Embed Size (px)
Citation preview
TUGAS TERSTRUKTUR BIOFARMASETIKA
PROTOKOL EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI
KAPLET ASAM MEFENAMAT 500 mg
Disusun oleh :
Yudha Fahmi A G1F008036
Awaliyatun Nikmah G1F011018
Heppi Purnomo G1F011024
KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN KEBUDAYAAN
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU-ILMU KESEHATAN
JURUSAN FARMASI
PURWOKERTO
2013
PROTOKOL EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI KAPLET ASAM
MEFENAMAT 500mg
Asam mefenamat merupakan derivat asam antranilat dan termasuk kedalam
golongan obat Anti Inflamasi Nonsteroid (AINS). Dalam pengobatan, asam
mefenamat digunakan untuk meredakan nyeri dan rematik. Obat ini cukup toksik
terutama untuk anak-anak dan janin, karena sifat toksiknya, Asam mefenamat
tidak boleh dipakai selama lebih dari 1 minggu dan sebaiknya jangan digunakan
untuk anak-anak yang usianya di bawah 14 tahun (Munaf,1994).
Stuktur asam mefenamat
Rumus Molekul : C15H15NO2
Berat Molekul : 241.29
Pemerian : serbuk hablur putih atau hampir putih. Melebur pada suhu
lebih kurang 230 ºC disertai peruraian.
Kelarutan : larut dalam alkali hidroksida, agak sukar larut dalam
klorofom, sukar larut dalam etanol dan methanol, praktis tidak larut
dalam air.
Persyaratan Kadar : mengandung asam mefenamat tidak kurang dari
90.0% dan tidak lebih dari 110% dari jumlah yang tertera pada etiket
(Anonim,1995).
Asam mefenamat mempunyai khasiat sebagai analgetik dan anti inflamasi.
Asam mefenamat merupakan satu-satunya fenamat yang menunjukkan kerja pusat
dan juga kerja perifer. Mekanisme kerja asam mefenamat adalah dengan
menghambat kerja enzim sikloogsigenase (Goodman, 2007). Tablet asam
mefenamat diberikan secara oral. Diberikan melalui mulut dan diabsorbsi pertama
kali dari lambung dan usus selanjutnya obat akan melalui hati diserap darah dan
dibawa oleh darah sampai ke tempat kerjanya. konsentrasi puncak asam
mefenamat dalam plasma tercapai dalam 2 sampai 4 jam. Pada manusia, sekitar
50% dosis asam mefenamat diekskresikan dalam urin sebagai metabolit 3-
hidroksimetil terkonjugasi dan 20% obat ini ditemukan dalam feses sebagai
metabolit 3-karboksil yang tidak terkonjugasi (Goodman, 2007).
Parameter farmakokinetik Keterangan
T1/2 eliminasi 2-4 jam
t max 2 jam
C max 20 µg/mL
Steady state tercapai dalam 2 hari
Vd 1,06 L/kg
Protein binding Lebih dari 90 %
ekskresi ± 50 % dosis dikeluarkan di urin
20 % dosis dikeluarkan dalam feses
Efek samping dari asam mefenamat terhadap saluran cerna yang sering
timbul adalah diare, diare sampai berdarah dan gejala iritasi terhadap mukosa
lambung, selain itu dapat juga menyebabkan eritema kulit, memperhebat gejala
asma dan kemungkinan gangguan ginjal (Setiabudy, 2009).
TUJUAN EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI OBAT
Produk obat yang mengandung zat aktif berupa zat kimia baru (new
chemical entity = NCE) dibutuhkan penilaian mengenai efikasi, keamanan dan
mutu secara lengkap. NCE ini yang dipatenkan oleh pabrik penemunya disebut
juga obat inovator. Sedangkan untuk produk obat yang merupakan produk “copy”
hanya dibutuhkan standar mutu yang antara lain berupa bioekivalensi dengan
produk obat innovator sebagai produk pembanding (reference product) yang
merupakan baku mutu (BPOM,2005)
Evaluasi produk farmasetik perlu dilakukan guna untuk menjamin efikasi,
keamanan dan mutu produk obat yang beredar serta untuk menjamin produk obat
”copy” yang akan mendapat izin edar bioekivalen dengan produk obat
inovatornya juga untuk menentukan bioavailabilitas absolut dan relatif suatu zat
kimia baru, serta bioekivalensi zat tersebut dalam formulasi untuk uji klinik dan
dalam produk yang akan dipasarkan. Untuk mengetahui perbandingan kualitas
produk copy dengan sediaan inovator perlu diketahui bioekuivalensi antara dua
sediaan tersebut. Masing-masing sediaan diukur bioavailabilitasnya. Perbandingan
bioavailabilitas ini disebut bioekivalansi obat (BPOM,2005).
Dasar untuk menentukan bioavailabilitas suatu obat terlebih dahulu harus
diketahui profil disolusinya. Disolusi tablet ialah jumlah atau persen zat aktif dari
sediaan padat yang larut pada waktu tertentu dalam kondisi baku. Kondisi yang
dimaksud misalnya, dalam suhu, kecepatan, pengadukan, dan komposisi media
tertentu. Uji disolusi merupakan suatu metode fisika kimia yang penting sebagai
parameter dalam pengembangan produk dan pengendalian mutu sediaan obat
yang didasarkan pada pengukuran kecepatan pelepasan dan melarut zat aktif dari
sediaannya. Uji disolusi digunakan untuk uji bioavailabilitas secara in vitro,
karena hasil uji disolusi berkorelasi dengan ketersediaan hayati obat dalam tubuh
(Ari,2006).
