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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS
CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
Laboratório de Engenharia das Reações
Prof.ª Dr.ª Raquel de Lima Camargo Giordano
Experimento 2
Cinética de Reação Heterogênea em Reator de Batelada
Christian Carlos Cândido da Silva RA: 389234
Mariana Stefani Machado RA: 389340
Milton Quaresma Gomes Junior RA: 389480
Patrícia Metolina RA: 388998
Rodrigo Toscano Santos RA: 389498
Thaís Sousa de Sateles RA: 389366
SÃO CARLOS – SP
2013
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................ 3
1.1 Enzimas ................................................................................................................... 3
1.2 Mecanismo geral de catálise enzimática .................................................................. 3
1.3 Imobilização da enzima ........................................................................................... 5
1.4 Efeitos difusivos ....................................................................................................... 6
2 OBJETIVOS ................................................................................................................... 7
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL .............................................................................. 8
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................... 9
4.1 Determinação dos parâmetros cinéticos .................................................................. 9
4.2 Cálculo da energia de ativação .............................................................................. 13
4.3 Cálculo da efetividade ........................................................................................... 16
5 CONCLUSÃO ............................................................................................................... 25
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 26
3
1 INTRODUÇÃO
1.1 Enzimas
As enzimas são proteínas especializadas na catálise de reações biológicas.
São catalisadores biológicos extremamente eficientes e aceleram em média 109 a
1012 vezes a velocidade da reação, transformando de 100 a 1000 moléculas de
substrato em produto por minuto de reação, sem participar dela como reagente ou
produto. A especificidade das enzimas se deve à existência, na superfície da
enzima, de um local denominado sítio de ligação do substrato. O sítio de ligação do
substrato de uma enzima é pelo arranjo tridimensional especial dos aminoácidos de
uma determinada região da molécula, geralmente complementar à molécula do
substrato, configurada espacial e eletricamente para a ligação do mesmo.(1)
Alguns modelos procuram explicar a especificidade substrato/enzima. O
Modelo Chave/Fechadura prevê um encaixe perfeito do substrato no sítio de ligação,
que seria rígido como uma fechadura. Por outro lado, o Modelo do Ajuste Induzido
prevê um sítio de ligação não totalmente pré-formado, mas sim moldável à molécula
do substrato.(1)
1.2 Mecanismo geral de catálise enzimática
As enzimas aceleram a velocidade de uma reação por diminuir a energia livre
de ativação da mesma, sem alterar a termodinâmica da reação. Uma reação
enzimática pode ser expressa pela seguinte Equação (1), onde E é a enzima, S, o
substrato, ES, o Estado de Transição e P, o produto formado:
E + S <=> [ES] => E + P (1)
Para superar a energia de ativação de uma reação, há a formação de um
estado intermediário, o "Estado de Transição" (ES), um composto instável e de alta
energia, representado por ES, ligado com altíssima afinidade ao sítio catalítico, mas
não é considerado um intermediário e é rapidamente convertido em produto. A
Figura 1 mostra a comparação entre a reação com catalisador e a reação sem
catalisador e a diminuição da energia de ativação proporcionada pela enzima.(2)
4
Figura 1 – Energia de ativação da reação com catalisador e da reação sem
catalisador
Fonte: Biociência (2011).
A atividade das enzimas é condicionada pelos seguintes fatores:
Temperatura: à medida que se eleva a temperatura, a taxa de reação
aumenta. No entanto, estabilidade da proteína decresce devido à desnaturação
térmica, ocorrendo a perda da atividade biológica da enzima. Dessa forma, toda
enzima tem uma temperatura ótima para que atinja sua atividade máxima.
pH: as enzimas têm um pH ótimo de atuação, acima e abaixo do qual a sua
atividade diminui e se inativam. O pH do meio influencia a conformação do centro
ativo da enzima e, consequentemente, a sua interação com o substrato.
Concentração do substrato: o aumento da concentração de substrato
corresponde o aumento da atividade enzimática até que todos os centros ativos
fiquem ocupados e a atividade enzimática estabiliza.
Concentração de enzima: aumentando a concentração da enzima, aumenta
a velocidade da reação desde que haja substrato disponível.
Inibidores: a presença de inibidores diminui a atividade enzimática.
