Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm … · 5.2 Untersuchungen zur Struktur der Ca2+-Kanäle 84 5.3 Untersuchungen zur Quantifizierung der Ca2+-Kanäle 85 5.4

Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover

___________________________________________________________________________

Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im

Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln

INAUGURAL-DISSERTATION Zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.)

durch die Tierärztliche Hochschule Hannover

Vorgelegt von Thomas Hinterding

aus Krefeld

Hannover 2002

Wissenschaftliche Betreuung: Prof. Dr. B. Schröder 1. Gutachter: Prof. Dr. B. Schröder 2. Gutachter: Prof. Dr. U. Ebert Tag der mündlichen Prüfung: 22. November 2002 Gefördert durch die H. WILHELM SCHAUMANN STIFTUNG

Für meine Eltern

Karl & Maria

Hinterding

Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung 1

2 Literaturübersicht 2

2.1 Biologische Bedeutung von Calcium im Säugetierorganismus 2

2.2 Regulation der zellulären Ca2+-Homöostase 2

2.3 Regulation der systemischen Ca2+-Homöostase 3

2.4 Alimentäre Ca2+-Aufnahme 5

2.5 Mechanismen des intestinalen Ca2+-Transports 6

2.5.1 Parazellulärer Ca2+-Transport 6

2.5.2 Transzellulärer Ca2+-Transport 7

2.6 Neonatale Entwicklung des Gastrointestinaltrakts 12

2.7 Besonderheiten des transzellulären Ca2+-Transports bei Saugferkeln 14

3 Material und Methoden 15

3.1 Versuchstiere 15

3.2 Probenentnahmen 16

3.2.1 Probenentnahme für die Präparation von Bürstensaummembranvesikeln 16

3.2.2 Probenentnahme für die RNA-Präparation 16

Inhaltsverzeichnis

3.3 Präparation der Bürstensaummembranvesikel 17

3.3.1 Prinzip 17

3.3.2 Durchführung 17

3.3.3 Präparationspuffer 19

3.4 Messung der Aufnahmeraten in die Bürstensaummembranvesikel 21

3.4.1 Puffer für die Aufnahmestudien 21

3.4.2 Kalkulation von [Ca2+]f 22

3.4.3 Studien zur zeitabhängigen Glucose-Aufnahme 23

3.4.4 Studien zur zeitabhängigen Calcium-Aufnahme 23

3.4.5 Studien zur konzentrationsabhängigen Calcium-Aufnahme 25

3.4.6 Kalkulation der kinetischen Kenngrößen der Ca2+-Aufnahme 26

3.4.7 Ermittlung des Vesikelvolumens 27

3.5 Protein- und Enzym-Bestimmungen im Mukosahomogenat

und in der Vesikelsuspension 28

3.5.1 Protein 28

3.5.1.1 Prinzip 28

3.5.1.2 Durchführung 28

3.5.2 Aktivität der alkalische Phosphatase (AP) 29

3.5.2.1 Prinzip 29


3.5.3 Aktivität der Na+/K+-ATPase 29

3.5.3.1 Prinzip 29


Inhaltsverzeichnis

3.6 Gesamt-RNA-Isolierung und DNase-Verdau 30

3.6.1 Prinzip 31


3.7 cDNA-Synthese 32

3.7.1 Prinzip 32


3.8 Polymerasekettenreaktion (PCR) 33

3.8.1 Prinzip 33


3.9 Darstellung der DNA auf einem Agarosegel 36

3.9.1 Prinzip 36


3.10 Isolierung der PCR-Produkte 37

3.10.1 Prinzip 37


3.11 Ligation der PCR-Produkte 38

3.11.1 Prinzip 38


Inhaltsverzeichnis

3.12 Transformation der Bakterien 39

3.12.1 Prinzip 39


3.13 Plasmidpräparation 40

3.13.1 Prinzip 40


3.14 Restriktionsverdau 41

3.14.1 Prinzip 41


3.15 Sequenzierung 41

3.16 mRNA-Isolierung 42

3.16.1 Prinzip 42


3.17 Northern-Blot 43

3.17.1 Prinzip 43

3.17.2 Größenfraktionierung der RNA in einem denaturierenden Agarosegel 43

3.17.3 Übertragen der RNA auf eine Nitrocellulosemembran 44

3.17.4 Erstellung von spezifischen, radioaktiv markierten Sonden 46

3.17.5 Hybridisierung der RNA mit den radioaktiv markierten Sonden 47

3.17.6 Darstellung der RNA 48

3.17.7 Auswertung der Northern-Blots 48

Inhaltsverzeichnis

3.18 Real-Time-PCR 49

3.18.1 Prinzip 49


3.18.3 Auswertung der Real-Time-PCR 52

3.19 Chemikalien 53

3.20 Statistik 54

4 Ergebnisse 55

4.1 Effekte des Alters der Versuchstiere auf die Ca2+-Aufnahme

in BSMV 55

4.1.1 Charakterisierung der BSMV 55

4.1.2 Ca2+-Aufnahmeraten in die BSMV 60

4.2 Ergebnisse der PCR 65

4.3 Teilsequenz des ECaC im konservierten Bereich 66

4.4 Teilsequenz des ECaC1 im hypervariablen Bereich 67

4.5 Teilsequenz des ECaC2 im hypervariablen Bereich 69

4.6 Northern-Blots mit verschiedenen Sonden entlang der Darmachse 72