Studi bioekivalensi (BE) adalah studi bioavailabilitas (BA) komparatif yang
dirancang untuk menunjukkan bioekivalensi antara produk uji (suatu produk obat
”copy”) dengan produk obat inovator /pembandingnya. Caranya dengan
membandingkan profil kadar obat dalam darah atau urin antara produk-produk
obat yang dibandingkan pada subyek manusia. Karena itu desain dan pelaksanaan
studi BE harus mengikuti Pedoman Cara Uji Klinik yang Baik (CUKB), termasuk
harus lolos Kaji Etik.Ekivalensi farmaseutik Dua produk obat mempunyai
ekivalensi farmaseutik jika keduanya mengandung zat aktif yang sama dalam
jumlah yang sama dan bentuk sediaan yang sama. Alternatif farmaseutik adalah
dua produk obat merupakan alternatif farmaseutik jika keduanya mengandung zat
aktif yang sama tetapi berbeda dalam bentuk kimia (garam, ester, dsb) atau bentuk
sediaan atau kekuatan (BPOM,2005).
Dua produk obat disebut bioekivalen jika keduanya mempunyai ekivalensi
farmaseutik atau merupakan alternatif farmaseutik dan pada pemberian dengan
dosis molar yang sama akan menghasilkan bioavailabilitas yang sebanding
sehingga efeknya akan sama, dalam hal efikasi maupun keamanan. Jika
bioavailabilitas nya yang tidak memenuhi kriteria bioekivalen maka kedua produk
obat tersebut disebut bioinekivalen. Dua produk obat mempunyai ekivalensi
terapeutik jika keduanya mempunyai ekivalensi farmaseutik atau merupakan
alternatif farmaseutik dan pada pemberian dengan dosis molar yang sama akan
menghasilkan efikasi klinik dan keamanan yang sebanding. Dengan demikian,
ekivalensi/inekivalensi terapeutik seharusnya ditunjukkan dengan uji klinik.Akan
tetapi, untuk produk obat yang bekerja sistemik, uji klinik mempunyai kendala
berikut :
pada penyakit ringan tidak terlihat, pada penyakit berat tidak etis;
endpoint yang diukur seringkali kurang akurat sehingga variabilitasnya besar
sekali, dengan akibat dibutuhkan sampel yang besar;
sebagai uji klinik untuk menunjukkan ekivalensi dibutuhkan sampel yang
besar sekali.
Oleh karena itu, sebagai alternatif dilakukan uji bioekivalensi yang
endpointnya sangat akurat (yakni kadar obat dalam plasma) sehingga
variabilitasnya rendah, dan dengan demikiansampel yang dibutuhkan jauh lebih
kecil. Jika terdapat perbedaan yang bermakna secara klinik dalam
bioavailabilitasnya, maka kedua produk obat tersebut dinyatakan inekivalen
secara terapeutik (inekivalensi terapeutik) (BPOM,2005).
PROTOKOL EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI KAPLET ASAM
MEFENAMAT 500mg
Evaluasi ketersediaan hayati kaplet asam mefenamat dilakukan dengan
beberapa tahapan, yaitu evaluasi ekivalensi farmasetik, uji disolusi terbanding (uji
in vitro) dan uji ketersediaan hayati secara in vivo.
1. EKIVALENSI FARMASETIK
Uji pertama yang dilakukan untuk mengevaluasi ketersediaan hayati
suatu obat adalah uji ekivalensi farmasetik. Uji ini akan menunjukkan
kadar zat aktif dalam suatu sediaan. Dua produk obat memiliki ekivalensi
farmasetik jika kedua obat tersebut mengandung zat aktif yang sama
dalam jumlah yang sama dan bentuk sediaan yang sama. Suatu pengujian
ekivalensi farmasetik dapat dilakukan dengan cara membandingkan
kandungannya, yaitu
PROTOKOL PENGUJIAN
Metode pengukuran kadar : spektrofotometri UV (Singh,2011)
Instrumen : Perkin Elmer UV-Visible Spektrovotometri model
lambda 25 dengan spektral band width 1 nm
Akurasi panjang gelombang : 0,5 nm dan 1 cm yang cocok dengan
sel kuarta.
Panjang gelombang analisis : 285 nm
Larutan induk
Larutan induk memiliki konsentrasi 1 mg/ml yang dibuat dengan
melarutkan 50 mg obat murni dalam 0,1 M HCl dan diencerkan
dengan 50 ml 0,1 M HCl.
Penentuan kurva baku asam mefenamat
Pembuatan kurva baku dilakukan dengan mengambil larutan induk
sebanyak 7 titik yaitu 0, 1, 2 ,3 , 4, 5, 6 dan 7.0 mL dan diletakkan
pada labu ukur 100 mL, kemudian ditambahkan 0.1 M HCl sampai
tanda batas. Kemudian larutan tersebut diukur panjang gelombangnya
pada rentang 200‐400 nm. Panjang gelombang yang dihasilkan adalah
285 nm. Dari data yang dihasilkan lalu ditentukan persamaan kurva
baku dari asam mefenamat standar.
Pengukuran kadar / kandungan tablet asam mefenamat
Dua puluh kaplet ditimbang secara akurat dan digerus sampai halus
menjadi serbuk. Serbuk asam mefenamat sebanyak 100mg ditimbang
secara akurat dan dimasukkan kedalam labu ukur 100 ml, kemudian
ditambahkan 60 ml HCl 0,1 M. campuran tersebut dikocok selama 15-
20 menit dan di add sampai volume 100 ml. Larutan disaring dengan
kertas Whatman No. 42 kemudian 10 mL alikuot yang didapat
digunakan untuk analisis kadar dengan metode spektrofotometri yang
telah ditetapkan.
2. UJI DISOLUSI TERBANDING (UJI IN VITRO)
Dasar untuk menentukan bioavailabilitas suatu obat terlebih dahulu
harus diketahui profil disolusinya. Uji disolusi digunakan untuk uji
bioavailabilitas secara in vitro, karena hasil uji disolusi berkorelasi dengan
ketersediaan hayati obat dalam tubuh.
