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03/08/2017
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Histórico da Microbiologia
Sec. XIX
Duas grandes questões biológicas levaram ao desenvolvimento de técnicas laboratoriais essenciais:
O debate sobre
a geração
espontânea
A natureza das
doenças
infecciosas
(Louis Pasteur) (Robert Koch)
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Geração espontânea – prós e contras
• Francesco Redi (1668): experimentos com carne apodrecidas.
• John Needham (1745): o aquecimento de caldos nutrientes (degalinha ou milho) não prevenia o aparecimento de MO’s.
• Lazaro Spallanzani (1765): refutou experimentos de Needham. Afervura de frascos previamente lacrados impedia o crescimentode MO’s. (crítica de Needham: o lacre impedia a entrada da“força vital” necessária).
• Rudolf Wirchow (1858): introduziu conceito da biogênese(“células vivas somente podem surgir de células vivas pré-existentes”).
• Louis Pasteur (1861): experimentos que refutaramdefinitivamente a teoria da geração espontânea.
O experimento de Pasteur
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© 2004 Pearson Education, Inc.
O experimento de Pasteur
© 2004 Pearson Education, Inc.
O experimento de Pasteur
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© 2004 Pearson Education, Inc.
O experimento de Pasteur
Teoria do germe da doença
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Teoria do germe da doença
• Experimentos de Pasteur: base das técnicas de assepsia.
• Pasteurização: para resolver problema de vinhos e cervejas que azedavam por causa das bactérias (álcool ácido acético).
• Relação entre deterioração dos alimentos e os microrganismos colaborou para a “Teoria do germe da doença”.
• Doenças: punição para os pecados individuais ou crimes. Causa: demônios nos detritos ou nos vapores dos pântanos.
• 1865: Pasteur descobre a causa da doença do bicho-da-seda (protozoário).
• 1860: Joseph Lister tratou ferimentos cirúrgicos com fenol – redução drástica de infecções e mortes.
Teoria do germe da doença
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• Robert Koch, médico prático alemão, 1876: comprovou a teoria do germe da doença.
• Koch estudou o antraz (carbúnculo) – doença de gado e ovelhas – e descobriu o agente causador –Bacillus anthracis.
• Problema! Como afirmar que a bactéria presente no sangue do animal afetado é o agente causador da doença?
Teoria do germe da doença
1. O organismo patogênico suspeito deve estar presente em todos os casos da doença e ausente em animais sadios.
2. O organismo suspeito deve ser cultivado em cultura pura.
3. Células de uma cultura pura do organismo suspeito devem provocar a doença em um animal sadio.
4. O organismo deve ser isolado e caracterizado como o mesmo encontrado originalmente.
Postulados de Koch
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Exceções aos postulados de
KochExceções aos postulados
de Koch
1) Nem todos os microrganismos crescem em meios de cultura;
2) Um conjunto de sinais e sintomas podem ser os mesmos em várias doenças;
3) Um microrganismo pode causar várias doenças.
Exceções aos postulados
de Koch
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• Não são cultivados em meio artificial:
– Treponema pallidum: sífilis
– Mycobacterium leprae: lepra
– Riquétsias e vírus: multiplicam-se somente dentro das células
Exceções aos postulados
de Koch
Diversidade Microbiana
1910 – Paul Ehrlich – “Bala Mágica” para combater um patógeno sem prejudicar o hospedeiro
Dentre várias substâncias testadas salvarsan (derivado de arsênico) para o combate à Sífilis
Antes disso, a única substância utilizada pelos Europeus era a quinina, extraída de casca de árvore sul-americana para o tratamento da malária
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Diversidade Microbiana
-Alexander Fleming, médico e bacteriologista escocês
Contaminação por fungo em placa alerta para substância inibidora do crescimento bacteriano
1928, Penicillium notatum Penicilina
1940 – Importância médica da Penicilina
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Instrumentação e técnicas básicas de assepsia
Sobre as aulas práticasProfa. Dra. Ilana Camargo
Aula 1
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Biossegurança
Conjunto de procedimentos adotados com o objetivo de dar
proteção e segurança ao profissional e à sua equipe.
