Etude de l’interaction antagoniste entre Lactibacillus sp ...theses.univ-oran1.dz/document/TH2866.pdf · La culture de ces bactéries dans des milieux sélectifs et dans des meilleures

République Algérienne Démocratique et Populaire Ministère de l'enseignementsupérieur et de la recherche scientifique

Université d'Oran Es-Senia Faculté des SciencesDépartement de Biologie

MEMOIRE DE MAGISTEROption: Microbiologie Alimentaire

Thème

Etude de l’interaction antagoniste entre Lactibacillus sp.et quelques souches d’entérobactéries

Présenté par

Mademoiselle Bey Faiza

Soutenu le : / /2009

Devant le jury:

Pr. SAIDI Djamel Président Université d’Oran

Pr. SLIMANI Miloud Examinateur Université d’Oran

Dr. ABBOUNI Bouziane Examinateur Université de Sidi Bel-Abbés

Dr. CHERIGUENE Abderrahim Examinateur Université de Mostaghanem

Pr. BENSOLTANE Ahmed Rapporteur Université d’Oran

Année universitaire

2008-2009

Remerciement

Avant tout, je remercie Dieu le Tous Puissant de m’avoir donné la force, le

courage, la santé et la patience pour pouvoir accomplir ce travail.

J’adresse mes sincères remerciements au Pr BENSOLTANE Ahmed

qui m’a offert par ses compétences scientifiques et pédagogiques et ses qualités

humaines, les moyens de mener à bien ce travail. Je tiens également à le remercier

pour la confiance et le soutien permanent.

J’adresse toute ma reconnaissance au Pr SAIDI Djamel d’avoir

accepter de présider le jury de soutenance.

Je remercie Pr SLIMANI Miloud, Dr ABBOUNI Bouziane et DrCHERIGUENE Abderrahim d’avoir accepter de juger mon travail.

Je remercie Monsieur BOUDILMI Benabdellah docteur vétérinaire aulaboratoire vétérinaire régional de Tlemcen.

A la mémoire de Monsieur LOKBANI Ismail spécialiste en virologie aulaboratoire vétérinaire régional de Tlemcen.

Je remercie Monsieur LAKHAL Abdalhafid chargé de cours à l’universitéAboubakr Belkaid Tlemcen.

A tous le personnelle du laboratoire vétérinaire régional de Tlemcen.

A mes chers parents pour leur aide, leur soutien durant mon travail, et à toutema famille.

Enfin je remercie tous ceux qui ont de prés ou de loin contribué

à la réalisation de ce travail.

Résumé

Afin de stabiliser le microbiote intestinal et prévenir ou traiter les infections

entériques, il est suggéré depuis des décennies d’utiliser certaines bactéries lactiques

dites « probiotiques». La consommation de ces bactéries, qui sont des composants

normaux du microbiote intestinal, aurait des effets bénéfiques sur la santé.

Cependant, leur éventuel rôle prophylactique ou thérapeutique n’a été que très peu

étudié.

En ce basant sur ces critères, on a réalisé l’interaction bactérienne entre les

souches de Lactobacillus (L. lactis, L. helveticus et L. rhamnosus) et les

Entérobactéries (E. coli, S. typhi et K. oxytoca) on passant par trois étapes :

La mise en évidence d’Entérobactéries qui repose sur l’observation

macroscopique et microscopique qui révèlent des petits bacilles à caractère Gram

négatif. La culture de ces bactéries dans des milieux sélectifs et dans des meilleures

conditions de croissance nous a permit d’isoler E. coli, S. typhi et K. oxytoca.

A la fin de cette étape on a réalisé l’antibiogramme qui a été important pour

étudier la réaction de ces bactéries vis-à-vis des antibiotiques utilisés et qui nous

conduit vers un traitement éventuel.

L’étude microbiologique des souches de Lactobacillus qui nous a montré que

ces bactéries sont des bacilles, Gram positif, les tests biochimiques et la fermentation

des sucres nous ont permit d’identifie et confirmé l’appartenance de ces souches au

genre Lactobacillus. L’étude de leurs sensibilité aux antibiotiques est un critère

important pour sélectionner les probiotiques , la résistance est recherché chez ces

souches pour qu’elles soient actif même après un traitement aux antibiotiques.

L’interaction entre Lactobacillus (L. lactis, L. helveticus et L. rhamnosus) et

les Entérobactéries (E. coli, S. typhi et K. oxytoca) a donné des résultats positifs

observés par la présence des halos d’inhibition. E. coli est inhibée par Lb1 avec un

diamètre de 19mm et de 23mm avec Lb2 et 18mm avec Lb3, tan disque S. typhi est

inhibée par Lb1avec un diamètre de 19mm et de 28mm avec Lb2 et 31mm avec Lb3,

et pour la souche K. oxytoca sa croissance est inhibée par Lb1 avec un diamètre de

17mm et de 22mm avec Lb2 et 19mm avec Lb3, et en fin on a constaté que Lb1

inhibe la croissance de E. coli ATCC 25922 avec un diamètre de 24mm et de 23mm

avec Lb2 et de 20mm pour Lb3. Des tests supplémentaires sont nécessaires pour

connaitre la nature exacte de l’agent inhibiteur. Les résultats ont montré que la

sécrétion des acides organique et la production des bactériocines sont à l’origine de

l’inhibition. A la fin on a réalisé, l’intérêt d’étudier cette interaction est de trouvé un

moyen de cont rôlé l’effet pathogène des Entérobactéries a base des propriétés

antimicrobiennes des souches de Lactobacillus.

Mots clés : Enterobactéries, Maladies intestinale, infection urinaires, Intéraction,

Lactobacillus, Probiotiques, Antagonisme, Bactériocines, infection entérique.

Abstract

For decades, the use of certain lactic acid bacteria as so-called probiotics has

been suggested in order to stabilize the intestinal microbiota and thus prevent or treat

enteric infections. Consumption of these bacteria, which are normal components of

human intestinal microbiota, is reputed to be beneficial to health. However, their

possible role as therapeutic or prophylactic agents has been studied very little.

While basing for on these criteria, we started to carry out the bacterial

interaction between Lactobacillus strains (L. lactis, L. helveticus, L. rhamnosus) and

Enterobacteria (E. coli, S. typhi and K. oxytoca) while passing by three stages:

The description of Entérobactérias which rests on the observation macroscopic

and microscopic who reveal small bacilli with character negative Gram. Culture of

these bacteria in mediums selective and in better conditions of growth us a made it

possible to insulate E. coli, S. typhi and K. oxytoca. With the end of this stage one

carried out the antibiogram which a was important for studies the reaction of

Entérobactérias with respect to the antibiotics used and which leads us towards a

possible treatment.

The study microbiological of Lactobacillus strains who showed us that these

bacteria are bacilli, positive Gram. Biochemical tests and the fermentation of sugars

us have allowed identifies and confirmed membership of these to the strains

Lactobacillus.The study of their sensitivity to antibiotics is a significant criterion to

select the probiotiques ones, resistance is required at these strains so that they are

active even after a treatment antibiotics.

The interaction between Lactobacillus strains (L. lactis, L. helveticus, L.

rhamnosus) and Enterobacteria (E. coli, S. typhi and K. oxytoca) gave positive results

observed by the presence of the halations of inhibitions. E. coli is inhibited by Lb1

with a diameter of inhibition of 19mm and 23mm with Lb2 and finally of 18mm with

Lb3, In a second study the growth of S. typhi was inhibited by Lb1 with a diameter of

inhibition of 19mm and 28mm with Lb2 and finally of 31mm with Lb3.Thereafter

growth of K.oxytoca was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 17mm and

22mm with Lb2 and finally of 19mm with Lb3.At the end, growth of E. coli ATCC

25922 is inhibited by Lb1 with a diameter of 24mm and 23mm for Lb2 and 20mm for

Lb3 respectively. Additional tests are necessary to know the exact nature of the

inhibiting agent. The results showed that the secretion of the organic acids and the

production of the bacteriocin bactériocines is at the origin of inhibition. With the end

one carried out the interest to study this interaction of is found a means of controlled

the pathogenic effect of Entérobactéries has base of the antimicrobic properties of the

strains of Lactobacillus.

Key words: Enterobacteria, Diseases intestinal, enteric infection , Interaction,

Lactobacillus, Probiotics, Urinary infection, Antagonism , Bactoriocin.

Listedes Abréviations

Liste des Abréviations

ADN : Acide désoxyribonucleique.

ARN : Acide ribonucleique ribosomale.

CVWT : Centre vétérinaire wilaya de Tlemcen

C° : Degrée celsius

CO2 : Gaz carbonique

D° : Degrée dornic

Ec : Escherichia cloi

g/l : Gramme par litre

G+C : Guanine+cytosine

H : Heure

HCl : Chlorure d’hydrogène

Ko : Klebsiella oxytoca

Lb : Lactobacillus

mg : Milligramme.

min : Minuteml : Millilitre

NaCl : Chlorure de sodium

NaOH : Hydroxyde de sodium

O2 : Oxygène

pH : Potentiel d'hydrogène

St : Salmonella typhi

Ufc : Unité formant colonies

μ : Micron

μg : Microgramme

% : Pour cent

Listedes Tableauxet Figues

Liste des tableaux

Tableau 1 : Rôles des différents groupes bactériens retrouvés dans le microbiote.

Tableau 2 : Principaux agents infectieux responsables d’infections entériques.

Tableau 3: Les Milieux d'isolement des bactéries lactiques.

Tableau 4 : Différents genres de bactéries lactiques et leurs principales

Caractéristique.

Tableau 5 : Liste d’éspéces du genre Lactobacillus.

Tableau 6: Liste des principales souches microbiennes considérées comme

probiotiques.

Tableau 7 : Principaux critères de sélection des probiotiques.

Tableau 8 : Provenance des souches.

Tableau 9 : Liste des antibiotiques testés et leurs charges.

Tableau 10: Tests biochimiques recherchés pour l’identification des souches

des étudiées.

Tableau 11 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches d’E. coli.

Tableau12 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de S. typhi.

Tableau 13 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de K.oxytoca.

Tableau 14 : Résultat du test de fermentation des sucres par les souches deLactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3).

Tableau 15: Résultat de l’antibiogramme des étudies isolées Lb1, Lb2 et Lb3.

Tableau 16 : Résultats d’halos d’inhibition d’antagonisme entre Lb1, Lb2, Lb3 etEc1, St1, Ko1 et E. coli ATCC 25922.

Tableau 17: Résultats de la densité optique de S.typhi (St1) et S. typhi (St1) + 1 ml deHcl.

Tableau 18 : Résultats de la densité optique de S.typhi et S. typhi + 1 ml desurnageant.

Tableau 19: Contrôle de Qualité: Escherichia coli ATCC 25922.

Tableau 20 : des résultats des teste biochimiques API20E.

Liste des figures

Figure 1: Colonisation microbienne du tractus gastrointestinal humain.

Figure 2 : E. coli observés au microscope électronique

Figure 3 : Pathogénie de la souche E. coli chez l’humain

Figure 4 : S. typhi observés au microscope électronique

Figure 5: K. oxytoca observés au microscope électronique

Figure 6 : Le système immunitaire intestinal

Figure 7: Défenses antimicrobiennes de l’hôte face à l’intrusion de micro-organismespathogènes au niveau du tractus intestinal.

Figure 8 : Lactobacillus rhamnosus (à gauche) et, Lactobacillus helveticus (à droite),observés au microscope électronique.

Figure 9: Schéma représentatif de la méthodologie de prélèvement et d'identificationdes souches étudiées. CVWT

Figure 10: Test de fermentation des sucres

Figure 11: méthode de la recherche des halos d’inhibition.

Figure 12 : schéma représentant la recherche de Bactériocine

Figure 13: Aspect macroscopique d’E.coli après incubation à 37°C /24h

Figure14: Aspect macroscopique d’S .typhi après incubation à 37°C /24h

Figure15 : Aspect macroscopique de K.oxytoca après incubation à 37°C /24h

Figure16 : Observation microscopique de la souche E.coli (G x100).

Figure 17 : Observation microscopique de la souche S.typhi (G x100).

Figure 18: Observation microscopique de la souche K.oxytoca (G x100).

Figure 19: Résultats de l’identification biochimique de la souche E.coli.

Figure 20: Résultats de l’identification biochimique de la souche S.typhi.

Figure 21: Résultat de l’identification biochimique de la souche K. oxytoca.

Figure 22 : Résultat de l’antibiogramme de la souche E. coli (Ec1).

Figure 23 : Résultat de l’antibiogramme de la souche S. typhi (Ec1).

Figure 24: Résultat de l’antibiogramme de la souche Klebsiella oxytoca (Ko4).

Figure 25 : L’aspect des colonies de la souche L. rhamnosus (Lb3) ensemencé parstries sur milieu MRS gélosé, incubées à 30°C pendant 48heures en aeroanaerobiose

Figure 26: Observation microscopique de la souche L. rhamnosus (Lb3)

Figure 27 : Test de fermentation des trois souches de Lactobacillus Lb1, Lb2, Lb3

Figure 28 : Profil fermentaire de la souche L. lactis (Lb1).

Figure 29 : Profil fermentaire de la souche L. helveticus (Lb2).

Figure 30: Profil fermentaire de la souche L. rhamnosus (Lb3).

Figure 31: Résultats du test d’antibiogramme de la souche L. rhamnosus (Lb3).

Figure 32 : Cinétique d’évolution de l’acidité Dornic produite par les souches Lb1,Lb2 et Lb3 à 30°C

Figure 33 : Variation du pH des souches de Lactobacillus, lors du suivie de l’aciditétitrable

Figure 34 : Résultat de l’interaction entre E. coli ATCC 25922 et Lb1, Lb2 et Lb3

Figure 35 : Résultat de l’interaction entre E. coli (Ec1) et Lb1, Lb2, Lb3

Figure 36: Résultat de l’interaction entre S. typhi (St1) et Lb1, Lb2, Lb3

Figure 37: Résultat de l’interaction entre K. oxytoca: (Ko1) et Lb1, Lb2, Lb3

Figure 38: Croissance de S. typhi (St1) en fonction du pH.

Figure 39: Croissance de S. typhi (St1) en présence de bactériocine produite parLactobacillus rhamnosus (Lb3)

Sommaire

Sommaire

IntroductionEtude bibliographique1-Ecosystème gastro-intestinal1.1-Description générale1.2-Microflore intestinale1.3- Importance de la barrière microbienne1.4- Les infections entériques et réponses de l’hôte1.4.1- Principales causes d’infections entériques1.4.2- Bactéries pathogènes1.4.2.1- Escherichia coli1.4.2.1.1- Habitat1.4.2.1.2- Caractérisation d’Escherichia coli1.4.2.1.3-Caractères morphologiques1.4.2.1.4- Caractères culturaux1.4.2.1.5- Caractères biochimiques1.4.2.1.6- Résistance aux agents physiques et chimiques1.4.2.1.7- Structure antigénique1.4.2.1.7.1-Antigène O, Antigène de la paroi ou Antigène somatique1.4.2.1.7.2- Antigène K, antigène capsulaire ou antigène d’enveloppe1.4.2.1.7.3- Antigène H ou antigène flagellaire1.4.2.1.7.4- Antigène F ou antigène fimbriaire1.4.2.1.8- Pouvoir pathogène1.4.2.1.9- Groupes pathogènes d'E. coli1.4.2.1.9.1- E. coli entéropathologène (ECEP)1.4.2.1.9.2- E. coli entérotoxinogène (ECET)1.4.2.1.9.3- E. coli entero-invasive (ECEI)1.4.2.1.9.4- E. coli enterohemorragique (ECEH)1.4.2.1.9.5- E. coli enteroaggrégant et enteroadhérant (ECEAgg)1.4.2.1.10- Moyens de lutte et traitements actuels1.4.2.2- Salmonella typhi1.4.2.2.1-Habitat1.4.2.2.2- Caractérisation de S. typhi1.4.2.2.3- Caractères morphologiques1.4.2.2.4- Caractères culturaux1.4.2.2.5- Caractères biochimiques1.4.2.2.6- Structure antigénique1.4.2.2.6.1- Antigènes somatiques (ou antigène O)1.4.2.2.6.2 -Antigènes flagellaires (ou antigène H)1.4.2.2.6.3-Antigènes capsulaires (ou antigène Vi)1.4.2.2.7-Pouvoir pathogène1.4.2.2.8- Physiopathologie et symptomatologie de Salmonella typhi1.4.2.3- Les Klebsiella1.4.2.3.1- Habitat1.4.2.3.2- Caractérisation de la bactérie1.4.2.3.3- Caractères morphologiques1.4.2.3.4- Caractères culturaux1.4.2.3.5- Caractères biochimiques1.4.2.3.6- Structure antigénique

1

333488999991011121212131313141516161617171718181818191919202020202122222223232324

1.4.2.3.7-Pouvoir pathogène1.5- Modulations des mécanismes de la réponse immunitaire1.6 Défenses de l’hôte2- Les bactéries lactiques2.1. Définition et caractéristiques généraux des bactéries lactiques2.2. Les milieux naturels des bactéries lactiques2.3-Taxonomie et classification2.3.1. Caractère morphologique2.3.2- Classification des bactéries lactiques2.4-Les Lactobacillus2.4.1- Habitat2.4.2-Caractères morphologiques2.4.3- Caractères culturaux2.4.4-Caractères biochimiques2.5- Phénomènes des interactions entre les bactéries2.6- Production des bactériocines3- Les probiotiques3.1-Historique de leur utilisation et définitions3.2-Souches à fort potentiel probiotique3.3- Critères de sélection des probiotiques3.4-Allégations santéMatériel et Méthodes1-MATERIELS1.1-Souches étudiées1.2-Souche de référence1.3-Antibiotiques testés1.4-Milieux de culture2-METHODES2.1-Identification des souches isolées2.1.1-Examen bactériologique2.1.2-Enrichissement2.1.3-Isolement2.1.4-Identification2.1.4.1- Examen macroscopique2.1.4.2 - Examen microscopique2.1.4.3 -Identification des caractères biochimiques2.1.4.3.1-Test des 3 sucres2.1.4.3.2- Test mannitol-mobilité2.1.4.3.3- Test de Simmons2.1.4.3.4- Production d’acétone2.1.4.3.5- Recherche de la production d’indole2.1.4.3.6- Recherche de à ß-galactosidase2.1.4.3.7- Recherche de l’uréase et du tryptophane désaminase2.1.4.3.8- Recherche de nitrate réductase2.1.4.3.9- Recherche de l’oxydase2.1.4.3.10- Recherche de L.D.O ; O.D.C et ADH2.1.5- Antibiogramme2.2- Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus sp2.2.1-Tests enzymatiques2.2.1.1-Recherche de catalase2.2.1.2-Recherche de l’oxydase2.2.2- Antibiogramme

242425272730323232343434353542444545464750

525253535455555555555657575757575858585859595959606161616161

2.2.3-Tests physiologiques2.2.3.4- La production de CO2 de la fermentation du glucose2.2.3.5-Fermentation des sucres2.2.3.6- Suivie de l’acidité titrable2.2.3.7- Suivi du pH2.3-Test de l’antagonisme2.3.1-Préparation des précultures2.3.2-Recherche des inhibitions2.3.3-Recherche des agents d’inhibition2.3.3.1- Le pH2.3.3.2 - Recherche de bactériocinesRésultats1-Identification des entéropathogène : E.coli, S.typhi, K.oxytoca1.1-Etude bactériologique1.2- Identification des caractères biochimiques1.3- Antibiogramme des souches isolées : E.coli, S.typhi, K.oxytoca2-Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus : Lb1, Lb2, Lb32.1-Etude macroscopique et microscopique2.2- Tests physiologiques et biochimiques2.2.1- Activités enzymatiques2.2.2- Production de CO22.2.3- Identification de l’espèce par le profil fermentaire2.3- Antibiogramme2.4-L’acidification du lait3- Test de l’antagonisme3.1- Recherche des inhibitions3.2- Recherche des ageant d’inhibition3.2.1- Le pH3.2.2- Recherche de bactériocines

Discussion

1- Isolement et identification des souches d’entérobactéries2- Identification des souches de Lactobacillus3- Interaction bactériennes

Conclusion et PerspectivesRéférences bibliographiquesPublications scientifiqueAnnexe

6262626364656565676767

6969717375757676767678798080838384

858890

9496

Introduction

Introduction

1

Introduction

Chaque année, les infections entériques surviennent en grand nombre, ce

problème important de santé publique touche tous les groupes d’âge et

particulièrement les populations sensibles telles que les nourrissons, les enfants et les

personnes âgées.

Les bactéries pathogènes Campylobacter, Salmonella, Klebsiella et E. coli sont

les causes les plus communes d’infection entérique au niveau mondial (Fasano,

2001 ; Lamps, 2007) et l’incidence de ces micro-organismes demeure préoccupante.

De façon générale, les entéropathogènes bactériens représentent près de 15%

des cas de diarrhées dans les pays développés et plus de 50% dans les pays en voie de

développement (DuPont, 2005).

Environ 1 Enfant sur 10 en meurt avant d'atteindre l'âge de 5 ans. La diarrhée

peut être d'origine bactérienne, parasitaire ou virale (Tortora et al., 2003)

Actuellement, l’antibiothérapie est le traitement le plus commun contre les infections

à E. coli. Cependant des études cliniques récentes ont montré que leur utilisation ne

serait pas recommandée car ils peuvent être associés à un risque plus élevé de

développer un syndrome urémique hémolytique chez les enfants et les personnes

âgées en plus d’allonger la durée de la diarrhée (Molbak et al., 2002 ; Panos et al.,

2006), et vue la résistance bactérienne croissante avec l'utilisation abusive des

antibiotiques l'alternative de ce problème pourrait être la consommation de bactérie

probiotiques (Syndifrais, 2005).

Depuis quelques années, les bactéries probiotiques ayant des effets bénéfiques

sur la santé reçoivent un engouement croissant. L’utilisation des probiotiques en

thérapeutique a naturellement concerné en premier lieu les maladies de l’appareil

digestif, et en particulier les maladies de l’intestin grêle et du colon ; les travaux en

Introduction

2

pathologie digestive ont utilisé soit des « probiotiques-aliments», ou plus souvent, des

«probiotiques-medicaments» (Pelletier et al., 2007).

Plusieurs études ont montré l’effet thérapeutique des probiotiques sur les

diarrhées aigue infectieuse et diarrhée compliquant l’antibiothérapie (De-Vrese et

Marteau, 2007) sur les maladies inflammatoire chroniques intestinales (Barnich et

Darfeuille-Michaud, 2007 ; Falagas et al., 2008). Mais des études supplémentaires

sont nécessaires pour déterminer de façon précise le mécanisme d’action de chaque

souche probiotique.

Alors pourquoi ne pas essayer de détecter la présence de substances

antimicrobiennes chez nos souches de Lactobacillus, tel est l'objectif de notre étude

qui est divisé en deux parties :

La première partie : une étude bibliographique qui révèle plusieurs points sur

les Entérobactéries (E. coli, S. typhi et K. oxytoca) concernant les aspects

microbiologiques, épidémiologiques, physiologiques et thérapeutiques et

l’importance des bactéries lactiques comme organismes probiotiques.

La deuxième partie : composé d’une méthodologie de travail, puis résultats et

discussion.

Le but de notre travail est :

1- Isolement et identification des entérobactéries à savoir : E. coli, S. typhi

et K. oxytoca à partir des selles et des urines des patients hospitalisés ou

CHU de Tlemcen.

2- Une vérification de la pureté des souches de Lactobacillus isolé à partir

du lait de chamelle aimablement offertes par le laboratoire de

microbiologie du centre vétérinaire de la wilaya de Tlemcen.

3- La recherche des inhibitions inter- bactériennes.

EtudeBibliographique

Etude bibliographique

3

1- Ecosystème gastro-intestinal

1.1- Description générale :

Le tractus gastro-intestinal est un écosystème complexe et ouvert aux

microorganismes exogènes. De par sa surface totale (muqueuse) estimée à 200-300

m2, il représente la plus grande surface du corps en contact avec l’environnement.

L’écosystème gastro-intestinal est généré par une alliance stable entre l’épithélium

gastro-intestinal, le système immunitaire et une importante flore microbienne. Ces

trois composants sont continuellement liés entre eux et évoluent ensemble en assurant

une fonction et une activité normales de l’écosystème. Si l’un des trois composants

de l’écosystème est défaillant, l’alliance est altérée et par conséquent diverses

pathologies s’y installent (Mc Cracken et Lorenz, 2001).

Il existe plusieurs compartiments constituant le tractus gastro-intestinal de

l’homme .Les interactions entre les microorganismes et l’hôte peuvent être de trois

types: symbiose, commensalisme et pathogénique. L’hôte est protégé contre la

microflore intestinale pathogène par les barrières chimiques et physiques formées par

l’épithélium gastro-intestinal (Hooper et Gordon, 2001).

1.2-Microflore intestinale :

La flore intestinale normale est une collection complexe et en équilibre de

microorganismes qui habitent normalement le tractus gastro-intestinal et remplissant

un rôle dans la nutrition, la physiologie et le contrôle du système immunitaire de

l’hôte. Après une colonisation complète, la microflore intestinale est considérée

comme un organe acquis après la naissance. Il est constitué d’une grande diversité

d’espèces microbiennes assurant différentes fonctions pour l’hôte. La microflore du

tractus gastro-intestinal a été estimée de 1013 à 1014 cellules microbiennes

représentant 400 à 500 espèces et sous espèces. Cette microflore représente environ

10 fois le nombre total de cellules du corps humain (Bjorksten, 2004).


4

La prévalence des bactéries dans le tractus gastro-intestinal dépend des

conditions régnant dans le compartiment du tractus. Deux catégories de bactéries ont

été identifiées : les bactéries autochtones ou indigènes se trouvant dans des niches

particulières, et les bactéries allochtones ou transitoires rencontrées dans d’autres

habitats du tractus. La majorité des bactéries pathogènes sont allochtones et vivent

normalement en harmonie avec l’hôte, excepté lorsque l’équilibre du système est

rompu (Hao et Lee, 2004).

1.3- Importance de la barrière microbienne :

Le microbiote résident du tractus gastrointestinal humain contient diverses

populations de bactéries qui jouent un rôle essentiel dans le développement et le bien-

être de l’hôte (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). En plus de ses effets nutritionnels et

physiologiques, le microbiote intestinal participe à la protection de l’hôte en agissant

comme une barrière microbienne contre l’infection par des pathogènes microbiens

(Servin, 2004). Ce rôle est communément appelé «l’effet barrière».

L’établissement de cet écosystème microbien complexe s’effectue dès les

premières heures de vie d’un nouveau-né, qui en est initialement dépourvu (Steer et

al., 2000). Les premiers germes rencontrés sont des entérobactéries (E. coli

essentiellement) et streptocoques (Cibik et al., 2004). Puis vers le deuxième-troisième

jour, apparaissent des espèces variées appartenant aux genres Bifidobacterium,

Lactobacillus, suivent ensuite les Bacteroides et Clostridiae (Ballongue, 1998).

Jusqu’à l’âge de deux ans, le microbiote se diversifiera et s’établira dans les

différents compartiments du tractus digestif tel qu’illustré à la Figure 1.

La connaissance des genres et des espèces dominantes, de même que leurs

concentrations et leurs activités biologiques sont utiles pour comprendre l’écologie

du tractus gastrointestinal. Le microbiote de l’estomac est peu élevée avec des

concentrations inférieures à 103 cfu/ml et sont en général des micro-organismes

Gram-positifs et aérobiques (Gibson et Beaumont, 1996).


5

L’intestin grêle constitue une zone de transition entre la population disparate de

l’estomac et le microbiote luxuriant du côlon. En conditions normales, le microbiote

de la première partie du duodénum est similaire à celle de l’estomac. Les espèces

dominantes incluent entre autres les streptocoques et lactobacilles (Mackie et al.,

1999). Dans la dernière partie de l’intestin grêle, le nombre de bactéries Gram-

négatifs dépasse celui de Gram-positifs. Les coliformes et les bactéries anaérobiques

telles que les Bacteroides, bifidobactéries et fusobactéries sont régulièrement présents

en concentrations substantielles jusqu’environ 108 cfu/ml (Mackie et al., 1999).

A la suite de l’intestin grêle, la concentration bactérienne augmente rapidement

pour atteindre 1010 à 1012 cfu/g (Conway, 1995; Macfarlane et al., 2004). Les

bactéries anaérobiques dépassent les aérobes. Les bactéries dominantes sont les

Bacteroides, bifidobactéries, coques Gram-positifs, clostridia et différentes espèces

d’entérobactéries sont aussi présentes (Guarner, 2006).

En général, les populations bactériennes à l’intérieur du tractus gastrointestinal

coexistent en ayant chacune leur niche écologique nécessaire à leur croissance (Fooks

et Gibson, 2002). Cependant, pour fonctionner de façon optimale, la balance du

microbiote bactérien doit être maintenue de façon équilibrée mais de nombreux

facteurs peuvent l’affecter. La composition globale du microbiote dans l’intestin peut

être influencée par l’âge de l’hôte, l’état de santé, l’alimentation (riche en sucres ou

en protéines) et l’adaptation de chaque espèce (Ventura et al., 2004). Ceci explique

les variations interindividuelles retrouvées dans la population en général (Hopkins et

al., 2002). Un autre facteur contributoire est la consommation de médicaments, en

particulier les antibiotiques, qui détruisent les bactéries et peuvent avoir un impact

négatif sur la balance du microbiote intestinal. Ainsi, tous ces facteurs peuvent

déplacer l’équilibre du microbiote contenant des bactéries potentiellement bénéfiques

vers des micro-organismes néfastes comme les clostridia, les réducteurs de sulphates

et les Bacteroides protéolytiques (Salminen et al., 1998).


6

Figure 1: Colonisation microbienne du tractus gastrointestinal humain.Adapté de Holzapfel et al. (1998).

Le concept des espèces bénéfiques existe depuis longtemps (Liévin et al.,

2000). selon ce concept, certaines bactéries formant le microbiote intestinal seraient

associées à des effets positifs sur la santé, alors que d’autres sont considérées comme

néfastes (Tableau 1).

Les bactéries potentiellement favorables pour la santé incluent principalement

les genres Bifidobacterium et Lactobacillus et leur dominance chez les nouveaux-nés

nourris au sein leur procureraient une protection contre les infections intestinales

(Picard et al., 2005).


7

Tableau 1 : Rôles des différents groupes bactériens retrouvés dans le

microbiote

Bactéries intestinales Rôles Effet

Bifidobactéries

Lactobacilles

Bacteroides

EntérocoquesE. coli

Streptocoques

Ps. aeruginosaProteus sp

StaphylocoquesClostridium

Veillonellae

Digestion/ absorption des aliments,stimule la fonction immunitaire,synthèse de vitamines

Digestion/ absorption des aliments,stimule la fonction immunitaire

Synthèse de vitaminesputréfaction intestinale

Inhibition de bactéries exogènesdiarrhée/ constipation

Stimule la fonction immunitaireproduction de précurseurs cancéreux

Putréfaction intestinale

Production de précurseurs cancéreux

+

+

+

+/-

+/-

-

-

Adapté de Salminen et al. (1998); Guarner (2006).

Tel que souligné par Servin et al. (2004), il apparaît de plus en plus évident que

les bactéries appartenant aux genres Bifidobacterium et Lactobacillus possèdent des

activités antimicrobiennes qui participent au système de défense gastrointestinal de

l’hôte. Il est ainsi intéressant d’améliorer la composition du microbiote intestinal par

les aliments en apportant des bactéries transitoires. Le but étant d’augmenter le

nombre et l’activité des microorganismes possédant des propriétés bénéfiques à la

santé.


8

1.4- Les infections entériques et réponses de l’hôte :

1.4.1- Principales causes d’infections entériques :

Les infections entériques résultent de l’ingestion de micro-organismes

pathogènes ou de leurs toxines (Steer et al., 2000). Il existe une grande variété de

bactéries, virus et parasites à l’origine des infections entériques (Tableau 2).

Cependant, les micro-organismes d’origine bactérienne et virale sont le plus

souvent impliqués dans les cas rapportés et leur mode de transmission se fait

principalement par la voie oro-fécale (Mead et al., 1999; Tauxe, 2002). Ces

principaux entéropathogènes sont capables d’envahir le tractus intestinal pour s’y

multiplier et causer principalement des symptômes diarrhéiques mais également dans

certains cas des nausées, des vomissements et une altération générale de l’état de

santé (Steer et al., 2000).

Tableau 2 : Principaux agents infectieux responsables d’infections entériques.

Adapté de Koopmans et al. (2002); Gadewar et Fasano (2005); Lamps (2007).

Bactéries Virus Parasites/protozoaires

CampylobacterSalmonella

E. coliShigella

Vibrio choleraClostridium difficile

Aeromonas

Pleisiomonas

Yersinia

Klebsiella

NorovirusRotavirusAstrovirus

Adenovirus entériques(types 40, 41)

Hépatite A et E

Entamoeba histolyticaGiardia lamblia

Cryptosporidium parvumMicrosporidiumIsospora belli

Cyclospora cayetanensis


9

1.4.2- Bacteries pathogenes

1.4.2.1- Escherichia coli :

Théodor Escherichia, médecin Allemand fut en 1885 l'inventeur d'une bactérie

particulière bacterium coli commune qui sera appelée plus tard Escherichia coli

(Guiraud, 1998)

1.4.2.1.1- Habitat :

Depuis plus d'un siècle, il est connu que Escherichia coli est un hôte normal

de la flore digestive de l'homme et de nombreuses espèces animale souvent retrouvés

en petit nombres dans les urines saines, c’est une bactéries largement répandue dans

le milieu extérieur; elle ne semble cependant pas pouvoir y mener une vie saprophyte

authentique : sa présence en quantité importante témoigne d'une contamination fécale

récente .(Savage, 1977 ; Grimont, 1997 ; Joffin, 2002).

1.4.2.1.2- Caractérisation d’Escherichia coli :

Elle fait partie du groupe des Entérobactéries. Cette bactérie constitue une

espèce aérobie quantitativement la plus importante à raison de 107 à 109 corps

bactériens par gamme dans le caecum ou le rumen. (Pilet et al., 1981 ; Grimont,

1997 ; Phillipon, 2007).

1.4.2.1.3-Caractères morphologiques :

Bacille à bout arrondi, Gram-, mesure approximativement 2 à 4 µ de

longueur sur 0.6 µ de largeur, ne possédant ni capsule ni spores, elle se présente isolé

ou en courtes chaînettes (Figure 2), et en quelque cas, sous forme de très long

filaments. (Djelouat, 2008).

Pourvu de cils, elle est généralement mobile grâce à une ciliature péritriche

mais cette mobilité est très variable selon le milieu où la souche a été ensemencée.


10

Certaines souches développent des capsules et cultivent sur milieux solides en

donnant des colonies muqueuses. (Le Minor et Richard ,1993).

Figure 2 : E. coli observés au microscope électronique (Ducluzeau, 2006).

1.4.2.1.4- Caractères culturaux :

Aérobie facultatif, elle cultive bien en 24 heures à 37 °C sur les milieux gélosés

en donnant des colonies rondes; lisses, à bords régulier, de 2 à 3mm de diamètre.

(Marchal et al., 1991).

La culture en bouillon ordinaire, rapide, produit un trouble avec ondes et

parfois un voile grisâtre en surface (Pasteur. 1981 ; Marchal et al., 1991).

Sur gélose ordinaire, la bactérie donne une culture blanchâtre, épaisse

crémeuse, devenant rapidement opaque, et envahissant toute la surface du milieu, et

sur milieu gélosé Mac Conkey les colonies sont lactose positif et donnent une

coloration rouge brique (Pasteur. 1981 ; Marchal et al., 1991). Toutes ces cultures

répandent, en générale, une odeur fécaloïde. (Pilet et al., 1981).


11

1.4.2.1.5- Caractères biochimiques :

C’est sur l'étude des caractères biochimiques qui repose en pratique le

diagnostique de genre et d'espèce qui ne doit être abordé qu'après que le diagnostique

de famille ait été établai avec certitude (Pilet et al., 1981).

Toute Entérobactéries lactose positif, indole positif oriente vers une

Escherichia coli, cependant la recherche des caractères biochimiques permet de

confirmer le diagnostique (Larpent, 1997).