Potensi dan karakteristik disolusi in vitro dari produk obat uji dan
pembanding dipastikan dulu sebelum dilakukan studi BE. Hasilnya harus
dilaporkan sebagai profil persen obat yang terlarut terhadap waktu. Nomor
batch kedua produk harus dicantumkan, demikian juga tanggal kadaluarsa
produk pembanding. Kandungan zat aktif antara kedua produk tidak boleh
berbeda lebih dari 5%. Jika potensi produk pembanding menyimpang >
5% dari kandungan 100% yang tercantum dalam label, perbedaan ini dapat
digunakan kemudian untuk koreksi dosis pada perhitungan parameter
bioavailabilitas pada studi BE (BPOM,2005).
PROTOKOL PENGUJIAN
Uji dilaksanakan secara analitik observasional dengan sampel 1 jenis
kaplet asam mefenamat 500mg sediaan copy dan sediaan inovator
(Ponstan). Masing - masing sediaan 4 tablet.
Bahan yang diperlukan adalah kaplet asam mefenamat 500mg 8 buah
masing – masing dalam sediaan copy dan inovator (ponstan) sebanyak
4 kaplet,aquades 7200 ml untuk mengisi 8 vessel sebagai media
disolusi dan sebanyak 16 liter aquadessebagai penangas air pada
disolusi tester.
Pada tahap pertama sampel akan mengalami uji disolusi. Alat uji
disolusi yang digunakan adalah Disolution Tester tipe 1 ERWEKA
DT600HH, diset pada suhu 370C, kecepatan 100 rpm selama 20
menit.
900 ml media disolusi disiapkan untuk uji disolusi. Media yang
dianjurkan untuk pengujian terdiri dari :
HCL 0,1 N atau media simulated gastric fluid (SGF) bebas enzim
Buffer pH 4,5
Buffer fosfat pH 6,8 atau media simulated intestinal fluid (SIF)
bebas enzim
Kaplet asam mefenamat 500mg dimasukkan dalam 8 vessel pada
tiap-tiap media disolusi masing – masing 1 buah. Sampel diambil
dengan spuit tiap 5 menit sehingga dalam waktu 20 menit,total data
yang didapat untuk asam mefenamat 500mg sediaan copy dan sediaan
inovator (Ponstan) adalah 48 data.
Setelah semua data didapat kemudian dilanjutkan dengan pembacaan
hasil uji disolusi melalui aspirasi pada spektrofotometer. Alat yang
digunakan adalah Spektrofotometer UV. Alat diatur pada panjang
gelombang 254 nm dengan memasukkan media disolusi sebagai
larutan blangko, kemudian dilihat absorbansi produk copy maupun
produk inovator pada tiap titik pengambilan sample.. Dari hasil
tersebut dapat dihitung kadar zat aktif yang terlarut (%).
Kadar zat aktif yang terlarut (%) =
Fu Au Cb
V x Mb x ---- x ---- x ---- x 100 %
Fb Ab Ke
V = volum media disolusi (dalam ml)
Mb = penimbangan baku (dalam mg)
Fu = faktor pengenceran sampel
Fb = faktor pengenceran larutan baku
Au = absorbansi larutan sampel
Ab = absorbansi larutan baku
Cb = kadar larutan baku yang diukur (dalam mg per ml)
Ke = kadar asam mefenamat per tablet yang tertera pada etiket ( mg)
(Ari,2006)
Dari rumus diatas,dapat diketahui persen obat terlepas dari sediaan
yang diuji.jika produk yang diuji merupakan produk inovator maka profil
disolusi yang didapat tidak perlu dibandingkan. Namun jika produk yang
diuji disolusinya adalah produk copy maka profil disolusi produk copy
yang didapat dibandingkan dengan profil disolusi produk inovator, Profil
disolusi dibandingkan dengan menggunakan faktor kemiripan f2 yang
dihitung dengan persamaan berikut :
Rt = persentase kumulatif obat yang larut pada setiap waktu sampling
dari produk pembanding (R =reference)
Tt = persentase kumulatif obat yang larut pada setiap waktu sampling
dari produk uji (T = test)
Nilai f2 50 atau lebih besar (50–100) menunjukkan kesamaan
atau ekivalensi ke – 2 kurva, yang berarti kemiripan profil
disolusi ke-2 produk;
Jika produk ”copy” dan produk pembanding memiliki disolusi
yang sangat cepat (> 85% melarut dalam waktu < 15 menit
dalam ke-3 media dengan metode uji yang dianjurkan),
perbandingan profil disolusi tidak diperlukan.
Disamping itu harus ditunjukkan bahwa eksipien dalam komposisi
produk obat sudah dikenal, bahwa tidak ada efek terhadap motilitas
saluran cerna atau proses lain yang mempengaruhi absorpsi, juga
diperkirakan tidak ada interaksi antara eksipien dan zat aktif yang dapat
mengubah farmakokinetik zat aktif. Jika digunakan eksipien baru atau
eksipien yang biasa digunakan tapi dalam jumlah yang luar biasa besar,
diperlukan tambahan informasi yang menunjukkan tidak adanyadampak
terhadap bioavailabilitas.
Uji disolusi terbanding juga dapat digunakan untuk memastikan
kemiripan kualitas dan sifat-sifat produk obat dengan perubahan minor
dalam formulasi atau pembuatan setelah izin pemasaran obat
(BPOM,2005).
