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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
QUÍMICA FARMACÉUTICA
EVALUACIÓN DEL EFECTO NOOTRÓPICO DE LOS EXTRACTOS DE HOJAS Y
RAÍCES DE JÍCAMA (Smallanthus sonchifolius) CON MAYOR CONTENIDO DE
COMPUESTOS POLIFENÓLICOS
Trabajo de investigación previo a la obtención del título de Química Farmacéutica
Autor: Diana Carolina Estrella Romero
Tutor: Borja Espín Dayana Paulina
DMQ, JUNIO 2018
ii
DEDICATORIA
A mis padres Patricio y Laura, por el
inmenso amor que siempre me
demuestran, su apoyo incondicional, y
los consejos que han sabido brindarme
en el transcurso de mi vida.
A mis queridas hermanas Pauly y Paty
por su cariño, alegría, por estar
siempre a mi lado con palabras de
aliento, y abriéndome sus brazos
siempre que lo necesito.
Este trabajo de investigación es por
ustedes que son el pilar fundamental en
mi vida.
iii
AGRADECIMIENTO
A Dios por la vida, por darme fuerzas para seguir adelante, guiar siempre mis pasos, por poner
en mi camino a personas valiosas, y por todas las bendiciones derramadas sobre mí.
A mis adorados padres y hermanas por apoyarme en cada paso de mi vida profesional, por estar
ahí cuando más necesito su amor, su comprensión, ayuda, por nunca soltarme cuando las cosas
se ponen duras, y por motivarme a siempre hacer lo mejor, los amo.
A mis queridas abuelitas, tíos y primos, que siempre han estado pendientes de mi bienestar,
brindándome sabios consejos y deseándome lo mejor.
Mi agradecimiento especial a la Universidad Central del Ecuador, Facultad de Ciencias
Químicas, la cual me abrió sus puertas para formarme profesionalmente.
A mi tutora, Dra. Dayana Borja, por su tiempo, guía, paciencia y dedicación en el desarrollo
de este trabajo, agradecer también a los doctores Javier Santamaría y Fernando Novillo por
haberme brindado la oportunidad de recurrir a su capacidad y conocimiento, por su tiempo,
consejos y ayuda.
Mi sincero agradecimiento también va dirigido al propietario de la empresa “COTEG” el Ing.
Jaime Silva, y al Ing. Raúl Barragán que de forma desinteresada y con la mejor predisposición
han contribuido enormemente en la realización de esta investigación.
A mis grandes amigos Andreita y Pablito, con quienes he compartido alegrías y tristezas a lo
largo de estos años y me han brindado una maravillosa amistad, ¡son únicos!, y a las personas
que he ido conociendo a lo largo del camino y que de una forma u otra han estado ahí, gracias
por su apoyo y amistad.
iv
v
vi
vii
INDICE DE CONTENIDOS
Introducción .......................................................................................................................... 1
Capítulo I ............................................................................................................................... 3
El problema ........................................................................................................................... 3
Planteamiento del problema .............................................................................................. 3
Formulación del problema ................................................................................................ 4
Preguntas directrices ......................................................................................................... 4
Objetivos ........................................................................................................................... 5
Objetivo general. ........................................................................................................... 5
Objetivos específicos. ................................................................................................... 5
Justificación e Importancia. .............................................................................................. 5
Capitulo II ............................................................................................................................. 8
Marco teórico ........................................................................................................................ 8
Antecedentes de la investigación ...................................................................................... 8
Fundamento teórico ......................................................................................................... 10
Fundamento botánico y taxonómico ........................................................................... 10
Distribución geográfica ............................................................................................... 10
Hábitat ......................................................................................................................... 10
Descripción botánica ................................................................................................... 11
Composición química .................................................................................................. 11
Etnofarmacología y usos ............................................................................................. 12
Control de calidad de la materia prima ....................................................................... 13
viii
Identidad .................................................................................................................. 13
Pureza ...................................................................................................................... 14
Fundamento del Tamizaje Fitoquímico ...................................................................... 16
Metabolitos secundarios .......................................................................................... 16
Saponinas ................................................................................................................ 16
Taninos .................................................................................................................... 16
Terpenos y Esteroides ............................................................................................. 17
Glicósidos cardiotónicos ......................................................................................... 17
Alcaloides ................................................................................................................ 18
Antraquinonas ......................................................................................................... 18
Flavonoides ............................................................................................................. 19
Extracción. .................................................................................................................. 19
Generalidades. ......................................................................................................... 19
Métodos de obtención de extractos vegetales. ........................................................ 21
Compuestos polifenólicos ........................................................................................... 23
Generalidades .......................................................................................................... 23
Clasificación química .............................................................................................. 23
Propiedades y aplicaciones de los compuestos polifenólicos ................................. 25
Método de cuantificación de polifenoles. ............................................................... 26
Deterioro cognitivo leve (DCL). ................................................................................. 27
Nootrópicos. ................................................................................................................ 28
ix
Piracetam. .................................................................................................................... 28
Mecanismo de acción. ............................................................................................. 29
Farmacocinética. ..................................................................................................... 29
Contraindicaciones y precauciones. ........................................................................ 30
Reacciones adversas. ............................................................................................... 30
Ginkgo biloba .............................................................................................................. 31
Experimentación animal. ............................................................................................. 33
Normas éticas en el manejo de los animales. .......................................................... 33
Ratón de laboratorio (Mus musculus). .................................................................... 34
Taxonomía. .............................................................................................................. 34
Comportamiento del ratón. ...................................................................................... 35
Pruebas para evaluar la actividad nootrópica en ratones. ........................................... 35
Laberinto acuático de Morris. ................................................................................. 36
Laberinto radial. ...................................................................................................... 36
Fundamentación Legal .................................................................................................... 37
Hipótesis .......................................................................................................................... 39
ETAPA I ...................................................................................................................... 39
ETAPA II .................................................................................................................... 39
Sistema de variables ........................................................................................................ 39
ETAPA I ...................................................................................................................... 39
ETAPA II .................................................................................................................... 40
x
Capítulo III .......................................................................................................................... 41
Metodología de Investigación ............................................................................................. 41
Diseño de la Investigación .............................................................................................. 41
Materiales y Métodos ...................................................................................................... 42
Métodos experimentales. ................................................................................................. 43
Control de calidad del material vegetal. ...................................................................... 43
Identidad. ................................................................................................................. 44
Pureza. ..................................................................................................................... 44
Tamizaje fitoquímico. ................................................................................................. 44
Preparación de las muestras. ....................................................................................... 45
Obtención del Extracto. ............................................................................................... 45
Maceración. ............................................................................................................. 45
Expresión. ................................................................................................................ 46
Cuantificación de polifenoles totales .......................................................................... 46
Actividad nootrópica de los extractos de jícama (Smallanthus sonchifolius) ............. 46
Método 1. Laberinto Acuático de Morris. ............................................................... 47
Método 2. Laberinto Radial de 8 brazos. ................................................................ 48
Diseño experimental ........................................................................................................ 51
ETAPA I ...................................................................................................................... 51
ETAPA II .................................................................................................................... 51
Matriz de operacionalización de variables .................................................................. 53
xi
Técnicas de procesamiento de datos ........................................................................... 53
Capitulo IV .......................................................................................................................... 54
Análisis e interpretación de resultados ................................................................................ 54
Caracterización taxonómica. ........................................................................................... 54
Control de calidad del material vegetal. .......................................................................... 54
Identidad. ..................................................................................................................... 54
Pureza. ......................................................................................................................... 56
Determinación del contenido de polifenoles totales ....................................................... 60
Evaluación de la actividad nootrópica de Smallanthus sonchifolius .............................. 63
Análisis Estadístico de la actividad nootrópica ........................................................... 64
Método 1. Laberinto Acuático de Morris. ............................................................... 64
Método 2. Laberinto Radial de ocho brazos ........................................................... 67
Análisis de pesos ............................................................................................................. 70
Capítulo V ........................................................................................................................... 72
Conclusiones y Recomendaciones ...................................................................................... 72
Bibliografía ......................................................................................................................... 74
ANEXOS ............................................................................................................................. 83
xii
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1. Estructura de ácidos fenólicos identificados en hojas y raíces de jícama ... 12
Ilustración 2. Clasificación de los métodos de obtención de extractos vegetales ............. 21
Ilustración 3. Clasificación química de los polifenoles, con su estructura química .......... 24
Ilustración 4. Mecanismo del reactivo de Folin Ciocalteu ................................................ 27
Ilustración 5. Estructura química de Piracetam ................................................................. 29
Ilustración 6. Placa cromatográfica de los extractos de hojas y raíces por maceración y
expresión .................................................................................................................................. 55
Ilustración 7. Curva de calibración del estándar de ácido gálico a concentraciones de 0,1 -
1,3 mg/ml ................................................................................................................................. 60
Ilustración 8. Comportamiento de los grupos de estudio durante los días de prueba ........ 66
Ilustración 9. Número de elecciones incorrectas durante los días de prueba .................... 69
Ilustración 10. Pesos de ratones machos durante 7 semanas de prueba ............................ 71
Ilustración 11. Pesos de ratones hembra durante 7 semanas de prueba ............................ 71
xiii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Ensayo fitoquímico para la determinación de metabolitos secundarios. ............. 45
Tabla 2. Diseño Experimental - Etapa I ............................................................................. 51
Tabla 3. Diseño experimental – Etapa II ............................................................................ 52
Tabla 4. Matriz de Operacionalización de Variables ......................................................... 53
Tabla 5. Valores de Rf de muestras y estándar de ácido clorogénico en hojas y raíces de
jícama por maceración y expresión.......................................................................................... 56
Tabla 6. Porcentaje de cenizas totales en hojas de jícama ................................................. 56
Tabla 7. Porcentaje de cenizas totales en raíces de jícama ................................................ 57
Tabla 8. Porcentaje de humedad en hojas de jícama .......................................................... 57
Tabla 9. Porcentaje de humedad en raíces de jícama ......................................................... 58
Tabla 10. Resultados del tamizaje fitoquímico en hojas y raíces de S. sonchifolius. ........ 59
Tabla 11. Lecturas para la curva de calibración, Absorbancia vs Concentración de ácido
gálico ........................................................................................................................................ 60
Tabla 12. Lecturas de absorbancia de los extractos de hojas y raíces de S. sonchifolius por
maceración y expresión............................................................................................................ 61
Tabla 13. Concentración de polifenoles en hojas y raíces por maceración y expresión .... 61
Tabla 14. Datos generales del análisis estadístico de polifenoles ...................................... 62
Tabla 15. Resultados para el Análisis de Varianza ............................................................ 62
Tabla 16. Test de comparaciones múltiples ....................................................................... 63
Tabla 17. Prueba de Duncan al 5 % para tratamientos ....................................................... 63
Tabla 18. Volumen de sustancias por administrar a ratones de prueba ............................. 64
Tabla 19. Datos generales, laberinto acuático de Morris ................................................... 65
Tabla 20. Resultados para análisis de varianza, laberinto acuático ................................... 65
Tabla 21. Prueba de Duncan al 5 % para los extractos en estudio ..................................... 66
xiv
Tabla 22. Datos generales, laberinto radial de ocho brazos ............................................... 67
Tabla 23. Resultados para análisis de varianza, laberinto radial ........................................ 68
Tabla 24. Prueba de Duncan al 5 % para los extractos en estudio ..................................... 68
Tabla 25. Pesos de los ratones durante las 7 semanas de prueba ....................................... 70
xv
EVALUACIÓN DEL EFECTO NOOTRÓPICO DE LOS EXTRACTOS DE HOJAS Y
RAÍCES DE JÍCAMA (Smallanthus sonchifolius) CON MAYOR CONTENIDO DE
COMPUESTOS POLIFENÓLICOS
Autor: Diana Carolina Estrella Romero
Tutor: Borja Espín Dayana Paulina
Resumen
El propósito del presente trabajo fue evaluar el efecto nootrópico de los extractos, de hojas y
raíces de jícama (Smallanthus sonchifolius), que presentaron mayor contenido de compuestos
polifenólicos. Inicialmente se realizó la identificación y caracterización botánica, así como
también de algunas pruebas para garantizar la calidad de la especie vegetal, como contenido de
cenizas, humedad y el perfil cromatográfico. Los grupos de Productos Naturales identificados
cualitativamente, mediante tamizaje fitoquímico en hojas y raíces, fueron alcaloides,
flavonoides, taninos y antraquinonas. El contenido de polifenoles cuantificado por el método
de Folin Ciocalteu de los extractos por expresión y maceración de hojas y raíces fue de 0,62;
0,26; 1,12 y 1,08 [EAG/ml de extracto] respectivamente. Con los extractos de hojas y raíces
obtenidos por maceración se procedió a evaluar el efecto nootrópico en 24 ratones Mus
musculus divididos en 4 grupos de 6 ratones cada uno, control negativo (agua), control positivo
(Ginkgo biloba), extracto de hojas por maceración y extracto de raíces por maceración a dosis
de 30mg/kg, después de la administración diaria durante 28 días se realizaron las pruebas
usando dos métodos el laberinto acuático de Morris y laberinto radial de ocho brazos. Los
resultados indicaron que los ratones que fueron administrados el extracto de raíces obtenido
por maceración presentan una mejor memoria espacial en comparación con los otros grupos de
estudio.
Palabras Clave: Smallanthus sonchifolius, POLIFENOLES, EFECTO NOOTRÓPICO.
xvi
EVALUATION OF THE NOOTROPIC EFFECT OF THE EXTRACTS OF LEAVES
AND ROOTS OF JICAMA (Smallanthus sonchifolius) WITH GREATER CONTENT
OF POLYPHENOLIC COMPOUNDS
Autor: Diana Carolina Estrella Romero
Tutor: Borja Espín Dayana Paulina
Abstract
The purpose of the present work was to evaluate the nootropic effect of the extracts, leaves
and roots of jicama (Smallanthus sonchifolius), which presented a higher content of
polyphenolic compounds. For which initially the identification, botanical characterization, and
tests were carried out to guarantee the quality as determination of ashes, humidity and
chromatographic profile. The secondary metabolites identified qualitatively by phytochemical
screening on leaves and roots were alkaloids, flavonoids, tannins and anthraquinones. The
content of polyphenols quantified by the Folin Ciocalteu method of the extracts by expression
and maceration of leaves and roots was 0,62; 0,26; 1,12 and 1,08 [EAG/ml] respectively. With
the extracts of leaves and roots obtained by maceration, the nootropic effect was evaluated in
24 Mus musculus mice divided into 4 groups of 6 mice each, negative control (water), positive
control (Ginkgo biloba), leaf extract by maceration and root extract by maceration at a dose of
30mg/kg, after daily administration for 28 days the tests were carried out using two methods,
the Morris water labyrinth and the eight-arm radial labyrinth. The results indicated that the
mice that were administered the root extract obtained by maceration presented a better spatial
memory compared to the other study groups.
Keywords: Smallanthus sonchifolius, POLYPHENOLES, NOOTROPIC EFFECT
1
Introducción
El objetivo del presente trabajo de investigación fue evaluar el efecto nootrópico de los extractos
de hojas y raíces de jícama, Smallanthus sonchifolius, que presentaron mayor contenido de
compuestos polifenólicos. Numerosas evidencias sugieren que una dieta rica en polifenoles tiene la
capacidad de mitigar el daño celular, inducido por la producción de radicales libres de oxígeno, con las
actividades diarias el cerebro tiene un gran desgaste energético generando gran cantidad de
estos radicales.
