SINTESIS DAN KARAKTERISASI DERIVAT LUTEOLIN (SENYAWA 3’,4’-DIASETIL-5,7-DIHIDROKSIFLAVON)

ETHA AWALIYAH N111 08 259

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2013

SINTESIS DAN KARAKTERISASI DERIVAT LUTEOLIN (SENYAWA 3’,4’-

DIASETIL-5,7-DIHIDROKSIFLAVON)

SKRIPSI

untuk melengkapi tugas-tugas dan memenuhi syarat-syarat untuk mencapai gelar sarjana

ETHA AWALIYAH N111 08 259

PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS HASANUDDIN MAKASSAR

2013

iii

PERSETUJUAN

SINTESIS DAN KARAKTERISASI DERIVAT LUTEOLIN (SENYAWA 3’,4’-DIASETIL-5,7-DIHIDROKSIFLAVON)

ETHA AWALIYAH

N111 08 259

Disetujui oleh :

Pembimbing Utama, Pembimbing Pertama,

Yusnita Rifai, S.Si., M.Pharm., Ph.D., Apt Dr. Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt NIP. 19751117 200012 2 002 NIP.19771125 200212 2 003

Pada tanggal, Juli 2013

iv

PENGESAHAN

SINTESIS DAN KARAKTERISASI DERIVAT LUTEOLIN (SENYAWA 3’,4’-DIASETIL-5,7-DIHIDROKSIFLAVON)

Oleh : Etha Awaliyah N111 08 259

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi

Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin Pada Tanggal Juli 2013

Panitia Penguji Skripsi

1. Ketua

Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc., Ph.D., Apt. : …………….

2. Sekretaris

Dr. Hj. Sartini, M.Si., Apt : …………….

3. Ex Officio

Yusnita Rifai, S.Si., M.Pharm., Ph.D., Apt. : …………….

4. Ex Officio

Dr.Herlina Rante, S.Si., M.Si., Apt : …………….

5. Anggota

Dra. Hj. Naimah Ramli, Apt. : …………….

Mengetahui :

Dekan Fakultas Farmasi Universitas Hasanuddin

Prof. Dr. Elly Wahyudin, DEA., Apt. NIP. 19560114 198601 2 001

v

PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi ini adalah karya saya

sendiri, tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh

gelar kesarjanaan di suatu Perguruan Tinggi dan sepanjang pengetahuan

saya juga tidak terdapat karya atau pendapat yang pernah ditulis atau

diterbitkan oleh orang lain, kecuali yang secara tertulis diacu dalam

naskah ini dan disebutkan dalam daftar pustaka.

Apabila dikemudian hari terbukti bahwa pernyataan saya ini tidak

benar, maka skripsi dan gelar yang diperoleh, batal demi hukum.

Makassar, Juli 2013

Penyusun,

Etha Awaliyah

vi

UCAPAN TERIMA KASIH

Assalaamu’alaikum Warahmatullah Wabarakaatuh

Alhamdulillah Rabbil „Alamiin, puji syukur penulis panjatkan kepada

Allah SWT karena atas izin dan rahmat-Nya penulis mampu

merampungkan penyusunan skripsi ini sebagai salah satu syarat dalam

memperoleh gelar kesarjanaan pada Program Studi Farmasi Fakultas

Farmasi Universitas Hasanuddin.

Penghormatan dan terima kasih setinggi-tingginya penulis

hanturkan kepada kedua orang tua penulis Alm. bapak Muh. Tahang,

S.Pd., yang selalu menjadi motivator yang sangat berarti bagi penulis

hingga akhir hayatnya, Ibu Hj. Ruaena atas kasih sayang, doa dan

dukungan, arahan, perhatian serta pengorbanan yang tiada henti-

hentinya. Kepada saudara-saudara penulis Mushawiruddin Muhtar dan

Asfihanuddin Muhtar yang selalu menjadi pendukung dan penyemangat

bagi penulis serta kepada keluarga besar penulis atas dukungannya

kepada penulis. Kepada Baso Ramdana, Amd penulis ucapkan terima

kasih untuk semua bantuan, dukungan dan perhatiannya.

Banyak kendala dan hambatan yang penulis hadapi dalam

penyusunan skripsi ini, namun berkat bantuan dari berbagai pihak,

akhirnya penulis dapat melewati kendala-kendala dan hambatan tersebut.

vii

Oleh karena itu, penulis menghaturkan banyak terima kasih dan

penghargaan yang setinggi-tingginya kepada :

1. Ibu Yusnita Rifai, S.Si., M.Pharm., Ph.D., Apt., dan Ibu Dr. Herlina

Rante, S.Si., M.Si., Apt., selaku pembimbing utama dan pembimbing

pertama yang telah memberikan arahan, nasihat, dan solusi-solusi

dengan penuh kesabaran mulai dari perencanaan penelitian hingga

terselesaikannya penulisan skripsi ini.

2. Dekan Prof.Dr. Elly Wahyudin, DEA., Apt, Wakil Dekan I Prof. Dr.

Gemini Alam. M.Si., Apt. Wakil Dekan II Prof. Dr.rer.nat. Hj. Marianti A.

Manggau., Apt. Wakil Dekan III Bapak Drs. Abd. Muzakkir Rewa,

M.Si., Apt., staf dosen, serta karyawan Fakultas Farmasi Universitas

Hasanuddin atas bantuan serta motivasi-motivasi yang diberikan.

3. Bapak Usmar, S.Si., M.Si., Apt selaku Penasihat Akademik penulis

yang telah membimbing dan memberikan motivasi kepada penulis

selama menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Unhas.

4. Bapak Subehan, S.Si., M.Pharm.Sc., Ph.D., Apt., Ibu Dr. Hj. Sartini,

M.Si., Apt, dan Ibu Dra. Hj. Naimah Ramli, Apt. selaku dosen penguji

yang telah memberikan masukan dan saran kepada penulis hingga

selesainya penulisan skripsi ini.

5. Teman-teman farmasi angkatan 2008 (STEROID ‟08) yang telah

mengajarkan kebersamaan dan kekompakan serta keluh kesah yang

telah dilalui bersama, canda tawa serta motivasi, dan dukungan baik

viii

moril maupun materil yang tidak berujung sehingga hari-hari yang

penulis lalui selalu penuh dengan semangat.

6. Laboran dan kru Laboratorium Biofarmaka Kanda Ismail, S.Si., Apt.,

dan Kanda M. Arifuddin S.Si., Apt., terima kasih untuk waktu dan

bantuannya.

7. Kepada pihak yang tidak sempat disebut namanya, penulis mohon

maaf dan terima kasih semoga Allah membalas semua kebaikan

kalian selama ini.

Penulis menyadari bahwa karya tulis ini sangat jauh dari

kesempurnaan, karena itu penulis mengharapkan saran dan kritik yang

membangun demi terciptanya suatu karya yang lebih bermutu. Akhirnya,

semoga karya kecil ini dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu

pengetahuan kedepannya.

Makassar, Juli 2013

Penulis

ix

ABSTRAK

Telah dilakukan sintesis derivat luteolin menggunakan metode asetilasi. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh senyawa derivat luteolin, yang kemudian dikarakterisasi dengan metode spektrofotometri UV-Vis dan FT-IR. Sebanyak 5 mg luteolin murni direaksikan dengan asam asetat glasial dan piridin. Dari hasil asetilasi diperoleh senyawa sintetik derivat luteolin yang diduga merupakan senyawa 3‟,4‟-diasetil-5,7-dihidroksiflavon sebanyak 3,9 mg. Senyawa sintetik tersebut kemudian dianalisis kemurniannya menggunakan metode KLT dengan perbandingan eluen n-heksan : etil asetat : metanol (3:1:1). Hasil karakterisasi senyawa hasil sintesis dengan menggunakan spektrofotometer UV-Vis dan FT-IR menunjukkan karekteristik gugus yang mengandung gugus C-H (siklik), Dimer -COOH (aromatik), N-H (tersier), C=O (karbonil), C-O (terkonjugasi), C=C (aromatik) dan N-H serta menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 342,50 nm.