3. PELAKSANAAN EVALUASI KETERSEDIAAN HAYATI
Bioavailabilitas (ketersediaan hayati) adalah persentase dan kecepatan
zat aktif dalam suatu produk obat yang mencapai/tersedia dalam sirkulasi
sistemik dalam bentuk utuh/aktif setelah pemberian produk obat tersebut,
diukur dari kadarnya dalam darah terhadap waktu atau dari ekskresinya
dalam urin
1. Bioavailabilitas absolut
Bioavailabilitas absolut adalah bila dibandingkan dengan sediaan
intravena yang bioavailabilitasnya 100 % ( F = 1)
2. Uji bioavailabilitas relatif
Bioavailabilitas relatif adalah bila suatu sediaan dibandingkan dengan
sediaan bukan intravena.
Bioavailabilitas produk copy asam mefenamat 500mg ditentukan
bioavailabilitas relatifnya dibandingkan dengan tablet Ponstan 500mg
(produk inovator)
Evaluasi ketersediaan hayati dilakukan dengan studi bioekivalensi
(BE),yaitu studi bioavailabilitas (BA) komparatif yang dirancang untuk
menunjukkan bioekivalensi antara produk uji (suatu produk obat ”copy”)
dengan produk obat inovator /pembandingnya. Caranya dengan
membandingkan profil kadar obat dalam darah atau urin antara produk-
produk obat yang dibandingkan pada subyek manusia. Karena itu desain
dan pelaksanaan studi BE harus mengikuti Pedoman Cara Uji Klinik yang
Baik (CUKB), termasuk harus lolos Kaji Etik.
Produk obat uji yang digunakan dalam studi BE harus dibuat sesuai
dengan Cara Pembuatan Obat yang Baik (CPOB), dan catatan
batchnya harus dilaporkan.
Produk uji yang digunakan dalam studi BE untuk tujuan registrasi
harus identik dengan produk obat yang akan dipasarkan. Karena
itu, tidak hanya komposisi dan sifat-sifatnya (termasuk stabilitas),
tetapi juga cara produksinya harus sama dengan cara produksi rutin
yang akan datang.
Idealnya, produk uji harus diambil dari batch skala industri. Jika ini
tidak mungkin, batch produksi berskala kecil atau pilotbatch dapat
digunakan asalkan tidak lebih kecil dari 10% batch skala industri
atau 100.000 unit (pilih yang besar), kecuali jika ada alasan khusus.
Sponsor harus menyimpan sampel dari semua produk yang diteliti
dalam studi (dalam jumlah yang cukup) selama 2 tahun setelah
selesainya studi atau 1 tahun lebih lama dari masa pakai (shelflife)
produk atau sampai keluarnya izin edar (mana yang lebih lama)
agar dapat dilakukan pemeriksaan ulang jika diminta oleh Badan
POM.
Kaji Etik
Oleh karena studi BA/BE dilakukan pada subyek manusia (suatu uji
klinik) maka protokol studi harus lolos kaji etik terlebih dahulu sebelum
studi dapat dimulai.
DESAIN
Pelaksanaan uji in vivo dilaksanakan sesuai dengan panduan yang
dibuat oleh dunia internasional. Pengujian bioavailabilitas dari asam
mefenamat dievaluasi dari ploting kadar obat dalam darah terhadap waktu
pengambilan sampel setelah pemberian obat secara oral,yang kemudian
diikuti dengan perhitungan parameter-parameter farmakokinetiknya.
Studi dilakukan pada subyek yang sama (dengan desain menyilang)
untuk menghilangkan variasi biologik antar subyek (karena setiap
subyek menjadi kontrolnya sendiri), hal ini sangat memperkecil
jumlah subyek yang dibutuhkan. Jadi untuk membandingkan 2 produk
obat, dilakukan studi menyilang 2-way (2 periode untuk pemberian 2
produk obat pada setiap subyek).
Tiap Subjek uji mendapatkan 500mg asam mefenamat 5 kali interval
pemberian terlebih dahulu dengan asumsi pada 5 kali pemberian kadar
obat dalam darah sudah steady state.
Pengambilan sampel darah dilakukan pada saat kadar obat plasma
sudah steady state,sehingga memberikan nilai farmakokinetika yang
konstan.
Pemberian produk obat yang pertama (obat inovator/ponstan) harus
dilakukan secara acak agar efek urutan (order effect) maupun efek
waktu (period effect), bila ada, dibuat seimbang.
Kedua perlakuan dipisahkan oleh periode washout yang cukup untuk
eliminasi produk obat inovator yang diberikan pertama kali diberikan
dalam hal ini periode washout pemberian asam mefenamat adalah 10
jam (5 kali t1/2 asam mefenamat,t1/2 = 2 jam)
(USP,2013)
Subjek
Kriteria seleksi
o Sukarelawan sehat (untuk mengurangi variasi antar subyek);
o Sedapat mungkin pria dan wanita (jika wanita pertimbangkan risiko
pada wanita usia subur;
o Umur antara 18 – 55 tahun
o Berat badan dalam kisaran normal (47-87 kg)
o Kriteria sehat berdasarkan uji laboratorium klinis yang baku
(hematologi rutin, fungsi hati, fungsi ginjal, gula darah, dan
urinalisis), riwayat penyakit, dan pemeriksaan fisik;
o Pemeriksaan khusus mungkin harus dilakukan sebelum, selama
dan setelah studi selesai, bergantung pada kelas terapi dan profil
keamanan obat yang diteliti.
o Sebaiknya bukan perokok. Jika perokok sedang (kurang dari 10
batang sehari) diikutsertakan, harus disebutkan dan efeknya pada
hasil studi harus didiskusikan;
o Tidak mempunyai riwayat ketergantungan pada alkohol atau
penyalahgunaan obat;
o Tidak kontraindikasi atau hipersensitif terhadap asam mefenamat
o Uji serologis terhadap Hepatitis B (HBsAg), Hepatitis C (anti-
HCV) dan HIV (anti-HIV) optinal B.