En el primer capítulo de este documento se detalla el planteamiento del problema en donde
se explica la problemática que conlleva a realizar esta investigación; la formulación del
problema; justificación, en donde se expone la importancia que tiene esta investigación para el
bien de la población e implementación de nuevas alternativas terapéuticas.
En el segundo capítulo se presenta el marco teórico, donde se detallan investigaciones
realizadas anteriormente y se enlistan los diferentes temas y subtemas que conforman los
objetos del tema de estudio. También se presenta las definiciones de las variables y los
reglamentos de seguridad que rigen en el país.
En el tercer capítulo, se encuentra el Marco Metodológico, se describe el procedimiento
seguido para desarrollar el trabajo de investigación, que paradigma, el nivel y qué tipo de
investigación se utilizó. Además de esto, se describe los métodos y materiales que se utilizaran
en la experimentación. También se mencionan las variables con sus dimensiones e indicadores
mediante la matriz de operacionalización de variables.
En el cuarto capítulo se detalla el análisis y discusiones de resultados en el cual se incluye
el desarrollo del diseño experimental donde se encuentran las tablas de ANOVA para el
contenido de compuestos polifenólicos, y los tiempos de latencia las cuales fueron realizas en
2
el programa SEDEX V1.0; también se encuentra la curva de calibración, resultados del control
de calidad realizados e interpretación de estos.
En el quinto capítulo se encuentra conclusiones y recomendaciones del trabajo de
investigación donde las sustancias de prueba si presentan efecto en el comportamiento de los
ratones tanto en su aprendizaje y memoria espacial.
3
Capítulo I
El problema
Planteamiento del problema
El deterioro cognitivo es la alteración de las facultades intelectuales de la persona, entre las
que destaca, el deterioro de la orientación, la memoria, la atención, el aprendizaje, el
razonamiento, el cálculo, el lenguaje y la capacidad de realizar tareas complejas constituye uno
de los principales problemas de los ancianos, aunque cada día es frecuente en personas jóvenes
lo cual es preocupante (Díaz, 2011).
Los nootrópicos o también llamadas drogas inteligentes, son fármacos que actúan sobre las
capacidades cognitivas mejorando la capacidad de aprendizaje, la memoria, la atención,
reforzando las formas de comportamiento aprendidas y la motivación (Cristina Lanni, 2008).
Existe una extensa gama de estimulantes farmacéuticos de origen sintético para optimizar la
capacidad mental, los cuales tienen una acción más específica, pero causa efectos secundarios
como trastornos del sistema nervioso central y periférico, alteraciones metabólicas y
nutricionales, alteraciones psiquiátricas y al reducir la dosis una descomposición general.
Los Productos Naturales de uso medicinal nos ofrecen alternativas para mejorar las
habilidades cognitivas, disminuyendo los efectos secundarios mencionados, con la ventaja de
que tienen cierta demanda, además, que la disponibilidad en el mercado de las plantas
medicinales es alta pero la mayoría no cuentan con estudios in vivo que garanticen sus efectos
terapéuticos.
Ecuador está considerado como uno de los 17 países donde está concentrada la mayor
biodiversidad del planeta. Su amplia gama de climas en sus cuatro regiones ha dado lugar al
nacimiento de miles de especies de flora y fauna en medio de extensos territorios naturales.
Tiene un 10 por ciento de todas las especies de plantas que hay en el planeta. De este porcentaje,
4
la mayor cantidad crece en la cordillera de los Andes, en la zona noroccidental, donde se calcula
que hay aproximadamente 10 mil especies (Ministerio de Turismo, 2015).
Por lo anteriormente expuesto existe un creciente interés en las plantas cultivadas en la
región Andina de Ecuador, en la búsqueda de nuevas alternativas para el tratamiento y
prevención del deterioro cognitivo, evaluando el efecto nootrópico de plantas que presentan
compuestos antioxidantes y en las que exista evidencia documentada de no tener efectos
nocivos, como es la jícama Smallanthus sonchifolius. (Genta, 2005) (Olaciregui, y otros, 2009)
Formulación del problema
¿Cómo influye el material vegetal utilizado (hojas y raíces) de S. sonchifolius y el método
de extracción, en la cuantificación de fenoles totales, para la evaluación del efecto nootrópico
en ratones Mus musculus por los métodos de laberinto acuático de Morris y laberinto radial de
ocho brazos?
Preguntas directrices
- ¿Corresponde la planta obtenida a Smallanthus sonchifolius?
- ¿Qué método de extracción es el mejor para favorecer la obtención de compuestos
fenólicos?
- ¿Qué cantidad de compuestos fenólicos, se obtienen en las hojas y raíces de los
extractos de jícama, Smallanthus sonchifolius?
- ¿Cuáles son las características fitoquímicas de Smallanthus sonchifolius?
- ¿Qué modelos se aplicarán para determinar el efecto nootrópico en ratones Mus
musculus y sobre que estándar será comparable?
5
Objetivos
Objetivo general.
Evaluar el efecto nootrópico de los extractos de hojas y raíces de jícama (Smallanthus
sonchifolius) con mayor contenido de compuestos polifenólicos.
Objetivos específicos.
a) Realizar la investigación farmacobotánica y fitoquímica de los extractos de las hojas
y raíces de Smallanthus sonchifolius.
b) Generar especificaciones de la droga vegetal, aplicables al control de calidad.
c) Realizar la extracción por maceración y por expresión de las hojas y raíces de
Smallanthus sonchifolius y determinar el contenido de polifenoles totales mediante
el método de Folin-Ciocalteu.
d) Evaluar el efecto nootrópico en los extractos con mayor concentración de
compuestos polifenólicos por el método de laberinto acuático de Morris y laberinto
radial en ratones de la especie Mus musculus, y comparar con el estándar de Ginkgo
biloba.
Justificación e Importancia.
En la actualidad, la combinación de factores ambientales y genéticos ha incrementado la
prevalencia de enfermedades neurodegenerativas. Perder objetos con frecuencia, no recordar
el nombre de alguien que se acaba de conocer o hasta olvidarse de las actividades diarias,
podrían ser síntomas de un deterioro cognitivo (Navarro, 2007). En el Ecuador en el año 2009
se presentó un deterioro cognitivo en personas mayores a 60 años del 16,3 % en hombres y
25,7 % en mujeres (INEC, 2009).
Según datos de la Organización Mundial de la Salud, en el mundo entero hay unos
47,5 millones de personas que padecen demencia, y cada año se registran 7,7 millones de
nuevos casos. La enfermedad de Alzheimer es la causa de demencia más común y acapara entre
6
el 60 % a 70 % de los casos. También establece que la demencia es un síndrome generalmente
de naturaleza crónica o progresiva caracterizado por el deterioro de la función cognitiva, más
allá de lo que se podría considerar una consecuencia del envejecimiento normal. La demencia
afecta a la memoria, el pensamiento, la orientación, la comprensión, el cálculo, la capacidad de
aprendizaje, el lenguaje y el juicio, sin afectar la conciencia (OMS, 2016).
Los costos originados por trastornos cognitivos y demencias son significativos para los
sistemas de salud, según guías nacionales e internacionales, los fármacos recomendados para
su tratamiento son donepecilo, galantamina, rivastigmina, memantina y noótropos sintéticos
como el piracetam que es el medicamento con mayor difusión dentro de este grupo (MSP,
2008). Sin embargo, el empleo excesivo de estas sustancias puede afectar de manera negativa
al individuo cuando su uso prolongado y desordenado termina en dependencia del fármaco o
efectos adversos que pueden llegar a ser trastornos del sistema nervioso central y periférico,
alteraciones metabólicas y nutricionales, además de alteraciones psiquiátricas, otros efectos
menos frecuentes son: trastornos del ritmo cardiaco, síncopes, mareo, confusión, insomnio,
cefalea y calambres musculares (Silanes, 2012).
Teniendo en cuenta los inconvenientes provocados por los nootrópicos de origen sintético,
los fitofármacos toman especial interés en el tratamiento del deterioro cognitivo produciendo
menos efectos secundarios y una eficacia moderada en comparación con los fármacos.
Diversos estudios epidemiológicos in vitro e in vivo indican que el consumo de alimentos
ricos en polifenoles reduce el riesgo de neurodegeneración y también del declive cognitivo
asociado a la edad. El cerebro en su actividad tiene un gran desgaste energético ya que consume
mucho oxígeno, durante el proceso oxidativo genera gran cantidad de radicales libres que
dañan las células, los antioxidantes son sustancias que protegen a la célula frente a la acción de
los oxidantes o radicales libres, contrarrestando su efecto nocivo (Perón, 2001) (Schaffer,
2007).
7
En la actualidad existe una gran tendencia a la suplementación alimenticia con antioxidantes
y polifenoles para contrarrestar la acción de los radicales libres y el estrés oxidativo. Una gran
alternativa es la jícama, siendo más conocida y utilizada en el tratamiento de la diabetes, los
extractos acuosos de las hojas han demostrado tener efectos hipoglicemiantes, además de
poseer capacidad antioxidante y antimicrobiana. A la raíz se la considera como alimento
prebiótico e hipocalórico, lo cual es debido a su contenido de fructooligosacáridos (FOS),
compuestos que no pueden ser hidrolizados por las enzimas digestivas de los humanos.
Comparado con otras raíces tuberosas, la jícama contiene una alta concentración de
polifenoles, aproximadamente 200 mg/100 g de peso húmedo, este valor es importante porque
algunas bebidas consideradas ricas en compuestos fenólicos tienen cantidades similares: Café
(200-500 mg/taza), té (150-200 mg/taza) y vino tinto (200-800 mg/taza) (Almeida, Abranches,
& Luces, 2013).
Este ha sido el motivo para que la jícama, Smallanthus sonchifolius, sea de interés de estudio
para el deterioro cognitivo.
8
Capitulo II
Marco teórico
Antecedentes de la investigación
Las investigaciones señaladas a continuación hacen referencia a estudios realizados sobre
los métodos de extracción, identificación de compuestos polifenólicos en las raíces y hojas de
jícama, así como también de estudios sobre la actividad de los polifenoles.
“Extracción e identificación de antioxidantes en las raíces de Yacón (Smallanthus
sonchifolius)”, Xiaojun Yan, Masahiro Suzuki, Mayumi Ohnishi-Kameyama, Yasutoshi Sada,
Tateo Nakanishi, and Tadahiro Nagata, Japón, 1999.
En el estudio del extracto metanólico de las raíces frescas de yacón, mediante el ensayo de
1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), se aislaron y caracterizaron los metabolitos secundarios
con actividad antioxidante.
Dos de los principales antioxidantes que fueron identificados, como son el ácido clorogénico
y triptófano, mediante RMN y espectrometría de masas. El contenido de ácido clorogénico en
yacón fue 48,5 ± 12,9 μg/g y triptófano, 14,6 ± 7,1 μg/g, obtenido a partir de seis raíces de
yacón cultivadas en diferentes lugares.
“Investigación de ácidos fenólicos en hojas y tubérculos de yacón (Smallanthus
sonchifolius)”, Breda Simonovska, Irena Vovk, Samo Andrenšek, Katerina Valentová, Jitka
Ulrichová, Republica Checa, 2003.
En esta publicación se contribuyó a la clarificación de la composición química de las hojas
y tubérculos de Yacón, especialmente en relación con los compuestos con actividad
antioxidante.
El tamizaje cromatográfico en capa fina (TLC) de extractos crudos de hojas secas y
tubérculos de yacón y productos de hidrólisis ácida del tubérculo sobre las placas HPTLC de
gel de sílice demostró la presencia de ácido clorogénico, cafeico y ferúlico.
9
Estos ácidos dieron una contribución significativa a la actividad de eliminación de radicales
detectado directamente sobre la placa de TLC rociada con 1,1-difenil-2-picrilhidrazil.
“Componentes de una dieta mediterránea y su impacto en las funciones cognitivas en el
envejecimiento”, Sebastian Huhn, Shahrzad Kharabian Masouleh, Michael Stumvoll, Arno
Villringer, and A. Veronica Witte, Alemania, 2015.
En esta investigación se resumieron los beneficios para la salud de la dieta mediterránea y
se evaluaron los estudios disponibles sobre el efecto de los polifenoles derivados de la dieta o
suplementarios, tales como el resveratrol (RSV), sobre el rendimiento cognitivo y la estructura
cerebral en modelos animales y estudios humanos.
Dentro de la publicación tratan sobre el impacto de los polifenoles en el cerebro. Varios
polifenoles incluyendo RSV eliminan una multitud de ROS (Especies Reactivas de Oxigeno),
estos se consideran tóxicos y se supone que el daño celular que producen contribuye al proceso
de envejecimiento. Además, señalan que se ha demostrado que en las ratas los polifenoles
aumentan la expresión de la proteína de choque térmico (HSP) 70 y la expresión del factor de
crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) en el hipocampo, lo que protege contra el daño celular,
beneficia el aprendizaje y el rendimiento de memoria.
“Modulación de la plasticidad del hipocampo y el comportamiento cognitivo por la
suplementación a corto plazo del arándano en ratas envejecidas”, GEMMA
CASADESUS, BARBARA SHUKITT-HALE, HEATHER M. STELLWAGEN, XIONGWEI
ZHU, HYOUNG-GON LEE, MARK A. SMITH and JAMES A. JOSEPH, USA, 2004.
El propósito de este artículo fue examinar si la neurogénesis, los factores de crecimiento y
la proteína quinasas activadas por mitógenos, están asociadas, en combinación o de forma
sinérgica con las mejoras del comportamiento cognitivo por la suplementación de arándanos
en ratas. Anteriormente, se demostró que la disminución de la memoria espacial relacionada
con la edad se puede mejorar por las dietas ricas en antioxidantes que contienen arándanos.
10
Sus resultados demostraron que todos estos parámetros de la plasticidad neuronal del
hipocampo se incrementan en los animales que estuvieron alimentados con arándanos.
Por lo tanto, las mejoras cognitivas proporcionadas por las frutas ricas en polifenoles
parecen, en parte, mediadas por sus efectos sobre la plasticidad del hipocampo.
Fundamento teórico
Fundamento botánico y taxonómico
Nombre científico: Smallanthus sonchifolius
Familia: Asteraceae
Nombre común: Jícama o Yacón
Sinónimos: Polymnia edulis
Polumnia sonchifolia (Tropicos org., 2017)
Distribución geográfica
Es una planta originaria de la región andina, se distribuye desde Venezuela hasta el noroeste
argentino. En Ecuador, se encuentra distribuida en las provincias de Carchi, Pichincha,
Cotopaxi, Tungurahua, Bolívar, Chimborazo, Cañar, Azuay y Loja (INIAP, 2007).
Hábitat
En nuestro país, esta especie se cultiva desde los 2100 hasta los 3000 msnm, a lo largo de
la Ceja Andina, zona en que la que esta familia es la más representativa. Crece en un amplio
rango de suelos, con mejores rendimientos en suelos ricos y bien drenados. Puede encontrarse
asociada con otros cultivos indígenas típicos de este piso altitudinal, como son el melloco, la
mashua y la oca (Barrera, Tapia, & Monteros, 2004).