Selon Guechi, (2002) environ 70 % des souches mobiles donnent les

caractères suivants:

- Gaz en glucose positifs en général

- Production d'indole positif

- Lactose, mannitol, sorbitol positif

- β-galactosidase (ONPG) positive

- Phénylalanine-désaminase, uérase, oxydase, gélatinas, malonate, anoditol,

inositol, H2S, Citrate de Simmons négatifs.

- Rouge de méthyle positif

- Vogues Proskauer (VP) négative

On peut rencontrer des variant négatifs pour un caractère habituellement

positif par exemple l'indole ; ceci est consécutif à une mutation.

A l'inverse, on peut exceptionnellement rencontrer des variantes positives pour

un caractère habituellement négatif. Ce caractère peut être codé par un plasmide

dont l'existence a été démontrée dans certains cas (H2S, citrate de Simmons) (Pilet

et al., 1981).

Les variantes immobiles et agazogènes d’Escherichia coli peuvent poser des

problèmes du diagnostic différentiel avec les Shigella (Larpent, 1997).


12

1.4.2.1.6- Résistance aux agents physiques et chimiques :

Escherichia coli est relativement sensible aux agents physiques et chimiques,

dans la majorité des cas, une température de 55°C pendant une heure ou 60°C

pendant 20 mn est mortelle pour ces organismes et ils sont tués en autoclave à 120°C

pendant 20 mn. (Mao et al., 2003).

Elle peut survivre des semaines ou des mois dans l'eau, les matières fécales et

dans les poussières des animaux domestiques, elle est hautement sensible à l'action

léthale du phénol et du crésol, mais l'efficacité de ces désinfectants est réduite en

présence du mucus et des fèces (Guechi, 2002).

1.4.2.1.7- Structure antigénique :

Le sérotypage représente une méthode intéressante pour caractériser des

souches pathogènes d’Escherichia coli, et n'a d'intérêt en pratique que dans la

mesure où l'on peut faire une relation entre le sérotype et le pouvoir pathogène des

souches (Nataro et Kaper, 1998 ; LeBlanc, 2003).

Il détermine la structure antigénique majeure des colibacilles notamment les

antigènes somatiques O, capsulaire K, flagellaire H, fimbriaire F (Pilet et al., 1981).

1.4.2.1.7.1-Antigène O, Antigène de la paroi ou Antigène somatique:

Sa nature est lipopolysaccharidique, chaque antigène O permet de définir un

sérotype O correspondant, grâce à des réactions d'agglutination.

Les antigènes O sont particulièrement importants, car ils conditionnent le

pouvoir pathogène des souches, ainsi que l'immunité conférée, c'est pourquoi certains

sérotypes semblent plus impliqués que d'autres dans le processus pathologiques. On a

distingué jusqu'à présent, plus de 171 antigènes O différents chez Escherichia coli

(Pilet et al., 1981).


13

1.4.2.1.7.2- Antigène K, antigène capsulaire ou antigène d’enveloppe :

De nature polysaccharidique, ils entourent les antigènes O et se présente sous

deux types de structure: la première, capsulaire lorsqu'ils constituent une capsule

visible au microscope et la seconde, d'enveloppe quand ils ne sont pas visibles au

microscope et masquent les antigènes somatiques, si bien qu'ils inhibent

l'agglutinabilité O des bactéries par les sérums de diagnostic des Escherichia coli

préparer sur lapin.

Environ 80 antigènes K ou antigène d’enveloppes différentes ont été

reconnus. (Joly et Alain, 2003).

1.4.2.1.7.3- Antigène H ou antigène flagellaire :

Ils sont présents dans les flagelles sous forme de flagelline, protéine fibreuse

comparable à la myosine du muscle. Les antigènes ne sont présents que chez les

souches mobiles. On en connaît 56 types.

Les antigènes O, K, H sont à la base d'un schéma de diagnostic antigénique,

notamment pour le diagnostic différentiel, ils permettent d'établir le sérotype et de

détecter les souches d’Escherichia coli, responsable de pathologie. (Joly et Alain,

2003).

1.4.2.1.7.4- Antigène F ou antigène fimbriaire :

Ils sont présents dans les structures fimbriaires de certaines adhésines de

virulence. Le terme '' fimbriae'' est utilisé pour décrire les adhésines de surface dont la

fonction est l'attachement de la bactérie à l'épithélium intestinal. Ces fimbriae sont

encore appelés pili ou facteurs de colonisation. Ils forment autour du corps bactérien

de fins filaments non flagellaires ayant une spécificité antigénique propre (Pilet et al.,

1981).


14

Ils sont un important facteur de pathogénécité, car ils confèrent aux bactéries

des propriétés d'adhésion aux cellules, telles les cellules intestinales ou rénales et

hémagglutinantes des bactéries qui les possèdent. (Joly et Alain, 2003).

1.4.2.1.8- Pouvoir pathogène :

La propagation de l’infection à l’homme peut s’effectuer directement par

contacts de personne à personne par la route oro-fécale, indirectement par

contamination croisée ou par la consommation d’aliments ou d’eau contaminés. De

nombreux cas d’infection à E. coli ont été associés avec la consommation de bœuf

haché insuffisamment cuit, de lait cru, de fruits et légumes ou d’eau contaminée avec

des matières fécales (Le Blanc, 2003).

Les symptômes associés aux infections par E. coli sont notamment des crampes

abdominales et des diarrhées susceptibles d’évoluer vers des diarrhées sanguinolentes

(Karch et al., 2005). De la fièvre et des vomissements peuvent également être

observés (LeBlanc, 2003). La période d’incubation est de 3 à 8 jours, avec une

moyenne de 3 à 4 jours (OMS, 2005). Dans la plupart des cas, la guérison s’effectue

dans les 10 jours, mais chez un nombre restreint de patients, l’infection peut parfois

se compliquer par un syndrome urémique hémolytique qui affecte les reins (LeBlanc,

2003).

E. coli possède des facteurs de virulence lui permettant de s’attacher aux

cellules intestinales et de libérer des toxines, connues sous le nom de vérotoxines ou

toxines de type Shiga en raison de leur ressemblance avec les toxines élaborées par

Shigella dysenteriae (Figure 3). Les vérotoxines jouent un rôle important dans

l’apparition des symptômes gastrointestinaux mais l’étape cruciale dans la

pathogenèse d’E. coli est l’attachement aux cellules de l’hôte (LeBlanc, 2003). Suite

à l’infection, des hémorragies, de l’oedème et une infiltration de neutrophiles situés


15

au niveau de la lamina propria peuvent se produire au niveau des cellules intestinales

(Nataro et Kaper, 1998).

Le diagnostic chez l’humain s’effectue soit par l’isolation de la bactérie

E. coli ou la détection de la présence des vérotoxines dans des échantillons fécaux ou

la détection d’une augmentation d’anticorps anti-E. coli dans le sérum (Nataro et

Kaper, 1998). L’incidence de ces infections varie avec la classe d’âge, mais

l’incidence maximale des cas notifiés s’observe chez l’enfant de moins de 15 ans

(OMS, 2005).

Figure 3 : Pathogénie de la souche E. coli chez l’humain. Adapté de Nataro etKaper (1998); EcL (2004).

1.4.2.1.9- Groupes pathogènes d'E. coli :

L'analyse des facteurs de virulence des souches a permis de reconnaître cinq

catégories d'E. coli pathogènes, agissant par des mécanismes différents. (Nataro et

Kaper, 1998).


16

1.4.2.1.9.1- E. coli entéropathologène (ECEP) :

Ces bactéries sont responsables des diarrhées surtout chez l'enfant. Elles

peuvent être responsables d'épidémies dans les collectivités notamment en milieu

néonatal, favorisées par le manque d'hygiène. La diarrhée peut être sévère et

prolongée : selles aqueuses accompagnées d'une grande quantité de mucus, fièvre et

vomissements. Pour manifester leur pouvoir pathogène, la plupart des souches

doivent posséder des structures d'adhérence aux entractes, gérant une destruction

progressive de ceux-ci associée ou non à l'action d'une cytotoxine (Leclerc et al.,

1995).

1.4.2.1.9.2- E. coli entérotoxinogène (ECET) :

L'ECET est une cause fréquente des diarrhées du voyageur et d'enfants dans

les pays en voie de développement. Les bactéries ingérées adhèrent aux anthérocytes

et sécrètent des entérotoxines l'une protéine thermolabile, non dialysable,

antigénique, libérée dans le milieu lors de la lyse des corps bactériens; l'autre est

thermostable, dialysable, non antigénique et peut être le résultat de fragmentation de

la molécule première. Ces toxines vont être responsables d'une diarrhée aqueuse,

s'accompagnant de nausées et de vomissements, de douleurs abdominales, parfois de

la fièvre et du malaise général (Leclerc et al., 1995).

1.4.2.1.9.3- E. coli entero-invasive (ECEI) :

C'est une souche provoquant des diarrhées aigues, avec de la fièvre, myalgies

et frissons, il s'agit de syndrome de dysentériforme : la souche se fixe à la muqueuse

et l'infecte. Certaines souches ont des réactions sérologiques croisés avec les

shigelles, aussi bien morphologique que physiologique, elles sécrètent la même

vérotoxine, elles sont retrouvées surtout chez les enfants de moins de dix ans dans les

pays en voie de développement (Leclerc et al., 1995).


17

1.4.2.1.9.4- E. coli enterohemorragique (ECEH) :

Ces germes sont responsables d'une diarrhée sanglante, de colites

hémorragiques parfois accompagnées d'atteintes rénales graves pouvant aboutir à la

mort, notamment chez l'enfant ou les personnes âgées. Ces bactéries interagissent

avec la muqueuse de l'intestin et produisent une toxine, la vérotoxine qui détruit les

vaisseaux sanguins du rein (Leclerc et al., 1995).

1.4.2.1.9.5- E. coli enteroaggrégant et enteroadhérant (ECEAgg) :

Leurs caractéristiques sont voisines de celles des ECEP. Ils provoquent des

diarrhées chez l'enfant et chez les voyageurs en milieu tropical (Leclerc et al., 1995).

1.4.2.1.10- Moyens de lutte et traitements actuels

La prévention de l’infection à E. coli exige des mesures de lutte à toutes les

étapes de la chaîne alimentaire, depuis la production jusqu’au traitement, à la

fabrication et à la préparation des aliments, tant dans les établissements commerciaux

que dans l’environnement domestique. Ainsi, les mesures d’hygiène accrues et la

cuisson des aliments demeurent des moyens efficaces pour diminuer l’incidence de

ces infections.

Actuellement, l’antibiothérapie est le traitement le plus commun contre les

infections à E. coli. Cependant, des études cliniques récentes ont montré que leur

utilisation ne serait pas recommandée car ils peuvent être associés à un risque plus

élevé de développer un syndrome urémique hémolytique chez les enfants et les

personnes âgés en plus d’allonger la durée de la diarrhée (Molbak et al., 2002; Panos

et al., 2006).

Ces auteurs ont entre autres attribué cet effet d’allongement de la diarrhée à

l’élimination du microbiote intestinal compétiteur laissant place à la multiplication

des E. coli et plus particulièrement si les souches sont résistantes aux antibiotiques


18

administrés. De plus, en lysant les cellules les antibiotiques peuvent augmenter la

diffusion des toxines (Nataro et Kaper, 1998).

1.4.2.2- Salmonella typhi :

Salmonella a été isolée pour la première fois en 1885 par Daniel Salmon, dont

Salmonella typhi est l'agent pathogène humain à l'origine de la fièvre typhoïde

(Bergeron et Dufour, 2004).

1.4.2.2.1-Habitat :

De nombreuses espèces animales hébergent des Salmonelles pathogènes ou

non pour l'homme. On peut les retrouver dans l'eau et diverses denrées alimentaires,

et aussi, on peut les trouver également dans l'intestin d'hommes sains (Philippon,

2007).

1.4.2.2.2- Caractérisation de S. typhi :

Les Salmonella typhi font partie du groupe des entérobactéries, les bactériesconstituent une espèce aéro-anaérobie facultative (Pilet et al., 1981).

1.4.2.2.3- Caractères morphologiques :Bacille à Gram négatif, mesure en générale de 1.5 à 3 mm après 24 heures

d’incubation à 37°C (Figure 4), elle ne forme pas d’endospore. Mobile grâce à une

ciliature péritriche (Larpent, 1997).

Figure 4 : S. typhi observés au microscope électronique (Ducluzeau, 2006).


19


Elle cultive bien en 24 heures à 37°C sur les milieux gélosés en donnant des

colonies petites, rondes, à bords réguliers.

La culture en bouillon ordinaire, rapide, produit un trouble dense avec ondes.

Sur milieu gélosés Hektoen, les colories sont vertes à centre noir (Larpent, 1997 ;

Mao et al., 2003).


Selon Guechi, (2002) parmi les bactéries ayant les caractères généraux des

Entérobactéries on pensera à Salmonella lorsque les réactions suivantes sont

obtenues :

- H2S positif, B galactosidose négative

- Lysine décarboxylase positif

- Production de l’indole négative

- Urease, tryptophane désaminose négatives

- Citrate de simmons négatifs

- Vages Proskauer (VP) négative

On peut rencontrer des caractères un peu particuliers d’une salmonelle

rencontrée chez l’homme : Salmonella para-typhi A est : LDC négatif, citrate de

Simmons négatifs et le plus souvent H2S négatif (Pilet et al., 1981).


Le genre Salmonella possède des antigènes variés associés à trois types


20

1.4.2.2.6.1- Antigènes somatiques (ou antigène O) :

Ce sont les antiqénes des parois ctérienne, de nature lipopolysaccharidique. Ils

sont thermostables et alcoolostables. Trois composants sont mis en évidence : le

lipide A responsable des effets toxiques, le corps ou la partie basale, et le

polysaccharide qui est le support de la spécificité et il repose sur les sucres

constitutifs (Gledel, 1988 ; Pilet et al., 1981 ; Joly et Alain, 2003).

1.4.2.2.6.2 -Antigènes flagellaires (ou antigène H) :

Les flagelles sont constitués de polymères de flagilline (protéine fibreuse).

Pour une souche donnée, il peut exister un ou deux déterminants antigéniques de

type H (Gledel, 1988 ; Pilet et al., 1981 ; Joly et Alain, 2003).

1.4.2.2.6.3-Antigènes capsulaires (ou antigène Vi) :

Ces antigènes forment une mince capsule glycolipidique qui recouvre le LPS

et donc masque les spécificités O. Cette enveloppe peut être détruite par chauffage

à 100°C pendant 10 minutes (Gledel, 1988 ; Pilet et al., 1981 ; Joly et Alain,

2003).

1.4.2.2.7-Pouvoir pathogène :

Les salmonelles sont pathogènes, soit exclusivement pour l’Homme (S typhi),

soit exclusivement pour l’animal (S. abortus ovis), soit, le plus souvent, à la fois

pour l’Homme et pour l’animal. (Lamps, 2007).

Chez l’Homme, les salmonelles peuvent être responsables :

- De la fièvre typhoïde due à S .typhi ou de fièvres paratyphoïdesgénéralement provoquées par S. para A, S. para B et plus rarement

S. para C.


21

Ces maladies, graves et souvent mortelles si elles ne sont pas traitées,

associent :

- Un état septicémique, avec fièvre et splénomégalie,

- Un état de prostation très particulier, le « tuphos »,

- Des signes digestifs graves (vomissements, diarrhée).

L’évolution peut se grever de complications atteignant le plus souvent le

tractus digestif (hémorragie, perforations). (Margairaz et al., 1975 ; De Vrese et

Marteau, 2007).

Chez l’animal : avortements chez différentes espèces, septicémies du jeune,

entérites (Pilet et al., 1981).

1.4.2.2.8- Physiopathologie et symptomatologie de Salmonella typhi :

Le réservoir de Salmonella typhi est strictement humain. La transmission peut

être interhumaine par contact direct avec une personne infectée, ou indirecte par

consommation d'aliments contaminés lors de leur préparation par une personne

malade (ou porteuse saine) ou par consommation d'aliments contaminés par de l'eau

souillée par des matières fécales. La fièvre typhoïde emprunte quatre phases, la

première se traduit par l'élimination rapide des bactéries sériques. (Mead et al., 1999 ;

Steer et al., 2000 ; Tauxe, 2002).

Durant la semaine suivant l'infection, Salmonella se réplique activement au

sein des cellules phagocytaires. Cette phase précède la reconnaissance de PAMP

(pathogen-associated molecular pattern) par les cellules de la lignée phagocytaire

mononucléaire. Il en résulte la production de nombreuses cytokines (tumor necrosis

factor , interleukines 1,6 et 12, interféron ) et une infiltration massive de

monocytes et de polynucléaires neutrophiles dans les cites inflammatoires. (Fasano,

2001; Lamps, 2007).


22

A la quatrième phase de l'infection s'installe la défense inflammatoire dite

acquise, c'est-à-dire faisant intervenir les cellules T et B, ainsi que les facteurs

humoraux qui en découlent. Cliniquement; la phase d'invasion associe une fièvre

élevée d'installation progressive (40°C avec dissociation du pouls), des céphalées,

une asthénie, une insomnie, des troubles digestifs de type : anorexie, nausées et

crampes abdominales avec constipation ou diarrhées; peuvent également apparaître

des myalgies et des arthralgies. (DuPont, 2005).

La phase d'état associe une fièvre qui se maintient en plateau entre 39°C et

40°C (pouls dissocié) et l'émission de selles diarrhéiques (classiquement diarrhée jus

de melon). Un état somnolant apparaît et évolue vers une prostration dans la formes

graves (tuphos), des complications peuvent apparaître à type de perforation et

d'hémorragie intestinale, ou de myocardite, d'ostéomyélite, d'encéphalite et de

glomérulonéphrite. Ces complications sont dues à la libération d'endotoxines lors de

la lyse des salmonelles (Fasano, 2001; Tauxe, 2002 ; Bergeron et Dufour, 2004 ;

DuPont, 2005).

1.4.2.3- Les Klebsiella :

1.4.2.3.1- Habitat :

Klebsiella est une espèce ubiquistes, isolées des eaux de surface, des eaux

usées, des effluents industriels (papeteries, minoteries, scieries, usines textiles), du

sol, du bois, de végétaux divers et des aliments. Elle est également retrouvée dans la

flore fécale d’environ 30% des animaux et de l’homme et elle existe à l’état

commensal sur la peau et les muqueuses, notamment les muqueus.es respiratoires

(Podschum et al., 2001).

1.4.2.3.2- Caractérisation de la bactérie :

Ce genre forme un ensemble très homogène caractérisé par la production d’un

dérivé particulier de l’acide pyruvique : l’acétyle-méthyle-cabriole (Pilet et al., 1981).


23

1.4.2.3.3- Caractères morphologiques :

Bacille Gram -, de 0.3 à 1.0 µm de diamètre sur 0.6 à 6.0 µm de largeur,

immobile, capsulées surtout au sortir de l’organisme, très polymorphes : de forme

coccoide (Figure 5), se présente de manière isolée, ou en groupe par deux ou groupés

en courte chaines (Le Minor et Richard., 1993).

Figure 5: K. oxytoca observés au microscope électronique (Ducluzeau, 2006).


Sur gélose : les colonies ont un aspect caractéristique, elles sont volumineuses,

bombées, brillantes, opaques et souvent confluentes. Le contact avec l’anse de platine

permet de constater l’aspect visqueux des colonies dites « en coulées de miel ». En

bouillon, on note la formation d’un trouble dense avec collerette visqueuse (Le Minor

et Richard., 1993).


Selon Guechi, (2002) l’élément biochimique essentiel, qui caractérise

Klebsiella oxytoca est la présence d’une uréase et la production d’acétone, plus les

caractères suivants :

- Glucose positif avec production de gaz

- Oxydase, ODC, ADH négative


24

- Tryptophane désaminase et phénylalanine désaminase négatives

- Β-galactosidase, LDC positive

- Citrate de Simmons positive


Klebsiella comporte des antigènes O et R et surtout un antigène capsulaire, de

nature polysaccharidique qui est en effet le seule utilisée pour la détermination des

72 sérotypes connus (Pilet et al., 1981).

1.4.2.3.7-Pouvoir pathogène :

Klebsiella est une bactérie commensale de l’intestin et des voies respiratoires

de l’homme et des animaux.

Chez l'homme, elle est responsable d'infections diverses (infections

suppuratives, infections urinaires, infections respiratoires, infections biliaires,

infections hépatiques, septicémies) et elle est responsable d'environ 5 % des

infections nosocomiales (Margairaz et al ., 1975).

Chez l’animale, on peut la retrouver dans certain métrites de la jument,

infections respiratoires du chien et mammites de la vache. (Pilet et al., 1981 ;

Tainturier et Richard, 1986

1.5- Modulations des mécanismes de la réponse immunitaire :

L’hôte possède également des défenses immunologiques lui permettant de

répondre spécifiquement aux pathogènes entériques. Lorsque ces pathogènes sont en

contact avec l’intestin, une réponse immune peut se produire à partir de sites

d’induction constitués de tissus organisés tels que les follicules lymphoïdes (Plaques

de Peyers et nodules lymphatiques mésentériques) et s’exprimer à partir des sites


25

effecteurs représentés par un nombre élevé de cellules immunocompétentes situées au

niveau de la lamina propria et de l’épithélium mucosal (Gill, 2003) (Figure 6).

Figure 6 : Le système immunitaire intestinal. Tiré et traduit de Magalhaes et

al. (2007).

1.6 Défenses de l’hôte :

Face à l’intrusion de micro-organismes pathogènes dans le tube digestif, le

corps humain possède différents moyens de défenses. Plusieurs lignes de défenses

chimiques, mécaniques et microbiologiques participent à limiter l’accès des

pathogènes d’origines diverses (bactérienne, virale, parasitaire) à la muqueuse

intestinale qui est la plus grande partie exposée à l’environnement externe avec 200 à

300 m2 (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). Ainsi, pour lutter contre l’établissement

infectieux d’entéropathogènes tout au long du tractus digestif, une première ligne de

défense est assurée par des barrières chimiques telles que l’acidité gastrique, l’activité

antimicrobienne d’enzymes pancréatiques, le lysozyme, les sécrétions intestinales et

bactériennes. Les défenses antimicrobiennes au niveau intestinal sont présentées à la

Figure .7


26

Les pathogènes entériques, qui expriment des facteurs de pathogénicité tels que

facteurs d’adhésion, invasines et toxines interagissent avec les cellules des villosités

intestinales (Nauciel, 2000). En réponse à ces pathogènes indésirables, les cellules de

Paneth situées à la base des villosités sécrètent des molécules protéiques

antimicrobiennes de même que d’autres cellules situées sur les villosités. En

parallèle, les bactéries intestinales résidentes Gram-négatif et positif produisent des

molécules antibactériennes. Ces substances antimicrobiennes ont un large spectre

d’activité contre une variété de bactéries et les virus enveloppées (Liévin-Le Moal et

Servin, 2006). Cette défense chimique joue un rôle majeur lors des premières heures

suivant l’infection (Liévin-Le Moal et Servin, 2006). D’autres moyens physiques, tels

que la mobilité de l’intestin par péristaltisme, peuvent contribuer à l’élimination des

pathogènes hors de l’intestin (Ouwehand et al., 2002a; Gill, 2003).

Figure 7: Défenses antimicrobiennes de l’hôte face à l’intrusion de micro-organismes pathogènes au niveau du tractus intestinal. Tiré de Liévin-Le Moal etServin (2006).


27

2- Les bactéries lactiques

2.1. Définition et caractéristiques généraux des bactéries lactiques.

Le groupe des lactiques ou bactéries de l’acide lactique a été défini par Orla

Jensen, (1919). Ce sont des cellules vivantes, procaryotes, hétérotrophes et chimio-

organotrophes. Leur capacité à fermenter les glucides en produisant de l’acide lactique

leur a valu l’appellation de bactéries lactiques (De Roissart et Laquet, 1994 ; Novel,

1993).

La fermentation est dite homolactique si l’acide lactique est pratiquement le

seul produit formé et hétérolactique si d’autres composés sont aussi présents : acide

acétique, éthanol, CO2 Selon le mode de fermentation obligatoire au préférentiel, on

parle de bactéries homofermentaires et hétérofermentaires.

Certaines bactéries homofermentaires sont aussi capables de fermentation

hétérolactique dans des conditions de croissance non optimales ou selon la nature du

sucre utilisé (Novel, 1993).

Certaines espèces peuvent en plus produire de l'acide formique ou de l'acide

succinique.

Aucune souche du groupe lactique n'est capable de produire des acides volatils

ayant plus de deux atomes de carbones (Dellaglio et al, 1994).

Ces bactéries forment un groupe hétérogène; leurs cellules sont soit des coques :

Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, soit des bâtonnets : Lactobacillus, soit de

formes variées : Carnobacterium et Bifidobacterium.

Les bactéries lactiques présentent d’autres caractéristiques communes qui expliquent

leur regroupement :


28

Ce sont des bactéries gram positif généralement immobiles jamais sporulées

catalase négative (quelques souches de lactobacilles possèdent une pseudo-catalase)

oxydase négative et généralement nitrate réductase négative (Stiles et Holzapfel,

1997).

Leur capacité de biosynthèse est faible, ce qui explique leurs poly-auxotrophie pour

divers acides aminés; des bases nucléiques, des vitamines et des acides gras mais

aussi leur métabolisme fermentaire (incapable de synthétiser le noyau hème des

porphyrines, elles sont normalement dépourvues de cytochrome et en conséquence

inapte à toute respiration aérobie ou anaérobie. (Stiles et Holzapfel, 1997).

Ce sont des bactéries anaérobies facultatives : microaérophiles, uniquement

capables de fermentation en aérobiose comme en anaérobiose.

Elles sont multi-auxotrophes pour divers acides aminés, nucléotides, vitamines et

acides gras, comme leur capacité de synthèse est faible, elles exigent des milieux de

cultures complexes pour leur croissance.

Parmi les bactéries répondant à ces caractéristiques, on distingue quatre genres

bactériens : Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus et Lactobacillus. Toutefois des

exceptions ont été observées concernant la production d’endospores, la mobilité de

quelques souches de lactobacilles, l’aérobiose de certains streptocoques et

lactobacilles, la présence de réaction catalase positive chez les pediocoques et chez

quelques lactobacilles, etc..(Michael et al., 1996).

Les bactéries lactiques sont utilisées dans de nombreux produits laitiers dont

les laits fermentés, les fromages et les yogourts. Elles contribuent à la texture, à la

saveur des aliments ainsi qu’à la production de composés aromatiques. Les bactéries

lactiques inhibent la prolifération de micro-organismes par la production de


29

Composés inhibiteurs telles les bactériocines (Piard et Desmazeaud, 1991,

1992) et en abaissant le pH par la production d’acide lactique (Gilliland, 1985).

Les bactéries lactiques sont des cellules procaryotes, hétérotrophes et chimio-

organotrophes. Elles sont Gram +, généralement immobiles, asporulées et ont des

exigences nutritionnelles complexes pour les acides aminés, les peptides, les

vitamines, les sels, les acides gras et les glucides fermentescibles (Dellaglio et al.,

1994).

Onze genres bactériens figurent dans la catégorie des bactéries lactiques :

Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et

Vagococcus. Les bactéries du genre Bifidobacterium ne sont pas considérées comme

des bactéries lactiques typiques, mais leur usage se répand en industrie laitière.

Les bactéries lactiques sont utilisées pour la fermentation d’un grand nombre

de produits d’origine animale ou végétale. Seuls les cinq genres Bifidobacterium,

Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc et Streptococcus sont communément

propagés dans les salles à ferments des industries laitières ou employés dans la

fermentation lactique des produits laitiers en Amérique du Nord (Champomier et al.,

1989). Le rôle principal des bactéries lactiques est la production d’acide lactique qui

influence la texture, le goût et la qualité microbiologique du fromage. En effet, la

production d’acide facilite la coagulation des protéines par la présure ainsi que la

synérèse. L’abaissement du pH limite aussi la croissance des bactéries indésirables

(Gilliland, 1985). Enfin, la production d’acide lactique intervient également sur le

goût des produits fermentés, soit directement dans les produits frais, soit

indirectement en agissant sur les activités enzymatiques pendant l’affinage.

Les bactéries lactiques tolèrent de petites quantités d’oxygène, mais de trop

grandes teneurs peuvent leurs êtres néfastes. Ceci peut probablement être relié au


30

peroxyde d’hydrogène (H2O2) qui est produit dans les cellules en présence d’air. Le

H2O2 doit être éliminé sinon son accumulation devient toxique. Le système le plus

efficace d’élimination du H2O2 est une enzyme nommée catalase dont les bactéries

lactiques en sont déficientes. Les bactéries lactiques possèdent plutôt une peroxydase,

moins efficace que la catalase. Ainsi, comme les bactéries lactiques n’éliminent pas

facilement le peroxyde, elles sont considérées comme micro-aérophiles.

Les bactéries lactiques aromatisantes comme Lactococcus lactis ssp. lactis

biovar. diacetylactis produisent des composés aromatisants qui contribuent au goût

des produits frais et à la production de CO2 responsable d’ouvertures dans le

fromage.

Enfin, certaines bactéries lactiques produisent des exopolysaccharides qui

influencent l’aspect et la texture des produits fermentés, ainsi que du peroxyde

d’hydrogène et des bactériocines inhibant la croissance de bactéries indésirables.

2.2. Les milieux naturels des bactéries lactiques :

Nombreux sont les biotopes qui fournissent des conditions favorables à la

croissance des bactéries du groupe lactique (Tableau 3) ; De ce fait elles colonisent des

milieux naturels riches très variés comme les végétaux (plantes, fruits), animaux et

humains (cavité buccal et vaginale, lait), les produits laitiers ( fromage, beurre), et

carnés boissons alcoolisées à base de fruits (vins, cidres, bière, ) légumes et fruits

fermentés (choucroute, olives, cornichons,) céréales fermentés (différentes variétés

de pain) .


31

Tableau 3: Les Milieux d'isolement des bactéries lactiques (De Roisart et luquet, 1994)

Espèce Milieu d'isolement

Lc. lactis subsp. lactisbiovar diacetylactisLc. lactis subsp. cremorisLc. raffinolactisLc. garviaeLc. Plantarum

Lc. hordniaeSc. thermophilus

Leuconostoc

Ln. oenosPediococcuspc. pentosaceusPc. acidilacticiPc. halophilusLb. delbrueckii subsp. delbrueckiiLb. delbrueckii subsp. bulgaricusLb. delbrueckii subsp .lactisLb. acidophilusLb. gasseriLb .helveticusLb. caseisubsp.caseiLb. casei subsp pseudoplantarumLb. casei subsp.totleansLb. casei subsp.rhamnosusLb. sakeLb. curvatusLb. bavaricusLb. plantarumLb. brevisLb. buchneriLb. kefirLb. malefermantensLb. sanfranciscoBifidobacterium

Lait cru lait fermenté et floreminoritaire du rumenvégétaux laituniquement laitlait caillélait de mammitepis congeléscicadelle nommée hordniaelait chauffé 45-50°C lait pasteuriséyaourt levains a tisanauxlait, produit laitier, fruit betteravechoucroute produite de panificationuniquement vinvégétaux en décompositionmatière végétalelait, produits laitiers, saucissonanchois salésvégétauxyaourt, fromagefromagelait, acide, bouche, vaginbouche, vaginfromagelait rumenfromage, fourragebouche, vagintractus intestinalsaucisson, viande fraîche, végétalelait, fromage, végétauxvégétaux fermentesvégétaux, fromageensilage, végétaux, fromagelait fermenté : kéfirbièreproduits de panificationintestin, vagin, selle des nouveaux –nés


32

2.3-Taxonomie et classification :

2.3.1. Caractère morphologique :

Il existe dans ce groupe bactérien deux types morphologiques bien distincts : les

coccis et les bacilles :

• Les coccis [du grec kakos : grain] sont de petites sphères plus ou moins

ovoïdes, de 0.5 à 1.5μm (10-6m) de diamètre dont la division peut engendrer des paires,

des tétrades, des chaînettes ou des amas, (Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ;

Carmen-Collado et Hernandez, 2007 ; Tabasco et al., 2007).

• Les bacilles [du latin bacillum : bâton] sont de petits bâtonnets plus ou moins

allongés de 0.5 à 2µm de diamètre et de 1.5 à environ 10µm de long, qui se présent par

paires ou en chaînettes de longueur variable. (Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ;

Carmen-Collado et Hernandez, 2007 ; Tabasco et al., 2007).

2.3.2- Classification des bactéries lactiques.

L’application des hybridations des acides nucléiques et des techniques de

séquençage conduit à diviser les bactéries lactiques en onze groupes principaux :

Aerococcus, Alloicoccus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus et

Vagococcus. (Tableau4)

Ces bactéries seraient apparues avant les cyanobactéries photosynthétiques. Ces

dernières ayant laissé des traces fossiles datées d'au moins 2,75 milliards d'années, les

bactéries lactiques pourraient donc avoir vu le jour il y a près de 3 milliards d'années.

Leur médiocre adaptation à la vie en aérobiose concourt à penser qu'elles se seraient

plutôt développées au cours d'une période de transition entre un monde anaérobie et un

mon de micro-aérobie (Tailliez., 2001).


33

Tableau 4 : Différents genres de bactéries lactiques et leurs principalescaractéristiques (T° opt : température optimale développement ; Nb : nombred’espèces connues).

Genre Morphologie Fermentation T° opt Nb espèces

Lactobacillus bacilles Homofermentairesou

hétérofermentaires

Thermophiles

ou

mésophiles

G.I : 23

G.II :16

G.III :22

Carnobacterium bacilles hétérofermentaires psychrotrophes 6

Lactococcus coques homofermentaires mésophiles 5

Streptococcus coques homofermentaires Mésophiles

ou

termophiles

19

Enterococcus coques homofermentaires mésophiles 13

Vagococcus coques mobiles homofermentaires mésophiles 2

Pediococcus coques entétrades

homofermentaires mésophiles 7

Tetragenococcus coques entétrades

homofermentaires mésophiles 1

Leuconostoc coques hétérofermentaires mésophiles 11

Oenococcus coques hétérofermentaires mésophiles 1

D’après Schleifer, (1986); Kandler et Weiss, (1986).


34

2.4-Les Lactobacillus :

2.4.1- Habitat :

Très répandus dans la nature, les Lactobacilles sont également des

hôtes Habituels des cavités naturelles de l’homme et des animaux. Leur pouvoir

pathogène est pratiquement nul. (Siegumfeldt et al., 2000).

Les Lactobacilles ont une place de choix en bactériologie appliquée parmi les

« microbes utiles » .Ils appartiennent aux ferments lactiques, et à ce titre

interviennent dans l’industrie laitière et fromagère, ils sont aussi utilisés dans les

spécialités pharmaceutiques employées comme complément de l’antibiothérapie

(Tabasco et al., 2007).

2.4.2-Caractères morphologiques :

Les espèces de Lactobacillus sont caractérisées par des cellules en forme de

bâtonnet souvent groupées en chaînes ou en amas plus ou moins volumineux dans

certaines espèces on rencontre des groupements en diplobacilles (Figure 8), ils

apparaissent toujours Gram positif. .Asporulés, en général acapsulés, non

ramifies.(Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ; Carmen-Collado et Hernandez,

2007 ; Tabasco et al ., 2007).

Figure 8 : Lactobacillus rhamnosus (à gauche) et, Lactobacillus helveticus (à

droite), observés au microscope électronique. Gancel et al., (1997).


35

2.4.3- Caractères culturaux :

Les Lactobacilles sont incapables de synthétiser les substances

indispensables à leur développement, ils exigent différents facteurs de croissance, et

ne cultive pas en milieux ordinaires. (Sutra et al., 1998).

En milieu liquide, les Lactobacilles donnent un trouble après 24 heures à

30°C. Sur milieux solide, les colonies apparaissent en 24 heures à 48 heures pour

la plupart des espèces : il s’agit de colonies opaques, lisses, blanchâtres, de 0.5 à

1mm de diamètre. (Sutra et al., 1998).

2.4.4-Caractères biochimiques :

Parmi les caractères généraux des Lactobacilles, citons : Catalase et oxydase

négative, Nitrates négatif, pouvoir protéolytique négatif.

Le métabolisme des glucides est toujours de type fermentatif. (Sutra et al.,

1998)

En tenant compte de plusieurs caractéristiques telle que les résultats

moléculaires, la détermination du type de PTG, les propriétés de certaines enzymes

dont la LDH, la détermination de l’isomère de l’acide lactique, la taille du génome et

l’hybridation ADN-ADN est répartie en trois groupes.