(Alil,2004)
Jumlah subjek
Jumlah subyek yang dibutuhkan dihitung berdasarkan parameter
bioavailabilitas yang utama, yakni AUC atau luas area dibawah kurva
kadar obat dalam darah terhadap waktu, yang menunjukkan jumlah
obat yang masuk peredaran darah sistemik.
Jumlah subjek berjumlah 12 orang dimana 6 orang mendapatkan
pemberian obat produk inovator dan 6 orang mendapatkan
pemberian produk copy
Standardisasi kondisi studi
Kondisi studi harus dibakukan (untuk mengurangi variabilitas
berbagai faktor yang terlibat kecuali produk yang diuji) :
o subjek uji dipuasakan selama 10 jam sebelum pemberian obat asam
mefenamat yang diujikan
o studi BE asam mefenamat harus dilakukan bersama makanan
standar;karena makanan dapat menikan kadar asam mefenamat
dalam darah
o Volume air yang diminum bersama produk harus konstan (antara
150 – 200 ml) karena dapat mempengaruhi pengosongan lambung;
o Semua makanan dan minuman yang dikonsumsi setelah pemberian
produk harus dibakukan komposisi dan waktu pemberiannya
selama periode pengambilan sampel darah :
Air boleh diminum kapan saja kecuali 1 jam sebelum dan 2 jam
sesudah pemberian produk;
Makanan standar diberikan tidak kurang dari 4 jam setelah
pemberian produk;
o Subyek tidak boleh makan obat lain apapun (termasuk obat bebas
dan obat tradisional) selama beberapa waktu sebelum penelitian
(minimal 1 minggu) dan selama penelitian.
o Subyek tidak boleh mengkonsumsi makanan dan minuman yang
dapat berinteraksi dengan fungsi sirkulasi, saluran cerna, hati atau
ginjal (misal : merokok, minum alkohol, kopi, teh, kola, coklat atau
jus buah) selama 24 jam sebelum penelitian dan selama periode
pengambilan sampel darah;
o Subjek uji diatur agar dalam posisi duduk pada hari pengujian
karena posisi tubuh dan aktivitas fisik juga harus distandardisir
sepanjang hari penelitian karena akan mempengaruhi motilitas dan
aliran darah saluran cerna.
(Alil,2004)
Genetic phenotyping
Menurut (Alil,2004),Phenotyping subyek harus dilakukan
karena diketahui asam mefenamat memiliki beberapa veriabilitas pada
beberapa gen terkait seperti CYP3A4.Dosis harus disesuaikan pada
subyek yang bersangkutan :
untuk alasan keamanan pada studi menyilang maupun studi paralel;
untuk menghindari terjadinya bias/variasi pada studi paralel
Dosis pemberian
Dosis asam mefenamat yang diberikan adalah 500mg
500mg asam mefenamat diberikan 5 kali interval pemberian (5 x 8
jam) terlebih dahulu untuk mencapai kadar obat dalam plasma yang
steady state.
Pengambilan sample dilakukan saat obat mencapai kadar steady
state.
Pengambilan sempel darah
o sample darah digunakan untuk analisa kadar obat dalam sirkulasi
sistemik
o kadar obat atau metabolit diukur dalam serum atau plasma setelah
obat dalam plasma sedah pada kondisi steady state.
o Sampel darah harus diambil pada waktu-waktu tertentu sehingga
dapat menggambarkan fase-fase absorpsi,distribusi, dan eliminasi
obat;
o Untuk kebanyakan obat diperlukan 12-18 sampel darah, yakni :
1 sampel sebelum obat : pada waktu nol (t0) ;
2-3 sampel sebelum kadar maksimal (Cmax) ;
4-6 sampel sekitar Cmax ;
5-8 sampel setelah Cmax, sampai sedikitnya 3 atau lebih waktu
paruh eliminasi obat dalam plasma (> 3 x t1/2).
Dengan demikian akan diperoleh AUC (luas area dibawah kurva
kadar obat terhadap waktu) sedikitnya 80% dari AUC yang
diekstrapolasi ke tidak terhingga (∞)
o Estimasi waktu paruh eliminasi harus diperoleh dari sedikitnya 3-4
sampel selama fase log linear terminal;
o Untuk obat atau metabolit aktifnya yang mempunyai waktu paruh
eliminasi (t1/2) yang panjang (> 24 jam), sampel darah harus
diambil sampai sedikitnya 72 jam jika variabilitas intra-subyek
kecil, atau lebih lama jika variabilitas intra-subyek besar;
o Pada studi keadaan tunak, untuk obat dengan kronofarmakologi,
jika ritme sirkadian diketahui mempengaruhi bioavailabilitas, maka
sampel darah harus diambil selama 1 siklus 24 jam penuh,namun
asam mefenamat tidak terpengaruh siklus sirkardian.
(Lo,1997)
Pengambilan sampel urin
o Sample unrin di kumpulkan dari subjek uji.
Sample urin digunakan karena 50% dosis asam mefenamat
diekskresikan dalam urin sebagai metabolit 3-hidroksimetil
terkonjugasi Sampel urin hanya digunakan eliminasi obat melalui
ginjal cukup besar (> 40%);
o Urin dikumpulkan di tempat studi secara periodik sampai
sedikitnya 3 x waktu paruh eliminasi obat (3 x t1/2).atau sampai
obat dalam tubuh sudah pada kondisi steady state.
o Studi dilakukan selama 24 jam, waktu sampling dilakukan pada
jam 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 dan 24 jam. Volume urin setiap
interval waktu tersebut harus diukur dan dilaporkan;
o Dibuat kurva jumlah obat kumulatif yang diekskresi dalam urin
terhadap waktu.