Para evitar disseminação e contaminações devem ser empregadas
medidas de controle de infecção como a utilização de equipamento
de proteção individual (EPI), esterilização de materiais, desinfecção
de ambiente e equipamentos.
Equipamentos de Proteção Individual (EPI)
Equipamentos de Proteção Coletiva (EPC)
Todo dispositivo ou produto de uso individual ou coletivo, utilizado pelo
trabalhador destinados a proteção de riscos que podem ameaçar a
segurança e a saúde no trabalho
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Jalecobranco
Gorro
Luvas
máscara
Óculos de proteção
Equipamentos de Proteção Individual (EPI)
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A importância do Jaleco
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Chuveiros e lava-olhos
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Designados em ordem crescente, pelo grau de proteção proporcionado ao pessoal
do laboratório, meio ambiente e à comunidade:
O nível de Biossegurança 1, é o nível de contenção laboratorial que se aplica aos
laboratórios de ensino básico, onde são manipulados os microrganismos
pertencentes a classe de risco 1 (não causam doenças nos homens ou outros
animais). Não é requerida nenhuma característica de desenho, além de um bom
planejamento espacial e funcional e a adoção de boas práticas laboratoriais.
Exemplos: Bacillus subtilis
O nível de Biossegurança 2 diz respeito ao laboratório em contenção, onde são
manipulados microrganismos da classe de risco 2 (causam doenças nos homens
ou outros animais). Se aplica aos laboratórios clínicos ou hospitalares de níveis
primários de diagnóstico, sendo necessário, além da adoção das boas práticas, o uso
de barreiras físicas primárias (cabine de segurança biológica e equipamentos de
proteção individual) e secundárias (desenho e organização do laboratório).
Exemplos: Vírus da Febre Amarela e Schistosoma mansoni.
Níveis de Biossegurança
Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services,
Atlanta, 1999. 250p.
Níveis de Biossegurança
NB-1
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Níveis de Biossegurança
NB-2
O nível de Biossegurança 3 é destinado ao trabalho com microrganismos da
classe de risco 3 (causam graves doenças nos homens ou outros animais) ou
para manipulação de grandes volumes e altas concentrações de microrganismos da
classe de risco 2. Para este nível de contenção são requeridos além dos itens
referidos no nível 2, desenho e construção laboratoriais especiais. Deve ser mantido
controle rígido quanto a operação, inspeção e manutenção das instalações e
equipamentos e o pessoal técnico deve receber treinamento específico sobre
procedimentos de segurança para a manipulação destes microrganismos. Exemplo:
Mycobacterium tuberculosis
O nível de Biossegurança 4, ou laboratório de contenção máxima, destina-se a
manipulação de microrganismos da classe de risco 4 (causam doenças nos
homens ou outros animais representando grande risco para os trabalhadores
de saúde, sendo alto o risco de transmissibilidade na comunidade), onde há o
mais alto nível de contenção, além de representar uma unidade geográfica e
funcionalmente independente de outras áreas. Esses laboratórios requerem, além
dos requisitos físicos e operacionais dos níveis de contenção 1, 2 e 3, barreiras de
contenção (instalações, desenho equipamentos de proteção) e procedimentos
especiais de segurança. Exemplo: Vírus Ebola.
Centers for Disease Control and Prevention - CDC. Biosafety in microbiological and biomedical laboratories. 4a. ed. U.S. Department of Health and Human Services,
Atlanta, 1999. 250p.