4.6.1 Northern-Blot mit der „ECaC-Sonde“ 72

4.6.2 Northern-Blot mit der „ECaC1-Sonde“ 73

4.6.3 Northern-Blot mit der „ECaC2-Sonde“ 73

Inhaltsverzeichnis

4.7 Ergebnisse der Real-Time-PCR bei Saug- und Absetzferkeln 74

5 Diskussion 79

5.1 Untersuchungen zur Funktion der Ca2+-Kanäle 79

5.2 Untersuchungen zur Struktur der Ca2+-Kanäle 84

5.3 Untersuchungen zur Quantifizierung der Ca2+-Kanäle 85

5.4 Schlussbetrachtung und Ausblick 86

6 Zusammenfassung 88

7 Summary 90

8 Literaturverzeichnis 92

Abkürzungsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

ATP Adenosintriphosphat

as antisense

ave average

bp Basenpaare

BSMV Bürstensaummembranvesikel

Ca2+ Calcium in ionisierter Form

[Ca2+]ges Gesamt- Ca2+-Konzentration

[Ca2+]f Konzentration freier Ca2+-Ionen

cDNA komplementäre DNA (complementary DNA)

cpm Impulse pro Minute (counts per minute)

Ct-Wert der Ct-Wert gibt an, wie viele Zyklen in der PCR für den jeweiligen Ansatz

gebraucht werden, bis das Fluoreszenzsignal einen definierten Schwellenwert

überschritten hat (cycle; threshold)

dCTP 2`Desoxycytidin-5`triphosphat

DMSO Dimethylsulphoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid)

dNTP 2`Desoxyribonucleosid-5`triphosphat

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylen-Diamin-tetra-Essigsäure (-Acetic-Acid)

EGTA Ethylen-Glykol-bis (β-Aminoethylether)-N,N´-tetra-Essigsäure (-Acetic-Acid)

g Zentrifugalbeschleunigung

GM Größenmarker

HEPES 4-(2-Hydroxy-Ethyl)-1-Piperazin-Ethan-Sulfonsäure

Kap. Kapitel

Km Michaelis-Menten-Konstante; gibt die Menge an Substrat an, die für die

halbmaximale Transportrate notwendig ist

LB-Medium Luria-Bertani-Medium

Abkürzungsverzeichnis MOPS 3-(N-Morpholino)Propansulfonsäure

µCi mikro Curie (1 Ci = 37 x 109 Bq)

mRNA Boten-RNA (messenger-RNA)

p Irrtumswahrscheinlichkeit

PCR Polymerase Kettenreaktion (polymerase chain reaction)

PMCA Plasmamembran-Calciumpumpe

PTH Parathormon

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

rpm Umdrehungen pro min (rounds per minute)

RT Raumtemperatur

RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR

s sense

SEM Standardfehler des Mittelwertes (standard error of the mean)

SDS Sodiumdodecylsulfat

spez. A. spezifische Aktivität

Tris Tris (Hydroxymethyl) Aminomethan

VDR Vitamin D-Rezeptor

Vmax maximale Transportkapazität

v/v Volumen zu Volumen

w/v Gewicht zu Volumen

Einleitung 1 EINLEITUNG Beim Schwein ist das Duodenum wichtigster Ort der aktiven Ca2+-Absorption, der damit

wesentlich an der Aufrechterhaltung der Calcium-Homöostase beteiligt ist. Dieser Prozess ist

zunächst in der frühen postnatalen Lebensphase bis etwa zur 4. Lebenswoche unabhängig von

Calcitriol, dem klassischen Vitamin D-Hormon, kommt aber anschließend mehr und mehr

unter Kontrolle dieses Hormons. Über den physiologischen Sinn dieser postnatalen

Anpassung kann bislang nur diskutiert werden.

Für viele Spezies wurde gezeigt, dass Ca2+ durch einen aus mindestens drei Einzelschritten

bestehenden Mechanismus vom Darmlumen durch die Enterozyten zur Blutseite transportiert

wird. Im ersten Teilschritt, der für den transzellulären Ca2+-Transport wahrscheinlich

geschwindigkeitsbestimmend ist, tritt Ca2+ entlang eines chemischen Gradienten über die

Bürstensaummembran durch Ca2+-Kanäle in die Zelle ein. Im zweiten Teilschritt wird Ca2+

auf bisher nicht genau geklärte Weise unter Beteiligung von Calbindin-D9k durch das Cytosol

transportiert. Die Ausschleusung aus der Zelle durch die basolaterale Membran wird durch

die ATP-abhängige Plasmamembran-Calciumpumpe vermittelt und stellt den dritten

Teilschritt dar.

Beim Menschen und bei der Ratte konnten vor kurzem jeweils zwei verschiedene Ca2+-

Kanäle kloniert werden, die eine 75%ige Aminosäurenidentität zueinander aufwiesen. Es gibt

Hinweise darauf, dass ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm möglicherweise in

unterschiedlichem Maße durch Calcitriol reguliert werden können.

