EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE …

UNIVERSIDAD DE LOS ANDES

FACULTAD DE INGENIERÍA

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA

EVALUACIÓN DE LA INFLUENCIA DE LAS CONDICIONES DE CULTIVO DE

LOS GRANOS DE KÉFIR CULTIVADOS EN SUERO LÁCTEO EN LA

PRODUCCIÓN DE KEFIRAN

Proyecto de Grado

Autor

María Alejandra Morales Sánchez

Asesor

Felipe Salcedo Galán Ph.D.

Co-asesor

Ariel Mauricio Vaca Bohórquez

Mayo 2018

Bogotá D.C

1

Universidad de los Andes | 2018

Evaluación de la influencia de las condiciones de cultivo de los granos de

kéfir cultivados en suero lácteo en la producción de Kefiran María Alejandra Morales Sánchez Universidad de los Andes, Depatamento de Ingeniería Química, Bogotá D.C., Colombia.

Resumen

Las siguientes condiciones en el cultivo de los granos de kéfir, fueron estudiadas: el tiempo de fermentación

el tipo de medio, y la adición de fuentes de carbono y nitrógeno al medio. El principal objetivo de este

proyecto es buscar condiciones de cultivo de los granos de kéfir que permitan mejorar el rendimiento de la

producción de Kefiran, utilizando como medio de cultivo el suero lácteo, sustrato de bajo costo y alto valor

nutricional. Se pudo determinar que la frecuencia de cambio de medio que permite un aumento en la

producción de Kefiran, es de 4 horas, llegando a obtener hasta un 80% más del producto que al utilizar una

frecuencia de 24 horas. Por otro lado, se obtuvo que a menor relación carbono-nitrógeno presente en el medio,

el rendimiento de la producción de Kefiran mejora de manera significativa, llegando a ser un 64% mayor que

con una relación de 40:1. Con una relación de 2:1 se logró obtener 111% más de Kefiran que con una relación

de 40:1 y un 52% más que con una relación de 10:1. Finalmente, se tiene que, aunque con la leche el

crecimiento de los granos es un 2% mayor que con el suero enriquecido con una relación C:N de 2:1, con

esta se obtiene un 13% más que con la leche. Lo cual se debe a que el rendimiento es mayor, llegando a un

53% más de rendimiento que con suero puro y un 16% más que la leche.

Palabras clave: Granos de kéfir, polímero, producción, Kefiran, exopolisacárido, cultivo, rendimiento

1. INTRODUCCIÓN

El Kefiran es un polisacárido microbial soluble en agua que contiene cantidades aproximadamente iguales

de glucosa y galactosa. Este tipo de polisacárido tiene ventajas sobre otros, al mejorar las propiedades

viscosas y viscoelásticas a bajas temperaturas de bebidas lácteas fermentadas, así como el yogurt, el queso,

el kéfir o el kumis [1]. Al ser añadido a productos alimenticios, el Kefiran actúa como espesante, estabilizante,

emulsificante, agente gelificante, y puede tener influencia sobre el tiempo de percepción de su sabor en la

boca del consumidor [2]. Adicionalmente, el Kefiran tiene ventajas sobre otros exopolisacáridos porque tiene

propiedades antifúngicas, antitumorales y antibacterianas [3]. Por su gran cantidad de usos y aplicaciones, es

importante poder aislar la mayor cantidad de este polisacárido de los granos de kéfir.

Los granos de kéfir son masas pequeñas, gelatinosas amarillentas e irregulares [4]. Contienen una compleja

mezcla microbial simbióticas de bacterias ácido-lácticas (Lactobacilos, Lactococcus, Leuconostoc,

Streptocuccus), bacterias ácido-acéticas (Acetobacteria) y levaduras (Kluyveromyces, Saccharomyces y

Torula), incluidas en una matriz viscosa de proteína polisacáridas [2] [5]. La bacteria ácido-láctica

Lactobacilos Kefiranociens es la principal productora del exopolisacárido descubierto por La Rivié en 1967

[6], el Kefiran.

Los granos de kéfir, generalmente, son cultivados en leche, a 25°, 130rpm y con una frecuencia de cambio

de medio de 24 horas [7]. Sin embargo, en estudios realizados anteriormente, se pudo identificar que el pH

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del medio llega a su estabilidad aproximadamente en 4 horas, lo cual podría ser un buen indicio del

estancamiento de la producción de ácido láctico y junto a él, la producción de Kefiran. [8]. Para el aislamiento

del Kefiran de los granos de kéfir, primero se deben diluir los granos a una temperatura que oscile entre 80-

90°C y agitación constante. A continuación, para separar partículas no solubles, se centrifuga la dilución de

los granos a 4500rpm, 25°C y 35 minutos, y como resultado se obtiene el Kefiran en el sobrenadante.

Posteriormente, se precipita el Kefiran con Etanol al 95% p/p, a una relación en volumen de 1:2 a 4°C,

durante 24 horas. Al cabo de este tiempo, se centrifuga el Kefiran a 4500rpm, 4°C durante 40 minutos, al

finalizar se obtiene en el precipitado el Kefiran. Finalmente, para purificarlo se suspende el Kefiran obtenido

en agua desionizada en relación 1:10 peso-volumen, y se repite nuevamente el procedimiento [9].

