine oocytes induced byspermatozoa and by reagents. Theriogenology, v.50, p.269-282, 1998.
NIEMANN, H.; WRENZYCKI, C.; LUCAS-HAHN, A.; BRAMBRINK, T.; KUES,W.A.; CARNWATH,J.W. Gene expression patterns in bovine in vitro-produced and nuclear transfer-derived embryosand their implications for early development. Cloning Stem Cells, v.4, p.29-38, 2002.
83
NIEMANN, H.; RATH, D.; WRENZYCKI, C. Advances in biotechnology: newtools in future pigproduction for agriculture and biomedicine. Reprod. Dom. Anim., v.38, p.82–89, 2003.
NURSE, P. Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature, v. 344, p.503-508,1990.
NUSSBAUM, D.J.; PRATHER, R.S. Differential effects of protein synthesis inhibitors on porcineoocyte activation. Mol. Reprod. Dev., v.41, p.70-75, 1995.
O’NEILL, G.T.; KAUFMAN, M.H. Cytogenetic analysis of ethanol induced parthenogenesis. J. Exp.Zool., v.249, p.182-192, 1989.
O’NEILL, G.T.; McDOUGALL, R.D.; KAUFMAN, M.H. Ultrastructural analysis of abnormalities in themorphology of the second meiotic splindle in ethanol-induced parthenogenones. Gam. Res., v.22,p.285-299, 1989.
O’NEILL, M.J.; INGRAM, R.S.; VRANA, P.B.; TILGHMAN, S.M. Allelic expression of IGF2 inmarsupials and birds. Dev. Genes Evol., v.210, p.18-20, 2000.
OBACK, B.; WELLS, D. Donor cells for nuclear cloning: many are called, but few are chosen.Cloning Stem Cells, v.4, p.147-168, 2002.
OBATA, Y.; KONO, T. Maternal primary imprinting is established at a specific time for each genethroughout oocyte growth. J. Biol. Chem., v.277, p.5285-5289, 2002.
OBATA, Y.; KANEKO-ISHINO. T.; KOIDE, T.; TAKAI, Y.; UEDA, T.; DOMEKI, I.; SHIROISHI, T.;ISHINO, F.; KONO, T. Disruption of primary imprinting during oocyte growth leads to the modifiedexpression of imprinted genes during embryogenesis. Development, v.125, p.1553-1560, 1998.
OBATA, Y.; KONO, T.; HATADA, I. Gene silencing: maturation of mouse fetal germ cells in vitro.Nature, v.418, p.497, 2002.
OGAWA, H.; ONO, Y.; SHIMOZAWA, N.; SOTOMARU, Y.; KATSUZAWA, Y.; HIURA, H.; ITO, M.;KONO, T. Disruption of imprinting in cloned mouse fetuses from embryonic stem cells.Reproduction, v.126, p.549-557, 2003.
OGURA, A.; INOUE, K.; OGONUKI, N.; NOGUCHI, A.; TAKANO, K.; NAGANO, R.; SUZUKI, O.;LEE, J.; ISHINO, F.; MATSUDA, J. Production of male cloned mice from fresh, cultured, andcryopreserved immature Sertoli cells. Biol. Reprod., v.62, p.1579-1584, 2000a.
OGURA, A.; INOUE, K.; TAKANO, K.; WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Birth of mice afternuclear transfer by electrofusion using tail tip cells. Mol. Reprod. Dev., v.57, p.:55-59, 2000b.
OGURA, A.; INOUE, K.; OGONUKI, N. Phenotypic effects of somatic cell cloning in the mouse.Cloning Stem Cells, v.4, p.397–405, 2002.
OHGANE, J.; WAKAYAMA, T.; KOGO, Y.; SENDA, S.; HATTORI, N.; TANAKA, S.;YANAGIMACHI, R.; SHIOTA, K. DNA methylation variation in cloned mice. Genesis, v.30, p.45-50,2001.
ONISHI, A.; IWAMOTO, M.; AKITA, T.; MIKAWA, S.; TAKEDA, K.; AWATA, T.; HANADA, H.;PERRY, A.C.F. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science, v.289, p.1188-1190,2000.
84
ONO, Y.; SHIMOZAWA, N.; ITO, M.; KONO, T. Cloned mice from fetal fibroblast cells arrested atmetaphase by a serial nuclear transfer. Biol. Reprod., v.64, n.1, p.44-50, 2001.
OSWALD, J.; ENGEMANN, S.; LANE, N.; MAYER, W.; OLEK, A.; FUNDELE, R.; DEAN, W.; REIK,W.; WALTER, J. Active demethylation of the paternal genome in the mouse zygote. Curr. Biol.,v.10, p.475-478, 2000.
OZIL, J.P.; HEYMAN, Y.; RENARD, J.P. Production of monozygotic twins by micromanipulation andcervical transfer in the cow. Vet. Rec., v.110, p.126-127, 1982.