A catálise enzimática pode ser homogênea e heterogênea. Na catálise
homogênea, reagentes e catalisador encontram-se na mesma fase, proporcionando
melhor interação entre esses componentes e, consequentemente, resultando em
melhor rendimento de reação. No entanto, a aplicação industrial da catálise
homogênea normalmente é limitada, devido às dificuldades de separação do
catalisador do meio de reação.(3)
A catálise heterogênea envolve mais de uma fase, sendo que o catalisador
é, geralmente, um sólido e os reagentes e produtos líquidos ou gasosos. Nesse
5
caso, o catalisador fornece uma superfície onde os reagentes irão reagir mais
facilmente, e com menor energia de ativação. As principais vantagens da utilização
de catalisadores heterogêneos são a sua grande estabilidade térmica (suportam
temperaturas elevadas) e a sua facilidade de recuperá-los no fim da reação. A
principal desvantagem é a falta de seletividade.
1.3 Imobilização da enzima
Os vários métodos de imobilização empregados baseiam-se nas ligações
físicas e químicas entre a biomolécula e o suporte. Os mais utilizados são: adsorção
física e química, imobilização por confinamento em matriz ou microcápsula e ligação
cruzada.
Na imobilização em matriz de gel, a enzima está livre em solução, mas com
seu movimento restrito por uma rede de gel ou polímero. A enzima é misturada aos
componentes que formarão o gel e, quando esse é formado, a enzima fica presa à
matriz. A porosidade da matriz deve evitar a perda de enzima e, ao mesmo tempo,
permitir o livre movimento do substrato e do produto.(5)
Após a imobilização, as propriedades físicas e químicas da enzima podem
sofrer modificações. Devem ser considerados os efeitos da imobilização sobre a
estabilidade, as propriedades cinéticas e especificidade, além da produtividade da
enzima. As diferenças no comportamento da enzima imobilizada, quando
comparada à sua forma em solução, devem-se aos seguintes fatores: efeitos
conformacionais – modificação conformacional da molécula de enzima devido à
alteração na estrutura terciária do sítio ativo; efeitos estereoquímicos – uma parte da
molécula da enzima é imobilizada numa posição tal que o sítio ativo é relativamente
inacessível; efeitos difusionais – têm origem na resistência de difusão do substrato
até o sítio catalítico da enzima, e do produto da reação; efeitos microambientais –
resultantes do método de imobilização utilizado ou da presença do suporte na
vizinhança da enzima.(5)
6
1.4 Efeitos difusivos
Para promover uma determinada reação química com catalisador, a condição
desejada é que a etapa controladora seja a cinética química. Mas em reações
heterogêneas ocorrem diversos outros fenômenos, como efeitos difusivos externos e
internos. Para uma molécula reagente alcançar o sítio ativo onde a reação de fato
ocorre, há várias etapas:
1) Difusão da molécula reagente do seio do fluido para a superfície da partícula;
2) Difusão da molécula reagente da superfície da partícula pelo interior do poro;
3) Reação química no sítio ativo;
4) Difusão da molécula do produto formado do interior do poro para a superfície
da partícula;
5) Difusão da molécula do produto da superfície da partícula para o seio do
fluido.
Há duas possibilidades de ocorrência do fenômeno externo ao catalisador. A
primeira é quando a transferência de massa através do filme é rápida. Neste caso a
taxa global da reação será determinada pela velocidade da reação química na
superfície do catalisador e a reação química será a etapa limitante do processo. E a
segunda é quando a transferência de massa através do filme é lenta e, portanto, é a
etapa limitante. Neste caso, há uma barreira difusional provocada pelo filme ao redor
da superfície do catalisador.
Os fenômenos difusivos internos devem ser levados em conta quando se
emprega catalisadores porosos, os quais contêm sítios ativos localizados no interior
dos poros. Portanto, as moléculas reagentes devem difundir pelos poros até atingir
o sitio ativo, onde ocorrerá a reação química.
7
2 OBJETIVOS
O experimento teve como objetivo estudar a isomerização de frutose a glicose
catalisada por glicose isomerase imobilizada em gel de quitosana ativado com
glutaraldeído. Através da estimativa dos parâmetros cinéticos e da determinação da
efetividade experimental e comparação com a teórica, analisaram-se os efeitos
provocados ao empregar diferentes temperaturas e diâmetros de partículas de
catalisador na reação heterogênea, operada em reator batelada.
8
3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Inicialmente, cada tubo Falcon contendo 10 mL de solução de frutose em
cinco diferentes concentrações molares de 1,5, 0,8, 0,3, 0,2 e 0,1 M permaneceram
imersos em um banho termostático para o controle da temperatura.