Uno de los usos del Kefiran que cuenta con un gran potencial a nivel industrial, es su implementación como

recubrimiento de alimentos. Esto se debe, a la deshidratación y pérdidas nutricionales y de apariencia a las

que están expuestos los alimentos son muy significativos. En países desarrollados la pérdida de cosecha de

frutas está entre un 5% y un 25% mientras que, en países en vía de desarrollo, esta cifra alcanza valores entre

el 20% y el 50% [10]. Por lo tanto, se ha presentado un incremento en el uso de recubrimientos de productos

alimenticios, con el fin de aumentar su vida útil. En la actualidad, la mayor parte de los empaques son

elaborados con materiales obtenidos a partir de recursos no renovables, como el petróleo, que traen consigo

perjuicios para el medio ambiente [11]. Por esta razón, se ha estado buscando un reemplazo a estos tipos de

empaques, que pueda mantener la calidad y aumentar la vida útil del producto y, sumado a esto, que sea

amigable con el medio ambiente [12]. Se ha fomentado la exploración de nuevos materiales biológicos, así

como las películas comestibles y biodegradables producidas a partir de recursos renovables [13]. Es

importante mencionar que entre las propiedades que más se destacan de algunos biopolímeros están su

estabilidad térmica, su flexibilidad, sus propiedades de barrera al vapor de agua, a distintos gases como el

dióxido de carbono, y su resistencia a sustancias químicas, entre otras [14]. En cuanto a la implementación

de películas con base a Kefiran, y estudios realizados con anterioridad, se ha podido comprobar que estas

tienen buenas propiedades de barrera al vapor de agua, sus propiedades no varían significativamente a través

del tiempo y son bastante estables [12] [15].

La producción láctea colombiana en el año 2006 contó con una producción de leche de 6.024 millones de

litros, de queso de 1.084 millones de litros y de leches fermentadas de 542 millones de litros [16]. En este

mismo año se obtuvo una producción de lactosuero de 921.672 millones de litros [16]. El suero lácteo se

define como el producto lácteo líquido obtenido durante la elaboración del queso, la caseína y productos

similares, por medio de la separación de la cuajada, luego de la coagulación de la leche, mediante la acción

de enzimas como la renina (cuajo) [17]. Este subproducto puede contener hasta un 50% de los nutrientes de

la leche (proteínas, lactosa, vitaminas y sales) considerándolo un producto de un alto valor nutricional. Esta

gran concentración de proteínas conlleva a que el suero tenga una gran carga orgánica, y al ser desechado

genera un alto impacto ambiental [18]. Hoy día este producto se utiliza como alimento para cerdos y terneros

o es lanzado a ríos y potreros, por un litro de suero se puede llegar a contaminar hasta una tonelada de agua

[19], y como en Colombia no se regula este tipo de desechos, se pueden producir problemas de contaminación

en ríos y lagunas de ciertas regiones lechereas del país [20]. Por ello, se busca la aplicación de este

subproducto en otros campos como sustrato microbiano [21]. En el presente trabajo se desea utilizar el suero

lácteo, por su bajo costo y carga nutricional, como medio de cultivo de los granos de kéfir.

El crecimiento de bacterias puede verse afectado por numerosos factores. Aunque aún no es claro lo que

limita el crecimiento bacteriano, es de vital importancia saber cuáles elementos químicos pueden intervenir

en él [22]. Esta limitación se puede ver desde dos puntos de vista distintos. Primero, se puede relacionar con

la cantidad de sustrato, sin tener en cuenta un elemento en particular. El segundo, se relaciona con la calidad

del sustrato, es decir, la influencia de la relación entre elementos como C/N, C/P o N/P sobre el crecimiento

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de la bacteria [22]. Con este último se podría determinar cuál elemento es el encargado de limitar el

crecimiento bacteriano. La calidad de los sustratos asimilados, en función de la relación C/N del sustrato,

también influye en las eficiencias de crecimiento, al conocerlas, se puede proceder a estimar los porcentajes

de carbono orgánico y nitrógeno que se respiran, se excretan y aquellos que se utilizan en la producción de

biomasa. Los sustratos asimilados se pueden dividir en dos tipos, no nitrogenados (carbohidratos y lípidos),

y nitrogenados (proteínas y aminoácidos) [23]. Cabe resaltar que, las eficiencias de crecimiento de carbono

y nitrógeno no son independientes, ya que la estequiometría de estos elementos debe mantenerse en la

biomasa bacteriana. Es evidente la importancia de la relación de las fuentes de carbono y nitrógeno en el

crecimiento de las bacterias, en el presente estudio se desea observar como dicha relación afecta el

crecimiento de los granos de kéfir, y por lo tanto la producción de Kefiran.

2. OBJETIVOS

En el presente trabajo se pretende evaluar el efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de

kéfir en la producción de Kefiran, comparando la frecuencia del cambio de medio de cultivo utilizado

tradicionalmente, 24 horas, y un tiempo donde el pH del fermento es aproximadamente estable, 4 horas [8].

Igualmente, se pretende identificar el efecto de la relación de las fuentes de carbono y nitrógeno (C/N)

presentes en el medio de cultivo en la producción de Kefiran. Finalmente, se compara el crecimiento de los

granos de kéfir y la producción de Kefiran utilizando como sustrato de los granos leche, suero, y suero

enriquecido con la mejor relación C/N, utilizando como frecuencia del cambio de medio aquella con la cual

se obtuvo los mejores resultados.

3. MATERIALES Y MÉTODOS

3.1. Materiales

3.1.1. Obtención y cultivo de los granos de kéfir

Los granos de kéfir utilizados fueron obtenidos de un cultivo realizado durante dos años por Ariel Mauricio

Vaca, en el laboratorio de bioprocesos del Departamento de Ingeniería Química de la Universidad de los

Andes. Para aumentar la cantidad de los granos, se llevó a cabo su inoculación, en el mismo laboratorio, en

un baño agitado a 25°C, 130 rpm y una frecuencia de cambio de medio del cultivo de 4 horas. Como medio

de cultivo se utilizó leche entera UHT, con una relación de 6mL de leche por gramo de granos de kéfir.