Smallanthus sonchifolius es una planta que crece en un rango óptimo de temperatura de 18
a 25°C y que no requiere de fertilizantes, pesticidas ni mayores cuidados (Arnao, Seminario,
Cisneros, & Trabucco, 2011).
11
Descripción botánica
Es una planta herbácea perenne que puede multiplicarse por semillas o rizomas. Forma un
sistema radical muy ramificado del que salen tallos aéreos cilíndricos que alcanzan 1,5 m de
alto.
Las hojas: son de forma variable, pinnatífidas en la base de los tallos, triangulares en la
parte apical (Barrera, Tapia, & Monteros, 2004).
Las inflorescencias tienen cinco brácteas verdes, triangulares y agudas; las flores externas
están provistas de lígulas largas, de entre 10 mm y 15 mm de longitud, amarillas o anaranjadas,
recortadas en el ápice, mientras que las centrales son tubulares y de unos 8 mm de largo.
Las raíces son irregulares o fusiformes y desarrollan masas ramificadas en la base de la
planta, externamente son de color purpura, la parte interna es carnosa. El peso de los tubérculos
puede variar de 50 a 1000 g y una planta puede producir un promedio entre 2 y 4 Kg de raíz
(Gusso, Mattanna, & Richards, 2015).
Composición química
Las hojas y raíces son comestibles y altamente nutritivas. Contienen carbohidratos,
proteínas, lípidos, minerales, fibra y azucares. Entre los componentes bioactivos presentes en
la jícama, se destacan los fructanos, del tipo inulina que son azucares no calóricos (INIAP,
2007).
Estudios fitoquímicos realizados en las hojas, tallos y raíces de jícama se encontraron
metabolitos secundarios como los esteroles, los sesquiterpenos, flavonoides como la quercetina
(INIAP, 2007).
12
Yan, Suzuki, & Ohnishi-Kameyama, investigaron el contenido fenólico de las raíces de
jícama, encontrando que contienen dos compuestos antioxidantes principales, identificados
como ácido clorogénico, ácido cafeico y ácido ferulico.
(Simonovska, Vovk, Andrensk, Valentová, & Ulrichová, 2003)
Etnofarmacología y usos
Las raíces de jícama fresca se consumen como fruta, las hojas pueden ser utilizadas como
una verdura en la preparación de sopas y ensaladas (INIAP, 2007).
La jícama es un recurso vegetal valorado por sus propiedades nutricionales y medicinales y
ha concitado interés su uso en el tratamiento de la diabetes, pues los extractos acuosos de las
hojas han demostrado tener efectos hipoglicemiantes, además de poseer capacidad antioxidante
y antimicrobiana.
Las actividades biológicas demostradas en la jícama están vinculadas a la presencia de
fructooligosacáridos (FOS) compuestos que no pueden ser hidrolizados por las enzimas
digestivas de los humanos.
A la raíz se la considera como alimento prebiótico, estimulante del desarrollo de
lactobacilos, incrementa la absorción de Ca y Mg, reduce los triglicéridos e hipocalórico.
La actividad antioxidante es atribuida a la presencia de compuestos fenólicos (Grau,
Kortsarz, Sánchez, Genta, & Catalán., 2007).
Ilustración 1. Estructura de ácidos fenólicos identificados en hojas y raíces de jícama
13
Control de calidad de la materia prima
Según (Waksman de Torres, Ramírez-Durón, & Salazar-Cavazos, 2015) es un proceso
múltiple que debe cubrir todas las etapas, desde el cultivo del material vegetal hasta el control
del producto terminal y la evaluación de su estabilidad y calidad a lo largo del tiempo. En
general, el control de calidad se basa en tres importantes definiciones: identidad, pureza y
contenido.
El análisis de los parámetros para el control de calidad se siguió según los lineamientos de
la Organización Mundial de la Salud.
Identidad
Los materiales provenientes de plantas medicinales se clasifican de acuerdo con sus
características sensoriales, macroscópicas, microscópicas y es importante también agregar el
perfil cromatográfico. Estos ensayos para confirmar la identidad de la planta o droga dan una
idea de su conservación, y detectar posibles adulteraciones o falsificaciones. (Secretaría de
Salud, 2013)
Análisis macroscópico
La identidad macroscópica de los materiales vegetales medicinales se basa en la forma,
tamaño, color, características superficiales, textura, características de fractura y aspecto de la
superficie cortada. Sin embargo, puesto que estas características se juzgan subjetivamente y los
sustitutos o adulterantes pueden parecerse mucho al material genuino, a menudo es necesario
corroborar los hallazgos mediante microscopía y / o análisis fisicoquímicos.
14
Perfil cromatográfico
Cromatografía en capa fina
La cromatografía es un poderoso método de separación que tiene aplicaciones en todas las
ramas de la ciencia, se define como un procedimiento mediante el cual se separan solutos por
un proceso dinámico de migración diferencial en un sistema que consta de dos o más fases, una
de las cuales se mueve continuamente en una dirección dada y en la que sustancias individuales
presenta diferentes movilidades a causas de diferencias de adsorción, partición, solubilidad,
presión de vapor, tamaño molecular o densidad de carga iónica. Las sustancias individuales así
separadas se pueden identificar o de terminar mediante procedimientos analíticos.
En la cromatografía en capa delgada, el adsorbente es una capa relativamente delgada y
uniforme de material seco, reducido a polvo fino, que se aplica sobre una lámina o placa de
vidrio, plástico o metal, las que se utilizan más comúnmente son las de vidrio.
La identificación presuntiva se puede efectuar mediante la observación de las manchas o
zonas con valores de Rf idénticos y de magnitud aproximadamente igual, obtenidos
respectivamente cromatografiando una muestra desconocida y una muestra de referencia en la
misma placa.
Una comparación visual del tamaño o intensidad de las manchas o zonas puede servir para
una estimación semicuantitativa. Las mediciones cuantitativas se pueden efectuar mediante
densitometría (mediciones de absorbancia o de fluorescencia) o bien pueden retirarse
cuidadosamente las machas de la placa, luego eluirse con un disolvente adecuado y medirse
espectrofotométricamente.
Pureza
Está íntimamente ligada con la seguridad de las drogas y se refiere a la presencia de
contaminantes como material extraño o metales pesados, contaminación microbiana,
15
aflotoxinas, radioactividad y residuos de pesticidas que deben estar ausentes o por debajo de
ciertos umbrales previamente establecidos (Waksman de Torres, Ramírez-Durón, & Salazar-
Cavazos, 2015).
Determinación de cenizas
Representan el contenido en sales minerales o en materia inorgánica de la droga. En
condiciones rigurosas, es constante y nos permite descubrir falsificaciones por otras drogas,
tierras u otros minerales.
El método de determinación de cenizas totales está diseñado para medir la cantidad total de
material que queda después del encendido. Esto incluye tanto "ceniza fisiológica", que se
deriva del propio tejido vegetal, y ceniza "no fisiológica", que es el residuo de la materia
extraña (por ejemplo, arena y tierra) adherida a la superficie de la planta (World Health
Organization, 1998).
Determinación de humedad
Un exceso de agua en las plantas medicinales estimulará el crecimiento microbiano, la
presencia de hongos o insectos y el deterioro después de la hidrólisis. Deben establecerse
límites para el contenido de agua para cada material vegetal. Esto es especialmente importante
para materiales que absorben humedad fácilmente o deterioran rápidamente en presencia de
agua.
16
Fundamento del Tamizaje Fitoquímico
Metabolitos secundarios
Los vegetales, las plantas, organismos autótrofos, además del metabolismo primario
presente en todos los seres vivos, poseen un metabolismo secundario que les permite producir
y acumular compuestos de naturaleza química diversa. Estos compuestos derivados del
metabolismo secundario se denominan metabolitos secundarios, se distribuyen
diferencialmente entre grupos taxonómicos y presentan propiedades biológicas. Muchos
desempeñan funciones ecológicas y se caracterizan por sus diferentes usos y aplicaciones como
medicamentos, insecticidas, herbicidas, perfumes o colorantes, entre otros. Reciben también la
denominación de productos naturales (Zeiger, 2006).
El tamizaje fitoquímico se realizó a través de reacciones químicas de identificación,
mediante cambios de color o formación de precipitados para determinar la presencia cualitativa
de metabolitos secundarios como: saponinas, taninos, esteroides, glucósidos cardiacos,
alcaloides, flavonoides, antraquinonas, lactonas.
Saponinas
Son glicósidos cuya aglicona consiste en un núcleo esteroidal o triterpénico; esta
característica estructural les confiere un carácter anfótero que les permite actuar como
tensioactivos. Aprovechando esta propiedad, las dos pruebas más empleadas en la detección
de saponinas son la de hemólisis y la de formación de espuma, puesto que al ser tensioactivas
las saponinas inestabilizan la membrana celular de los eritrocitos, induciendo su ruptura
(Carvajal, 2009).
Taninos
Están constituidos por un amplio grupo de compuestos hidrosolubles con estructura
polifenólica. Estos polifenoles tienen la propiedad de unirse a ciertas macromoléculas como
proteínas, alcaloides, celulosa, gelatina y precipitarlas. Esta capacidad es la base de sus dos
17
propiedades principales, su capacidad de curtir la piel y su poder astringente, tales propiedades
condicionan su uso (Kuklinski, 2003).
Estos compuestos al igual que los compuestos fenólicos precipitan en presencia de cloruro
férrico, esta respuesta se debe al ataque producido por el ion cloruro al hidrogeno del grupo
hidroxilo provocando una ruptura de enlace y la unión del grupo fenóxido al hierro (formación
de complejo) (Coy, Parra, & Cuca, 2014).
Terpenos y Esteroides
Elaborados a partir de los mismos precursores, terpenoides y esteroides constituyen sin
duda, el más amplio conjunto conocido de metabolitos secundarios de los vegetales. Estos
compuestos tienen en común que se pueden considerar formados por la unión de un número
entero de unidades pentacarbonadas ramificadas derivadas del isopreno, están clasificados
como lípidos insaponificables (Coy, Parra, & Cuca, 2014).
La presencia de estos compuestos se puede determinar por:
Prueba de Liebermann, el cambio en el color de violeta a azul y luego a verde indica la
presencia de núcleo esteroideo.
Prueba de Salkowski, la aparición de efervescencia y la posterior aparición un color marrón
rojizo claro en la interfase confirma la presencia de anillo esteroideo (Mudi & Ibrahim, 2008).
Glicósidos cardiotónicos
Estos compuestos poseen características estructurales similares a las de las saponinas, con
una estructura compuesta por un núcleo esteroidal glicosilado (2 desoxiazúcares) y una lactona
insaturada de 5 o 6 miembros (Carvajal, 2009).
Para la identificación de los glicósidos cardiotónicos se usan reacciones coloreadas, como
es la reacción de Keller – Kiliani (ácido acético, ácido sulfúrico y tricloruro de hierro). Puede
observarse un anillo pardo en la interfase y una coloración azul – verdosa en la capa acética
(Kuklinski, 2003).
18
Alcaloides
Los alcaloides son sustancias básicas que contienen nitrógeno en un anillo heterocíclico,
son derivados de aminoácidos y se encuentran en las plantas superiores de un ácido orgánico.
En el análisis fitoquímico preliminar las técnicas de reconocimiento son basadas en la
capacidad que tienen los alcaloides en estado de sal, de combinarse con el yodo y métales
pesados formando precipitados con reactivos como el mercuriyoduro de potasio (de Mayer) y
yoduro de bismuto (Dragendorff), estas reacciones se basan en los siguientes comportamientos.
El yoduro de potásico cuando reacciona con cloruro mercúrico forma un precipitado rojo de
yoduro mercúrico:
𝐻𝑔𝐶𝑙2 + 2𝐼− → 2𝐶𝑙− + 𝐻𝑔𝐼2
Soluble en exceso de iones de yoduro con formación de un anión complejo incoloro:
𝐻𝑔𝐼2 + 𝐼− → 𝐻𝑔𝐼4−2
La solución alcalina de este complejo sirve para descubrir indicios de amoníaco. En esta
reacción se forma el compuesto de color pardo oxiyoduro mercuri amoníaco, que es soluble en
exceso de complejo [𝐻𝑔𝐼4−2], generando intenso color amarillo (Coy, Parra, & Cuca, 2014).
Antraquinonas
Las antraquinonas constituyen el grupo más numeroso de las quinonas naturales y son la
base y fuente de una importante cantidad de colorantes. Son compuestos poli hidroxilados y
metilados.
La identificación de las quinonas se establece por sus constantes físicas, mediante métodos
químicos y espectroscópicos, los ensayos preliminares comprenden ensayos de solubilidad en
soluciones de bicarbonato de sodio, de carbonato de sodio e hidróxido de sodio, y reacciones
de color en soluciones alcalinas de acetato de magnesio y por la reacción de Bornträger.
19
Reacción de Bornträger: las naftoquinonas y antraquinonas libres al ser tratadas con la
solución de hidróxido amónico forman complejos de color rojo cereza (Universidad Mayor de
San Marcos, 2013).
Flavonoides
Los flavonoides son la clase más diversa, común y amplia de los polifenoles, están
distribuidos entre los vegetales superiores y se encuentran prácticamente en todas las plantas
superiores, sobre todo, en partes aéreas: hojas, flores y frutos. Algunos flavonoides son los
responsables del color amarillo de ciertas flores.
Debido a las funciones fenol, son ionizables en medio básico, lo cual permite su
identificación porque tiene reacciones coloreadas con ciertos compuestos. Producen
generalmente soluciones amarillas que al acidificar viran a incoloras.
Ciertos grupos funcionales de los flavonoides son capaces de formar complejos con metales
como el Fe3+ (FeCl3) o el Al3+ (AlCl3) (Kuklinski, 2003).
Extracción.
Generalidades.
Antes de empezar un proceso extractivo, se debe definir la selectividad del solvente a ser
usado en el proceso. Dependiendo del propósito al que se destine, se puede obtener un extracto
cuya composición química contiene la mayor parte de los constituyentes químicos de la planta,
o un extracto que contiene solamente constituyentes químicos con una determinada
característica. En el primer caso, normalmente se usa un solvente de naturaleza general, de alta
polaridad, como etanol o metanol. En el segundo caso se emplea un solvente selectivo, de
menor polaridad, como el hexano que solo extrae de la planta las grasas vegetales y otros
componentes apolares. La elección del solvente de extracción, así como el tiempo de
permanencia en la composición química de la materia vegetal, representan dos aspectos de
suma importancia en cualquier proceso de fabricación (Kuklinski, 2003).
20
Cuando la droga se pone en contacto con el solvente se inicia un proceso que tiende a
reconstituir el estado original de la célula. Inicialmente el solvente penetra en la célula vegetal
y desplaza el aire contenido en el citoplasma, dándose inicio de esta forma al proceso
extractivo. La penetración del solvente en la célula induce a un momento dipolar en las
moléculas de los compuestos que van a ser extraídos. Es de esta manera como las sustancias
extraíbles se adhieren a las moléculas del solvente. La capacidad de asociación puede
expresarse en términos de la constante dieléctrica. Cuanto más polar sea el solvente mayor será
su respectiva constante dieléctrica. Compuestos ionizables y/o altamente polares se disuelven
en solventes de elevada constante dieléctrica; al igual que compuestos apolares se disolverán
en solventes de baja constante dieléctrica (Sharapin, 2000).
Los solventes más usados en las industrias de productos fitoterapéuticos son el agua, el
etanol, la glicerina, el propilenglicol y mezclas de estos líquidos.