PACE, M.M.; AUGENSTEIN, M.L.; BATTHAUSER, J.M.; CHILDS, L.A.; EILERTSEN, K.J.; ENOS,J.M.; FORSBERG, E.J.; GOLUEKE, P.J.; GRABER, D.F.; KEMPER, J.C.; KOPPANG, R.W.;LANGE, G.; LESMEISTER, T.L.; MALLON, K.S.; MELL, G.D.; MISICA, P.M.; GENSKOW, M.P.;STRELCHENKO, N.S.; VOELKER, G.R.; WATT, S.R. Ontogeny of cloned cattle to lactation. Biol.Reprod., v.67, p.334-339, 2002.
PALERMO, G.D.; COHEN, J.; ALIKANI, M.; et al. Intracytoplasmic sperm injection: a noveltreatment for all forms of male factor infertility. Fertil. Steril., v.63, p.1231-1240, 1995.
PARK, K.W.; LAI, L.; CHEONG, H.T.; CABOT, R.; SUN, Q.Y.; WU, G.; RUCKER, E.B.; DURTSCH,D.; BONK, A.; SAMUEL, M.; RIEKE, A.; DAY, B.N.; MURPHY, C.N.; CARTER, D.B.; PRATHER,R.S. Mosaic gene expression in nuclear transferderived embryos and the production of clonedtransgenic pigs from ear-derived fibroblasts. Biol. Reprod., v.66, p.1001-1005, 2002.
PATERSON, L.; DE SOUSA, P.; RITCHIE, W.; KING, T.; WILMUT, I. Application of reproductivebiotechnology in animals: implications and potentials. applications of reproductive cloning. Anim.Reprod. Sci., v.79, p.137-143, 2003.
PESCE, M.; SCHOLER, H.R. Oct-4: gatekeeper in the beginnings of mammalian development.Stem Cells, v.19, p.271-278, 2001.
PEURA, T.T.; LEWIS, I.M.; TROUNSON, A.O. The effect of recipient oocyte volume on nucleartransfer in cattle. Mol. Reprod. Dev., v.50, p.185-191, 1998.
PIEDRAHITA, J.A. Targeted modification of the domestic animal genome. Theriogenology, v.53,p.105-116, 2000.
POLEJAEVA, I.A.; CAMPBELL, K.H.S. New advances in somatic cell nuclear transfer: applicationin transgenesis. Theriogenology, v.53, p.117-126, 2000.
POLEJAEVA, I.A.; CHEN, S-H.; VAUGHT, T.D.; PAGE, R.L.; MULLINS, J.; BALL, S.; DAI, Y.;BOONE, J.; WALKER, S.; AYARES, D.L.; COLMAN, A.; CAMPBELL, K.H.S. Cloned pigs producedby nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, v.407, p.505-509, 2000.
PRATHER, R.S.; BARNES, F.L.; SIMS, M.M.; ROBL, J.M.; EYESTONE, W.H.; FIRST, N.L. Nucleartransfer in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte. Biol. Reprod.,v.37, p.859-866, 1987.
PRATHER, R.S.; SIMS, M.M.; MAUL, G.G.; FIRST, N.L.; SCHATTEN, G. Nuclear laminin antigensare developmentally regulated during porcine and bovine early embryogenesis. Biol. Reprod., v.41,p.123-132, 1989a.
PRATHER, R.S.; SIMS, M.M.; FIRST, N.L. Nuclear transplantation in early pig embryos. Biol.Reprod.,v.41, p.414-419, 1989b.
85
PRATHER, R.S.; KUBIAK, J.; MAUL, G.G.; FIRST, N.L.; SCHATTEN, G. The expression of nuclearlamin A and C epitopes is regulated by the developmental stage of the cytoplasm in mouse oocytesor embryos. J. Exp. Zool., v.257, p.110-114, 1991.
PRESICCE, G.A.; YANG, X. Parthenogenetic development of bovine oocytes matured in vitro for 24hr and activated by ethanol and cycloheximide. Mol. Reprod. Dev., v.38, p.380-385, 1994.
PTAK, G.; CLINTON, M.; TISCHNER, M. Improving delivery and offspring viability of in vitro–produced and cloned sheep embryos. Biol. Reprod., v.67, p.1719-1725, 2002.
RACHMILEWITZ, J.; GOSHEN, R.; ARIEL, I.; SCHNEIDER, T.; DE GROOT, N.; HOCHBERG, A.Parental imprinting of the human H19 gene. FEBS Lett., v.309, p.25-28, 1992.
RAVELICH, S.R.; BREIER, B.H.; REDDY, S.; KEELAN, J.A.; WELLS, D.N.; PETERSON, A.J.; LEE,R.S.F. Insulin-like growth factor-I and binding proteins 1,2 and 3 in bovine nuclear transferpregnancies. Biol. Reprod., v.70, p.430-438, 2004a.
RAVELICH, S.R.; SHELLING. A.N.; RAMACHANDRAN, A.; REDDY. S.; KEELAN, J.A.; WELLS,D.N.; PETERSON, A.J.; LEE, R.S.; BREIER, B.H. Altered Placental Lactogen and LeptinExpression in Placentomes from Bovine Nuclear Transfer Pregnancies. Biol. Reprod., v.71,p.1862-1869, 2004b.