Groupe I : les Lactobacilles homofermentaires obligatoire, contenant les espèces de

groupe Thermobacterium et d’autres espèces nouvellement décrites. Ils sont

incapables de fermenter les pentoses et les gluconate. Ils contiennent deux complexes :

Complexe Lb. delbrueckii et ses quatre sous espèces qui présentent une

homologie d’ADN à plus de 80% (Weiss et al., 1993) : subsp. delbrueckii, subsp.

bulgaricus, subsp. lactis, et subsp. leichmanii. Ces bactéries produisent jusqu’à

80g/l d’acide lactique.

Complexe Lb, acidophilus hétérogène forme de trois sous groupes : Lb.

acidophilus, Lb. gasseri et Lb. helveticus.


36

Les nouvelles données de la littérature (Leisner et al., 2000), indiquent la

présence d'une nouvelle espèce Paralactobacillus selangorensisgen, isolée a partir d'un

aliment de malaisie (le chilibo).

Groupe II : les Lactobacilles homofermentaires facultatifs : formés par trois

complexes d’espèces : Ils produisent 3 à 13g/l d’acide lactique b (+) ou DL selon

les espèces. Ils forment un groupe très homogène, ce groupe comprend trois

complexes d'espèces apparentées par leurs homologies ADN - ADN et plusieurs

espèces ne présentant aucune relation phylogénique connue. L'écart des contenus GC%

est plus étroit (35-47%) par rapport au groupe précédant (Dellaglio et al, 1994)

Complexe Lb. plantarum ”.Lb. plantarum et Lb. pentosus.

Complexe Lb. casei ” Lb. casei, Lb. casei (subsp. casei, subsp.

pseudoplantarum, subsp. tolerans) et Lb. casei subsp. ramnosus.

Complexe Lb. sake- Lb. curvatus- Lb. rhamnosus.”

Groupe III : les Lactobacilles hétérofermentaire obligatoires.

Ils renferment des espèces très diverses possédant par fois un GC% très voisin, peu

d’homologie entre elles. Le contenu en G+C est de 34 à 53% (Dellaglio et al, 1994) Ils

produisent une faible quantité d’acide lactique (5g/l). L’acide lactique formé est

toujours de type DL. Il contient deux complexes.

Complexs Lb. fermentum

Complexe Lb. brevis


37

Tableau 5 : liste d’espèces du genre Lactobacillus d’après Euzéby, (2007)

Espéce Source et référencesLactobacillus acidifarinae L'ensilage de blé Vancanneyt et al. (2005)Lactobacillus acidipiscis Les poissons fermentés Tanasupawat et

al. (2000)Lactobacillus acidophilus Johnson et al. (1980)Lactobacillus agilis Weiss et al. (1982)Lactobacillus algidus Viande de bœuf conservé Kato et al.

(2000)Lactobacillus alimentarius Reuter (1983)Lactobacillus amylolyticus Bierre de malt Bohak et al. (1999)Lactobacillus amylophilus Mais fermenté Nakamura and Crowell

(1981)Lactobacillus amylovorus Aliments de bétail Nakamura (1981)Lactobacillus animalis tube digestive des animaux Dent and

Williams (1983 )Lactobacillus antri La muceuse d’estomac humaine Roos et

al. (2005)Lactobacillus apodemi Les selles des souris Osawa et al. (2006)Lactobacillus arizonensis Les extraits de Jojoba Swezey et al.

(2000)Lactobacillus aviariusLactobacillus aviarius subsp.araffinosusLactobacillus aviarius subsp. aviarius

Les intestins des volailles Fujisawa et al.(1985)Fujisawa et al. (1986)

Fujisawa et al. (1985)Lactobacillus bavaricus Les produits a base de viande Stetter and

Stetter (1980)Lactobacillus bifermentans Les fromages enflés Kandler et al. (1983)Lactobacillus brevis Le vin Bergey et al. (1934)Lactobacillus buchneri Kimchi Bergey et al. (1923)Lactobacillus bulgaricus Rogosa and Hansen (1971)Lactobacillus camelliae Les feuilles de thé fermentées

Tanasupawat et al. (2007)Lactobacillus carnis Les produits carnés Shaw and Harding

(1986)Lactobacillus caseiLactobacillus casei subsp. caseiLactobacillus casei subsp.pseudoplantarum

Orla-Jensen (1916)Hansen and Lessel (1971)Abo-Elnaga and Kandler (1965)


38

Lactobacillus casei subsp. rhamnosusLactobacillus casei subsp. tolerans

Hansen (1968)Abo-Elnaga and Kandler (1965)

Lactobacillus catenaformis Moore and Holdeman (1970)Lactobacillus cellobiosus Rogosa et al. (1953)Lactobacillus ceti Vela et al. (2008)Lactobacillus coleohominis Source humaine Nikolaitchouk et al.

(2001)Lactobacillus collinoides Carr and Davies (1972)Lactobacillus composti Endo and Okada (2007)Lactobacillus concavus Tong and Dong (2005)Lactobacillus confusus Sharpe et al. (1972)Lactobacillus coryniformisLactobacillus coryniformis subsp.coryniformisLactobacillus coryniformis subsp.torquens

Abo-Elnaga and Kandler (1965)Abo-Elnaga and Kandler (1965)

Abo-Elnaga and Kandler (1965)

Lactobacillus crispatus Moore and Holdeman (1970)Lactobacillus crustorum L’ensilage de blé Scheirlinck et al. (2007)Lactobacillus curvatusLactobacillus curvatus subsp. curvatusLactobacillus curvatus subsp.melibiosus

Abo-Elnaga and Kandler (1965)Abo-Elnaga and Kandler (1965)Torriani et al. (1996)

Lactobacillus cypricasei Les fromagesLawson et al. 2001Lactobacillus delbrueckiiLactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricusLactobacillus delbrueckii subsp.delbrueckiiLactobacillus delbrueckii subsp. indicusLactobacillus delbrueckii subsp. lactis

Beijerinck (1901)Weiss et al. (1984)

Beijerinck (1901) ( Les produits laitiers)

Dellaglio et al. (2005)

Weiss et al. (1984)Lactobacillus diolivorans L’ensilage de mais Krooneman et al.

(2002)Lactobacillus divergens Holzapfel and Gerber (1984)Lactobacillus durianis Leisner et al. (2002)Lactobacillus equi Les selles des chevaux Morotomi et al.

(2002)Lactobacillus equigenerosi Les selles des chevaux Endo et al. (2008)Lactobacillus farraginis Endo and Okada (2007)Lactobacillus farciminis Reuter (1983)Lactobacillus ferintoshensis whisky de malt Simpson et al. (2002)Lactobacillus fermentum Beijerinck (1901)Lactobacillus fornicalis Dicks et al. (2000)


39

Lactobacillus fructivorans Charlton et al. (1934)Lactobacillus fructosus Kodama (1956)Lactobacillus frumenti Müller et al. (2000)Lactobacillus fuchuensis Sakala et al. (2002)Lactobacillus gallinarum Fujisawa et al. (1992)Lactobacillus gasseri Lauer and Kandler (1980)Lactobacillus gastricus L’estomac humaine Roos et al. (2005)Lactobacillus ghanensis Nielsen et al. (2007)Lactobacillus graminis Beck et al. (1989)Lactobacillus halotolerans Kandler et al. (1983)Lactobacillus hammesii Valcheva et al. (2005)Lactobacillus hamsteri Les intestins des hamters Mitsuoka and

Fujisawa (1988)Lactobacillus harbinensis Miyamoto et al. (2006 )Lactobacillus hayakitensis Morita et al. (2007)Lactobacillus helveticus Bergey et al. (1925)Lactobacillus heterohiochii Kitahara et al. (1957)Lactobacillus hilgardii Douglas and Cruess (1936)Lactobacillus homohiochii Kitahara et al. (1957)Lactobacillus iners Source humaine Falsen et al. (1999)Lactobacillus ingluviei Les intestins des pigeons Baele et al.

(2003)Lactobacillus intestinalis Les intestins des souris Fujisawa et al.

(1990)Lactobacillus jensenii Gasser et al. (1970)Lactobacillus johnsonii Fujisawa et al. (1992)Lactobacillus kalixensis L’estomac humaine Roos et al. (2005)Lactobacillus kandleri Holzapfel and van Wyk (1983)Lactobacillus kefiranofaciensLactobacillus kefiranofaciens subsp.kefiranofaciensLactobacillus kefiranofaciens subsp.kefirgranum

Fujisawa et al. (1988)

Vancanneyt et al. (2004)

Lactobacillus kefirgranum Takizawa et al. (1994)Lactobacillus kefiri Kandler and Kunath (1983)Lactobacillus kimchii Yoon et al. (2000)Lactobacillus kitasatonis Les intestins des volailles Mukai et al.

(2003)Lactobacillus kunkeei Edwards et al. (1998)Lactobacillus lactis Bergey et al. (1934)Lactobacillus leichmannii Bergey et al. (1923)Lactobacillus lindneri Back et al. (1997)Lactobacillus malefermentans Farrow et al. (1989)


40

Lactobacillus mali Carr and Davies (1970)Lactobacillus maltaromicus Miller et al. (1974)Lactobacillus manihotivorans Morlon-Guyot et al. (1998)Lactobacillus mindensis Ehrmann et al. (2003)Lactobacillus minor Kandler et al. (1983)Lactobacillus minutus Moore and Holdeman (1972)Lactobacillus mucosae Roos et al. (2000)Lactobacillus murinus Hemme et al. (1982)Lactobacillus nagelii Edwards et al. (2000)Lactobacillus namurensis Scheirlinck et al. (2007 )Lactobacillus nantensis Valcheva et al. (2006)Lactobacillus oligofermentans Koort et al. (2005)Lactobacillus oris Cavité orales deshumains Farrow and

Collins (1988)Lactobacillus panis Wiese et al. (1996)Lactobacillus pantheris Selles de Jaguar Liu and Dong (2002)Lactobacillus parabrevis Vancanneyt et al. (2006)Lactobacillus parabuchneri Farrow et al. (1989)Lactobacillus paracaseiLactobacillus paracasei subsp.ParacaseiLactobacillus paracasei subsp. tolerans

Collins et al. (1989)

Lactobacillus paracollinoides Suzuki et al. (2004)Lactobacillus parafarraginis Endo and Okada (2007)Lactobacillus parakefiri Takizawa et al. (1994)Lactobacillus paralimentarius Cai et al. (1999)Lactobacillus paraplantarum Curk et al. (1996)Lactobacillus pentosus Zanoni et al. (1987)Lactobacillus perolens Back et al. (2000)Lactobacillus piscicola Hiu et al. (1984)Lactobacillus plantarumLactobacillus plantarum subsp.argentoratensisLactobacillus plantarum subsp.plantarum

Bergey et al. (1923)Bringel et al. (2005)

Bergey et al. (1923)

Lactobacillus pontis Vogel et al. (1994)Lactobacillus psittaci Lawson et al. (2001)Lactobacillus rennini Chenoll et al. (2006)Lactobacillus reuteri Kandler et al. (1982)Lactobacillus rhamnosus Collins et al. (1989)Lactobacillus rimae Olsen et al. (1991)Lactobacillus rogosae Selles des humains Holdeman and Moore


41

(1974)Lactobacillus rossiae L’ensilage de blé Corsetti et al . (2005)Lactobacillus ruminis Sharpe et al. (1973)Lactobacillus saerimneri Selles des porcs Pedersen and Roos

(2004)Lactobacillus sakeiLactobacillus sakei subsp. carnosusLactobacillus sakei subsp. sakei

Katagiri et al. (1934)Torriani et al. (1996)Katagiri et al. (1934)

Lactobacillus salivariusLactobacillus salivarius subsp.saliciniusLactobacillus salivarius subsp.salivarius

Rogosa et al. (1953)

Lactobacillus sanfranciscensis Weiss and Schillinger (1984)Lactobacillus satsumensis Endo and Okada (2005)Lactobacillus secaliphilus Ehrmann et al. (2007)Lactobacillus sharpeae Weiss et al. (1982)Lactobacillus siliginis Aslam et al. (2006)Lactobacillus sobrius Konstantinov et al. (2006)Lactobacillus spicheri Meroth et al. (2004)Lactobacillus suebicus Kleynmans et al. (1989)Lactobacillus suntoryeus Cachat and Priest (2005)Lactobacillus thailandensis Tanasupawat et al. (2007)Lactobacillus thermotolerans Selle des volailles Niamsup et al. (2003)Lactobacillus trichodes Vin Fornachon et al. (1949)Lactobacillus uli Olsen et al. (1991)Lactobacillus ultunensis Roos et al. (2005)Lactobacillus vaccinostercus Kozaki and Okada (1983)Lactobacillus vaginalis Embley et al. (1989)Lactobacillus versmoldensis Kröckel et al. (2003)Lactobacillus vini Rodas et al. (2006)Lactobacillus viridescens Niven and Evans (1957)Lactobacillus vitulinus Sharpe et al. (1973)Lactobacillus xylosus Les produits laitiers Kitahara (1938)Lactobacillus yamanashiensisLactobacillus yamanashiensis subsp.maliLactobacillus yamanashiensis subsp.yamanashiensis

Nonomura (1983)

Lactobacillus zeae Dicks et al. (1996)Lactobacillus zymae L’ensilage de blé Vancanneyt et al.

(2005)


42

2.5- Phénomènes des interactions entre les bactéries :

On a classé les interactions entre les bactéries selon leurs effets avantageux ou

désavantageux et on distingue en générale, deux types d’interaction :

Interaction positive, ou stimulation et Interaction négative, ou inhibition. Fredrickson,

(1977)

Ce type d’interaction peut résulte, sans contact physique entre les espèces

bactériennes, d’ou la notion d’interaction indirecte, dans d’autre cas l’interaction

nécessite un contact physique entre les souches, d’ou la notion d’interaction directe.

On pratique, dans un même milieu écologique, comme le lait ou le ferment

lactique, constitue de plusieurs souches de bactéries lactiques ou culture mixte, les

interactions peuvent être à double sens, et chaque une des souches peut avoir une

action stimulante ou inhibitrice sur les autres, d’où les problèmes de l’équilibre

microbiens dans les produits laitiers, on distingue d’une façon générale les cas

suivants :

Symbiose : dans se cas, deux espèces différentes, vivants ensemble, dans les

mêmes milieux de culture, stimulent d’une façon réciproque leur croissance.

Synergie : dans ce cas apparaissent des changements qui ne peuvent être

produit par une en absence de l’autre.

Commensalisme : dans ce cas l’une des deux espèces bactériennes, vit des

produits de l’autre, sans offrir quelques choses, à l’autre espèce.

Compétition : il y a un effet négatif sur les deux populations.

Antagonismes : inhibition d’une espèce par un facteur inhibiteur non

spécifique, produit par une autre espèce.

Mutualisme : dans ce cas ; l’interaction est obligatoire pour la survie des deux

populations bactérienne.

L’étude des phénomènes d’antagonismes ou d’interactions microbiennes

notamment les inhibitions entres les bactéries a paroi Gram négatif et les bactéries


43

impliquées dans les industries de fermentation ; a permis a Pasteur et Jobert des

observations systématiques sur ces phénomènes qui caractérisent ces groupes

microbiens Jack et al.,(1995)

Les travaux de Pasteur sur les phénomènes d’antagonismes microbiens

élargissent ces champs d’application en montrant une interférence.

La croissance de la souche E.coli inoculée dans le milieu de culture avec

Bacillus anthracis causant l’anthrax (agent pathogène, de charbon). Parallèlement à

ces travaux Gratia, (1946) a parvenu a démontrer que E.coli, produit une molécule

active thermostable appelée colicine, le terme bactériocine était utilisé pour la

première fois .Jack et al., (1995).

Depuis la découverte de la nisine de nombreuses substances antimicrobienne

ont été découvertes ayant intérêt thérapeutiques ou alimentaire ; toutefois cette

substance produite par genre Lactobacillus, reconnue comme molécule inoffensive, a

large spectre d’action est actuellement utilisée comme agent de conservation et

additif dans l’industrie alimentaire .Recio et al., (2000) ; Klaenhammer.,(1988) ;

Klaenhammer eal.,(1994) ;Richard (1996).

Les bactéries lactiques sont utilisées en industrie laitière, le plus souvent sous

forme de ferments complexes, ainsi les effets d’interaction entre les souches peuvent

modifier les aptitudes manifestées en culture pures.

Il existe de nombreux phénomènes d’antagonismes ou d’antibioses à l’intérieur

des groupes de bactéries lactiques, vis-à-vis des autres groupes microbiens ; cultivés

sur même milieu, des études ont montré l’effet inhibiteur des bacteries lactiques

contre les especes Helicobacter pylori, E.coli, S.typhi ; Armuzzi et al, (2001) ;

Cocconnier et al, (1998) ; Canducci et al,(2000) ;Sakamoto et al,(2001) ;Collado et

al, (2005) .

Des effets d’inhibition par lesbacteries lactiques contre Listeria, notamment

dans les produits laitiers ; Grade et al., (1997 ; 2004.) ; Raccach et al., (1989) ;


44

Rodriguez et al., (1998) ; Benkerroum et al., (1993 ;2000 ; 2003); Achemchem

et al., (2004) ; Teixeira de carvalho et al., (2006).

Par production des substances inhibitrices tel que : les bactériocines par des

souches de bactéries lactiques qui sont activent contre d’autres souches de bactéries

pathogènes et sur les spores de Bacillus sp et de Clostridium sp. Cependant ; d’autre

produit de métabolisme primaires des bactéries lactiques tel que l’acide lactique,

acide formique, acide acétique et peuvent avoir des effets antagoniques sur la

croissance des autre germes.

2.6- Production des bactériocines :

Les bactéries lactiques ont la faculté de produire des substances

antibactériennes ou bactériocines ; cette caractéristique de produire des agents

antimicrobiens, est sujet à d’intenses investigations scientifiques ; plusieurs revues de

littérature scientifique étaient réservées à leur égard.

D’autres travaux ont focalisées les techniques permettant la mise en évidence

et quantification des bactériocines. Tagg et Mc Given.(1971) ; Tagg et al.,(1973) ;

Daba et al.,(1994) ;Rodriguez et al., (2002) ; Savadogo et al., (2006). Cabo et al.,

(1999) ;Recio et al., (2000) ;Aslim et al .,(2004 ;2005)

De l’analyse de la littérature scientifique relative aux sujet de bactériocines, il

ressort que, les bactériocines ou agents antimicrobiens, produits par, les bactéries

lactiques thermophiles (Lactobacillus acidophilus, Lb helviticus, Enterococcus sp.)

étaient relativement sujet a plus d’intenses investigations et d’explorations

scientifiques en comparaison aux travaux focalisant la production de ces molécules

par l’espèce Streptococcus thermophilus. Aktypis et al., (1998) ;Aktypsis et

Kalantzopoulos, (2003).


45

Les bactériocines sont des substances antibactériennes, de nature protéique,

produites par des bactéries lactiques, dotées d’un spectre d’action étroit, qui se limite

à des espèces proches de l’espèce productrice, à paroi Gram positif.

Klaenhammer, (1993) : avait distingué (04) classes :

Classe 1 : Les Lantibiotics : leur membranes renferme des acides aminés non

courantes comme : Lanthionines et βmethyllanthionines, exemple : la Nisine.

Classe 2 : Des bactériocines ne renferme pas de résidus « Lanthionines », sont

thermostables, ces bactériocines ont un PM supérieur à 10 Kda.

Classe 3 : Bactériocines thermolabiles ou « large haet labile » bactériocines,

(exemple : helviticin J ; Lactacines A et B).

Classe 4 : Cette classe renferme les proteines complex ou « Complexe

Bacteriocins » exemple : « Lactacin 27 », « Leucocin S ».

3- Les probiotiques :

3.1-Historique de leur utilisation et définitions

Le concept des probiotiques a été introduit pour la première fois au début du

siècle dernier par Elie Metchnikoff, un chercheur russe ayant reçu un Prix Nobel pour

ses études. Il est à l’origine de l’observation scientifique originale du rôle positif joué

par certaines bactéries sur la santé. Metchnikoff (1908) suggéra que « la dépendance

des microbes intestinaux par l’alimentation rend possible l’adoption de mesures pour

modifier la microflore du corps en remplaçant les microbes nocifs par des microbes

utiles ».

Suite à cette hypothèse, il y eut un intérêt scientifique croissant malgré le

manque de résultats positifs et d’objectivité pour certaines études. Malgré toutes les

investigations réalisées, à l’aide des techniques disponibles à l’époque, le concept

demeura sans preuve et fut mis de côté pendant de longues années. Ce n’est que


46

depuis une vingtaine d’années que la recherche a repris dans ce domaine, il est

maintenant possible de sélectionner les souches les plus appropriées pour répondre

aux bénéfices santé recherchés.

Le terme probiotique provient de deux mots grecs, pro et bios, qui signifient

littéralement «pour la vie ». Il a été popularisé par Fuller en 1989 lorsqu’il lui donna

sa première définition officielle : « les probiotiques sont des suppléments alimentaires

à base de micro-organismes vivants qui agissent de façon bénéfique sur l’être vivant

en améliorant l’équilibre et la stabilité de sa microflore intestinale ». Cette définition

a été révisée à plusieurs reprises et actuellement, la plus acceptée est celle

recommandée par un panel d’experts mandatés par l’Organisation des Nations Unies

pour l’Alimentation et l’Agriculture et l’Organisation Mondiale de la Santé. Elle

indique que les probiotiques sont : « des microorganismes vivants qui lorsqu’ils sont

administrés en quantités suffisantes confèrent un bénéfice pour la santé de l’hôte »

(FAO/WHO, 2002). Tel qu’indiqué, la notion de viabilité est essentielle (Sanders,

2003). De plus, même s’il en est pas fait mention dans cette définition, la dose

généralement recommandée pour obtenir des effets bénéfiques se situe aux environs

de109 à 1010 bactéries par jour afin d’obtenir environ 108 cellules bactériennes

vivantes au duodénum (Sanders et Huis in’t Veld, 1999).

L’apport doit également être régulier puisque ces dernières ne colonisent pas

l’intestin de façon permanente (Ouwehand et al., 2002a). Ceci peut être dû au fait que

la composition du microbiote résident est spécifique à chaque individu et que les

bactéries exogènes ne s’établissent pas facilement (Heyman et Ménard, 2002).

Actuellement, les probiotiques sont disponibles sous différents types de

produits. Ils peuvent être consommés sous la forme de suppléments alimentaires en

capsules contenant des cultures viables lyophilisées ou sous la forme de produits

alimentaires fermentés tels que les yogourts, qui demeurent un véhicule par

excellence pour leur consommation (Sanders, 2003; Parvez et al., 2006). D’autres


47

produits alimentaires incorporant des probiotiques sont également sur le marché tels

que les préparations infantiles, des boissons lactées, des jus de fruits, des fromages et

d’autres actuellement en cours de développement comme la gomme à mâcher. Ces

produits contiennent une ou plusieurs souches probiotiques de genres et d’espèces

différents (Fooks et Gibson, 2002).

3.2-Souches à fort potentiel probiotique

Les principales souches reconnues en tant que probiotiques chez l’humain sont

des bactéries appartenant aux genres Lactobacillus, Bifidobacterium, Enteroccocus,

Streptoccocus et des levures du genre Saccharomyces. Les espèces associées à

chacun de ces groupes sont présentées au Tableau 6

Tableau 6: Liste des principales souches microbiennes considérées comme

probiotiques.

Lactobacilles Bifidobactéries Autres bactéries lactiques Autres micro-organismesnon lactiques

L. acidophilus

L. casei

L. helveticus

L. gasseri

L. johnsonii

L. paracasei

L. plantarum

L. rhamnosus

L. lactis

B. adolescentis

B. animalis

B. bifidum

B. breve

B. infantis

B. lactis

B. longum

Enterococcus faecium

Streptococcus thermophilus

E. coli (‘Nissle 1917’)

Saccharomyces

boulardii

Saccharomyces

cerevisiae

Adapté de Holzapfel et al. (2001).

Parmi ces micro-organismes, les bactéries appartenant aux genres

Lactobacillus et Bifidobacterium sont les plus fréquemment utilisées avec le plus

d’applications connues à ce jour chez l’humain, a titre d’exemples, les souches

commerciales de lactobacilles ayant des propriétés fonctionnelles et des effets


48

cliniques documentés incluent L. rhamnosus GG, L. casei, L. casei Shirota et L.

reuteri comparativement aux bifidobactéries dont la principale souche, B. lactis

Bb12, fait l’objet de plusieurs études (Pedone et al., 2000; Alvarez-Olmos et

Oberhelman, 2001; Chouraqui et al., 2004).

3.3- Critères de sélection des probiotiques

Afin de satisfaire à la définition des probiotiques, les micro-organismes doivent

posséder diverses propriétés de survie, d’activité et de persistance dans le tractus

digestif qui leurs permettront d’exercer des effets bénéfiques sur l’hôte.

Ces propriétés sont propres à chaque souche et ne peuvent pas être extrapolées

d’une souche à l’autre même au sein d’une seule espèce (Dunne et al., 2001).

Plusieurs critères majeurs de sélection in vitro et in vivo ont été établis et retenus par

différents auteurs (Tableau 7).

Tableau 7 : Principaux critères de sélection des probiotiques.

Critères de sécurité

Identification taxonomique préciseOrigine humaine pour utilisation chez l’humainSouche caractérisée par des techniques phénotypiques etgénotypiquesHistorique de non pathogénicité et non-invasion de l’épitheliumintestinalPas de transmission possible de gènes de résistance aux antibiotiques

Critères fonctionnels

Tolérance à l’acidité, à la bile et aux enzymes digestivesAdhésion aux cellules intestinales et persistance dans le tractusintestinalProduction de substances antimicrobiennes (bactériocines, acidesorganiques, peroxyde d’hydrogène ou autres composés inhibiteurs) etantagonisme envers les pathogènesImmunomodulationAptitude à produire des effets bénéfiques sur la santé

Critères technologiques

Stabilité au cours des procédés de production et dansle produit finiConservation des propriétés probiotiques après productionNon modification des propriétés organoleptiques du produit fini


49

Adapté de Klaenhammer et Kullen (1999); Saarela et al., (2000); Ouwehand et al.,

(2002); Gueimonde et Salminen (2006).

Parmi les critères reliés à la sécurité, l’identification taxonomique de la souche

est une étape importante dans l’établissement de nouvelles souches potentiellement

probiotiques (Holzapfel et al., 2001). Chaque souche doit être identifiée par des

techniques moléculaires fiables et confrontée à une nomenclature actualisée

(FAO/WHO, 2002; Gueimonde et Salminen, 2006). Actuellement, l’hybridation

ADN-ADN est la méthode moléculaire de référence pour identifier l’espèce d’une

souche, mais cette méthode est longue et requiert une large collection de souches de

référence (FAO/WHO, 2002). Le séquençage de l’ADN codant pour l’ARN 16S

ribosomal est considéré aussi pertinent (FAO/WHO, 2002).Dans ce dernier cas, il est

recommandé que la technique soit combinée avec des tests sphénotypiques pour

confirmation. L’origine de la souche est également une condition importante car

l’interaction spécifique avec l’hôte est maximisée lorsqu’elle provient du même

habitat (Alvarez-Olmos et Oberhelman, 2001). Les souches probiotiques doivent

également être sans effet négatif et être sécuritaires pour la santé humaine. A ce titre,

les souches potentiellement probiotiques seront évaluées afin qu’aucun des effets

secondaires suivants ne soient détectés: infections systémiques, activité métabolique

nuisible, stimulation immune excessive chez des individus susceptibles et transfert de

gènes (par exemple de résistance aux antibiotiques) (FAO/WHO, 2002).

A ce sujet, les souches de lactobacilles et bifidobactéries associées aux

aliments possèdent un historique de sécurité de longue date et très peu de corrélations

existent entre des infections systémiques et la consommation de ces probiotiques dans

la littérature (Borriello et al., 2003; Marteau et al., 2006).

Pour assurer une fonctionnalité optimale, les souches probiotiques doivent

conserver leur viabilité jusqu’à leur site d’action. Cependant, il existe une controverse

autour de ce critère notamment par rapport à l’effet sur le système immunitaire.


50

Même s’il est reconnu que les cellules bactériennes mortes peuvent apporter

des bénéfices physiologiques (Sanders, 2003), la définition actuelle des probiotiques

insiste sur le paramètre de viabilité (FAO/WHO, 2002).

Avant d’atteindre le tractus intestinal, les probiotiques doivent résister

principalement à l’environnement acide de l’estomac (pH compris entre 2,0 et 3,4) et

à la bile sécrétée dans le duodénum (Dunne et al., 2001; Gueimonde et Salminen,

2006). Le degré de tolérance à ces conditions diffère pour chaque souche (Havenaar

et Huis in’t Veld, 1992).

3.4-Allégations santé

De nombreuses allégations santé ont été associées à la consommation de

souches probiotiques. Parmi les principaux effets bénéfiques rapportés dans la

littérature (Marteau et al., 2001; Parvez et al ., 2006) nous retrouvons :

- Atténuation de l’intolérance au lactose

- Prévention et traitement des infections entériques

- Diminution des diarrhées associées à la prise d’antibiotiques

- Prévention des allergies alimentaires

- Modulation de la fonction immunitaire (stimulation ou régulation).

Un nombre croissant d’études cliniques réalisées pour vérifier ces allégations a

permis d’avancer certaines explications. Les probiotiques pourraient apporter une

quantité supplémentaire d’enzymes digestives (par exemple des β-galactosidases

capables d’hydrolyser le lactose), créer un effet barrière contre les pathogènes,

rétablir l’équilibre du microbiote résident, dégrader des protéines allergènes et

interagir avec le système immunitaire intestinal pour produire une réponse immune

plus efficace (Sanders, 2003; Corthésy et al., 2007). Bien que les bénéfices santé

mentionnés précédemment soient supportés par plusieurs études, il en existe d’autres


51

qui nécessitent des investigations pour confirmer certains bienfaits. Il s’agit

notamment de l’activité hypocholestérolémiante, de l’effet antihypertenseur, de la

prévention du cancer du côlon, du soulagement des maladies inflammatoires et

irritables des intestins et de la diminution des ulcères induits par Helicobacter pylori

(Parvez et al., 2006).

Parmi les allégations santé avec de fortes évidences scientifiques, l’utilisation

de microorganismes probiotiques pour la prévention et le traitement des désordres

gastrointestinaux est une mesure adaptée et constitue l’application la plus commune

des probiotiques car la plupart des effets santé leurs étant attribués sont en rapport

direct ou indirect (via le système immunitaire) avec le tractus gastrointestinal (De

Vrese et Marteau, 2007).

A ce titre, certains auteurs qualifient l’utilisation des probiotiques comme étant

un traitement d’interférence microbien contre les infections intestinales (Fooks et

Gibson, 2002).

Cependant, peu d’études sont disponibles pour confirmer l’effet prophylactique

ou thérapeutique qu’apportent les bactéries à haut potentiel probiotique contre des

pathogènes.

Il est néanmoins reconnu que les probiotiques offrent les avantages d’être

accessibles, peu coûteux et sans effet secondaire notable contrairement aux

traitements actuellement utilisés pour prévenir ou traiter ces infections (vaccination,

antibiothérapie).

Matérielset Méthodes

Matériels et Méthodes

52

1-MATERIELS

1.1-Souches étudiées :

Le travail expérimental a porté sur l’étude de vingt souches d’entérobactéries

(dont la répartition est donnée sur le Tableau 8) ; ces souches ont été prélevées sur

des selles et des urines des patients présentant séparément des diarrhées infectieuses,

des infections urinaires et de la fièvre typhoïde, pour la recherche et l’isolement des

entérobactéries .Le prélèvement des selles a été examiné dans les quatre premières

heures. (Conservation possible de 8 heures à 4°C) pour éviter tout desséchement des

prélèvements.

Alors que le prélèvement urinaire est examiné dés son arrivée au laboratoire,

par la vérification de son aspect qui peut être clair ou opaque.

Les bactéries lactiques utilisées pour l’étude de l’antagonisme à savoir:

Lactobacillus lactis (Lb1), Lactobacillus helveticus (Lb2), Lactobacillus rhamnosus

(Lb3). Ces bactéries sont isolées à partir du lait de chamelle et identifiées au

laboratoire de bactériologie au niveau du centre vétérinaire de la wilaya de Tlemcen.


53

Tableau 8 : Provenance des souches

1.2-Souche de référence :

Escherichia coli ATCC 25922 : une souche de référence de la collection du

centre vétérinaire a été utilisée pour mieux valider nos résultats lors de la réalisation

de l’antibiogramme et l’antagonisme.

1.3-Antibiotiques testés :

Tous les antibiotiques utilisés proviennent de Biorad, Marnes, La Coquette,

France. La liste figure dans le Tableau 9

Sexe des patients Age des patients Source deprélèvements

FémininFémininMasculinFémininFémininFémininFémininFémininFémininMasculinFémininFémininFémininFémininFémininMasculinMasculinFémininMasculinFéminin

3052

3 mois822218

5 mois56

2 mois3430178230253329133317

SellesUrinesSellesUrinesUrinesUrinesSellesUrinesSellesUrinesUrinesSellesUrinesUrinesSellesSellesSellesSellesSellesSelles


54

Tableau 9 : la liste des antibiotiques testés et leurs charges

Antibiotiques Abréviation La charge (µg)

CéfotaximeFlumequine

ColistineAmoxycilline Clavulanic

AcidGentamicine

TrimethoprimeSulfamethoxazole

AmpicillineTétracycline

EnrofloxacineChloranphénicoleSulfamethoxazole

TrimethoprimeOxacillin

NeomycineStreptomycine

Acide NalidixiquePenicilline

Erythromycin

CTXUBCS

AMC

GMSXT

AMPTE

ENRCSS

TMPOXNES

NAPEN

E

30301010

1010

10301030101510101030

3015

1.4-Milieux de culture :

Le Rogosa Sharp liquide et solide (MRS) a été utilisés pour l’enrichissement et

le dénombrement des Lactobnacilles.

Le bouillon Trypyicase Soja Bouillon (TSB) a été utilisé pour l’enrichissement

des Entéropathogénes (E. coli, S. typhi, K oxytoca).

Milieu Hektoen et le milieu ont été utilisé pour l’isolement des Gram négétifs

entéropathogénes (E.coli, S. typhi, K. oxytoca).Le milieu Muller- Hinton a été utilisé

pour la réalisation de l’antibiogramme.


55

Les souches isolées sont conservées sur Gélose Nutritive (GN) exception pour

les souches de Lactobacilles.

2-METHODES

2.1-Identification des souches isolées :

L’identification des souches a été réalisée au niveau du Laboratoire Vétérinaire

Régional de la wilaya de Tlemcen, elle a pour but la séparation des Entérobactéries.

2.1.1-Examen bactériologique :

La coproculture et l’étude cytobactériologique des urines ont pour but la mise

en culture des matières fécales et des urines afin d’isoler les bactéries responsables

des infections urinaires et digestives, la méthodologie est illustrée sur la Figure 9.

2.1.2-Enrichissement :

Une portion de selles et ajoutée à 2 ml de bouillon TSB pour l’enrichissement

après le milieu est homogénéisé pour être incubée à 37°C pendant 24heures (Le

Minor et Richard, 1993).

2.1.3-Isolement :

Une goutte du milieuTSB préalablement enrichi et ensemencé sur le milieu

gélose Hektoen par stries (Marchal et al., 1991).

Une goutte du prélèvement urinaire et ensemencé sur le milieu gélose nutritive

(Marchal et al., 1991).Les boites ensemencées sont incubées à 37°C pendant 24

heures.


56

2.1.4-Identification :

L’identification est basée sur la détermination des caractères morphologiques

et biochimiques (Le Minor and Richard, 1993).

Figure 9: Schéma représentatif de la méthodologie de prélèvement et

d'identification des souches étudiées. CVWT

Selles Urines

Enrichissement dans les bouillons TSB

Culture sur gélose nutritiveCulture sur gélose Hektoen

Incubation 24 H à 37°C

Résultat positif Résultat négatif

Examen macroscopique etmicroscopique

Galerie biochimique


57

2.1.4.1- Examen macroscopique :

La lecture des ensemencements vise à noter La couleur ; l’odeur ; la taille et

l’aspect des colonies.

Cette observation à l’œil nu est une première clé d’identification (Philippon et

al., 2007).