x

ABSTRACT

Synthesis of luteolin derivative, which was using acetylation method, has been done. The aim of this research was to obtaining luteolin derivative, which was than characterized by spectrophotometry UV-Vis and FT-IR. 5 mg of pure luteolin was reacted with glacial acetate acid and pyridine. As a result, 3.9 mg luteolin derivative which estimated as 3‟,4‟-diacetyl-5,7-dihydroxyflavone was obtained. The purity of synthetic was then analyzed using TLC method with hexane : ethyl acetate : methanol (3:1:1) as eluen. Characterization results from spectrophotometer UV-Vis and FT-IR showed that the luteolin derivative coumpound consisted of C-H (cyclic), dimer -COOH (aromatic), N-H (tertiary), C=O (carbonyl), C-O (conjugated), C=C (aromatic) and N-H. The absorbtion of spectrophotometer was at wave length 342.50 nm.

xi

DAFTAR ISI

Halaman

LEMBAR PERSETUJUAN ................................................................. iii

LEMBAR PENGESAHAN .................................................................. iv

LEMBAR PERNYATAAN .................................................................... v

UCAPAN TERIMA KASIH ................................................................... vi

ABSTRAK .......................................................................................... ix

ABSTRACT ........................................................................................ x

DAFTAR ISI ....................................................................................... xi

DAFTAR TABEL ................................................................................ xiv

DAFTAR GAMBAR ............................................................................ xv

DAFTAR LAMPIRAN ......................................................................... xvi

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................... 1

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................. 4

II.1 Uraian Senyawa Luteolin .................................................... 4

II.1.1 Sifat Kimia Luteolin ........................................................... 6

II.2 Desain Obat ........................................................................ 7

II.3 Sintesis Kimia ..................................................................... 8

II.4 Metode Analisis Kemurnian ................................................ 8

II.4.1 Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ......................................... 8

II.4.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) .......................... 10

II.5 Metode Pemurnian .............................................................. 12

II.5.1 Kromatografi Cair Vakum ................................................. 12

xii

II.5.2 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP) ...................... 13

II.6 Elusidasi Struktur ................................................................ 14

BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN ............................................... 18

III.1 Penyiapan Alat dan Bahan ................................................ 18

III.2 Sintesis Senyawa ............................................................... 18

III.3 Analisis Kemurnian ............................................................ 19

III.3.1 Kromatografi Lapis Tipis .................................................. 19

III.3.2 UFLC (Ultrafast Liquid Chromatography) ........................ 20

III.4 Karakterisasi Senyawa ....................................................... 21

III.4.1 Spektrofotometri UV-Vis .................................................. 21

III.4.2 Spektrofotometri Infrared ................................................ 21

III.5 Pemurnian Senyawa........................................................... 22

III.5.1 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif.................................. 22

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN .................................................. 24

IV.1 Hasil Penelitian .................................................................. 24

IV.1.1 Skema Reaksi Kimia ...................................................... 24

IV.1.2 Perbedaan Sifat Fisik antara Parent Drug dengan hasil

sintesis .............................................................................. 24

IV.1.3 Perbedaan Karakteristik antara Parent Drug dengan

Hasil Sintesis ................................................................... 25

IV.2 Pembahasan ..................................................................... 26

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .................................................. 30

V.1 Kesimpulan ........................................................................ 30

xiii

V.2 Saran .................................................................................. 30

DAFTAR PUSTAKA ........................................................................... 32

LAMPIRAN ......................................................................................... 35

xiv

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Skema reaksi kimia pada proses sintesis ..................................... 24

2. Perbandingan sifat fisik antara senyawa parent drug dan

senyawa hasil sintesis ................................................................... 24

3. Data hasil karakterisasi senyawa Luteolin dan senyawa hasil

sintesis........................................................................................... 25

4. Data karakteristik FT-IR luteolin dan senyawa hasil sintesis ........ 25

5. Data Spektra UFLC Senyawa Hasil Sintesis ...................................... 37

6. Data Spektra UV-Vis Luteolin Murni .............................................. 38

7. Data Spektra UV-Vis Senyawa Hasil Sintesis ............................... 39

8. Data Spektra FT-IR Senyawa Hasil Sintesis ................................. 40

xv

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Struktur Dasar Flavonoid . ............................................................. 4

2. Rumus Struktur Luteolin ................................................................ 6

3. Profil Kromatogram Hasil Sintesis Senyawa Derivat Luteolin

(Senyawa 3‟,4‟-Diasetil-5,7-Dihidroksiflavon). Fase diam silika

gel dan fase gerak heksan-etil asetat (1:3), A : visualisasi

dengan UV 254 nm, B : Visualisasi dengan UV 366 nm dan C :

visualisasi dengan H2SO4. Rf SM = 0,72, Rf S1=0,57; Rf

S2=0,87 ......................................................................................... 36

4. Profil Kromatogram Hasil Separasi Senyawa Derivat Luteolin

(Senyawa 3‟,4‟-Diasetil-5,7-Dihidroksiflavon). Fase diam silika

gel dan fase gerak heksan-etil asetat-metanol (3:1:1), A :

visualisasi dengan UV 254 nm, B : Visualisasi dengan UV 366

nm. Rf A = 0,7 ; Rf B = 0,14. .......................................................... 36

5. Spektra UFLC senyawa hasil sintesis............................................ 37

6. Spektra UV-Vis luteolin murni ........................................................ 38

7. Spektra UV-Vis senyawa hasil sintesis .......................................... 39

8. Spektra FT-IR senyawa hasil sintesis ............................................ 40

xvi

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Skema Kerja .................................................................................. 35

2. Gambar dan Tabel Hasil Penelitian ............................................... 36

1

BAB I

PENDAHULUAN

Luteolin, 3′,4′,5,7-tetrahidroksiflavon merupakan senyawa golongan

flavonoid yang banyak terdapat dalam buah–buahan, sayur–sayuran serta

berbagai jenis tanaman obat. Luteolin dimanfaatkan sebagai agen

antiinflamasi, antioksidan, antikanker, serta antialergi (1).

Dari penelitian sebelumnya telah ditemukan bahwa senyawa

luteolin memiliki efek antikanker dengan mekanisme yang sama dengan

kuersetin yang dikarenakan adanya persamaan struktur antara kedua

senyawa tersebut, mekanismenya yaitu dapat menginhibisi enzim DNA

topoisomerase II pada Leishmania serta dapat berefek inhibitor

topoisomerase I yang potensial pada DNA sel eukariotik (2), pada

penelitian terbaru mengenai senyawa ini juga ditemukan bahwa quersetin

dan luteolin dapat berfungsi sebagai inhibitor jalur signal Hedgehog (Hh)

(3,4). Selain itu pada penelitian lainnya dikemukakan bahwa luteolin juga

dapat mempengaruhi jalur signal TNF-related apoptosis-inducing ligand

(TRAIL) dengan cara mensupresi NF – кB yang kemudian menginduksi

terjadinya apoptosis oleh aktivasi TNF (1). Namun mekanisme antikanker

yang lebih dititikberatkan yaitu inhibitor jalur signal Hedgehog karena

dianggap lebih berpotensi dalam terapi pengobatan kanker.

Jalur signal Hedgehog (Hh) merupakan salah satu jalur signal yang

berperan dalam mekanisme pertumbuhan sel embrio dan pemeliharaan

jaringan otot dewasa. Protein Hh adalah polipeptida ligan yang ditemukan

2

pada Drosophila dan berperan penting dalam tahap akhir embryogenesis

dan metamorphosis larva Drosophila (5). Protein ini berperan dalam

proses transkripsi DNA. Gangguan pada komponen dasar jalur signal

Hedgehog dapat menimbulkan cacat lahir bawaan pada embrio serta

dapat memicu terjadinya kanker pada sel dewasa(3). Kelebihan GLI yang

teraktivasi oleh jalur signal Hedgehog akan mengakibatkan terbentuknya

tumor yang progresif, yang kemudian berkembang menjadi kanker seperti

kanker pankreas dan kanker prostat. Jadi penting menjadikan jalur signal

Hedgehog (Hh) sebagai target untuk penemuan obat anti kanker yang

baru (4).

Senyawa luteolin murni dapat diperoleh dengan cara ekstraksi dan

isolasi senyawa tersebut dari tanaman penghasilnya, seperti Vitex

negundo, Tomentosa salvia dan berbagai jenis tanaman lainnya (2).

Senyawa ini dapat bersifat inhibitor signal Hedgehog pada konsentrasi <

0,5 µM (IC50) (6). Aktivitas ini perlu ditingkatkan menjadi skala nM untuk

memperoleh efek terapi kanker yang lebih baik lagi, oleh karena itu perlu

dilakukan sintesis senyawa derivat luteolin yang memiliki aktivitas

antikanker yang lebih baik daripada senyawa bahan alamnya.