RAVELICH, S.R.; SHELLING. A.N.; WELLS, D.N.; PETERSON, A.J.; LEE, R.S.F. Expression ofT GF-â1, T GF-â2, T GF-â3 and the receptors T GF-âR1 and T GF-âRII in placentomes of artificiallyinseminated and nuclear transfer derived bovine pregnancies. Placenta, v.27, p.307-316, 2006.
REIK, W.; DEAN, W.; WALTER, J. Epigenetic reprogramming in mammalian development.Science, v.293, 1089-1093, 2001.
REIK, W.; WALTER, J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. Nat. Rev. Genet.,v.2, p.21-32, 2001.
REIK, W.; CONSTANCIA, M.; FOWDEN, A.; ANDERSON, N.; DEAN, W.; FERGUSON-SMITH, A.;TYCKO, B.; SIBLEY, C. Regulation of supply and demand for maternal nutrients in mammals byimprinted genes. J. Physiol., v.547, p.35-44, 2003.
RENARD, J.P.; CHASTANT, S.; CHESNÉ, P.; RICHARD, C.; MARCHAL, J.; CORDONNIER, N.;CHAVATTE, P.; VIGNON, X. Lymphoid hypoplasia and somatic cloning. The Lancet, v.353,p.1489-1491, 1999.
RENARD, J.P.; ZHOU, Q.; LEBOURHIS, D.; CHAVATTE-PALMER, P.; HUE, I.; HEYMAN, Y.;VIGNON, X. Nuclear transfer technologies: between successes and doubts. Theriogenology, v.57,p.203-222, 2002.
RICHARDS, E.J.; ELGIN, S.C. Epigenetic codes for heterochromatin formation and silencing:rounding up the usual suspects. Cell, v.108, p.489-500, 2002.
RIDEOUT III, W.M.; EGGAN, K.; JAENISCH, R. Nuclear cloning and epigenetic reprogramming ofthe genome. Science, v.293, 1093-1098, 2001.
ROBL, J.M. Development and application of technology for large scale cloning of cattle.Theriogenology, v.51, p.499-508, 1999.
86
ROCHA, J.C.M.C.; TONHATI, H.; ALENCAR, M.M.; LÔBO, R.B. Genetic parameters estimates forgestation length in beef cattle. Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.57, p.784-791, 2005.
ROUGIER, N.; BOURC'HIS, D.; GOMES, D.M.; NIVELEAU, A.; PLACHOT, M.; PALDI, A.;VIEGAS-PEQUIGNOT, E. Chromosome methylation patterns during mammalian preimplantationdevelopment. Genes Dev., v.12, p.2108-2113, 1998.
RUNGE, S.; NIELSEN, F.C.; NIELSEN, J.; LYKKE-ANDERSEN, J.; WEWER, U.; CHRISTIANSEN,J. H19 RNA binds four molecules of insulin-like growth factor II mRNA-binding protein. J. Biol.Chem., v.275, p.29562-29569, 2000.
RUSSELL, D.F.; IBANEZ, E.; ALBERTINI, D.F.; OVERSTROM, E.W. Activated bovine cytoplastsprepared by demecolcine-induced enucleation support development of nuclear transfer embryos invitro. Mol. Reprod. Dev., v.72, p.161-170, 2005.
SAMAKÉ, S.; SMITH, L.C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced invitro: effects of nocodazole. Mol. Reprod. Dev., v.44, p.486-492, 1996.
SAMAKÉ, S.; SMITH, L.C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced invitro: effects of 6-dimethylaminopurine. J. Reprod. Fert., v.110, p.21-27, 1997a.
SAMAKÉ, S.; SMITH, L.C. Synchronization of cell division in eight-cell bovine embryos produced invitro: effects of aphidicolin. Theriogenology, v.48, p.969-976, 1997b.
SANTOS, F.; HENDRICH, B.; REIK, W.; DEAN, W. Dynamic reprogramming of DNA methylation inthe early mouse embryo. Dev. Biol., v.241, p.172-182, 2002.
SANTOS, F.; ZAKHARTCHENKO, V.; STOJKOVIC, M.; PETERS, A.; JENUWEIN, T.; WOLF, E.;REIK, W.; DEAN, W. Epigenetic marking correlates with developmental potential in cloned bovinepreimplantation embryos. Curr. Biol., v.13, p.1116-1121, 2003.
SASAKI, H.; FERGUSON-SMITH, A.C.; SHUM, A.S.W.; BARTON, S.C.; SURANI, M.A. Temporaland spatial regulation of H19 imprinting in normal and uniparental mouse embryos. Development,v.121, p.4195-4202, 1995.
SENDA, S.; WAKAYAMA, T.; YAMAZAKI, Y.; OHGANE, J.; HATTORI, N.; TANAKA, S.;YANAGIMACHI, R.; SHIOTA, K. Skewed X-inactivation in cloned mice. Bioch. Bioph. Res.Comm., v.321, p.38-44, 2004.
SHI, W.; ZAKHARTCHENKO, V.; WOLF, E. Epigenetic reprogramming in mammalian nucleartransfer. Differentiation, v.71, p.91-113, 2003.
SHI, W.; DIRIM, F.; WOLF, E.; ZAKHARTCHENKO, V.; HAAF, T. Methylation reprogramming andchromosomal aneuploidy in in vivo fertilized and cloned rabbit preimplantation embryos. Biol.Reprod., v.71, v.340-347, 2004.