2.1.4.2 - Examen microscopique :

La double coloration de Gram et l’observation à l’état frais sont la deuxième

étape de l’identification. (Philippon et al., 2007).

2.1.4.3 -Identification des caractères biochimiques :

En se référant aux tests préconisés par Marshall, (1982), on a procéder aux

tests suivants :

2.1.4.3.1-Test des 3 sucres :

Sur le milieu TSI (Trois Sucres à Identifier) est ensemencé avec la souche à

étudier, il est incubé à 37°C pendant 24 heures. Ce test permet la mise en évidence de

la fermentation du glucose, du lactose et du saccharose, la réaction est dite positive si

le milieu devient jaune orange.

Il met aussi en évidence la production d’H2S qui fait virer le milieu au noir ce qui

est dû à la formation du sulfure de fer (Sahl, et al.1995).

2.1.4.3.2- Test mannitol-mobilité :

L’utilisation du mannitol se traduit par une acidification entraînant un

jaunissement de l’indicateur du milieu mannitol ; la mobilité se traduit par une

diffusion à partir de la piqûre centrale vers le fond du tube (Couture, 1990 ; Joffin et

al., 2001).


58

2.1.4.3.3- Test de Simmons :

Ce test permet la mise en évidence du citrate perméase : enzyme permettant à

la souche l’utilisation du citrate comme seule source de carbone ; après incubation à

37°C pendant 24heures, l’utilisation du citrate se traduit par la libération des ions

« OH- », qui alcalinisent le milieu en se traduisant par une couleur bleue après le

virage du vert de bromothymol (Gaillot, 2008).

2.1.4.3.4- Production d’acétone :

La souche à identifier est ensemencé dans un tube qui contient le milieu Clark

et Lubs, après incubation à 37°C, pendant 24 heures une goutte de VP1 et une goutte

de VP2 (VP : Vogs Proakauer), sont ajoutées ; si après 10 min la couleur rouge au

préalable devient rose la réaction est dite alors positive (Marchal et al., 1991).

2.1.4.3.5- Recherche de la production d’indole :

Le milieu d’urée indole (couleur orange) est ensemencé avec la souche à

tester, après incubation à 37°C, pendant 24 heures,on ajoute quelques gouttes de

réactif Kovacs ,s’il ya formation d’un anneau rouge la réaction est dite indole positif

(Guillaume, 2004).

2.1.4.3.6- Recherche de à ß-galactosidase :

La souche étudiée est ensemencée dans un tube de 2 ml d’eau physiologique

auquel on ajoute un disque d’Ortho-Nitro-Phenyl-Galactopyranoside (ONPG).

Après incubation à 37°C, pendant 24heures la réaction positive se traduit par une

coloration jaune due à la libération d’orthonitrophenol dans le milieu (Richard,

1978).


59

2.1.4.3.7- Recherche de l’uréase et du tryptophane désaminase :

Après 24 heures d’incubation à 37°C Sur milieu urée indole la souche à

tester produit la réaction suivante :

NH2 + COOH → CO2 + NH3

La combinaison des produits CO2 et NH3 entraîne la formation du carbonate

d’ammonium qui alcalinise le milieu et entraîne un virage au rouge violacé, le

tryptophane désaminase est détectée par addition du perchlorure du fer qui entraîne

une coloration brunâtre (Sigleton, 2005).

2.1.4.3.8- Recherche de nitrate réductase :

Le bouillon nitrate est ensemencé avec la souche à tester, après incubation à

37°C 24 heures on ajoute une goutte de nitrate 1 et une goutte de nitrate 2, si la

coloration vire vers le rouge le teste est dit positif (Joly et Alain, 2003).

2.1.4.3.9- Recherche de l’oxydase :

La bandelette d’oxydase est déposée sur une lame propre et imbibé avec une

goutte d’eau distillée stérile. Une colonie est prélevée à partir du milieu gélose

nutritive à l’aide d’une pipette pasteur puis déposer sur la bandelette.

En présence de l’oxydase la coloration violet foncé apparaît immédiatement

ou en quelque secondes, puis noircit (rose violette puis elle devient brun foncé)

(Grath et al., 1977).

2.1.4.3.10- Recherche de L.D.O ; O.D.C et ADH:

Les milieux liquides : Lysine décarboxylase, Ornithine décarboxylase,

Arginine décarboxylase de couleur violette pour la recherche des décarboxylase et

dihydrolase bactériennes.


60

Dans trois tubes différents on ensemence la souche a étudier, on incube à 37°C,

pendant 24 heures, si la couleur reste violacée, la réaction est dite positive et si elle

devient jaune la réaction est dite Négative (Djelouat, 2008).

2.1.5- Antibiogramme

Nous avons utilisé la méthode par diffusion de disques imprégnés, décrite pour

la première fois par Kirby-Bauer (1966) et utilisée actuellement par différents

organismes de recherche avec des modifications mineures.

- A partir d’une culture pure de18 heures, on prélever 3 à 4 colonies ayant le

même aspect.

- on décharge la pipette dans un tube d’eau physiologique à 9 ‰

- on homogénéise la suspension bactérienne, la mettre dans le densitomètre

pour avoir une opacité de 0.5 mcfarland ; puis on trempe un écouvillon

stérile dans la suspension, et on élimine l’excédent en pressant l’écouvillon

sur la paroi du tube. Ensuite on ensemence en stries sur toute la surface

gélosée à trois reprises en faisant tourner la boite et l’écouvillon de 60°

après chaque application.

- on applique les disques d’antibiotiques à l’aide d’un distributeur ou d’une

pince stérile.Il ne faut pas mettre plus de 6 disques dans une même boite de

90 mm.

- La lecture se fait par la mesure du diamètre d’inhibition à l’aide d’un pied

a coulisse, pour comparer les diamètres obtenus aux valeurs critiques

figurant dans la référence (NCCLS).

- Dans notre étude on a complété avec une lecture interprétative, c’est à dire

en comparant les diamètres des souches étudiées avec celui de la souche de

référence E. coli ATCC 25922 pour la validité du procédé.

- L’antibiogramme de la souche de référence est réalisé dans les mêmes

conditions, le même jour (Denteil, 1996).


61

2.2- Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus sp

La pureté des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) est obtenue par

repiquage successif sur milieu MRS gélose et incubé à 30°C pendant 24 à 48 heures.

Puis on réalise une coloration de Gram et plus des tests suivants :

2.2.1-Tests enzymatiques :

2.2.1.1-Recherche de catalase :

Sur une lame on dépose une goutte d’eau oxygénée puis on ajoute un peu de

culture prélevé des boites, un résultat est considérés positif par un dégagement de

bulles gazeuses. Il est souhaitable d’éviter toute recherche de la catalase sur gélose au

sang (cause d’erreur), du fait de la présence de cette enzyme dans le sang (Marchal et

al., 1991).

2.2.1.2-Recherche de l’oxydase :

Sur une lame on dépose un disque d’oxydase et une goutte d’eau distillé, unpeu de culture est prélevé et déposer sur le disque. Résultat positif se manifeste parune coloration rose violette. (Marchal et al., 1991).

2.2.2- Antibiogramme :

La sensibilité et la résistance des souches de Lactobacillus été réalisé par la

technique de diffusion sur milieu MRS solide en utilisant des disques d’antibiotiques

suivants : acide nalidixique , gentamicine, chloramphénicol, pénicilline, néomycine,

erythromycine, tétracycline, oxacillin , cefoxitin, streptomycine, sulphametaxazole,

trimethoprime. Les boites sont incubées en aeroanaerobiose à 30°C pendant 24à 48h.

La lecture s’effectue par la mesure de la zone d’inhibition (Goppola et al., 2005 ;

Delgado et al., 2005).


62

2.2.3-Tests physiologiques :

2.2.3.4- La production de CO2 de la fermentation du glucose :

Pour déterminer la production de CO2 de la fermentation de glucose par les

souches de Lactobacillus, nous avons ensemencé des colonies d’une culture pure

dans le bouillon MRS contenant une cloche de Durham et incubé à 30°C pendant 24 à

48h en aeroanaerobiose. La présence de gaz dans la cloche indique qu’il y a

production de CO2. (Garvie, 1984).

2.2.3.5-Fermentation des sucres :

Un tube de 10 ml de milieu MRSc a été ensemencé avec une colonie de

Lactobacillus et incubé en aeroanaerobiose à 30ºC pendant 24 à 48h.On a procédé

une centrifugation 3000g/15 mn.Le culot une fois récupéré est rincé 3 fois à l’eau

physiologique puis une suspension épaisse est réalisée avec 20 gouttes d’eau

physiologiques (Collins et Hall 1984).

Le milieu MRSc sans sucre additionné d’indicateur de pH pourpre de

Bromocrésol à raison de 0.0004% et auquel on ajoute les sucres testés à une

concentration finale de 2% puis le milieu est ensemencées avec 1% de la suspension

bactérienne.Les cultures sont incubées en aeroanaerobiose en présence d’huile de

vaseline stérile à30ºC pendant 24 à 48h. Figure 10.

La fermentation d’un sucre donné par la souche de Lactobacillus testée se

traduit par la formation d’acide qui se manifeste par le virage de la coloration rouge

en jaune.


63

2.2.3.6- Suivie de l’acidité titrable :

Les souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3), ont été inoculé dans des

flacons de 250ml avec une concentration de 5% d’inoculum .A partir des flacon de

250ml on a préparé des tubes de 10ml pour suivre l’acidité titrable pendant 6h

d’incubation a 42 ºC.

Le titrage s’effectue à l’aide d’une burette avec de la soude dornic sous

agitation, on a utilisé le phénophtaleine comme indicateur. Le résultat est considéré

positive quand le virement de la couleur blanche du lait au rose dure quelques

secondes.

Les résultats sont exprimés en degrée dornic n×10

n : volume de la soude dornic

1 D° dornic=0.1 g d’acide lactique

L’acidité titrable été suivie en milieu lait écrémé +0.05% cystéine Hcl.


64

2.2.3.7- Suivi du pH :

L’acidité développée dans le lait est suivie aussi par la mesure du pH.

Figure 10: Test de fermentation des sucres (Collins et Hall, 1984)

10 ml de bouillon MRS ensemencé par Lactobacillus Lb1

Centrifugation du contenu du tube à 3000 tours/min pendant 15 min

2 ml de

MRS BCP

Culot

Huile de paraffine

1 ml de sucre

0.1 ml

Incubation à 30°C pendant 24 heures

La fermentation du sucre se traduit par une couleur jaune

5 ml de MRSBCP


65

2.3-Test de l’antagonisme

2.3.1-Préparation des précultures

On a ensemencé les souches Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) dans des tubes

contenant 5ml de bouillon MRS, puis sont incubés à 30°C pendant 24 heures, alors

que les souches pathogènes E.coli, S.typhi et K.oxytoca sont ensemencées dans un

bouillon d’enrichissement TSB à 37°C pendant 24heures.

2.3.2-Recherche des inhibitions

On ensemence les souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) par touche à la

surface du milieu MRS solide (Gagnon, 2007), après séchage à la température

ambiante pendant 30mn, les boites de Pétri sont mises à l’étuve à 30°C pendant 12

heures.

On couvre alors la culture avec 7ml de gélose molle maintenue en surfusion

45°C contenant 500µl d’une culture pathogène de 12 heures.

Après solidification du milieu, les boites sont incubées à 37°C /24 à 48h

Un résultat positif de l’antagonisme se traduit par la présence des halos clairs

autours des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) ensemencées en touches.

Figure11 (un résultat est positif si le diamètre est supérieur à 2mm) (Abeet et al.,

1995).


66

Figure 10: méthode de la recherche des halos d’inhibition. (Gagnon, 2007)

Halo d’inhibition

- 5 ml de bouillon TSB- Incubation à 37 °C pendant 24 h

- 5 ml de MRS bouillon- Incubation à 30°C pendant 48 h

- Ensemencement des souchesLb1, Lb2 et Lb3 par touche

- Incubation à 30°C pendant 12 h


- Ensemencement des souches sur gélosenutritive semi solide

- Incubation à 37 °C pendant 12h


67

2.3.3-Recherche des agents d’inhibition :

2.3.3.1 - Le pH :

La recherche des inhibitions inter bactériennes est réalisée selon la technique

de Fleming et al., 1983.

On prépare deux tubes de bouillons nutritifs contenant une souche de

Lactobacillus ( Lb3) qui a présenté la plus grande zone d’inhibition pour s’assurer

d’avoir de bon résultas , les tubes sont ensuite incubés à 37°C pendant 18 heures .On

note la croissance des Entérobactéries dans les deux tubes .

Le pH des deux tubes est de 7, après 6 heures d’incubation on ajoute à l’un

des tubes (pour comparer) 1ml de HCL 0.9% ; les tubes sont incubés à 37°C , la

croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique chaque deux

heures pendant 20 heures ( Fleming et al , .1983)

2.3.3.2 - Recherche de bactériocines

La recherche des bactériocines se fait sur milieu liquide. Elle est réalisée

seulement sur la souche bactérienne présentant le plus grand halo d’inhibition.

Une culture jeune de 12 heures de la souche Lactobacillus (Lb3) est introduite

dans 50ml de bouillon MRS à 37°C pendant 16 heures (Kleanhammer, 1986). Après

incubation on centrifuge à 8000 t/m pendant 7mn et on récupère le surnageant, qui est

ajusté avec du NaOH (5N) à pH 7 pour éliminer l’effet de l’acidité (Hutt et al., 2006).

On prépare deux tubes contenant 10ml de bouillon nutritive ensemencée avec

la souche pathogène (St1) .Les tubes sont incubés à 37°C pendant 20h h, la

croissance bactérienne est suivie par la mesure de la densité optique chaque les deux

heures, à la 6 éme heure après l’incubation le surnageant est ajouté a l’un des deux

tubes. (Asperger, 1985).voire Figure 12.


68

Figure 12 : schéma représentant la recherche de Bactériocine (Asperger, 1985).

NaOH


Centrifugation du contenu du tube à 8000 tours/mn pendant 7 minutes

On récupère le surnageant, que l’on ajuste à pH= 7

Le surnageant (Après6 heures d’incubation)

Incubation à 37 °C pendant 20 heures

La croissance bactérienne est suivie par la mesurede la densité optique chaque 2 heures

2- On prépare deux tubes de 10 ml du bouillon TSB ensemencé par Salmonella typhi

1- On prépare un pré culture de la souche Lactobacillus helveticus dans le bouillon MRS

Résultats

Résultats

69

1-Identification des entéropathogène : E.coli, S.typhi, K.oxytoca :

1.1-Etude bactériologique :

L’aspect macroscopique sur milieu solide Héktoen des souches ensemencéesmontre :

Des colonies rondes, saumons lisses et laiteuses, suspectées d’être E.coliFigure 13

Figure 13: Aspect macroscopique d’E.coli après incubation à 37°C/24h

• Des colonies fines, vertes au centre noir suspecté d’être S.typhi. Figure14

Figure 14 : Aspect macroscopique d’S .typhi après incubation à 37°C/ 24h

Résultats

70

• Des colonies volumineuses, saumons, bombées, brillantes et souvent confluentessuspectées d’être K.oxytoca Figure15.

Figure15 : Aspect macroscopique de K.oxytoca après incubation à 37°C /24h

La double coloration de Gram des souches apparentés à E.coli, se révèlent en

bacilles de couleur rose donc Gram (-) Figure16.

Figure16 : Observation microscopique de la souche E.coli (G× 100).

Celles apparentés d’être S.typhi sont en forme de petits bacilles Gram- Figure 17

Figure 17 : Observation microscopiquede la souche S.typhi (G× 100).

Résultats

71

Alors que des formes coccoides, de groupements en diplobacilles ou en courtes

chaînettes correspondent à K.oxytoca Figure 18

Figure 18: Observation microscopique de la souche K.oxytoca (G×100).

1.2- Identification des caractères biochimiques :

Les Figures19, 20 et 21 représentent les résultats des tests biochimiques dont

les détails sont donnés par le Tableau 10.

Figure 19: Résultats de l’identification biochimique de la souche E.coli.

1: Milieu TSI, 2: Citrate de Simmons, 3: Mannitol- Mobilité, 4: Test ONPG,

5: Urée-Indole, 6: Milieu ADH, 7: Milieu ODC, 8: Milieu LDC,

9: Test d’Acétone VP, 10: Nitrate Réductase.

Résultats

72

Figure 20: Résultats de l’identification biochimique de la souche S.typhi.

1: Milieu TSI, 2: Citrate de Simmons, 3: Mannitol- Mobilité, 4: Test ONPG,


9: Test d’Acétone VP, 10: Nitrate Réductase.

Figure 21: Résultat de l’identification biochimique de la souche K. oxytoca.

1: Milieu TSI, 2: Citrate de Simmons, 3: Manitol- Mobilité, 4: Test ONPG,


Résultats

73

Tableau 10: Tests biochimiques recherchés pour l’identification des souchesdes étudiées.

1.3- Antibiogramme des souches isolées : E.coli, S.typhi, K.oxytoca :

L’étude de la sensibilité et la résistance de ces souches est utile dans le choix

thérapeutique. Figures 22,23 et 24. Tableaux 11, 12 et 13 (voire annexe).

Tests biochimiquesRésultats obtenus

E.coli S.typhi K.oxytoca

Fermentation des sucresTSI

(Glu, Sac, Lac)

Glu : +Sac : +Lac : +



Citrate de Simmons - - +

Manitol + + +

Mobilité + + -

Β-galactosidas ONPG + - +

H2S ou Gaz Gaz H2S Gaz

Uréase - - +

Indole + - +

Production d’acétone VP - - +

TryptophaneDésaminasTDA

- - -

Oxydase - - -

Arginine DihydrolaseADH

- - -

Lysine DécarboxylaseLDC

+ + +

Ornithine DécarboxylasODC

+ - -

Résultats

74

Figure 22 : Résultat de l’antibiogramme de la souche E. coli (Ec1).

Figure 23 : Résultat de l’antibiogramme de la souche S. typhi (Ec1).

Figure 24: Résultat de l’antibiogramme de la souche Klebsiella oxytoca (Ko4).

1: Cefotaxim, 2: Flumequine, 3: Colistine, 4: Amoxicillin clavulanic acid,

5: Gentamicine, 6: Trimethoprime Sulfamethoxazole, 7: Ampicillin,

8: Tetracycline, 9: Enrofloxacine, 10: Chlorenphenicol, 11: Sulfamethoxazole

12: Trimethoprime

1 2 3

4 5 6 7

8 9 1092

4

2

42

119

2

4

2

4

2

1292

4

2

42

Résultats

75

2. Vérification de la pureté des souches de Lactobacillus : Lb1, Lb2, Lb3 :

2.1-Etude macroscopique et microscopique :

• Sur milieu MRS gélosé, les colonies apparaissent après 24h à 48h d’incubation à

30°C, de couleurs blanches, petites, bien isolées.

Figure 25: L’aspect des colonies de la souche L. rhamnosus (Lb3) ensemencé par

stries sur milieu MRS gélosé, incubées à 30°C pendant 48heures en eroanaerobiose

• L’observation sous microscope après coloration de Gram, indique qu’il s’agit de

bacilles bien apparents, Gram positive. Figure 26

Figure 26 : Observation microscopique de la souche L. rhamnosus (Lb3)(grossissement × 100)

Résultats

76

2.2- Tests physiologiques et biochimiques :

2.2.1- Activités enzymatiques :

Les activités des enzymes catalase et oxydase ont été étudiées. Les résultats

nous montrent que les souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2et Lb3) sont catalase et

oxydase négatifs.

2.2.2- Production de CO2 :

La culture des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) dans des tubes

contenant le milieu MRS bouillon et la cloche de Durham incubés à 30°C en

aeroanaerobiose, n’a montrée aucune production de gaz dans la cloche.

Ce résultat nous démontre que ces souches fermentent le glucose sans production du

CO2 donc elles ont un métabolisme homofermentaire Figure 27.

Figure 27 : Test de fermentation des trois souches

de Lactobacillus Lb1, Lb2, Lb3.

2.2.3- Identification de l’espèce par le profil fermentaire :

L’identification au niveau de l’espèce des souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2

et Lb3) été réalisée par l’étude de leurs profils fermentaires, 10 sucres ont été utilisés

(Tableau 14). Les résultats obtenus nous ont montrés que les souches fermentent 04

sucres Figure 28,29 et 30.

Résultats

77

Figure 28 : Profil fermentaire de la souche L. lactis (Lb1).

Figure 29: Profil fermentaire de la souche L. helveticus (Lb2).

Figure 30 : Profil fermentaire de la souche L. rhamnosus (Lb3).

Résultats

78

De gauche à droite Témoin, Sorbitol, Saccharose, Mannitol, Maltose, Lactose

Glucose, Galactose, Fructose, Arabinose, Amidon.

Tableau 14 : Résultat du test de fermentation des sucres par les souches deLactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3)

(+) : réaction positive, (-) : réaction négative

2.3- Antibiogramme :

Les résultats obtenus du test d’antibiogramme sont représentés dans le

Tableau15 et la Figure 31 montre la sensibilité et la résistance des souches de

Lactobacillus (Lb1, Lb2et Lb3) aux antibiotiques.

Figure 31: Résultats du test d’antibiogramme de la souche L. rhamnosus (Lb3).

1 : Oxacillin, 2 : Cefoxitin, 3 : Néomycine, 4 : Gentamicine, 5 : Acide nalidixique, 6 :Pénicilline, 7 : Chloramphénicol, 8 : Erythromycine,

9 : Sulphamethoxazole, 10 : Tétracycline, 11 : Trimethoprime,12 : Streptomycine.

Sucres testésCode de la

souche

Am

idon

Ara

bino

se

Fruc

tose

Gal

acto

se

Glu

cose

Lac

tose

Mal

tose

Man

nito

l

Sacc

haro

se

Sorb

itol

+ / -+-+ / ----+-+Lb1

++-----+-+Lb2

+ / -+-----+ / --+ / -Lb3

213

2

42 52

4

2

4

2

62

42

42

72

42

4

2

82

4

2

42

92

4

2

4

2

1092

4

2 42

1192

4

2 42

4

2

1292

4

2 42

Résultats

79

Tableau 15: Résultat de l’antibiogramme des étudies isolées Lb1, Lb2 et Lb3

Antibiotique Lb1 Lb2 Lb3Néomycine R R R

Streptomycine R R RGentamicine R R R

Sulphamethoxazole R R RAcide nalidixique R R R

Oxacillin R R RCefoxitin R R R

Trimethoprime R R RPénicilline S S S

Chloramphénicol S S SErythromycine S S STétracycline S S S

S : sensibilité R : résistance

2.4-L’acidification du lait :

Les résultats montrent que les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ont un pouvoir

acidifiant cela est constaté a partir d’acidité titrable acquise et du pH observé

après 6h d’incubation a 42°C les résultats sont représentés dans les Figure

32 et 33. La production d’acide entre les trois souches est peut proche, elle atteint

29°D après 3h d’incubation et entre 40 et 46°D après 6h d’incubation pour les trois

souches Lb1, Lb2 et Lb3 en milieu lait écrémé.

Figure 32 : Cinétique d’évolution de l’acidité Dornic produite par les souches à 30°C

Résultats

80

La fermentation du lait provoque un abaissement de pH qui est proportionnelle

à l’acidité produite .Le pH varie de 6 à 6.5 en milieu lait écrémé. Figure 33.

3- Test de l’antagonisme :

3.1- Recherche des inhibitions :

Les résultats de l’interaction obtenue, révèlent la présence d’halos clairs au tour

des souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 et Lb3 ensemencées en touches.

Ces résultats indiquent l’existence des agents d’inhibitions produites par les

souches de Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3).

Figure 33 : Variation du pH des souches de Lactobacillus, lors du suivie del’acidité titrable

Résultats

81

• Les résultats de l’interaction entre la souche de référence E. coli ATCC 25922 et

Lb1, Lb2, Lb3 sont mentionné dans la Figure 34 et le Tableau 16.

Figure 34 : Résultat de l’interaction entre E. coli ATCC 25922 etLb1, Lb2 et Lb3

• Les résultats de l’interaction entre la souche E. coli (Ec1) et Lb1, Lb2, Lb3 sont

mentionné dans la Figure 35 et le Tableau 16

Figure 35 : Résultat de l’interaction entre E. coli (Ec1) et Lb1, Lb2, Lb3

Résultats

82

• Les résultats de l’interaction entre la souche S. typhi (St1) et Lb1, Lb2, Lb3 sont

mentionné dans la Figure 36 et le Tableau 16

Figure 36: Résultat de l’interaction entre S. typhi (St1) et Lb1, Lb2, Lb3

• Les résultats de l’interaction entre la souche K. oxytoca (Ko1) et Lb1, Lb2, Lb3

sont mentionné dans la Figure 37 et le Tableau 16

Figure 37: Résultat de l’interaction entre K. oxytoca: (Ko1) et Lb1, Lb2, Lb3

Tableau 16 : Résultats d’halos d’inhibition d’antagonisme entre Lb1, Lb2, Lb3 etEc1, St1, Ko1 et E. coli ATCC 25922.

Diamètre d’halosd’inhibition

Souches Lb1 Lb2 Lb3

E. coli (Ec1) 19 23 18

S. typhi (St1) 19 28 31

K.oxytoca (Ko1) 17 22 19

E. coli ATCC25922 24 23 20

En observant ce tableau, on remarque que les souches d’Entérobactéries Ec1,

St1, Ko1 et la souches deréférence ATCC 25922 ont été inhibées par l’activité

d’antagonisme que posséde les souches de

remarque que S. typhi (St1) a été la plus sensible à

d’inhibition de 31mm.

3.2- Recherche des ageant d’inhibition

3.2.1- Le pH :

Les résultats obtenus par la mesure de la densité optique des deux souches de

S. typhi cultivées dans deux tubes qui

ajusté à 7 avec de la soude NAOH

démontré que :

Dans les six premières heures d’incubation à 37°C et en aérobiose on note une

croissance des deux souches de

Dans un des deux tube on ajouté 1ml de HCL après 6h d’incubation. On a

observée une décroissance de

sensible et ne peut pas survivre dans un milieu acide. Par contre dans l’autre tube ou

le pH est ajusté à 7, on a noter une croissance progressive de

Figure 38

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0 2

Dens

itéO

ptiq

ue(D

O)

Figure 38: Croissance deS.typhi



d’antagonisme que posséde les souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 te Lb3, et on

(St1) a été la plus sensible à L. rhamnosus

Recherche des ageant d’inhibition :


cultivées dans deux tubes qui contient le milieu TSB liquide dont le pH est

ajusté à 7 avec de la soude NAOH afin d’éviter l’effet de l’acide lactique on


croissance des deux souches de S. typhi (St1) Tableau 17 (annexe).


observée une décroissance de S. typhi (St1), qui indique que cette bactérie est


le pH est ajusté à 7, on a noter une croissance progressive de S. typhi

2 4 6 8 12 18 20

Temps (H)

+1 ml de HCL

Croissance de S. typhi (St1) en fonction du pH.S.typhi +1 ml of HCl

Résultats

83



Lb1, Lb2 te Lb3, et on

(Lb3) avec un halo


contient le milieu TSB liquide dont le pH est

afin d’éviter l’effet de l’acide lactique on


(annexe).


(St1), qui indique que cette bactérie est


S. typhi (St1).

Résultats

84

3.2.2- Recherche de bactériocines :

Aprés incubation à 37°C pendant 20h. La croissance bactérienne est suivie par

la mesure de la densité optique, les résultats sont indiquées dans le Tableau18

(annexe).

Les résultats sont tradiutente par une courbe qui montre une décroissance de

S.typhi (St1) cultivé dans le milieu TSB qui contient le surnageant de L.rhamnosus

(Lb3), sachan que les bactérie ont été cultivée dans un milieu à pH 7. Ces résultats

s’éxpliquent par la présence de bactériocines produite par la souche probiotique

L.rhamnosus (Lb3).Figure 39

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 12 18 20

dens

itéO

ptiq

ue(O

D)

Temps (H)

+

1 ml de surnageant de Lb3

S.typhi (St1) +1 ml de surnageant de Lb3S.typhi (St1)

Figure 39: Croissance de S. typhi (St1) en présence de bactériocineproduite par Lactobacillus rhamnosus (Lb3)

Discussion

Discussion des résultats

85


1-Isolement et identification des souches d’entérobactéries :

Les informations obtenues à partir des résultats des tests réalisés sur 20 souches

prélevées des selles et des urines des patients présentant séparément des diarrhées

infectieuses, des infections urinaires et de la fièvre typhoïde nous ont permit de les

apparenter aux Entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella typhi et Klebsiella

oxytoca) selon Pilet et al., (1981) ; Pardier et al., (1998).

L’identification préliminaire des souches est basée sur des aspects

morphologiques : macroscopiques et microscopiques.

Macroscopiquement les souches d’E. coli qui poussent sur milieu Héktoen

forment des colonies rondes, saumons, lisses et laiteuses, alors que les souches de S.

typhi sont des colonies fines, vertes au centre noire, tandis que les colonies de K.

oxytoca ont un aspect caractéristique, elles sont volumineuses, bombées, brillantes,

opaques et souvent confluentes, ces résultats sont aussi obtenus par Izard et al.,

(1983) ; Gulian et al., (1994) ; Grimont (1998) ; Joly et Reynaud (2003).

Microscopiquement ce sont des Gram (-) se révèlent en bacilles fins pour E. coli,

en forme de petits bacilles pour S. typhi et enfin de forme coccoides, de groupements

en diplobacilles ou en courtes chainettes correspondant à K.oxytoca. (Le Minor et

Richard , 1993 ; Grimont, 1998 ; Sutra et al., 1998 ; Larpent, 1997 ; Djelouat, 2008).

Les résultats biochimiques viennent confirmer l’appartenance de ces souches au

Entérobactéries, ces tests ont démontré que :

Escherichia coli a pu fermenter l’indole, le mannitol et les sucres du milieu TSI

(glucose, lactose et saccharose) avec production de gaz. Elle contient les enzymes

suivantes : Lysine décarboxylase (LDC), Ornithine décarboxylase (ODC) et β-

galactosidase, par contre elle ne possède pas d’oxydase, d’uréase, Tryptophane


86

désaminase (TDA), Arginine dihydrolase (ADH) et l’acétone, elle est mobile et

n’utilise pas le citrate comme seule source de carbone. (Richard, 1978 ; Pilet et al.,

1981 ; Leclerc et al ., 1995 ; El Ouardi et Chami, 2001 ; Podschum et al., 2001 ;

Joffin, 2002 ; Tortora et al., 2003 ; Gaillot, 2006 ; Djelouat, 2008).

Salmonella typhi représente les mêmes caractères biochimiques que ceux d’E.coli,

sauf qu’elle ne fermente pas l’indole, le saccharose et le lactose, elle produit du

H2S lors de la fermentation du TSI. Elle n’utilise pas le citrate comme seule

source de carbone, elle possède de la Lysine décarboxylase (LDC), mais elle n’a

ni Ornithine décarboxylase (ODC) ni Arginine dihydrolase (ADH), elle n’a pas

aussi l’oxydase, le Tryptophane désaminase (ADH), l’uréase, l’acétone et la β-

galactosidase. (Richard, 1978 ; Pilet et al., 1981 ; Leclerc et al., 1995 ; El Ouardi

et Chami, 2001 ; Podschum et al., 2001 ; Joffin, 2002 ; Tortora et al., 2003 ;

Gaillot, 2006 ; Djelouat, 2008).

Enfin Klebsiella oxytoca a fermenté l’indole, le manitole et les sucres du milieu

TSI avec production de gaz, elle contient les enzymes suivantes : uréase, Lysine

décarboxylase (LDC) et la β- galactosidase, elle produit l’acétone et utilise le

citrate comme source de carbone. Par contre ne possède pas : d’oxydase,

Tryptophane désaminase (TDA), l’Arginine dihydrolase (ADH) et l’Ornithine

décarboxylase. (Richard, 1978 ; Pilet et al., 1981 ; Leclerc et al., 1995 ; El Ouardi

et Chami, 2001 ; Podschum et al., 2001 ; Joffin, 2002 ; Tortora et al.,2003 ;

Gaillot, 2006 ; Djelouat, 2008).

L’implication croissante des Entérobactéries dans les infections hospitalière est un

fait marquant des deux dernières décennies, qui semble associée à l’usage des

antibiotiques, à la multiplication des interventions chez les malades et à l’apparition

des souches multi résistantes (Filand, 1971).


87

Pour cette raison on a étudié la sensibilité de nos souches (Escherichia coli,

Salmonella typhi et Klebsiella oxytoca) aux différents antibiotiques.

Pour la Céfotaxime (CTX) : toutes les souches de E. coli sont sensibles sauf

Ec 10, Ec11 et Ec12 qui sont résistantes, K. oxytoca résiste à cet

antibiotique,les souches de S typhi en sont sensibles.

Pour la Flumequine (UB) : on remarque que Ec2, Ec7, Ec11 et Ec12 sont

résistantes tandis que les souches de K. oxytoca et S .typhi sont toutes

sensibles.

Pour la Colistine (CS) : l’ensemble des ces souches est sensible, exception

faite pour la souche Ec4.

Pour l’Amoxycilline Clavulanic Acid (AMC) : l’ensemble de ces souches est

sensible à l’exception d’Ec10 et Ec12 qui ont une sensibilité intermédiaire et

Ko2 qui est résistante.

Pour la Gentamicine (GM) : les souches d’E. coli (sauf Ec10, Ec11 et Ec12)

présentent une sensibilité à cet antibiotique ainsi que les k. oxytoca et S. typhi.

Pour la Trimethoprime Sulfamethoxazole (SXT), on remarque que la majorité

des E. coli sont résistantes ; exception faite pour Ec3 ; Ec5 ; Ec8 et Ec10; de

même que pour les Klebsielles qui sont résistantes, sauf pour Ko1et Ko4.

Enfin pour les S.typhi sont toutes sensibles.

Pour l’Ampicilline (AMP) : les E. coli présentent une résistance à cet

antibiotique. Ec3 ; Ec4 ; Ec5 ; Ec8 et Ec9 ne suivent pas cette règle. Alors que

les Klebsielles sont résistantes et les Salmonelles sont sensibles

Pour la Tétracycline (TE) : l’ensemble de ces souches est sensible à cet

antibiotique, exception faite pour Ec8, Ko4 qui sont résistantes.

Pour l’Enrofloxacine (ENR) : Toutes les souches d’E. coli sont sensibles sauf

Ec5 et Ec11qui sont résistantes. Ko1 résiste à cet antibiotique, les souches de

S.typhi en sont sensibles.


88

Pour le Chloranphénicole (C) : Toutes les souches sont sensibles sauf pour

Ec3 qui est résistante.

Pour le Sulfamethoxazole (SS) : Les E. coli présentent une résistance à cet

antibiotique sauf pour Ec3, Ec5, Ec8, Ec9 et Ec10 qui sont sensibles. Ko2 et

Ko3 sont résistantes et les Salmonelles sont sensibles.

Pour la Trimethoprime (TMP) : On remarque que la majorité des E. coli sont

résistantes, exception faite pour Ec3, Ec5, Ec8, Ec9 et Ec10 de même que pour

les Klebsielles qui sont résistantes sauf pour Ko1 et Ko4.Enfin pour les

Salmonelles, elles sont toutes sensibles.

La résistance des Entérobactéries aux antibiotiques citée au dessus est signalée

par plusieurs auteurs (Marshall et al., 1991 ; Nijsten et al., 1996 ; Manges et al.,

2001 ; Guenot et al., 2002 ; Zouatni, 2006 ; May, 2007).

Dans cette étude, on a complété par une lecture interprétative c'est-à-dire en

comparant les diamètres des souches étudiées avec celui de la souche de référence

E.coli ATCC 25922 pour la validité du procédé (Denteil, 1996).

2- Identification des souches de Lactobacillus :

D’après l’observation macroscopique faite sur les souches de Lactobacillus

(Lb1, Lb2 et Lb3) développée sur milieu MRS solide (De Man et al., 1960),on a

remarqué que les colonies sont de couleurs blanches, petites, bien isolées, et

l’observation sous microscope après coloration de Gram, indique qu’il s’agit de

bacilles bien apparents Gram (+). (Gancel et al., 1997 ; Felten et al., 1998 ; Carmen-

Collado et Hernandez, 2007 ; Tabasco et al., 2007).