(Hirai,1997)
Kadar yang diukur
1. Sampel darah
Kadar yang diukur dalam plasma/serum adalah senyawa induk
atau dalam hal ini adalah zat aktif dari asam mefenamat atau N-2,3-
xililantranilat. asam mefenamat dalam serum terdapat dalam bentuk
utuh karena belum di metabolisme (bukan merupakan prodrug),asam
mefenamat baru di metabolisme saat peroses eliminasi.
(Lo,1997)
2. Sampel urin
Kadar yang diukur dalam urin adalah metabolit 3-hidroksimetil
terkonjugasi, karena sekitar 50% dosis asam mefenamat
diekskresikan dalam urin sebagai metabolit 3-hidroksimetil
terkonjugasi. (Goodman, 2007)
Metode bioanalitik
1. Sampel darah (Lo,1997)
Sampel asam mefenamat stabil dalam darah untuk dilakukan
analisis selanjutnya
Metode : microbore high-performance liquid chromatography–
diode array detection dan capillary gas chromatography–flame
ionization detection.
HPLC (HPLC-DAD):
HPLC tipe Hewlett-Packard 1090 yang dilengkapi dengan
detektor diode array
Kolom : 200 mm x 2.1 mm I.D. microbore ODS-Hypersil
(ukuran partikel 5 mm )
Fase gerak : sistem elusi gradien dengan larutan A: 2 mM
bufer fosfst pH 3.2 dan larutan B: Acetonitrile
Panjang gelombang analisis : 210 nm
Flow-rate fase gerak : 0.4 ml/min
Total waktu analisis : 35 menit
Pengaturan gradien eluen :
Time (min) % Acetonitrile
0 5
20 50
30 50
31 5
GC (kromatografi gas) / GC-FID
Gas kromatografi tipe Hewlett-Packard 5890 dengan detektor
flame ionisasi
Kolom : 25 m narrow-bore x 0.25 mm I.D. HP-5 (tebal film
0.33 mm)
Kondisi analisis GC : suhu awal : 100 0C selama 1 menit ; suhu
hingga akhir analisis : 3000C sampai 14menit, suhu injector :
3000C; suhu detector temperature: 310
0C; tekanan gas N2: 250
kPa; tekanan gas H2: 105 kPa; tekanan udara: 300 kPa; column
flow: 1 ml /min, kecepatan alir gas: 5 ml /min.
Preparasi sempel
Sample darah yang dianalisis harus bebas dari Human
Immunodeficiency Virus I dan II, Treponema Pallidum dan
virus Hepatitis B
Disiapkan sample darah kontrol (tidak mengandung asam
mefenamat yang dianalisis),darah diambil dari subjek sebelum
pemberian obat.sampel disimpan pada suhu 40C selama 3 hari
sebelum proses selanjutnya.
Sampel darah di tambahkan 0.5 ml larutan NH4Cl jenuh
Divortex selama 10 detik,lalu ditambahkan 5 ml extracting
solvent (ethyl acetate mengandung 4.0 mg/ml heptabarbitone)
Dikocok selama 15 menit
Disentrifugasi pada 2500rpm selama 4 menit
Supernatan diambil dan dipindahkan tabung reaksi,dan dikenai
paparan gas nitrogen untuk menghilangkan pelarut organik
pada sampel.
Sampel di vortex dengan ditambahkan campuran 1 ml
acetonitrile- hexane selama 10 s pada vortex.
Pindahkan sampel pada vial sebanyak 2ml untuk siap dianalisis
dengan HPLC-DAD dan GC–FID
Analisis sempel dengan HPLC-DAD
Sistem HPLC yang digunakan dikalibrasi dengan cara
menganalisa sampel darah kontrol lalu ditentukan linearitas
pembacaan dengan penentuan korelasi relatif tinggi peak vs
konsentrasi
Sampel yang dianalisis dilakukan kuantifikasi dengan teknik
penambahan internal standar.
Internal standar yang dipakai adalah heptabarbitone (wktu
retensi=15.837 min )
Sample dianalisis kualitatif dengan parameter waktu retensi
dan analisis kuantitatif (kadar) dengan menghitung luas peak
yang dihasilkan.
Analisis sempel dengan GC-FID
Sampel yang dianalisis dilakukan kuantifikasi dengan teknik
penambahan internal standar.
Internal standar yang dipakai adalah heptabarbitone (wktu
retensi=15.350 min )
Analisis kualitatif sampel menggunakan waktu retensi relati
dan analisis kuantitatif (kadar) dengan menghitung luas peak
yang dihasilkan.
Kontrol kualitas metode analisis
Analisis dilakukan dengan menganalisa sample darah standar
dari Cardiff Bioanalytical Services, UK yang mengandung
kadar asam mefenamat 5 μg/ml
Presisi metode analisis cukup baik dengan nilai CV berkisar
5.4 sampai 21.8%.
2. Sampel urin (Hirai et al,1997)
Metode : high performance liquid chromatography dengan normal
solid-phase extraction.
HPLC :
HPLC : sistem kromatografi terdiri dari waters 600E solvent
delivery pump dengan JASCO 851-AS intelligent autosampler
dan Shimadzu SPD-6AV variable-wavelenght detector.
Millenium 2010 Chromatography Manager digunakan untuk
integrasi puncak kromatografi.
Kolom : reversed phase (fase terbalik) kolom Inertsil ODS-2
150 x 4.6 mm I.D. (ukuran partikel 5 µm )
Fase gerak : sistem elusi gradien dengan larutan 50 mM buffer
fosfat dan asetonitril (58:42,v/v) pada pH 5.0
Panjang gelombang analisis : 230 nm
Flow-rate fase gerak : 0.9 ml/min
Standar internal : indometasin
Pembuatan larutan
Larutan stok asam mefenamat dengan konsentrasi 1 mg/ml
dibuat dengan pelarut metanol. Larutan ini akan stabil selama 1
bulan ketika disimpan pada -20 0C dalam freezer.