3.1.2. Fuentes de carbono estudiadas

Para realizar las curvas estándar para la cuantificación de azúcares, se utiliza lactosa monohidratada PanReac

AppliChem, glucosa9 anhídrida Scharlau y galactosa al 99+% Acros.

3.2. Métodos

3.2.1. Aislamiento y cuantificación de Kefiran

Para el aislamiento de Kefiran, se trata cierta cantidad de granos con agua destilada a una proporción de 1:10

en peso durante una hora, manteniendo una temperatura entre 80 a 90°C y agitación constante.

Posteriormente, se procede a centrifugar la mezcla a 4500 rpm y 25°C durante 35 minutos. El precipitado

resultante se desecha, mientras que en el sobrenadante se encuentra el Kefiran. El cual se precipita con etanol

industrial al 95% a una relación 1:1, a 4°C durante 24 horas. La mezcla se centrifuga nuevamente a 4500

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rpm, 3°C y 40 minutos, obteniendo como precipitado el Kefiran. Para obtener un producto de una mayor

pureza, se repite de nuevo el proceso descrito con anterioridad. El Kefiran obtenido al finalizar el proceso es

secado en un liofilizador durante 24 horas. El producto final se somete a una prueba termogravimétrica para

definir su pureza y la cantidad de humedad presente en el polímero.

3.2.2. Caracterización del Kefiran

3.2.2.1. Análisis termogravimétrico (TGA)

Para el análisis termogravimétrico se toma una muestra de aproximadamente 2 mg del Kefiran obtenido.

El barrido de temperatura se realiza desde 25 hasta 700°C, con una rampa de calentamiento de 10°C/min,

en una atmósfera de nitrógeno UAP. Dicho análisis de lleva a cabo para hacer evidente la temperatura en

la que el polímero pierde masa en mayor cantidad, y la cual se podría decir es la temperatura de

degradación del polímero. Adicionalmente, permite obtener el porcentaje de humedad presente en la

muestra evaluada.

3.2.2.2. Calorimetría diferencial de barrido (DSC)

El análisis de calorimetría diferencial de barrido se realiza con una muestra de aproximadamente 1.9 mg

dispuesta en una celda hermética de aluminio. El barrido se lleva a cabo desde una temperatura de 25 hasta

250°C, utilizando una rampa de calentamiento de 10°C/min en una atmósfera de nitrógeno UAP.

3.2.3. Cuantificación de las fuentes de carbono

Las fuentes de carbono por cuantificar son la lactosa, la galactosa y la glucosa. Se utiliza el método de

cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC) [24], en primera instancia se deben realizar las curvas de

calibración de cada uno de los azúcares. En una balanza analítica se dispone un balón aforado de 20 mL, se

añade 0.02g del azúcar (Dilución I), y se procede a aforar con agua destilada, llegando a una concentración

de 1 ppm. Se realizan 5 puntos distintos para la realización de la curva, las respectivas diluciones se muestran

en la Tabla 1.

Tabla 1. Puntos para la curva de calibración para cuantificación de azúcares. Concentración

corregida válida solo para la lactosa.

Es importante mencionar que la lactosa utilizada es monohidratada, lo cual indica que, del peso total el 5%

corresponde a la molécula de H2O presente en el reactivo. Dado lo anterior, se realiza una corrección en los

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puntos de la curva de calibración de la lactosa. Los parámetros del método HPLC utilizados se especifican

en la Tabla 2.

Tabla 2. Parámetros del método HPLC

3.2.4. Cuantificación de fuentes de nitrógeno

El método de Bradford es utilizado para determinar la concentración de proteínas en general [25]. Para este

método se sigue el protocolo publicado por Gold Biotechnology. Primero se realiza la preparación del

reactivo de Bradford, a un balón aforado de 1 L se añade 100 mg de azul de Cromassie G-250, posteriormente,

se agrega 50 mL de etanol al 95% p/p, y lentamente se añade ácido fosfórico al 85% p/p. El contenido del

balón se mezcla hasta la dilución total del azul de Cromassie, finalmente se afora. El reactivo se almacena en

un shot de 1 L a 4°C.

Para realizar la curva de calibración, se realiza una solución de albúmina bovina, con una concentración de

albúmina de 0.5mg/mL. Con una micropipeta se toman diferentes volúmenes de la solución anterior [0 µL

(0 µg), 10 µL (5 µg), 20 µL (10 µg), 30 µL (15 µg), 40 µL (20 µg), 50 µL (25 µg)], y se disponen en celdas

para espectrofotometría. Posteriormente, se añade 1.5 mL del reactivo de Bradford en cada celda, se cubre

con plástico paraffin y se mezcla invirtiéndola. Después de 10 minutos, se mide la absorbancia a 595nm.

El análisis de la muestra de concentración de proteína desconocida se realiza pipeteando de 10 a 50 µL de la

muestra, si es necesario, se diluye. La idea es obtener una absorbancia que se encuentre dentro de los puntos

de la curva de calibración. A cada una de las celdas se añade 1.5 mL del reactivo de Bradford, y se tratan

igual que el procedimiento de la curva de albúmina. Si la concentración de proteína no se encuentra en el

rango de la curva estándar, se cambia la dilución de la muestra, y se mide la absorbancia nuevamente. Para

calcular la cantidad de proteína en la muestra, se utiliza la ecuación de la regresión lineal de la curva estándar

(Ecuación 1 y 2).

𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 − 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑡𝑜 𝑐𝑜𝑛 𝑒𝑗𝑒 𝑌

𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒

Ecuación 1

𝜇𝑔 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎

𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎= 𝑐𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒í𝑛𝑎 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 Ecuación 2

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3.2.5. Evaluación del efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de kéfir en la

producción de Kefiran, con una frecuencia de cambio de medio de cultivo de 4 y 24 horas

Con el fin de aprovechar el suero lácteo, se desea evaluar la influencia de la frecuencia de cambio de medio

de cultivo de los granos en su crecimiento, y en la producción de Kefiran, utilizando como sustrato suero

lácteo. La producción de Kefiran y de ácido láctico se lleva a cabo simultáneamente. A medida que el ácido

láctico se produce, el pH del medio disminuye, llegando a su estabilidad en un punto en el tiempo, el cual

fue estudiado anteriormente (Figura 1) [8].

Figura 1. Acidez total en función del tiempo [8]

Con el fin de aumentar la producción de Kefiran, se decide evaluar un tiempo de fermentación de 4 horas, y

el tiempo que tradicionalmente se utiliza, 24 horas. La inoculación de los granos se lleva a cabo a 25°C, con

una agitación constante de 130 rpm. La relación entre en el peso de los granos (g) y el volumen del medio

(mL) es de 1:6.

La producción de suero lácteo para esta evaluación se realiza de manera casera. Se toman 550 mL de leche

entera pasteurizada Colanta, se vierte en una olla y se aplica calor en una estufa. Simultáneamente, se añade

¼ de cuajo MILKSET®, en trozos, teniendo en cuenta una buena distribución. Posteriormente, se adicionan

otros 550 mL de leche, justo antes de que empiece a ebullir el contenido de la olla, se retira del calor y se

deja reposar durante 12 horas. El suero es el sobrenadante resultante, para separarlo del precipitado se cuela

en un tamiz de plástico y se almacena a 4°C para su preservación.

Los granos son pesados cada vez que se realiza cambio de medio. Después de 14 días de cultivo, se realiza

el aislamiento de Kefiran. El producto final se pesa y se somete a una prueba de TGA, para obtener el peso

total final de Kefiran obtenido. Se realiza duplicado del experimento.

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3.2.6. Evaluación de la influencia de la relación de fuentes de carbono y nitrógeno (C/N) presentes

en el medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de Kefiran

La relación C/N puede ser un factor determinante en el crecimiento de los granos de kéfir y consecuentemente

en la producción de Kefiran puesto que las bacterias sintetizan estos productos del sustrato para su

crecimiento, y demás procesos biológicos [26]. Cuando a las bacterias se les ofrece una mezcla de fuentes de

carbono, estas prefieren aquellas que pueden metabolizar con una mayor rapidez. Para la mayoría de las

bacterias, la fuente de carbono preferida es la glucosa [27]. Por otro lado, las fuentes de carbono son

indispensables para sintetizar proteínas y ácidos nucleicos, dichas fuentes pueden ser orgánicas e inorgánicas.

En un estudio realizado por Azjsek et al. (2013), se obtuvo el mayor incremento de masa de los granos de

kéfir utilizando fuentes orgánicas de nitrógeno, así como la triptona (15.97g/L) [1]. Es importante mencionar

que, se supone que la bacteria solo consume carbono de las fuentes de los carbohidratos, los carbonos

presentes en las fuentes de nitrógeno son utilizados para la glucólisis.

Teniendo en cuanto lo anterior, y que se analizan bacterias ácido-lácticas, para evaluar la influencia de la

relación C/N en el crecimiento de los granos de kéfir y la producción de Kefiran, dependiendo de la relación

de fuentes requerida, el medio se enriquece con lactosa como fuente de carbono, y triptona como fuente de

nitrógeno.

Primero, se realiza la cuantificación de fuentes de carbono y nitrógeno presentes en el suero lácteo (se utiliza

dicho medio, con el fin de su aprovechamiento). Seguido, se evalúa el crecimiento de los granos de kéfir

cultivados en medios con una relación C/N diferente. Uno donde se limite el carbono (2:1), otro donde se

limite el nitrógeno (40:1) y para el último, teniendo cuenta que el suero tiene una relación aproximada de

27:1, limitando el nitrógeno, se escoge una relación intermedia pero que no limite al carbono de manera

drástica (10:1). La inoculación de los granos se realiza durante 14 días, en un baño agitado, con agitación de

130 rpm, temperatura de 25°C y frecuencia de cambio de medio de 24 horas. La relación de los granos con

el medio se mantiene de 1:6 peso-volumen. Finalmente, se aísla el Kefiran. El producto final se pesa y se

somete a una prueba de TGA, para obtener el pero total final de Kefiran obtenido, y poder definir la relación

C/N que mejora la producción de este. Se realiza duplicado del experimento.

3.2.7. Evaluación del crecimiento de los granos de kéfir cultivados en leche, suero lácteo, y suero

lácteo enriquecido en la producción de Kefiran

Para dar soporte a los resultados obtenidos, se pretende comparar el crecimiento de los granos de kéfir y la

producción de Kefiran, teniendo en cuenta tres diferentes medios de cultivo. Para el primer cultivo, se utiliza

como sustrato leche entera KLIM ®, a una concentración de 0.13g/L. Para el segundo, se utiliza suero lácteo

como medio de cultivo. Para el último, se utiliza suero lácteo enriquecido, teniendo en cuenta la relación C/N

que permitió un mejor crecimiento de granos y producción de Kefiran. La inoculación se realiza en un baño

agitado, a 25°C, agitación de 130 rpm y con una frecuencia de cambio de medio de 4 horas.