Le test de la catalase et l’oxydase sur les souches Lb1, Lb2 et Lb3 se révèle

négatif. (Collins et al., 1987).


89

Les souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 et Lb3 fermentent le glucose sans

production du CO2, et donc nos souches sont homofermentaire. (Larpent, 1996).

La différenciation des espèces de Lactobacillus repose sur la fermentation des

sucres, les souches Lb1, Lb2 fermentent l’arabinose, sorbitol, mannitol et la souche

Lb3 fermente l’arabinose et l’égermant le sorbitol, le mannitol et l’amidon. (De

Bruyn et al., 1988 ; Tan et al., 1994 ; Sutra et al., 1998 ; Fasoli et al., 2003 ;

Syndifrais, 2005).

Les Lactobacilles supportent un pH inferieur à 5, elles préfèrent les milieux

neutres ou légèrement acides. (Pilet et al., 1981 ; Rommonond et al., 1992).

La température optimale de développement varie suivant les espèces et fait

partie des critères de classification, les souches Lb1, Lb2 et Lb3 ont montré une

croissance à la température 30°C. (Fasoli et al., 2003).

La composition du lait utilisé influence sur la croissance et aux taux d’acidité

produite par les Lactobacillus. (Hadadji et Bensoltane 2006).

La fermentation du lait par les Lactobacillus conduit à la production d’une

acidité titrable qui détermine les propriétés technologiques de ces bactéries. En

revanche la production de l’acidité dépend de plusieurs paramètres tels que la

température d’incubation, l’état physiologique des bactéries, la concentration de

l’inoculum et le lait utilisé. (Chekroun et al., 2006 ; Chekroun et Bensoltane, 2007).

La production d’acide entre les trois souches est peut proche, elle atteint 29°D

après 3h d’incubation et entre 40 et 46°D après 6h d’incubation pour les trois souches

Lb1, Lb2 et Lb3 en milieu lait écrémé.

La résistance des Lactobacillus à l’acidité est importante pour avoir de bon

effet thérapeutique et pour garder sa viabilité dans les produits fermentés. (Takiguchi

et al., 2000).


90

L’étude de la sensibilité aux anti biotiques c’est un critère important pour

sélectionner les probiotiques (Zhou et al., 2005). La résistance reste une condition

controversé, d’un côté elle est recherché chez les probiotiques pour qu’ils soient actif

même après un traitement aux antibiotiques et d’un autre côté elle est redouté qu’elle

soit transmise au d’autre bactéries indésirable dans l’intestin pourrait mener au

développement de nouveaux microbes pathogènes résistant aux antibiotiques

(Salminen et al., 1998; Saarela et al., 2000).

Toutes les souches de Lactobacillus Lb1, Lb2 et Lb3 ont montrées des

résistances à l’acide nalidixique, streptolmycine et gentamicine. Ces résultats sont

conformes aux résultats précédemment rapportés pour la même espèce. (Charteris et

al., 1998 ; Coppola et al., 2005 ; Zhou et al., 2005). Les Lactobacillus sont aussi

résistante à l’oxacillin, cefoxitin, neomycine, sulphamethoxazole et la trimethoprime.

(Charteris et al., 1998 ; Danielsen et Wind, 2003 ; Delgado et al., 2005 ; Florez et al.,

2005). Cette résistance été observé chez les souches étudies (Lb1, Lb2 et Lb3).

La résistance des Lactobacillus aux antibiotiques cités au dessus est signalée

par plusieurs auteurs. (Charteris et al., 1998 ; Klein et al., 2000 ; Katla et al., 2001 ;

Delisle et Perl, 2003 ; Moubareck et al., 2005 ; Masco et al., 2006 ; Ammor et al.,

2007).

Par contre comme toutes les espèces de Lactobacillus les souches Lb1, Lb2 et

Lb3 sont sensible à la pénicilline, chloramphénicol, érythromycine et la tétracycline.

Ces résultats sont aussi obtenus par Danielsen et Wind, (2003) Coppola et al., (2005).

3- Interaction bactériennes :

Les résultats obtenus de l’antagonisme révèlent l’inhibition des Entérobactéries

(E. coli, E. coli ATCC 25922, S. typhi et K. oxytoca) par les souches de Lactobacillus

(L. lactis, L. helveticus et L. rhamnosus). Cette interaction positive indique

l’inhibition de la croissance des Entérobactéries, et montre une activité


91

d’antagonisme élevée, qui est traduite par l’apparition des halos d’inhibition dans les

souches isolées E. coli, S. typhi et K. oxytoca (Tabak et al., 2007).

Des études effectuées par Bernet et al., (1993) ont démontré que des souches

de bactéries lactiques adhérant fortement aux cellules intestinales Caco-2 inhibent

l’adhésion de micro-organismes pathogènes comme E. coli et Salmonella typhi à ces

mêmes cellules lorsque elles sont placées en compétition. Parmi les souches ayant fait

l’objet d’études préalables sur Caco-2, L. rhamnosus GG, L. casei, L. helveticus

.Elles adhèrent fortement au tissu provenant du côlon, une inhibition complète d’E.

coli est remarqué par l’ajout préalable de ces souches. (Coconnier et al., 1993; Bernet

et al., 1994 ; Mack et al. 1999).

Ces auteurs ont proposé, que l’adhésion préalable des probiotiques aux cellules

intestinales contribuerait à limiter l’accès des pathogènes aux entérocytes en plus

d’augmenter la sécrétion du mucus qui pourrait lui aussi empêcher l’adhésion des

pathogènes aux cellules intestinales.

Ces souches probiotiques étaient capables d’exclure et d’entrer en compétition

avec les pathogènes de façon significative sur le mucus (Lee et al., 2003). Le degré

de compétition était dépendant de chaque souche et probablement déterminé par

l’affinité respective des adhésines présentes sur la surface des bactéries aux

glycoprotéines du mucus (Lee et al., 2003).

La compétition sur le mucus peut se produire même durant des épisodes de

diarrhée. En effet, Karch et al., (2005) ont observé que l’adhésion des souches

probiotiques B. lactis, L. rhamnosus, L. casei Shirota, L. paracasei , L. acidophilus

aux mucus intestinaux isolés d’enfants en santé et d’enfants ayant une diarrhée à E.

coli était similaire. Ainsi selon ces auteurs les probiotiques pourraient agir même

après que l’infection soit déclenchée. (Guandalini et al., 2000).


92

Dans notre étude on a remarqué que la croissance d’E. coli est inhibée par

L.lactis (Lb1) avec un diamètre d’inhibition de 19mm et de 23mm par L.helveticus

(Lb2) et enfin de 18mm par L. rhamnosus (Lb3).

Pour la souche de référence E. coli ATCC 25922 sa croissance est inhibée par

L.lactis (Lb1) avec un diamètre d’inhibition de 24mm et de 23mm par L.helveticus

(Lb2) et enfin de 20mm par L. rhamnosus (Lb3).

On a constaté que L. lactis (Lb1) inhibe la croissance de S. typhi , ceci avec un

diamètre de 19mm et de 28mm par L. helveticus (Lb2) et de 31mm pour L.rhamnosus

(Lb3).

Enfin la croissance de K. oxytoca est inhibée par L.lactis (Lb1) avec un

diamètre d’inhibition de 17mm et de 22mm par L.helveticus (Lb2) et de 19mm par L.

rhamnosus (Lb3).

Des résultats similaire ont été trouvées par, Alm, (1983) ; Dupont, (1997) ;

Hilton et al., (1997) ; Reid et al., (2003) ; Annuk et al., (2003) ; Michalkiewicz et al.,

(2003) ; Monack et al., (2004) ; Labioui et al., (2005) ; Songisepp et al., (2005) ;

Hutt et al., (2006).

Le mécanisme d’action des probiotiques concerne l’inhibition de la croissance

des bactéries pathogènes grâce à des composés antimicrobiens (Cotter et al., 2005).

Le résultat du test de l’antagonisme nous a permis la recherche des agents

inhibiteurs chez le genre Lactobacillus (Servin, 2003), telles que les acides

organiques, qui sont actives in vitro et in vivo contre les micro-organismes

pathogènes impliqués dans les cas de diarrhées (Servin, 2004).

L’acide lactique et acétique sont produits pendant la fermentation des hexoses

par les lactobacilles et bifidobactéries. Ces acides organiques peuvent diffuser

passivement à travers la membrane bactérienne sous leur forme non dissociée, ils


93

acidifient le cytoplasme après dissociation et inhibent l’activité enzymatique

cellulaire des pathogènes acidosensibles (Deng et al., 1999). Cette diminution du pH

peut donc affecter la viabilité des pathogènes bactériens (Bruno et Shah, 2002;

Servin, 2004).

Comme la présence d’anneau d’inhibition ne signifie pas forcement production

de bactériocine, (Kleanhammer, 1993) des tests supplémentaires sont nécessaires

pour connaitre la nature exacte de l’agent inhibiteur.

Les résultats de ces tests nous ont permis de constater la présence des

bactériocines produite par les souches de Lactobacillus (Aymerich et al., 2000 ;

Fooks et Gibson, 2002) qui ont provoquées une nette diminution de la densité optique

après leurs adjonctions directes dans le milieu de culture.

Ces substances ont été caractérisées par plusieurs chercheurs comme étant des

composés protéiques ayant une activité inhibitrice contre un large spectre de souches

bactériennes (Klaenhammer, 1993 ; Bogovic-Matijasic et al., 1998 ; Cleveland et al.,

2001 ; Chen and Hoover, 2003 ; Cotter et al., 2005 ). Elles agissent principalement

sur la membrane externe des bactéries cibles en formant des pores qui mènent à la

libération du contenu intracellulaire et à la mort de la bactérie affectée

(Klaenhammer, 1993). Laissant suggérer que les substances protéiques

antibactériennes ne sont pas uniquement responsable de l’inhibition et qu’elles

agissent de concert avec l’acide produit. Selon Servin et al. (2004) ceci s’expliquerait

par une diminution du pH qui provoque une perméabilisassions de la membrane

externe des bactéries Gram-négatif facilitant ainsi la pénétration d’autres substances

antimicrobiennes telles que les bactériocines.

Conclusionet Perspectives

Conclusion et Perspectives

94

Conclusion

Les infections entériques constituent actuellement un des problèmes majeurs

dans le domaine de la santé au niveau mondial. Le manque de vaccins effectifs et

l’émergence de micro-organismes résistants aux antibiotiques ont stimulé la

recherche de méthodes alternatives pour contrôler ces infections. Des études cliniques

récentes ont fourni des évidences que la consommation de certaines souches

probiotiques peut être efficace dans la prévention en diminuant l’incidence des

diarrhées et/ou dans le traitement en affectant la durée et la sévérité des diarrhées lors

d’infections entériques.

Dans notre étude on a isolées des Entérobactéries (Escherichia coli, Salmonella

typhiet et Klebsiella oxytoca) à partir des selles et des urines des patients présentant

séparément des diarrhées infectieuses, des infections urinaires et de la fièvre

typhoïde , leurs culture sur milieu spécifique Héktoen permet à l’étude

bactériologique proprement dite de s’orienter vers ces bactéries, leurs taille, formes

,contour , odeurs et aspects sont spécifiques et donc permettent de les différencier des

autres groupes de bactéries., leurs mobilités, leurs pouvoir fermentatif des sucres

(glucose, saccharose et lactose) et leurs équipement enzymatiques (ODC, ADH,

LDC, tryptophane désaminase, uréase……) sont les éléments de l’étude biochimique

qui apportent plus de confirmation quand à leur identification. Pour mettre en relief

l’importance de l’antagonisme des bactéries lactiques probiotiques, il était utile de

vérifier la réaction des Entérobactéries à un certaines nombres d’antibiotiques.

Pour les souches de Lactobacillus on a vérifié leur pureté on passant par

l’étude macroscopique et microscopique et des tests tel que : la catalase, oxydase,

production de Co2, profil fermentaire, et en fin l’étude de la sensibilité aux

antibiotiques qui est un critère important pour sélectionner les probiotiques et elle est

recherché chez ces souches pour qu’elles soient actif même après un traitement aux

antibiotiques.

Conclusion et Perspectives

95

Le test de l’antagonisme a montré l’effet inhibiteur de nos souches de

Lactobacillus (Lb1, Lb2 et Lb3) vis-à-vis des Entérobactéries (E. coli, S. typhi, K.

oxytoca et E. coli ATCC 25922) cette interaction positif est traduite par l’apparition

des halos d’inhibition dans le cas des souches d’Entérobactéries isolées.

La recherche des agents d’inhibition révèlent la présence de deux facteurs le

premier est les acides organiques libérées par les souches de Lactobacillus qui

diminue le pH. Le second facteur est l’existence des bactériocines qui ont un effet

d’antagonisme sur la croissance des Entérobactéries.

Ce qui fait aujourd’hui que les Lactobacillus nous poussent à réaliser de

nombreuses études sur le plan taxonomique, écologique et sur le plan médical.

Perspective

Ce travail aura donc permis d’améliorer nos connaissances sur le rôle des

probiotiques dans la prévention des infections entériques.Cela nous a permis de

conclure avec ces perspectives :

1- Production d’un lait fermenté à base de Lactobacillus.

2- Application du génie génétique pour la sélection des souches améliorées afin

de produire des cultures probiotiques thérapeutique.

3- L’identification des bactériocines produite par les Lactobacillus.

4- Approfondir le mécanisme d’action de ces souches.

5- Évaluer l’impact de l’ajout de Lactobacillus transitoires sur le microbiote

intestinal résident.

RéférencesBibliographique s

Références Bibliographiques

96

Abeet A., Knock L. and Hill C. (1995). Bactériocines: modes of action and potentialin food preservation and control of food poisioning. Int. J. food microbial, 28:169-185.

Achemchem F., Abrini J., Martinnez –Bueno M. Valdivia E. and Maqueda,M.(2004). Purification et caractérisation d’une bactériocine anti Listeriaproduite par Enterococcus faecium F-420 isolé a partir de lait cru de Chèvre,Biotechnologies .384-388.

Aktypis A., klantzpoulos G., HuisIn’tVeld J.H.J.,Ten Brunk B.(1998).Purification of “thermophilin T” a novel bacteriocin by Streptococcusthermophilus ACA-DC0040. Jo. Appl. Mic, 84:568-576.

Aktypsis A. and Kalantzopoulos G. (2003). Purification and characterisation of“Thermophilin ST-1”, a novel bacteriocin produced by Streptococcusthermophilus ACA-DC001. Le Lait, (83):365-378.

Alm L. (1983).The effect of Lactobacillus acidophilus administration upon thesurvival of Salmonella in randomly selected human carriers – Prog. Food Nutr.Sci 7, 13-17.

Alvarez-Olmos M.I. and Oberhelman R.A. (2001). Probiotic agents and infectiousdiseases: a modern perspective on a traditional therapy. Clin Infect Dis. 32:1567-1576.

Ammor M.S., Florez A. B. and Baltasar M. (2007).Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and bifidobacteria. Journal of FoodMicrobiology24:559–570.

Annuk H., Shchepetova J., Kullisaar T., Songisepp E., Zilmer M. and MikelsaarM. (2003). Characterization of intestinal Lactobacilli as putative probioticscandidates. J.Appl. Microbiol 94,403-412.

ArmmuzziA.Cremonini,F.,Bartolozzi,F.,Candelli,M.,Ojetti,V.,Cammarota,G.,Anti,M., De Lorenzo ,A .,Pola,P.,Gasbarrini,G.,Gasbarrini,G.and Gasbarrini,A.(2001). The effect of Oral administration of Lactobacillus GG on Antibiotic-associated gastrointestinal side effects during Helicobacter pylori eradicationtherapy. Alimetary. Pharmacology and Therapy, 15:163-169.

Aslim B., Yucel N. and Beyatli Y. (2004). Effect of a bacteriocin-like substance(B.L.S) produced by Streptococcus thermophilus strains on Listeria spp.Strains.Journal of Food. Processing.Preservation. 28, 241-250.

Aslim B., Vuksekdaga Z.N., Sarikayub E. and Beyatli Y. (2005). Determinationof the bacteriocin like substance produced by some lactic acid bacteria isolatedfrom Turkish dairy products. LWT, 38:691-694.

Asperger H. (1985). Produits laitiers fermentées : exemples d’interaction de micro-organismes : Osterreichiche Milchwirtschaft. 19 : 15-31

Aymerich T., Garriga M., Monfort J.M., Nes I.F. and Hugas M.(2000).Bacteriocin-producing lactobacilli in Spanish-style fermented sausages:characterization of bacteriocins. Food Microbiology 17, 33–45


97

Ballongue J.( 1998). Bifidobacteria and probiotic action. Chapter 17. In: Lactic acidbacteria. Salminen S, von Wright A (Eds), Marcel Dekker, New York, pp.519-587.

Barnich N, Darfeuille-Michaud A (2007). Adherent invasive Escherichia coli andCrohn's disease. Curr Opin Gastroenterol 23: 16-20

Benkerroum N., Daoudi A. and kamel M. (2003). Behaviour of Listeriamonocytogenes in raw sausages (marguez) in presence of a bacteriocinproducing Lactococcal strains as a protective culture, Meat Science, 63: 479-484.

Benkerroum N., Ghaouti Y., Sandine W.E.and Tantaoui-Elaraki A.(1993).Méthodes to demonstrate the bactericide activity ofbacteriocines.Lett.App.Microbiol.17, (2):78-81.

Benkerroum N., Oubel H., Zahar M., Dlia S.and Fellali Maltouf A.(2000).Isolation of bacteriocin producing Lactococcus lactis sub sp lactis andapplication to control Listeria monocytogenes in Moroccan J’ben.Journal.ofAppli. Microbiology, 89:960-968.

Bergeron M. and Dufour J.C. (2004) Protagonistes de l’immunité innée dans lesinfections à salmonelles.Médecine Sciences, 23 : 112-118.

Bernet MF., Brassart D., Neeser JR. and Servin AL.( 1994). Lactobacillusacidophilus LA1 binds to cultured human intestinal cells and inhibits cellattachment and cell invasion by enterovirulent bacteria. Gut. 35: 483-489.

Bjorksten B. (2004). Effects of intestinal microflora and the environment on thedevelopment of asthma and allergy. Springer Seminras in mmunopathology,25 : 257-270.

Bogovic-Matijasic B., Rogelj I., Nes I.F. and Holo H. (1998). Bacteriocin complexof Lactobacillus acidophilus LF221-production studies in MRS media atdifferent pH values and effect against Lactobacillus helveticus ATCC15009.Process Biochemistry 33, 345–352.

Borriello S.P., Hammes W.P., Holzapfel W., Marteau P., Schrezenmeir J., VaaraM. and Valtonen V. (2003). Safety of probiotics that contain lactobacilli orbifidobacteria. Clin Infect Dis. 36: 775-780.

Bruno FA. and Shah NP. (2002). Inhibition of pathogenic and putrefactivemicroorganisms by lactic acid bacteria. Milchwissenschaft. 57: 617-621.

Cabo M.L., Murado M.A., Gonza´lez M.P. and Pastoriza L. (1999). A methodfor bacteriocins quantification. Journal of Applied Microbiology, 87: 907–914.

CanducciF.,AmuzziA.,Cremonii,F.,Cammarota,G.,Bartolozzi,F.,Pola,P.,Gasbirrini,G.and Gasbarrini , A.,(2000). A lyophilized and inactived culture ofLactobacillus acidophilus increases Helicobacter pylorieradication rates.Alimentary Pharmacology and Therapeutic, 14: 1625-1629.

Carmen-Collado M. and Hernandez M. (2007). Identification and differentiationof Lactobacillus,Streptococcus and Bifidobacterium species in fermented milkproducts with bifidobacteria.Microbiol. Res., 162: 86-92


98

Champomier M., Contel M. and Grumont J.L. (1989). Genomic identification ofmeat lactobacilli as lactobacillus sake Ann. Inst Pasteur, Microbiologie,138:751-758.

Charteris W.P., Kelly P.M., Morelli L. and Collins J.K. (1998).Development andapplication of an in vitro methodology to determine the transit tolerance ofpotentially probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium species in the upperhuman gastrointestinal tract. Journ Appl Microbiol 84, 759–768.

Chekroun A. and Bensoltane A. (2007) . Nutritional characterization of fermentedcow’s milk at 45°C by Lactobacillus acidophilus and bifidobacteria. Egypt. J.App. Sci. 22: (12A), 188-202.

Chekroun A., Bensoltane A. , Kheroua O. and Saidi D. (2006) .Biotechnological characteristics of fermented milk by bacterial associations ofthe strains Streptococcus, Lactobacillus and Bifidobacterium . Egypt. J. App.Sci. 21: (2b), 583-598.

Chen H. and Hoover D.G. (2003). Bacteriocins and their foodapplications.Comprehensive Review in Food Science and Food Safety 2, 82–100

Chouraqui J.P., Van Egroo L.D, Fichot M.C. (2004). Acidified milk formulasupplemented with Bifidobacterium lactis: impact on infant diarrhea inresidential care setting. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 3: 288-292.

Cibik R., Marcille F., Corthier G. and Doré J. (2004). Bacterial intestinal flora:development, characteristics and influence of the type of feeding. ArchPediatrie. 11: 573-575.

Cleveland J., Montville T.J., Nes I.F., Chikindas M.L. (2001). Bacteriocins: safe,natural antimicrobials for food preservation. International Journal of FoodMicrobiology 71, 1–20.

Coconnier M.H., Lievin V., Hemerey E. and Servin A. (1998). Antagonisticactivity against Helicobacter infection in vitro and in vivo by the humanLactobacillus acidophilus strain LB. Applied and EnvironmentalMicrobiology,64:4573-4580.

Coconnier MH., Bernet MF., Kerneis S., Chauviere G., Fourniat J. and ServinAL. (1993). Inhibition of adhesion of enteroinvasive pathogens to humanintestinal Caco-2 cells by Lactobacillus acidophilus strain LB decreasesbacterial invasion. FEMS Microbiol Lett. 110: 299-305.

Collado M.C. and Herna’ndez, M. (2005). Identification and differentiation ofLactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium species in fermented milkproducts with. Bifidobacteria. Microbiology Research, 162:82-92.

Colliins M.D., Ferusu S. and Jones D. (1987). Classification of Lactobacillusdivergens, and some catalase negative.Int . J. Syst. Bacteriol.37, 310-1-316.

Collins EB., Hall BJ. (1984). Growth of bifidobacteria milk and preparation ofBifidobacterium infantis for a dietary adjunct. Journal of Dairy Sciences67(7):1376–80.


99

Conway P.L. (1995). Microbial ecology of the human large intestine. In: Humancolonic bacteria: Role in nutrition, physiology and pathology, Gibson GR andMacfarlane GT (Eds) CRC Press, Boca Raton, pp.1-18.

Coppola R., Succi M., Tremonte P., Reale A., Salzano G. and Sorrentino E.(2005). Antibiotic susceptibility of Lactobacillus rhamnosus strains isolatedfrom Parmigiano Reggiano cheese. Lait 85, 193–204.

Corthesy B., Rex Gaskins H., Mercenier A.( 2007). Cross-talk between probioticbacteria and the host immune system. J Nutr. 137: 781S-790S.

Cotter P.D., Hill C., Ross R.P.( 2005). Bacteriocins: developing innate immunityfor food. Nature Reviews Microbiology 3, 777–788.

Couture B., (1990). Bactériologie médicale : étude et méthode des bactéries aérobieset facultatives d’intérêt médicale, Edition DECARIE - VIGOT

Daba H., Lacroix C., Huang J. and Simard R.E. (1994). Influence of growthconditions on production and activity of mesentericin 5 by a strain ofLeuconostoc meseteroides .Appl MicrobBiotech. 39,136-173.

Danielsen M. and Wind A. (2003). Susceptibility of Lactobacillus spp.toantimicrobial agents. Int. J. Food Microbiol. 82, 1–11.

De Bruyn I., Holzapfel W.H., Visser L. and Louw A.I. (1988). Glucosemetabolism by Lactobacillus. J. Gen. Microbiol.134, 2103-2109.

De Man J.C., Rogosa M. and Sharpe M.E. (1960). A medium foe cultivation ofLactobacilli. J. App. Bacteriol. 23: 130-138.

De Roissard H.B. and Luquet, (1994). F.M. Bactéries lactiques. Aspectsfondamentaux et technologiques. Uriage:lorica, 1994 ; 605 P et 614P.

De Vrese M. and Marteau P.R. (2007). Probiotics and prebiotics: Effects ondiarrhea. J Nutr. 137:803S-811S.

Delgado, S., Florez, A.B., Mayo, B. (2005). Antibiotic susceptibility ofLactobacillus and Bifidobacterium species from the human gastrointestinal tract.Curr. Microbiol. 50, 202–207.

DeLisle S. and Perl T.M. (2003). Vancomycin-resistant enterococci: a road map onhow to prevent the emergence and transmission of antimicrobial resistance.Chest 123, 504S–518S.

Dellaglio G., De Roissart H., Torriani S., Curk M.C. and Janssens(1994).Bactéries lactiques. Ed. Lorica (chemin de saint george). France. P: 58-96.

Deng Y., Ryu JH. and Beuchat LR. (1999). Tolerance of acid adapted and nonadapted Escherichia coli O157:H7 cells to reduced pH as affected by type ofacidulant. J Appl Microbiol. 88: 203-210.

Denteil H. (1996). Interprétation de l’antibiogramme. Inst. De bactério-Labo deMéd- Hopitaux universitaire de Strasbourg.


100

Djelouat S. (2008). Les Entérobactéries : généralité. Laboratoire d’analyse médicalebactériologique. Version 6. 32-43.

Ducluzeau R. (2006). Des bactéries génotoxique dans le tube digestif .INRA Prod.lavie .33 :12-16.

Dunne C., O’Mahony L., Murphy L., Thornton G., Morrissey D., O’Halloran S.,Feeney M., Flynn S., Fitzgerald G et al. (2001). In vitro selection criteria forprobiotic bacteria of human origin: correlation with in vivo findings. Am J ClinNutr. 73: 386S-392S.

Dupont H.L. (1997). Lactobacillus in prevention of traveler's diarrhea: anencouraging first step. J Travel Med 1, 1-2.

DuPont H.L.,( 2005). What’s new in enteric infectious diseases at home and abroad.Curr Opin Infect Dis. 18: 407-412.

EcL, (2004). Le laboratoire d’Escherichia coli. Université de Montréal. Available at:http://www.ecl-lab.com/fr/ecoli/index.asp

El Ouardi A. and Chami A. (2001). Interest and limits of the biochemicalidentification system in the diagnosis of Enterobacteria. Rabat, Morocco,Institut de Formation aux Carrieres de Sante p. 6, 26, 17.

Euzéby J.P. (2007). List of prokaryotic names with standing in nomenclatures,list ofgenera included in families. Update: September 04, 2007

Falagas M. E., Rafailidis P. and Markis G .(2008). Bacterial interference for theprevention and treatment of infection, International Journal of AntimicrobialAgents. In press;

FAO/WHO. (2002). Joint Working Group Report on Guidelines for the Evaluationof Probiotics in Food, London, Ontario, Canada, April 30 and May 1. Availableat:http:www.who.int/foodsafety/publications/fs_management/probiotics2/en/index.html

Fasano A. (2001). Bacterial infections: small intestine and colon. Curr OpinGastroenterol. 17: 4-9.

Fasoli S., Marzotto M., Rizzotti L., Rossi F., Dellaglio F.and Torriani S. (2003).Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis. International. Journal of. Food. Microbiology, 82: 59–70.

Felten A. (1998). Identification and technological properties of lactic acid bacteria. FoodMicrobiol. 55: 203-210.

Filand M. (1971).Change in susceptibility of selected pathogenic bacteria to widelyused antibiotics. Ann .N.Y. Acad. Sci. 128:5-20.

Fleming T.P., Nahilik M.S. and Mcintosh M.A. (1983). Régulation of enterobactimiron transport in Escherichia coli: characterization of ent: (Aplac) open fusion .J. bacterial. 156:1171-1174.

Fleming, H.P., Erchells, J.L. and Caslilow, R.N. (1975). Microbial inhibition ofisolate Pediococcus from cucumber bune. Appl. Environ Microbiol, 30:1040-1042.


101

Florez A.B., Delgado S. and Mayo B. (2005). Antimicrobial susceptibility of lacticacid bacteria isolated from a cheese environment. Can. J. Microbiol. 51, 51–58.

Fooks L.J and Gibson G.R. ( 2002). Probiotics as modulators of the gut flora. Br JNutr. 88: S39-S49.

Fredrickson A.G. (1977). Behavior of mixed cultures of microorganisms . Ann .Rev.Microbiol (31), 63-87.

Fuller R. (1989). Probiotics in man and animals. J Appl Bacteriol. 66: 365-378.Gadewar S., and Fasano A. (2005). Current concepts in the evaluation, diagnosis

andmanagement of acute infectious diarrhea. Curr Opin Pharmacol. 5: 559-565.

Gagnon. M. (2007). In vitro inhibition of Escherichia coli O157:H7 bybifidobacterial strains of human origin. International Journal of FoodMicrobiology 92: 69-78

Gaillot O. (2008). Identification des Entérobactéries : a review.J. Appl. Microbiol.99:223-229.

Gancel F., Dzierszinski F. and Taillez R. (1997). Identification et caractérisationd'espèces de Lactobacillus isolés de filets de hareng (Clupea harengus) fuméset salés, emballés sous vide Journal of Applied Microbiology. N° 82, p. 722-728.

Garvie E.I. (1984). Separation of species of the genus Leuconostoc anddifferentation of the leuconostocs from other lactic acid bacteria. In: Methodesin Microbiology volume 16. Academic press London: 147-178.

Garvie E.I. (1984). Separation of species of the genus Leuconostoc anddifferentation of the leuconostocs from other lactic acid bacteria. In: Methodesin Microbiology volume 16. Academic press London: 147-178.

Gibson G.R. and Beaumont A. (1996). An overview of human colonic bacteriologyin health and disease. In: Gut flora and health- Past, present and future. LeedsAR and Rowland IR (Eds), The Royal Society of Medicine Press, London, pp.3-11.

Gill H.S., (2003). Probiotics to enhance anti-infective defences in the gastrointestinaltract. Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17: 755-773.

Gilliland S.E. (1985). Concentrated starter cultures. In: bacterial starter cultures forfoods, Ed. S.E. Gilliland., CRC Press Inc., Boca Raton, P: 57-72.

Gledel J. (1988). Les salmonelles. In : microbiologie alimentaire. Vol. 1.Ed : Lavoisier, Paris, pp : 51-53.

Grade S., Gaya P., Medina M. and Nunez M. (1997). Acceleration of flavourformation in cheese by a bacteriocin producing adjunct lactic culture.Biotechnology. Letteres, 19: 101-1014.

Grade S., Tomillo J., Gaya P., Medina M. and Nunez M. (2004).Proteolysis inHispanico cheese manufactured using a mesophilic starters, a thermophilicadjunct culture and bacteriocin -producing Lactococcus lactis sub sp lactisANIA 415 adjunct culture. Journal of Agricultural and food chemistry. 50,


102

3479-3485.Grath V. A., Overman S. B. and Overman T. L. (1977).Média- dependent

oxidase reaction in astrain of Escherichia coli .J.Clin Microbiol, 5,112-113

Gratia A. (1946).Techniques selectives pour la recherche systématique des germesantibiotiques S R SCI. SOc.Bio.Paris.140, 1053-1055.

Grimont PAD. (1997). Systématique et identification .In: Traité de MicrobiologieClinique. Ed: Eyquem A., Alouf J., Montagnier L. Piccin, Padova. Ch. 37, p339-356.

Guandalini S., Pensabene L., Zikri MA., Dias JA., Casali LG., Hoekstra H.,Kolacek S., Massar K., Micetic-Turk D., Papadopoulou A., De Sousa JS.,Sandhu B., Szajewska H. and Weizman Z. (2000). Lactobacillus GGadministred in oral rehydration solution to children with acute diarrhea: amulticenter European trial. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 30: 54-60.

Guarner F. (2006). Enteric flora in health and disease. Digestion 73: S5-S12.Guechi, Z. (2002). Microbiologie des viandes et des produits carnés.Cours

nationales d’hygiène et de microbiologie des aliments. Institut Pasteurd’Algérie. 38:140-145

Gueimonde M.,and Salminen S. (2006). New methods for selecting and evaluatingprobiotics. Dig Liver Dis. 38: S242-S247.

Guenot M., Fouratui V., Loiseau B. and Vial C. (2002). Problemes posés parl’utilisation des antibiotiques en élevage pour la santé humaine .InstitutNational d’Agronomie – Paris. 213 (15) :1154-1161.

Guillaume P.R. (2004). Microbiologie pierre_Yves. guillaume@ laposte.net.Guiraud J.P. (1998). Microbiologie alimentaire. Ed : Dunod, Paris, pp : 88-89.Gulian C., Bollet C. and De Micco P. (1994). Contrôle bactériologique de l'eau à

l'hôpital. In : Manuel de bactériologie clinique. Paris, Elsevier : 621-41.

Hadaji M. and Bensoltane A (2006). Growth and lactic acid production byBifidobacterium longum and Lactobacillus acidophilus in goat’s milk.AJB Vol.5/(6), 505-509.

Hao W. L and Lee Y. K. (2004). Microflora of the gastrointestinal tract: a review.Methods in Molecular Biology, 268 : 491-502.

Havenaar R, and Huis in’t Veld J.H.J.( 1992). Selection of strains for probioticuse. In: Fuller R (Ed). Probiotics, the scientific basis. Chapman & Hall, pp.209-224.

Heyman M. and Menard S. (2002). Probiotic microorganisms: how they affectintestinal pathophysiology. Cell Mol Life Sci. 59: 1151-1165.

Hilton E. Kolakowski P., Singer C. and Smith M. (1997). Efficacy ofLactobacillus GG as a diarrheal preventive in travelers. J Travel Med 1, 41-43.

Holzapfel W.H., Haberer P., Geisen R., Björkroth J.and Schillinger U. (2001).Taxonomy and important features of probiotic microorganisms in food andnutrition. Am J Clin Nutr.73: 365S-373S.

Holzapfel W.H., Haberer P., Snel J., Schillinger U.and Huis in’t Veld J.H.J.


103

(1998). Overview of gut flora and probiotics. Int J Food Microbiol. 41: 85-101.Hooper L. V and Gordon J. I. (2001). Commensal host- bacterial relationships in

the Gut. Science, 292 : 1115-1118.Hopkins M.J., Sharp R. and Macfarlane G.T.( 2002). Variation in human

intestinal microbiota withage. Dig Liver Dis. 34: S12-S18.Hutt P., Shchepetova J., Loivukene K., Kullisaar T. and Mikelsaa M. (2006).

Antagonistic activity of probiotic Lactobacilli and Bifidobacteria against entero-and uropathogens. Journal of Applied Microbiology 100:1324-1332.

Izard D., Husson MD., Vincent P. and Leclerc H. (1983).Méthodes rapides etautomatiques d'identification des entérobactéries. Ann Biol Clin ; 41 : 419-26.

Jack R.W., Tagg J.R., Ray B.(1995). Bacteriocins of Gram positive bacteriaMicrob .Rev. 59 :171-200.

Joffin J.N. (2002). Microbiologie générale : Les Entérobactéries. . Spectra-Biologie17 : 527-535.

Joffin J.N. and Leyal G. (2001). Microbiologie technique, dictionnaire destechniques. Centre nationale de documentation pédagogiques d’Aquitaire.

Joly B. and Reynaud A. (2003). Entérobactéries : systématique et méthodes dediagnostic. Ed : Lavoisier, Paris, 356 : 29-38.

Joly B. and Alain R. (2003). Entérobactéries : systématique et méthodes dediagnostic. Ed : Lavoisier, Paris, 356 : 29-38.

Kandler O. and Weis N. (1986). Genus lactobacillus Beijering 1901, 212 Al.In:Berjey’s Manual of systematic bacteriology, 2: 1209-1234, Williams, Wilkins,Baltimore.

Karch H., Tarr P.I. and Bielaszewska M. (2005). Enterohaemorrhagic Escherichiacoli in human medicine. Int J Med Microbiol. 295: 405-418.

Katla A.K., Kruse H., Johnsen G. and Herikstad H.( 2001). Antimicrobialsusceptibility of starter culture bacteria used in Norwegian dairy products. Int.J. Food Microbiol. 67, 147–152.