Foram estudadas a enzima solúvel (livre) e a enzima glicose isomerase,
imobilizada em gel de quitosana ativada com glutaraldeído, em três diferentes
tamanhos de diâmetros. A Tabela 1 demonstra os diâmetros, as atividades teóricas
e as massas de gel empregadas. Para o experimento desse grupo, as reações
foram realizadas com enzima imobilizada de diâmetro P, à temperatura de 50°C.
Tabela 1 – Características da enzima glicose isomerase empregadas.
Tamanho Diâmetro (mm) Atividade Teórica (UI/ggel) Massa de gel (mg)
P 0,05-0,3 1000 28,7
M 1,70-0,85 757 37,9
G 3,36-2,36 782 36,7
Livre - 287 -
Cada uma das diferentes configurações da enzima empregadas foi utilizada
por um grupo experimental e em cada uma delas havia cinco frascos contendo as
enzimas a serem adicionadas num reator para a determinação da velocidade inicial
da reação, correspondente a cada concentração inicial de substrato. Foi empregado
um reator em batelada encamisado para manter o controle da temperatura, sob
agitação de aproximadamente 300 rpm.
Após adição das partículas de enzima imobilizada ao reator, para cada uma
das cinco concentrações iniciais Cs, retirou-se 100 µL de amostra do reator nos
tempos de 10, 20 e 30 minutos.
Cada amostra foi recolhida em frascos do tipo Eppendorf, já contendo 100 µL
solução de HCl 20% (vol/vol). Em seguida, fechou-se o frasco e o agitou
imediatamente para acelerar a mistura com o ácido e interromper a reação. Em
seguida, adicionaram-se 800 µL de água destilada e agitou-se novamente o frasco,
mantendo-o reservado e devidamente identificado.
9
Para a análise colorimétrica, foram utilizados 50 µL de cada amostra inativada
para reagir com 1mL de reagente GOD-PAP, por 10min, a 37°C, mantida em banho
termostático. Nesse método analítico enzimático, a glicose oxidase (GOD) oxida a
glicose presente na amostra e produz peróxido de hidrogênio. Por sua vez, a
peroxidase catalisa a oxidação de fenol e aminofenazona (PAP) na presença de
peróxido, gerando um complexo colorido. Coloração esta que pode ser medida em
espectrofotômetro e relacionada com a concentração de glicose inicialmente
presente na amostra.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Determinação dos parâmetros cinéticos
Neste experimento, trabalhou-se com a reação de isomerização de frutose a
glicose, catalisada pela enzima glicose isomerase imobilizada.
Com os valores de absorbância (Abs) medidos em diferentes instantes para
cada solução de frutose, foram calculadas as concentrações de glicose (Cp) através
da curva de calibração do espectrofotômetro fornecida, expressa pela Equação (1):
(1)
Uma vez que foi realizada uma diluição 1:2, a concentração real de produto
foi obtida pela relação:
(2)
Na Tabela 1, estão dispostas as absorbâncias em função do tempo para as
diferentes soluções de frutose e as concentrações de glicose obtidas.
10
Tabela 1 – Valores de absorbância e concentração de glicose.
Amostra Cs0 (mol/L) Cs0 (g/L) Tempo (min) Abs Cp,dil (g/L) Cp (g/L)
S1
1,5 270
10,133 0,137 0,601 1,202
S2 19,983 0,252 1,095 2,191
S3 29,850 0,347 1,503 3,007
S4
0,8 144
9,967 0,079 0,352 0,704
S5 19,917 0,179 0,782 1,563
S6 29,817 0,274 1,190 2,380
S7
0,3 54
10,000 0,039 0,180 0,360
S8 19,933 0,067 0,300 0,601
S9 30,000 0,130 0,571 1,142
S10
0,2 36
10,233 0,022 0,107 0,214
S11 19,917 0,051 0,232 0,463
S12 29,967 0,098 0,434 0,867
S13
0,1 18
10,233 0,021 0,103 0,206
S14 20,000 0,048 0,219 0,438
S15 30,083 0,080 0,356 0,713
Na isomerização da frutose, 1 mol de frutose é convertida a 1 mol de glicose,
ambas com massa molar de 180 g/mol. Assim, as concentrações de substrato
(frutose), Cs, e de produto (glicose), Cp, em unidades molar e mássica, estão
relacionadas numa proporção de 1 para 1 e a velocidade de consumo de substrato, -
rs, pode ser calculada por:
(3)
Com os dados da Tabela 1, foi realizada regressão linear através da origem
dos dados de concentração de produto em função do tempo, sendo as velocidades
de consumo de substrato equivalentes aos coeficientes angulares de cada reta
ajustada.