Pada penelitian ini dilakukan sintesis senyawa derivat luteolin,

luteolin merupakan senyawa induk (Parent drug) yang disintesis dengan

metode asetilasi menggunakan asam asetat anhidrid sebagai pereaksi

dan piridin sebagai katalistor (7), prosedur tersebut merupakan prosedur

yang telah digunakan oleh peneliti sebelumnya yang kemudian

3

dimodifikasi untuk disesuaikan dengan sampel yang akan disintesis pada

penelitian ini yaitu luteolin. Dari prosedur tersebut diharapkan dapat

menghasilkan senyawa derivat luteolin yakni senyawa 3‟,4‟-diasetil-5,7-

dihidroksiflavon.

Berdasarkan uraian diatas, penelitian ini dimaksudkan untuk

membuat senyawa sintetik derivat dari luteolin yang murni. Adapun tujuan

dari penelitian ini adalah untuk memperoleh senyawa sintetik derivat

luteolin yang diperuntukkan sebagai bahan baku untuk selanjutnya

dilakukan penelitian uji aktifitas antikanker secara invivo dari senyawa

tersebut.

4

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

II.1 Uraian Senyawa Luteolin (Senyawa induk)

Flavonoid merupakan senyawa fenolik yang banyak terdapat pada

tanaman tinggi.Sampai saat ini telah berhasil diisolasi lebih dari 8000 jenis

flavonoid dari berbagai jenis tanaman pada hampir seluruh bagian

tanaman tersebut. Pada tanaman, flavonoid memiliki banyak fungsi

diantaranya sebagai antioksidan, antimikrobial, fotoreseptor, atraktor

visual dan skrining cahaya. Flavonoid memiliki kerangka dasar karbon

yang terdiri dari 15 atom karbon, dimana dua cincin benzen terikat pada

rantai propan yang juga dapat membentuk cincin heterosiklik yang

dihubungkan oleh jembatan hidrogen sehingga terbentuk senyawa 1,3-

diarilpropan dengan susunan C6-C3-C6. Klasifikasi flavonoid adalah :

flavon, flavanon, isoflavon, flavonol, flavanonol, flavan-3-ol dan

antosianidin (9).

Gambar 1 : Struktur dasar flavonoid

Flavon merupakan jenis senyawa flavonoid yang terbesar

jumlahnya di alam dan juga lazim ditemukan.Dari penelitian sebelumnya

ditemukan bahwa beberapa senyawa hidroksiflavon dan metoksiflavon

5

menunjukkan efek yang signifikan sebagai penghambat pertumbuhan

terhadap jalur karsinogenesis jurkat, PC-3 dan kolon 205 (10).

Luteolin (3‟,4‟,5,7-tetrahidroksiflavon) merupakan senyawa polifenol

golongan flavon yang terdapat dalam jumlah yang berlimpah di dalam lada

hijau, perilla, seledri, dan teh chamomile. Penelitian sebelumnya telah

menunjukkan efek kemopreventive kanker dari luteolin.Luteolin dapat

menginduksi terjadinya apoptosis pada banyak jenis sel kanker. Luteolin

juga mampu menghambat berbagai jenis rangsangan yang diinduksi oleh

ekspresi gen proinflamatori dan senyawa kmia penginduksi

karsinogenesis payudara, kolon dan kulit (11).

Luteolin dalam bentuk glikosida dapat menghambat aktivitas

mediasi transcriptional Hh/GLI1 dengan IC50 pada konsentrasi 0,5 µM,

senyawa tersebut juga bersifat sitotoksik terhadap sel PANC1 (IC50 = 0,7

µM) dan sel DU145 (IC50 = 0,8 µM) (3), Hh/GLI1 signaling pathway

merupakan jalur signal yang berperan dalam pertumbuhan dan

perkembangan embrio serta pada pemeliharaan jaringan dewasa.

Signal Hh pada proses transduksi diawali dengan pembentukan

ikatan antara protein ligan Hedgehog yang disekresikan oleh episilial sel

tumor dengan reseptor PTCH pada membran. Ikatan ini menyebabkan

terjadinya internalisasi reseptor PTCH ke dalam sel tumor sehingga efek

inhibitor PTCH terhadap Smoothened (Smo) menghilang, Smo yang

terbebas kemudian bergerak menuju daerah cilium, setelah terikat pada

cilium Smo kemudian mengirim signal untuk mengaktifkan protein GLI

6

yang merupakan faktor transkripsi. Kelebihan konsentrasi GLI akan

memicu pertumbuhan dan progresifitas sel tumor dan memicu terjadinya

kanker seperti kanker pada pancreas dan prostat (4).

Luteolin juga dapat menginduksi terjadinya apoptosis melalui

penghambatan enzim topoisomerase I dengan nilai IC50 = 5 µM (2) dan

dapat menghambat jalur signal TNF–α pada konsentrasi 5 µM hingga 20

µM (12), serta menghambat enzim 15-lipoksigenase dengan nilai IC50 =

0,6 µM (15).

II.1.1 Sifat Kimia Luteolin

Gambar 2 :Rumus struktur luteolin

Nama IUPAC : 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)- 5,7-dihydroxy-4-chromenone

Sinonim : 3‟,4‟,5,7-tetrahidroksiflavon, 2-(3,4-dihidroksifenil)-5,7-

dihidroksi-4H-1-benzopiran-4-one, lutelol.

Rumus Molekul : C15H10O6.

Berat molekul : 286,2.

Titik lebur : 392ºC.

Pemerian : Berupa serbuk kristal kuning, mudah teroksidasi oleh

agen pengoksidasi, bersifat iritasi terhadap mata,

system pernapasan, system gastrointestinal dan kulit.

7

Penyimpanan : Pada suhu 2 – 8ºC, terlindung dari cahaya.

LD50 : 180 mg/kg (pada tikus) (14).

Kelarutan : Larut dalam butanol, dimetil formamida, propanol,

isopropanol, DMSO, aseton, etanol, heksan dan

metanol (13).

II.2 Desain Obat

Dalam pengembangan dan penemuan obat baru, ada empat

langkah utama, yaitu (1) dari bahan alam dengan melakukan skrining

(penapisan) untuk mencari komponen bioaktif; (2) modifikasi struktur dari

bahan obat yang sudah digunakan untuk meningkatkan aktivitas atau

mencari aktivitas baru; (3) dari bahan kimia sintesa dan pemodelan hewan

percobaan dengan melakukan penapisan skrining bahan-bahan kimia

terhadap penyakit (menggunakan pemodelan hewan percobaan) dan (4)

dari pendekatan modern desain obat dengan mendesain obat berbasis

mekanisme fisiologi (19).

Desain obat merupakan proses iterasi dimulai dengan penentuan

senyawa yang menunjukkan sifat biologi penting dan diakhiri dengan

langkah optimasi, baik dari profil aktivitas maupun sintesis senyawa kimia.

Tanpa pengetahuan lengkap tentang proses kimia yang bertanggung

jawab terhadap aktivitas biologis, hipotesis desain obat umumnya

didasarkan pada pengujian kemiripan struktural dan pembedaan antara

molekul aktif dan tak aktif (20). Tujuan utama desain obat dalam ilmu

kimia medisinal adalah dapat menemukan suatu molekul yang akan

8

menghasilkan efek biologis yang bermanfaat tanpa memberikan efek

biologis yang merugikan (21).

II.3. Sintesis Kimia

Sintesis dalam bahasa yunani artinya “meletakkan bersama–sama”.

Sintesis kimia organik adalah seni pembentukan struktur molekul

kompleks dari suatu senyawa prekursor yang lebih mudah diperoleh

melalui serangkaian reaksi kimia rumit yang didesain dengan analisis

retrosintesis berdasarkan serangkaian diskoneksi reaksi gugus fungsi

(22).

Reaksi kimia dalam sintesis meliputi penggabungan gugus fungsi

atau penggantian gugus fungsi. Reaksi–reaksi tersebut umumnya melalui

intermediet (zat antara) ionic dan ikatan–ikatan C–X terpolarisasi atau

ikatan–ikatan π (8).

II.4 Metode Analisis Kemurnian

II.4.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi merupakan suatu metode analisis di mana fase gerak

bergerak melewati fase diam sehingga campuran senyawa dapat terpisah

menjadi komponen-komponen. Istilah “Kromatografi Lapis Tipis” pertama

kali diperkenalkan oleh E. Stahl pada tahun 1956, yang berarti proses

pemisahan secara kromatografi di mana fase diam terdiri dari lempeng

tipis yang digunakan pada suatu substrat. KLT digunakan dibidang

farmasi, kimia klinik, kimia forensik, biokimia, kosmetik, analisis makanan,

analisis lingkungan, analisis senyawa anorganik dan elektrolitik (16).