4. RESULTADOS

4.1. Evaluación del efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de kéfir en la

producción de Kefiran, con una frecuencia de cambio de medio de cultivo de 4 y 24 horas

La evaluación del efecto del suero lácteo como medio de cultivo de los granos de kéfir con diferentes

frecuencias de cambio de medio se realiza durante 14 días, comenzando con 19 gramos de granos. Los

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tiempos evaluados fueron 4 horas y 24 horas, con su respectiva réplica. En la Figura 2 se muestra el

incremento de masa de los granos después del tiempo evaluado. Se evidencia que el crecimiento de los granos

realizando un cambio de medio con una frecuencia de 4 horas es significativamente mayor que realizando el

cambio cada 24 horas, incrementando su masa un 101% más que con una frecuencia de 24 horas.

Figura 2. Incremento de la masa de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo

En cuanto a la influencia de la frecuencia de cambio de medio de cultivo de los granos de kéfir, utilizando

como sustrato suero lácteo, en la producción de Kefiran se tiene que, con una frecuencia de 4 horas, en 14

días se puede llegar a producir 80% más de Kefiran que con una frecuencia de cambio de medio de 24 horas

(Figura 3). El incremento de peso de los granos y la producción de Kefiran en las diferentes frecuencias de

cambio de medio fueron de 33.76 g y 1.60 g para 4 horas, y de 16.74 g y 0.85 g para 24 horas. Es importante

mencionar que con ayuda del análisis termogravimétrico se pudo definir la cantidad de humedad presente en

las muestras de Kefiran liofilizado, teniendo en cuenta dicho porcentaje, se obtuvo la cantidad final total de

Kefiran (Tabla 3).

Tabla 3. Cantidad final de Kefiran teniendo en cuenta el porcentaje de humedad obtenida por medio de TGA

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Figura 3. Producción final de Kefiran con diferentes frecuencias de cambio de medio de cultivo de los granos de kéfir

Finalmente, se determina que por gramo de kéfir aproximadamente el 3% corresponde al Kefiran con un

cambio de medio de 4 horas, mientras que utilizando un tiempo de cambio de medio de 24 horas se obtiene

que aproximadamente el 2% es Kefiran (Figura 4). Con lo anterior se puede decir que con un periodo de

cambio de medio de 4 horas se puede obtener un 28% más de Kefiran, por gramo de kéfir que con un tiempo

de 24 horas. Lo anterior se puede dar gracias al aumento de nutrientes disponibles para la alimentación de

las bacterias, lo cual permite el aumento de producción de Kefiran. Al comparar dicha hipótesis con el

comportamiento del pH con respecto al tiempo (Figura 1) [8], se evidencia que con un tiempo de cambio de

medio de 4 horas no solo se ve beneficiada la producción de Kefiran, sino también la producción de ácido

láctico.

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Figura 4. Cantidad de Kefiran obtenido por gramo de kéfir

Para caracterizar el Kefiran obtenido, se realiza un análisis termogravimétrico de las muestras de Kefiran

después de su liofilización. Los resultados obtenidos fueron graficados junto a su derivada para llevar un

análisis más exacto de las tasas de pérdida de peso (Figura 4). Para realizar la comparación con el Kefiran

cultivado en leche, se plasma igualmente, el TGA de una muestra de Kefiran obtenido a partir del cultivo de

los granos en leche, con una frecuencia de cambio de medio de 24 horas, cultivado en el laboratorio de

bioprocesos de la Universidad de los Andes [8]. En los termogramas se logra identificar dos regiones de

pérdida de masa, la primera desde los 50 a los 100°C, correspondiente a la evaporación del agua, el segundo

desde los 275 hasta los 300°C, correspondiente a la degradación del polímero. Teniendo en cuenta lo anterior,

se puede decir que la temperatura de degradación del polímero para cada muestra es 308.81 ± 1.11°C ,

298.52 ± 4.26°C y 271.71 ± 16.76°C, para el Kefiran producido a partir de leche como medio de cultivo, con

una frecuencia de cambio de medio de 24 horas, el Kefiran obtenido a partir de suero como medio de cultivo

con una frecuencia de cambio de medio de 24 horas y de 4 horas, respectivamente. Adicionalmente se puede

ver diferencias en la segunda pendiente, lo cual se puede explicar por la presencia de impurezas en la muestra.

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Figura 5. TGA y curva derivada de TGA del Kefiran obtenido utilizando suero como sustratos y diferentes frecuencias de cambio de medio

Adicionalmente, se evidencia en las derivadas de los termogramas de frecuencia de cambio de medio de 4

horas, la presencia de una punta adicional después de la curva de degradación del polímero. Como hipótesis

de este comportamiento se plante la presencia de impurezas y lípidos. Sin embargo, para validar esta hipótesis

se lleva a cabo un análisis termogravimétrico del residuo, el cual se muestra en la Figura 6. Como se puede

observar, hay dos curvas que sobresalen del residuo, la primera tiene una temperatura característica de

pérdida de peso de 266.2°C, con lo cual se podría decir, que aún en el residuo se observa la presencia de

Kefiran. La segunda, tiene una temperatura característica de 328.99°C. Al comparar dicho punto con el

observado en los termogramas de una frecuencia de cambio de medio de 4 horas, se evidencia que coinciden,

es decir, si se podría afirmar que el Kefiran producido utilizando dicha frecuencia posee impurezas y lípidos,

presentes en el residuo.