A Figura 1 apresenta os dados da concentração de produto em função do
tempo para cada uma das concentrações iniciais de substrato para obtenção de -rs.
Os valores encontrados estão dispostos na Tabela 2.
11
Figura 1 – Concentração de produto em função do tempo para cada uma das
concentrações iniciais de substrato.
Tabela 2 – Valores de –rs para as diferentes soluções de frutose.
Cs0 (g/L) -rs (g/L.min)
270 0,1046
144 0,0788
54 0,0357
36 0,0267
18 0,0229
Para determinar os parâmetros cinéticos aparentes foi utilizado o modelo
cinético de Michaelis-Menten, o qual relaciona a concentração de substrato com a
sua velocidade de consumo em uma reação enzimática, conforme a Equação (4).
(4)
onde vmáx e Km são os parâmetros cinéticos do modelo de Michaelis-Menten para a
reação enzimática. A constante Km representa a afinidade da enzima pelo substrato
(reagente) e vmáx expressa a velocidade máxima da reação.
A equação de Michaelis-Menten pode ser aproximada por uma hipérbole
descrita pela Equação (5).
y = 0.1046x R² = 0.9733
y = 0.0788x R² = 0.9946
y = 0.0357x R² = 0.9459
y = 0.0267x R² = 0.9417
y = 0.0229x R² = 0.9860
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0
Cp
(g
/L)
Tempo (min)
1,5 M
0,8 M
0,3 M
0,2 M
0,1 M
12
(5)
em que y = -rs, x = Cs, P1 = vmáx e P2 = Km.
Dessa forma, foi realizado um ajuste de hipérbole com os dados de –rs em
função de Cs (Tabela 2), por meio do software Scidavis, conforme apresentado na
Figura 2, de onde foram obtidos vmáx = 0,179 g/(L min) e Km = 190,14 g/L.
Figura 2 – Ajuste hiperbólico dos valores de –rs em função de Cs0.
Rearranjando a Equação (4), obtém-se a Equação (6), que representa a
linearização de Lineweaver-Burk da equação de Michaelis-Menten.
(6)
Assim, construindo-se um gráfico com os dados de 1/-rs versus 1/Cs, pode-se
obter os parâmetros Km e vmáx por meio de um ajuste linear. Na Tabela 3 estão
dispostos os valores de 1/-rs e 1/Cs0 e a Figura 3 apresenta o ajuste linear realizado.
Os valores tachados na Tabela 3 foram desprezados na regressão, pois se
distanciaram significativamente da tendência linear.
13
Tabela 3 – Valores de 1/-rs e 1/Cs0 para linearização da equação de Michaelis-
Menten.
1/Cs0 (L/g) 1/-rs (L.min/g)
0,00370 9,560
0,00694 12,695
0,01852 28,032
0,02778 37,405
0,05556 43,652
Figura 3 – Valores de 1/-rs em função de 1/Cs0.
Pela Figura 3, tem-se:
4.2 Cálculo da energia de ativação
Dados experimentais obtidos pelos grupos de cada turma, em três
temperaturas e três diferentes tamanhos de diâmetros de gel foram utilizados para
calcular a energia de ativação da reação para a enzima imobilizada e para a livre,
conforme apresentado na Tabela 4.
y = 1184.5x + 5.0601 R² = 0.9966
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0.00 0.01 0.01 0.02 0.02 0.03 0.03
1/-
rs (
L.m
in/g
)
1/Cs0 (L/g)
14
Tabela 4 – Dados cinéticos para temperaturas e diâmetros de partícula diferentes.
Diâmetro da partícula Temperatura (°C) vmáx (g/L.min) Km (g/L)
Enzima livre
60 0,711 150,6
50 0,256 268,6
40 0,109 100,5
P
60 0,675 151,5
50 0,198 234,1
40 0,104 108,3
M
60 0,509 287,6
50 0,146 119,8
40 0,063 82,3
G
60 0,211 253,2
50 0,108 207,0
40 0,047 78,9
A equação de Arrhenius permite calcular a variação da constante de
velocidade de uma reação química com a temperatura, conforme a Equação (7).
(7)
em que k = constante de velocidade, A = constante pré-exponencial, Ea = Energia de
ativação (kcal/mol), R = constante dos gases (kcal/mol.K) e T = Temperatura (K).
A Equação (7) pode ser linearizada utilizando o logaritmo natural, de modo a
se obter a Equação (8).
( ) ( )
(8)
Na prática, usa-se ln (k) = ln (vmáx), uma vez que vmáx é proporcional a k.
