Evaluation des VirClia® Monotests zum serologischen Nachweis von Antikörpern gegen humane Infektionserreger mittels

Chemilumineszenz Immunoassay Sandra Athina Reitzer, BMA 14-17

Bildungsgang Biomedizinische Analytik HF Institut für Infektionskrankheiten – Universität Bern, Abteilung Immunologie

1.  Zusammenfassung

Für die serologische Infektionsdiagnostik ist die Identifizierung einer frischen Infektion oder die Bestimmung des Immunstatus von Masern und Mumps unerlässlich. Bisher wurde am Institut für Infektionskrankheiten (IFIK) auf der Abteilung Infektionsserologie der Nachweis spezifischer IgG-Antikörper mittels Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) und für die IgM-Antikörper mittels indirekter Immunfluoreszenz (IF) erreicht. Ausgetestet wird ein automatisierter Chemilumineszenz Immunoassay (CLIA) auf dem VirClia® (Vircell, Spanien), um die Masern- und Mumpsantikörper zu detektieren. Ziel dieser Diplomarbeit ist es, die neue Methode zu evaluieren und diesen Assay mit der bisherigen Methode SERION ELISA classic (Virion\Serion, Deutschland) und indirekter Immunfluoreszenz (Bios, Deutschland) zu vergleichen. Die Ergebnisse zeigen, dass von den frischen Infektionen keine verpasst werden. Beim IgG-Nachweis gibt es Unterschiede zur ELISA-Methode. Tendenziell erfasst die CLIA-Methode hoch avide IgG-Antikörper länger, jedoch detektiert die ELISA-Methode bei frischen Infektionen die IgG-Antikörper schon früher. In Zukunft wird der Chemilumineszenz Immunoassay als Screeningmethode im Labor zur Detektion von IgM-Antikörpern gegen Masern und Mumps eingesetzt.

4. Material, Methodik, Vorgehen

Die Chemilumineszenz Immunoassay Methode basiert auf der Reaktion von humanen Antikörpern in der Serumprobe mit den auf der Polystyrol-Oberfläche der Titerplatte adsorbierten Antigenen. Beim Masernantigen handelt es sich um den Edmonston (ATCC VR-24) Stamm und beim Mumpsantigen um den Enders (ATCC VR-106) Stamm. Ungebundene Antikörper werden durch Waschen entfernt. Ein Enzym-markiertes anti-human-Globulin bindet in einem zweiten Schritt an den Antigen-Antikörper-Komplex. Nach einem erneuten Waschschritt wird das gebundene Konjugat mit Hilfe einer Chemilumineszenz-Substratlösung sichtbar gemacht. Aufgrund einer chemischen Reaktion (Oxidation mit Hilfe einer Peroxidase) gelangen die Elektronen des Substrats in einen angeregten, unstabilen Zustand. Um wiederum Stabilität zu erreichen, wird Energie in Form von Licht abgegeben, welches von einem Luminometer gemessen wird. Gemessen wird in Relative Light Unit (RLU). Durch die sogenannte „glow-type“ Lumineszenz wird diese Methode mit einer höheren Sensitivität assoziiert, da die Halbwertszeit des Lichtsignals lang ist. Im Rahmen der Evaluation der CLIA-Methode wird ein Gerät, das auf Basis der Chemilumineszenz arbeitet, verifiziert. Das Gerät ist vom Hersteller Vircell (Spanien) und wird unter dem Namen VirClia® vermarktet (siehe Abbildung 2.1). Es analysiert die Proben automatisch. Bearbeitet werden bis zu 24 Monotests pro Testanlauf. Die Reagenzien, welche für die Testdurchführung benötigt werden, sind alle in den Monoteststreifen enthalten.2

Verglichen wird die CLIA-Methode mit ELISA (Automatisiert auf DSX®) beim IgG-Nachweis und mit IF (manuell durchgeführt) für den IgM-Nachweis. Für die Evaluation werden 41 Seren für die Masern IgG- und IgM-Antikörper getestet. Für Mumps 38 Seren für IgG und IgM.

Die Richtigkeit und Zuverlässigkeit der neuen Methode wird nach folgenden Kriterien und statistischen Berechnungen ausgewertet: Sensitivität und die Spezifität, der positive prädiktive Wert (PPW) und negative prädiktive Wert (NPW), die Übereinstimmung nach Cohens Kappa. Grenzwertige Resultate werden bei den statistischen Berechnungen nicht berücksichtigt.

3. Ziele und Fragestellungen

Das Ziel dieser Diplomarbeit ist die Etablierung der VirClia® Chemilumineszenz Immunoassay Monotest Methode für den Nachweis von Masern IgG, IgM und Mumps IgG, IgM.

1.  Korrelieren die Testergebnisse der neuen Chemilumineszenz Immunoassay Methode mit den Ergebnissen des Enzyme-linked Immunosorbent Assays und der indirekten Immunfluoreszenz?

2. Kann der VirClia® die ELISA-Methode für Masern IgG und Mumps IgG und indirekte Immunfluoreszenz für Masern IgM und Mumps IgM künftig ersetzen?