SHIELS, P.G.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.; WADDINGTON, D.; WILMUT, I.; COLMAN, A. .;SCHNIEKE, A.E. Analysis of telomere lengths in cloned sheep. Nature, v.399, p.316-317, 1999a.
SHIELS, P.G.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.S.; WILMUT, I.; WADDINGTON, D.; COLMAN, A.;SCHNIEKE, A.E. Analysis of telomere length in Dolly, a sheep derived by nuclear transfer.Cloning, v.1, p.119-125, 1999b.
87
SHIN, T.; KRAEMER, D.; PRYOR, J.; LIU, L.; RUGILA, J.; HOWE, L.; BUCK, S.; MURPHY, K.;LYONS, L.; WESTHUSIN, M. A cat cloned by nuclear transplantation. Nature, v.415, p.859, 2002.
SHIOTA, K.; YANAGIMACHI, R. Epigenetics by DNA methylation for development of normal andcloned animals. Differentiation, v.69, p.162-166, 2002.
SIBLEY, C.P.; COAN, P.M.; FERGUSON-SMITH, A.C.; DEAN, W.; HUGHES, J.; SMITH, P., et al.Placental-specific Igf-2 regulates the diffusional exchange characteristics of the mouse placenta.Proc. Natl. Acad. Sci., v.101, p.8204-8208, 2004.
SIMERLY, C.; DOMINKO, T.; NAVARA, C.; PAYNE, C.; CAPUANO, S.; GOSMAN, G.; CHONG,K.Y.; TAKAHASHI, D.; CHACE, C.; COMPTON, D.; HEWITSON, L.; SCHATTEN, G. Molecularcorrelates of primate nuclear transfer failures. Science, v.300, p.297, 2003.
SIMERLY, C.; NAVARA, C.; HYUN, S.H.; LEE, B.C.; KANG, S.K.; CAPUANO, S.; GOSMAN, G.;DOMINKO, T.; CHONG, K.Y.; COMPTON, D.; HWANG, W.S.; SCHATTEN, G. Embryogenesis andblastocyst development after somatic cell nuclear transfer in nonhuman primates: overcomingdefects caused by meiotic spindle extraction. Dev. Biol., v.276, p.237–252, 2004.
SIMS, M.; FIRST, N.L. Production of calves by nuclear transfer of nuclei from cultured inner cellmass cells. Proc. Natl. Acad. Sci., v.91, p.6143-6147, 1994.
SINGH, U.; FOHN, L.E.; WAKAYAMA, T., Different molecular mechanisms underlie placentalovergrowth phenotypes caused by interspecies hybridization, cloning, and Esx1 mutation. Dev.Dyn., v.230, p.149-164, 2004.
SLIMANE-BUREAU, W.C.; KING, W.A. Chromosomal abnormalities: a potential quality issue forcloned cattle embryos. Cloning and Stem Cells, v.4, p.319-329, 2002.
SMITH, L.C. Membrane and intracellular effects of ultraviolet irradiation with Hoechst 33342 onbovine secondary oocytes matured in vitro. J. Reprod.Fert., v.99, p.39-44, 1993.
SMITH, L.C.; ALCIVAR, A.A. Cytoplasmic inheritance and its effects on development andperformance. J. Reprod. Fert. Supplement, v.48, p.31-43, 1993.
SMITH, L.C.; BORDIGNON, V.; BABKINE, M.; FECTEAU, G.; KEEFER, C. Benefits and problemswith cloning animals. Can. Vet. J., v.41, p.919-924, 2000a.
SMITH, L.C.; BORDIGNON, V.; GARCIA, J.M.; MEIRELLES, F.V. Mitochondrial genotypesegregation and effects during mammalian development: applications to biotechnology.Theriogenology, v.53, p.35-46, 2000b.
SOLTER, D. Differencial imprinting and expression of maternal and paternal genomes. Annu. Rev.Genet., v.22, p.127-146, 1988.
SOLTER, D. Mammalian cloning: advances and limitations. Nat. Rev. Genet., v.1, p.199-207, 2000.
SOOD, R.; ZEHNDER, J.L.; DRUZIN, M.L.; BROWN, P.O. Gene expression patterns in humanplacenta. Proc. Natl. Acad. Sci., v.103, p.5478-5483, 2006.
SPAHN, L.; BARLOW, D.P. An ICE pattern crystallizes. Nature Genet., v.35, p.11-12, 2003.
SPEEMANN, H. ‘Embryonic Development and Induction’. 1938. Yale University Press: NewHaven, Conn.
88
SPIELMAN, M.; VINKENOOG, R.; DICKINSON, H.G.; SCOTT, R.J. The epigenetic basis of genderin flowering plants and mammals. Trends Genet., v.17, p.705-711, 2001.
SPINDLE, A. Polyethylene glycol-induced fusion of two-cell mouse blastomeres. Exp. Cell Res.,v.131, p.465-470, 1981.
STICE, S.L.; ROBL, J.M. Nuclear reprogramming in nuclear transplant rabbit embryos. Biol.Reprod., v.39, p.657-664, 1988.