9

Pelarut yang digunakan dalam KLT memiliki karakteristik permukaan

dan sifat fisika-kimia. Selain itu, banyak pilihan fase gerak yang dapat

digunakan untuk memisahkan campuran senyawa; umumnya memiliki

sifat yang berbeda seperti donor proton, aseptor proton, dan dipol. Dalam

KLT, absorpsi ultraviolet (UV) dari fase gerak tidak berperan penting

dalam deteksi dan kuantifikasi karena fase gerak akan menguap sebelum

dideteksi. Pelarut yang digunakan adalah pelarut yang tidak memiliki

viskositas yang tinggi (17).

Selain itu, manfaat KLT yaitu lempeng hanya dapat digunakan sekali,

dengan demikian penyiapan sampel lebih simpel dari metode lain seperti

Kromatografi Gas (KG) dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT).

Beberapa sampel dapat dianalisis pada waktu yang sama pada satu

lempeng KLT atau KCKT, sehingga mengurangi waktu volume pelarut

yang digunakan untuk tiap sampel. Pengerjaan beberapa sampel dalam

lempeng yang sama memberikan manfaat yaitu akurasi dan presisi pada

saat analisis kuantitatif menggunakan densitometri (17).

KLT memiliki beberapa parameter antara lain sebagai berikut:

a. Retardation Factor (Rf)

Posisi noda pada KLT dapat diuraikan dengan retardation factor (Rf),

yang merupakan hasil bagi antara jarak pergerakan noda dari batas

bawah dengan jarak antara batas bawah dengan batas atas.

10

Di mana:

Rf = retardation factor

Zs = jarak noda dengan batas bawah (mm)

Zf = jarak batas atas dengan batas bawah (mm) (17).

b. Konstanta Alir

Konstanta alir ( ) merupakan pengukuran laju pergerakan pelarut

(eluen). Parameter ini penting dalam KLT dan dapat digunakan untuk

menghitung, misalnya waktu elusi dengan jarak pemisahan yang berbeda,

sehingga membuktikan bahwa fase diam, sistem pelarut, tipe chamber

dan suhu konstan. Konstanta alir dapat dirumuskan dengan:

Di mana:

= Konstanta alir (mm2/s)

Zf = jarak awal pergerakan pelarut dengan batas atas (mm)

t = waktu elusi (s) (17).

II.4.2 Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT)

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Performance

Liquid Chromatography (HPLC) merupakan suatu metode analisis

kromatografi yang memiliki sensitifitas tinggi dibanding metode

kromatografi cair lainnya, bersifat tidak destruktif serta dapat digunakan

baik untuk analisis kualitatif maupun kuantitatif. KCKT dapat digunakan

untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam

11

amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis,

menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping

proses sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi

(27). Salah satu jenis terbaru dari KCKT yaitu Ultrafast Liquid

Chromatography (UFLC) merupakan metode analisis yang lebih sensitif

dibanding jenis KCKT yang lain. UFLC dapat mendeteksi senyawa

dengan lebih cepat dan dengan nilai presisi yang tinggi serta dapat

digunakan untuk menganalisis senyawa yang tidak stabil pada tekanan

yang tinggi karena UFLC dapat dioperasikan pada tekanan normal yang

lebih rendah dibanding tekanan yang digunakan pada jenis KCKT lainnya.

Prinsip kerja KCKT sama seperti kromatografi cair lainnya yaitu

pemisahan komponen sampel dengan cara melewatkan sampel tersebut

pada suatu fase diam yang berupa kolom menggunakan fase gerak

berupa pelarut yang sesuai dan memiliki kemurnian yang tinggi, kemudian

selanjutnya dilakukan pengukuran kadar masing-masing komponen-

komponen tersebut dengan suatu detektor. Kerja detektor bermacam-

macam, tetapi pada dasarnya membandingkan respon dari komponen

sampel dengan respon dari larutan standar (27). Prinsip pemisahan KCKT

yaitu perbedaan distribusi komponen di antara fase gerak dan fase diam

yang menyebabkan migrasi diferensial komponen-komponen analit dalam

kolom kromatografi (28).

Data yang diperoleh dari instrument KCKT yaitu berupa nilai waktu

retensi yang spesifik bagi setiap senyawa. Waktu retensi adalah selang

12

waktu yang diperlukan oleh sampel (solut) mulai saat injeksi sampai keluar

dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor (29).

II.5 Metode Pemurnian

II.5.1 Kromatografi Cair Vakum

Kromatografi cair vakum dapat diartikan sebagai suatu proses yang

dilakukan pada suatu kolom pendek dengan pengisapan untuk

mempercepat aliran pelarut. Fase diam (sorben) dipadatkan di dalam

kolom pendek atau corong Buchner. Sorben dipadatkan dengan mengetuk

pinggir kolom pada saat pengisian kemudian menekan lapisan atas

sorben dengan benda yang memiliki permukaan yang rata sambil terus

diisap dengan pompa vakum. Pemadatan diselesaikan dengan melepas

alat vakum lalu menuangkan pelarut dengan kepolaran rendah melalui

permukaan sorben lalu diisap dengan pompa vakum. Pemadatan kolom

tepat bila aliran pelarut membentuk garis mendatar, jika tidak sorben

harus dikeringkan, dipadatkan ulang, lalu diuji kembali. Ketika semua

pelarut telah melewati kolom, sisa pelarut yang terperangkap di antara

partikel sorben harus dikeluarkan melalui pengisapan. Sampel yang telah

dilarutkan di dalam pelarut yang cocok atau yang telah dicampur dengan

sejumlah kecil sorben atau bahan inert diletakkan di atas padatan

sorben.Jika menggunakan larutan sampel, pelarut harus diisap ke dalam

padatan kolom. Sepotong kertas saring dengan diameter yang sama

dengan diameter kolom ditempatkan di atas sorben untuk menghindari

kekacauan sorben pada saat penambahan pelarut. Kemudian kolom

13

dielusi dengan campuran pelarut dengan meningkatkan kepolaran pelarut

secara berangsur-angsur. Sebelum pelarut selanjutnya dimasukkan,

sorben harus diisap sampai kering dan eluen berisi fraksi sampel

dikumpulkan dalam tabung reaksi atau labu erlenmeyer (17).

Kromatografi vakum memiliki keuntungan tersendiri yaitu sederhana,

cepat, dan tepat. Jumlah maksimal sampel yang digunakan hampir sama

dengan kromatografi kilat. Tetapi, tidak jarang digunakan sampel melebihi

muatan untuk memisahkan campuran sederhana atau untuk

menyederhanakan campuran senyawa untuk pemisahan yang lebih lanjut.

Pada kondisi ini, muatan sampel dapat mencapai 10% (b/b) atau lebih dari

massa sorbent. Dibandingkan dengan kromatografi kilat, pergantian

pelarut lebih mudah karena bagian atas kolom memiliki tekanan atmosfer

(18).

II.5.2 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif (KLTP)

Kromatografi Lapis Tipis Preparatif merupakan metode kromatografi

yang digunakan untuk mempartisi sekelompok senyawa. Kromatografi

jenis ini memiliki prinsip yang sama dengan metode Kromatografi Lapis

Tipis pada umumnya, perbedaannya hanya terletak pada lempeng silika

yang digunakan. Lempeng silika yang digunakan pada KLTP berukuran

lebih besar daripada lempeng KLT serta lapisan silika pada permukaan

lempeng lebih tebal, hal ini dimaksudkan agar senyawa yang terelusi

dapat diambil dengan mudah. Senyawa yang telah terelusi dipisahkan dari

lempeng dengan cara dikerok lalu diekstraksi dari serbuk silika dengan

14

kromatografi kolom atau dengan metode endap tuang menggunakan

pelarut yang dapat melarutkan senyawa secara sempurna tanpa

melarutkan serbuk silikanya (16).

II.6 Elusidasi Struktur

Elusidasi struktur merupakan suatu prosedur yang bertujuan untuk

menentukan rumus struktur dari suatu senyawa. Dalam mengelusidasi

struktur kita memerlukan data spektrum dari sampel yang dianalisis, baik

berupa spectrum spektrofotometri UV-Vis, FT-IR, MS, dan NMR (23).