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Figura 6. TGA y curva derivada de TGA del residuo del Kefiran

Por otro lado, se realiza una calorimetría diferencial de barrido con el fin de realizar una caracterización

térmica del Kefiran obtenido. Igualmente, se pretende comparar los resultados del Kefiran obtenido a partir

del cultivo de los granos de kéfir utilizando leche como sustrato, medio que se utiliza tradicionalmente y el

obtenido utilizando suero como sustrato. La Figura 7 muestra el termograma DSC de una muestra de Kefiran

cultivado en leche, cultivo realizado por Ariel Vaca en el laboratorio de bioprocesos de la Universidad de los

Andes [28], y dos muestras de Kefiran producido a partir del uso de suero lácteo como medio de cultivo de

los granos de kéfir. La primera utilizando un tiempo de fermentación del medio de 4 horas, y la segunda

utilizando un tiempo de 24 horas. Para todas las muestras se logra identificar un pico después de los 160°C,

al igual que unas fluctuaciones alrededor de los 130 y 150°C. Al comparar el DSC con el TGA se puede

observar que los puntos endotérmicos no coinciden con un cambio de peso considerable, lo cual indicaría la

presencia de un cambio de entalpía de primer orden que representa la fusión de dominios cristalinos del

Kefiran [28]. Por otro lado, las fluctuaciones señaladas en los termogramas de la frecuencia de cambio de

medio de 4 horas pueden deberse a la presencia de impurezas en las muestras.

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Figura 7. DSC del Kefiran. Comparación de Kefiran obtenido utilizando leche y suero lácteo como sustrato

Una de las características de los biopolímeros es la presencia de puentes de hidrógeno, con lo cual los picos

descendentes muestran el calor necesario para romper dichos enlaces. Al observar el comportamiento del

flujo de calor con respecto a la temperatura (Figura 7), se puede distinguir que la muestra de Kefiran cultivado

en suero con un tiempo de fermentación del medio de 4 horas, requiere un mayor calor para romper los

puentes de hidrógeno. Lo anterior se podría explicar por medio de un aumento de densidad de la muestra a

causa de la presencia de lípidos, proteínas y otras impurezas que se pueden adquirir cada vez que se realiza

el cambio de medio.

4.2. Evaluación de la influencia de la relación de fuentes de carbono y nitrógeno (C/N) presentes en

el medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de Kefiran

Ya que el suero cuenta con la gran ventaja de ser un subproducto de alto valor nutricional y bajo costo, se

desea aprovechar como sustrato microbiano. Para evaluar la influencia de la relación de las fuentes de

carbono y nitrógeno (C/N) presentes en el medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de Kefiran,

utilizando como sustrato suero, primero se debe realizar una caracterización de este. En cuanto a las fuentes

de carbono, se realiza una cuantificación de lactosa, puesto que, en la leche, los carbohidratos están

representados en su mayoría por lactosa [29], igualmente se cuantifica la glucosa y la galactosa. La

cuantificación de carbohidratos se lleva a cabo por medio de HPLC, con los parámetros mencionados en la

sección de metodología.

Para asegurar la eficiencia del método y la calidad de las curvas de calibración, en la Figura 8 se muestra la

cromatografía de las soluciones estándar de 1ppm de los azúcares a cuantificar. Se puede observar que la

separación de los tres analitos se da entre los 11 y 19 minutos, el minuto restante permite asegurar que los

componentes de la matriz eluyan de la columna entre cada inyección. Aunque se evidencia que las curvas de

la galactosa y la lactosa alcanzan a solaparse, el error no será significativo, por el área que se ve implicada.

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Adicionalmente, al analizar las curvas de calibración obtenidas (Anexo 2), se evidencia que todos los puntos

de referencia se acoplan a la regresión lineal realizada por el equipo, con respecto a la correlación obtenida,

para todos los estándares, esta supera los 0.99, confirmando la confiabilidad de los resultados [30].

Figura 8. Cromatografía de soluciones estándar de 1ppm de lactosa, glucosa y galactosa

La cuantificación de proteínas se realiza por medio del método de Bradford, en el cual, primero se debe

realizar una curva estándar de albúmina bovina (Figura 9). Gracias a la curva estándar es posible obtener una

ecuación de la regresión lineal de los puntos tenidos en cuenta para la misma. La confiabilidad de la curva es

dada por la correlación, la cual al superar los 0.99 asegura la confiabilidad del método.

Figura 9. Curva estándar de albúmina bovina

15


Para cuantificar las fuentes de carbono en el suero, se realizaron diluciones de 1:20 y 1:50 de cuatro muestras

de suero, obtenido en diferentes días, los resultados se pueden observar en la Tabla 4. Ya que se desea saber

en promedio, cual es la concentración de carbohidratos en el suero lácteo, se eliminan los valores

inconsistentes, obteniendo una concentración de lactosa de 49.96 ± 1.65 g/L, cabe resaltar que no se registró

la presencia de glucosa o galactosa en las muestras. Los valores inconsistentes pueden deberse a errores

durante la preparación de las diluciones. Teniendo en cuenta que el suero obtenido es dulce, ya que utiliza

enzimas para su coagulación, se desea comparar la concentración obtenida con la reportada en la literatura

[31], según la cual la concentración de lactosa en la leche está entre los 46 y 52 g/L.

Tabla 4. Resultados del HPLC para cuantificación de fuentes de carbono en el suero lácteo

Tres muestras de suero lácteo fueron caracterizas en cuanto las fuentes de nitrógeno (concentración de

proteínas). En la Tabla 5 se muestra los resultados para diferentes volúmenes tomados de muestra (10, 20,

30 y 40 μL).

Tabla 5. Resultados Bradford cuantificación de proteínas en suero lácteo

La concentración promedio de proteínas presente en el suero lácteo es de 1.82 ± 0.45 g/L. Al comparar la

concentración obtenida, con la reportada en la literatura (6-10 g/L) [31], se obtiene una diferencia

significativa, no obstante, las réplicas realizadas dan confianza de los resultados. Cabe aclarar que cada

volumen tomado es una réplica que se realiza ya que, para Bradford, solo es necesario tomar un volumen.

Igualmente, cada volumen fue replicado.