STOGER, R.; KUBICKA, P.; LIU, C.G.; KAFRI, T.; RAZIN, A.; CEDAR, H.; BARLOW, D.P.Maternal-specific methylation of the imprinted mouse Igf2r locus identifies the expressed locus ascarrying the imprinting signal. Cell, v.73, p.61-71, 1993.
SULLIVAN, E.J.; KASINATHAN, S.; KASINATHAN, P.; ROBL, J.M.; COLLAS, P. Cloned calvesfrom chromatin remodeled in vitro. Biol. Reprod., v.70, p.146-153, 2004.
SURANI, M.A.H.; BARTON, S.C.; NORRIS, M.L. Development of reconstituted mouse eggssuggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature, v.308, p.548-550, 1984.
SURANI, M.A.H.; REIK, W.; NORRIS, M.L. Influence of germline modifications of homologouschromosomes on mouse development. J. Embryol. Exp. Morphol., v.97(suppl.), p.123-146, 1986.
SZABO, P.E.; MANN, J.R. Biallelic expression of imprinted genes in the mouse germ line:implications for erasure, establishment, and mechanisms of genomic imprinting. Genes Dev., v.9,p.1857-1868, 1995.
SZABO, P.E.; HUBNER, K.; SCHOLER, H.; MANN, J.R. Allele-specific expression of imprintedgenes in mouse migratory primordial germ cells. Mech. Dev., v.115, p. 157-160, 2002.
TAKEDA, K.; TAKAHASHI, S.; ONISHI, A.; GOTO, Y.; MIYAZAWA, A.; IMAI, H. Dominantdistribution of mitochondrial DNA from recipient oocytes in bovine embryos and offspring afternuclear transfer. J. Reprod. Fert., v.116, p.253-259, 1999.
TAMASHIRO, K.L.; WAKAYAMA, T.; BLANCHARD, R.J.; BLANCHARD, D.C.; YANAGIMACHI, R.Postnatal growth and behavioral development of mice cloned from adult cumulus cells. Biol.Reprod., v.62, p.1579-1584, 2000.
TAMASHIRO, K.L.; WAKAYAMA, T.; AKUTSU, H.; YAMAZAKI, Y.; LACHEY, J.L.; WORTMAN,M.D.; SEELEY, R.J.; D’ALESSIO, D.A.; WOODS, S.C.; YANAGIMACHI, R.; SAKAI, R.R. Clonedmice have an obese phenotype not transmitted to their offspring. Nat. Med., v.8, p.262-267, 2002.
TAMASHIRO, K.L.; WAKAYAMA, T.; YAMAZAKI, Y.; AKUTSU, H.; WOODS, S.C.; KONDO, S.;YANAGIMACHI, R.; SAKAI, R.R. Phenotype of cloned mice: development, behavior, andphysiology. Exp. Biol. Med., v.228, p. 1193-1200, 2003.
TANAKA, H; KANAGAWA, H. Influence of combined activation treatments on the success of bovinenuclear transfer using young or aged oocytes. Anim. Reprod. Sci., v.49, p.113-123, 1997.
TANAKA, S.; ODA, M.; TOYOSHIMA, Y.; WAKAYAMA, T.; TANAKA, M.; YOSHIDA, N.; HATTORI,N.; OHGANE, J.; YANAGIMACHI, R.; SHIOTA, K. Placentomegaly in cloned mouse concepticaused by expansion of the spongiotrophoblast layer. Biol. Reprod., v.65, p.1813-1821, 2001.
89
TANI, T.; KATO, Y.; TSUNODA, Y. Direct exposure of chromosomes to nonactivated ovumcytoplasm is effective for bovine somatic cell nucleus reprogramming. Biol. Reprod., v.64, p.324-330, 2001.
TATHAM, B.G.; DOWSING, A.T.; TROUNSON, A.O. Enucleation by centrifugation of in vitro-matured bovine oocytes for use in nuclear transfer. Biol. Reprod., v.53, p.1088-1094, 1995.
THIBAULT C. Recent data on the development of cloned embryos derived from reconstructed eggswith adult cells. Reprod. Nutr. Dev., v.43, p.303-324, 2003
THOMPSON, J.G. Defining the requirements for bovine embryo culture. Theriogenology, v.45,p.27-40, 1996.
THOMPSON, J.G. In vitro culture and embryo metabolism of cattle and sheep embryos - a decadeof achievement. An. Reprod. Sci., v.60-61, p.263-275, 2000.
THOMPSON, J.G.E.; SIMPSON, A.C.; PUGH, P.A.; DONNELLY, P.E.; TERVIT, H.R. Effect ofoxygen concentration on in-vitro development of preimplantation sheep and cattle embryos. J.Reprod. Fert., v.89, p.573-578, 1990.
THORVALDSEN, J.L.; DURAN, K.L.; BARTOLOMEI, M.S. Deletion of the H19 differentiallymethylated domain results in loss of imprinted expression of H19 and Igf2. Genes Dev., v.1,p.3693-3702, 1998.
TODER, R.; WILCOX, S.A.; SMITHWICK, N.; GRAVES, J.A. The human/mouse imprinted genesIGF2, H19, SNRPN and ZNF127 map to two conserved autosomal clusters in marsupial.Chromosome Res., v.4, p.295-300, 1996.