Metode yang digunakan dalam elusidasi struktur adalah sebagai

berikut :

1. Spektrofotometri UV-Vis

Spektrofotometri UV-Vis adalah anggota teknik analisis

spektroskopik yang memakai sumber radiasi elektromagnetik ultraviolet

dekat (190-380 nm) dan sinar tampak (380-780 nm) dengan memakai

instrumen spektrofotometer. Daerah spektrum spektrofotometer yaitu 200-

400 nm. Spektrofotometri UV-Vis dapat Memberikan informasi mengenai

keberadaan gugus kromofor pada suatu molekul. Spektrofotometri UV-Vis

melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang

dianalisis, sehingga spektrofotometri UV-Vis lebih banyak dipakai untuk

analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif (24).

Prinsip kerjanya yaitu sampel dipapari dengan radiasi

elektromagnetik berupa radiasi sinar ultraviolet yang kemudian

15

berinteraksi dengan molekul sampel sehingga molekul mengalami transisi

elektronik, radiasi elektronik yang memapari molekul atau atom akan

diserap oleh molekul atau atom dengan nilai serapan yang tergantung

pada gugus kromofor yang terdapat dalam molekul atau atom tersebut.

Serapan inilah yang kemudian terbaca oleh detektor sebagai nilai

absorbansi dan nilai transmitan (30).

2. Spektroskopi FT-IR

Fourier Transform-Infra Red Spectroskopy (FT-IR) merupakan

suatu teknik yang digunakan untuk menganalisa komposisi kimia dari

senyawa-senyawa organik, polimer, coating atau pelapisan, material

semikonduktor, sampel biologi, senyawa-senyawa anorganik, dan mineral.

FT-IR mampu mendeterminasikan perbedaan gugus fungsional yang ada

pada suatu senyawa. Spektroskopi FT-IR tidak hanya mempunyai

kemampuan untuk analisa kualitatif, namun juga bisa untuk analisa

kuantitatif (23, 24).

Prinsip kerjanya yaitu sampel diletakkan dalam suatu medan

magnet kemudian ditembakkan radiasi sinar Inframerah yang

menimbulkan eksitasi elektron ke tingkat energi yang lebih tinggi atau

lebih rendah, eksitasi tersebut akan melepaskan energi atau menyerap

energi, energi inilah yang kemudian terbaca oleh detektor sebagai data

spektra yang dapat mengkarakterisasi gugus fungsi dari sampel. Hanya

frekuensi tertentu dari radiasi inframerah yang akan diserap oleh molekul,

16

radiasi dalam kisaran energi ini sesuai dengan kisaran frekuensi rintangan

dan vibrasi bengkokan dari ikatan kovalen dalam kebanyakan molekul.

Namun, tidak semua ikatan dalam molekul dapat menyerap energi

inframerah, meskipun radiasi tetap sesuai dengan gerakan ikatan (25).

3. NMR (Nuclear Magnetic Resonance)

Penggunaan NMR sekarang ini dapat diklasifikasikan ke dalam 2

kategori utama yakni (25):

1. Teknik satu dimensi: 1HNMR, 13CNMR, 14CDEPT, 14CPENDANT, 14C

J mod., NOE., dan seterusnya.

2. Teknik dua dimensi: 1H-1H COSY, 1H-1H DQF-COSY, 1H-1H COSY-lr,

1H-1H NOESY, 1H-1H ROESY, 1H-1H TOCSY (atau HOHAHA), 1H-14C

HMBC, 1H-14C HMQC, 1H-14C HSQC, HSQCTOCSY, dan sejenisnya.

Instrumen NMR Memberikan informasi mengenai nomor serta jenis

proton, karbon dan unsur lain seperti nitrogen, fluorin, dan lain-lain yang

ada pada suatu molekul dan hubungan antara atom-atom tersebut.

Prinsip kerja NMR yaitu suatu molekul diberikan efek gelombang

elektromagnetik pada daerah frekuensi radio yang kemudian energi

radiasi elektomagnetiknya akan diabsobsi oleh inti atom berspin yang

terdapat dalam molekul tersebut sehingga menimbulkan resonansi

elektromagnetik, resonansi ini kemudian dapat terbaca oleh alat NMR

sebagai peak frekuensi yang spesifik untuk tiap inti atom tertentu

17

tergantung pada gelombang elektromagnetik yang diabsobsi serta nomor

spin dari atom tersebut.

Tidak semua atom dapat terbaca oleh alat NMR (Nuclear Magnetic

Resonance) hal ini dikarenakan tidak semua inti atom bermuatan

mengalami perputaran (spin) pada sumbu inti atom tersebut, atom yang

tidak berspin tidak akan menimbulkan dipol magnetik, oleh karena itu

hanya atom-atom tertentu yang dapat terbaca oleh alat NMR (Nuclear

Magnetic Resonance). Hanya inti dengan nomor atom ganjil, nomor

massa ganjil serta atom dengan nomor massa dan nomor atom ganjil

yang menimbulkan dipol magnetik karena apabila jumlah proton dan

neutron genap maka nilai spin (l) adalah nol (25).

4. Spektroskopi Massa (MS)

Spektroskopi Massa merupakan suatu metode analisis instrumental

yang dipakai untuk identifikasi dan penentuan struktur dari komponen

sampel dengancara menunjukkan massa relatif darimolekul komponen

dan massa relatif hasil pecahannya (25).

18

BAB III PELAKSANAAN PENELITIAN

III.1 Penyiapan Alat dan Bahan Penelitian

Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah seperangkat

alat KLT, timbangan analitik, corong pisah, sendok tanduk, pinset, FT-IR

(Bruker®), lampu UV (254 nm dan 366 nm), Spektrofotometer UV-Vis

(Hewlett-Packard®), kamera dan alat-alat gelas yang biasa digunakan di

laboratorium.

Bahan yang digunakan adalah asam asetat glasial, luteolin,

metanol PA, metanol teknis, etil asetat, heksan, piridin, kloroform dan

lempeng KLT silika gel 60 F254.

III.2 Sintesis senyawa

Sebanyak 5 mg kristal senyawa induk (luteolin) dilarutkan dalam

metanol sebanyak 2 mL, kemudian ditambahkan asam asetat glasial

sebanyak 6 ml dan piridin sebanyak 0,5 mL lalu diaduk pada suhu 20ºC

selama 2 jam, kemudian diekstraksi dengan kloroform, lapisan dipisahkan

menggunakan corong pisah, dibuang lapisan kloroform. Prosedur sintesis

ini merupakan modifikasi dari prosedur proteksi gugus hidroksi minyak

jarak dengan metode asetilasi yang dilakukan oleh Marlina, et al (7).

19

III.3 Analisis kemurnian

III.3.1 Kromatografi Lapis Tipis

Metode analisis kemurnian yang digunakan adalah metode

Kromatografi Lapis Tipis (KLT) menggunakan eluen heksan-etilasetat-

metanol dengan perbandingan tertentu.

Langkah–langkahnya adalah sebagai berikut :

1. Pengaktifan lempeng silika gel 60 F254

Lempeng silika gel 60 F254 diaktifkan dengan cara dipanaskan

dalam oven selama 30 menit kemudian didinginkan lalu dipotong

dengan ukuran 2 x 5 cm.

2. Penjenuhan chamber

Eluen yang akan digunakan dimasukkan ke dalam chamber lalu

chamber ditutup rapat agar udara dari luar chamber tidak dapat masuk

ke dalam chamber tersebut. Eluen yang digunakan yaitu heksan-

etilasetat-metanol (3:1:1).

3. Penotolan sampel

Dibuat garis batas atas dan batas bawah pada lempeng yang

telah diaktifkan dengan jarak minimal 0,5 mm dari tepi lempeng,

kemudian lempeng ditotol dengan sampel berbeda, sampel pertama

yaitu senyawa awal sebelum dilakukan sintesis dan sampel kedua

adalah senyawa hasil sintesis.

20

4. Pengelusian noda

Lempeng yang telah ditotol dengan kedua senyawa diatas

dimasukkan dalam chamber yang telah jenuh oleh eluen, chamber

ditutup rapat lalu ditunggu hingga noda terelusi sempurna. Setelah itu

lempeng diangin–anginkan hingga kering.

5. Pendeteksian dengan sinar UV

Lempeng silika gel 60 yang telah dielusi disinari dengan sinar UV

dengan panjang gelombang 254 dan 366 nm agar noda yang terbentuk

dapat terlihat. Jika noda senyawa hasil sintesis yang terbentuk pada

lempeng KLT lebih dari satu berarti senyawa tersebut belum murni,

perlu dilakukan prosedur tambahan yaitu pemurnian senyawa dengan

cara partisi menggunakan metode kromatografi preparatif.

