ETEROCROMATIZZAZIONE COME MECCANISMO REGOLATIVOES.= GENI OMEOTICI DI D. melanogaster.

Geni Omeotici:Complesso Antennapedia

Il fenotipo mutante in questigeni è quello in cui si sviluppanole zampe al posto delle antenne

Geni Omeotici:Complesso Bithorax

Il fenotipo mutante in questi geni è quello di un doppio torace

Proteine del gruppo Polycomb e Tritorax

PcG e Trx sono regolatori dei Geni Omeotici. Mutazioni in PcG comportano l’espressione di ANT e BX anche in tessuti dove di solito sono repressi.

•Queste proteine forniscono un modello chiave per il mantenimento degli stati cromatinici legati all’espressione genica.•PcG e Trx mantengono i pattern spaziali dell’espressione dei geni Hox, che vengono stabiliti inizialmente nell’embrione precoce a carico dei geni della segmentazione.•In stadi più avanzati dell’embriogenesi, i geni della segmentazione decadono e PcG e Trx assumono il controllo.

In generale:•PcG sono repressori e mantengono lo stato “off”•Trx sono attivatori e mantengono la trascrizione, cioè lo stato “on”

Recentemente è stato mostrato il coinvolgimento delle proteine dei gruppiPcG e Trx anche in altri processi:

•proliferazione cellulare•identità di cellule staminali•cancro•inprinting genomico nelle piante e nei mammiferi•inattivazione del cromosoma X

COMPLESSI PcG E TrxG

PcG Drosophila UomoPRC2 E(z) EZH2 Esc EED Su(var)12 SUZ12 N55 RpAp48 RpAp46PRC1 dRING RING1A Pc HPC1-3 Ph HPH1-3 Psc BMI1 Scm SCMH1-2 Fattori associati a TBPPhoRC dSfmbt ? Pho ?

TrxG Drosophila UomoSWI/SNF Brm BRM Osa BAF250 Moira BAF170 Snr1 BAF47NURF Iswi SNF2L N38 ? N301 BPTF N55 RpAp46 RpAp48TAC1 Trx dCBP SBF1Ash1 Ash1 dCBPMLL1-3 MLL1-3 WRD5 ASH2L RbBP5 CF1P

Geni ortologhi

Il reclutamento di PcG e TrxGcoinvolge segnali combinatoriali.

Varie proteine reclutano i complessi su PRE/TRE in maniera indipendente dallo stato di attivazione del gene.

Un segnale specifico dellosviluppo determina se il genedebba essere attivato o represso

H3K27me3 associata a deubiquitinazione diH2B

H3K4me3 associataa ubiquitinazione di H2B

Complessi PCR2: Tri-metilazionedi H3K27

Si localizzano sulle regionitrimetilate in K27, nelle mosche,in topo e nell’uomo.

Complessi Trx: Tri-metilazionedi H3K4

Si localizzano sulle regioni piùattive del genoma e arricchite in H3K4me3

UBX

Componenti di entrambi i gruppi interagiscono con elementi di sequenza

PRE = Polycomb response element

•Nello stato represso l’intero gene è trimetilato in H3K27

•Nello stato attivo questo segnale è presente in regioni a monte ma assente dal

promotore e dalle regioni codificanti.

•Nello stato attivo questo conduce al legame di Ash1 che induce immediata

trimetilazione di H3K4.

Trimetilazione di K27 interferiscecon met di K4 e ubiquitinazione di H2B.Forse ncRNAs partecipano al processo.Tipico di organismi che non hanno PCR1,tipo le piante.

K27me3 e PRC1 si espandono a partireda un PRE fino a un promotore vicino.Interferiscono con i complessi attivanticome SWI/SNF.dRING ubiquitina H2B, segnale negativo

Promotori lontani possono esseresilenziati in concomitanza con altriattraverso formazione di loop.

Il cromosoma X inattivo si distingue da quello attivo per molte caratteristiche:

•Distribuzione non casuale di varianti istoniche

•Modificazioni istoniche covalenti

•Ritardo della replicazione in fase S

•Associazione in cis con trascritti specifici per Xi (XIST). Questa è anche l’unica caratteristica esclusiva del cromosoma Xi, mentre le altre sono comuni anche ad altre frazioni eterocromatiche

Eterocromatina di Xi:

H3K9me2 + H3K27me3

segnali acquisiti durante l’inattivazione

EZH2 = human HMTase (omologa dell’enzima di Drosophila):è responsabile della metilazione di K27.

Non si conoscono ancora le metilasi specifiche per la dimetilazionedi K9 su Xi.

HP1 è fortemente arricchito su Xi. HP1 però lega normalmente H3K9me3 in vivo.

Esistono quindi su Xi caratteristiche comuni alla cromatina pericentricadella cui formazione HP1 è responsabile tramite il legame con H3K9me3?

Cellule RPE1 Cellule HME1

•In due linee cellulari diverse la forma H3K9me3 (verde) è presente•Questa e H3K27me3 (rosso) non sono distribuite casualmente

Altre evidenze:•Le bande arricchite in H3K27me3 presentano anche alti livelli di macroH2A (un’altra variante di H2A esclusiva del Xi). Questo sembra correlato con la presenza di una più alta densità nucleosomale.•Esistono due tipi distinti di eterocromatina sul Xi, di cui solo quella che presenta H3K9me2 ha anche la caratteristica della replicazione tardiva.•Analisi sul corpo di Barr (quindi in interfase) mostrano che H3K9me3 e H3K27me3 occupano territori distinti.•L’RNA XIST si associa chiaramente con H3K27me3 e non con H3K9me3.•Il territorio XIST/H3K27me3 è definito anche dalla presenza di macroH2A.•HP1 è presente ad alti livelli e associata a H3K9me3 + H4K20me3.