Der intestinale Ca2+-Transport beim Schwein ist bislang noch nicht mit

molekularbiologischen Methoden untersucht worden. Die Erkenntnisse solcher

Untersuchungen zum Ca2+-Transport berechtigen jedoch zu der Annahme, dass auch beim

Schwein Ca2+-Kanäle an der duodenalen Ca2+-Absorption beteiligt sind. Daher war es das

primäre Ziel der vorliegenden Untersuchungen, dieser Hypothese nachzugehen. Dazu sollten

zunächst die für Human- und Rattenproben beschriebenen molekularbiologischen Methoden

zur Darstellung von Ca2+-Kanälen auf mRNA-Ebene für den Schweinedarm adaptiert werden.

Anschließend sollte der Frage nachgegangen werden, ob eine veränderte Expression von

ECaC1 und/oder ECaC2 mit dem Wechsel vom calcitriol-unabhängigen zum calcitriol-

abhängigen Ca2+-Transport korreliert werden kann.

1

Literaturübersicht 2 LITERATURÜBERSICHT

2.1 Biologische Bedeutung von Calcium im Säugetierorganismus

Das Erdalkalielement Calcium ist aufgrund seiner multiplen Aufgaben eines der wichtigsten

kationischen Mengenelemente im Säugetierorganismus. Als essenzielles Strukturelement für

die Knochen und Zähne ist es genauso von Bedeutung, wie als Second messenger innerhalb

von Zellen. In der Funktion als Second messenger beeinflusst Calcium in ionisierter Form

(Ca2+) zum Beispiel die präsynaptische Ausschüttung von Neurotransmittern, die molekularen

Mechanismen der Muskelkontraktion (VAN BREEMEN u. SAIDA 1989), sowie die

Sekretionstätigkeit bestimmter exo- und endokriner Drüsen (MUALLEM 1989). Eine weitere

wichtige Rolle spielt Ca2+ in der Blutgerinnung als Aktivator der Thrombokinase (MORIN

1980) und auch beim epithelialen Transport von z. B. Natrium, Kalium und Chlorid wirkt

Ca2+ regulatorisch mit (DONOWITZ u. WELSH 1986).

2.2 Regulation der zellulären Ca2+-Homöostase

Die Konzentration an freien Ca2+-Ionen [Ca2+]f im Cytosol der ruhenden Zelle liegt bei vielen

Zelltypen in etwa bei 10-7 bis 10-8 mol.l-1 und steigt im stimulierten Zustand um bis zu 2

Zehnerpotenzen an (CAMPBELL 1988), was als funktionelles Signal interpretiert werden

kann (NEMERE und NORMAN 1991). Zur Aufrechterhaltung der Second messenger-

Funktion muss [Ca2+]f wieder auf die Ausgangskonzentration zurückgeführt werden. Dies

geschieht durch primär aktiven Transport mit Hilfe der Adenosintriphosphat (ATP)-

abhängigen Ca2+-Pumpen oder durch erleichterte Diffusion mittels des 3Na+/Ca2+-

Austauschers. Dabei kann Ca2+ entweder in Zellorganellen, wie die Mitochondrien und das

endoplasmatische Retikulum oder in den Extrazelluärraum transportiert werden (CARAFOLI

1987). Zur Regulation des [Ca2+]f kann dieses an Ca2+-bindende Proteine gebunden werden.

Ein ubiquitär vorkommendes Protein mit hoher Ca2+-Affinität ist das Calmodulin, das z. B. in

2

Literaturübersicht glatten Muskelzellen oder in den Mikrovilli von Enterozyten gefunden wird (GRAND et al.

1979, GLENNEY u. WEBER 1980). Enterozyten sind täglich mit relativ großen Mengen an

Ca2+ konfrontiert, das das Cytosol passieren muss, ohne dass die Second messenger-Funktion

eingeschränkt werden darf. Um dies zu gewährleisten, stehen der Darmschleimhautzelle

spezifische Ca2+-bindende Proteine zur Verfügung, die auf Grund ihrer Abhängigkeit vom

Vitamin D-Hormon Calbindin-D genannt werden (TAYLOR u. WASSERMAN 1967,

CORRADINO u. WASSERMAN 1968, WAREMBOURG et al. 1986). Dabei induziert

Calcitriol nach Bindung an den kernständigen Vitamin D-Rezeptor (VDR) die Bildung von

Calbindin-D, wobei sich auf Grund des Molekulargewichtes 2 Typen unterscheiden lassen,

nämlich Calbindin-D9k und –D28k (NORMAN et al. 1999). Im Vogelintestinum wurde das

Calbindin-D28k nachgewiesen, das je Molekül 4 Moleküle Ca2+ binden kann (WASSERMAN

u. TAYLOR 1966). Das Calbindin-D9k, das nur 2 Moleküle Ca2+ binden kann, wurde dagegen

im Säugetierintestinum gefunden (JOHNSON u. KUMAR 1994). Man nimmt an, dass durch

die Bindung an das Calbindin die Second messenger-Funktion des Ca2+ trotz des

gleichzeitigen Ca2+-Transports weitestgehend unbeeinflusst bleibt (FEHER et al. 1992,

SCHRÖDER et al. 1996).

