MICROBIOLOGA GENERAL

CARRERA DE QUMICA FARMACETICA

Sergio Rodrigo Quisberth Barrera M.Sc.

ser_barr@hotmail.com

La Paz Bolivia

16 de marzo del 2015

Conjunto de reacciones o transformaciones qumicas que tienen lugar en un microorganismo para mantener su viabilidad

Procesos o reacciones Catablicas Degradan nutrientes

Liberan energa

Procesos o reacciones Anablicas Tienden a unir molculas

Reacciones de sntesis que consumen energa

Metabolismo Microbiano

Excepto algunos tomos de C de los nucletidos, la asimilacin del C deriva de 8

intermediarios: glucosa-6-P, triosa-P, 3-fosfoglicerato, fosfoenolpiruvato, piruvato,

acetil-CoA, oxalacetato, -cetoglutarato.

Metabolismo Microbiano

Aumento de nmero (no de tamao)

Multiplicacin bacteriana: fisin simple o binaria

Elongacin

Auto duplicacin de ADN cromosmico

Tabicado central

Invaginacin membrana celular

Sntesis de pared

Crecimiento Bacteriano

Tiempo necesario para la duplicacin celular

Distintiva de cada especie

Puede influirse por factores estimulantes

Varan de 20 minutos (Escherichia coli) hasta 24 horas

Tiempo de generacin

Tiempo de generacin

Bacteria Medio Tiempo de Generacin (minutos)

Escherichia coli Glucose-salts 17

Bacillus megaterium Sucrose-salts 25

Streptococcus lactis Milk 26

Streptococcus lactis Lactose broth 48

Staphylococcus aureus Heart infusion broth 27-30

Lactobacillus acidophilus Milk 66-87

Rhizobium japonicum Mannitol-salts-yeast extract 344-461

Mycobacterium tuberculosis Synthetic 792-932

Treponema pallidum Rabbit testes 1980

Curva de Crecimiento Bacteriano

Bacteria en medio adecuado

Grfico de coordenadas: nmero de bacterias (logaritmo) versus lapso de tiempo.

Distinta para cada bacteria

En todas se identifican cuatro etapas:

Fase Lag

Fase Log

Fase estacionaria

Fase de muerte

El nmero de microorganismos no vara

Adaptacin al medio, produccin de enzimas

Tiempo variable: entre una hora a das.

Tamao relativo aumentado por divisin

Fase de Latencia

Relacin casi lineal entre el tiempo y el nmero de elementos.

Actividad metablica incrementada

Depende del tiempo de generacin de cada bacteria

Los antimicrobianos son mas activos

Puede haber variaciones entre el crecimiento in vitro e in vivo.

Fase exponencial o de crecimiento logartmico

Fase exponencial o de crecimiento logartmico

=

=

=

Ecuacin Cintica de

crecimiento en funcin al

numero de generaciones

Clculo del nmero de

generaciones

Fase exponencial o de crecimiento logartmico

=

=

= []

+

=

Ecuacin Cintica de

crecimiento en funcin a

la tasa de crecimiento

Clculo de la tasa de

crecimiento

Si partimos de 104 ufc/ml en un cultivo que tiene un tiempo de generacin de 2 h, cuntas clulas tendremos al cabo de 4, 24 y 48 h de cultivo?

Fase exponencial o de crecimiento logartmico

La tasa de crecimiento de un cultivo bacteriano es = 1.5 h-1. Si partimos de una poblacin inicial de 102 ufc/ml, Qu nmero de bacterias por mililitro (ufc/ml) habr despus de un cultivo de 10 h?. Cunto es el tiempo de generacin del cultivo?.

Fase exponencial o de crecimiento logartmico

En determinado punto el crecimiento disminuye

La poblacin no aumenta

Clulas nuevas reemplazan a las clulas muertas

Actividad metablica mas lenta

Produccin de metabolitos secundarios

Antibioticos

Toxinas

Fase de Esporogenesis para las especies productoras de esporas

Fase Estacionaria

Recuento de clulas disminuye sensiblemente

El numero de clulas muertas supera al nmero de clulas vivas

Acumulacin de productos txicos

Disminucin de nutrientes

Aparicin rpida : autolimitar diseminacin infecciones

Fase de declinacin o muerte

Qumicos

Carbono

Nitrgeno

Oxigeno

Azufre

Factores de crecimiento

Iones

Factores relacionados al Crecimiento

Fsicos

Temperatura

pH

Actividad Agua aW Potencial redox

Presin Osmtica

Todos los microorganismos tienen una temperatura ptima de crecimiento.

Esto significa que a determinada temperatura la velocidad de duplicacin o la velocidad de crecimiento poblacional de los microorganismos es mayor.