III.3.2 UFLC (Ultrafast Liquid Chromtography)

Alat UFLC (Ultrafast Liquid Chromatography) dinyalakan kemudian

diatur suhu, kecepatan aliran, panjang gelombang dan eluen atau

campuran eluen yang akan digunakan, lalu alat dijalankan untuk

melakukan prosedur ekuilibrasi selama 5-10 menit.

Selama proses ekuilibrasi dilakukan preparasi sampel dimana

sampel sebanyak 1 mg dilarutkan dengan 1 mL metanol kemudian dipipet

1 mL ke dalam labu tentu ukur 10 mL, lalu dicukupkan volumenya dengan

metanol kemudian sampel dipipet 2 mL (20 ppm) ke dalam tube yang

telah disiapkan, injeksi dilakukan dengan menggunakan syringe. Tube

yang telah diisi dimasukkan ke dalam gasket lalu UFLC dijalankan selama

21

10 menit. Setelah prosedur selesai maka diperoleh profil kromatogram dari

sampel yang menyatakan waktu retensi senyawa yang terkandung di

dalam sampel.

III.4 Karakterisasi Senyawa

III.4.1 Spektrofotometri UV-Vis

Alat spektrofotometer dinyalakan, kemudian diatur panjang

gelombang monokromator yang akan digunakan pada proses

pengukuran, shutter ditutup agar cahaya tidak mencapai detektor, lalu

instrumen diatur hingga mencapai absorbansi tak terhingga. Setelah itu,

pelarut yang akan digunakan dimasukkan kedalam kuvet (blanko) yang

diletakkan dalam spektrofotometer lalu instrumen diset hingga absorbansi

nol.

Sampel 1 mg dilarutkan ke dalam 1 ml kloroform lalu dimasukkan

dalam labu tentu ukur dan dicukupkan volumenya hingga 10 mL (100

ppm), lalu dimasukkan kedalam kuvet hingga penuh. Setelah tercapai

absorbansi nol pada instrumen, blanko dikeluarkan lalu sampel

dimasukkan kedalam spektrofotometer lalu instrumen dioperasikan dan

secara otomatis absorbansi senyawa akan terbaca oleh instrument

sehingga diperoleh data berupa panjang gelombang (λ) yang spesifik

untuk tiap-tiap senyawa.

III.4.2 Spektrofotometri Infrared (FT-IR)

Sampel sebanyak 2 mg diletakkan diatas plat optik untuk wadah

cuplikan hingga menutupi seluruh permukaan plat, lalu diidentifikasi gugus

22

fungsinya berdasarkan data spektrum yang direkam oleh detektor

spektrofotometer FT-IR.

III.5 Pemurnian senyawa

Proses partisi ini diperlukan apabila diperoleh senyawa yang

tidak murni, metode yang digunakan adalah kromatografi kolom

dan Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

III.5.1 Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Langkah pertama dalam pelaksanaan KLTP yaitu mengaktifkan

lempeng silika gel yang didesain khusus untuk KLTP, pengaktifan

dilakukan dengan cara lempeng dipanaskan di dalam oven pada suhu

100°C selama ± 60 menit, selanjutnya sampel dilarutkan ke dalam pelarut

metanol secukupnya. Sampel kemudian ditotolkan dipermukaan lempeng

yang telah diaktifkan, penotolan dilakukan secara kontinyu hingga

terbentuk garis lurus di bagian batas bawah lempeng, penotolan dilakukan

secara berulang-ulang hingga sampel yang akan dipartisi habis. Setelah

sampel yang ditotolkan tadi mengering, disiapkan eluen di dalam

chamber yang berbentuk balok dengan ukuran yang sesuai dengan

ukuran lempeng silika. Setelah chamber jenuh oleh eluen, lempeng

dimasukkan secara perlahan kedalam chamber lalu chamber ditutup rapat

hingga proses pengelusian selesai. Setelah pengelusian selesai, lempeng

dikeringkan lalu diamati noda yang muncul di bawah sinar UV, noda

kemudian dikeruk lalu dipisahkan dari silika gelnya dengan cara

memasukkan silika gel yang telah keruk kedalam kolom kecil (pipet

23

panjang) yang telah disumbat ujungnya dengan kapas, setelah semua

silika gel masuk kolom kemudian aliri dengan metanol PA secara kontinyu

hingga sampel yang terdapat dalam silika terpisah seluruhnya. Metanol

yang menetes ditampung dalam vial, lalu dibiarkan menguap.

Setelah proses partisi selesai, sampel yang diperoleh diuji kembali

dengan metode KLT, apabila hasilnya menunjukkan bahwa senyawanya

telah murni maka dilakukan karakterisasi dan diperolehlah senyawa

derivat luteolin yang baru.

24

COCH3

COCH3

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 Hasil Penelitian

IV.1.1 Skema Reaksi Kimia

Tabel 1. Skema reaksi kimia pada proses sintesis

IV.1.2 Perbedaan Sifat Fisik antara Parent Drug dengan Hasil Sintesis

Tabel 2. Perbandingan sifat fisik antara senyawa parent drug dan senyawa hasil sintesis

Sifat Fisik

Luteolin 3’,4’-diasetil-5,7-dihidroksiflavon

Pemerian Serbuk Kristal Kuning Serbuk Kuning Kecoklatan

Kelarutan Larut aseton, DMSO, metanol Larut methanol

Bau Bau khas Bau khas

%rendamen hasil sintesis =

Luteolin (3‟,4‟,5,7-Tetrahidroksiflavon)

3‟,4‟-diasetil-5,7-dihidroksiflavon

N

+ CH3COOH

Suhu 20°C, 2 jam

25

IV.1.3 Perbedaan Karakteristik antara Parent Drug dengan Hasil

Sintesis

Tabel 3. Data hasil karakterisasi senyawa Luteolin dan senyawa hasil sintesis.

Karakterisasi Luteolin Hasil sintesis

KLT (Gambar 4)

Nilai Rf : 0,7 cm Warna UV 254 : Hitam UV 366 : Tidak berfluoresensi

Nilai Rf : 0,14 cm Warna UV 254 : Tidak berfluoresensi UV 366 : Biru

Spektrofotometri UV-Vis (Gambar 6,7)

λmaks : 347 nm 254 nm 207 nm

λ maks : 342,5 nm

Tabel 4. Data karakteristik FT-IR luteolin dan senyawa hasil sintesis

IV.3 Pembahasan

Pada proses sintesis, sampel berupa luteolin murni direaksikan

dengan asam asetat glasial, agar dapat terbentuk gugus asetil maka

ditambahkan piridin (amina tersier) yang mampu mengubah asam asetat

glasial menjadi gugus asetil (CH3CO–) dan hidroksil (–OH) sehingga

gugus asetil dapat mensubtitusi ion hidrogen pada luteolin, selain itu pada

saat mereaksikan campuran diaduk selama 2 jam agar reaksi berlangsung

Karakterisasi FT-IR

Luteolin (35)

3‟,4‟-diasetil-5,7-dihidroksiflavon (gambar 8)

Bil. Gelombang (cm-1)

Kemungkinan gugus Bil. Gelombang (cm-1)

Kemungkinan gugus

3411 dan 3443 O–H (hidroksil) 3844 dan 3746 C-H (siklik)

_ _ 2608 Dimer –COOH (aromatic)

_ _ 2360 N–H (tersier)

1655 dan 1623 C=O (karbonil) 1710 C=O (karbonil)

1608 C=C (aromatik) 1546 dan 1487 C=C (aromatik)

_ _ 1391 C-H (metil)

1264 C–O (terkonjugasi) 1263 dan 1012 C-O (terkonjugasi)

_ _ 888, 759, 681 N–H

26

lebih cepat sehingga diharapkan reaksi dapat terjadi pada posisi atom

karbon nomor 4‟. Metode ini merupakan metode yang dimodifikasi dari

metode yang telah digunakan oleh peneliti sebelumnya untuk

memproteksi gugus hidroksi pada minyak jarak (7). Hasil sintesis yang

diperoleh kemudian diuapkan pada suhu kamar hingga volumenya

berkurang.