En el proceso de escogencia de un solvente determinado es necesario considerar aspectos
relacionados con la selectividad, la facilidad de manipulación, el precio, la seguridad y los
riesgos en cuanto a una posible contaminación ambiental. Sin embargo, el aspecto más
importante a ser considerado es el grado de toxicidad del solvente. Por esta razón los productos
fitoterapéuticos son elaborados, principalmente, con mezclas hidro-alcohólicas (García &
Molinero, 2014).
21
Métodos de obtención de extractos vegetales.
La extracción es una operación básica que consiste en separar el principio activo de la droga
de la que procede mediante diversos métodos (García & Molinero, 2014).
(Kuklinski, 2003)
Extracción Mecánica
Técnica que permite obtener los principios activos disueltos en los propios fluidos de la
planta, los cuales una vez extraídos se denominan jugo. La extracción mecánica se puede
realizar: por expresión, por calor y mediante incisiones por las que fluyen los exudados de la
planta (Kuklinski, 2003).
Extracción Mecánica por expresión:
Se utiliza para drogas vegetales frescas que poseen una gran cantidad de jugo, consiste en
ejercer una presión sobre el material vegetal exprimiéndolo (García & Molinero, 2014).
Ilustración 2. Clasificación de los métodos de obtención de extractos vegetales
22
Extracción con solventes
Consiste en poner en contacto la droga con un disolvente capaz de solubilizar los principios
activos, estos deben pasar de la droga al disolvente de manera que se obtenga un extracto
líquido. Posteriormente dicho extracto se puede concentrar eliminando mayor o menos
cantidad de disolvente, es uno de los métodos que se emplea con más frecuencia para la
obtención de principios activos (González, 2008).
Extracción continua o progresiva: el disolvente utilizado para la extracción se va
renovando y actúa en una sola dirección. Son técnicas que consisten en poner en contacto la
droga con el disolvente adecuado y mantener en todo momento el desequilibrio entre la
concentración de principio activo en la droga y en el disolvente para que se produzca la difusión
celular.
Extracción discontinua o simultanea: la droga es sumergida en el disolvente utilizado para
la extracción a temperatura ambiente, manteniéndolo todo en agitación durante un tiempo
determinado que dependerá de las características de la droga y de la naturaleza de los principios
activos. Generalmente se utiliza agua, glicerina o mezclas hidroalcohólicas (García &
Molinero, 2014).
Extracción por Maceración
Consiste en poner en contacto la droga y el solvente, durante varios días. Se trata de un
proceso que da como resultado un equilibrio de concentración entre la droga y el solvente, y
depende de factores que están unidos a la droga, como su naturaleza, el tamaño de partícula,
su contenido de humedad y cantidad, y factores que están relacionados con el solvente como
la selectividad y la cantidad. La velocidad con que se obtiene el equilibrio está en función del
tamaño de partícula de la droga, así como, del grado de hinchamiento de las células y de las
propiedades del solvente, como, su viscosidad y polaridad (Sharapin, 2000).
23
Compuestos polifenólicos
Generalidades
Los compuestos polifenólicos son todas aquellas sustancias que poseen varias funciones
fenol, unidas a estructuras aromáticas o alifáticas. Únicamente, algunos compuestos fenólicos
de la familia de los ácidos fenoles no son polifenoles, sino monofenoles.
Los compuestos polifenólicos tienen su origen en el mundo vegetal. Son unos de los
principales metabolitos secundarios de las plantas y su presencia en el reino animal se debe a
la ingestión de éstas. Los fenoles actúan como fitoalexinas (las plantas heridas secretan fenoles
para defenderse de posibles ataques fúngicos o bacterianos) y contribuyen a la pigmentación
de muchas partes de la planta (Creus, 2004).
Clasificación química
Los polifenoles se clasifican en varios grupos en función de sus estructuras. Las clases
principales incluyen flavonoides, ácidos fenólicos, estilbenos y lignanos, como se observa en
la ilustración 3.
Una de las principales clases de polifenoles son los flavonoides que se identifican por tener
una estructura común que consiste en dos anillos aromáticos, que están unidos entre sí por tres
átomos de carbono que forman un heterociclo oxigenado. Basándose en la variación en el tipo
de heterociclo involucrado, los flavonoides pueden dividirse en seis subclases: flavonoles,
flavonas, flavanonas, flavanoles, antocianinas e isoflavonas.
24
(Pascual, Valls, & Sola, 2009)
Las diferencias individuales dentro de cada grupo surgen de la variación en número y
disposición de los grupos hidroxilo y su extensión de alquilación y glicosilación. Los ácidos
fenólicos son abundantes en los alimentos y pueden clasificarse en derivados del ácido
benzoico y derivados del ácido cinámico. Los compuestos polifenólicos también incluyen
estilbenos, que son compuestos que poseen estructuras de 1,2-diarileteno y lignanos
caracterizados por una estructura de 1,4-diarilbutano (Spencer & otros, 2008).
Ilustración 3. Clasificación química de los polifenoles, con su estructura química
25
Propiedades y aplicaciones de los compuestos polifenólicos
Los compuestos fenólicos están presentes en todas las plantas en forma de metabolitos
secundarios. Pueden estar involucrados en el metabolismo primario, potenciar el crecimiento
de la planta, proteger las células más vulnerables de la fotooxidación de la luz ultravioleta o
potenciar la resistencia a enfermedades. Son también los responsables de modular la floración
y maduración de los frutos (Ferran, 2015).
Los polifenoles son parcialmente responsables de la calidad sensorial (contribuyen al sabor,
aroma y color) y nutricional de los alimentos que los contienen; es por ello que se usan en la
industria alimentaria como colorantes naturales y preservantes (Zeiger, 2006).
Actualmente hay un interés creciente en los polifenoles ya que en muchos estudios se ha
revelado que existe una relación directa entre la actividad antioxidante y el contenido fenólico
de extractos de plantas.
Un antioxidante se define como “cualquier sustancia que retrasa, previene o elimina el daño
oxidativo de una molécula diana”. Los antioxidantes pueden ser moléculas complejas, como
las superóxido dismutasas, catalasas y peroxiredoxinas, o simples como el ácido úrico o el
glutatión. Actúan en las reacciones de oxidación entre una molécula y un agente oxidante,
removiendo los radicales libres antes de que puedan comenzar la cadena de reacciones que
daña las células. Además, son capaces de inhibir otras reacciones de oxidación oxidándose
ellos mismos, su actividad depende de su estructura y un punto crítico es la interacción entre
varios antioxidantes en las células. (Gutteridge & Halliwell, 2010)
Los radicales libres son compuestos extremadamente inestables y reactivos generados en el
cuerpo durante la función metabólica normal o debido a la exposición a factores exógenos
(Hatami & otros, 2014). Se sabe que los radicales superóxido, hidroxilo y peróxido, peróxido
de hidrógeno y oxígeno que se clasifican como especies reactivas de oxígeno (ROS) causan
daño oxidativo. El daño oxidativo juega un papel significativamente patológico en la iniciación
26
y progresión de enfermedades humanas, tales como la aterosclerosis, isquemia miocárdica y
cerebral, lesión inflamatoria, diabetes, cáncer, artritis reumatoide, enfermedades
cardiovasculares y en el proceso de envejecimiento (Norshazila S, 2010).
Los mecanismos antioxidantes de los polifenoles se basan en la habilidad de donar
hidrógeno y la quelación de iones metálicos, propiedad proporcionada por la presencia de un
número variable de grupos hidroxilo fenólicos.
Estas propiedades antioxidantes son el motivo de sus posibles implicaciones en la salud
humana, como son la prevención del cáncer, de las enfermedades cardiovasculares o incluso
de enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer. (Ferran, 2015)
Método de cuantificación de polifenoles.
El método usado comúnmente para cuantificar polifenoles totales en productos vegetales es
el ensayo de Folin-Ciocalteu. Se basa en la capacidad de los polifenoles para reaccionar con
agentes oxidantes. Los compuestos fenólicos reaccionan con el reactivo de Folin-Ciocalteu, a
pH básico, dando lugar a una coloración azul susceptible de ser determinada
espectrofotométricamente a 765 nm. (Gutiérrez, Ortiz, & Mendoza, 2008)
Este reactivo contiene una mezcla de wolframato sódico y molibdato sódico en ácido
fosfórico y reacciona con los compuestos fenólicos presentes en la muestra. El ácido
fosfomolibdotúngstico (formado por las dos sales en el medio ácido), de color amarillo, al ser
reducido por los grupos fenólicos da lugar a un complejo de color azul intenso, cuya intensidad
es la que medimos para evaluar el contenido en polifenoles.
27
(García Martínez, 2013)
El mecanismo de reacción es una reacción redox, por lo que además puede considerarse
también, como un método de medida de la actividad antioxidante total. La oxidación de los
polifenoles presentes en la muestra causa la aparición de una coloración azulada que presenta
un máximo de absorción a 765 nm, y que se cuantifica por espectrofotometría en base a una
recta patrón de ácido gálico. También se pueden producir variaciones en el modo de expresar
los resultados Se trata de un método preciso y sensible, que puede padecer numerosas
variaciones, fundamentalmente en lo relativo a los volúmenes utilizados de la muestra a
analizar, concentración de reactivos y tiempo de reacción. (García Martínez, 2013)
Deterioro cognitivo leve (DCL).
Se trata de una alteración de la memoria, según (Winblad & Otros, 2004) el deterioro
cognitivo leve se refiere a personas no dementes con déficits cognitivos mensurables y además,
representan un síndrome clínico que puede ser utilizado para clasificar a las personas que no
cumplen con un diagnóstico de demencia, pero que tienen un alto riesgo de progresar a un
trastorno de demencia.
Los pacientes con DCL se quejan de tener dificultades con la memoria. Típicamente, la
queja incluye problemas para recordar nombres de personas que conocieron recientemente,
problemas para seguir una conversación, y un incremento en la tendencia a no poder encontrar
objetos o problemas similares. (Instituto de Neurología Cognitiva, 2014). El síntoma genera
Ilustración 4. Mecanismo del reactivo de Folin Ciocalteu
28
importante malestar en los pacientes y preocupación en sus familiares, por ello, resulta de
interés su diagnóstico preciso y su posible tratamiento.
Nootrópicos.
‘Noos’ (mente) y ‘tropos’ (dirección), son fármacos orientados al cerebro para mejorar y
potencializar su rendimiento en actividades que requieran de una mejor capacidad cognitiva,
como la memoria, la capacidad de aprender, percibir, pensar y concentrarse.
Un noótropo debe reunir una serie de características fundamentales:
- Mejorar la actividad cognitiva y la memoria, especialmente en situaciones de
deficiencia de metabolismo neuronal: hipoxia, intoxicaciones, traumatismos
craneoencefálicos, accidentes cerebrovasculares, envejecimiento cerebral.
- Presentar escasos efectos secundarios, incluso en dosis altas.
- No poseer en sí mismo efecto cerebrovascular que pueda explicar indirectamente sus
efectos.
- Carecer de efectos sedantes o estimulantes.
(Olivera & Pelegrín, 2015)
Los noótropos estimulan la síntesis de fosfolípidos de membrana, previamente deprimida
por la edad o por lesiones cerebrovasculares. También estimulan la captación de colina en las
terminaciones nerviosas colinérgicas, lo que sugiere una activación indirecta de sistemas
colinérgicos centrales involucrados en fenómenos de aprendizaje y memoria. (Gallego,
Novalbos, & García, 2005)
Piracetam.
Fármaco derivado cíclico del ácido γ-aminobutírico, pertenece a la familia de fármacos
conocidos como noótropos por sus supuestos efectos estimulantes sobre el cerebro.
29
(NCBI, 2018)
Mecanismo de acción.
El mecanismo de acción del piracetam no es bien conocido. Se cree que el piracetam actúa
estimulando la corteza cerebral y aumentando el metabolismo y los niveles energéticos de las
neuronas. Posiblemente facilita el intercambio de información entre los dos hemisferios del
cerebro a través del cuerpo calloso y mejora la función de la acetilcolina a través de las vías
colinérgicas muscarínicas implicadas en los procesos de la memoria. Además, el piracetam
tiene un efecto sobre los receptores de glutamato implicados en el aprendizaje y la memoria.
Se cree que el piracetam puede ejercer un efecto global sobre el cerebro mediante la
modulación de algunos canales iónicos. (Fang, Qiu, Yang, Huang, & Zhang, 2014)
Farmacocinética.
Después de una dosis oral el piracetam se absorbe rápida y casi completamente,
alcanzándose las máximas concentraciones plasmáticas una hora después de la dosis. Aunque
la comida no afecta la biodisponibilidad del piracetam, reduce las Cmax en un 17 %,
aumentando la Tmax a 1.5 h. Después de una dosis de 3.2 g las concentraciones plasmáticas
máximas son de 84 µg/ml. Después de dosis repetidas (3 al día) las concentraciones plasmáticas
llegan a 115 µg/ml. (IQB, 2014)
Ilustración 5. Estructura química de Piracetam
30
Contraindicaciones y precauciones.
El piracetam está contraindicado en pacientes con hipersensibilidad al piracetam o a
cualquiera de los componentes de su formulación.
Además, está contraindicado en pacientes con grave disfunción renal (aclaramiento de
creatinina < 20 ml/min), insuficiencia hepática y en adolescentes de menos de 16 años.
También está contraindicado en pacientes con historia de hemorragias cerebrales.
Se clasifica dentro de la categoría C de riesgo en el embarazo. Los estudios en animales no
han mostrado efectos nocivos directos o indirectos con respecto al embarazo, desarrollo
embrionario/fetal, parto o desarrollo postnatal. Sin embargo, no se dispone de datos suficientes
sobre el uso de piracetam en la mujer embarazada. El piracetam cruza la barrera placentaria y
los niveles plasmáticos del fármaco en el recién nacido son aproximadamente de un 70 % a un
90 % de los niveles de la madre. Por este motivo no se recomienda el uso de piracetam durante
el embarazo a menos que sea estrictamente necesario.
Piracetam se excreta por la leche materna, por lo que deberá evitarse su uso durante el
periodo de lactancia o se deberá suprimir la lactancia durante el tratamiento. (IQB, 2014)
Reacciones adversas.
Las reacciones adversas que fueron observadas con mayor frecuencia en los pacientes
tratados con piracetam son:
- Trastornos del sistema nervioso central y periférico:
Frecuentes: hipercinesia.
- Alteraciones metabólicas y nutricionales:
Frecuentes: incremento de peso.
- Alteraciones psiquiátricas:
Frecuentes: nerviosismo.
Poco frecuentes: somnolencia y depresión
31
- Trastornos Corporales Globales:
Frecuentes: Astenia.
- Alteraciones del oído y del laberinto: vértigo.
- Alteraciones gastrointestinales: dolor abdominal, dolor abdominal superior, diarrea,
náuseas, vómito.
- Alteraciones del sistema inmune: reacción anafiláctica, hipersensibilidad.
- Alteraciones del sistema nervioso: ataxia, pérdida de equilibrio, agravamiento de la
epilepsia, cefalea, insomnio, somnolencia.
- Alteraciones psiquiátricas: agitación, ansiedad, confusión, alucinaciones.
- Alteraciones de la piel y tejidos subcutáneos: edema angioneurótico, dermatitis, prurito,
urticaria.