TUCKER, K.L.; BERAD, C.; SAYSMANN, J., JACKSON-GRUSBY, L.; LAIRD, P.W.; LEI, H.; LI, E.;JAENISCH, R. Germ-line passage is required for establishment of methylation and expressionpatterns of imprinted but not of nonimprinted genes. Gen. Dev., v.10, p.1008-1020, 1996.
UEDA, T.; YAMAZAKI. K.; SUZUKI, R.; FUJIMOTO, H.; SASAKI, H.; SAKAKI, Y.;HIGASHINAKAGAWA, T. Parental methylation patterns of a transgenic locus in adult somatictissues are imprinted during gametogenesis. Development, v.116, p.831-839, 1992.
UEDA, T.; ABE, K.; MIURA, A.; YUZURIHA, M.; ZUBAIR, M.; NOGUCHI, M.; NIWA, K.; KAWASW,Y.; KONO, T.; MATSUDA, Y.; FUJIMOTO, H.; SHIBATA, H.; HAYASHIZAKI, Y.; SASAKI, H. Thepaternal methylation imprint of the mouse H19 locus is acquired in the gonocyte stage during fotaltestis development. Genes Cells, v.5, p.649-659, 2000.
VAJTA, G.; LEWIS, I.M.; HYTTEL, P.; THOUAS, G.A.; TROUNSON, A.O. Somatic cell cloningwithout micromanipulators. Cloning, v.3, p.89-95, 2001.
VAJTA, G.; LEWIS, I.M.; TROUNSON, A.O.; PURUP, S.; MADDOX-HYTTEL, P.; SCHMIDT, M.;PEDERSEN, H.G.; GREVE, T.; CALLESEN, H. Handmade somatic cell cloning in cattle: analysis offactors contributing to high efficiency in vitro. Biol. Reprod., v.68, p.571-578, 2003.
VAN WAGTENDONK-DE LEEUW, A.M.; MULLAART, E.; DE ROOS, A.P.W.; MERTON, J.S.;DEN DAAS, J.H.G.; KEMP, B.; DE RUIGH, L. Effects of different reproduction techniques: AI,MOET or IVP, on health and welfare of bovine offspring. Theriogenology, v.53, p.575-597, 2000.
VARMUZA, S.; MANN, M. Genomic imprinting-defusinf the ovarian time bomb. Trends Genet.,v.10, p.118-123, 1994.
90
VERLHAC, M.H.; PENNART, H.; MARO, B.; COBB, M.H.; CLARKE, H.J. MAP Kinase becomesstably activated at metaphase and is associated with microtubule-organizing centers during meioticmaturation of mouse oocytes. Dev. Biol., v.158, p.330-340, 1993.
VERLHAC, M.H.; KUBIAK, J.Z.; CLARKE, H.J.; MARO, B. Microtubule and chromatin behaviorfollow MAP kinase activity but not MPF activity during in mouse oocytes. Development, v.120,p.1017-1025, 1994.
VERONA, R.I.; MANN, M.R.W.; BARTOLOMEI, M.S. Genomic imprinting: intricacies of epigeneticregulation in clusters. Annu. Rev. Cell Dev. Biol., v.19, p.237-259, 2003.
VIGNON, X.; CHESNE, P.; Le BOURHUIS, D.; FLECHOM J.E.; HEYMAN, Y.; RENARD, J.P.Development potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fusedwith cultured somatic cells. C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la vie/Life Sciences, v.321, p.735-745, 1998.
VOLPERT, O.; JACKSON, D.; BOUCK, N.; LINZER, D.I. The insulin-like growth factor II/mannose6-phosphate receptor is required for proliferatin-induced angiogenesis. Trends Genet., v.10,p.3871-3876, 1996.
WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Cloning of male mice from adult tail-tip cells. Nat. Genet.,v.22, p.127-128, 1999.
WAKAYAMA, T.; YANAGIMACHI, R. Effect of cytokinesis inhibitors, DMSO and the timing of oocyteactivation on mouse cloning using cumulus cell nuclei. Reproduction, v.233, p.49-60, 2000.
WAKAYAMA, T.; PERRY, A.C.F.; ZUCCOTTI, M.; JOHNSON, K.R.; YANAGIMACHI, R. Full-termdevelopment of mice enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, v.394, p.369-374, 1998.
WAKAYAMA, T.; RODRIGUEZ, I.; PERRY, A.C.F.; YANAGIMACHI, R.; MOMBAERTS, P. Micecloned from embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci., v.96, p.14984-14989, 1999.
WAKAYAMA. T.; SHINKAI, Y.; TAMASHIRO, K.L.; YANAGIMACHI, R. Cloning of mice to sixgenerations. Nature, v.407, p.318-319, 2000.
WAKAYAMA, T.; TABAR, V.; RODRIGUEZ, I.; PERRY, A.C.; STUDER, L.; MOMBAERTS, P.Differentiation of embryonic stem cell lines generated from adult somatic cells by nuclear transfer.Science, v.292, p. 740-743, 2001.