Dari prosedur sintesis awal diperoleh senyawa berupa cairan

berwarna kuning kecoklatan yang kemudian dianalisis kemurniannya

dengan metode KLT menggunakan eluen heksan dan etil asetat dengan

perbandingan 3:1 dengan fase diam silika gel 60 F254 (gambar 3). Pada

profil kromatogram hasil sintesis tersebut terdapat 2 noda dengan nilai Rf

yaitu 0,57 dan 0,87 yang berbeda dengan nilai Rf luteolin yaitu 0,72.

Analisis kemurniannya juga dilakukan dengan metode Kromatografi Cair

Kinerja Tinggi tipe Ultrafast Liquid Chromatography (gambar 5), spektra

yang diperoleh menunjukkan bahwa terdapat lima senyawa di dalam hasil

sintesis yang diperoleh, waktu retensinya adalah 1,518 menit; 2,126

menit; 2,766 menit; 3,785 menit; 5,967 menit (tabel 5). Data hasil KLT dan

UFLC menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis yang diperoleh tidak

murni. Oleh karena itu, proses pemurnian hasil sintesis dilanjutkan

menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif.

Partisi menggunakan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

menghasilkan senyawa berupa serbuk berwarna kuning kecoklatan

sebanyak 3,9 mg dengan nilai %rendamen = 78%. Senyawa hasil partisi

27

tadi kemudian dianalisis kemurniannya dengan metode KLT

menggunakan eluen heksan, etil asetat dan metanol perbandingan 3:1:1

dengan fase diam silika gel 60 F254 (gambar 4). Dari profil kromatogram

tersebut terdapat 1 noda yang berfluoresensi pada UV 366 dengan nilai Rf

yaitu 0,14 yang berbeda dengan luteolin yang berfluoresensi pada UV 254

dengan nilai Rf yaitu 0,7. Dari profil kromatogram yang diperoleh dapat

disimpulkan bahwa senyawa hasil sintesis yang diperoleh merupakan

senyawa yang lebih polar dibandingkan dengan luteolin (Parent drug)

namun belum dapat dipastikan kemurniannya karena noda yang diperoleh

melebar dan berekor.

Senyawa hasil sintesis kemudian dikarakterisasi dengan

menggunakan metode spektrofotometri UV-Vis (gambar 7) untuk

menunjukkan perbedaan nilai panjang gelombang serapan maksimum

antara luteolin (Parent drug) dengan derivat hasil sintesisnya, spektra

yang diperoleh menunjukkan nilai panjang gelombang serapan maksimum

dari hasil sintesis yaitu 342,5 nm (Tabel 7) sedangkan nilai panjang

gelombang serapan maksimum dari luteolin (Parent drug) yaitu 347 nm,

254 nm dan 207 nm (Tabel 6).

Karakterisasi gugus fungsi dari senyawa hasil sintesis

menggunakan metode Spektrofotometri Fourier Transform-Infrared

(gambar 8) dengan hasil interpretasi data spektra yang menunjukkan pita

serapan pada bilangan gelombang 3844 cm-1 dan 3746 cm-1 merupakan

serapan dari C-H pada senyawa siklik yang biasanya muncul pada

28

bilangan gelombang diatas 3100 cm-1. Pita serapan yang melebar pada

bilangan gelombang 2608 cm-1 merupakan serapan dari gugus dimer –

COOH pada senyawa aromatik biasanya muncul pada bilangan

gelombang 3300-2500 cm-1 (31). Pita-pita tersebut berbeda dengan

karakteristik luteolin yaitu adanya pita yang muncul pada bilangan

gelombang 3411 cm-1 dan 3443 cm-1 yang merupakan serapan dari gugus

O-H berupa alkohol primer yang biasanya muncul pada bilangan

gelombang 3550-3200 cm-1 (35).

Adanya pita serapan pada bilangan gelombang 1710 cm-1

diakibatkan oleh adanya gugus C=O (karbonil) anhidrida yang biasanya

muncul pada bilangan gelombang 1820-1600 cm-1. Hal ini diperkuat

dengan adanya serapan C-O terkonjugasi tajam pada 1263 cm-1 dan 1012

cm-1, yang biasanya muncul pada bilangan gelombang 1300-1000 cm-1.

Pita serapan pada bilangan gelombang 1546 cm-1 dan 1487 cm-1 yang

merenggang menunjukkan adanya gugus C=C aromatik yang biasanya

muncul pada bilangan gelombang 1650-1450 cm-1. Pita serapan pada

bilangan gelombang 1391 cm-1 menunjukkan adanya gugus C-H yang

biasanya muncul pada bilangan gelombang 1450-1380 cm-1 (34).

Karakteristik tersebut sama dengan karakteristik luteolin (Parent drug)

yaitu adanya pita yang muncul pada bilangan gelombang 1655 cm-1 dan

1623 cm-1 menunjukkan adanya gugus C=O (karbonil) yang dugaannya

diperkuat dengan adanya serapan C-O terkonjugasi yang muncul pada

bilangan gelombang 1264 cm-1 serta adanya pita pada bilangan

29

gelombang 1608 cm-1 yang menunjukkan adanya gugus C=C aromatik

(35). Pada spektrum juga terlihat adanya pita serapan yang melebar pada

bilangan gelombang 2360 cm-1 merupakan serapan dari gugus N–H

tersier yang biasanya muncul pada bilangan gelombang 2700-2250 cm-1,

hal ini didukung dengan munculnya pita pada bilangan gelombang 909-

666 cm-1 yakni pada 888 cm-1, 759 cm-1 dan 681 cm-1 yang menunjukkan

bahwa masih terdapat sisa hasil reaksi berupa piridin dalam senyawa

yang dianalisis (32,33).

Berdasarkan analisis data spektrofotometri UV-Vis dan FTIR

menunjukkan bahwa senyawa hasil sintesis merupakan senyawa lain

yang berbeda dengan senyawa luteolin murni serta diduga telah terjadi

subtitusi oleh gugus fungsi yang mengandung ikatan karbonil pada gugus

benzene serta nilai panjang gelombang serapan maksimum dari senyawa

hasil sintesis yang diperoleh menunjukkan adanya gugus karbonil C=C–

C=O yang terkonjugasi (31).

30

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

V.1 Kesimpulan

Telah diperoleh senyawa sintetik yang diduga merupakan senyawa

derivat luteolin (3‟,4‟-diasetil-5,7-dihidroksiflavon) sebanyak 3,9 mg.

Karakterisasi senyawa hasil sintesis menunjukkan karekteristik gugus

yang mengandung gugus C-H (siklik), Dimer –COOH (aromatik), N-H

(tersier), C=O (karbonil), C-O (terkonjugasi), C=C (aromatik) dan N-H

serta menunjukkan serapan maksimum pada panjang gelombang 342,50

nm yang menandakan adanya gugus kromofor berupa gugus C=C–C=O

(terkonjugasi). Senyawa yang diperoleh belum murni karena berdasarkan

hasil karakterisasi yang menunjukkan adanya gugus N–H tersier yang

berarti masih ada sisa piridin dalam senyawa tersebut.

V.2 Saran

1. Dilakukan prosedur pemurnian senyawa menggunakan metode yang

lebih peka dibanding metode KLTP.

2. Dilakukan identifikasi rumus struktur senyawa hasil sintesis dengan

metode spektroskopi mass dan NMR.

3. Dilakukan uji aktivitas inhibitor Hedgehog signaling pathway dan uji

toksisitas terhadap sel normal untuk mengetahui dosis tepat dalam

penggunaannya pada terapi antikanker.

31

DAFTAR PUSTAKA

1. Ju, Wei. Xia wang, Hong lian shi, Wen shu chen, Steven A. belinsky, Yong lin. A Critical Role of Luteolin-Induced Reactive Oxygen Species in Blockage of Tumor Necrosis Factor-Activated Nuclear Factor-κB Pathway and Sensitization of Apoptosis in Lung Cancer Cells.Molecular Pharmacology vol. 71 no. 5. 2007. Hal 1381-1388.

2. Chowdhury, Arnab Roy. Shalini sharma, Suparna mandal, Anindya goswami, Sibabrata mukhopadhyay, Hemanta K. majumder. Luteolin, an emerging anti-cancer flavonoid, poisons eukaryotic DNA topoisomerase I. Biochem. J. Vol 366. 2002. Hal 653-661.

3. Rifai, Yusnita. Midori A, Takashi koyano, Thaworn Kowithayakorn, Masami ishibasi. New Hedgehog/GLI Signaling Inhibitors from Excoecaria agallocha. Journal Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 21. 2011. hal 718-722.