(Holinski & Otros, 2011)
Ginkgo biloba
El Ginkgo biloba es un árbol caducifolio originario de China. El extracto estandarizado de
Ginkgo biloba es un fitofármaco que se ha estudiado por sus múltiples propiedades. Posee gran
número de compuestos polifenólicos: 24 % Glicósidos (ginkgetina, kaempferol, bilobetina,
etc); 6 % lactonas terpénicas (ginkgólidos A, B, C); trilactona sesquiterpénica, bilobálido y
ácido ginkgólico en cantidad menor a 5 ppm. (Diamond & Otros, 2000)
Se han demostrado diferentes efectos del G. biloba:
- Antagonismo específico del factor activador plaquetario.
- Inhibición de radicales libres.
- Efectos beneficiosos en la circulación sanguínea.
- Protección contra los cambios hipóxicos, tanto in vitro como in vivo.
- Propiedades neuroprotectoras. (Olivera & Pelegrín, 2015)
32
Como efecto más importante a nivel del SNC y que es compartido por otros polifenoles, es
su acción antioxidante, que se traduce un efecto neuroprotector al reducir la muerte neuronal,
rescatando radicales libres (NO, OH-) y previniendo la oxidación de lípidos. (Ramassamy,
2006)
Experimentos en cultivos celulares han mostrado como resultado de la acción de polifenoles
del extracto de Ginkgo biloba, efectos antiapoptóticos en células granulares del cerebelo
inducidas por estrés oxidativo. (DeFeudis & Drieu, 2000)
Además, se ha demostrado in vivo e in vitro, que el extracto de Ginkgo biloba disminuye la
toxicidad del péptido β-amiloide (componente principal de las placas seniles que causan la
enfermedad de Alzheimer, al producir apoptosis y disfunción mitocondrial). (Ramassamy,
2006).
Por las investigaciones antes mencionados y la evidencia encontrada, el extracto de Ginkgo
biloba fue aprobado en el año 1998 por la Comisión E de Alemania (equivalente a la FDA en
Norteamérica) para el tratamiento sintomatológico de déficit de memoria, concentración y
depresión, a partir de patologías orgánicas cerebrales como la enfermedad de Alzheimer.
(Diamond & Otros, 2000)
Contraindicaciones:
- Puede potencializar el efecto anticoagulante del acenocumarol y Warfarina, y el
efecto antiagregante plaquetario de la aspirina.
- No debe administrarse en personas epilépticas
- Se desaconseja su empleo durante el embarazo, lactancia y en niños hasta obtener
más datos sobre la inocuidad. (Aguaviva, 2011)
33
Experimentación animal.
En la actualidad el uso de animales de experimentación es esencial para que las ciencias
biomédicas se desarrollen. Esto se da con la finalidad de encontrar las respuestas que la
humanidad requiere frente a problemas sanitarios, de toxicidad ambiental, evaluación de
efectos terapéuticos nuevos, que prácticamente es imposible contestar si no se cuenta con los
animales de experimentación.
Los modelos animales de enfermedades humanas se han utilizado en diferentes áreas de la
investigación, desde hace muchos años, formando uno de los pasos esenciales en la
biomedicina. Son indispensables para proyectos de investigación, pruebas diagnósticas y
terapéuticas, así como también en los controles de productos farmacológicos. Sin embargo,
este avance, tiene la obligación de cumplir normas éticas. (Momox, 2011)
Normas éticas en el manejo de los animales.
- Tratarlos humanamente
- Reducir al mínimo el dolor y la incomodidad.
- Evitar el sufrimiento innecesario
- Manipularlos adecuadamente, firme, pero con suavidad, para evitar desencadenar
reacciones agresivas hacia el experimentador.
- Evitar su uso innecesario.
(Rodríguez, 2007)
Las normas en las que se basan los principios éticos en la investigación con animales son
las tres “Rs”:
1. Reducir el uso de animales y las causas de dolor y estrés, los proyectos de
investigación que requieren el uso de animales deben ser realizados con el menor
número posible de animales que permitan obtener resultados científicamente
válidos.
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2. Reemplazar siempre los procedimientos in vivo (uso de animales vivos) por métodos
alternativos.
3. Refinar los procedimientos para realizar los experimentos, con el fin de garantizar
el bienestar animal. (Rodríguez, 2007)
Ratón de laboratorio (Mus musculus).
El ratón Mus musculus es desde el punto de vista genético, conductual y fisiológico es más
similar a los seres humanos que otros organismos, por lo que se convierte en el modelo de
elección para muchos estudios. (Pereira, c. Y Villegas, j. 2000)
Taxonomía.
Clase: Mamalia
Orden: Rodentia
Familia: Muridae
Género: Mus
Especie: musculus
Según la guía de manejo y cuidado de animales de laboratorio, las ventajas de su uso como
animal de laboratorio son:
- De fácil cuidado y mantenimiento, por su pequeño tamaño.
- Bajos costo de manutención.
- Cepa definida.
- Diversidad de características específicas que sirven como modelo.
- Eficiencia reproductiva.
- Por su vida relativamente corta es excelente para su uso en ensayos crónicos de
toxicología, microbiología, virología, farmacología, etc.
- Corto tiempo de generación.
Y como desventajas de uso de ratones tenemos:
35
- Dificultad en la recolección de material biológico.
- Dificultad la administración de drogas.
- Dificultad en las técnicas quirúrgicas.
Comportamiento del ratón.
El ratón es un animal sociable y se mantiene en grupos sin ningún inconveniente, estos
grupos deben formarse rápidamente luego del destete.
Sin embargo, los machos de algunas cepas comienzan a mostrar su agresividad entre la
séptima y décima semana de edad, aun cuando estos grupos se hayan establecido al destete. En
el grupo de machos existe uno dominante que puede ser muy agresivo. Las hembras
generalmente no pelean, incluso cuando se hayan agrupado siendo ya adultas. El acto de comer
es cíclico, con un pico máximo durante el periodo de oscuridad. El mayor consumo de agua es
durante las horas de oscuridad. El consumo de alimento y agua varía entre las cepas de ratones.
El ratón generalmente divide su caja en áreas específicas para dormir, comer, orinar y defecar.
Las hembras parturientas construyen un nido y permanecen mucho tiempo cerca de él o sobre
las crías. (Ministerio de Salud del Perú, 2008)
Pruebas para evaluar la actividad nootrópica en ratones.
El aprendizaje y la memoria espacial se relacionan con la capacidad de adquirir y retener
asociaciones de las características del ambiente, lo que permite al organismo desenvolverse en
el espacio. La memoria espacial consiste en múltiples mecanismos especializados en codificar,
almacenar y recuperar información acerca de rutas, configuraciones y localizaciones espaciales
(Kessels & Otros, 2001). Esta memoria puede ser evaluada mediante modelos animales en los
que la solución de la tarea depende de la información espacial disponible. Los roedores pueden
adoptar cuatro formas principales de navegación para la resolución de tareas espaciales:
orientación, guía, cartográfica y de integración de la ruta (Vicens, Redolat, & Carrasco,
Aprendizaje espacial y laberinto de agua: metodología y aplicaciones, 2003)
36
Laberinto acuático de Morris.
El laberinto acuático es uno de los modelos más empleados en el estudio de la memoria
espacial en roedores. En este laberinto los animales tienen que nadar para localizar una
plataforma oculta. Este paradigma resulta de especial interés, puesto que no necesita de la
privación de agua o comida ni de la aplicación de una descarga eléctrica para motivar la
conducta. Además, se requieren relativamente pocos ensayos, ya que los animales aprenden
rápido, guiándose por claves extra-laberinto, y se pueden valorar los efectos de los fármacos
sobre los procesos de aprendizaje y memoria de forma más efectiva. (Vicens, Redolat, &
Carrasco, Aprendizaje espacial y laberinto de agua: metodología y aplicaciones, 2003)
Laberinto radial.
El procedimiento básico, consiste en subordinar la localización del reforzador al lugar o los
lugares en los que previamente se hallaba dicho reforzador. Para ello, se le permite al animal
acceder a determinados emplazamientos donde es recompensado, generalmente con alimento
para después de un intervalo de demora, hacerle elegir entre diversas opciones espaciales a
donde se dirigió anteriormente, se encuentra de nuevo la recompensa. (Aparicio & Huidrobo,
2009)
37
Fundamentación Legal
El artículo 32 de la Constitución de la República del Ecuador, título II “Derechos”,
sección séptima “Salud”, establece que la salud es un derecho que garantiza el Estado, cuya
realización se vincula al ejercicio de otros derechos, entre ellos el derecho al agua, la
alimentación, la educación, la cultura física, el trabajo, la seguridad social, los ambientes sanos
y otros que sustentan el buen vivir. El Estado garantizará este derecho mediante políticas
económicas, sociales, culturales, educativas y ambientales; y el acceso permanente, oportuno
y sin exclusión a programas, acciones y servicios de promoción y atención integral de salud,
salud sexual y salud reproductiva. La prestación de los servicios de salud se regirá por los
principios de equidad, universalidad, solidaridad, interculturalidad, calidad, eficiencia,
eficacia, precaución y bioética, con enfoque de género y generacional.
La Ley Orgánica de Salud en el capítulo III: Derechos y deberes de las personas y del
Estado en relación con la salud, articulo 7, literal E indica que:
Toda persona, sin discriminación por motivo alguno, tiene con relación a la salud, los
siguientes derechos: Ser oportunamente informada sobre las alternativas de tratamiento,
productos y servicios en los procesos relacionados con su salud, así como en usos, efectos,
costos y calidad; a recibir consejería y asesoría de personal capacitado antes y después de los
procedimientos establecidos en los protocolos médicos.
La Agencia Nacional de Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria – ARCSA, en la
Normativa técnica sanitaria sustitutiva para la obtención del Registro Sanitario y control de
productos naturales procesados de uso medicinal y de los establecimientos en donde se
fabrican, almacenan, distribuyen y comercializan, en el Capítulo III (Del Registro Sanitario),
articulo 4, establece que:
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Los Productos Naturales Procesados de Uso Medicinal, previo a su fabricación,
importación, almacenamiento, distribución y comercialización, deberán obtener
obligatoriamente el correspondiente Registro Sanitario, otorgado por la Agencia Nacional de
Regulación, Control y Vigilancia Sanitaria - ARCSA.
A la solicitud de Registro Sanitario se adjuntarán los siguientes requisitos:
a. Requisitos para demostrar la calidad del producto terminado:
Descripción del o los recursos naturales.
Especificaciones y límites de contenido en la materia prima o recurso natural.
Proceso de fabricación.
Descripción del producto terminado.
Estabilidad: Estudios de estabilidad en base a los criterios de la ICH o USP para la zona
climática IV.
b. Requisitos para demostrar la seguridad del producto:
Estudios de toxicidad
Monografías con información sobre toxicidad
c. Requisitos para la evaluación de la eficacia:
Las indicaciones aprobadas por la ARCSA serán las únicas que se podrán promocionar en las
etiquetas y en la publicidad del producto en cualquier medio.
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Hipótesis
ETAPA I
Hipótesis
El método de extracción y el material vegetal empleado (hojas y raíces) de Smallanthus
sonchifolius influyen en la concentración de polifenoles totales.
Hipótesis nula
El método de extracción y el material vegetal empleado (hojas y raíces) de Smallanthus
sonchifolius no influyen en la concentración de polifenoles totales.
ETAPA II
Hipótesis
Los extractos obtenidos de Smallanthus sonchifolius con mayor concentración de
polifenoles presentan actividad nootrópica en ratones Mus musculus.
Hipótesis nula
Los extractos obtenidos de Smallanthus sonchifolius con mayor concentración de
polifenoles no presentan actividad nootrópica en ratones Mus musculus.
Sistema de variables
ETAPA I
Variables independientes:
Material vegetal: hojas y raíces de Smallanthus sonchifolius, que se empleara en el proceso
de extracción.
Método de extracción: proceso por el cual se realizará la obtención de los extractos
(maceración y expresión)
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Variable dependiente:
Concentración de polifenoles totales: cantidad de polifenoles presentes en las hojas y
raíces de la especie vegetal Smallanthus sonchifolius.
ETAPA II
Variables independientes:
Extracto empleado: extractos que presenten mayor concentración de polifenoles a una
dosis segura.
Variable dependiente:
Tiempo de latencia: tiempo en el cual el roedor va a cumplir con el propósito.
41
Capítulo III
Metodología de Investigación
Diseño de la Investigación
La presente investigación utilizó un enfoque cuantitativo, basada en la obtención de datos
para probar hipótesis, con base en la medición numérica y el análisis estadístico, para establecer
patrones de comportamiento y probar teorías (Sampieri, 2006), los datos que se recogieron son
los resultados de los ensayos farmacobotánicos, fitoquímicos, cuantificación de polifenoles
totales, así como también del tiempo de latencia en la evolución del efecto nootrópico en los
ratones de estudio.
El nivel de investigación llega hasta nivel explicativo, este estudio según (Sampieri, 2006)
va más allá de la descripción de conceptos, fenómenos o del establecimiento de relaciones entre
conceptos, más bien están dirigidos a responder a las causas de los eventos físicos o sociales.
Su interés se centra en explicar por qué ocurre un fenómeno y en qué condiciones este se da.
En el trabajo se analiza las consecuencias del material vegetal empleado y el tipo de extracción
en la cuantificación de compuestos fenólicos y estos en el efecto nootrópico.
Los tipos de investigación que se manejó son documental y experimental. Documental,
porque se busca elaborar un marco teórico conceptual para formar un cuerpo de ideas sobre el
objeto de estudio y descubrir respuestas a determinados interrogantes a través de la aplicación
de procedimientos documentales, esta técnica documental permite la recopilación de
información para enunciar las teorías que sustentan el estudio de los fenómenos y procesos.
(Amador, 2011) En cambio, experimental debido a que está integrada por un conjunto de
actividades metódicas y técnicas que se realizan para recabar la información y datos necesarios
sobre el tema a investigar y el problema a resolver, ya que se realizó la extracción y
cuantificación de fenoles totales, además de evaluar el efecto nootrópico. (Ruiz, 2009)
42
Materiales y Métodos
Material Vegetal.
Hojas y raíces de jícama (Smallanthus sonchifolius) procedentes de la parroquia rural
Guayllabamba, cantón Quito, provincia de Pichincha.
Materiales de laboratorio.
Balones aforados Pera de succión
Cápsulas de porcelanas Pinza para cápsula
Crisoles Pipetas Volumétricas
Envases ámbar Piseta
Embudo de Buchner Probetas
Embudo Simple Cocineta eléctrica
Picnómetro Termómetro
Espátula Trípode
Gradilla Tubos de ensayo
Kitasato Varilla de agitación
Papel aluminio Vasos de precipitación
Papel empaque Vidrio reloj
Papel filtro
Equipos.
Balanza Analítica Mufla
Bomba de vacío Potenciómetro
Cabina extractora de gases Refrigeradora
Desecador Rotavapor
Espectrofotómetro UV-VIS Extractor mecánico
Estufa Autoclave
Reactivos.
Acetato de Sodio Éter
Ácido acético glacial Etanol
Ácido clorhídrico Magnesio metálico
Ácido nítrico Metanol
Ácido Sulfúrico Plata nitrato 0.1M
Ácido clorogénico Reactivo de Dragendorff
Agua destilada Reactivo de Fehling
Alcohol (96 %) Reactivo de Meyer
Amonio 5 % Reactivo de Wagner
Butanol Reactivo Folin-Ciocalteu
Cloroformo Sodio carbonato
Sodio cloruro Medio de cultivo
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Materiales y reactivos para evaluación de actividad nootrópica.