16


Teniendo la concentración de fuentes de carbono y nitrógeno definidas, se pudo determinar en qué medida

se enriquece el suero para cumplir con los requerimientos de la relación carbono nitrógeno definidos, en la

Tabla 6 se especifica el enriquecimiento necesario de cada medio a evaluar.

Tabla 6. Caracterización en cuanto a fuentes de carbono y nitrógeno de los medios evaluados

La evaluación de la influencia de la relación de fuentes de carbono y nitrógeno (C/N) presentes en el medio

de cultivo de los granos de kéfir, en su crecimiento se lleva a acabo durante 14 días, teniendo una cantidad

inicial de 16.5 gramos de granos. Para cada evaluación se realiza una réplica. Es importante mencionar, que

se deseaba comparar el crecimiento de los granos de kéfir y la producción del Kefiran, utilizando como

sustrato suero sin enriquecer, ya que al cuantificar las fuentes de nitrógeno y carbono la relación fue de 27.43.

Sin embargo, la disponibilidad de granos de kéfir era limitada, y no se podía realizar la comparación con los

resultados del objetivo anterior ya que el crecimiento se ve afectado directamente por la cantidad inicial de

bacterias, a mayor muestra, mayor incremento se presenta.

Figura 10. Incremento de la masa de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo

17


En la Figura 10 se muestra el incremento de masa de los granos de cultivo de los granos de kéfir. Se observa

que, a medida que disminuye la relación carbono nitrógeno, mayor será el incremento de masa de los granos.

Con una relación de C/N de 2:1 los granos de kéfir pueden incrementar su masa hasta en un 114% más que

con una relación de 40:1. Lo anterior, se debe a que el nitrógeno es uno de los principales componentes de

las células bacterianas, junto al carbono y al oxígeno, cumpliendo el rol de constituyente de proteínas, ácidos

nucleicos y coenzimas. Igualmente, dicho nutriente inorgánico, junto al fósforo son utilizados como fuentes

de energía y hacen parte de las reacciones químicas que se llevan a cabo en el metabolismo intracelular [32].

Por otro lado, si la relación C/N del medio de cultivo bacteriano es mayor que el demandado por las bacterias,

se tendrá eficiencias de crecimiento bajas. Una alta relación de C/P se relaciona con una rotación lenta de

productos primarios, y sólo un pequeño porcentaje de la producción primaria neta será consumida por las

bacterias [33].

Figura 11. Producción final de Kefiran con diferentes proporciones C/N del medio de cultivo de los granos de kéfir

Al evaluar la influencia de la relación C/N del medio de cultivo de los granos de kéfir en la producción de

Kefiran (Figura 11), se puede evidenciar que, con una relación de 2:1 se puede llegar a obtener hasta un 111%

más de Kefiran que con una relación de 40:1 y un 52% más que con una relación de 10:1. El incremento de

masa de los granos y la producción de Kefiran para las diferentes relaciones de C/N fueron de 4.47g y 1.2g,

3.57g y 0.79g, y 1.32g y 0.57g, para las relaciones 2:1, 10:1 y 40:1, respectivamente. Finalmente, en la

Figura 12 se presenta la cantidad obtenida de Kefiran en gramos por gramo de granos de kéfir. Como se

evidencia, a menor relación carbono-nitrógeno mayor será el porcentaje de Kefiran presente en los granos de

kéfir. Con una relación de 2:1 se logra obtener 0.05g de Kefiran por gramo de kéfir, mientras que con una

relación de 40:1 se obtiene 0.02 gramos.

18


Figura 12. Cantidad obtenida de Kefiran por gramo de granos de kéfir

Cabe mencionar que con ayuda del análisis termogravimétrico se pudo definir la cantidad de humedad

presente en las muestras de Kefiran, y teniendo en cuenta dicho porcentaje, se obtuvo la cantidad final total

de Kefiran (Tabla 7).

Tabla 7. Cantidad final de Kefiran teniendo en cuenta el porcentaje de humedad obtenida por medio de TGA

El Kefiran obtenido se caracterizó por medio de TGA, los resultados se graficaron junto a su derivada (Figura

13). Al observar los termogramas, se pueden distinguir dos regiones de pérdida de masa, la primera se da

entre 150 y 250°C, correspondiente a la evaporación del agua, y la segunda entre 280 y 350°C,

correspondiente a la degradación del polímero. Teniendo en cuenta el pico más alto de la derivada, se podría

decir que para el Kefiran obtenido a partir del cultivo con diferentes relaciones de C/N, son 306.74 ± 2.96°C,

310.53 ± 2.13°C, y 313.10 ± 0.24°C para las relaciones 2:1, 10:1 y 40:1, respectivamente.

19


Figura 13. TGA y curva derivada de TGA del Kefiran obtenido utilizando suero como sustrato y diferentes radios C/N del medio

4.3. Evaluación del crecimiento de los granos de kéfir cultivados en leche, suero lácteo, y suero lácteo

enriquecido en la producción de Kefiran

Finalmente, se desea comparar el incremento másico de los granos de kéfir cultivados durante 12 días en

leche, suero, y suero enriquecido satisfaciendo la relación C/N de 2:1. Se desea determinar si el suero lácteo,

producto de bajo costo y que generalmente es un desecho y potencial contaminante de recursos hídricos,

puede ser implementado como medio de cultivo de los granos. Igualmente, se desea establecer si

enriqueciendo el suero lácteo se puede llegar a tener un rendimiento igual o mejor en la producción de Kefiran

que con la leche. En la Figura 14 se muestran los resultados del incremento de la masa de los granos después

del cultivo de aproximadamente 9.35 gramos de granos de kéfir en los diferentes medios a evaluar. Como se

puede observar, aunque el cultivo en suero lácteo enriquecido no alcanza la eficiencia del cultivo en leche,

en cuanto al crecimiento de los granos, sí mejora considerablemente la calidad del suero como sustrato.