WELLS, D.N. Animal cloning: current progress, challenges and future prospects. Rev. Bras.Reprod. Anim., v.23, n.2, 86-97, 1999.
WELLS, D,N.; FORSYTH, J.T.; MCMILLAN, V.; OBACK, B. The health of somatic cell cloned cattleand their offspring. Cloning Stem Cells, v.6, p.101-110, 2004.
WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; TERVIT, H.R.; VIVANCO, W.H. Adult somatic cell nuclear transfer isused to preserve the last surviving cow of the Enderby Island cattle breed. Reprod. Fert. Dev.,v.10, p.369-378, 1998.
WELLS, D.N.; MISICA, P.M.; TERVIT, H.R. Production of cloned calves following nuclear transferwith cultured adult mural granulosa cells. Biol. Reprod., v.60, p.996-1005, 1999.
91
WESTHUSIN, M.E.; COLLAS, P.; MAREK, D.; SULLIVAN, E.; STEPP, P.; PRYOR, J.; BARNES, F.Reducing the amount of cytoplasm available for early embryonic development decreases the qualitybut not quantity of embryos produced by in vitro fertilization and nuclear transplantation.Theriogenology, v.46, p.243-252, 1996.
WESTHUSIN, M.E.; LONG, C.R.; SHIN, T.; HILL, J.R.; LOONEY, C.R.; PRYOR, J.H.;PIEDRAHITA, J.A. Cloning to reproduce desired genotypes. Theriogenology, v.55, p.35-49, 2001.
WHITE, K.L.; BUNCH, T.D.; MITALIPOV, S.; REED, W.A. Establishment of pregnancy after transferof nuclear transfer embryos produced from fusion of Argali (Ovis ammon) nuclei into domesticsheep (Ovis aries) enucleated oocytes. Cloning, v.1, p.47-54, 1999.
WILLADSEN, S.M. A method for culture of micromanipulated sheep embryos and its use to producemonozygoytic twins. Nature, v.277, p.298-300, 1979.
WILLADSEN, S.M. The viability of early cleavage stages containing half the normal number ofblastomeres in the sheep. J. Reprod. Fert., v.59, 357-362, 1980.
WILLADSEN, S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature, v.320, p.63-65, 1986.
WILMUT, I.; SCHNIEKE, A.E.; McWHIR, J.; KIND, A.J.; CAMPBELL, K.H.S. Viable offspringderived from fetal and adult mammalian cells. Nature, v.385, p.810-813, 1997.
WOODS, G.L.; WHITE, K.L.; VANDERWALL, D.K.; LI, G.P.; ASTON, K.I.; BUNCH, T.D.; MEERDO,L.N.; PATE, B.J. A mule cloned from fetal cells by nuclear transfer. Science, v.301, p.1063, 2003.
WRENZYCKI, C.; WELLS, D.; HERRMANN, D.; MILLER, A.; OLIVER, J.; TERVIT, R.; NIEMANN,H. Nuclear transfer protocol affects messenger RNA expression patterns in cloned bovineblastocysts. Biol. Reprod., v.65, p.309-317, 2001.
WRENZYCKI, C.; LUCAS-HAHN, A.; HERRMANN, D.; LEMME, E.; KORSAWE, K.; NIEMANN, H.In vitro production and nuclear transfer affect dosage compensation of the X-linked gene transcriptsG6PD, PGK, and Xist in preimplantation bovine embryos. Biol. Reprod., v.66, p.127-134, 2002.
WUTZ, A.; SMRZKA, O.W.; SCHWEIFER, N.; SCHELLANDER, K.; WAGNER, E.F.; BARLOW,D.P. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. Nature, v.389,p.745-749, 1997.
XUE, F.; TIAN, X.C.; DU, F.; KUBOTA, C.; TANEJA, M.; DINNYES, A.; DAI, Y.; LEVINE, H.;PEREIRA, L.V.; YANG, X. Aberrant patterns of X chromosome inactivation in bovine clones. Nat.Genet., v.31, p.216-220, 2002.
YAMAZAKI, W. Clonagem em bovinos utilizando-se células somáticas de animais adultos:avaliação comparativa da reconstituição de citoplastos pelas técnicas de transferêncianuclear e injeção nuclear intracitoplasmática. 2001. 132f. Dissertação (Mestrado em MedicinaVeterinária) – Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista,Jaboticabal, 2001.
YAMAZAKI, W.; FERREIRA, C.R.; MEO, S.C.; LEAL, C.L.; MEIRELLES, F.V.; GARCIA, J.M. Useof strontium in the activation of bovine oocytes reconstructed by somatic cell nuclear transfer.Zygote, v.13, p.295-302, 2005.
92
YAMAZAKI, W.; MEIRELLES, F.V.; BORDIGNON, V.; GARCIA, J.M.; SMITH, L.C. Effect ofmitochondrial DNA (mtDNA) on nucleocytoplasmic interaction of mouse embryos reconstituted bycytoplast transfer. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDDE BRASILEIRA DE TECNOLOGIA DEEMBRIÕES, 26, Campos do Jordão, 1999. Arq. Fac. Vet. UFRGS , Porto Alegre - RS, v. 27(Supl.), n. 1, p. 310, 1999.