Kirby-Bauer A. (1966). L’antibiogramme.45 : 493-496Klaenhammer T.R., Fermaux C .and Hechard Y. (1994). Activité anti-

microbienne des bacteries lactiques in : bacteries lactiques, Tome:1 De RoissartHet LuquetF.M., Edition Lorica Pp : 353-366.

Klaenhammer T.R. (1986). Bacteriocins of lactic acid bacteria. Biochimie 70; 337-349.

Klaenhammer T.R. (1993).Genetics of bacteriocins produced by lactic acidbacteria.FEMS MicrobioRev, 12: 39-86.

Klaenhammer T.R. and Kullen M.J. (1999). Selection and design of probiotics. IntJ Food Microbiol. 50: 45-57.

Klaenhammer TR. (1993). Genetics of bacteriocins produced by lactic acid bacteria.FEMS Microbiol Rev. 12: 39-85.


104

Klein G., Hallmann C., Casas I.A., Abad J., Louwers J.and Reuter G.,(2000).Exclusion of vanA, vanB and vanC type glycopeptide resistancein strains ofLactobacillus reuteri and Lactobacillus rhamnosus used as probiotics bypolymerase chain reaction and hybridization methods. J. Appl. Microbiol. 89,815–824.

Koopmans M., Von Bonsdorff C.H., Vinjé J., de Medici D. and Monroe S.(2002). Foodborne viruses. FEMS Microbiol Rev. 26: 187-205.

Labioui H., Elmoualdi L., El yachioui M. and Ouhssine M. (2005). Selection desouches de bactéries lactiques antibactériennes. Bull. Sac. Pharm. Bordeaux,144, 237-250.

Lamps LW. ( 2007). Infective disorders of the gastrointestinal tract. Histopathology.50: 55-63.

Larpent J.P. (1997). Les bactéries lactiques. In : Microbiologie alimentaire,Aliments fermentés et fermentations alimentaires (Tome 2), 2e édition, (edsBourgeois C.M. et Larpent J.P.), Lavoisier, Tec. & Doc., Paris. pp. 6-33.

Le Minor L. and Richard C. (1993). Méthode de laboratoire pour l’identificationdes Entérobactéries. Institue. Pasteur. Paris, 310-324.

Leahy S.C., Higgins D.G., Fitzgerald G.F.and Van Sinderen D. (2005). Gettingbetter with bifidobacteria. J Appl Microbiol. 98: 1303-1315.

LeBlanc J.J.( 2003). Implication of virulence factors in Escherichia coli O157:H7pathogenesis. Crit Rev Microbiol. 29: 277-296.

Leclerc H., Gaillard J.L. and Simonet M. (1995). Microbiologie générale : Labactérie et la monde bactérien. Ed : Doin, Paris, p. 65-180.

Lee YK., Puong KY., Ouwehand AC. And Salminen S. (2003). Displacement ofbacterial pathogens from mucus and Caco-2 cell surface by lactobacilli. J MedMicrobiol. 52: 925-930.

Liévin V., Peiffer I., Hudault S., Rochat F., Brassart D., Neeser J.R. and ServinA.L. (2000). Bifidobacterium strains from resident infant human gastrointestinalmicroflora exert antimicrobial activity. Gut. 47: 646-652.

Liévin-Le Moal V. and Servin A.L. (2006). The front line of enteric host defenseagainst unwelcome intrusion of harmful microorganisms: Mucins, antimicrobialpeptides, and microbiota. Clin Microbiol Rev. 19: 315-337.

Macfarlane S. and Macfarlane G.T. (2004). Bacterial diversity in the human gut.Adv Appl Microbiol. 54: 261-289.

Mack DR., Michail S., Wei S., McDougall L. and Hollingsworth MA. (1999).Probiotics inhibit enteropathogenic E. coli adherence in vitro by inducingintestinal mucin gene expression. Am J Physiol. 276: G941-G50.

Mackie R.I, Sghir A.and Gaskins H.R.( 1999). Developmental microbial ecologyof the neonatal gastrointestinal tract. Am J Clin Nutr. 69: 1035S-1045S.

Magalhaes J.G., Tattoli I. and Girardin S.E. (2007). The intestinal epithelialbarrier: How to distinguish between the microbial flora and pathogens. SeminImmunol. 19: 106-115.


105

Manges A.R., Johnson J.R., Foxman B., Obryan T.T., Fullerton K.E. and RileyL.W. (2001). Widespread distribution of urinary tract infection caused by amultidrug resistant E. coli clonal group. N Eng J Med. 345 (14):1007-1013.

Mao Y., Zhu C. and Boedeker E.C.( 2003). Foodborne enteric infections. CurrOpin Gastroenterol. 19:11-22

Marchal N., Bourdon J. and Richard C. L. (1991). Les milieux de culture pourl’isolement etl’identification biochimique des bactéries. Ed. Doin. p. 65-149.

Marchal V.M. (1982). Flavour compounds in fermented milks Perfumer andFlavorist, 7(2): 27-34.

Margairaz A. ; Gallet J.P. ; Frank R. and Jardin F. (1975).Pathologie infectieuse.Ed : Masson, Paris, 130-135.

Marteau P. (2006). Living drugs for gastrointestinal diseases: the case for probiotics.Dig Dis. 24:137-147.

Masco L., Van Hoorde K., De Brandt E., Swings J.andHuys,G.(2006).Antimicrobial susceptibility of Lactobacillus andBifidobacterium strains from humans,animals and probiotic products. J.Antimicrob. Chemother. 58, 85–94.

May T.H. (2007). Apport de l’antibiogramme pour le clinicien. 6éme rencontre debiologie en Lorraine.

Mc Cracken V. J. and Lorenz R. G. (2001). The gastrointestinal ecosystem: aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota. CellularMicrobiology, 3: 1-11.

Mead P.S., Slutsker L., Dietz V., McCaig L.F., Bresee J.S., Shapiro C., GriffinP.M. and Tauxe R.V. (1999). Food-related illness and death in the UnitedStates. Emerg Infect Dis. 5: 607-625.

Metchnikoff E. (1908). Prolongation of life. G. Putman Sons, New York.Michael E. Stiles W. and Holzapfel (1996.) lactics acid bacteria of foods and their

curent taxonomy. J. of Food Microbiol 36: 1-29.Michalkiewicz J., Krotkiewski M., Gackowska L., Wyszomirska-Golda M.,

Helmin-Basa A., Dzierzanowska D. and Madalinski K. (2003).Immunomodulatory effects of lactic acid bacteria on human peripheral bloodmononuclear cells-Microb Ecol Health D 15,185-192.

Molbak K., Mead P.S. and Griffin PM. (2002). Antimicrobial therapy in patientswith Escherichia coli O157:H7 infection. JAMA. 288: 1014-1016.

Monack D.M., Bouley D.M. and Falkow S. (2004). Salmonella typhi persists withinmacrophages in the mesenteric lymph nodes of chronically infected Nramp1+/+mice and can be reactived by IFNgamma neutralization.J Exp Med 199,231-241.

Moubareck C., Gavini F., Vaugien L., Butel M.J. and Doucet-Populaire,F.(2005). Antimicrobial susceptibility of Lactobacillus and Bifidobacteriumspecies. J. Antimicrob.Chemother. 55, 38–44.

Nataro J.P, and Kaper J.B. (1998). Diarrheagenic Escherichia coli. Clin MicrobiolRev. 11: 142-201.


106

Nauciel C., (2000). Bactériologie médicale. Éditions Masson, Paris, pp.27-33.Ouwehand A.C., Salminen S. and Isolauri E. (2002a). Probiotics: anoverview of beneficial effects. Anton Leeuw. 82: 279-289.

Nijsten R., London N., Van Den BA. and Stobberingh E. (1996). Antibioticresistance among E. coli isolated from faecal samples of pig farmers and pigsAntimicrob Chemother .37 (6): 1131-1140.

Nijsten R., London N., Van Den BA. and Stobberingh E. (1996). Antibioticresistance among E. coli isolated from faecal samples of pig farmers and pigsAntimicrob Chemother .37 (6): 1131-1140.

Novel G- (1993). Les bactéries lactiques. In : Microbiologie industrielle, les microsorganismes d’intert industriels, Eds.J. Y. Leveau et M. Bouix. Technique etdocumentation Lavoisier, Paris. 170-374.

Novel G- (1993). Les bactéries lactiques. In : Microbiologie industrielle, les microsorganismes d’intert industriels, Eds.J. Y. Leveau et M. Bouix. Technique etdocumentation lavoisier, Paris. 170-374.

OMS. ( 2005). Escherichia coli enterohemorragique (EHEC). Aide mémoire Nº125.Available at: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs125/fr/print.html

Orla. Jensen S. (1919). The lactic acid bacteria. End host Copenhagen.KomisionHos Ejnar Munksgaard. Sect. Sc, 5: 81-169.

Ouwehand A.C., Salminen S. and Isolauri E. (2002a). Probiotics: an of verview ofbeneficial effects. Anton Leeuw. 82: 279-289.

Ouwehand A.C., Salminen S., Tolkko S., Roberts P., Ovaska J. and Salminen E.(2002b). Resected human colonic tissue: new model for characterizing adhesionof lactic acid bacteria. Clin Diagn Lab Immunol. 9: 184-186.

Panos G.Z., Betsi G.I. and Falagas M.E.(2006). Systematic review: are antibioticsdetrimental or beneficial for the treatment of patients with Escherichia coliO157:H7 infection? Aliment Pharmacol Ther. 24: 731-742.

Pardier C., Keita-Perse O., Vezolles MJ., Armengaud A., Barbotte E., BernardE., Carles D., Fazardi V., Oran N., Grimont F Desenclos JC. andDellamonica P. (1998). Epidémie de fièvre typhoïde à Utelle (Alpes-Maritimes, France, 1997). Bulletin Epidémiologique Hebdomadaire, (32) 137-139.

Parvez S., Malik K.A, Ah Kang S.and Kim H.Y. (2006). Probiotics and theirfermented food products are beneficial for health. J Appl Microbiol. 100: 1171-1185.

Pasteur P. (1981). Milieux de culture au laboratoire. Edition Pasteur p : 44-49.Pedone C.A., Arnaud C.C., Postaire E.R., Bouley C.F.and Reinert P. (2000).

Multicentric study of the effect of milk fermented by Lactobacillus casei on theincidence of diarrhoea. Int J Clin Pract. 54: 568-571.

Pelletie J.F., Faurie J.M., Alan F .and Teissier P. (2007). Lait fermenté: la technologie auservice du goutut, International Journal of Dairy Technology, Volume 42,2 : 15-20

Philippon A. (2007). Cours de bactériologie médicale. faculté de médecine Cochin-Port-Royal.,150-155

Piard J.C., Muriana P.M., Desmazeaud M.J. and Klaenhammer T.R. (1992).


107

Purification and partial, characterization of lactocin 481, a lantionine-containing- bacteriocin produced by LC. lactis. CNR.Z. 481. Appl. Environ.Microbiol. 58: 279-284.

Piard J.C., Kuipers O.P., Rollema H.S., Desmazeaud M.J. and Devos W.M.(1991). Structures, organization and expression of the lct for lactocin 481, anovel antibiotic produced by Lc. Lactis.In: PP-85-116, université de CaenFrance.

Picard C., Fioramonti J., Francois A., Robinson T., Neant F. and MatuchanskyC. (2005). Review article: bifidobacteria as probiotic agents – physiologicaleffects and clinical benefits. Aliment Pharmacol Ther. 22: 495-512.

Pilet C., Bourdon J.L., Toma B., Marchal N. and Balbastre C. (1981).Bactériologie médicale et vétérinaire.biologie appliquée. ISBN 2-7040-0362-9.

Podschum R., Pietsch S., Holler C. and Ullmann U. (2001). Incidence ofKlebsiella species in surface waters and their expression of virulence factors.Appl. Environ. Microbial, 67, 3325-3327

Raccach M., Mc Garth R. and Draftarian H. (1989). Antibiosis of some Lacticacid bacteria including Lactobacillus acidophilus toward Listeriamonocytogenes, Int. J. Food. Microbiol., 9:25-32.

Reccio I., Slangen C.J. and Visser S., (2000). Method for the production ofantibacterial peptides from biological fluids at anionic membrane. Application tothe isolation of nisin ,caprine and lactoferine. Lait 80,187-195.

Reid G., Sebulsky J. and Mc Cormick J.K. (2003). Pontential uses of probiotics inclinical practice.Clin Micro-biol Rev 16,658-672.

Richard C. and Proskauer V. (1978). Méthode rapide pour l’étude de rouge demèthyle. Ann. Inst. Past 122 : 979-986.

Richard D.J. (1996). Utilisation de bacteriocines pour la production d’aliment plussur mythe ou réalité ? Lait .76, 179-189.

Rodriguez E., Gaya P., Nunez M. and Medina M. (1998). Inhibitory activity of anisin -producing starter culture on Listeria innocua in raw ewe’s milk Manchegocheese. International .Journal.of Food.Microbiology, 39:129-132.

Rodriguez J.M., Martinez M.I., Horn N. and Dodd H.M. (2002). Heterologousproduction of bacteriocin by lactic acid bacteria. International. Journal.of. Food.Microbiology.80: 101-116.

Romond M.B., Romond C., and Izard D in Hermier J., Lenoir J. and Weber F.(1992). Les groupes microbiens d’intérêt laitiers. Ed Tec Et Doc .Paris.61-80.

Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J. and Mattila-Sandholm T. (2000).Probiotic bacteria: safety, functional and technological properties. J Biotechnol.84: 197-215.

Sahl H. G.M Jack, RW. et Bierbaum, G. (1995). Lantibiotics biosynthesis and bio-defecation activity of lantibiotics with unique post transsional modification. Eur.J.Biochem. 230:827-853.

Sakamoto I., Igarashi M., Kimura K., Takagi A., Miwa T.and KogaY.(2001).Suppressive Effect of Lactobacillus gasseri OLL 2716 (LG21)on Helicobacter


108

pylori infection in humans. Journal .of .Antimicrobial chemotherapy.47: 709-710.

Salminen S., Bouley C., Boutron-Ruault M.C., Cummings J.H., Franck A.,Gibson G.R, Isolauri E., Moreau M.C, Roberfroid M. and Rowland I.(1998). Functional food science and gastrointestinal physiology and function. BrJ Nutr. 80: S147-S171.

Sanders M.E. (2003). Probiotics: considerations for human health. Nutr Rev. 61: 91-99.

Sanders M.E. and Huis in’t Veld J. (1999). Bringing a probiotic-containingfunctional food to the market: microbiological, product, regulatory and labellingissues. Anton Leeuwen. 76: 293-315.

Savadogo A., Ouattara C.A.T., Bassole I.H.N. and Traore S.A.(2006).bacteriocins and lactic bacteria-a mini review. African. Journal. OfBiotechnology.Vol.5 (9), 678-683.

Savage F. (1977). Méthodes d'identification des entérobactéries. Ann Biol Clin ; 50 :522-526

Schleifer, (1986). Gram-positive cocci. In Bergy’s Manual of systematicBacteriology, vol.2, 1999-1002. Williams et Wilkims, Ballimore.

Servin A.L.( 2004). Antagonistic activities of lactobacilli and bifidobacteria againstmicrobialpathogens. FEMS Microbiol Rev. 28: 405-440.

Servin AL. and Coconnier MH. (2003). Adhesion of probiotic strains to theintestinal mucosa and interaction with pathogens. Best Pract Res ClinGastroenterol. 17: 741-754.

Sigumfeldt H., Rechinger K. and Jakobsen M. (2000). Dynamic changes ofintracellular pH in Individuel lactic acid bacterium cells in reponse to a rapiddrop in extracellular ph.Appl .Environ .Microbiol .66:2330-2335.

Singleton P. (2005). Bactériologie chimique. 4éme édition. DUNOD- Paris , 9(5):30-39.

Songisepp E., Kals J., Kullisaar T., Mandae R., Hutt P., Zilmer M. andMikelsaar M. (2005). Evaluation of the functional efficacy of an antioxidativeprobiotics in health volunteers. Nutr. J 4, 22.

Steer T., Carpenter H., Tuohy K. and Gibson G.R. (2000). Perspectives on therole of the human gut microbiota and its modulation by pro- and prebiotics. NutrRes Rev. 13: 229-254.

Stiles M. E., and Holzapfel W. H. (1997). Review article lactic acid bacteria offoods and cuent taxonomy, Int J. Microbiol. 36, 1-19.

Sutra L., Federighi M. and Jouve J.L. (1998). Manuel de bactériologiealimentaire. Ed : Polytechnica, Paris, 308(6) : 31-249.

Syndifrais, (2005).Yaourt et laits fermentés .Santé. Nutrition. Flore; n°24, 6p

Tabak S. , Medouakh L., Adda M., Chekroun A., Krantar K. and Bensoltane A.(2007). Interaction between Helicobacter pylori responsible for diseases gastro-


109

duodenal and bifidobacteria. . Egypt. J. App. Sci. 22: (12A), 72-83.Tabasco R., Paarup T., Janer C., Pelaez C. and Requena T. (2007). Selective

enumeration and identification of mixed cultures of Streptococcusthermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, L. acidophilus, L.paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactis in fermented milk.International Dairy Journal .23:250-255.

Tagg J.R. and MC Given A.R.(1971). Bacteriocin activity can be detected andassyed by a modification of the punch hole method. Appl.Micro, Vol 21(5); 943.

Tagg J.R., Dajani A.S., Wanamaker L.W. and Gray E.D. (1973). Group (A)Streptococci bacteriocins. The Journal .of. Experimental.Medecine, Vol1,(138):68-1183.

Tailliez P. (2001). Les bactéries lactiques, ces êtres vivants apparus il y a près de 3milliards d’années. Lait, 81 : 1-11.

Tainturier D. and Richard C. (1986). Métrites en série pendant la saison de montechez des juments de trait breton provoquée par Klebsiella Revue. Méd. Vét, 137,49-58

Takiguchi R. and Suzuki Y. (2000). Survival of lactic acid bacteria in simulateddigestive juice. J Intest Microbiol 14, 11–18.

Tan P.S.T., Bosma B.W. and Sasaki M. (1994). Purification and charActerisationof a dipeptidase from Lactobacillus helveticus SBT 2171. Snow BrndEuropean Reseach Laboratoires B.V., Groningen, the Netherlands.

Tauxe R.V. (2002). Emerging foodborne pathogens. Int J Food Microbiol. 78: 31-41.Koopmans M., von Bonsdorff C.H., Vinjé J., De Medici D. and MonroeS. (2002). Foodborne viruses. FEMS Microbiol Rev. 26: 187-205.

Teixeira de carvallo A.A., Apareicida de paula R., Mantovani H.C., De MoraesC.A.(2006) . Inhibition of Listeria monocytogenes by lactic acid bacteria fromItalian salami cheese, Food. Microbiology, 23:213-219.

Tortora G. J., Funke, B. R. and Case C. L. (2003). Les maladies infectieuses dusystème digestif. 756, 757,761-772.

Ventura M., Van Sinderen D., Fitzgerald G.F. and Zink R. (2004). Insights intothe taxonomy, genetics and physiology of bifidobacteria. Anton Leeuw. 86: 205-223.

Weiss N., Schillinger U. and Kandler O. ( 1993). Lactobacillus lactis,Lactobacillus leichmannii and Lactobacillus bulgaricus, subjective synonyms ofLactobacillus bulgarius, subjective synonyms of Lactobacillus delbreakii subsp.lactis, comb. Nov.And Lactobacillus delbruekii subsp.bulgarieus Dairy productcult. Dairy product J. , 22: 23,24, 26

Zhou J.S., Pillidge C.J., Gopal P.K. and Gill H.S. (2005). Antibiotic susceptibilityprofiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. Int. J.Food Microbiol., 98: 211–217.

Zouatni B. (2006). Antibiorésistance des Entérobactéries. Institut Nationald’Hygiene. 125:15-25.

Annexe

Annexe

Gélose nutritive (G N)Peptone …………………………………………………. ..5 gExtrait de viande ……………………………………..…...1 gExtrait de levure …………………………………………. 2 gChlorure de sodium ……………………………………….5 gAgar ……………………………………………….……. 15 gEau distillée…………………………………….…… .1000ml

PH = 7,4

Autoclavage 121°C pendant 15 min.

Gélose Hektoen

Protéase peptone………………………………………… 12gExtrait de levure……………………………………………..3gChlorure de sodium………………………………………….5gThiosulfate de sodium……………………………………….5gSels biliaires…………………………………………………9gCitrate de fer ammoniacal…………………………………1.5gSalicine………………………………………………………2gLactose…………………………………………………… 12gSaccharose………………………………………………… 12gFuschine acide…………………………………………… .0.1gBleu de bromothymol……………………………………0.065gAgar……………………………………………………… .14gEau distillée…………………………………………… .1000ml

PH=7.5


Gélose Mueller – Hinton

Macération de viande de bœuf …………………………300mlHydrolysat caséine……………………………………… 17,5 gAmidon…………………………………………………….1,5 gAgar..................................................................................... 10 gEau distilée…………………………………………… 1000ml

PH = 7,4

Autoclavage 121 °C pendant 15 min

Annexe

Gélose M. R. S (Man Rogosa Sharp)

Peptone.................................................................................10 gExtrait de viande ....................................................................8 gExtrait de levure .....................................................................4 gAcétate de sodium ………………………………………… 5 gPhosphate bipotassique ………………………………….… 2 gCitrate d’ammonium ………………………………………. 2 gSulfate de magnésium 7 H2O.............................................. 0,2 gSulfate de manganèse 4 H2O………………………...… 0,05 gGlucose ………………………………………………...… 20 gAgar……………………………………………………...…10gTween 80………………………………………………...…1mlEau distilée……………………………………………..1000ml

PH = 6,2


Bouillon TSB (Trypticase Soja Bouillon)

Peptone de viande.................................................................20gGlycerol..............................................................................10mlPotassium sulfate................................................................105gAgar ……………………………………………………....20g

PH = 7,3


Lait écrémé

Lait écrémé………………………………………………. ..10 gExtrait de levure…………………………………………... 0,5 gEau distillée ……………………………………………..100 ml

pH=7Autoclavage : 110 °C pendant 10 mn.

Eau physiologique

Chlorure de sodium ………………………………………….8.5gPeptone………………………………………........................ 0.5 gEau distillé ……………………………………………….1000ml

pH= 7Autoclavage à 120°C pendant 20 minutes.

Annexe

Lait écrémé UHT Candia silhouette

EauPoudre de lait écréméVitamines C E B1 B6 B9 DVitamine E………………………………………… 0.13 mg/100mlVitamine B1……………………………………….. 0.05 mg/100mlVitamine B6………………………………………. 0.03 mg/100 mlVitamine B9……………………………………………. 7μg/100ml

Annexe

Tableau 11 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches d’E. coli

code des souches

antibiotiques

Ec1 Ec2 Ec3 Ec4 Ec5 Ec6 Ec7 Ec8 Ec9 Ec10 Ec11 Ec12 ATCC25922

CefotaximeDiamètre/résultat

30/S 28/S 30/S 30/S 30/S 34/S 28/S 34/S 30/S <6/R <6/R <6/R 30/S

FlumequineDiamètre/résultat

30/S <6/R 33/S 34/S 36/S 34/S <6/R 30/S 29/S 29/S <6/R <6/R 28/S

ColistineDiamètre/résultat

26/S 26/S 30/S <6/R 30/S 21/S 21/S 28/S 30/S 26/S 26/S 28/S 28/S

Amoxycillinglavulanic acidDiamètre/résultat

20/S 20/S 28/S 26/S 18/S 19/S 22/S 25/S 23/S 17/I 18/S 16/I 24/S

GentamicineDiamètre/résultat

27/S 29/S 29/S 30/S 30/S 26/S 29/S 28/S 29/S 11/R 12/R <6/R 30/S

TrimethoximesulfamethoxazoleDiamètre/résultat

<6/R <6/R 20/S <6/R 34/S <6/R <6/R 30/S 29/S 25/S <6/R <6/R 25/S

AmpicillineDiamètre/résultat

<6/R <6/R 23/S 20/S 22/S <6/R <6/R 21/S 21/S <6/R <6/R <6/R 20/S

TetracyclineDiamètre/résultat

25/S 28/S 20/S 29/S 19/S 25/S 27/S 27/S 28/S 24/S 17/S 29/S 24/S

EnrofloxacineDiamètre/résultat

20/S 27/S 25/S 27/S <6/R 24/S 29/S 26/S 29/S 24/S 19/S 27/S 23/S

ChlorenphenicoleDiamètre/résultat

24/S 20/S <6/R 26/S 25/S 28/S 30/S 25/S 27/S 23/S 20/S 26/S 28/S

SulfamethoxazoleDiamètre/résultat

<6/R <6/R 21/S <6/R 30/S <6/R <6/R 29/S 27/S 26/S <6/R <6/R <6/R

TrimethoprimeDiamètre/résultat

<6/R <6/R 24/S <6/R 29/S <6/R <6/R 28/S 26/S 28/S <6/R <6/R 27/S

Annexe

Tableau 12 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de S. typhi

code des souches

antibiotiques

St 1 St 2 St 3 St 4 ATCC25922


32/S 32/S 30/S 31/S 30/S


28/S 28/S 27/S 25/S 28/S


30/S 32/S 29/S 30/S 28/S

Amoxycillinglavulanic acid

Diamètre/résultat

30/S 30/S 29/S 27/S 24/S


26/S 30/S 25/S 25/S 30/S


28/S 30/S 30/S 27/S 25/S


30/S 29/S 27/S 30/S 20/S


29/S 27/S 28/S 27/S 28/S


28/S 29/S 32/S 29/S 30/S


30/S 30/S 31/S 25/S 31/S


31/S 31/S 26/S 27/S 30/S


27/S 27/S 29/S 30/S 28/S

Annexe

Tableau13 : Résultats du test de l’antibiogramme pour les souches de K.oxytoca

code des souches

antibiotiques

Ko 1 Ko 2 Ko 3 Ko 4 ATCC25922


<6/R <6/R <6/R <6/R 30/S


30/S 28/S 28/S 31/S 28/S


32/S 31/S 29/S 31/S 28/S

Amoxycillinglavulanic acid

Diamètre/résultat

23/S <6/R 24/R 22/S 24/S


11/R 22/S 20/S 19/S 30/S


28/S <6/R <6/R 27/S 25/S


<6/R <6/R <6/R <6/R 20/S


25/S 24/S 25/S <6/R 24/S


26/S 27/S 24/S 28/S 27/S


22/S 26/S 27/S 27/S 26/S


27/S <6/R <6/R <6/R 24/S


28/S <6/R <6/R 27/S 25/S

Annexe

Tableau 17: Résultats de la densité optique de S.typhi (St1) et S. typhi (St1) + 1ml de

Hcl

Temps

Souches 0 2 4 6 8 12 18 20

S. typhi (St1) 0,15 0,263 0,385 0,498 0,556 0,562 0,571 0,589

S. typhi (St1) + 1 mlde Hcl

0,13 0,21 0,35 0,428 0,375 0,351 0,245 0,12

Tableau 18 : Résultats de la densité optique de S.typhi et S. typhi + 1 ml desurnageant

Temps

Souches 0 2 4 6 8 12 18 20

S. typhi (St1) 0,15 0,26 0,379 0,49 0,55 0,56 0,559 0,565

S. typhi + surnageant de LB3

0,13 0,243 0,357 0,456 0,445 0,446 0,356 0,334

Annexe

Tableau 19: Contrôle de Qualité: Escherichia coli ATCC 25922

Antibiotiques testés Chargedes

disques(µg)

Diamètres critiques (mm)Résistant Intermédiaire sensible

B- LactaminesAmpicilline 10 ≤13 14-16 ≥17Cefalexine X 30 ≤12 13-17 ≥18Ceftiofin 30 ≤17 18-20 ≥21AménosidesGentamicine 10 ≤12 13-14 ≥15SulfamidesTrimethoprimesulfamethoxazole

10 ≤10 11-15 ≥16

TétracyclinesTétracycline 30 ≤14 15-18 ≥19QuinolonesAcide nalidixique 30 ≤13 14-18 ≥19Flumequine**X 30 ≤21 - ≥25Ennfloxacine 5 ≤16 17-20 ≥21PolyptidesColistins X 10 - - ≥15FuranesNitrofurontoine 300 ≤14 15-16 ≥17Chloramphéricol 30 ≤12 13-17 ≥18

Annexe

Les galeries référence d'identifications biochimiques d’entérobactérie API20E(bio Mérieux sa, France, version 04/98) :

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Tableau 20 : des résultats des teste biochimiques API20E :

Teste Substrats Réactions /Enzymes

Résultats

Négatif Positif

1 : ONPG Ortho-nitrophényl-β-Dgalactosidase.

β-galactosidase incolore jaune

2 : ADH Arginine Argininedihydrolase

jaune rouge / orangé

3: LDC Lysine Lysinedécarboxylase

jaune orangé

4 : ODC Ornithine Ornithinedécarboxylase

jaune rouge / orangé

5 : CIT Citrate de sodium Utilisation ducitrate

vert pâle / jaune bleu-vert / bleu

6 : H2S Thiosulfate desodium

Production d’ H2S incolore / grisâtre dépot noir / finliseré

7 : URE Urée Uréase jaune rouge / orangé

8 : TDA Tryptophane Tryptophanedésaminase

TDA / immediat

jaune marron foncé

9 : IND Tryptophane Productiond’indole

JAMES / immédiat ou IND / 2 min

JAMES : incolorevert pâle / jaune.

IND : jaune

JAMES : rose.IND : anneau

rouge10 : VP Pyruvate de

sodium

Production

d’acétoine

VP 1+ VP 2 / 10 min

incolore rose / rouge

Annexe

Coloration de Gram :

Technique

Préparer un frottis d’une culture bactérienne pure ;

Recouvrir le frottis avec de cristal violet ; laisser agir une minute ; rincer à

l’eau distillée ;

Verser du Lugol et le laisser agir pendant une minute ; rincer à l’eau distillée ;

Décolorer à l’alcool à 950 entre 15 et 30 secondes ; rincer à l’eau distillée

Recolorer avec de la fuchsine phénique ; pendant 10 seconde si elle est

concentrée ou 1 minute si elle est diluée. Rincer à l’eau distillée ;

Sécher au dessus de la flamme d’un bec Bunsen ;

Observer à l’objectif à immersion (objectif x 100) et à pleine lumière.

Les bactéries « Gram-positif » apparaissent en violet foncé, les bactéries« Gramnégatif » en rose ou rouge.

Publications Scientifique


Egypt. J.of Appl.Sci

INTERACTION BETWEEN ENTEROBACTERIA RESPONSIBLE FORDISEASES DIGESTIVE SYSTEM INFECTIONS AND

LACTOBACILLUS SP.

Bey*1, F.; A. Abdelmalek1; A. Ait Abdeslam1; A. Meribai1; L. Medouakh1; A. Lakhal2; B.Boudilmi3 and A. Bensoltane1

1Laboratory of Food and Industrial MicrobiologyFaculty of Science. Department of Biology. University Es-Senia Oran Algeria.

2Laboratory of Food and Industrial MicrobiologyFaculty of Science. Department of Biology. University Aboubaker belkaid Tlemcen Algeria.

3Veterinary Laboratory Regional. Tlemcen Algeria.*Bey, F. corresponding author. E.mail: [email protected]

Key words: antagonistic, enterobacteria, gastrointestinal and urinary infection, Lactobacillus,probiotic bacter

ABSTRACT

The enterobacterias are responsible for the infectious diseases of the digestive system andappear by acute diarrhoeas. Lactobacillus sp. plays an important part in biotechnological fields,medical and in the agro alimentary like a better conservative by the production of the antimicrobialmetabolites. The enterobacterias (Salmonella tiphy (St1) , Escherichia coli (Ec1) and Klebsiellaoxytoca (Ko1) used in this work are insulated from the feces and of the urines of twenty patientsurinary infections and infectious diarrhoeas. The identification is made by a microbiological andbiochemical studies. An antibiogram was carried out for possible antibiotherapy .The interactionbetween Lactobacillus strains ((Lb1: Lactabacillus lactis, Lb2: Lactobacillus helveticus, Lb3:Lactobacillus rhamnosus) and enterobacteria gave positive results observed by the presence ofinhibition zones, the growth of E. coli ATCC 25922 is inhibited by Lb1 with a diameter of 24mmand 23mm for Lb2 and 20mm for Lb3 respectively. In a second study the growth of (Ec1) isinhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 19mm and 23mm with Lb2 and finally of 18mmwith Lb3 Thereafter, the growth of (St1) was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of19mm and 28mm with Lb2 and finally of 31mm with Lb3 At the end , this growth, of (Ko1) wasinhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 17mm and 22mm with Lb2 and finally of 19mmwith Lb3 .

,. Additional tests were necessary to know the exact nature of the inhibiting agent. Theresults showed that the secretion of the organic acids and the production of the bacteriocin areprobably the origin of inhibition.

INTRODUCTIONThe enterobacteria infection is an excellent example of a discovery that has led to improved

treatment of a wide variety of upper gastrointestinal diseases. They cause infectious diseases of thedigestive system that appear by acute diarrhoeas, (Margairaz et al., 1975; pilet et al., 1981) andrepresent the first cause of infant mortality in the third World, approximately 1 child out of 10 diesabout it before reaching the 5 years old (Tortora et al., 2003) .The Lactobacillus is probioticbacteria exerting various beneficial effects on the health of the host (Shah, 1999). Indeed, amongthese effects we note: the control of the intestinal flora, regulation of the intestinal transit,


improvement of lactose intolerance (Gionchetti et al., 2000; Gupta et al., 2000; Gopal et al.,2001) and the inhibition of the growth many pathogenic bacteria (Callewaert and De Vuyst, 2000).The limitation or the inhibition of growth is also due to the production of Lactobacillus H2O2 andbacteriocins. Many researchers have reported the potential health and nutritional benefits ofLactobacillus strains (Chekroun and Bensoltane, 2007). The objective of this work was toinvestigate the interaction between Lactobacillus and enterobacteria in order to determine theinhibition effect of Lactobacillus against the growth of enterobacterias.

MATERIALS AND METHODS1-Organisms:

The experimental work concerned by the study of twenty strains of enterobacterias(Salmonella tiphy (St1), Escherichia coli (Ec1) and Klebsiella oxytoca (Ko1)). These strains weretaken from the feces and of the urines of patients presenting an infectious diarrhoeas, urinaryinfections as well as typhoid fever. We work also on Escherichia coli ATCC 25922. Lactobacillus(Lb1: Lactabacillus lactis, Lb2: Lactobacillus helveticus and Lb3: Lactobacillus rhamnosus) usedin this study were isolated from the chamelle milk and identified at the laboratory of bacteriologyon the veterinary center of Tlemcen Algeria. The identification of isolated strains of enterobacteriais based on the morphological, physiological and biochemical characteristics according to themethods of Couture, (1990); Larpent and Gourgaud, (1997); Singleton, (1999); Joffin andLeyral, (2001).The identification of isolated strain of Lactobacillus was based on themorphological, physiological and biochemical characteristics according to the published work byChekroun, (2005); Hadaji and Bensoltane, (2006).2-Antibiogram:

The sensitivity study of isolated culture of enterobacteria strains tested with antibiotic. Thistest was based on the diffusion agar techniques of Fleming et al. (1975) on Muller-Hinton mediumby using following antibiotics : Ampicilline, Amoxicilline, Colistine, Tetracycline, Flumequine,Enrofloxacine, Ceftiofur, Gentamicine, Chlorophenicole, Amoxicillin+clavulanic acid,Sulfamethoxazole, Trimethoprime Incubation was carried out at 37°C during 24h in aeroanaerobicconditions. The readings of the results were carried out by the measurements of diameters ofinhibition zones and compared with references strains ATCC 25922 (Denteil, 1996).3- Antagonism Test:

3-1- Cultures preparationWe cultured our strains of Lactobacillus ( Lb1, Lb2, Lb3) in a liquid medium of MRS the

culture was incubated at 30°C during 24h to 48h aero-anaerobically. In parallel, the cultures ofisolated enterobacteria (St1, Ko1, Ec1, and E.coli ATCC 25922) were cultured in nutritive broth at37°C during 24 hours in aeroanerobic conditions.