Larutan kerja I digunakan untuk recovery study yang dibuat
dengan mencampurkan larutan stok asam mefenamat yang
telah dibuat yang diikuti dengan pengenceran menggunakan
metanol sampai memiliki konsentrasi 50 µg/ml.
Larutan kerja II digunakan untuk persiapan kurva kalibrasi
standar dan kontrol kualitas sampel yang disiapkan seperti
larutan kerja I, tanpa penggunaan indometasin sebagai internal
standar. Larutan ini dibuat dengan konsentrasi 50 µg/ml.
Larutan standar internal dibuat dengan cara mengencerkan
larutan stok indometasin menggunakan metanol sampai
memiliki konsentrasi 20 µg/ml.
Preparasi sampel
Sep - Pak Silica cartridge yang digunakan untuk analisa
sampel dicuci dengan 10 ml etil asetat dan dikeringkan.
Sebanyak 100 µl larutan internal standar diuapkan sampai
kering pada suhu 37 °C.
Sebanyak 1,0 ml sampel urin ditambahkan, dan divortex.
Sebanyak 250 µl dari 1 M buffer asetat pH 5.0 ditambahkan
ke sampel, dan divortex.
Sebanyak 250 µl dari larutan yang dihasilkan dimasukkan ke
Sep-Pak silica cartride dan dikeringkan.
Cartridge dielusi dengan 3 ml etil asetat, dan eluat diuapkan
sampai kering di bawah aliran nitrogen pada 37 °C.
Residu kering dilarutkan dengan 200 µl fase gerak.
Sebanyak 10-30 µl dari reconstituent tersebut diinjeksikan ke
HPLC.
Sampel urin yang ditambahkan dengan asam mefenamat
dengan konsentrasi yang telah diketahui, disiapkan sebanyak
larutan kerja I dan II yang telah diencerkan, kemudian
diuapkan sampai kering di bawah aliran nitrogen pada water
bath 37 °C.
Sebanyak 1,0 ml urin yang bebas asam mefenamat
ditambahkan dan divortex.
Pembuatan sample biologis
Sample kontrol menggunakan urin bebas obat yang diperoleh
dari subjek uji sebelum pemberian obat asam mefenamat.
Urin dari subjek uji diambil setelah obat berada pada keadaan
tunak didalam tubuh (5 kali interfal pemberian)
Setelah pemberian asam mefenamat 500mg maka sampel urin
diambil pada interval waktu yang sudah ditentukan di awal
Sample urin diukur volume dan pH tiap kali pengambilan
Sample lalu disimpan pada suhu -20°C sampai akan dianalisis.
Metode Validasi
Recovery dan reproducibility
Dibuat latutan asam mefenamat dengan konsentrasi 0.2, 1.0
dan 5.0 μg/ml.
Tiap konsentrasi dibuat menjadi 6 replikasi.
Setiap replikasi yang sudah dibuat lalu dianalisis yang mana
setelah itu peak yang muncul pada kromatogram dibandingkan
tingginya dengan larutan asam mefenamat standar pada
konsentrasi yang sama.
metode yang digunakan harus mempunyai nilai recovery >78%
Linearitas
Dibuat larutan asam mefenamat dengan seri konsentrasi pada
rentang 0.05-10.0 μg/ml
Tiap konsentrasi dibuat menjadi 7 replikasi.
Setiap replikasi yang sudah dibuat lalu dianalisis kadarnya.
metode yang digunakan harus mempunyai linearitas dengan r
lebih besar dari 0,99
Akurasi dan presisi
Dibuat latutan asam mefenamat dengan konsentrasi 0.05, 0.5
dan 5.0 μg/ml.
Tiap konsentrasi dibuat menjadi 3 replikasi.
Setiap replikasi yang sudah dibuat lalu dianalisis kadarnya.
Dari kadar yang diukur pada setiap konsentrasi,nilai relatif
standar deviasi yang diperoleh tidak boleh lebih dari 5%.
Kuantifikasi
Sampel dianalisis menggunakan HPLC ddengan cara
menginjeksikannya ke kolom.
Panjang gelombang yang digunakan adalah 230 nm.
Konsentrasi dari asam mefenamat dalam sampel urin dihitung
dengan membandingkan rasio tinggi puncak dari asam
mefenamat/standar internal dengan kalibrasi sampel urin yang
mengandung konsentrasi asam mefenamat yang diketahui.
Parameter farmakokinetik yang diukur
Bentuk dan luas area di bawah kurva kadar plasma terhadap waktu
(data darah), serta profil ekskresi ginjal kumulatif dan kecepatan
ekskresi (data urin) digunakan untuk menilai jumlah dan kecepatan
absorpsi / jumlah yang bioavailabel dalam tubuh.