Níveis de Biossegurança
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Níveis de Biossegurança
NB-3
•Fluxo de ar sempre de
fora para dentro;
•Filtro de ar para troca de
ar do ambiente;
•Usar equipamento de
contenção de bioaerossol
Níveis de Biossegurança
NB-4
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Níveis de Biossegurança
NB-4
Sala de troca de roupas
http://www.niaid.nih.gov/topics/BiodefenseRelated/Biodefense/PublicMedia/labtour/Pages/bsl9.aspx
Níveis de Biossegurança
NB-4
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Níveis de Biossegurança
NB-4
http://www.agricultura.gov.br/comunicacao/noticias/2014/08/lanagromg-e-o-primeiro-do-
brasil-com-nivel-de-biosseguranca-maximo
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Aula 2
Sobre as aulas práticasProfa. Dra. Ilana Camargo
Instrumentação e técnicas básicas de assepsia
Tortora, et al, 6ª ed, 2000
Conceitos importantes!!
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Lavagem das mãos
Indicação de lavagem das mãos:
SempreQue as mãos estiverem sujas
Antes e apósPreparo de materiais e/ou equipamentosO uso de luvasA aula de microbiologia
Com o uso concomitante de luvasApós coleta de sangueAdministração de hemoderivadosHigienização de paciente
O uso das luvas não substitui a lavagem das mãos!!!
Lavagem das mãos
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Lavagem das mãos
- Retirar jóias, relógio, pulseiras (acúmulo de bactérias não removidas)
- Abrir a torneira com a mão dominante quando não houver pedal
- Molhar as mãos- Aplicar de 3 a 5 mL de sabão líquido nas mãos
- Ensaboar as mãos, formando espuma, friccionando-as por 15 a 30 segundos, atingindo todas as suas faces
- Enxaguar, deixando a água penetrar nas unhas e espaços interdigitais (mão em forma de concha). Retirar toda a espuma e os resíduos de sabão, sem deixar respingar água na roupa e no piso.
- Secar as mãos com papel toalha descartável. Se a torneira for manual, usar o mesmo papel-toalha para fechá-la
Verificação das lavagens das mãos
Antes Depois
Diminuição do número de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Placas com 24h a 37°C e 5 dias a 4°C
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Verificação das lavagens das mãos
Antes Depois
Diminuição das UFCs e da variedade de colônias
(morfologia: tamanho, cor, aspecto)
Placas com 24h a 37°C e 5 dias a 4°C
Limpar a bancada com álcool 70% ANTES E DEPOIS
dos experimentos!!
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Zona Asséptica
Bico de Bunssen
O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança
Análise de microrganismos
Lâmina Lamínula
Contador de
colônias Espectrofotômetro
Microscópio óptico
Cubetas
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Alça de inoculação
(Niquel-cromo ou platina)
Agulha de inoculação
Materiais
Haste
Cabo
Cabo de Kohle
Transferência de microrganismos
Alça de inoculação Agulha de
inoculação
Alça de Drigalski
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Zona Asséptica
O bico de Bunssen e a zona asséptica/de segurança
Transferência de microrganismos
Pipeta pasteur
Swab (cotonete)
Pinça
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Aula 3
Sobre as aulas práticasProfa. Dra. Ilana Camargo
Instrumentação e técnicas básicas de assepsia
Autoclave
Câmara de biossegurança / fluxo
laminar
Instrumentos
Esterilização pelo calor úmido (vapor sob pressão)
Em geral: 15 a 20 minutos a 121ºC
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Equipamentos
Estufa
Equipamentos
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Materiais
Fechar com tampão de
algodão e cobrir com papel
alumínio e papel pardo
Rotina do laboratório
Tubos cônico
(tipo falcon)Microtubos
(“tubo
Eppendorf”)
Erlenmeyer
Balão volumétrico
Proveta
Frasco com
tampa de
rosca
Béquer
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Rotina do laboratório
pHmetro
Centrífuga
Balança de precisão
Rotina do laboratório
Agitador magnético
com aquecimento
Barras magnéticas
(“pulgas” ou “peixinhos”)
Banho-maria
Agitador de tubos (vórtex)
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Esterilização
Filtro esterilizante
Autoclave
Bico de Bunsen
Câmara de Biossegurança
NUNCA PIPETE COM A BOCA!!!
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Instrumentos
Pipetas e pipetadores
Pipeta Pastuer
Pipetas automáticas
Ponteiras
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