3-2- Inhibitions testWe cultured Lactobacillus strains (Lb1, Lb2 Lb3) in Petri-dishes on Agar medium in touch by

the multi-points inoculator (Tabak et al 2007). Incubation was carried out at 30°C during 24 to 48hours aero-anaerobically. Thereafter,the plates were covered with a layer of 10 ml soft agarinoculated with 0.1 ml of enterobacteria (St1, Ko1, Ec1, and E.coli ATCC 25922) aftersolidification, the plates were aero-anaerobically incubated at 37°C during 24h. (Fuller, 1991;Hove et al., 1994). The positive results of antagonism test showed the presence of clear zonesaround of the Lactobacillus strains, the result is positive if the diameter of the inhibition zone ishigher 2 mm. (Abeet et al., 1995).


4-Research of inhibition agents:4-1- pH

The research of inhibition between strains Lactobacillus and enterobacteria was carried outaccording to the technique of Fleming et al. (1975) we prepared two tubes of nutritive brothcontaining Salmonella tiphy (St1) which presented the largest inhibition zones to ensure a goodresult. Tubes were then incubated at 37°C during 24 h. After incubation, we noted that growth ofSalmonella tiphy (St1) in the two tubes. The pH of the two tubes was adjusted at pH 7 with 5N HClafter 6 hours of incubation at 37°C .The bacterial growth was measured optically each hour during20 hours (Fleming et al., 1983).

4-2- Bacteriocins:The research of the bacteriocin is carried out in liquid medium. It is done only with the bacteria

which gave the largest inhibition activity against Salmonella tiphy (St1). Culture of Lactobacillusrhamnosus (Lb3) was inoculated in 50 ml of MRS liquid at 30°C during 18 hours (Kleanhammer,1986). After incubation we centrifuged at 8000 rpm for 7 minute and the supernatant was adjustedwith 5N NAOH to eliminate the effect of acidity. We prepared two tubes containing 10ml ofnutrient broth with Salmonella tiphy (St1) the tubes were incubated at 37°C during 24 hoursaerobically. The bacterial growth was followed by the measurement of the optical density each twohours. At the 6th hour of incubation the supernatant was added to one of the tubes.

RESULTS1-Antibiogram:

The study of the sensitivity on the growth of enterobacteria is sometimes very useful in thetherapeutic choice (Figure: 01)

Figure 01: Test of antibiotics in Muller Hinton medium.

1:Ampicilline (AMP) 7:Ceftiofur (CF)2:Amoxicilline (AMX) 8:Gentamicine (GN)3:Colistine (CS) 9:Chlorenphenicole ©4:Tétracycline (TE) 10:Ampicilline+clavulanic ac5:Flumiquine (UB) 11:Sulfamethaxazol (SS)6:Enrofloxacine (ENR) 12:Trimethoprime (TMP)

2-Antagonism activity of Lactobacillus sp. against enterobacteriaGrowth inhibition of enterobacteria isolated shows the existence of some inhibition agents

produced by Lactobacillus species and do not indicated the nature of these agents. (Table: 02),(Figure: 02).


Table 02: Results of diameter of antagonism between Lactobacillus (Lb1, Lb2, and Lb3)and enterobacteria (S.typhi (St1), K. oxytoca (Ko1), E.coli (Ec1) , E.coli ATCC 25922 )

diameter of antagonism (mm)Strains Lb1 Lb2 Lb3

E.coli (Ec1) 19 23 18S.typhi (St1) 19 28 31

K.oxytoca (Ko1) 17 22 19E.coli ATCC25922 24 23 20

Figure 02: Result of antagonism test between Lactobacillus Lb1: Lactabacillus lactis,Lb2: Lactobacillus helveticus, Lb3: Lactobacillus helveticus

and enterobacteria ( (St1), (Ko1), (Ec1) and E.coli ATCC 25922 )

From the obtained results resumed in the table above we can see that enterobacteria species(Salmonella tiphy (St1), Escherichia coli (Ec1), Escherichia coli ATCC 25922 and Klebsiellaoxytoca (Ko1)) were inhibited by the antagonism activity of Lactobacillus species (Lb1, Lb2, Lb3).The growth of E. coli ATCC 25922 is inhibited by Lb1 with a diameter of 24mm and 23mm forLb2 and 20mm for Lb3 respectively. In a second study the growth of E. coli (Ec1) is inhibited byLb1 with a diameter of inhibition of 19mm and 23mm with Lb2 and finally of 18mm with Lb3Thereafter, the growth of S.typhi (St1) was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 19mmand 28mm with Lb2 and finally of 31mm with Lb3 At the end , this growth, of K.oxytoca (Ko1)was inhibited by Lb1 with a diameter of inhibition of 17mm and 22mm with Lb2 and finally of19mm with Lb3 .

Escherichia coli ATCC 25922

Klebsiella oxytoca (Ko1)Salmonella typhi (St1)

Escherichia coli (Ec1)


3-Research of the agents of inhibition:3-1- pH

Results obtained by the measurement of the optical density of isolated Salmonella tiphycultivated in the nutrient broth whose pH was adjusted to 7 with NAOH and incubated at 37°Cduring 24 hours that in the first six hours of incubation at 37°C and in aerobic conditions, there wasa normal growth of the two Salmonella tiphy (St1) (the control and the test). In the test tube weadded 1ml of (HCl 0.9%). We observe a decrease of S. tiphy (St1) .which indicated that thisbacterium is sensitive to HCl .On the other hand, in the control tube where the pH was adjusted to 7,we noted progressive growth of Salmonolla tiphy (St1) .The resulted are represented in Figure 03

3-2- Search for bacteriocin:

After incubated at 37°C during 24 hours .The bacterial growth is measured. the results areindicated in Figures 02 and 04.in order to know the existence of bacteriocin and its effect on thegrowth of Salmonella tiphy (St1) .The results are translated by a curve which contains thesupernatant by Lb3 in wells, knowing that this bacterium have to develop in a medium with pH7.These results are explained maybe by the presence of bacteriocin production by Lactobacillusspecies (Lb1, Lb2, Lb3).

DISCUSSION

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8 12 18 20

Opt

ical

dens

ity(O

D)

Times (H)

+

1 ml of supernatant to Lb3

S.typhi (St1) +1 ml of supernatant to Lb3S.typhi (St1)

Figure 04: Growth of S. typhi (St1) in the presence of bacteriocinproduced by Lactobacillus rhamnosus (Lb3)

00,10,20,30,40,50,60,7

0 2 4 6 8 12 18 20

Opt

ical

Den

sity

(DO

)

Times (H)

+

Figure 03: Growth of S. typhi (St1) according to the pH.S.typhi S.typhi +1 ml of HCl


The sensitivity of enterobacteria to antibiotics showed that S. typhi (St1) andE. coli ATCC25922 is sensitive to all antibiotics. K. oxytoca (Ko1) and E. coli (Ec1) are sensitive toAmoxicilline, Colistine, Tetracycline, Flumequine, Enrofloxacine, Gentamicine, Chlorophenicole,Amoxicillin+ clavulanic acid. Therefore a remarkable resistance to: Ampicilline, Ceftiofur,Sulfamethaxazol, Trimethoprim. It is important to note that any infection by enterobacteria has totest the antibiotic sensitivity for their uses in the therapeutic field (Margairaz et al., 1975).

The results obtained by the antagonism test suggested and revealed that inhibition ofS. typhi (St1), E. coli (Ec1), E. coli ATCC25922 and K.oxytoca (Ko1) by strains of Lactobacillus(Lb1, Lb2, Lb3). This positive interaction indicated the growth inhibition of enterobactria andshowed an antagonism activity which is translated by the appearance of halos in the enterobacteriaisolated. Lactobacillus rhamnosus (Lb3) inhibits the E. coli (Ec1) with a diameter to 18 mm and E.coli ATCC 25922 with a diameter to 20 mm , 31mm for S.typhi (St1) and 19mm for K.oxytoca(Ko1) same results were showed by ; Alm, (1983); Dupont, (1997); Hilton et al., (1997); Reid etal., (2003); Annuk et al., (2003); Michalkiewicz et al., (2003); Monack et al., (2004); Labioui etal., (2005); Hutt et al., (2006); Songisepp et al., (2005).

The results of the antagonism test allowed us to push deeply the research and to look for theagents of inhibition that produce Lactobacillus species.

The presence of halations due to secretion of the organic acids which have an effect to lower thepH in the medium. And thus, the presence of the Lactobacillus species and enterobacteria in thesame medium causes inhibition of S.typhi (St1), E.coli (Ec1), and E.coli ATCC 25922 andK.oxytoca (Ko1) growth. On the other hand strains of Lactobacillus have continued to grow,because they are bacteria which have acidophilic character (Ouwehand and Vesterlund, 2004).

The examination of antagonism test explains the action of the acids in general on thecytoplasmic membrane of the bacteria (Blom and Mortvedt, 1991) these acids touch with themaintenance of the membrane potential and inhibit to molar acid concentration (Chekroun andBensoltane, 2007).The acetic acid is more inhibiting than the lactic acid, it can inhibit yeasts,mould and the bacteria pathogenic (Caplice et al., 1999; Gerald and Fitzerald, 1999) thepropionic acid inhibits mushrooms and certain bacteria the inhibiting activity is higher inassociations of two or several strains of lactic bacteria (Chekroun and Bensoltane, 2007).

As the presence of ring of inhibition does not mean forcing production of bacteriocin(Kleanhammer, 1986) of the additional tests are necessary to know the exact nature of theinhibiting agent. The results of these tests enabled us to note the presence of the bacteriocins-likeproduced by strains of Lactobacillus which caused a clear reduction in the optical density after theirdirect addition in the culture medium. Similar results were found according Carmen et al. (2000)which confirmed the inhibiting presence of bacteriocin of enterobacteria.

These substances were characterized by other researchers. The molecule is of proteinicnature (Delvis-Broughton, 1990) are sensitive to the action of the varied proteolytic enzymes orhaving a proteinic part and consequently, they are inactivated by these enzymes (Devuyest, andVandamme, 1994). The strain of Lactobacillus can naturally produce more than a bacteriocin. Huttet al., (2006).


REFERENCES

Abeet, A.: L. Knock and C. Hill (1995). Bacteroicins: modes of action and potential in foodpreservation and control of food poisioning.Int.J.food Microbial.28:169-185

Alm, L. (1983).The effect of Lactobacillus acidophilus administration upon the survival ofSalmonella in randomly selected human carriers - Prog Food Nutr Sci 7, 13-17

Annuk, H.; J. Shchepetova; T. Kullisaar; E. Songisepp; M. Zilmer and M. Mikelsaar (2003).Characterization of intestinal Lactobacilli as putative probiotics candidates.J.Appl Microbiol94, 403-412.

Blom, H. and C. Mortvedt (1991). Anti-microbial substances produced by food associated micro-organisms.Biochem Soc T19, 694-698

Callewaert, R.; L. De Vuyst (2000). Bacteriocin production with Lactobacillus amylovorus DCE471 in improved and stabilized by fedbatch fermentation -Appl.Environ.Microbiol, 66(2),606-613.

Caplice, E and F. Geraldfitzerald (1999). Food fermentation reloe of micro organisms in foodproduction and preservation -International Journal of Food Microbioligiy, 50:131_149.

Carmen, M.; E.H. Jan Kok; C. Pelaez; T. Requens and G. Buist (2000). Applied andEnvironmental Microbiologie.Aug, Page: 3174-3179.

Chekroun, A. (2005). Valorisation diététique des proteine du lait de vache par la fermentationlactique: role des bactéries lactiques et des Bifidobactéries. Thése de Doctora d'Etat Es-Sciences. Université d'Oran (Algerie).

Chekroun, A. and A. Bensoltane (2007). Nutritional characterization of fermented cow's milk at45°C by Lactobacillus acidaphilus and Bifidobacteria. Egypt. J. App. Sci .22: (12A) ,188-202

Couture, B. (1990). Bactériologie médicale: Etude et méthode des bactéries aérobie et facultativesd'intérêt médicale, Edition DECARIE-VIGOT 35:706-750.

Delvis-Broughton, J. (1990). Nisine and dits uses of food preservative Food Technol. 44: 100-117.Denteil, H. (1996). Interprétation de l'antibiogramme. Inst de Bactériologie Laboratoire de Medecin

.Hopitaux universitaire de StrasbrourgDevuyest, L. and E.J.Vandamme (1994). Bactericide of lactic acid bacterie. Devuyest and

Vandamme London: blatic academic anc professional.pp.91-146Dupont, H.L. (1997). Lactobacillus in prevention of traveler's diarrhea : an encouraging first step.

J Travel Med 1, 1-2.Fleming, H.P., Erchells, J.L. and Caslilow, R.N. (1975). Microbial inhibition of isolate

Pediococcus from cucumber bune. Appl. Environ Microbiol, 30:1040-1042.Fleming, T.P.; M.S. Nahilik and M.A. Mclntosh (1983). Regulation of enterobacterium iron

transport in Escherichia coli: characterization of ent: Mut (Aplac) open fusions. J Bacteriol156: 1171-1174.

Fuller, R. (1991). Probiotics in humain medium.gut pp: 32:107-138Gerald, F. and N. Fitzerald (1999). Food fermentation. Role of micor organisms in food

production and preservation international. Journal of Food Microbiology, 50:131-149.


Gionchetti, P.; F. Rizzello; A. Venturi; P. Brigidi; D. Matteuzzi; G. Bazzocchi; G. Poggioli; M.Miglioli and M. Campieri (2000). Oral bacteriotherapyas maintenance treatment in patientswith chronic pouchitis: A double-blind,placebo-controlled trial Gastroeterol, 119:305-9.

Gopal, P.K.; J. Prasad; J. Smart and H.S. Gill (2001). In vitro adherence properties ofLactobacillus rhamnosus DR20 and Bifidobacterium lactis DR10 strains and theirantagonisticactivity against an entertoxigenic Escherichia coli. In. Food. Microbiol. 67(3): 207-216.

Gupta, P.; H. Andrew; B.S. Kirschner and S. Guandal (2000). Is Lactobacillus GG help inchildren with Grohn's disease. Results of a preliminary, open label study .J. Pediatr.Gastroenterol.Nutr. 31:4537.

Hadaji, M. and A. Bensoltane (2006).Growth and lactic acid priduction by Bifidobacteriumlongum and Lactobacillus acidophilus in goat's milk. AJB Vol. 5(6). Pp 6505-509.

Hilton, E.; P. Kolakowski; C. Singer and M. Smith (1997). Efficacy of Lactobacillus GG as adiarrheal preventive in travelers. J Travel Med 1, 41-43.

Hove, H.; I. Nord Gaard-Anderson and P.B. Mortensr (1994). Effet of lactic acid bacteria on theintestinal production of lactate and short chain fatty acids and the absorption of lactate andshort chain fatty acids and the adsorption of lactose AMJ clin nutr,9:174-149.

Hutt, P.; J. Shchepetova; K. Loivukene; T. Kullisaar and M. Mikelsaa (2006). Antagonisticactivity of probiotic Lactobacilli and Bifidobacteria against entero-and uropathogens. Journalof Applied Microbiology 100:1324-1332.

Joffin, J.N.; G. Leyral (2001). Microbiologie technique.Dictionaire des technique. Centre nationalde documentation pédagogique d'Aquitaine.24:330-332.

Kleanhammer, T.R. (1986). Bacteriocins of lactic acid bacteria.Biochimie.70:337-349.Labioui, H.; L. Elmoualdi; M. El yachioui; M. Ouhssine (2005). Selection de souches de

bactéries lactiques antibactériennes.Bull.Sac.Pharm.Bordeaux, 144,237-250.Larpent, J.P.; M.L. Gourgaud (1997). Technique et documentation, Lavoisier 3éme

édition.51:509-518.Margairaz, A.; J.P. Gallet; R. Frank and F. Jardin (1975). Pathologie infectieuse. Ed:Masson,

Paris, 130-135.Michalkiewicz, J.; M. Krotkiewski; L. Gackowska; M. Wyszomirska-Golda; A. Helmin-Basa;

D. Dzierzanowska and K. Madalinski (2003). Immunomodulatory effects of lactic acidbacteria on human peripheral blood mononuclear cells-Microb Ecol Health D 15,185-192.

Monack, D.M.; D.M. Bouley and S. Falkow (2004). Salmonella typhimuruim persists withinmacrophages in the mesenteric lymph nodes of chronically infected Nramp1+/+ mice and canbe reactived by IFNgamma neutralization.J Exp Med 199,231-241.

Ouwehand, A.C. and S. Vesterlund (2004). Antimicrobial components from lactic acid bacteria.InAcid Bacteria: Microbilogical and Functional Aspects ed. Salminen, S.A., von Wright, A andOuwehand, A.C.pp.375-395.New York Marcel Dekker.

Pilet, C; J.L. Bourdon; B. Toma; N. Marchal; C. Balbaste (1981). Bactériologie médicale etvéterinaire.213-216.

Reid, G.; J. Sebulsky and J.K. Mc Cormick (2003). Pontential uses of probiotics in clinicalpractice.Clin Micro-biol Rev 16,658-672.

Shah, N.P. (1999). Probiotic bacteria: Antimicrobial and antimutagenic properties. Probiotica, 6:1-3.

Singleton, P. (1999). Bacteriologie chimique. 4éme édition, DUNOD-Paris.213-216.



Viability and resistance to acidity of Bifidobacterium spin Algerian’s bio-yogurts

Abdelmalek.A*1; F.Bey1; Y.Gheziel2; K.Krantar1; A. Ait Abdeslam1; A. Meribai1;L. Medouakh1 and A. Bensoltane1

1Laboratory of Food and Industrial MicrobiologyFaculty of Science. Department of Biology. University Es-Senia Oran 31000 Algeria.

2Hygiene laboratory. Wilaya of Oran . Algeria.*Abdelmalek,A. corresponding author. E.mail: [email protected]

Key Words: Bifidobacterium sp. ,bio-yogurt, viability, resistance,storage.

ABSTRACTFermented milk products are the most popular means of delivering probiotic bacteria in

food.Among them strains of Bifidobacterium sp predominate in commercial probiotic products.Four commercial bio-yogurt products which claimed to include bifidobacteria, were obtained fromlocal Algerian markets. These products were examined at 0,7,14 and 21 days for the viability ofbifidobacteria and yogurt culture L. delbrueckii spp.bulgaricus and S. thermophilus during storageat 4°C.All yogurts contained bifidobacteria at levels > 6.2 log cfu/ml at the time of purchase,theviability decreased during storage and on expiry counts were variable, ranging from 4.8 to 6.1 logcfu/ml. The average yogurt culture counts ranged from 6.7 to 7.2 log cfu/ml for L. delbrueckiispp.bulgaricus and 7.8 to 8.2 log cfu/ml for S. thermophilus.Specific growth rate(µ) andgeneration time of Bifidobacterium strains were determined. Acid tolerance was determined byintroducing the strains of Bifidobacterium in skimmed milk at pH=4.3 and enumerating duringstorage at 4°C.B.animalis showed superior survival abilities and resistance to acidity.

INTRODUCTIONProbiotics are defined as ‘live micro-organisms’ which confer a health benefit on the host

when administered in adequate amounts.Fermented dairy products containing probiotic bacteriasuch as Bifidobacteria, are generally considered as functional foods (O’sullivan, 2001). Productionof fermented milks containing bifidobacteria is increasing because of their beneficial effects onhealth(Crittenden, 1999). The reported health benefits of bifidobacteria include stabilizing the gutmucosal barrier, modulation of immune response, modulation of intestinal microbiota, prevention oftraveller’s diarrhoea in children,reduction of necrotizing endocarditis in neonates, alleviation ofatopic dermatitis symptoms in children, improvement of constipation, and antibacterial andanticarcinogenic activities ( Kailsapathy and Rybka, 1997; Ouwehand et al., 2002; Reid et al.,2003).In order to provide health beneficets, fermented dairy product should contain a minimumlevel of life and active cultures at the time of consumption.It has been argued that a minimum levelof 108 cfu/ml should be present in order to promote human health(Shah, 2000).The internationalStandard of federation Internationale de Laiterie/ International Dairy federation(FIL/IDF) require107cfu/ml of Lactobacillus acidophilus in product such as acidophilus milk and 106 cfu/ml ofBifidobacteria in fermented milks containing Bifidobacteria at the time of sale(IDF 1992). Severalfactors affect the survival of Bifidobacterium spp. in yogurts. These include strains of probioticbacteria, pH, hydrogen peroxide, storage atmosphere, concentration of metabolites such as lacticacid and acetic acids, dissolved oxygen, and buffers such as whey proteins (Kailasapathy andRybka, 1997). Among the various milk products, yogurts are regarded as the ideal vector for thedelivery of probiotic bacteria to consumers. A growing number of yogurt manufacturers aretherefore incorporating Bifidobacterium spp. in their products (Lourens-Hattingh and Viljoen,2001).In Algeria five manufactures claimed to include bifidobacteria in their products.The objective


of this study was to determine the viability of bifidobacteria and yogurt culture, and to determineresistance of bifidobacteria to acidity in Algerian’s commercial bio-yogurt products.

MATERIALS AND METHODSYogurt samples :

Four bio-yogurt made by two different manufacturers that claimed to include bifidobacteriain addition traditional yogurt culture L. delbrueckii spp.bulgaricus and S. thermophilus.Bacterial cultures :

Strains of Bifidobacterium B1,B2,B3 and B4 were isolated from Algerian commercially bio-yogurt. Strains were cultured on MRS-raffinose and incubated under anaerobicconditions(anaerocult, Merck Germany) at 37 °C for 72 h (Tabasco et al 2007).Strains wereidentified on the basis of the colony morphology, Gram positif , pleomorphic fermentative rodsoften Y-shaped ,negative reaction in biochemical test (catalase, urease, oxydase) (Marchal et al.,1991) and sugar fermentation(Scardovi,1986). Bifidobacterium species for strains B1 and B2 wereBifidobacterium.animalis, B3 and B4 were identifind at Bifidobacterium sp.(Abdelmalek, 2008).Specific growth rate (µ) and generation time of strains:

Samples of UHT skim milk were inoculated with strain B1,B2,B3 and B4 ( c.108 CFU/mlfor each strain).During 6 h of incubation, sampling and dilutions in sterile Ringer solution with0.05% cysteine HCl were made. Strains of bifidobacteria were cultured on MRS- agar with 0.05%cysteine HCl( De man et Sharpe, 1960) under anaerobic conditions using anaerocult(Merck,Germany) at 37°c for 72h.Specific growth rate (µ) for each culture was calculated using thisequation µ= ( log10 Xt – log10 Xt0)/ ( t1 – t0) where Xt and X0 are counts (cfu/ml) at time tt andt0.Generation time (Tg) was calculated as Tg= ln(2/µ) ( Shin et Ustunol, 2000b).Viability of bifidobacteria strains at 4°C in skimmed milk:

The UHT skimmed milk was used as the survival medium.Strains of bifidobacterium wasintroduced into 500 ml portion of sterile skimmed milk in Durran bottles to have a final populationof c. 108 cfu/ml.The pH was adjusted to 4.3 using 88% lactic acid.the bottles were stored at 4°C for21 days.The viability of Bifidobacteria was determined in samples at 0,7,14 and 21 days.The countswere made on MRS-agar with 0.05% cysteine Hcl after anaerobic incubation at 37°C for 72h.Enumeration of bifidobacteria and yogurt culture in commercial product during storage:

We tested viable bifidobacteria and yogurt cultures L. delbrueckii spp. bulgaricus andStreptococcus thermophilus in four commercial bio-yogurt (P1, P2, P3 and P4) every week until 21days past the expiry date.At each sampling, 1 ml of bio-yogurt was dissolved in 9 ml of Ringersolution with 0.05% cysteine HCl.Serial dilutions were made to 10-7.A volume of 100µl was spreadon to triplicate plates of selective media. MRS- agar ( De man et Sharpe, 1960) was used forenumeration of L. delbrueckii spp. bulgaricus , M17-agar (Tersaghi et Sandine, 1975) was usedfor enumeration of Streptococcus thermophilus and MRS-raffinose (Tabasco et al., 2007) was usedfor the enumeration of bifidobacteria. The inoculated plates were then incubated under anaerobicconditions at 37°C for 72h.Measure of pH:

The pH of the bio-yogurt samples was measured using a pH meter. Between samples theelectrode was rinsed with distilled water.

RESULTSB1 and B2 Strains showed the highest µ followed by B3 and B4,the specific growth rates µ

were ranged between 0.45 and 0.38.Generation time (Tg) was ranged between 1.54 and 1.48.Table1 shows specific growth rates(µ) and generation time Tg of four bifidobacteria strains inskimmed milk after 6 h of incubation.


Table 1:Specific growth rates(µ) and generation time(Tg) of four strains of bifidobacteria

Strains µ(h-1) TgB1 0.45 1.54B2 0.40 1.50B3 0.35 1.45B4 0.38 1.48

B1 and B2 survived for more than 21 days above 106cfu/ml, B3 and B4 declined numbersand decreased below 106 cfu/ml in 21 days of storage at 4°C in pH adjusted skimmed milk(Fig1).

Figure 1 Viability of bifidobacteria strains at 4°C with pH=4.3 in skimmed milk

Yogurt culture counts ranged from 6.7 to 7.2 log cfu/ml for Lactobacillus delbruckii spp.bulgaricus and 7.8 to 8.2 log cfu/ml for Streptococcus thermophilus during storage period in allproducts tested.The levels of L. delbruckii spp. bulgaricus and S. thermophilus remained relativelystable. All bio-yogurt contained >106 cfu/ml of bifidobacteria when purchased. All product showeda steady decline in viable numbers during storage, P1 and P2 contained > 106 cfu/ml ofbifidobacteria on expiry day, whereas the two other products P3 and P4 contained > 105 cfu/ml ofbifidobacteria. Figures 2-5 show the viability of bifidobacteria and yogurt culture L. delbruckii spp.bulgaricus and S. thermophilus in commercial bio-yogurt products P1;P2;P3 and P4 respectivelyduring refrigerated storage at 4°C.

Figure 2: Viability of bifidobacteria and yogurt culture in P1 during 21 days of storage at 4°C

0

2

4

6

8

10

Day 0 Day 7 Day 14 Day 21

log

cfu/

ml

B1 B2 B3 B4

0

5

10


log

cfu/

ml

Streptococcus Lactobacillus

Bifidobacteria





0

5

10


log

cfu/

ml


Bifidobacteria

0

5

10


log

cfu/

ml


Bifidobacteria

0

5

10


log

cfu/

ml


Bifidobacteria


DISCUSSION:

Bacteria B1 and B2 strain isolated from Algerian bio-yogurt were Bifidobacteriumanimalis.The technological properties of B.animalis make it suitable for inclusion in bio-yogurt(Jayamanne et Adams, 2006).Two product tested in this study, claimed to contain B.animalis spplactis.Specific growth rates (µ) and generation time of four strains of bifidobacteria ranged from0.38 to 0.45 and 1.45 to 1.54 respectively .Similar results were found with B. lactis and B.breve(Martinez-Villaluenga and Gomez, 2007).The acid tolerance of bifidobacteria is important as theorganism has to withstand the acidity in yogurts and gut, it has been reported to have healthbenefits.For digestion of food, the pH of gastric juice has to be around 3-4(Takiguchi and Suzuki,2000) and the pH of yogurt varies from 3.8 to 3.36(Shah et al., 1995).The results in the presentstudy showed that B.animalis (B1 and B2) survived longer in high acid environements over otherstrains B3 and B4.Matsumoto et al.,(2004) reported that of 17 Bifidobacterium strains, B.animalisspp lactis had highest acid tolerance.In their study,Hcl was used as the acidulent. A same resultwere found by Jayamanne and Adams, (2006) but they used lactic acid as the acidulent.In ourstudy the acid lactic was used to simulate the acidic environment in the product.Bifidobacteriashould be present at > 106 cfu/ml in bio-yogurts on expiry to have health benefits (Kurmann andRasic, 1991).Microbial interactions could contribute to the ability of bifidobacteria in bio-yogurts.Different combinations of yoghurt starter and probiotic bacteria, and these combinations could havemutualistic and antagonistic effects on bifidobacteria(Jayamanne and Adams ,2006).Our resultsrevealed that all the bio-yogurt products contain this level when purchased, but this number increaseduring storage. A similar study showed adequate bifidobacteria counts and a high viable counts ofL. delbruckii spp. bulgaricus and S. thermophilus in bio-yogurts on expiry (Shin et al., 2000a ;Jayamanne and Adams, 2006; Ibrahim and Carr, 2006). Our results revealed that two Algerianbio-yoguerts contain viable B.animalis >106 cfu/ml on expiry but two others contain level> 105 onexpiry. Results obtained from this study can help the food industry to develop new technologies toensure consumers receive quality and beneficial products.

Acknowledgments:We would like to express our thanks to Mr Merahi, A.E.K.for her technical help.

REFERNCESAbdelmalek, A.(2008). Etude de performances des bifidobacteries isolées a partir des yaourts

fabriqués en Algérie. Mémoire de magister .département de biologie, faculté des sciences,Université d’ Oran, Algérie.

Crittenden, R. (1999). Prebiotics. In Probiotics: A Critical Reviewed. Tannock, G.W. pp. 141–156. Norwich, UK:Horizon Scientific Press.

De Man, J.C.;M. Rogosa, and M.E.Sharpe (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. JAppl Bacteriol 23, 130–135.

Ibrahim. S. A and J.P Carr (2006). Viability of bifidobacteria in commercial yogurt products inNorth Carolina during refrigerated storage. International Journal of Dairy Technology, Vol59, No 4 November;272-277.

[IDF] Intl Dairy Fed. (1992). General standard of identity for fermented milks. Vol.163. Belgium:Intl Dairy Fed.

Jayamanne, V. S. and M.R. Adams (2006). Determination of survival, identity and stressresistance of probiotic bifidobacteria in bioyoghurts. Letters in Applied Microbiology.42:189–194.

Kailasapathy, K. and S.Rybka (1997). L. acidophilus and Bifidobacterium spp. – their therapeuticpotential and survival in yoghurt. Aust J Dairy Technol. 52: 28–35.


Kurmann, J.A. and J.L. Rasic (1991). The health potential of products containing bifidobacteria.In Therapeutic Properties of Fermented Milks . London: Elsevier Applied Food Science.160: 117–158.

Lourens-Hattingh, A., and B.C. Viljoen (2001). Yoghurt as probiotic carrier food. InternationalDairy Journal. 11 : 1–17.

Marchal ,N.; J. Bourdon and C.L.Richard (1991). Les milieux de culture pour l’isolement etl’identification biochimique des bactéries. Ed.Doin 65-149.

Martinez-Villaluenga, C and R. Gomez (2007).Characterization of bifidobacteria as starters infermented milk containing raffinose family of oligosaccharides from lupin as prebiotic.International Dairy Journal. 17: 116–122.

Matsumoto, M.; H. Ohishi and Y.Benno(2004). H+-ATPase activity in Bifidobacterium withspecial reference to acid tolerance. Inter Jour Food Microbiology. 93: 109–113.

O’Sullivan, D. J. (2001). Screening of intestinal microflora for effective probiotic bacteria. Journalof Agricultural Food Chemistry 49 :1751–1760.

Ouwehand, A. C.; S. Salminem and E. Isolauri (2002). Probiotics: An overview of beneficialeffects. Antonie van Leeuwenhock. 82: 279–289.

Reid, G; J.Jass ; T. Sebulsky and J.K. McCormick (2003). Potential uses of probiotics inclinical practice. Clinical Microbiology Reviews.16: 658–672.

Scardovi, V. (1986). Genus Bifidobacterium. In Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, Vol.2 ed. Sneath, P.H.A., Mair, N.S., Sharpe, M.E. and Holt, J.G. pp. 1418–1434. Baltimore,MD: Williams and Wilkins.

Shah, N.P.;W.E. Lankaputhra; M.L.Britz and W.S. Kyle(1995). Survival of Lactobacillusacidophilus and Bifidobacterium bifidum in commercial yogurt during refrigerated storage.Int Dairy Jour. 5: 515–521.

Shah, N. P. (2000). Probiotic bacteria: Selective enumeration and survival in dairy foods. Journalof Dairy Science.83:894–907.

Shin, H.; J. Lee ; J.J. Pestka and Z. Ustunol (2000a). Viability of bifidobacteria in commercialdairy products during refrigerated storage. J Food Prot .63: 327–331.

Shin, H.; J. Lee ; J.J. Pestka and Z. Ustunol (2000b). Growth and viability of commercialBifidobacterium spp. in skim milk containing oligosaccharides and inulin. Journal of FoodScience.65:884–887.

Tabasco,R.; T. Paarup; C. Janer;C. Pelaez and T. Requena (2007). Selective enumeration andidentification of mixed cultures of Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus, L. acidophilus, L. paracasei subsp. paracasei and Bifidobacterium lactisin fermented milk. International Dairy Journal .17:1107-1114.

Takiguchi, R. and Y.Suzuki (2000). Survival of lactic acid bacteria in simulated digestive juice. JIntest Microbiol 14:11–18.

Tersaghi B. E. and W.E. Sandine (1975). Improved medium for lactic streptococci and theirbacteriophage. Appl. Environ. Microbiol. 29: 807-813.


Bifidobacteriumامكانیة العیش و قدرة مقاومة الحموضة sp.في منتجات لبنیة جزائریة

.1و بن سلطان أ1، مدواخ ل.1، مربعي ع.1، آیت عبد السالم ا.1، كرنطار ك.2، غزیل ي.1، باي ف.1اعبد المالكوھران الجزائرمخبرالمكروبیولوجیا الغذائیة و الصناعیة قسم الیبولوجیا كلیة العلوم1

.مخبر الوقایة و النظافة لوالیة وھران الجزائر2تدخل سالالت .Probioticتعتبر المنتجات اللبنیة من أكثر المواد الغذائیة انتشارا لكفاءتھا في نقل البكتیریا العالجیة

Bifidobacterium وي على سالالت قمنا بدراسة أربع منتجات لبنیة تحت.في صناعة الكثیر من ھذه الموادBifidobacteriumكل المنتجات .درجة مئویة 4یوم من التخزین عند درجة حرارة قدرھا 21و14-7-0العینات أخذ ت من األسواق الجزائریة في

6.2log>المدروسة احتوت على عدد cfu/mlص بین logوقت سحب العینات و ھذا العدد یتناق cfu/ml4.8عدد.6.1وL.delbrueckii spp.bulgaricus 6.7تراوح بین to 7.2 log cfu/ml. وعددS. thermophilus 7.8تراوح بین to 8.2

log cfu/ml. تمت دراسة مقاومة سالالت .قمنا بدراسة درجة النمو و وقت التناسل للسالالت المعزولةBifidobacteriumإمكانیة B.animalisأظھرت .و تعدادھا طیلة مدة الحفظ pH=4.3في الوسط الحامضي و ذلك بإضافتھا في وسط الحلیب ذو

.عیش كبیرة و مقاومة عالیة للوسط الحامضي.، إمكانیة العیش، منتج لبني، مقاومة، مدة الحفظBifidobacterium:الكلمات المفتاحیة



UTILIZATION OF EWE’S MILK FOR THE PRODUCTION OFPROBIOTIC YOGHURT

Ait-Abdeslam, A.*1; A. Chekroun2; L. Medouakh1; K. krantar1; F. Bey1; A. Abdelmalek1; A. Meribai1;M. Mahi1 and A. Bensoltane.1

1: Laboratory of Food and Industrial Microbiology, Department of Biology, Faculty ofscience, University of Oran, Es-Senia Oran-31000. Algeria.

2: Laboratory of Physiology of the nutrition and Food Safety, Department of Biology, Faculty ofscience, University of Oran, Es-Senia Oran-31000. Algeria.

*Ait-Abdeslam A. corresponding author, E-mail address: [email protected]

Key words: Ewe's milk; Bifidobacterium; Yoghurt starter bacteria, Growth, Fermentation.

ABSTRACTIn this study the ewe’s milk was used for probiotic yoghurt production. The physico-chemical analyze of

the ewe's milk showed that is rich in proteins (6.15% ± 0.12), fat (5.27% ± 0.09) and total solids (17.35% ± 0.2).The strains of Bifidobacterium animalis (Bif3), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1) andStreptococcus thermophilus (Strp1) isolated from commercial probioticfermented milks products in Algeria wereused to inoculate the ewe's milk. The growth of Bifidobacterium animalis (Bif3) was studied in ewe’s milk andreconstituted skim-milk in pure culture at 37°C and in mixed culture with Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (Lb1) andStreptococcus thermophilus (Strp1) at 42°C. The specific growth rate (µ) of Bifidobacterium animalis

(Bif3) in pure culture was estimated at 0.33 h-1

in ewe's milk and at 0.47 h-1

in reconstituted enriched skim-milk,

and in mixed culture it is equal at 0.90 h-1

in the ewe's milk and at 0.53 h-1

in reconstituted skim-milk. The pHreached the value of 5.21 at the end of 24 hours of fermentation for ewe's milk whereas, 4.26 for reconstitutedenriched skim-milk , and a concentration of total acidity products 73.5 D° and 117.75 D°, respectively in pureculture. However, in mixed culture the acidification of two milks was very fast. After 4 hours of fermentation, thepH of ewe's milk and reconstituted skim-milk are decreased from 6.6 to 4.6 and from 6.8 to 4.5, respectively.