1. Data Darah
o AUCt = Area di bawah kurva kadar asam mefenamat dalam plasma
(atau serum atau darah) terhadap waktu dari waktu 0 sampai waktu
terakhir kadar obat diukur – dihitung secara trapezoidal.
o AUC∞ = AUC dari waktu 0 sampai waktu tidak terhingga = AUCt
+ Ct / ke (menggambarkan jumlah obat yang bioavailabel)
o Cmax = kadar puncak (maksimal) asam mefenamat dalam plasma
(atau serum atau darah) yang teramati.
o tmax = waktu sejak pemberian asam mefenemat sampai dicapai
Cmax
o t1/2 = waktu paruh asam mefenamat dalam plasma (atau serum
atau darah)
AUC∞ dan Cmax merupakan parameter yang paling relevan
untuk penilaian BE. AUCt paling dapat dipercaya untuk
menggambarkan besarnya absorpsi (jumlah obat yang bioavailabel)
2. Data Urin
o Aet = jumlah kumulatif metabolit asam mefenamat yang
dikeluarkan atau ditemukan dalam urin dari waktu 0 sampai waktu
terakhir kadar diukur
o Ae∞ = Ae dari waktu 0 sampai waktu tidak terhingga, diperoleh
dengan cara ekstrapolasi = jumlah obat maksimal yang diekskresi
dalam urin – sebanding dengan jumlah obat yang bioavailabel
o dAe/dt = kecepatan ekskresi metabolit asam mefenamat dalam urin
o (dAe/dt)max = Kecepatan maksimal ekskresi obat dalam urin –
terjadi pada waktu tmax (plasma) dan besarnya sebanding dengan
Cmax (plasma),sehingga besarnya bergantung pada jumlah dan
kecepatan absorpsi.
Ae∞ dan (dAe/dt)max merupakan parameter yang paling
relevan untuk penilaian BE. Aet paling dapat dipercaya untuk
menggambarkan besarnya absorpsi (jumlah obat yang bioavailabel).
Analisis data
Data farmakokinetik yang telah dikumpulkan dari setiap subjek
dilakukan analisa lebih lanjut dengan analisis statistik yang sesuai untuk
menghitung perbedaan bioavailabilitas antara produk uji dan produk
pembanding, dan untuk menunjukkan bahwa tidak ada perbedaan yang
bermakna secara klinik.
1. Data Darah
Parameter bioavailabilitas yang dibandingkan untuk penilaian
bioekivalensi adalah AUC,Cmax dan tmax. Cara menghitung AUC0-
t ; AUC0-∞ ; ke , t1/2 harus dicantumkan.
AUC dan Cmax, ditransformasi logaritmik (ln) terlebih dulu
sebelum dilakukan analisis statistik karena kinetik obat mengikuti
kinetik first order sehingga dalam skala logaritmik akan diperoleh
distribusi yang normal dan varians yang homogen.
nilai nilai ln AUC ke-2 produk dibandingkan menggunakan analisis
varians (ANOVA).
2. Data Urin
Parameter yang dibandingkan adalah Ae dan (dAe/dt)max
Kriteria Bioekivalen (BPOM,2005)
Produk uji asam mefenamat (test = T) dan produk pembanding
ponstan (reference = R) dikatakan bioekivalen jika :
a. Rasio nilai rata-rata geometrik (AUC)T / (AUC)R = 1.00 dengan
90% Cl = 80 – 125%.
b. Rasio nilai rata-rata geometrik (Cmax)T / (Cmax)R juga = 1.00
dengan 90% C I = 80-125%. Oleh karena Cmax lebih bervariasi
dibanding AUC, maka interval yang lebih lebar mungkin cocok.
Interval ini harus ditetapkan sebelumnya,
c. Perbandingan tmax dilakukan hanya jika ada claim yang relevan
secara klinik mengenai pelepasan atau kerja yang cepat atau adanya
tanda-tanda yang berhubungan dengan efek samping obat. 90% CI dari
perbedaan tmax harus terletak dalam interval yang relevan secara
klinik.
Catatan :
Nilai confidence interval (CI) tidak boleh dibulatkan ; jadi untuk CI 80-
125, nilainya harus minimal 80.00 dan tidak lebih dari 125.00.
DAFTAR PUSTAKA
AliI,obaid et al, 2004, Pharmacokinetics Differences Of Tab Mefenamic Acid
(Ma) 5oomg (One Pill) And 250mg (Two Pill) With And Without Food, Inti.
Chem. Pharm. Med. J. Vol. 1, pp.63-68 (2004).
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia Edisi IV, Jakarta, Departemen Kesehatan
RI.
Ari,Ardiarini ,2006 , Perbandingan Bioavailabilitas ( Bioekivalensi ) Obat asam
mefenamat Dalam Sediaan Generik Dan Paten Secara In Vitro. artikel
karya tulis ilmiah, Fakultas Kedokteran Universitas Diponegoro Semarang.
BPOM,2005, Pedoman Uji Bioekuivalensi, Peraturan Kepala Badan Pengawas
Obat Dan MakananRepublik IndonesiaNomor : Hk.00.05.3.1818 , Badan
Pengawas Obat Dan Makanan, Jakarta.
Goodman dan Gilman, 2007, Dasar Farmakologi Terapi, Jakarta, Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
Hirai T., Shozo M., Ikuo K., 1997, Simultaneous analysis of several non-steroidal
anti-inflammatory drugs in human urine by high-performance liquid
chromatography with normal solid-phase extraction, Elsevier Science B.V.
S0378-4347(96)00509-9.
Lo, T.C. Chao, S.E. Ng-Ong, Y.J. Yao, T.H. Koh , 1997 , Acidic and neutral
drugs screen in blood with quantitation using microbore high-performance
liquid chromatography–diode array detection and capillary gas
chromatography–flame ionization detection. Forensic Science International
90 (1997) 205–214.
Munaf S, 1994, Catatan Fuliah Farmakologi Bagian II, Jakarta, Penerbit Buku
Kedokteran EGC.
Setiabudy, R, 2009, Farmakologi dan Terapi E V, Jakarta, Balai Penerbit Fakultas
Kedokteran UI.
Singh H, Rajnish K, Pinderjith S, 2011, Development Of Uv Spectrophotometric
Method For Estimation Of Mefenamic Acid In Bulk And Pharmaceutical
Dosage Forms. International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical
Sciences ISSN- 0975-1491 Vol 3.
USP , 2013, Mefenamic Acid Tablet. Compendium.html, The United States
Pharmacopeial Convention. Diakses tanggal 3 januari 2013.