4. Rifai, Yusnita. Midori A, Takashi koyano, Thaworn Kowithayakorn, Masami ishibasi. Terpenoid and a Flavanoid Glycoside from Acacia pennata as Hedgehog/GLI-Mediated transcriptional Inhibotors. J Nat Prod. Vol 73. 2010. hal 995-997.

5. Lodish H, Berk A, Zipursky SL, et al. Molecular Cell Biology. 4th edition. W. H. Freeman and company. New York. Section 23.2. 2000.

6. DB Lubahn. Anna slusarz, Nader shenouda, Mary S. Sakla. Phytoesterogen as Regulators of Hedgehog Signaling and Methods of their use in cancer treatment. US Patent App. Google Patent. 2008. Hal 16-17.

7. Marlina. N.M. Surdia, C.L. Radiman, S. Achmad. Pengaruh Variasi Konsentrasi Asam Sulfat pada Proses Hidroksilasi Minyak Jarak (Castor Oil). Jurnal Matematika dan Sains Vol. 9 No. 2. 2004. Hal 249-253.

8. Sastrohamidjojo, Hardjono. Harno D. P. Sintesis Senyawa Organik. Penerbit erlangga. Jakarta. 2009. Hal 24 – 71.

9. Pietta G. Flavonoids as antioxidant. J Nat Prod ; 63 (7). 2000. Hal : 1035-1042

10. Rao YK, Fang SH, Tzeng YM. Synthesis, growth inhibition, and cell cycle of novel flavonoid derivatives.

32

11. Lin Y, Shi R, Wang X and Shen HM. Luteolin, a flavonoid with potential for cancer prevention and therapy. Curr. Cancer Drug Targets. 8. 2008. hal 634-646

12. Jong. Eun Kim, Joe eun son, Yong jinjan, et al. Luteolin, a Novel Natural Inhibitor of TPL-2 Kinase, Inhibits Tumor Necrosis Factor-α- Induced Cyclooxigenase-2 Expression in JB6 Mouse Epidermis Cells. JPET Fast Forward No. 111.179200. 2011.

13. Anonym. Solubility of luteolin in organic solvents. Open Notebook Science Solubility Challenge. 2013.

14. Material Safety Data Sheet. Certified ISO 9002. 2004.

15. Sadik, C.D. Sies H, and Schewe, T. Inhibition of 15-lipoxygenases by Flavonoids : structure-activity Relations and Mode of Action. Biochem. Pharmacol, 65. 2003. Hal 733-781.

16. Deinstrop, Elke-Hahn. Applied Thin Layer Chromatography. Wiley-VCH: Jerman. 2007. Hal: 1-7

17. Hajnos MW, Sherma J, Kowalska T. Thin Layer Chromatography in Phytochemistry. CRC Press: Boca Raton. 2008. Hal: 5-6.

18. Cooke M dan Poole CF. Encyclopedia of Separation Science. Academic Press. USA. 2000. Hal: 2809

19. Leonardus Broto Sugeng Kardono. MDG; sebentar lagi sanggupkah kita menghapus kemiskinan dunia, KOMPAS. hal 123

20. Leach AR. Molecular Modelling, Principle and Applications, edisi-2. Pearson Edocation EMA. London. 2001

21. Purcell WP. Quantitative Structure-Activity Relationship. Bergman ED. Pulman B. Mol Quant Pharm. Reidel Publishing Company. 1974.

22. Nicotra, Francesco. Synthetic Organic Chemistry. Organic and Biomolecular Chemistry Vol. 1. EOLSS.2010.

23. Noerdin D. Elusidasi Struktur Senyawa Organik dengan Spektroskopi Ultarlembayung dan Infaramerah. Penerbit Angkasa. Bandung. 1986. hal. 91-98.

33

24. Benny, R. F. Kimia Material Spektroskopi Infra Merah (FT-IR) dan Sinar Tampak (UV-Vis). Pascasarjana Universitas Andalas. Padang. 2011. hal. 4, 13

25. Williams, D., Fleming, I. Spectroscopic Methods In Organic Chemistry Fourth Edition. Mc Graw-Hill Book Company. 1987.

26. Gritter RJ et al. Pengantar kromatografi. Terjemahan oleh Kosasih PK. Penerbit ITB. Bandung.1991. hal 64

27. Adnan M. Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Penerbit ANDI. Yogyakarta. 1997. hal. 36, 38

28. Wahyuni T. HPLC Prinsip Dasar dan Peralatan. Puslitkimia. LIPI. 2003.

29. Mulja M & Suharman. Analisis Instrumental. Airlangga University Press. Surabaya. 1995. hal. 236-241

30. Mulja, M. Aplikasi Spektrofotometer UV-VIS. Mecphiso. Surabaya. 1990. Hal 3.

31. Bruno, Thomas J. Handbook of Basic Tables for Chemical Analysis 2nd

edition. CRC Press. United States. 2003. Hal 363-404

32. Sitorus, M. Spektroskopi Elusidasi Struktur Molekul Organik. Graha Ilmu. Yogyakarta. 2009. hal.36

33. Cresne., Clifford J., Olaf A. Runquist., Malcon M. Campbell. Analisis Spektrum Senyawa Organik. Penerbit ITB. Bandung. 1982. hal: 85-93.

34. Kealey D. & P.J. Haines. Instant notes Analytical Chemistry. BIOS Scientific Publishers Limited ltd. United Kingdom. 2002. Hal 242-247.

35. Ahmad F., M. S. Hj. Idris, A. M. Adib. Synthesis and Characterization Some Flavonoids Derivates. UTM Press. Malaysia. 2006. Hal 9-16.

34

LAMPIRAN I

Skema Kerja Sintesis derivat luteolin

Sebanyak 5 mg sampel luteolin murni

Serbuk kering

Senyawa sintetik yang belum murni

Hasil

Kesimpulan

Senyawa hasil partisi

Analisis data

Dituang ke dalam labu Erlenmeyer 50 mL

Diuapkan pada suhu ruangan

Dipartisi dengan metode Kromatografi Lapis Tipis Preparatif

Diaduk selama 2 jam pada suhu 20ºC

Dilarutkan dalam 2 mL metanol.

Ditambahkan 6 mL asam asetat glasial dan 0,5 mL piridin

Ditambahkan kloroform sama banyak

Ditimbang bobot serbuk yang terbentuk Dianalisis kemurniannya dengan metode KLT

Dikarakterisasi dengan Spektrofotometer UV-Vis dan FT-IR

Pembahasan

35

LAMPIRAN II Gambar danTabel Hasil Penelitian

S2

S1

4,4 cm

A B Gambar 3. Profil Kromatogram Hasil Sintesis Senyawa Derivat Luteolin (Senyawa 3‟,4‟-Diasetil-5,7-Dihidroksiflavon). Fase diam silika gel dan fase gerak heksan-etil asetat (1:3), A : visualisasi dengan UV 254 nm dan B : Visualisasi dengan UV 366 nm. Rf SM=0,72; Rf S1=0,57; Rf S2=0,87

5,1 cm

A B Gambar 4. Profil Kromatogram Hasil Separasi Senyawa Derivat Luteolin (Senyawa 3‟,4‟-Diasetil-5,7-Dihidroksiflavon). Fase diam silika gel dan fase gerak heksan-etilasetat-metanol (3:1:1), A : visualisasi dengan UV 254 nm, B : Visualisasi dengan UV 366 nm.Rf A = 0,7 ; Rf B = 0,14.

36

Gambar 5. Spektra UFLC Senyawa Hasil Sintesis

Tabel 5. Data Spektra UFLC Senyawa Hasil Sintesis

37

Gambar 6. Spektra UV-Vis Luteolin Murni

Tabel 6. Data Spektra UV-Vis Luteolin Murni

38

Gambar 7. Spektra UV-Vis Senyawa Hasil Sintesis

Tabel 7. Data Spektra UV-Vis Senyawa Hasil Sintesis

39

Gambar 8. Spektra FT-IR Senyawa Hasil Sintesis

Bilangan Gelombang

(cm-1

)

Kemungkinan Gugus Fungsi

3844 C-H (siklik)

3746 C-H (siklik)

2608 Dimer –COOH (aromatik)

2360 N-H (tersier)

1710 C=O (karbonil)

1546 C=C (aromatik)

1487 C=C (aromatik)

1391 C-H (metil)

1263 C-O (terkonjugasi)

1012 C-O (terkonjugasi)

888 N-H

759 N-H

681 N-H

Tabel 8. Data Spektra FT-IR Senyawa Hasil Sintesis