2.3 Regulation der systemischen Ca2+-Homöostase

Die Ca2+-Konzentrationen im Blutplasma bei Schweinen variieren unter physiologischen

Bedingungen in Abhängigkeit vom Alter, von der Rasse und vom Geschlecht, wobei bei

weiblichen Tieren der Reproduktionszustand mit entscheidend ist. Auch individuelle

Schwankungen und Beeinflussungen durch den Ca2+-Gehalt des Futters sind beschrieben

worden (SCHRÖDER 1996). So liegt der Plasmacalciumspiegel beim adulten Schwein bei

2,3 bis 2,8 mmol.l-1 und beim Ferkel während der Saugperiode zwischen 2,7 und 3,1 mmol.l-1

(KOLB 1989). Calcium wird im Blutplasma zu etwa 40 % in Komplexverbindungen oder an

Proteine (z. B. Albumine, Globuline) gebunden. Für die Ca2+-Homöostase im Organismus ist

nur das ionisiert vorliegende Calcium (etwa 60 %) von Relevanz (BROWN 1991).

Für die hormonelle Regulation des Plasmacalciumspiegels sind das Parathormon (PTH),

Calcitonin und Calcitriol, der biologisch aktive Metabolit des Vitamins D3, von

entscheidender Bedeutung. Die an der Regulation relevant beteiligten Organe sind die

3

Literaturübersicht Knochen, der Darm, die Nieren und die Nebenschilddrüsen (AUDRAN u. KUMAR 1985,

NORMAN 1987, DELUCA 1986, BROWN 1991). Abbildung 1 beschreibt in einer Übersicht

die Beeinflussungen und Anpassungsmechanismen zur Regulation der Ca2+-Homöostase.

PTH ist ein Peptidhormon, das bei niedrigen Plasmacalciumspiegel aus der Nebenschilddrüse

ausgeschüttet wird, und eine erhöhte renal-tubuläre Absorption von Ca2+ (BINDELS et al.

1991), eine erhöhte Mobilisation von Ca2+ aus dem Knochen und eine verstärkte Biosynthese

von Calcitriol in den proximalen Tubulusepithelzellen der Niere bewirkt (KOVARIK 1983).

Calcitonin, ein Peptidhormon, wird bei einem erhöhten Plasmacalciumspiegel überwiegend

aus den C-Zellen der Nebenschilddrüse freigesetzt. Calcitonin vermindert die Mobilisation

von Ca2+ aus dem Knochen (PECHET et al. 1967) und die renale Absorption (ZUO et al.

1997) und wirkt somit der PTH-Wirkung entgegen. Ein Einfluss von Calcitonin auf die

intestinale Ca2+-Absorption konnte bis jetzt nicht nachgewiesen werden.

Vitamin D ist ein Steroidhormon und wird entweder als Ergocalciferol (Vitamin D2) aus der

pflanzlichen Nahrung, als Cholecalciferol (Vitamin D3) aus tierischer Nahrung aufgenommen

oder im Körper selbst unter Einfluss von ultraviolettem Licht in der Haut aus Provitamin D3

synthetisiert. Vitamin D2 und D3 bzw. deren Metaboliten wirken im Säugetierorganismus über

den gleichen Mechanismus (NORMAN u. ROSS 1979). Vom Vitamin D3 sind mehr als 37

Metaboliten unter physiologischen Bedingungen bekannt (HENRY u. NORMAN 1984,

1991), wobei die biologisch aktivste Form für den intestinalen Ca2+-Transport das Calcitriol

ist (FAVUS 1985, NEMERE u. NORMAN 1990). Calcitriol (1α,25-Dihydroxyvitamin D3

oder 1α,25-Dihydroxychole-calciferol) entsteht aus Vitamin D3, das in der Leber am C25-

Atom und in der Niere am C1-Atom hydroxyliert wird. Calcitriol stimuliert die aktive

Absorption von Ca2+ aus dem Darm und fördert in Anwesenheit von PTH sowohl die

Absorption von Ca2+ in der Niere, als auch die Auflösung von Hydroxylapatit aus der

Knochenmatrix (HARMEYER u. KAUNE 1988).

Es sind weitere Substanzen, die die Ca2+-Homöostase beeinflussen, beschrieben worden, doch

sind deren Bedeutung sowie deren Wirkmechanismen bislang unklar. Zu diesen Substanzen

gehören das PTHrP (parathyroid hormone-related protein) (BLIND et al. 1993), das Prolaktin

(PAHUJA und DELUCA 1981) und das Stanniocalcin (MADSEN et al. 1998).

4

Literaturübersicht

Abbildung 1: Mechanismen zur Regulation der systemischen Ca2+-Homöostase ( Hochregulation,

Herunterregulation)

HypercalcämieHypocalcämie

NebenschilddrüsePTH

NebenschilddrüsePTH Calcitonin

NiereCalci-triol Ca2+-

Renale

Exkre-tion

NiereRenale Calci-Ca2+- triolExkre-tion

KnochenCa2+-Mobilisation

KnochenCa2+-Mobilisation

Ca2+

Normocalcämie

DarmCa2+-Absorption

DarmCa2+-Absorption

2.4 Alimentäre Ca2+-Aufnahme

Calcium wird dem Organismus überwiegend über die Aufnahme fester Nahrung zugeführt, da

der Gehalt an Ca2+ im Wasser meist weit unter 40 mg.l-1 liegt. Der tägliche Ca2+-Bedarf eines

Saugferkels liegt bei 0,8-1,1 g pro kg Körpermasse (KIRCHGESSNER 1997) und kann über

die Sauenmilch gedeckt werden, die etwa 2,3 g Calcium pro Liter enthält (MEYER u.