Assim, obtém-se a Equação (9).
( ) ( )
(9)
Logo, a partir dos dados da Tabela 4, pode-se construir o gráfico de ln (vmáx)
em função de 1/T, como ilustra a Figura 4. Os valores utilizados para a construção
das retas encontram-se na Tabela 5.
15
Tabela 5 – Valores de ln (vmáx) em função de 1/T.
Diâmetro da partícula 1/T (1/K) ln (vmáx)
Enzima livre
0,00300 -4,435
0,00309 -5,457
0,00319 -6,311
P
0,00300 -4,487
0,00309 -5,714
0,00319 -6,358
M
0,00300 -4,770
0,00309 -6,018
0,00319 -6,859
G
0,00300 -5,650
0,00309 -6,320
0,00319 -7,152
Figura 4 – ln (vmáx) em função de 1/T para cada diâmetro.
y = -9770.1x + 24.852 R² = 0.9952
-7.000
-6.500
-6.000
-5.500
-5.000
-4.500
-4.000
-3.500
0.00280 0.00300 0.00320 0.00340
ln(v
má
x)
1/T (1/K)
Livre
y = -9721.7x + 24.584 R² = 0.9622
-7.000
-6.500
-6.000
-5.500
-5.000
-4.500
-4.000
0.00280 0.00300 0.00320 0.00340
ln(v
má
x)
1/T (1/K)
Pequeno
y = -10873x + 27.786 R² = 0.9831
-7.500
-7.000
-6.500
-6.000
-5.500
-5.000
-4.500
-4.000
0.00280 0.00300 0.00320 0.00340
ln(v
má
x)
1/T (1/K)
Médio
y = -7839.6x + 17.901 R² = 0.998
-7.500
-7.000
-6.500
-6.000
-5.500
-5.000
-4.500
-4.000
0.00280 0.00300 0.00320 0.00340
ln(v
má
x)
1/T (1/K)
Grande
16
Os valores obtidos para a Ea (kJ/mol) através da linearização da equação de
Arrhenius foram calculados de acordo com a Equação (10):
(10)
onde a (K) é o coeficiente angular da reta obtida a partir do ajuste linear dos dados
da Tabela 5 e R = 8,314 J/(mol.K). A Tabela 6 apresenta os valores da energia de
ativação em função do diâmetro da partícula.
Tabela 6 – Energia de ativação em função do diâmetro da partícula.
Diâmetro da partícula Ea (kJ/mol) Ea (kcal/mol)
Enzima livre 81,2 19,4
P 80,8 19,3
M 90,4 21,6
G 65,2 15,6
4.3 Cálculo da efetividade
A relação existente entre a velocidade de reação com a enzima imobilizada e
a velocidade que deveria ser obtida na ausência de difusão, considerando a enzima
totalmente livre, é dada pela efetividade experimental (ηexp):
(11)
onde vimobilizada é a velocidade aparente da reação com enzima imobilizada e vlivre, a
velocidade da reação considerando a enzima livre. A efetividade experimental (ηexp)
varia entre 0 e 1. Os dados de velocidade obtidos com a enzima livre e a enzima
imobilizada, juntamente com a efetividade experimental, para cada uma das
concentrações de substrato, diâmetro de enzima e temperatura estão mostrados nas
Tabelas de 7 a 9.
17
Tabela 7 – Valores de efetividade experimental em função da concentração de
substrato e diâmetro da partícula (a 60°C).
Cs0
(g/L)
Enzima livre Enzima ImP Enzima ImM Enzima ImG
-rs (g/L.min) -rs
(g/L.min) exp
-rs
(g/L.min) exp
-rs
(g/L.min) exp
270 0,508 0,453 0,893 0,225 0,443 0,087 0,170
144 0,356 0,343 0,964 0,191 0,536 0,076 0,213
54 0,191 0,202 1,059 0,074 0,389 0,036 0,190
36 0,126 0,110 0,876 0,060 0,475 0,031 0,245
18 0,078 0,074 0,953 0,030 0,385 0,014 0,175
Tabela 8 – Valores de efetividade experimental em função da concentração de
substrato e diâmetro da partícula (a 50°C).
Cs0
(g/L)
Enzima livre Enzima ImP Enzima ImM Enzima ImG
-rs (g/L.min) -rs
(g/L.min) exp
-rs
(g/L.min) exp
-rs
(g/L.min) exp
270 0,143 0,105 0,734 0,119 0,831 0,082 0,577
144 0,083 0,079 0,945 0,073 0,879 0,065 0,783
54 0,053 0,036 0,671 0,043 0,806 0,020 0,373
36 0,039 0,027 0,689 0,035 0,898 0,013 0,340
18 0,016 0,023 1,421 0,026 1,632 0,009 0,571
Tabela 9 – Valores de efetividade experimental em função da concentração de
substrato e diâmetro da partícula (a 40°C).