Efecto de la Temperatura

Clasificacin Rango Optima

Termfilos 25 - 80 C 50 - 60 C

Mesfilos 10 - 45 C 20 - 40 C

Psicrfilo -5 - 30 C 10-20 C

Temperatura mnima de crecimiento

Temperatura ptima de crecimiento

Temperatura mxima de crecimiento

Efecto de la Temperatura

Efecto de la Temperatura

Bacteria T Mnima T Optima T Mxima

Listeria monocytogenes 1 30-37 45

Vibrio marinus 4 15 30

Pseudomonas maltophilia 4 35 41

Thiobacillus novellus 5 25-30 42

Staphylococcus aureus 10 30-37 45

Escherichia coli 10 37 45

Clostridium kluyveri 19 35 37

Streptococcus pyogenes 20 37 40

Streptococcus pneumoniae 25 37 42

Bacillus flavothermus 30 60 72

Thermus aquaticus 40 70-72 79

Methanococcus jannaschii 60 85 90

Sulfolobus acidocaldarius 70 75-85 90

Pyrobacterium brockii 80 102-105 115

La mayora de los microorganismos crecen en pH cercanos a la neutralidad, entre 5 y 9, cosa que no excluye que existan microorganismos que puedan soportar pH extremos y se desarrollen.

Condiciones de pH

Clasificacin pH externo pH interno

Acidfilos 1.0 - 5.0 6.5

Neutrfilos 5.5 - 8.5 7.5

Alcalfilos 9.0 - 10.0 9.5

pH < 6,5 cido

pH > 8,5 bsico o alcalino

pH 6,5 8,5 neutro Mas adecuado para crecimiento bacteriano

Condiciones de pH

Condiciones de pH

Organismo pH Mnimo pH Optimo pH Mximo

Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-2.8 4.0-6.0

Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.0-3.0 5.0

Bacillus acidocaldarius 2.0 4.0 6.0

Zymomonas lindneri 3.5 5.5-6.0 7.5

Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8

Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3

Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0

Clostridium sporogenes 5.0-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0

Erwinia caratovora 5.6 7.1 9.3

Pseudomonas aeruginosa 5.6 6.6-7.0 8.0

Thiobacillus novellus 5.7 7.0 9.0

Streptococcus pneumoniae 6.5 7.8 8.3

Nitrobacter sp 6.6 7.6-8.6 10.0

Los solutos disueltos se desplazan a zonas de menor concentracin.

El agua se desplaza a zonas de mayor concentracin de solutos

Una presin osmtica alta causa prdida de agua y plasmlisis de la clula

Halfilas: bacterias que toleran altas concentraciones salinas.

Halfilas facultativas: toleran hasta un 5 % de sales.

Presin Osmtica

La disponibilidad de agua se mide por un parmetro llamado actividad de agua o potencial de agua, indicativo del agua libre, y que se expresa como

aW= PS/PW

donde PS es la presin parcial de vapor de agua en la solucin problema y PW es la presin parcial de vapor del agua destilada.

Actividad Agua aW

Actividad Agua aW

Organismo aw mnima para crecer

Caulobacter 1.00

Spirillum 1.00

Pseudomonas 0.91

Salmonella/E. coli 0.91

Lactobacillus 0.90

Bacillus 0.90

Staphylococcus 0.85

Halococcus 0.75

Presin Osmtica y Actividad Agua aW

El Potencial de Oxido-Reduccin es una medida de la tendencia del medio a donar o recibir electrones.

Es crtico para el crecimiento de los microorganismos generalmente asociado con la presencia de oxgeno disuelto en el medio.

En medios con oxgeno, el potencial redox vara entre 0,2 y 0,4 Voltios.

Los anaerobios estrictos necesitan una atmsfera sin oxgeno, deben crecer en medios reductores donde el potencial no sea mayor a -0,2 Voltios.

Potencial de Oxido-Reduccin

Potencial de xido-reduccin o Redox (Eh)

Respiracin bacteriana : reacciones de xido-reduccin, en cadena

El aceptor final de electrones o hidrogeniones es variable

Condiciones atmsfricas

Requieren oxgeno, aceptor final de hidrgeno

Formacin de H2O y CO2

Produccin de enzima Catalasa : desdoblamiento del Perxido de hidrgeno (H2O2) en H2O y oxgeno

Prueba de Catalasa para diferenciar microroganismos (Staphylococcus de Streptococcus)

Aerobios

Viven en ausencia de oxgeno atmosfrico

Aceptor final de hidrgeno : compuesto inorgnico (NO3 o SO4)

Fermentacin: la fuente de carbono provee energa, el donador de hidrgeno y el aceptor final (un compuesto orgnico como cidos o alcoholes)

Muy frecuente en microorganismos orales

Anaerobios

Anaerobios obligados: no utilizan O2

Anaerobios moderados: toleran de un 2 a un 8 % de O2

Anaerobios aerotolerantes: sobreviven un tiempo en presencia de O2

Anaerobios facultativos: aceptan indistintintamente una situacin u otra

Anaerobios

Requieren bajas concentraciones de O2 para crecer

Utilizan el O2 como fuente de energa pero a concentraciones < 15 %

Susceptibles a radicales superxido

Enzima Superxido Dismutasa (SOD) : transforma radicales superxido en H2O2

Capnofilas: desarrollan mejor con concentraciones de CO2 elevadas

La cavidad oral presenta todas estas variantes

Las especies capnfilas aumentan en personas con alteraciones periodontales.