KAMPHUES 1990). Der Ca2+-Bedarf eines adulten Schweines wird in der Regel vollständig

über die handelsübliche Fütterung gedeckt, wenn in dem Futtermittel 0,55 bis 0,80 % Ca2+

enthalten sind (BEESON et al. 1953). Das entspricht einer täglichen Gabe von 11 bis 15 g für

ein 35 bis 100 kg schweres Schwein (OLTJEN et al. 1979).

5

Literaturübersicht Die Ca2+-Absorption im Magen des Schweines ist vernachlässigbar. Die Nettoabsorption

findet fast vollständig (über 90 %) im Dünndarm statt, wobei dem proximalen Teil die größte

Bedeutung zukommt (PARTRIDGE 1978). Die Befunde bezüglich der Ca2+-Absorption im

Dickdarm sind sehr widersprüchlich und reichen von einer täglichen Ca2+-Nettosekretion von

1,9 g bis zu einer gleichhohen Nettoabsorption (SAUER et al. 1982, LARSEN u.

SANDSTRÖM 1993). Die Ca2+-Aufnahme über den gesamten Darm variiert je nach Autor

von 3,0 bis 5,3 g pro Tag bei einer Aufnahme von 9,2 bis 15,1 g (HENNING et al. 1988,

LARSEN u. SANDSTRÖM 1993). Dies führt zu einer scheinbaren Verdaulichkeit des

Calciums von etwa 34 %.

2.5 Mechanismen des intestinalen Ca2+-Transports

Der intestinale Ca2+-Transport kann prinzipiell parazellulär und/oder transzellulär verlaufen.

Die quantitativen Anteile dieser Transportwege an der Ca2+-Nettoabsorption sind unter In-

vivo-Bedingungen nicht geklärt.

2.5.1 Parazellulärer Ca2+-Transport

Der parazelluläre Transport verläuft passiv und ist nicht sättigbar. Er nimmt mit der luminalen

Ca2+-Konzentration linear zu und ist außerdem abhängig vom elektrischen Gradienten

zwischen der luminalen und basolateralen Seite des Epithels (PANSU et al. 1983a). Diese

Transportform kann über den gesamten Darmtrakt nachgewiesen werden (PANSU et al.

1981), findet sich aber vor allem im distalen Dünndarm (NELLANS 1990, BRONNER 1992).

Sie kann aber auch im proximalen Dünndarm in gleichem Ausmaß auftreten, wenn

entsprechend hohe Ca2+-Konzentrationen vorliegen (PANSU et al. 1983b). Eine besondere

Bedeutung hat der parazelluläre Transport anscheinend bei jungen Ratten. Bei In-situ-

Untersuchungen mit ligierten Darmschlingen wurde festgestellt, dass neugeborene Ratten bis

zum 3. Lebenstag fast ausschließlich auf parazellulärem Wege transportieren. Während der

Zeit bis zum 35. Lebenstag verliert der passive Transport an Bedeutung und stagniert auf

niedrigem Niveau (PANSU 1983a, b).

6

Literaturübersicht 2.5.2 Transzellulärer Ca2+-Transport

Der transzelluläre Transport ist sättigbar und stellt einen aktiven Vorgang dar. Er erfolgt im

proximalen Dünndarm, vor allem in Duodenum (PANSU et al. 1981, FAVUS 1985) und ist

auch beim Saugferkel nachzuweisen (SCHRÖDER et al. 1993). Dabei wird Ca2+ durch einen

aus mindestens drei Einzelschritten bestehenden Mechanismus vom Darmlumen durch die

Enterozyten zur Blutseite transportiert (Abbildung 2). In dem ersten Teilschritt tritt Ca2+

durch die Bürstensaummembran in die Zelle ein, im zweiten Teilschritt wird Ca2+ durch das

Cytosol transportiert. Die Ausschleusung aus der Zelle durch die basolaterale Membran stellt

den dritten Teilschritt dar (KAUNE et al. 1992, SCHRÖDER et al. 1998a, VAN OS 1987,

TIMMERMANS et al. 1991).

?ECaC1

ECaC2

Lumen Enterozyt Blut

PMCA

Ca2+Ca2+

Calcitriol

VDR

?

?

Ca2+

CAL

+

+ -

Abbildung 2: Modell der aktiven Ca2+-Absorption im Dünndarm (CAL = Calbindin-D9k, PMCA =

Plasmamembran-Calciumpumpe, VDR = Vitamin D-Rezeptor).