Algodón
Micropipetas
Cofia
Guantes
Jeringuillas
Mandil
Mascarilla
Laberinto acuático
Laberinto radial de ocho brazos
Reactivo biológico
24 ratones Mus musculus de tres meses de edad (12 hembras y 12 machos)
Reactivos
Extractos de hojas y raíces de jícama (Smallanthus sonchifolius)
Agua
Ginkgo biloba
Métodos experimentales.
El desarrollo de este proyecto de investigación se realizó en el Laboratorio de Productos
Naturales de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, y en el
Bioterio de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia.
Caracterización taxonómica.
Se realizó la autentificación taxonómica de la planta recolectada, con el fin de comprobar
que se trate del mismo género, familia y especie.
Del material recolectado se tomaron muestras completas de tallos, hojas, flores y tubérculo,
para ser enviado al Herbario Alfredo Paredes (QAP) de la Universidad Central del Ecuador,
para su comprobación taxonómica.
Control de calidad del material vegetal.
Para determinar la calidad del material vegetal con el que se realizó el estudio se siguieron
los procedimientos descritos en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.
(Secretaría de Salud, 2013)
44
Identidad.
1. Análisis macroscópico.
2. Perfil cromatográfico.
Identificación de ácido clorogénico por cromatografía en capa fina
La fase móvil fue constituida por una mezcla de alcohol butílico, agua destilada, ácido
acético en proporciones 60:25:15. Se mezcló 12 ml de alcohol butílico, 5 ml de agua destilada
y 3 ml de ácido acético para obtener 20 ml de fase móvil necesarios para cubrir 5 mm de la
superficie de la placa cromatográfica. Se saturo la cámara cromatográfica con la fase móvil y
se equilibró el sistema con los vapores del solvente durante 30 minutos aproximadamente.
En la placa cromatográfica se aplicó con ayuda de un capilar las muestras de hojas y raíces
de jícama por maceración y expresión, obteniendo manchas longitudinales de 5 mm.
Se colocó la placa en la cámara de forma vertical y que las manchas de siembra estuvieran
por encima de la superficie de la fase móvil. Se desarrolló el cromatograma a temperatura
ambiente permitiendo que la fase móvil ascendiera.
Se observaron las placas secas bajo luz UV de longitud de onda 365nm, los resultados de la
placa se midieron y registraron las distancias hasta cada mancha desde el punto de siembra, se
determinaron los valore de Rf y se comparó el cromatograma de los extractos con el del
estándar de ácido clorogénico registrado en bibliografía.
Pureza.
1. Determinación de cenizas.
La ceniza total
2. Determinación de humedad.
Tamizaje fitoquímico.
El tamizaje fitoquímico se realizó a través de reacciones químicas de identificación,
mediante cambios de color o formación de precipitados, destinadas a determinar la presencia
45
de metabolitos secundarios en el vegetal, siguiendo procedimientos según (Mudi & Ibrahim,
2008)
Se preparan tres extractos: cloroformo, éter de petróleo y acetato de plomo, para cada
material vegetal (hojas y raíces), en cada fracción se realiza las reacciones de identificación,
como se detalla en el ANEXO B
Tabla 1. Ensayo fitoquímico para la determinación de metabolitos secundarios.
METABOLITO ENSAYO
Alcaloides Dragendorff, Meyer y Wagner
Saponinas Espuma
Taninos Tricloruro férrico
Antocianos Con HCl
Antraquinonas Bomtrager
Flavonoides Shidona
Triterpenos y esteroides Liebermand - Bouchard
Glucósidos Cardiotónicos Kedde
Elaborado por: Diana Estrella
Preparación de las muestras.
La materia prima vegetal recolectada se examinó y se separó materiales extraños, partes
deterioradas, enfermas o contaminadas. Posteriormente, se realizó la limpieza con abundante
agua destilada y desinfección con una solución diluida de hipoclorito de sodio durante 5
minutos.
Se eliminó la cascara o piel de las raíces utilizando un cuchillo, para la reducción de tamaño se
realizó cortes en rodajas para tener facilidad en el proceso de secado del producto, por su alto
contenido de humedad.
Obtención del Extracto.
Maceración.
Las hojas y raíces tratadas se secaron en una estufa a 50°C, hasta obtener un peso constante,
para posteriormente molerlo. En un envase de vidrio cubierto con papel aluminio para
protegerlo de la luz se colocó el material vegetal con etanol al 70 %, en una proporción 1:15
(p/v), se maceró durante dos semanas, a temperatura ambiente y con agitación. Transcurrido
46
este tiempo, se filtró con papel filtro, para continuar con el proceso de concentración en el
rotavapor.
Expresión.
El material vegetal fresco (hojas y raíces) se sometieron a extracción mecánica con la ayuda
de un procesador de alimentos OSTER, el extracto obtenido se almacenó en refrigeración.
Cuantificación de polifenoles totales
Preparación de disoluciones patrón de ácido gálico
Se realizó una solución de ácido gálico de 1,3 mg/ml (disolución concentrada o madre), a
partir de esta disolución se prepararán 10 ml de soluciones diluidas de concentraciones
crecientes de ácido gálico entre 0,1 y 1,3 mg/ml para la curva de calibración.
Determinación de polifenoles en la muestra y en los patrones de ácido gálico.
- Se tomó 100 l de cada solución patrón de ácido gálico y del sobrenadante
procedente de los extractos obtenidos por maceración y expresión y se colocó en
tubos de ensayo cubiertos con papel aluminio para impedir el paso de la luz.
- Se añadió 7,9 ml de agua destilada y 500 l de reactivo de Folin-Ciocalteu.
- Se homogenizó el contenido de los tubos de ensayo y se dejó reposar 2 horas a
temperatura ambiente en la oscuridad.
- Transcurrido este tiempo, medir la absorbancia a 765 nm.
Actividad nootrópica de los extractos de jícama (Smallanthus sonchifolius)
La evaluación de la actividad nootrópica se realizó siguiendo procedimientos in vivo
aplicados a 24 ratones (Mus musculus) de 90 días de edad aproximadamente.
La administración a los roedores fue por vía oral durante 28 días y después durante el
transcurso de las dos semanas de pruebas en las que se realizó los 2 test de aprendizaje mediante
el Laberinto Acuático de Morris y el Laberinto Radial de 8 brazos.
47
Los animales fueron divididos en 4 grupos, cada uno con 6 ratones escogidos aleatoriamente
(tres hembras y tres machos). A cada grupo se estableció al azar los distintos tratamientos de
la siguiente manera:
- Control negativo
- Control positivo
- Extractos en estudio, con mayor cantidad de compuestos polifenólicos.
Evaluación
Método 1. Laberinto Acuático de Morris.
El aparato que se utilizó en esta investigación consistía en un tanque circular lleno de agua
de aproximadamente 100 cm de diámetro y de 30 cm de profundidad, este tanque fue dividido
en cuatro cuadrantes iguales. La temperatura del agua osciló entre 23 y 27 °C, lo que hace que
los animales quieran escapar sin sentirse tan estresados como para que se inhiba su conducta
de búsqueda de la plataforma. La plataforma de escape fue cuadrada, de 10 – 12 cm y
sumergida 1 cm por debajo de la superficie del agua en uno de los cuadrantes (cuadrante
objetivo) (Wenk, 2004). Además, se ubicaron varias señales distales alrededor del tanque para
orientar al animal dentro de la piscina.
El test del laberinto acuático de Morris consistió en las siguientes fases:
Entrenamiento:
Los animales fueron entrenados durante seis días para encontrar la plataforma sumergida.
En esta fase se introdujo al animal con el hocico apuntando hacia las paredes de la piscina para
que busque la plataforma durante un tiempo 120 segundos máximo. En el caso de no
encontrarla en el tiempo máximo establecido se colocó al ratón entre 20 o 30 segundos en la
plataforma (Vicens, Redolat, & Carrasco, Psicothema, 2003).
48
El ensayo se detuvo después de este tiempo o después de que el animal llegó a la plataforma.
Se consideró que un animal ha encontrado la plataforma cuando permanece en ella 5 o 10
segundos (Vicens, Redolat, & Carrasco, Psicothema, 2003).
Después se retiró al animal de la plataforma y se le dejó descansar antes de iniciar el
siguiente ensayo. Este procedimiento se repitió en los distintos tratamientos y a lo largo del
entrenamiento (Vicens, Redolat, & Carrasco, Psicothema, 2003).
Pruebas de Adquisición:
- Se introdujo la plataforma en un cuadrante de la piscina.
- Se colocó al animal frente a la pared del tanque, luego fue liberado en el agua, el
cronómetro se inició en el momento en que el animal fue liberado (Vorhees &
Williams, 2006).
- Se detuvo el cronómetro y se registró el tiempo (en segundos) cuando el animal
alcanzó la plataforma. El límite de prueba estándar fue de 2 min por ensayo, los
animales que no encontraron la plataforma dentro de este límite de tiempo se le
dirigirá a ella (Vorhees & Williams, 2006).
- Se dio a cada ratón cuatro ensayos el primer día (Wenk, 2004).
- En los 6 días siguientes, se repitieron los ensayos, con cuatro ensayos por día.
- Se realizó el análisis de datos. El rendimiento se expresó como el tiempo promedio
que toma cada grupo para encontrar la plataforma sumergida. (Wenk, 2004)
- Los fármacos fueron administrados antes del entrenamiento para evaluar sus efectos
en la adquisición. (Wenk, 2004)
Método 2. Laberinto Radial de 8 brazos.
El aparato que se utilizó en esta investigación consistió en un laberinto radial elevado a 1 m
desde el suelo, compuesto de ocho brazos idénticos de 35 cm de longitud x 5 cm de ancho
distribuidos radialmente, unidos a una plataforma central con un diámetro de 20 cm para
49
acomodar al animal y permitir que se movilice fácilmente entre los brazos. La plataforma
central estuvo rodeada de una pared de 25 cm de altura, con unas puertas tipo guillotina que
conectaban a cada brazo las cuales se podían abrir y cerrar para permitir o impedir la entrada
(Wenk, 2004). Además, cada brazo tuvo un orificio de 5 mm de profundidad a 1 cm del
extremo, que se utilizó como recipiente para mantener la comida fuera de la vista del ratón, y
las paredes a lo largo del borde de los brazos del laberinto fueron, cortas de aproximadamente
2 cm de altura, las cuales evitaron que el animal se caiga del laberinto durante la ejecución de
la tarea. (Wenk, 2004)
El aparato fue ubicado en una sala de experimentación con luz artificial y varias señales
externas (ambientales) que fueron visibles para el ratón mientras estuvo en el laberinto (Wenk,
2004).
El test del laberinto de brazos radiales consistió en tres fases:
Habituación.
A los ratones se les dio un ensayo de habituación de 20 minutos el primer día en el laberinto
con acceso libre a todos los brazos, tantas veces como quisieran. Esta habituación no será
contada ni registrada.
Entrenamiento de los ratones
- Se pesó cada ratón semanalmente durante el entrenamiento y la prueba para
monitorear la salud y el grado de privación de alimento.
- Se disminuyó el alimento disponible al ratón durante las pruebas y el entrenamiento.
- Se colocó dos ratones en el laberinto al mismo tiempo, debido a que el uso de dos
ratones reduce el tiempo que tarda cada uno en aclimatarse al laberinto.
- Se esparció recompensas de alimentos alrededor de todo el laberinto para fomentar
la exploración. La aclimatación fue de 2 días.
50
- Por último, se colocó al ratón solo en el laberinto; y también el alimento sólo en el
recipiente de comida al final de los brazos. La prueba puede comenzó cuando el
ratón estuvo cómodo de ser recogido por el experimentador.
- Los ratones estuvieron listos para la prueba, a los 7 días del entrenamiento, los
ratones recorrieron el laberinto una vez al día todos los días incluidos los fines de
semana. (Wenk, 2004)
Realizar ensayos
- Se colocó la recompensa de comida al final de cada brazo antes de cada sesión de
prueba.
- Se colocó al ratón en la plataforma central con todas las puertas tipo guillotina
cerradas. (Wenk, 2004)
- Levantar todas las puertas simultáneamente y permitir que el ratón entre en un brazo,
dar tiempo al ratón para comer y regresar a la plataforma central.
- La prueba finalizo cuando el ratón ingresó a todos los brazos.
- Se registró los siguientes datos:
o Tiempo que transcurrió desde el comienzo de la sesión de prueba y el ratón
ingresando a los ocho brazos.
o A qué brazo entró cada vez el ratón.
o Número de elecciones correctas de los brazos: es decir, aquellas que se
eligieron la primera vez.
o Número de elecciones incorrectas de los brazos: es decir, visitas al mismo
brazo más de una vez durante una sesión de prueba única.
51
Diseño experimental
ETAPA I
Variable independiente:
- Material vegetal
- Método de extracción
Variable dependiente:
- Contenido de polifenoles totales
En esta etapa se estudia la influencia del material vegetal y el método de extracción en la
concentración de fenoles totales, se analiza la influencia de estas dos variables independientes
con dos niveles cada una y cada tratamiento con 3 réplicas, por lo tanto, el diseño experimental
aplicado es un diseño de bloques completos al azar.
Tabla 2. Diseño Experimental - Etapa I
Elaborado por: Diana Estrella
ETAPA II
Variables independientes:
- Extracto empleado
Variable dependiente:
- Tiempo de latencia
En esta etapa se evalúa la influencia del extracto empleado en el tiempo de latencia (tiempo
en el cual el roedor va a cumplir con el propósito) se analiza la influencia de esta variable
independiente con dos niveles y cada tratamiento con 7 réplicas, por lo tanto, el diseño
experimental aplicado es un diseño factorial de bloques completos al azar.
Material
Vegetal
Método de
extracción
Tratamiento Contenido de polifenoles
I II III
Hojas Maceración T1
Expresión T2
Raíces Maceración T3
Expresión T4
52
Tabla 3. Diseño experimental – Etapa II
Grupo Dosis N° de
Ratón
Método 1 Método 2
Tiempo de
latencia
[s]
Tiempo de
latencia
[s]
Numero de
desacierto
Blanco 0 mg/kg
M1
M2
M3
H1
H2
H3
Control (+)
Ginkgo biloba 240 mg/70kg
M1
M2
M3
H1
H2
H3
E1 30 mg/kg
M1
M2
M3
H1
H2
H3
E2 30 mg/kg
M1
M2
M3
H1
H2
H3
Elaborado por: Diana Estrella
53
Matriz de operacionalización de variables
Tabla 4. Matriz de Operacionalización de Variables
Variable Dimensiones Indicadores
Material vegetal
Hojas y raíces de
Smallanthus sonchifolius
Control de calidad
- Porcentaje de humedad
- Porcentaje de cenizas
- Perfil cromatográfico
Método de extracción
Maceración
Expresión
- Volumen de disolvente
- Tipo de disolvente
Cuantificación de
fenoles totales
- Cantidad de fenoles totales [EAG/ml
extracto]
Actividad Nootrópica
Latencia de escape
- Tiempo en el que el ratón llega a la
plataforma sumergida en el laberinto
acuático de Morris.