Cs0
(g/L)
Enzima livre Enzima ImP Enzima ImM Enzima ImG
-rs (g/L.min) -rs
(g/L.min) exp
-rs
(g/L.min) exp
-rs
(g/L.min) exp
270 0,073 0,060 0,830 0,052 0,719 0,041 0,567
144 0,063 0,080 1,275 0,050 0,794 0,028 0,443
54 0,040 0,034 0,849 0,023 0,591 0,026 0,652
36 0,029 0,026 0,870 0,016 0,552 0,011 0,388
18 0,016 0,015 0,916 0,012 0,727 0,009 0,561
18
Para determinar a efetividade teórica, os cálculos seguintes foram realizados
para a comparação de condições reacionais e unidades equivalentes. Inicialmente
foi necessário corrigir a unidade em que se expressa a velocidade máxima de
reação através da Equação (12).
(12)
Em seguida, converteu-se v’máx, que estava em unidade de volume do reator
para v”máx, em unidade de volume de catalisador, conforme Equação (13).
(13)
onde v”máx é a velocidade máxima de reação em função da massa de substrato
(gfrutose/(min.cm³cat), Cgel, a concentração de catalisador por volume de reator (ggel/L)
e gel, a densidade do catalisador (ggel/cm³cat).
A partir das concentrações iniciais de substrato (Cs*) e da constante de
Michaelis-Menten (Km), foi calculado o adimensional () pela Equação (14):
(14)
onde Cs* corresponde à concentração de substrato na película de fluido ao redor da
partícula. Na presença de alta agitação, considera-se que Cs* apresenta o mesmo
valor que a concentração no meio, ou seja, Cs* = Cs0.
Através do ábaco que relaciona a efetividade em função do módulo de Thiele,
, para diferentes valores de (Figura 5), foi possível encontrar os valores de para
cada concentração, diâmetro de catalisador e temperatura.
Figura 5 – Efetividade interna em função de , para diferentes valores de .
Fonte: Roteiro Experimental
19
Com o módulo de Thiele, estimou-se a difusividade efetiva, Deff, a partir da
Equação (15).
(15)
onde Rp é o raio da partícula de gel.
As Tabelas de 10 a 12 apresentam os valores de e obtidos para cada
concentração de substrato, diâmetro de partícula e temperatura, bem como os
dados das respectivas difusividades. Para os casos em que a efetividade calculada
foi maior que 1, não foi possível estimar o Módulo de Thiele.
Tabela 10 – Valores estimados de , e Deff (a 60°C).
Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Deff (m2/min)
P
270 1,782 3,0 1,49·10-8
144 0,950 1,5 5,94·10-8
54 0,356 - -
36 0,238 2,0 3,34·10-8
18 0,119 0,8 1,85·10-7
M
270 0,939 6,5 5,05·10-8
144 0,501 5,0 8,54·10-8
54 0,188 4,5 1,05·10-7
36 0,125 4,0 1,33·10-7
18 0,063 4,0 1,33·10-7
G
270 1,066 10,0 5,24·10-8
144 0,569 8,5 7,25·10-8
54 0,213 8,0 8,18·10-8
36 0,142 7,5 9,31·10-8
18 0,071 7,0 1,07·10-7
20
Tabela 11 – Valores estimados de , e Deff (a 50°C).
Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Deff (m2/min)
P
270 1,153 6,0 7,04·10-10
144 0,615 2,0 6,34·10-9
54 0,231 4,0 1,58·10-9
36 0,154 3,0 2,82·10-9
18 0,077 - -
M
270 2,253 4,0 9,19·10-8
144 1,202 3,0 1,63·10-7
54 0,451 2,0 3,68·10-7
36 0,300 1,5 6,53·10-7
18 0,150 - -
G
270 1,304 6,0 9,07·10-8
144 0,696 3,0 3,63·10-7
54 0,261 7,0 6,67·10-8
36 0,174 8,0 5,10·10-8
18 0,087 3,0 3,63·10-7
Tabela 12 – Valores estimados de , e Deff (a 40°C).
Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Deff (m2/min)
P
270 2,494 5,0 1,16·10-9
144 1,330 - -
54 0,499 2,0 7,23·10-9
36 0,332 1,5 1,29·10-8
18 0,166 1,0 2,89·10-8
M
270 3,282 6,0 2,55·10-8
144 1,751 4,5 4,54·10-8
54 0,656 5,5 3,04·10-8
36 0,438 5,0 3,67·10-8
18 0,219 4,0 5,74·10-8
G
270 3,420 8,0 5,83·10-8
144 1,824 7,5 6,63·10-8
54 0,684 5,0 1,49·10-7
36 0,456 7,0 7,61·10-8
18 0,228 4,5 1,84·10-7
A partir de Deff, calculou-se Ds, pela seguinte relação:
(16)
21
onde p é a porosidade do gel (p = 7), é a tortuosidade do gel ( = 0,98) e H é o
coeficiente de restrição. H pode ser obtido pela Equação de Renkin (17):
( )( ) (17)
sendo y dado por:
(18)
em que raioS é o raio do soluto e raioP é o raio do poro de catalisador.
Com o valor de y, foi obtido H = 0,9814, a partir do qual se calcularam as
diferentes difusividades Ds. As Tabelas de 13 a 15 apresentam os valores calculados
de Ds para cada uma das condições estudadas durante o experimento.
Tabela 13 – Valores estimados de Ds (a 60°C).
Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Ds (cm2/s)
P
270 1,08·10-7
144 4,32·10-7
54 -
36 2,43·10-7
18 1,35·10-6
M
270 3,68·10-7
144 6,22·10-7
54 7,68·10-7
36 9,71·10-7
18 9,71·10-7
G
270 3,81·10-7
144 5,28·10-7
54 5,96·10-7
36 6,78·10-7
18 7,78·10-7
22
Tabela 14 – Valores estimados de Ds (a 50°C).
Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Ds (cm2/s)
P
270 8,54·10-7
144 7,69·10-6
54 1,92·10-6
36 3,42·10-6
18 -
M
270 6,69·10-7
144 1,19·10-6
54 2,67·10-6
36 4,76·10-6
18 -
G
270 6,60·10-7
144 2,64·10-6
54 4,85·10-7
36 3,71·10-7
18 2,64·10-6
Tabela 15 – Valores estimados de Ds (a 40°C).
Diâmetro do catalisador Cs0 (g/L) Ds (cm2/s)
P
270 8,42·10-9
144
54 5,26·10-8
36 9,36·10-8
18 2,11·10-7
M
270 1,86·10-7
144 3,30·10-7
54 2,21·10-7
36 2,67·10-7
18 4,18·10-7
G
270 4,24·10-7
144 4,83·10-7
54 1,09·10-6
36 5,54·10-7
18 1,34·10-6
23
4.4 Discussão
O experimento realizado utilizou o modelo cinético de Michaelis-Menten. Para
isso, foi necessário estabelecer algumas condições e hipóteses para a validade do
modelo. Assim, trabalhou-se com concentrações de frutose muito maiores que a
concentração de enzima, e considerou-se a hipótese de Briggs e Haldane do estado
pseudo-estacionário, ou seja, a velocidade de formação do complexo enzima-
substrato é igual a sua velocidade de decomposição, considerada de primeira
ordem. Além disso, o modelo de Michaelis-Menten pressupõe apenas um substrato,
que é o caso da isomerização da frutose.
A partir dos dados experimentais, construiu-se o gráfico de velocidade de
consumo do substrato em função de sua concentração inicial. A linearização da
equação de Michaelis-Menten realizada foi considerada satisfatória, obtendo-se um
valor de R² igual a 0,9966.
Comparando-se os valores obtidos de velocidade máxima de consumo de
substrato, é possível afirmar que o aumento da concentração inicial de frutose
promoveu o aumento da velocidade da reação. De fato, o crescimento na
concentração de substrato promove a maior ocupação dos sítios ativos da enzima,
aumentando, assim, a interação substrato-catalisador.
Pôde-se perceber também que o aumento do diâmetro da partícula acarretou
na diminuição da velocidade de reação, já que, quanto maior a partícula, maior o
efeito difusivo, dificultando ainda mais a transferência de substrato ao interior do
catalisador, onde se encontram alojados os sítios ativos da enzima.
O aumento da temperatura também ocasionou o aumento da velocidade de
formação de produto, pois a enzima atua melhor a temperaturas entre 60°C e
80°C(6). Não foi possível verificar, durante o experimento realizado, a desnaturação
térmica do catalisador, que ocorre com o crescimento da temperatura.