7

Literaturübersicht Der Eintritt von Ca2+ in die Zelle erfolgt sowohl entlang eines chemischen Gradienten mit

einer Ca2+-Konzentration im Darmlumen im millimolaren Bereich (FULLMER 1992) und

einer Ca2+-Konzentration im Zellinneren, die um den Faktor 1000 bis 10000 niedriger ist

(Kap. 2.2), als auch entlang eines elektrischen Gradienten mit einer intra/extrazellulären

Potentialdifferenz von etwa 50 mV (FULLMER 1992). Aufgrund des elektrochemischen

Gradienten erfordert dieser Schritt keine Energie, doch kann Ca2+ aufgrund der Ladung nicht

in ausreichendem Maße ohne spezifische Transportsysteme wie z. B. Kanäle, durch die

Lipiddoppelschicht gelangen. Es gibt sichere Hinweise darauf, dass dieser Schritt für die

Ca2+-Aufnahme geschwindigkeitslimitierend ist (HOENDEROP et al. 1999b, 2000c).

Untersuchungen von KAUNE et al. (1992) haben gezeigt, dass sich die Ca2+-Aufnahmen in

Bürstensaummembranvesikel durch Verapamil, einem Antagonisten der

spannungsgesteuerten Ca2+-Kanäle vom L-Typ, die aus erregbaren Zellen bekannt sind,

hemmen ließen. Bei Ratten wurde der Effekt des Verapamils ebenfalls beschrieben (MILLER

u. BRONNER 1981), doch muss aufgrund der hohen eingesetzten Konzentration des

Kanalblockers auch ein unspezifischer Effekt auf das Epithel diskutiert werden. Beim

Kaninchen konnte ein Ca2+-Kanal (ECaC), der Verapamil-insensitiv ist, kloniert werden.

Dieser Kanal wurde im proximalen Dünndarm, in der Plazenta und in den distalen

Abschnitten des Nephrons nachgewiesen (HOENDEROP et al. 1999a, b). Bei der Ratte

wurde ein Ca2+-Transportprotein (CaT1) mit einer 75%igen Homologie zum ECaC aus dem

Dünndarm kloniert. Eine Northern-Blot Analyse zeigte seine Präsenz auf mRNA-Ebene im

Duodenum, proximalen Jejunum, Caecum und Colon (PENG et al. 1999).

Da bei der Ratte das Homologon zum ECaC (bezeichnet als ECaC1, ISHIBASHI et al. 2000

bzw. CaT2, PENG et al. 2000b), bei der Maus das Homologon zum CaT1 (bezeichnet als

CaT) (SUZUKI et al. 2000) und beim Menschen sowohl das Homologon zum ECaC

(MÜLLER et al. 2000b), als auch zum CaT1 (PENG et al. 2000a) kloniert wurden und beide

Proteine als Ca2+-selektive Ionenkanäle funktionieren (HOENDEROP et al 2001), werden im

folgenden die homologen Transportproteine zum ECaC als ECaC1 und die homologen

Transportproteine zum CaT1 als ECaC2 bezeichnet. Diese Transportproteine, ECaC1 und

ECaC2, werden den „TRP cation channels“ (transient receptor potential cation channels)

zugeordnet und sind Bestandteil der Unterfamilie TRPV. Der ECaC1 wird auch als TRPV5

und der ECaC2 als TRPV6 bezeichnet (MONTELL et al. 2002).

8

Literaturübersicht Der ECaC1 hat bei den verschiedenen Spezies eine primäre Aminosäurensequenz von 724

(Ratte) bis 730 (Mensch und Kaninchen) Aminosäuren bei einer mRNA-Größe von 2190

(Mensch) bis 4860 (Ratte) Basenpaaren (HOENDEROP et al. 1999a, MÜLLER et al. 2000b,

ISHIBASHI et al. 2000). Der ECaC2 hat bei den verschiedenen Spezies eine primäre

Aminosäurensequenz von 726 (Mensch) bis 730 (Maus) Aminosäuren bei einer mRNA-

Größe von 2850 (Maus) bis 2955 (Ratte) Basenpaaren (PENG et al. 1999, 2000b, SUZUKI et

al. 2000). Beide Transporter haben 6 transmembranale Domänen und eine Porenregion

zwischen den Membrandurchgängen 5 und 6 (Abbildung 3). In diesen Bereichen besteht die

höchste Homologie zwischen den verschiedenen ECaC. Sie unterscheiden sich aber in den für

die Regulation wichtigen Bereichen mutmaßlicher Glycosylierungsstellen und in den

„Ankyrin-Repeats“, die für die Verankerung am Cytoskelett in der apikalen Membran wichtig

sind. In besonderem Maße lassen sich Unterschiede im Bereich des N- und C-terminalen

Ende finden (HOENDEROP et al. 1999a, 2000a, b, PENG et al. 1999).

Lumen

Zytosol

1 2 3 4 5 6

P

C

N

AA

A

Abbildung 3: Modell des ECaC (Epithelial Calcium Channel) in der Zellmembran (1-6 = transmembranale

Domänen, A = Ankyrin-Repeats, C = C-terminales Ende, N = N-terminales Ende, P =

Porenregion; MÜLLER et al. 2000b, modifiziert).

Die Km-Werte als Maß für die Spezifität des Ca2+-Transports durch ECaC unterscheiden sich

deutlich sowohl bei den verschiedenen Transportproteinen als auch zwischen den Spezies.

Die bekannten Km-Werte für die einzelnen Transportproteine, die bisher alle über die Ca2+-

Aufnahmen in ECaC-exprimierende Oozyten von Xenopus laevis bestimmt wurden, variieren

9

Literaturübersicht beim ECaC1 von 0,2 mmol.l-1 (HOENDEROP et al. 1999a) bis 0,66 mmol.l-1 (PENG et al.