2. Einleitung

Im Institut für Infektionskrankheiten (IFIK) der Universität Bern wird auf der Abteilung Infektionsserologie das neue Gerät VirClia® der Firma Vircell ausgetestet, welches zwei Monate dem Labor für die Testdurchführungen zur Verfügung steht. Es basiert auf der Chemilumineszenz Immunoassay (CLIA) Monotest-Methode.

Das Labor ist daran interessiert die Antikörpersuchteste mehrerer Infektions-krankheiten beziehungsweise Erreger auszutesten. Sie werden bereits routinemässig anhand verschiedener Methoden nachgewiesen. Einige Methoden werden von Hand angesetzt, andere sind automatisiert. Gründe für das Austesten des neuen Gerätes sind einerseits das Interesse zur Reduzierung des Zeitaufwandes und die Kosten-einsparung, anderseits sollen durch die automatisierte Testdurchführung und Messung der Ergebnisse, die Analysen standardisiert werden. Ausserdem wären die Antikörperuntersuchungen durch die Monotest-Methode auch bei wenigen Proben täglich ansetzbar. Im Rahmen dieser Diplomarbeit werden Masern IgG- und IgM-Antikörper und Mumps IgG- und IgM-Antikörper ausgetestet.

Masern und Mumps sind virale Infektionskrankheiten. In der Labordiagnostik stehen der Nachweis virusspezifischer Antikörper und der Virusnachweis zur Verfügung. In der Regel stellt der Nachweis von IgM-Antikörpern im Serum mit den typischen Symptome der jeweiligen Krankheit eine der schnellsten Methoden dar, um eine frische Masern- oder Mumpsinfektion zu diagnostizieren. Die IgM-Antikörper sind bis zu sechs Wochen nachweisbar und sind nach einigen Monaten nicht mehr vorhanden. Bei geimpften Personen werden Infektionen äussert selten beobachtet. Beweisend für eine Masernvirusinfektion ist dabei erst ein signifikanter IgG-Titeranstieg.1

5. Ergebnisse/Resultate

6. Diskussion

Die Ergebnisse zeigen zum Teil sehr unterschiedliche Werte auf. Zurückzuführen ist dies auf die kleine Anzahl Seren, welche für die Evaluation zur Verfügung standen. Diskrepante Resultate sind grösstenteils Werte nahe dem Cut-off der jeweiligen Methode. Daher konnte beim IgG-Nachweis einerseits aufgezeigt werden, dass in der Frühphase einer Infektion die IgG-Antikörper mittels CLIA-Methode tendenziell noch nicht erfasst werden können. Anderseits wurden aber bei Proben von durchgemachten Infektionen oder Impfungen, welche eine nur kleine IgG-Konzentrationen beinhalteten mit der CLIA-Methode erfasst werden, welche bei der ELISA-Methode nicht mehr detektiert wurden. Die IgM-Nachweise zeigen gute Übereinstimmungen auf, diskrepante IgM-Resultate sind vermutlich auf Kreuzreaktionen oder andere Störfaktoren zurückzuführen. Durch die Automatisierung des Geräts kann eine gewisse Verbesserung der Standardisierung generiert werden, im Vergleich zur IF-Methode, welche manuell angesetzt wird.

Zusammengefasst zeigen die Resultate dieser Diplomarbeit, dass mit der neuen CLIA-Methode auf dem VirClia® von den frischen Infektionen, keine verpasst wird. Beim IgG-Nachweis erfasst die CLIA-Methode hoch avide IgG-Antikörper länger, jedoch detektiert die ELISA-Methode bei frischen Infektionen die IgG-Antikörper schon früher. In Zukunft wird der Chemilumineszenz Immunoassay als Screeningmethode im Labor zur Detektion von IgM-Antikörpern gegen Masern und Mumps eingesetzt.

Referenzen 1 Milde-Busch, A. [Stand 20.12.2013] RKI-Ratgeber für Ärzte. 2 Vircell (2014) VirClia® Monotest. Granada (Spanien), S.L. Parque Tecnológico de la Salud.

Abbildungen Abb. 2.1 Alifax® [Stand 20.04.2017] VirClia®.

Tabellen Tab. 5.1 Reitzer, S. (2017) Resultate der CLIA-Methode.

Abb.  2.1:  VirClia®  Das Gerät VirClia® ist vom Hersteller Vircell (Spanien) und analysiert die Proben automatisch.  

Tab.  5.  1:  Resultate  der  CLIA-­‐Methode  Die  Ergebnisse  von  Masern  IgG  und  Mumps  IgG  zeigen  die  CLIA-­‐Methode  im  Vergleich  zu  der  ELISA-­‐Methode.  Die  Ergebnisse  von  Masern  IgM  und  Mumps  IgM  zeigen  die  CLIA-­‐Methode  im  Vergleich  zur  indirekten  Immunfluoreszenz.  

Masern IgG Mumps IgG Masern IgM Mumps IgM

Sensitivität 76 % 97 % 100 % 67 %

Spezifität 62 % 67 % 87 % 100 %

PPW 79 % 94 % 90 % 100 %

NPW 57 % 80 % 100 % 95 %

C‘ Kappa 0.37 0.68 0.78 0.78