YANAGIMACHI R. Cloning: experience from the mouse and other animals. Mol. Cell Endocrinol.,v.187, p.241-248, 2002.
YANG, L.; CHAVATTE-PALMER, P.; KUBOTA, C.; O'NEILL, M.; HOAGLAND, T.; RENARD, J.P.;TANEJA, M.; YANG, X.; TIAN, X.C. Expression of imprinted genes is aberrant in deceasednewborn cloned calves and relatively normal in surviving adult clones. Biol. Reprod., v.71, p.431-438, 2005.
YASSEN, M.A.; WRENZYCKI, C.; HERRMANN, D.; CARNWATH, J.W.; NIEMANN, H. Changes inthe relative abundance of mRNA transcripts for insulin0lie growth factor (IFG-I and IGF-II) ligandsand their receptors (IGF-IR/IGR-IIR) in preimplantation bovine embryos derived from different invitro systems. Reproduction, v.122, p. 601-610, 2001.
YIN, X.J.; KATO, Y.; TSUNODA, Y. Effect of enucleation procedures and maturation conditions onthe development of nuclear-transferred rabbit oocytes receiving male fibroblast cells.Reproduction, v.124, p.41-47, 2002a.
YIN, X.J.; TANI, T.; YONEMURA, I.; KAWAKAMI, M.; MIYAMOTO, K.; HASEGAWA, R.; ATO, Y.;TSUNODA, Y. Production of cloned pigs from adult somatic cells by chemically assisted removal ofmaternal chromosomes. Biol. Reprod., v.67, p.442-446, 2002b.
YIN, X.J.; LEE, H.S.; LEE, Y.H.; SEO, Y.I.; JEON, S.J.; CHOI, E.G.; CHO, S.J.; CHO, S.G.; MIN,W.; KANG, S.K.; HWANG, W.S.; KONG, I.K. Cats cloned from fetal and adult somatic cells bynuclear transfer. Reproduction, v.129, p.245-249, 2005.
YONG, Z.; YUQIANG, L. Nuclear-cytoplasmic interaction and development of goat embryosreconstructed by nuclear transplantation: production of goats by serially cloning embryos. Biol.Reprod., v.58, p.266-269, 1998.
YOUNG, L.E.; BEAUJEAN, N. DNA methylation in the preimplantation embryo: the differing storiesof the mouse and sheep. An. Reprod. Sci., v.82, p.61-78, 2004.
YOUNG, L.E.; SINCLAIR, K.D.; WILMUT, I. Large offspring syndrome in cattle and sheep. Rev.Reprod., v.3, p.155-163, 1998.
YOUNG, L.E.; FERNANDES, K.; MCEVOY, T.G.; BUTTERWITH, S.C.; GUTIERREZ, C.G.;CAROLAN, C.; BROADBENT, P.J.; ROBINSON, J.J.; WILMUT, I.; SINCLAIR, K.D. Epigeneticchange in IGF2R is associated with fetal overgrowth after sheep embryo culture. Nat. Genet., v.27,p.153-154, 2001.
YOUNG, L.E.; SCHNIEKE, A.E.; MCCREATH, K.J.; WIECKOWSKI, S.; KONFORTOVA, G.;FERNANDES, K.; PTAK, G.; KIND, A.J.; WILMUT, I.; LOI, P.; FEIL, R. Conservation of IGF2-H19and IGF2R imprinting in sheep: Effects of somatic cell nuclear transfer. Mech. Dev., v.120, p.1433-1442, 2003.
ZHANG, S.; KUBOTA, C.; YANG, L.; ZHANG, Y.; PAGE, R.; O’NEILL, M.; YANG, X.; TIAN, X.C.Genomic Imprinting of H19 in Naturally Reproduced and Cloned Cattle. Biol. Reprod., v.71, p.540-1544, 2004.
93
ZHONG, Z.S.; ZHANG, G.; MENG, X.Q.; ZHANG, Y.L.; CHEN, D.Y.; SCHATTEN, H.; SUN, Q.Y.Function of donor cell centrosome in intraspecies and interspecies nuclear transfer embryos. Exp.Cell Res., v.306, p.35-46, 2005.
94
ZHOU, Q.; BOULANGER, L.; RENARD, J.P. A simplified method for the reconstruction of fullycompetent mouse zygotes from adult somatic donor nuclei. Cloning, v.2, p.35-44, 2000.
ZHOU, Q.; RENARD, J.P.; LE FRIEC, G.; BROCHARD, V.; BEAUJEAN, N.; CHERIFI, Y.;FRAICHARD, A.; COZZI, J. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation.Science, v.302, p.1179, 2003.
ZOU, X.; CHEN, Y.; WANG ,Y.; LUO, J.; ZHANG, Q.; ZHANG, X.; YANG, Y.; JU, H.; SHEN, Y.;LAO, W.; XU, S.; DU, M. Production of cloned goats from enucleated oocytes injected with cumuluscell nuclei or fused with cumulus cells. Cloning, v.3, p.31-37, 2001.
![[Maths] 4.6.1 Derivadas.Problemas](https://img.pdfslide.tips/doc/110x75/577d38571a28ab3a6b97a052/maths-461-derivadasproblemas.jpg)