Comparado al suero solo, con el suero enriquecido de triptona (relación C: N de 2:1) se puede llegar a tener

un incremento de masa mayor en un 111%. Adicionalmente, cabe mencionar que, utilizando leche como

sustrato, se alcanza un crecimiento de los granos de un 2.68% más que con el suero enriquecido. Como se ha

mencionado, dicho valor hace del suero enriquecido un buen medio de cultivo de los granos de kéfir.

20


Figura 14. Incremento de masa de los granos de kéfir después de 12 días de cultivo utilizando diferentes tipos de medio

En la Figura 15 se muestra la producción de Kefiran a partir del cultivo de los granos de kéfir utilizando

diferentes tipos de sustrato. Observando los resultados, se evidencia que el suero enriquecido con una relación

de C/N de 2:1 es el mejor medio para la producción de Kefiran, llegando a producir un 61% más de Kefiran

en comparación al suero puro. Igualmente, con dicho medio se produjo un 13% más que con la leche,

haciendo del suero enriquecido un medio que aumenta significativamente la producción de Kefiran.

Figura 15. Producción final de Kefiran con diferentes tipos de medio de cultivo de los granos de kéfir

21


A pesar de que los granos de kéfir tienen un mayor incremento en su masa utilizando leche como sustrato,

con el suero enriquecido se obtiene una mayor producción de Kefiran, lo cual se atribuye a que con el suero

enriquecido de tiene mayor rendimiento. Como se puede observar en la Figura 16, el rendimiento obtenido

utilizando como medio de cultivo suero enriquecido con una relación de carbono nitrógeno de 2:1 es 53%

mayor que el obtenido utilizando leche como sustrato y un 53% mayor que utilizando suero puro.

Figura 16. Cantidad obtenida de Kefiran por gramo de granos de kéfir

Comparando los termogramas mostrados en la Figura 17, se distinguen las dos regiones características que

se vieron en los casos anteriores. La primera correspondiente a la evaporación del agua, entre 150 y 250°C,

y la segunda de la degradación del polímero, entre los 280 y 350°C. La temperatura de degradación del

polímero se puede tomar como la mayor temperatura alcanzada por la curva de la derivada, obteniendo para

el Kefiran producido a partir del cultivo de los granos en leche, en suero puro y el suero enriquecido con una

relación C/N de 2, de 315.39, 314.94 y 304.47°C, respectivamente.

A partir de la misma figura (Figura 17), se puede determinar que la pureza del producto no se ve afectada por

el tipo de medio que se utilice.

22


Figura 17. TGA y curva derivada de TGA del Kefiran obtenido utilizando diferentes tipos de medio

5. CONCLUSIONES

Factores como el tipo de medio, la frecuencia de cambio de medio y la relación entre las fuentes de carbono

y nitrógeno influyen de manera significativa en el crecimiento de los granos de kéfir, en la producción de

Kefiran y en el rendimiento. Con el presente trabajo se demostró que una aplicación del suero lácteo, que

cuenta con gran potencial, es su uso como sustrato microbiano. Evaluando la frecuencia de cambio de medio

de los granos, se obtuvo que con un periodo de 4 horas se obtiene hasta un 28% más de producción de Kefiran

que con un periodo de 24 horas. Sin embargo, el producto obtenido con un periodo de 4 horas tiene más

impurezas, requiriendo un proceso de purificación más exhaustivo.

Aunque el suero puro se puede utilizar como sustrato microbiano, su rendimiento es bajo en comparación a

la leche o al suero enriquecido con triptona como fuente de nitrógeno, donde la relación C/N sea baja, así

como una relación 2:1. El suero enriquecido puede llegar a producir una cantidad de Kefiran igual o mayor

a la producida a partir de leche como sustrato del cultivo de los granos. Adicional a esto se pudo evidenciar

que con la relación 2:1, se puede obtener mayor Kefiran por gramo de kéfir.

6. TRABAJO FUTURO

Como trabajo futuro se plantea realizar la réplica de la comparación del crecimiento de los granos de kéfir

utilizando diferentes sustratos como medios de cultivo. Igualmente, se espera aislar el Kefiran, determinar

qué tipo de medio permite un mayor rendimiento y caracterizarlo de modo que se puedan identificar

diferencias o similitudes en su estructura y pureza. Por otro lado, se espera evaluar el tiempo, el tipo de

23


sustrato y el peso inicial de los granos, para determinar cuál de estos tiene mayor influencia sobre el

crecimiento de los granos, producción de Kefiran y rendimiento (Diseño factorial).

Se podrían estudiar relaciones de carbono nitrógeno donde el exceso de nitrógeno se haga más evidente, es

decir una relación más pequeña, para determinar si se puede llegar a obtener una cantidad similar, o mayor

de Kefiran que la obtenida a partir del suero enriquecido con una relación C/N de 2.

Finalmente, ya que el tiempo de fermentación del medio que permite mejorar el crecimiento de los granos de

kéfir, como la producción de Kefiran, es de 4 horas, se podría diseñar un reactor semi-batch que permita

realizar el cambio de medio con dicha constancia y si necesidad de una manipulación manual.

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26


Anexos

Anexo 1. Crecimiento de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo con diferentes frecuencias de cambio de medio

Anexo 2. Curvas estándar HPLC de la glucosa, lactosa y galactosa

27


Anexo 3. Crecimiento de los granos de kéfir después de 14 días de cultivo con diferentes relaciones C/N del medio

.

Anexo 4. Crecimiento de los granos de kéfir después de 12 días de cultivo con diferente tipo de medio

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