2000b) und beim ECaC2 von 0,25 mmol.l-1 (PENG et al. 2000a) bis 0,44 mmol.l-1 (PENG et

al. 1999). In Studien zur Ca2+-Aufnahme mit BSMV wurden Km-Werte für den Gesamt-Ca2+-

Transport ermittelt. Dabei hat KAUNE 1992 für das Schwein eine Km von 0,03 mmol.l-1

ermittelt. Diese liegt in der gleichen Größenordnung wie die Km-Werte für den Menschen

(GHISHAN et al. 1989), Ratten und Hamster (SCHEDL u. WILSON 1985, WILSON et al.

1989). MILLER u. BRONNER haben allerdings 1981 eine apparente Km für die Ratten von

0,27 mmol.l-1 beschrieben und für Hühner lag der Km-Wert bei 0,54 mmol.l-1 (LIANG et al.

1986).

Wie die einzelnen Transportproteine reguliert werden, ist noch weitgehend unklar. RT-PCR

Analysen mit unterschiedlichen Humangeweben haben erbracht, dass beide Kanaltypen in

Calbindin-D enthaltenden Geweben coexprimiert werden, wie z. B. im Dünndarm, Plazenta

und Pankreas (HOENDEROP et al. 2001). Dieser Befund könnte auf eine Regulation von

ECaC1 und/oder ECaC2 durch das Calcitriol/VDR-System hindeuten. Eine ausschließliche

Expression von ECaC1 wurde für die Niere, das Colon und das Gehirn festgestellt, während

sich im Magen nur ECaC2 nachweisen ließ. In der Promotorregion des ECaC1 wurde eine

Struktur ermittelt, die vier Vitamin D-abhängige Elemente sowohl nach CARLBERG 1995

als auch nach CHRISTAKOS et al. 1996 enthält (MÜLLER et al. 2000a). Der ECaC2 ist im

Darm insensitiv gegenüber Vitamin D (PENG et al. 1999, BARLEY et al. 2001), jedoch

reagiert die ECaC2-Expression in Caco-2-Zellen signifikant auf den Zusatz von Vitamin D3

(WOOD et al. 2001). Im Gegensatz dazu schließen WEBER et al. (2001) für beide

Transporter eine Beeinflussung durch Vitamin D aus und postulieren eine Regulation über

extrazelluläres Calcium. Andererseits weisen Studien an zwei verschiedenen VDR-Knockout-

Mäusemodellen auf eine Beeinflussung von ECaC1 und ECaC2 durch Calcitriol hin (VAN

CROMPHAUT et al. 2001), jedoch konnten WEBER et al. 2001 dies nicht durch Studien an

Mäusen mit einem mutierten und dadurch funktionsunfähigen VDR bestätigen.

Die Funktion von ECaC1 und ECaC2 wird durch die intrazelluläre Ca2+-Konzentration

insofern reguliert (HOENDEROP et al. 1999b, SUZUKI et al. 2000, NILIUS et al. 2001a), als

eine Reduktion der intrazellulären Ca2+-Konzentration den Ca2+-Einstrom in die Zelle fördert,

während ein Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration die ECaC-Aktivität inhibiert

(YUE et al. 2001). Extrazelluläres Ca2+ kann die Expression der Transportproteine

10

Literaturübersicht beeinflussen (WEBER et al. 2001) und in HEK293-Zellen führte extrazelluläres Ca2+ in

physiologischen Konzentrationen zu einer schnellen und reversiblen Abnahme der ECaC-

Aktivität (NILIUS et al. 2000, 2001b, VENNEKENS et al. 2000). Beide Transportproteine

lassen sich durch Rutheniumrot hemmen, wobei der ECaC1 eine 100fach höhere Sensitivität

für den Blocker als der ECaC2 hat (HOENDEROP et al. 2001). ECaC2 lässt sich bis zu 15 %

durch Verapamil hemmen (PENG et al. 1999). In exokrinen Geweben wurde ein Protein

beschrieben, dass eine sehr hohe Homologie zu den bekannten Sequenzen des ECaC1 bzw.

des ECaC2 hat. Es wurde daher als CaT-like bezeichnet und scheint aber ausschließlich eine

Bedeutung im Zusammenhang mit der Malignität von Prostataentartungen zu haben

(WISSENBACH et al. 2001, NIEMEYER et al. 2001). Dieses Protein kann durch Calmodulin

und Proteinkinase C reguliert werden, indem Calmodulin an das Protein bindet bzw. diese

Bindungsstelle durch die Proteinkinase C phosphoryliert wird (NIEMEYER et al. 2001).

Diese potentiellen Phosphorylierungsstellen wurden auch im ECaC1 bzw. ECaC2 identifiziert

(HOENDEROP et al. 1999a, PENG et al. 1999).

Beim 2. Schritt des transzellulären Ca2+-Transports, der Durchschleusung durch das Cytosol,

muss simultan die Second messenger-Funktion des freien Ca2+ erhalten bleiben. Es wird

angenommen, dass dies überwiegend dadurch erreicht wird, dass Ca2+ an Calbindin-D

gebunden wird (SCHRÖDER et al. 1996). In dieser Form kann Ca2+ etwa 70-mal schneller

durch die Zelle diffundieren als bei freier Diffusion (BRONNER et al. 1986). Die genauen

Vorgänge sind zur Zeit nicht geklärt.