- Tiempo empleado en recorrer los
ocho brazos del laberinto radial.
Respuesta
- Número de aciertos en el laberinto
radial de ocho brazos.
- Número de desaciertos en el
laberinto radial de ocho brazos.
Elaborado por: Diana Estrella
Técnicas de procesamiento de datos
Para probar las hipótesis planteadas se usó la técnica de análisis de varianza de ANOVA y
un test post estadístico de Duncan de comparaciones múltiples al 95 %.
El test de ANOVA, un análisis de varianzas con datos agrupados plantea dos hipótesis, la
nula que dice que los grupos de estudio no presentan diferencias estadísticamente
significativas, lo cual se interpreta como que todas las sustancias de estudio tienen el mismo
efecto y no difieren entre sí, y por otra parte está la hipótesis alternativa que menciona que al
menos uno de los grupos de estudio presenta resultados distintos a los demás de interés.
54
Capitulo IV
Análisis e interpretación de resultados
Caracterización taxonómica.
El personal del Herbario Alfredo Paredes (QAP) de la Universidad Central del Ecuador,
confirmó que la muestra recolectada con la que se realizó el trabajo de investigación fue la
especie Smallanthus sonchifolius, de la familia Asteraceae. (ANEXO C)
Control de calidad del material vegetal.
Para determinar la calidad del material vegetal con el que se realizó el estudio se siguieron
los procedimientos descritos en la Farmacopea Herbolaria de los Estados Unidos Mexicanos.
(Secretaría de Salud, 2013)
Identidad.
Análisis macroscópico.
La jícama es una planta herbácea perenne de aproximadamente 1 a 2,5 m de altura, con
tallos verdes cilíndricos, surcados, densamente pubescentes y huecos en la madurez. De cada
nudo del tallo brotan dos hojas.
Las hojas son opuestas, grandes, distribuidas en pares, de forma triangular, de base trunca,
hastada o acorazonada. El haz es de color verde oscuro y el envés color verde claro con
pilosidad, tienen una longitud de 22 cm y ancho de 15 cm.
Las raíces son fusiformes, externamente recubiertas por una capa delgada fácilmente
desprendible, en su parte interna son carnosas de color anaranjado, puede alcanzar un tamaño
de 25 cm de longitud por 10 cm de diámetro, su peso fluctúa entre los 300 y 1000 gramos,
Según la caracterización macroscópica la planta sujeta a estudio corresponde al mismo
género y especie que nos indica la literatura empleada. (Seminario, Valderrama, & Manrique,
2003)
55
Perfil cromatográfico.
En el estudio cromatográfico para identificar ácido clorogénico en los extractos de hojas y
raíces obtenidos por maceración y expresión de S. sonchifolius, se obtuvieron los siguientes
resultados:
Según datos bibliograficos el estandar de ácido clorogénico presenta una banda de
fluorescencia celeste observado a una longitud de onda de 365 nm sin necesidad de aplicar
revelador, con un factor de retención de aproximadamente 0,63 en una fase movil compuesta
por alcohol butílico, agua destilada, ácido acético en proporciones 60:25:15. (López &
Gallegos, 2014)
En la ilustracion 6, se observa el cromatograma de extractos de hojas y raices de jícama,
siendo HM y RM muestras de los extractos de hojas y raices obtenidos por maceración, donde
se vizualizan bandas con fluorescencia celeste pero no se observa claramente las manchas
caracteristicas del ácido clorogénico ya que la muestra es concentrada, por lo que se realizó
una dilución 1:1 en el mismo solvente de maceración (etanol 70%), de esta forma se pudo ver
mas claramente las manchas caracteristicas como se indica en HMd y RMd. Las muestras de los
extractos obtenidos por expresion de hojas y raices son HE y RE, en las que no se pudo observar
con claridad las bandas de fluorescencia celestes.
Ilustración 6. Placa cromatográfica de los extractos de hojas y
raíces por maceración y expresión
56
Se documentó los resultados de la placa después de cada observación, midiendo y
registrando la distancia hasta cada mancha desde el punto de origen, en la tabla 5 se presentan
los valores de Rf para las manchas principales comparando con el valor teórico del estandar de
ácido clorogénico.
Tabla 5. Valores de Rf de muestras y estándar de ácido clorogénico en hojas y raíces de
jícama por maceración y expresión.
Material
vegetal Extractos
Distancia
recorrida desde
el punto de
aplicación
Distancia
recorrida
del eluyente
Rf Valor
bibliografico
Hojas
Maceración - 7,2 - 0,63
Maceración 1:1 4,6 7,2 0,639 0,63
Expresión - 7,2 - 0,63
Raices
Maceración - 7,2 - 0,63
Maceración 1:1 4,5 7,2 0,625 0,63
Expresión - 7,2 - 0,63
Elaborado por: Diana Estrella
Los extractos de hojas y raices de jicama obtenidas por maceracion presentan valores de Rf
de 0,639 y 0,625 respectivamente, indicando la presencia de acido clorogénico en las muestras,
por el contrario con los extratos obtenidos por expresión en los que no se observo manchas
aparentemente no hay presencia de ácido clorogénico.
Pureza.
Determinación de cenizas totales
En las tablas 6 y 7 se exponen los resultados sobre el porcentaje de cenizas totales presentes
en las hojas y raíces de jícama.
Tabla 6. Porcentaje de cenizas totales en hojas de jícama
N° determinación P. muestra [g] Cenizas totales [ %]
1 3,002 12,79
2 3,000 12,33
3 3,004 12,35
4 3,000 12,43
Elaborado por: Diana Estrella
57
Tabla 7. Porcentaje de cenizas totales en raíces de jícama
N° determinación P. muestra
[g] Cenizas totales [ %]
1 3,005 4,19
2 3,002 4,30
3 3,000 4,76
4 3,001 4,53
Elaborado por: Diana Estrella
Como se puede observar en los resultados, los porcentajes de cenizas totales de hojas y
raíces son de 12,5 % y 4,4 % respectivamente, este parámetros es importante conocer porque
nos indica la cantidad total de materia que queda después de la calcinación, pudiendo ser
material fisiológico de la planta y material no fisiológico, así se podría conocer si se ha
realizado una correcta selección y lavado de las hojas y raíces de jícama, eliminando la mayor
parte de impurezas como tierra, polvo y arena que pudieran estar presentes durante la
recolección.
Determinación de humedad.
Los porcentajes de humedad obtenidas en las hojas y raíces de jícama se presentan en las
tablas 8 y 9.
Tabla 8. Porcentaje de humedad en hojas de jícama
N° determinación P. muestra [g] Humedad [ %]
1 1,008 9,14
2 1,029 8,85
3 1,007 8,95
4 1,016 9,07
Elaborado por: Diana Estrella
El porcentaje de humedad de las hojas de jícama es de 9,0 %, se debe controlar este
parámetro ya que un exceso de agua fomentara el crecimiento microbiano y para evitar
procesos enzimáticos que lleven al deterioro del material vegetal.
58
Tabla 9. Porcentaje de humedad en raíces de jícama
N° determinación P. muestra [g] Humedad [ %]
1 1,011 88,90
2 1,035 89,12
3 1,023 86,82
4 1,007 88,53
Elaborado por: Diana Estrella
La jícama es una de las raíces reservantes comestibles con mayor contenido de agua, según
diversos autores, entre el 83 y 90 % del peso seco de las raíces es agua, por lo tanto, los
resultados obtenidos de 88 % tienen relación con estudios publicados.
Tamizaje fitoquímico.
Los resultados se interpretaron como “positivo o negativo”, refiriéndose a la presencia o
ausencia respectivamente de los grupos de metabolitos secundarios en hojas y raíces.
59
Tabla 10. Resultados del tamizaje fitoquímico en hojas y raíces de S. sonchifolius.
Metabolitos
secundarios Reacciones
Hojas Raíces
Fase
acuosa
Fase
orgánica
Fase
acuosa
Fase
orgánica
Alcaloides
Dragendorff - + - +
Mayer - + - +
Wagner - + - +
Esteroles Lieberman-Bouchard N/A + N/A -
Zack N/A + N/A -
Flavonoides Shidona + N/A + N/A
Medio alcalino + N/A + N/A
Antocianos Con HCl - N/A - N/A
Antraquinonas Bomtrager + N/A + N/A
Taninos Con FeCl2 + N/A + N/A
Gelatina salada + N/A + N/A
Saponinas Con agua - N/A - N/A
Glucósidos
Cardiotónicos
Baljet N/A - N/A -
Kedde N/A - N/A -
Raymound N/A - N/A -
Equivalencia: + = positivo - = negativo N/A = No aplica
Elaborado por: Diana Estrella
El análisis fitoquímico de las hojas y raíces de Smallanthus sonchifolius se lo realizo de
acuerdo con el anexo B. Los resultados obtenidos para la investigación de alcaloides,
flavonoides, taninos y antraquinonas indican que existe presencia de estos metabolitos en hojas
y raíces, según la cromatografía en capa fina se detecta manchas intensas y definidas
características para cada metabolito con fluorescencia a 365 nm, lo cual confirma la presencia
de estos metabolitos.
Las pruebas de color realizadas para la investigación de esteroles con Lieberman Bouchard
y Zack fueron positivas para hojas y negativas raíces.
60
Según las pruebas cualitativas realizadas para saponinas, antocianos y glucósidos
cardiotónicos se detectó la ausencia de estos metabolitos, lo que se confirmó con cromatografía
en capa fina.
Determinación del contenido de polifenoles totales
Obtención de la curva de calibración
Con la curva de calibración que se muestra en la tabla 11, se obtiene la ecuación que permite
encontrar las concentraciones de polifenoles, con un coeficiente de correlación de 0,999.
Tabla 11. Lecturas para la curva de calibración, Absorbancia vs Concentración de ácido gálico
Elaborado por: Diana Estrella
Concentración, mg Ác gálico/ml Absorbancia
0 0
0,1 0,062
0,2 0,101
0,3 0,156
0,5 0,291
0,6 0,353
0,8 0,472
1,2 0,722
1,3 0,785
Ilustración 7. Curva de calibración del estándar de ácido gálico a concentraciones de 0,1 - 1,3
mg/ml
y = 0,6087x - 0,0113R² = 0,999
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4
Ab
sorb
anci
a
Concentración, mg/ml
61
En la tabla 12 se presentan los resultados de las lecturas de absorbancias de los extractos de
hojas y raíces por maceración y expresión.
Tabla 12. Lecturas de absorbancia de los extractos de hojas y raíces de S. sonchifolius por
maceración y expresión
Material vegetal Método de
Maceración
Absorbancias (765 nm)
I II III
Hojas Maceración 0,6790 0,6530 0,6760
Hojas Expresión 0,3710 0,3740 0,3520
Raíces Maceración 0,6630 0,6230 0,6537
Raíces Expresión 0,1420 0,1360 0,1550
Elaborado por: Diana Estrella
A partir de la ecuación obtenida en la curva de calibración:
𝑦 = 0,6087𝑥 − 0,0113
Se calcula la concentración de polifenoles para cada tratamiento como se indica en la tabla 13.
Tabla 13. Concentración de polifenoles en hojas y raíces por maceración y expresión
Material vegetal Método de
Maceración
Concentración de polifenoles
[EAG/ml extracto]
I II III
Hojas Maceración 1,1341 1,0913 1,1291
Hojas Expresión 0,6281 0,6330 0,5968
Raíces Maceración 1,1078 1,0421 1,0925
Raíces Expresión 0,2518 0,2420 0,2732
Elaborado por: Diana Estrella
Análisis Estadístico
Con el fin de evaluar la influencia de las variables del proceso sobre el contenido de
polifenoles de los extractos, se realizó el análisis de varianza al 95 % y 99 % de confianza, con
la ayuda del software estadístico SEDEX V1.0
62
Diseño de bloques completamente al azar para concentración de polifenoles
Tabla 14. Datos generales del análisis estadístico de polifenoles
Material
vegetal
Método de
Maceración Tratamientos
Concentración de polifenoles
Sumatoria Media
R1 R2 R3
Hojas Maceración T1 1.1341 1.0913 1.1291 3,3545 1,12
Hojas Expresión T2 0.6281 0.6330 0.5968 1,8579 0,62
Raíces Maceración T3 1.1078 1.0421 1.0925 3,2424 1,08
Raíces Expresión T4 0.2518 0.2420 0.2732 0,767 0,26
Elaborado por: Diana Estrella
En la tabla 15 se observan los resultados para el análisis de varianza (ANOVA) en la que nos
indica una diferencia significativa al 1 % para tratamientos, esto quiere decir que el material
vegetal y el método de extracción si influye en la concentración de polifenoles, mientras que
para bloques (réplicas) no presenta un efecto estadísticamente significativo.
Tabla 15. Resultados para el Análisis de Varianza
F.V SC GL CM F. cal F. Tab 5
%
F. Tab 1
%
Total 1,5199 11
Bloque 0,0017 2 0,0009 1,8 ns 5,14 10,92
Trat. 1,5152 3 0,5051 1010,2 ** 4,76 9,78
Error. 0,003 6 0,0005
- ns: no hay diferencia significativa
- **: diferencia al 1 %
Elaborado por: Diana Estrella
La tabla 16, el test de Duncan (pruebas de comparaciones múltiples) nos permite comparar que
medias son significativamente diferentes de otras, observando que entre los tratamientos T1 y T3
no hay diferencia significativa, en cambio entre los demás tratamientos si existe una diferencia
significativa.
63
Tabla 16. Test de comparaciones múltiples
Comparaciones Operación Diferencia Duncan Sig.
T1 vs T3 1,1200 - 1,0800 0,04 0,0446 ns
T1 vs T2 1,1200 - 0,6200 0,5 0,0462 *
T1 vs T4 1,1200 - 0,2600 0,86 0,047 *
T3 vs T2 1,0800 - 0,6200 0,46 0,0446 *
T3 vs T4 1,0800 - 0,2600 0,82 0,0462 *
T2 vs T4 0,6200 - 0,2600 0,36 0,0446 *
Elaborado por: Diana Estrella
La prueba de Duncan al 5 %, tabla 17, para los tratamientos detecta la presencia de tres
rangos siendo los tratamientos T1 y T3 los de ocupan el rango más alto, es decir los extractos
de hojas por el método de maceración y el extracto de raíces por maceración son las muestras
con mayor cantidad de compuestos fenólicos y por lo tanto son las sustancias elegidas para la
etapa II del presente trabajo de investigación.
Tabla 17. Prueba de Duncan al 5 % para tratamientos
Tratamientos Medias Rangos
T1 1,12 A
T3 1,08 A
T2 0,46 B
T4 0,26 C
Elaborado por: Diana Estrella
Evaluación de la actividad nootrópica de Smallanthus sonchifolius
De acuerdo con el análisis estadístico de la cantidad de compuestos polifenólicos las sustancias
elegidas para la administración a los ratones de prueba son los extractos de hojas y raíces
obtenidos por el método de maceración.
64
Para la administración oral de los extractos de prueba a los roedores se calculó el volumen de
extracto necesario según la dosis requerida como se indica en la tabla 18.