Modello proposto per duetipi di eterocromatinagiustapposti lungo il cromosomaX inattivo

I due territori sono chiaramenteseparati, sia sul cromosomametafasico (bandeggio) sia sul corpodi Barr (interfase) e sono caratterizzatida differenti combinazioni di modificazioni istoniche e proteineassociate.

XIST RNA + H3K27me3+ macroH2A

HP1 + H3K9me3 + H4K20me3

Telomeri

•Alle estremità dei cromosomi•Assicurano la Stabilità•Prevengono la degradazione delle estremità•Bloccano la fusione delle estremità cromosomali

Le strutture telomeriche sono evidenziabili alle estremità di tutti i cromosomi eucariotici, usando tecniche di fluorescenza.

SEQUENZE TELOMERICHE RIPETITIVE NEGLI EUCARIOTI

•In lievito le regioni subtelomeriche sono ricche in sequenze medio-lunghe ripetute un numero variabile di volte a seconda del ceppo.•Gli elementi X si trovano in tutti i telomeri si S. cerevisiae•Gli elementi Y’ possono essere presenti in numero da 0 a 4.•Questi elementi si muovono per ricombinazione e contribuiscono alla conservazione delle estremità.•In lievito mutanti est1- sono letali a causa dell’estremo accorciamento dei telomeri, ma possono essere recuperati tramite multiple inserzioni di elementi Y’.

I telomeri sono regioni estremamente resistenti alle nucleasi, quindi hanno una struttura cromatinica praticamente inaccessibile.

Questo è dovuto alla presenza di numerosi complessi proteici che ricoprono svariate funzioni telomeriche.

•Fattori che regolano la lunghezza dei telomeri, che hanno forti omologie nei lieviti e nell’uomo.•Fattori che si occupano del riparo del DNA e sono in grado di distinguere estremità sane da estremità rotte. Questi sono legati anche ai macchinari di replicazione.•Fattori che si associano alla telomerasi (sia nei lieviti che nell’uomo) e la coadiuvano nelle sue funzioni.

Nei lieviti il mantenimento della giusta lunghezza è assicurato dalla continua azione della Telomerasi

Questa è in grado di comunicare con alcune proteine che ricoprono le sequenze ripetute

Rap1Rif1/2Ku70/Ku80

La proteina Rap1 (POT1 nell’uomo) è effettivamente in grado di “contare” il numero di sequenze presenti e attivare o meno la telomerasi tramite proteine che comunicano con la telomerasi (Cdc13 in lievito, Pot1 nell’uomo)e si trovano proprio associate ad essa.

Proteine telomeriche in diversi organismiProteine telomeriche in diversi organismi

Modello del T-Loop inModello del T-Loop intelomeri umanitelomeri umanimediato da TRF1 e POT1mediato da TRF1 e POT1

Modello del T-loop: Proteine coinvolteModello del T-loop: Proteine coinvolte

ETEROCROMATINA TELOMERICA E DOMINI SUBTELOMERICI

Nucleosomiche contengonoHtz1

I domini HAST e HZAD contengonogeni a basso tasso di espressione, incondizioni di crescita normali.Vengono attivati in condizioni di crescitasfavorevoli.

ETEROCROMATINA TELOMERICA

Caratteristica generale: assenza di acetilazione e/o metilazione sui nucleosomi.L’attività deacetilasica principale è SIR2.

Specificità di SIR2:•H4K16 •H3 ed altri siti di H4 quando si trova nel complesso con SIR3 e SIR4

Se l’eterocromatina è disassemblata H3K4 e H3K79 vengono metilate, ma tale segnale sparisce con la riformazione dello stato eterocromatico.K4me viene rimosso attivamenteK79me viene diluito con i cicli replicativi

Est2p, TLC1

Est1p, Cdc13pNucleosoma

Rif1p, Rif2p Sir4p, Sir2p, Sir3p

Rap1p C1-3A/TG1-3

Rap1: centro di nucleazione dellacromatina telomerica.

Primo elemento reclutato da Rap1 èSir4.

Sir4 stabilizza la struttura legandoSir3 e Sir2

L’estensione della eterocromatinadipende da:•presenza del complesso SIR intatto•attività deacetilasica di Sir2•presenza di istoni H3 e H4 deacetilati

•Deacetilazione di H4K16 è fondamentale per il legame di Sir3•Acetilazione di H4K16 da parte di Sas2 nell’eucromatina adiacente blocca l’espansione dell’eterocromatina

Modello Multi-Step per la formazione dell’eterocromatina telomerica

HAST = Hda1-affected subtelomeric domain

•Si trovano a ~10-25Kb dall’estremità cromosomale.•I geni in HAST non sono silenziati dalla eterocromatina telomerica.•Sono attivati in condizioni avverse.•Acetilazione di H4 e H2A simile a geni eucromatici.•Acetilazione di H2B ridotta e di H3 fortemente ridotta.•Hda1 è la deacetilasi che funziona su questi domini, ed è specifica per H3 e H2B.

Questo stato perziale di acetilazione potrebbe favorire un certo grado di repressione, rendendo però ancora facile l’induzione genica in condizionidi stress

Nucleosomiche contengonoHtz1

Geni regolati tramite l’uso dellavariante istonica Htz1.Htz1 è di solito associata con promotoriinattivi dove facilita l’attivazione.In alcuni casi questi domini si sovrappongono agli HAST, anche se sono più piccoli.Htz1 è presente sia nel promotore chenella regione codificante, caratteristicaunica dei domini HZAD.Forte ipoacetilazione di H3K18,23 (forsea carico di Hda1) nel promotore.Maggiore acetilazione in quasi tutti i siti di H3 nella regione codificante.

HZAD = Htz1 activated domains