Microaerfilos

MTODOS DIRECTOS

Recuento en cmara

Determinacin del peso hmedo

Determinacin del peso seco

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Recuento en cmara

Es una tcnica comn, rpida y barata que utiliza un equipamiento fcilmente disponible en un laboratorio de microbiologa.

Para estos recuentos se utilizan generalmente cmaras de recuentos

Las cmaras ms utilizadas son las de Hawksley y la de Petroff-Hausser.

La primera tiene la ventaja que puede ser utilizada con objetivos de inmersin, aunque la mayora de los recuentos se realizan con objetivos secos.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Recuento en cmara

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Tipo de cuadro Area [cm2] Volumen [ml] Factor [1/Volumen]

Cuadrado total 1.00 x 10-2 2.00 x 10-5 5.00 x 104

Cuadrado grande 4.00 x 10-4 8.00 x 10-7 1.25 x 106

Cuadrado pequeo 2.50 x 10-5 5.00 x 10-8 2.00 x 107

Determinacin del peso hmedo

Se tara un tubo de centrfuga

Se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante

se determina el peso del sedimento

Inconvenientes: Grandes errores, debido al lquido intercelular retenido, cuya cuanta depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Determinacin del peso seco

Como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105C, toda la noche), hasta peso constante.

Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso hmedo.

Inconvenientes: Mtodo tedioso y con bastantes errores:

Difcil pesar menos de 1 mg con exactitud.

1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Determinacin del peso hmedo y seco

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

MTODOS INDIRECTOS

Recuento en placa

Recuento en filtro

Determinacin del nitrgeno total

Mtodos turbidimtricos (pticos)

Espectrofotmetro

Nefelmetro

Escala de Mac. Farland

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Recuento en placa

Los mtodos de recuento directos no distinguen entre clulas vivas y muertas.

En muchos casos conviene contar las clulas vivas.

El mtodo habitual de lograr esto es sembrar pequeas alcuotas de diluciones adecuadas de un cultivo original sobre placas de Petri con medio slido.

Cada clula viable dar origen a una colonia visible despus del tiempo adecuado de incubacin.

Contando las colonias visibles, teniendo en cuenta la dilucin de la que proceden y el volumen de alcuota utilizado, es fcil deducir el nmero de clulas viables en la suspensin original.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Recuento en placa

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Recuento en Filtro

Se usa para suspensiones diluidas de bacterias.

Se hace pasar un gran volumen de suspensin a travs de una membrana de nitrocelulosa o de nylon estriles.

Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo slido.

Las colonias se forman sobre el filtro a partir de las clulas retenidas.

Dichas colonias se cuentan, deducindose la concentracin original de viables en funcin del volumen de suspensin que se hizo pasar por el filtro.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Recuento en Filtro

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Determinacin del nitrgeno total

Permite determinar indirectamente la masa de una poblacin bacteriana.

Existen distintas tcnicas para determinar la cantidad de nitrgeno.

Puede analizarse: El nitrgeno no proteico mediante

el NO2-, NO3

-, NH4+

El nitrgeno proteico mediante absorcin en UV, Reaccin de Biuret, Reaccin de Lowry, o el nitrgeno total mediante Kjeldahl.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Mtodos turbidimtricos (pticos)

Muy usados en la prctica cotidiana del laboratorio.

La base comn de estos mtodos consiste en la medicin de la cantidad de luz dispersada o transmitida a travs de un cultivo bacteriano.

Recordemos que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partcula pequea suspendida en agua (efecto Tyndall).

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Mtodos turbidimtricos (pticos)

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Espectrofotmetro

Equipo de uso habitual en laboratorio de Microbiologa o Bioqumica.

Mide la densidad ptica (D.O.).

Por supuesto, hay que realizar una curva estndar para relacionar los valores de Absorbancia con la masa bacteriana en una muestra problema.

Comentarios: La proporcionalidad entre Absorbancia y masa bacteriana slo es vlida para >107cls/ml.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Nefelmetro

Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor est situado en ngulo recto respecto de la direccin de la luz incidente, y se mide la luz dispersada directamente por la preparacin.

Posee mayor sensibilidad que el espectrofotmetro.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Escala de Mac Farland

Los estndares de turbidez de Mac Farland se usan como referencia para saber el nmero de bacterias por mililitro, segn una escala que va de 0.5 a 10.

Estos estndares son creados al mezclar soluciones de cloruro de bario al 1% con cido sulfrico al 1% en volmenes especficos.

Los estndares pueden ser visualmente comparados con suspensiones de bacterias en salina estril o en caldos.

La desventaja de este mtodo es que no discrimina bacterias vivas o muertas en la solucin, por lo que se puede sobreestimar la poblacin de bacterias.

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Escala de Mac Farland

Tcnicas para determinar el nmero y viabilidad de las clulas

Preguntas??