INTRODUCTIONIn recent years, much research was done on yoghourt and probiotic-fermented milk manufactured with

the ewe’s milk (Bonczar et al., 2002; Bonczar and Reguła, 2003; Chougrani et al., 2008; Papadimitriou et al.,2007). Because of problems of the affliction of people with cow’s milk allergies (Kaddouri et al., 2008) andother gastro-intestinal ailments (Chekroun and Bensoltane, 2007), ewe’s and goat milk products are demanded.This demand is also growing because of a greater awareness of problems with traditional medical treatments forsuch afflictions, especially in developed countries (Haenlein, 2004). Furthermore, the demand for functionalfoods has been boosted as a result of growing awareness among consumers of the link between diet and health(FitzGerald et al., 2004). Fermented milk has proved to be an excellent vehicle for the production of suchfunctional food, especially when it contains probiotic bacteria. Probiotics are defined as living microorganismsthat upon ingestion in certain numbers exert health benefits (Guarner and Schaafsma, 1998). Among the mostoften used probiotic bacteria in dairy products are species of the genus Bifidobacterium (Masco et al., 2005;Meile et al., 2008).

Bifidobacteria behave in a different manner compared to the common lactic acid bacteria that are used infermented dairy products (e.g., yoghurt), since they require long fermentation time, anaerobic conditions, lowredox potential and exhibit weaker growth and acid production in cows’ milk (Gomes and Malcata, 1999; Janeret al., 2004 ; Lourens-Hattingh and Viljoen, 2001).

The purpose of this study was to produce probiotic-yoghurt from ewe’s milk using probiotic

bifidobacteria and yoghurt starter bacteria such as Streptococcus thermophilus and Lactobacillus


delbrueckii subsp. bulgaricus, and to determine the effect of ewe’s milk characteristics on the growth ofbifidobacteria in pure and mixed cultures with yoghurt starter bacteria.

MATERIALS AND METHODS1- Bacterial strains, isolation and identification

Strains used in this study were Bifidobacterium anmalis (Bif3), Streptococcus thermophilus(Strp1) and Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1). The Strains were isolated from commercialfermented milk products with yoghurt starter (Streptococcus thermophilus and Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus) and bifidobacteria, commercialized in Algeria.

For the strains isolation 1ml of commercial fermented milks products were dissolved in 9 ml of 1/4strength Ringer’s solution supplemented with 0. 3 g l-1 cysteine-HCl (Merck). A 10 fold dilution series wasprepared and pour plated in duplicate onto suitable isolation medium. Streptococcus was isolated on M-17 agarmedium containing 5 g l-1 lactose (Terzaghi and Sandine 1975) . MRS agar medium (De Man et al., 1960)adjusted to pH 5. 2 according to (Shah, 2000), was used for isolated Lactobacillus. Beerens medium containedBacto Columbia blood agar (per liter) (42 g; Difco), glucose (5 g; Merck), cysteine hydrochloride (0. 5 g; Merck)and propionic acid (5 ml; Merck) and the final pH was (5.0) (Beerens, 1990) and TPY agar medium (Scardovi,

1986) supplemented with 5% (v/v) filter-sterilised antibiotic solution (LiCl (60 g l-1

; Sigma) and neomycin

sulphate ( 2 g l-1; Sigma)) were used for isolated Bifidobacterium. All plates were incubated at 37 °C for 72 h.M17 was incubated aerobically, whereas all other media plates were incubated anaerobically. Anaerobicconditions were created using Anaerocult A sachets (Merck). Subsequently, all isolated bacteria were re-identifiedafter their isolation from the Gram stain reaction, colony appearance, and cell morphology and carbohydratefermentation patterns.

Each strain was grown in his specific medium at 37 °C for 24 h and maintained as frozen stock cultures at- 20°C, by mixing the fresh subculture with 20% glycerol as a cryoprotective agent and 20% (w/v) sterilereconstituted skim milk in a 2:5:5 ratio (Bolduc et al., 2006). Before all uses of the strains, Frozen cultures weresub-cultured twice overnight at 37 °C in sterile reconstituted skim milk.2- The ewe's milk and reconstituted skim milk

Ewe’s milk was collected during the summer period of 2007 in June from the small farms located in theWestern area of Algeria (Ain-Temouchent). Milking was made under aseptic conditions and milk was collected inbottles of 250 ml sterile and transported to the laboratory in a refrigerator at temperature 4°C.

Reconstituted skim milk was prepared by dissolving powder of the skimmed milk (Paulina, Molfino hnos,Argentina) in water distilled to 10% (w/v) and autoclaved at 110°C for 10 min.3- Treatment of the ewe's milk Pasteurization

of the ewe's milkThe ewe's milk was heated to 85°C for 30 min in a bain-marie (Memmert, Germany) before being cooled

to inoculation temperature.Physicochemical analyses of the ewe's milk after thermal processThe pH of ewe's milk samples was measured with a pH meter (Inolab pH Level1 WTW, Germany) and

total solids were determined by drying ewe's milk samples at 105°C for 24h (AOAC, 1984). Fat content wasdetermined using van Gulik’s method (Schwarz et al, 1950). Nitrogen content was determined by the Kjeldahlmethod (AOAC, 1990) and the total protein was calculated as follows: Kjeldahl N x6.38.

4- Process experimental from probiotic-Yoghurt productionPreparation of inocula

Lactobacillus, Streptococcus and Bifidobacterium species were first sub-cultured in MRS broth, M17 broth andTPY broth, respectively at 37 °C overnight. All strains were then sub-cultured twice in reconstituted skim milksterile (10%, w/v) supplemented with (0.5 %, w/v) yeast extract (Difco) (and


Cysteine hydrochloride (0.05%, w/v; Merck) for culturing B. animalis) (Frank et al., 1993), Followed by a finalsubculture in full fat sheep milk, previously pasteurized, in order to be better adapted to the ewe’s milkenvironment. All the subcultures were done at 37 °C for 18 h.

Inoculation of the milkTwo bottles contains each one 200 ml of the ewe's milk and 200 ml of the reconstituted skim- milk (10%,

w/v) enriched with (0.5 %, w/v) yeast extract (Difco) and (0.05%, w/v) Cysteine hydrochloride (Merck), wereinoculated with 3% (v/v) pure culture of Bifidobacterium. After a light agitation, inoculated milks were asepticallydistributed in tubes sterile at a rate of 10 ml each one and incubated at 37°C for 0–24h. One tube was prepared foreach sampling time and was used for all analyses. For the experiments with the mixed cultures, inoculum of 5%(v/v) (3% of Bifidobacterium, 1% of S. thermophilus and 1% of L. delbrueckii subsp. bulgaricus.) was used, andthe tubes were incubated at 42 °C for about 4-6 h, until pH 4.6 was reached.5- Microbiological analyses

Viable counts were determined in fermented milks samples (1 ml), after the fermentation process by

using serial decimal dilutions prepared in 1/4 strength Ringer’s solution supplemented with 0.3 g l-1 cysteine-HCl.One ml aliquot dilutions were poured onto plates of the various selective and differential agar in triplicate. Countsof S. thermophilus were enumerated on M-17 agar and incubated aerobically at 37°C for 48 h. For enumeration ofL. delbrueckii subsp. bulgaricus, appropriate dilutions were spread out on MRS agar pH 5.2, plates incubatedanaerobically at 37°C for 72h. A medium Beerens was adapted from bifidobacteria selective media described inthe literature (Bonaparte et al., 2001) to differentiate Bifidobacterium from the other two strains in the starterculture (S. thermophilus and L. delbrueckii subsp. bulgaricus). Plates were incubated for 3 days at 37°C underanaerobic conditions (Anaerocult A, Merck). Plates containing 20–200 colonies were counted and the results

expressed as colony-forming units per ml (cfu ml-1) of sample.6- Kinetics acidifying

The pH value was measured during fermentation using a digital pH-meter with a combined glasselectrode and temperature probe (Inolab pH Level1 WTW, Germany). The pH meter was calibrated usingstandard buffer solutions (Merck) at pH 4.0 and 7.0.Acidity was titrated with N/9 NaOH solution. The volume of NaOH was multiplied by 10 to calculate titratableacidity in degree Dornic (D°). Where 1D° = 0, 1 g of lactic acid in 1 liter of milk (Guiraud,1998).

RESULTS1- Identification of strains

All fermented milks with bifidobacteria tested contained L. delbrueckii, S. thermophilus andBifidobacterium sp., and we could isolate the three strains in each product tested. All lactobacilli isolates (Lb1,Lb2 and Lb3) were identified as L. delbrueckii subsp. bulgaricus by cell morphology and biochemical tests and allstreptococci isolates (Strp1, Strp2 and Strp3) were identified as S. thermophilus by means of microscopicappearance (coccoide form, completely different from lactobacilli and bifidobacteria) (fig.1) and then by use ofbiochemical tests. Bifidobacteria isolates (Bif1, Bif2 and Bif3) were identified as being Bifidobacterium animalisby cell morphology (polymorphing forms) (fig.1) and carbohydrate fermentation patterns.

(a)

(c)Fig. 1: Microscopic observations after the Gram stain reaction.

(a): S. thermophilus(b): L. delbrueckii

animalis (Bif3). Cultivation on M

2- Composition of ewe’s milkThe mean composition of ewe’s milk after heating is given in (Table 1). Physico

showed that the ewe's milk is rich in proteins, fat and total solids.

Table 1: Composition of ewe’s milk after heating at 85°C for 30Physico-chemical parameters

fat (%)Protein (%)

total solids (%)pH

a Analyses were performed in triplicate. Values are means ± SD. bProtein = total nitrogen x 6.38.

3- Growth and kinetics acidification ofThe results of growth and acidification kinetics of

shown in (fig. 2 and 3). The specific growth rate (µ) of

in ewe's milk and at 0.47 h-1

in reconstituted enriched skim24 hours of fermentation for ewe's milk whereas, 4.26 for reconstituted enriched skimof total acidity products 73.5 D° and 117.75 D°, respectivel


(b)

(d): Microscopic observations after the Gram stain reaction.

S. thermophilus (Strp1). Cultivation on M-17 agar, incubation at 42°C. (x120).L. delbrueckii subsp . bulgaricus (Lb1). Cultivation on MRS agar, incubation at 42°C. (x120). (c) and (d):

(Bif3). Cultivation on M-17 agar, incubation at 37°C. (x600).

The mean composition of ewe’s milk after heating is given in (Table 1). Physicoshowed that the ewe's milk is rich in proteins, fat and total solids.

Composition of ewe’s milk after heating at 85°C for 30 min a.

chemical parameters ewe’s milk pasteurizedfat (%) 5.27± 0.09

Protein (%)b

6.15 ± 0.12total solids (%) 17.35 ± 0.2

pH 6.6 ± 0.03a Analyses were performed in triplicate. Values are means ± SD. bProtein = total nitrogen x 6.38.

Growth and kinetics acidification of Bifidobacterium animalis (Bif3) in the pure cultureThe results of growth and acidification kinetics of Bifidobacterium animalis (Bif3) in the pure culture are

shown in (fig. 2 and 3). The specific growth rate (µ) of Bifidobacterium animalis (Bif3) was estimated at 0.33 h

in reconstituted enriched skim-milk.The pH reached the value of 5.21 at the end of24 hours of fermentation for ewe's milk whereas, 4.26 for reconstituted enriched skim -milk, and a concentrationof total acidity products 73.5 D° and 117.75 D°, respectivel y.


(Lb1). Cultivation on MRS agar, incubation at 42°C. (x120). (c) and (d): B.

The mean composition of ewe’s milk after heating is given in (Table 1). Physico -chemical Analyze

ewe’s milk pasteurized

(Bif3) in the pure culture(Bif3) in the pure culture are

(Bif3) was estimated at 0.33 h-1

milk.The pH reached the value of 5.21 at the end ofmilk, and a concentration


4- Growth and acidification kinetics of Bifidobacterium animalis (Bif3) in the mixed cultureAccording to the curves of pH evolution (fig. 4), we note that the acidification of two milks was very fast.

After 4 hours of fermentation, the pH of ewe's milk and reconstituted skim-milk are decreased from 6.6 to 4,6 andfrom 6.8 to 4,5, respectively.

Fig. 2: Growth and acidification kinetics ofBifidobacterium animalis (Bif3) in

the ewe's milk(Incubation at 37°C).

( ) Evolution of the pH( ) Curve of growth

Fig. 3: Growth and acidification kinetics ofBifidobacterium animalis (Bif3) in

the reconstituted enriched skim-milk(Incubation at 37°C).

( ) Evolution of the pH( ) Curve of growth

Fig. 4: Curve of pH evolution of milks duringfermentation by Lactobacillus delbrueckii subsp.

bulgaricus (Lb1) Streptococcus thermophilus (Strp1)and Bifidobacterium animalis (Bif3)(Incubation at

42°C).( ) ewe's milk.

( ) reconstituted skim-milk


The results of Growth studies of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1),Streptococcus thermophilus (Strp1) and Bifidobacterium animalis (Bif3) in ewe's milk and reconstituted skim-milk are shown in (fig. 5 and 6). All the strains grew better in the ewe's milk than in reconstituted skim-milk. The

initial viable cell counts were between 6.3 log cfu ml-1

and 6.6 log cfu ml-1

in ewe's milk and reconstituted skim-milk. All strains attained viable cell numbers between 7.11


DISCUSSION

According to Collado et al. (2006); Collado and Hernandez (2007); Gueimonde et al., (2004), themorphological and biochemical tests were excellent (>90%) and sufficient for identification S. thermophilus andL. delbrueckii subsp. bulgaricus used in the production of fermented milks. But this identification is unreliablefor Bifidobacterium sp., because the strains showed variable use of carbohydrate fermentation patterns atdifferent times. Consequently, a final identification at specie level is practically impossible without theapplication of the techniques using molecular methods (Masco et al., 2004; Ward and Roy, 2005).

The results obtained of the Physico-chemical analyzes of ewe's milk used for the production ofprobiotic-yoghurt are in agreement with the data reported by Park et al. (2007); Raynal-Ljutovac et al.(2008)and Rouissat and Bensoltane (2006). Ewe’s milk contains higher levels of total solids (17.35% ± 0.2) andproteins (6.15 % ± 0.12). According to Chougrani et al. (2006) and Haenlein and Wendorff (2006), thesecharacteristics are particularly suitable for the production of yoghourt and cheese.

The most important properties for commercial utilization of a starter composed of probiotic strains include rapidgrowth and acidification of milk, and good acid oxygen tolerance (Rasic and Kurman 1983). Likewise, it isimportant to consider the characteristics of the raw materials, the safety product, the ability to exert a beneficialeffect and the desired characteristics of the final product (Gomes et Malcata, 1998). Bifidobacterium animalis

(Bif3) grew better in reconstituted enriched skim-milk (µ = 0.47 h-1

) compared to the ewe's milk (µ = 0.33 h-1

).

These growth rates are higher than those observed by Hadadji and Bensoltane (2006) for B. longum (µ = 0.18 h-

1) during growth in the goat's milk. Several authors noted that milk and its drifts do not constitute an optimal

medium of growth for bifidobacteria (Murti et al., 1992; Rasic and Kurmann, 1983; Zbikowski and Ziajka,1986). This said, the growth of Bifidobacterium animalis (Bif3) in reconstituted skim-milk is stimulated by (0.5%)yeast extract and (0.05%) of cysteine previously added with milk. The yeast extract is regarded as a factorbifidogene which stimulates the growth of bifidobacteria (Roy et al., 1990). Cysteine is a reducing agent and is anessential amino acid required for the growth of the bifidobacteria (Ravula and Shah, 1998). This ingredient canbe used in the production of probioticfermented milks. Guler-Akın and Akın (2007), produced a probioticfermented milk (bio-yoghourt) starting from the goat's milk by using the starters of yoghourt (St. thermophilus andL. delbrueckii subsp. bulgaricus and probiotic bacteria (L acidophilus, Bifidobacterium bifidum BB12 andLactobacillus paracasei subsp. casei) , with or without the addition of cysteine (0,5%). Authors noted that theconcentration of the bifidobacteria is stronger in bio-yoghourt these which is supplemented with cysteine than inbio-yoghourt without cysteine. The higher content of proteins in ewe's milk (61.5g/l) cannot explain the

significant number of B. animalis (Bif3) reach after 24h fermentation at 37°C (8.47 log cfu ml-1

for initial viable

cell counts was 6.3 log cfu ml-1

). Because bifidobacteriea have a very weak proteolytic activity when compared toother lactic acid bacteria (Abu-Tarbaoush et al., 1998; Shihata and Shah, 2000). More recently, variousassumptions were proposed to explain the behavior of the bifidobacteria in the ewe's milk. Some of them beingbased on the higher concentration of β–lactoglobuline, α-lactalbumine and of the complexes of vitamins B(pantothenic acid, biotine and riboflavin) in ewe's milk (Gomes and Malcata, 1998; Kehagias et al., 2008).These compounds are regarded as good growth promoters for the bifidobacteria (Ibrahim and Bezkorovainy,1994; Petschow and Talbott, 1990; 1991; Poch and Bezkorovainy, 1988).The evolution of titratable acidityshowed a very slow speed of acidification in two fermented milks. This weak acidification by Bifidobacterium inpure culture was announced by several authors (Bennama, 1999; Chekroun et al.,2006; Hadadji and Bensoltane, 2006; Mahi et al., 2006; Samona et al., 1996).

Follow myth growth B. animalis (Bif3) in association with Streptococcus thermophilus (Strp1) andLactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus (Lb1) in the ewe's milk and reconstituted skim-milk shows us to aquite significant growth rate compared to that observed in pure culture. Indeed, a certain of number authors


mentioned that there has been an active synergy between the strains in mixed cultures (Altieri et al., 2008;Bensoltane et al., 2004; Chekroun et al., 2006; Cheriguene et al.,2006; 2007).Klaver et al . (1993) showed the growth rate of the bifidobacteria in milk could be increased by the presence ofproteolytic strains such as Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus or L. casei. The use of theassociation of B. animalis (Bif3) with Streptococcus thermophilus (Strp1) and Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus (Lb1) in fermentation is benific for the three strains. That is explained by the different requirements ingrowth promoters from the three species. the strains of Streptococcus thermophilus and of bifidobacteria are oftenproteolytique compared to the strains of L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Chekroun, 2005; Shihata and Shah,2000). So their growth is limited, the amino acids and the peptides present initially in milk being insufficient tomeet their needs. In the other hand, L. delbrueckii subsp. bulgaricus possesses a membrane protease which toallow the libiration of the amino acids and small peptides from degradation the caseins of milk. Those being thenused by Streptococcus thermophilus and bifidobacteria equipped with intracellular peptidase (Marshall, 1987;Shihata and Shah, 2000). As for Streptococcus thermophilus, this species has the capacity to use the oxygendissolved in the milk of the kind to reduce that concentration rate very low, but non zero (Altieri et al., 2008),thus making it possible to increase the viability of the bifidobacteria. It produces also formic acid and carbondioxide stimulating thus the growth of L. delbrueckii subsp. bulgaricus (Radke-Mitchell and Sandine, 1984;Veringa et al, 1968). The result of this protocooperation or symbiosis has like consequence the gooddevelopment of these three species, where B. animalis (Bif3) a reach the cell number of 7.11 log cfu ml-1 in the

ewe's milk and of 6.96 log cfu ml-1 in the reconstituted skim-milk for a initial cell number of 6.3 log cfu ml-1

after 6 hours of fermentation to 42°C and a fast acidification of two milks which have reach pH (4,6 – 4,5) afteronly 4 hours of fermentation.

REFERENCES

Abu-Tarbaoush, H. M.; M. M. Al-Dagal and M. Al-Royli (1998). Growth, viability and proteolytic activity ofbifidobacteria in whole camel milk. J. Dairy Sci., 81: 354-361.

Altieri, C.; A. Bevilacqua; D. D’Amato; M. Alessandro Del Nobile and M. Sinigaglia (2008).Modelling the survival of starter lactic acid bacteria and Bifidobacterium bifidum in single andsimultaneous cultures. Food Microbiol. 25: 729-734.

AOAC (1990). Official methods of analysis, 15th ed., Assoc. Offic. Anal. Chem., Arlington. AOAC (1984).Official Methods of Analysis, 14th ed., Assoc. Offic. Anal. Chem., Washington, DC.

No. 43.292, 7.001, 7.009, 7.006Beerens, H. (1990). An elective and selective isolation medium for Bifidobacterium spp., Lett. Appl. Microbiol. ,

11: 155–157.Bennama, R. (1999). Contribution à l’étude des bifidobactéries : Caractérisation biochimique, physiologique et

technologique de souches isolées en Algérie. Thèse de Magister, département de biologie, faculté dessciences, Université d’ Oran, Algérie.

Bensoltane, A.; A. Yagoubi; M. Mahi and A. Cheriguene (2004). Characterization of lactic acid bacteriaisolated from traditional Algerian butter. Egypt. J. Appl. Sci., 19(11B): 604-614.

Bolduc, M. P.; Y. Raymond, P. Fustier ; C.P. Champagne and J. C. Vuillemard (2006).Sensitivity of bifidobacteria to oxygen and redox potential in non-fermented pasteurized milk. Int. Dairy J.,16: 1038–1048.

Bonaparte, C.; G. Klein; W. Kneifel and G. Reuter (2001). Développement d’un milieu sélectif pour ledénombrement des bifidobactéries dans les laits fermentés. Lait, 81 :227–235.

Bonczar, G.; A. Reguła (2003). The influence of different amount of starter culture on the properties of yogurtsobtained from ewe’s milk. Electronic Journal of Polish Agricultural Universities, Food Sci. Tech., volume6, issue 2.

Bonczar, G; M. Wszolek and A. Siuta (2002). The effects of certain factors on the properties of yoghurt madefrom ewe’s milk. Food Chem., 79: 85–91.

Chekroun, A. (2005). Valorisation diététique des protéines du lait de vache par la fermentation lactique : rôle desbactéries lactiques et des bifidobactéries. Thèse de doctorat d’état Es- Sciences, département de biologie,faculté des sciences, Université d’ Oran, Algérie.

Chekroun, A. and A. Bensoltane (2007). Nutritional characterization of fermented cow’s milk at 45°C byLactobacillus acidophilus and bifidobacteria. Egypt. J. App. Sci. 22: (12A), 188-202.


Chekroun, A.; A. Bensoltane; O. Kheroua and D. Saidi (2006). Biotechnological characteristics of fermentedmilk by bacterial associations of the strains Streptococcus , Lactobacillus andBifidobacterium . Egypt. J. App. Sci. 21: (2b), 583-598.

Cheriguene, A.; F. Chougrani; A. M. A. Bekada; M. El soda and A. Bensoltane (2007).Enumeration and identification of lactic microflora in Algerian goat’s milk. African. J. Biotech, 6(15):1854-1861.

Cheriguene, A.; F. Chougrani and A. Bensoltane (2006). Identification and characterization of lactic acidbacteria isolated from Algerian goat’s milk. Pakistan J. Biol. Sci., 9(7): 1242-1249.

Chougrani, F.; A. Cheriguene and A. Bensoltane (2008). Use of lactic strains from Algerian ewe’s milk in themanufacture of a natural yogurt. A.J.B., 7 (8): 1181-1186.

Chougrani, F.; A. Cheriguene and A. Bensoltane (2006). Identification and some technological properties oflactic acid bacteria isolated from Algerian ewe’s milk. Egypt. J. App. Sci., 21(8): 148-157.

Collado, M. C. and M. Hernandez (2007). Identification and differentiation of Lactobacillus, Streptococcus andBifidobacterium species in fermented milk products with bifidobacteria.Microbiol. Res., 162: 86-92

Collado, M.C.; Y. Moreno; J.M. Cobo and M. Hernandez (2006). Microbiological evaluation and molecularcharacterization of bifidobacteria strains in commercial fermented milks. Eur. Food Res. Technol., 1–2:112–117.

De Man, J.C.; M. Rogosa and E.M. Sharpe (1960). A medium for the cultivation of lactobacilli. J. Appl.Bacteriol., 23: 130-135.

FitzGerald, R. J.; B. A. Murray and D. J Walsh (2004). Hypotensive peptides from milk proteins.J. Nutr., 134: 980S–988S.

Frank, AMK.; F. Kegma and HA. Weerkamp (1993). Growth and survival of bifidobacteria in milk. Neth.Milk. Dairy. J., 47: 151-164.

Gomes, A. M. P. and F. X. Malcata (1998). Use of small ruminants’ milk supplemented with available nitrogenas growth media for Bifidobacterium lactis and Lactobacillus acidophilus. J. Appl. Microbiol, 85:839–848.

Guarner, F. and GJ. Schaafsma (1998). Probiotics. Int. J. Food Microbiol., 39: 237-238.Gueimonde, M.; S. Delgado; B. Mayo; P. Ruas-Madiedo; A. Margolles and C. G. de los Reyes- Gavilan

(2004). Viability and diversity of probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium populations included incommercial fermented milks. Food Res. Int., 37: 839-850.

Guiraud, J. P. (1998). Analyse du lait. In : Microbiologie alimentaires, (eds. Guiraud J. P.). Dunod Parie. pp.390-391.

Guler-Akın, M. B. and M. S. Akın (2007). Effects of cysteine and different incubation temperatures on themicroflora, chemical composition and sensory characteristics of bio-yogurt made from goat’s milk. FoodChem., 100: 788–793.

Hadadji, M. and A. Bensoltan (2006). Growth and lactic acid production by Bifidobacterium longum andLactobacillus acidopuilus in goat’s milk. African. J.Biothec., 5(6): 505-509.

Haenlein, G.F.W. (2004). Goat milk in human nutrition. Small Rumin. Res., 51: 154–163. Haenlein, G.F.W. andW.L. Wendorff (2006). Sheep milk: production and utilization of sheep milk.

In: Handbook of Milk of Non-Bovine Mammals, (eds. Park Y.W. and Haenlein G.F.W.), BlackwellPublishing Professional, Oxford, UK, and Ames, Iowa, USA, pp. 137–194.

Ibrahim, S. A. and A. Bezkorovainy (1994). Growth promoting factors for Bifidobacterium longum.J. Food Sci, 59: 189-191.

Janer, C.; C. Pelaez and T. Requena (2004). Caseinomacropeptide and whey protein concentrate enhanceBifidobacterium lactis growth in milk. Food Chem., 86: 263–267.

Kaddouri, H.; S. Mimoun; K. E. El-Mechrefi; A. Chekroun; O. Kheroua and D. Saidi (2008).Impact ofƴ-Radation on antigenic properties of cow’s milk β-lactoglobulin. J. Food Prot., 71(6): 1270-1272.

Kehagias, C.; J. Csapo; S. Konteles; E. Kolokitha; S. Koulouris and Zs. Csapo-Kiss (2008).Support of growth and formation of D-amino acids by Bifidobacterium longum in cow’s, ewe’s, goat’smilk and modified whey powder products. Int. Dairy J., 18: 396–402.

Lourens-Hattingh, A. and B. Viljoen (2001). Yoghurt as probiotic carrier food. Int. Dairy J., 11: 1– 17.

Mahi, M.; A.Yagoubi; L. Rouissat; S. Tabak; L. Medouakh and A. Bensoltane (2006). Growth, viability andacidifying activity of bifidobacteria in goat’s milk. Egypt. J. App. Sci. 21: (3), 248- 261.


Marshall, V. M. (1987). Fermented milks and their future trends. I. Microbial aspects. J. Dairy Res., 54(4): 559-574.

Masco, L.; G. Huys; E. De Brandt; R. Temmerman and J. Swings (2005). Culture-dependent and culture-independent qualitative analysis of probiotic products claimed to contain bifidobacteria.Int. J. Food Microbiol., 102: 221-230.

Masco, L.; M. Ventura; R. Zink; G. Huys and J. Swings (2004). Polyphasic taxonomic analysis ofBifidobacterium animalis and Bifidobacterium lactis reveals relatedness at the subspecies level:reclassification of Bifidobacterium animalis as Bifidobacterium animalis subsp. animalis subsp. nov. andBifidobacterium lactis as Bifidobacterium animalis subsp. lactis subsp. nov. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.,54: 1137-1143.

Meile, L.; G. Le Blay and A. Thierry (2008). Safety assessment of dairy microorganisms:Propionibacterium and Bifidobacterium. Int. Food Microbiol., 126: 316–320Murti, T.W.; S. Roger ; C. Bouillanne ; M. Landon and Desmazeaud M. (1992). Croissance de

Bifidobucterium sp. CNRZ 1494 dans l'extrait de soja et le lait de vaches effets sur des composésaromatiques. Science des Aliments, 12(3) : 429-439.

Papadimitriou, C. G. ; A. Vafopoulou-Mastrojiannaki ; S. V. Silva A-M. Gomes; F. X. Malcata and E.Alichanidis (2007). Identification of peptides in traditional and probiotic sheep milk yoghurt withangiotensin I-converting enzyme (ACE)-inhibitory activity. Food Chem., 105: 647–656.

Park, Y.W.; M. Juarez; M. Ramos and G.F.W. Haenlein (2007). Physico-chemical characteristics of goat andsheep milk. Small Rumin. Res., 68: 88–113

Petschow, B. W. and R.D. Talbott (1991). Response Bifidobacterium species Growth promoters of human andbovine milk. Ped. Res., 29: 208-213.

Petschow, B.W. and R.D. Ta1bott (1990). Growth promotion of Bifidobacterium species by whey and caseinfractions from human and bovine milk. J. Clin. Microbiol., 28: 287-292.

Poch, M. and A. Bezkorovainy (1988). Growth-enhancing supplements for various species of genusBifidobacterium. J. Dairy Sci., 71: 3214-3221.

Radke-Mitchell L. and Sandine W. E. (1984). Associative growth and differential enumeration ofStreptococcus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus : a review. J. Food Prot., 47: 245- 248.

Rasic J. Lj. and Kurmann J. Am. (1983). Bifidobacteria and their role. Birkhäuser Verlag, Basel, Switzerland,278 pp.

Ravula R. R. and Shah N. P. (1998). Effect of acid casein hydrolysate and cysteine on the viability of yogurt andprobiotic bacteria in fermented frozen dairy desserts. Australian J. Dairy Technol, 53(3): 175–179.

Raynal-Ljutovac, K.; G. Lagriffoul; P. Paccard; I. Guillet and Y. Chilliard (2008). Composition of goat andsheep milk products: An update. Small Rumin. Res., 79: 57–72.

Rouissat L. and Bensoltane A. (2006). Physico-chemical, microbiological and biotechnological studies of lacticacid bacteria isolated from ewe’s milk of Algerian tow breeds (Ouled Djellal and El Hamra). Egypt. J. App.Sci. 21: (2b), 567-582.

Roy, D.; F. Dussavlt and P. Ward (1990). Growth requirements of Bifidobacfenum strains in milk.Milchwissenschaft. 45(8): 500-502.

Samona, A.; R. K. Robinson and S. Marakis (1996). Acid production by bifidobacteria and yoghurt bacteriaduring fermentation and storage of milk. Food Microbiol., 13: 275-280.

Scardovi, V. (1986). Section 15. Irregular nonsporing gram positive rods. Genus Bifidobacterium Orla Jensen1924, p. 1418–1434. In P. H. A. Sneath, N. S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (ed.), Bergey’s manual ofsystematic bacteriology, vol. 2. The Williams & Wilkins Co., Baltimore.

Schwarz, G.; B. Hageman; C. Huttig; R. Kellermann and W. Staege (1950). Untersuchung von MilchMilcherzeugnissen und Molkereihilfsstoffen. Methodenbuch Band VI (2nd ed.). Radebeul, Germany:NeumannVerlag

Shah, N. P. (2000). Probiotic bacteria: Selective enumeration and survival in dairy foods. J. Dairy Sci., 83(4):894–907.

Shihata, A. and N.P. Shah (2000). Proteolytic profiles of yogurt and probiotic bacteria Int. Dairy J., 10: 401-408.

Tersaghi, B. E. and W. E. Sandine (1975). Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophage.Appl. Environ. Microbiol., 29: 807-813.

Veringa, H. A.; T. E. Galesloot; and H. Davelaar (1968). Symbiosis in yoghurt. Isolation and identification of a


gowth factor for Lactobacillus bulgaricus produced by Streptococcus thermophilus. Netherlands MilkDairy J., 22: 114.

Ward, P. and D. Roy (2005). Review of molecular methods for identification, characterization and detection ofbifidobacteria. Lait, 85 : 23–32.

Zbikowski, Z. and S. Ziajka (1986). Hydrolyzed casein as a source of bifidus factor. Die Nahrung, 30(3-4):415-416.

حیويمخمرحلیبتصنیعفيالنعجةحلیباستعمال

*.آالسالمعبدآیت .عشقرون،1 .لمدواخ،2 .كآرانتار،1 .فباي،1 .أالمالكعبد،1 .عمریباي،1 .مماحي،1 بنو1.أسلطان 1

-وھرانالسانیا.وھرانجامعةالعلومآلیة.بیولوجیافرع،الصناعیةوالغذائیةالدقیقةاألحیاءعلممخبر1 الجزائر31000

-وھرانالسانیا.وھرانجامعةالعلومآلیة.بیولوجیافرعالتغذیة،صحةوالغذائیةفسیولوجیةمخبر2 الجزائر31000

[email protected] : األلكترونيالبریدعنوانالمتراسل،المؤلف.آالسالمعبدیتآ*

الملخص

الحیويالمساعدبكتیراتباستعمالوھذاحیويمخمرحلیبتصنیعفيالنعجةحلیباستعمالتمالدراسةھذهفي

)،منعزلھاتما L. delbrueckii subsp. bulgaricus +St. thermophilus)اللبنخمیرةبكتیراتوBifidobacterium

.الجزائرفيمصنعمخمرحلیب

.Bمختلطةأوبمفردھا animalis (Bifبالساللةالدسممنزوعالمرآبوحلیبالنعجةحلیبتخمرمتابعةإن( 3

.Lأنأظھرت delbrueckii subsp. bulgaricus (Lbو( 1 St. thermophilus (Strpاللبنخمیرةبكتیراتمع( 1

فيوذلكالمفردةالساللةمزرعةعندعلیھمماأعلىآانتلمختلطةاالسالالتمزرعةفيالتخمرمنالناتجةالحموضة

انخفضحیثالحلیبینpHقیمةإلىوالنعجةحلیبعندالمفردةالساللةالمزرعةفيالتخمرمنسا24بعد21,5قیمةإلى

°دورنیك73,5التسلسل،علىالحلیبینلكالالناتجةالحموضةآمیةوآانتالدسممنزوعالمرآبحلیبعند26,4

)قیمةإلىالحلیبین 4,6و4,5 انخفضالمختلطةالسالالتمزرعةفيأما.°دورنیك117,75وpHمنسا4بعدھذاو(

.Bخمیرةبكتیراتتواجدمعالنعجةحلیبفيأحسن animalis (Bifالساللةنموآانأخرىجھةومن.فقطالتخمر( 3

-سا0,33بالمفردةالمزرعةفينموھانسبةقدرةبحیث.الدسممنزوعالمرآبحلیبفيھوماعناللبن حلیبفي1

-سا0,47بوالنعجة -سا0,90بنموھانسبةقدرةالمختلطةالمزرعةفيأما.الدسممنزوعالمرآبحلیبفي1 في1

-سا0,53بوالنعجةحلیب .الدسممنزوعالمرآبحلیبفي1

:المفتاحیةالكلمات ,Bifidobacterium,النعجةحلیب .التخمرالنمو،،اللبنخمیرةبكتیرات

Documents

Etude de l’interaction antagoniste entre Lactibacillus sp ...theses.univ-oran1.dz/document/TH2866.pdf · La culture de ces bactéries dans des milieux sélectifs et dans des meilleures