Os parâmetros vmáx e Km determinados para a enzima livre são intrínsecos a
enzima, enquanto que os parâmetros obtidos para a enzima imobilizada são
aparentes, pois refletem o que ocorrem na superfície ou interior do catalisador,
sendo estimados na presença de efeitos difusionais internos e externos.
O experimento realizado trabalhou com o gel quitosana ativado com
glutaraldeído. Por ser um suporte poroso, os efeitos difusivos internos e externos
24
não são levados em conta separadamente, ou seja, a efetividade encontrada foi
determinada experimentalmente e representa, principalmente, aquela interna.
Em virtude da inconsistência dos dados experimentais, não foi possível
avaliar a difusividade do catalisador. Como cada grupo empregou condições
operacionais diferentes, o erro de cada experimentador promoveu uma série de
propagação de erros que influenciaram de forma significativa nos dados
experimentais. Além disso, o emprego de diferentes soluções de GOD-PAP, a perda
de massa de catalisador durante a sua transferência até o reator encamisado,
problemas no momento da pipetagem também contribuíram para a obtenção de
dados experimentais inadequados.
A alta agitação no reator (por volta de 300 rpm, considerando a sensibilidade
da enzima) permite que se faça uma aproximação da concentração de substrato
próximo a superfície do catalisador como igual a concentração do meio. Assim,
subentende-se que os efeitos difusivos internos são mais relevantes que os
externos, efeitos estes expressos a partir da efetividade experimental.
Por fim, também não foi possível realizar uma análise da influência do
diâmetro de catalisador na energia de ativação, devido à variação dos valores
medidos, os quais não apresentaram uma tendência definida. Contudo, espera-se
que a energia de ativação aumente com o diâmetro do catalisador, pois o aumento
difusivo diminui a velocidade de reação, desacelerando a catálise.
25
5 CONCLUSÃO
Os parâmetros cinéticos obtidos para todos os grupos apresentaram-se
condizentes com o esperado, já que de forma geral, os valores de vmax aumentaram
com a temperatura e diminuíram com o tamanho de partícula de catalisador.
Os valores de difusividade molecular (Ds) calculados se apresentaram da
mesma ordem de grandeza dos valores disponíveis na literatura (7), apesar da
inconsistência de tais valores entre as diferentes temperaturas e diâmetros, devidos
principalmente aos erros referentes à leitura do ábaco de Thiele e erros
experimentais propagados.
Por fim, o experimento se mostrou adequado no que se propõe ao estudo dos
efeitos difusivos na cinética de uma reação catalisada por enzima imobilizada,
processo de grande importância econômica e tecnológica.
26
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
[1] GALLO, L.,A.. Enzimas. Bioquímica. Escola Superior de Agricultura "Luiz de
Queiroz" - ESALQ – USP. Disponível em: <http://docentes.esalq.usp.br/luagallo/
enzimas.html>. Acesso em 25 de outubro de 2013.
[2] MARIOTTO, J.R. Cinética Enzimática. Estágio de Docência. Julho de 2006.
30p. Disponível em: <http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/apostilas/
Apostila_cinetica_enzimatica_ju.pdf>. Acesso em 07 de outubro de 2013.
[3] BIOCIÊNCIA. Actividade enzimática. Abril de 2011. Disponível em:
<http://bio12-ciencia.blogspot.com.br/2011/04/actividade-enzimatica.html>. Acesso
em 07 de outubro de 2013.
[4] DIAS, F.R.F.; FERREIRA, V.F.; CUNHA, A.C. Uma Visão Geral dos
Diferentes Tipos de Catálise em Síntese. Rev. Virtual de Química. 2012, 4 (6),
840-871.
[5] CARDOSO, C. L.; MORAES, M. C.; CASS, Q.B.. Imobilização de enzimas
em suportes cromatográficos: uma ferramenta na busca por substâncias
bioativas. Quím. Nova [online]. 2009, vol.32, n.1, pp. 175-187.
[6] FABER, M. O. Isomerização Enzimática de Glicose a Frutose em
Biorreator de Leito Fixo Alimentado Continuamente. Dissertação de Mestrado.
Rio de Janeiro: UFRJ, 2011. Disponível em: <http://tpqb.eq.ufrj.br/download/
isomerizacao-enzimatica-de-glicose-e-frutose.pdf>. Acesso em 07 de outubro de
2013.
[7] GIORDANO, R. L. C.; GIORDANO, R. C.; COONEY, C. L. A study on intra-
particle diffusion effects in enzymatic reactions: glucose-fructose
isomerization. Bioprocess Engineering, v. 23, p. 159-166, 2000.