Tabla 18. Volumen de sustancias por administrar a ratones de prueba
Grupo Dosis Sexo Peso promedio
[g]
Volumen por
administrar [µl]
Control - 0 Machos 38,99 25
Hembras 29,12 25
Control + 240mg/70kg Machos 38,99 25
Hembras 29,12 25
HM 30 mg/kg Machos 38,99 105
Hembras 29,12 78
RM 30 mg/kg Machos 38,99 104
Hembras 29,12 78
Elaborado por: Diana Estrella
A continuación, se presentan los resultados de las diferentes pruebas realizadas a ratones (Mus
musculus) que sirvieron para evaluar su comportamiento.
Análisis Estadístico de la actividad nootrópica
Método 1. Laberinto Acuático de Morris.
Con los datos experimentales obtenidos (tiempos de latencia) se analizó la distribución
normal de los datos, los valores fueron ingresados en el software estadístico SEDEX V1.0 el
cual indico que los datos son homogéneos.
Diseño experimental factorial en bloques completamente al azar.
En la tabla 19 se muestran los datos generales y tiempo de latencia de la prueba realizada en el
Laberinto acuático de Morris.
65
Tabla 19. Datos generales, laberinto acuático de Morris
Gru
po
Sex
o
Tra
tam
ien
tos Tiempos de Latencia [seg]
Su
ma
tori
a
Med
ia
Repeticiones
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
Control negativo M A1B1 30.88 39.90 22.62 24.85 25.44 46.25 26.38 216,32 30,9
H A1B2 28.50 13.30 11.29 7.80 6.89 15.54 13.29 96,61 13,8
Control positivo M A2B1 21.14 24.33 9.44 15.77 12.42 6.94 12.01 102,05 14,58
H A2B2 25.47 31.41 9.09 14.33 33.28 24.49 11.86 149,93 21,42
Extracto de hojas
maceración
M A3B1 25.82 16.86 10.69 21.28 10.99 14.03 12.60 112,27 16,04
H A3B2 15.86 16.14 9.47 14.37 5.46 12.48 9.10 82,88 11,84
Extracto de raíces
maceración
M A4B1 10.99 13.83 10.03 6.41 8.64 9.35 4.09 63,34 9,05
H A4B2 18.39 18.59 11.98 16.32 13.72 14.76 18.75 112,51 16,07
Elaborado por: Diana Estrella
En la tabla 20, se observan los resultados del análisis de varianza, en los que existe una
diferencia significativa al 1 % para bloques, tratamientos y el factor A (sustancias de prueba),
en cambio no existe diferencia significativa para el factor B (sexo). Esto quiere decir que el
comportamiento de los ratones no es lo mismo conforme pasan los días, de igual manera se ve
un cambio de la actividad con los tratamientos y las sustancias en estudio, en cuanto se
relaciona al sexo se ve claramente que esta variable no tiene influencia en el efecto nootrópico.
Tabla 20. Resultados para análisis de varianza, laberinto acuático
F.V SC GL CM F. cal F. Tab 5
%
F. Tab 1
%
Total 4207,84 55
Bloque 782,75 6 130,46 4,62 ** 2,42 3,47
Trat. 2239,17 7 319,88 11,33 ** 2,33 3,3
FA 817,43 3 272,48 9,65 ** 2,92 4,51
FB 48,38 1 48,38 1,71 ns 4,17 7,56
IAB 1373,36 3 457,79 16,21 ** 2,92 4,51
Error 1185,92 42 28,24
- ns: no hay diferencia significativa
- **: diferencia al 1 %
Elaborado por: Diana Estrella
La prueba de Duncan al 5 %, tabla 21, para las sustancias en estudio se detecta la presencia
de tres rangos siendo los extractos A3 y A4 los de ocupan el rango más bajo, es decir los
66
extractos de hojas por el método de maceración y de raíces por maceración son los extractos
con menor tiempo de latencia por lo tanto son los más eficientes.
Tabla 21. Prueba de Duncan al 5 % para los extractos en estudio
Elaborado por: Diana Estrella
En la ilustración 8 podemos observar como fue el comportamiento de los ratones durante
los 7 días de prueba, como se indica los ratones del control negativo presentan tiempos de
latencia mayores a los demás grupos y un comportamiento inestable al igual que los ratones
del control positivo y al grupo que se administró extracto de hojas, a comparación con el grupo
de ratones a los que se les dio el extracto de raíces, los cuales tuvieron un comportamiento más
estable durante toda la prueba. En relación con los tiempos de latencia los del extracto de raíces
son considerablemente menores.
Elaborado por: Diana Estrella
Extractos Tratamientos Medias Duncan
Control - A1 22,35 A
Ginkgo Biloba A2 18,00 B
Hojas Maceración A3 13,94 B C
Raíces Maceración A4 12,56 C
1 2 3 4 5 6 7
Extract. Raices 16,21 14,69 11,01 11,36 11,18 12,05 11,42
Extrac. Hojas 16,49 20,84 10,08 17,83 8,22 13,25 10,85
Control + 27,87 23,30 9,26 15,05 22,85 15,72 11,93
Control - 26,60 29,69 16,95 16,32 16,16 30,90 19,84
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
TIEM
PO
DE
LATE
NC
IA [
SEG
]
DÍAS DE PRUEBA
Ilustración 8. Comportamiento de los grupos de estudio durante los días de prueba
67
Método 2. Laberinto Radial de ocho brazos
De la misma manera que con los datos experimentales obtenidos en el laberinto acuático de
Morris, se realiza el análisis de distribución normal de los tiempos de latencia, los cuales fueron
homogéneos.
Diseño experimental factorial en bloques completamente al azar.
En la tabla 22 se presentan los datos generales y tiempos de latencia de la prueba realizada en
el laberinto radial de ocho brazos.
Tabla 22. Datos generales, laberinto radial de ocho brazos
Elaborado por: Diana Estrella
En la tabla 23, se observan los resultados del análisis de varianza de los tiempos de latencia
obtenidos en la prueba del laberinto radial de ocho brazos, en los que existe una diferencia
significativa al 1 % para tratamientos y para el factor A (sustancias de prueba), en cambio no
existe diferencia significativa para bloques (Repeticiones) y para el factor B (sexo). Esto quiere
decir que se ve un cambio de la actividad con los tratamientos y las sustancias en estudio, en
cuanto al comportamiento de los ratones conforme pasan los días y al sexo de los ratones se ve
que estas variables no tienen influencia.
Gru
po
s
Sex
o
Tra
tam
ien
tos Tiempo de latencia [seg]
Su
ma
tori
a
Med
ia
Repeticiones
R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7
Control
negativo
M A1B1 389.40 323.80 558.60 311.60 270.20 387.20 476.47 2717,27 388,18
H A1B2 313.40 186.80 328.80 369.20 211.60 252.60 361.80 2024,2 289,17
Control positivo M A2B1 388.20 274.0 227.40 200.60 225.40 447.40 254.60 2017,6 288,23
H A2B2 494.0 429.0 341.60 255.40 304.20 317.40 257.20 2398,8 342,69
Extrac. de hojas
maceración
M A3B1 245.0 128.60 158.40 163.60 196.40 348.60 268.0 1508,6 215,51
H A3B2 262.80 229.60 254.0 346.0 135.80 314.0 243.80 1786 255,14
Extrac. de raíces
maceración
M A4B1 223.0 246.80 248.0 212.80 198.0 264.20 195.60 1588,4 226,91
H A4B2 333.40 198.40 223.0 479.0 272.0 234.60 225.0 1965,4 280,77
68
Tabla 23. Resultados para análisis de varianza, laberinto radial
- ns: no hay diferencia significativa
- **: diferencia al 1 %
Elaborado por: Diana Estrella
La prueba de Duncan al 5 %, tabla 24 para las sustancias en estudio detecta la presencia de
tres rangos siendo los tratamientos A3 y A4 los de ocupan el rango más bajo, es decir los
extractos de hojas y raíces por maceración son los extractos que fueron administrados a los
ratones y que presentaron menor tiempo de latencia.
Tabla 24. Prueba de Duncan al 5 % para los extractos en estudio
Elaborado por: Diana Estrella
En la ilustración 11, se indica el promedio de elecciones incorrectas que tuvieron los ratones
de cada grupo de estudio durante los siete días de prueba. Se observa que los controles negativo
y positivo no tienen un comportamiento normal, el número de desaciertos varia cada día, pero
el último día de prueba se logra observar que los desaciertos disminuyeron con relación al
primer día. El grupo que fue administrado el extracto de raíces presenta un promedio de
desaciertos constantes en el día 3 y 4 a partir de este va disminuyendo hasta el día 7. Los ratones
a los que se les dio el extracto de hojas presentan un comportamiento ideal, el promedio de
elecciones incorrectas va disminuyendo conforme avanzan los días de prueba, aunque los
F.V SC GL CM F. cal F. Tab 5 % F. Tab 1
%
Total 477363,41 55
Bloque 63933,27 6 10655,55 1,78 ns 2,42 3,47
Trat. 161755,69 7 23107,96 3,86 ** 2,33 3,3
FA 101417,18 3 33805,73 5,64 ** 2,92 4,51
FB 2095,12 1 2095,12 0,35 ns 4,17 7,56
IAB 58243,39 3 19414,46 3,24 * 2,92 4,51
Error 251674,45 42 5992,25
Extractos Tratamientos Medias Duncan
Control - A1 338,68 A
Ginkgo Biloba A2 315,46 A B
Hojas Maceración A3 235,33 B C
Raíces Maceración A4 253,84 C
69
números de errores cometidos son mayores a los observados en los ratones administrados
extracto de raíces.
Los resultados obtenidos en el tiempo de latencia y en el número de elecciones incorrectas
tienen relación y se puede llegar a concluir que las mejores sustancias son los extractos de hojas
y raíces de jícama obtenidos por maceración.
Ilustración 9. Número de elecciones incorrectas durante los días de prueba
Elaborado por: Diana Estrella
El propósito de estos dos métodos fue determinar el aprendizaje y la memoria espacial, que
están relacionadas con la capacidad de adquirir y retener características ambientales, almacenar
y recuperar información acerca de rutas, configuraciones y localizaciones espaciales.
El aprendizaje y la memoria espacial se evaluaron mediante el tiempo de latencia, es decir,
el tiempo en el cual el roedor va a cumplir con el objetivo, mientras menos tiempo requiera
significa que el comportamiento es el óptimo.
1 2 3 4 5 6 7
Control Negativo 7 5 7 6 7 7 4
Ginkgo Biloba 5 3 5 5 3 7 4
Hojas Maceración 7 7 7 6 5 5 4
Raices Jícama 3 4 5 5 4 3 3
0
1
2
3
4
5
6
7
8
NÚ
MER
O D
E EL
ECC
IOO
NES
INC
OR
REC
TAS
DÍAS DE PRUEBA
70
Análisis de pesos
Se realizó el control del peso de los ratones durante todas las semanas de prueba, en la tabla
25 se indican los pesos promedios de los machos y hembras. Como se puede observar el peso
de los machos es significativamente mayor que el peso de las hembras desde el primer día de
prueba.
Tabla 25. Pesos de los ratones durante las 7 semanas de prueba
Elaborado por: Diana Estrella
En la ilustración 10 y 11 se puede apreciar gráficamente como fueron los pesos en los
ratones machos y hembras respectivamente a lo largo de toda prueba y para cada sustancia de
estudio, no existe una variación considerable en los pesos desde el primer día que se empezó
la prueba hasta la semana 7 en ninguna sustancia se evidenció subidas o bajadas bruscas de
peso, lo que nos ayuda concluir que no se produjo cambios en el metabolismo del ratón o que
se presentó problemas en los órganos internos, observación que se corroboró realizando la
necropsia de un ratón de cada grupo de estudio una vez finalizadas las pruebas.
Sustancias Sexo
Pesos [g] S
eman
a
1
Sem
an
a
2
Sem
an
a
3
Sem
an
a
4
Sem
an
a
5
Sem
an
a
6
Sem
an
a
7
Agua Macho 39,0 39,8 39,6 38,6 38,1 37,9 38,1
Hembra 28,0 28,7 29,1 29,2 28,9 28,6 29,6
Ginkgo biloba Macho 38,3 40,1 39,5 38,5 37,3 36,5 38,1
Hembra 27,7 30,0 29,4 29,6 29,6 29,6 30,3
Hojas de Jícama Macho 35,0 38,5 38,3 37,7 36,9 36,4 37,3
Hembra 28,7 29,8 29,9 30,0 30,1 30,0 30,6
Raíces de Jícama Macho 35,3 37,5 38,8 38,6 38,4 38,3 38,3
Hembra 26,0 27,9 27,9 28,1 28,0 27,9 27,9
71
Elaborado por: Diana Estrella
Elaborado por: Diana Estrella
32,0
33,0
34,0
35,0
36,0
37,0
38,0
39,0
40,0
41,0
1 2 3 4 5 6 7
Pes
os
[g]
SemanasControl - Control + Hojas Jícama Raíces jícama
Ilustración 10. Pesos de ratones machos durante 7 semanas de prueba
23,0
24,0
25,0
26,0
27,0
28,0
29,0
30,0
31,0
1 2 3 4 5 6 7
Control - Control + Hojas Jícama Raíces Jícama
Ilustración 11. Pesos de ratones hembra durante 7 semanas de prueba
72
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
1. Con la caracterización taxonómica y fitoquímica de jícama, se confirmó que se
trataba de la especie Smallanthus sonchifolius y se encontró que los principales
grupos químicos en la planta son alcaloides, flavonoides, taninos y antraquinonas
los cuales fueron comprobados por cromatografía en capa fina.
2. Se confirmó la presencia de ácido clorogénico por cromatografía en capa fina (CCF)
en extractos hidroalcohólicos de hojas y raíces de Smallanthus sonchifolius.
3. La cuantificación de compuestos fenólicos en los extractos de hojas y raíces de
jícama por los métodos de maceración y expresión fue realizada por
espectrofotometría UV/Vis, encontrando mayor contenido en los extractos de hojas
y raíces por maceración, 1,12 y 1,08 [EAG/ml de extracto] respectivamente.
4. Según las pruebas realizadas para la evaluación del efecto nootrópico, se evidenció
que los extractos de las hojas y raíces de jícama obtenida por maceración
presentaron cambios en el aprendizaje y memoria espacial comparado con el control
negativo. Sin embargo, estadísticamente se evidenció que el extracto de raíces fue
el mejor.
73
Recomendaciones
1. Repetir esta investigación utilizando como materia prima jícama proveniente de una
zona geográfica diferente, tomando en cuenta que la composición química puede
variar en concentración y por ende cambiar la actividad farmacológica.
2. Se recomienda preparar extractos con diferentes concentraciones de etanol y con
otros solventes para evaluar el efecto nootrópico. Además, es importante realizar
estudios de toxicidad de los extractos utilizados en el trabajo de investigación con
el fin de asegurar su inocuidad.
3. Evaluar los extractos obtenidos esta especie para otras actividades biológicas,
debido a que existe la posible presencia de alcaloides.
4. Se recomienda usar una muestra animal más amplia y homogénea para disminuir el
coeficiente de variación y la aleatoriedad de los datos.
74
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83
ANEXOS
84
A. Árbol de problemas
85
B. Procedimiento de tamizaje fitoquímico
86
C. Certificado de caracterización taxonómica.
87
D. Fotografías
Análisis macroscópico.
Determinación de cenizas totales
88
Determinación de humedad.
Tamizaje fitoquímico.
89
Determinación del contenido de polifenoles totales
Evaluación de la actividad nootrópica de Smallanthus sonchifolius