Nach einem weiteren Modell werden Ca2+-Ionen in Vesikel verpackt oder an diese gebunden

durch das Cytosol transportiert. Dieser als Transcaltachia bezeichnete Effekt wurde als „Fast

Response“ auf Calcitriol beobachtet und wird wahrscheinlich unter Einbeziehung des

Cytoskeletts über spezifische Membranrezeptoren vermittelt. Die physiologische Bedeutung

dieses Vorganges ist allerdings noch umstritten (NEMERE et al. 1986, NEMERE u.

NORMAN 1988, 1990, NEMERE u. FARACH-CARSON 1998, NEMERE et al. 2000,

NORMAN et al. 1999, SCHWARTZ et al. 2002).

Die Ausschleusung des Ca2+ durch die basolaterale Membran als Finalschritt der Ca2+-

Absorption verläuft entgegen des elektrochemischen Gradienten und benötigt daher Energie.

11

Literaturübersicht Plasmamembranale Ca2+-Pumpen (PMCA) transportieren Ca2+ unter ATP-Verbrauch. Bei mit

Vitamin D behandelten Küken, die vorher Vitamin D freie Nahrung erhielten, konnte dieser

Mechanismus stimuliert werden (WASSERMAN et al. 1992a, b), während Untersuchungen

an duodenalen Enterozyten von Ratte und Schwein einen Vitamin D-Effekt nicht bestätigen

konnten (VAN CORVEN et al. 1987a,b, KAUNE et al. 1990). In den basolateralen

Membranen von Enterozyten wurde außerdem ein 3Na+/Ca2+-Austauscher nachgewiesen, der

jedoch in quantitativer Hinsicht von untergeordneter Relevanz zu sein scheint (VAN OS

1987, KAUNE et al. 1992).

2.6 Neonatale Entwicklung des Gastrointestinaltrakts

Während der postnatalen Entwicklung des Magen-Darm-Traktes zeigen sich zahlreiche

morphologische und funktionelle Veränderungen, die einerseits altersabhängig, andererseits

aber auch alimentär bedingt sein können. Diese Vorgänge können sich prinzipiell auch auf

den Ca2+-Transport auswirken.

Bis zum 3. Lebenstag nimmt die Masse des Dünndarms um 72 % zu, was in einer Zunahme

der Dünndarmlänge und Schleimhautmasse begründet ist (XU et al. 1992), ohne das

Verhältnis der Schleimhautoberfläche zum Körpergewicht wesentlich zu verändern

(BUDDINGTON et al. 2001). In den ersten Lebenstagen nehmen die einzelnen Zotten sowohl

in ihrer Länge als auch in ihrem Umfang zu, wobei die Zottenlänge ab der 2. bis 5. Woche

wieder abnimmt und in dieser Zeit die Krypten etwas tiefer werden, was auf eine vermehrte

Zellproliferation hinweist (XU et al. 1992, CERA et al. 1988). Durch die Reduktion der

Zottenlänge und die gleichzeitige stärkere Ausprägung der Krypten verringert sich das

Längenverhältnis von Zotte zu Krypte in den ersten drei Lebenswochen um den Faktor 3

(MOON 1971). Da die Zellen der Darmschleimhaut von den Stammzellen der Krypten

gebildet werden, erklärt dies die Altersabhängigkeit der Lebensdauer der Enterozyten. Die

mittlere Lebensdauer der Enterozyten beträgt bei neugeborenen Ferkeln etwa 7 bis 10 Tage

(MARTINSSON u. JÖNSSON 1976, MOON 1971) und bei 4 Wochen alten Ferkeln etwa 2

bis 4 Tage (MOON 1971, KOLDOVSKY et al. 1966). Im apikalen Bereich der Enterozyten

des gesamten Dünndarms zeigen sich beim Saugferkel bis zur 4. Lebenswoche

charakteristische Vakuolisierungen (MOON 1972), in denen größere Mengen an

12

Literaturübersicht Immunglobulinen nachgewiesen wurden (KÖMÜVES u. HEATH 1992). Während sich die

morphologischen Veränderungen im Dünndarm schnell entwickeln und in besonderem Maße

vom Alter des Tieres abhängig sind (CERA et al. 1988), entwickelt sich der Dickdarm

langsam und hängt vor allem von der Fütterung insbesondere der Umstellung der reinen

Milchfütterung in der Saugperiode auf die faserreiche Fütterung ab (MCCANCE 1974).

Dennoch beeinflusst die Fütterung auch die Morphologie des Dünndarm insofern, dass nach

dem Absetzen eine deutliche Abnahme der Zottenlänge und Zunahme der Kryptentiefe

einsetzt (HAMPSON 1986). Die Zottenform ändert sich von fingerförmig beim Saugferkel

nach zungen- oder blattförmig beim abgesetzten Tier (HALL u. BYRNE 1989) und kann

ebenfalls durch verschiedene Futterbestandteile bzw. Futterzubereitungen modifiziert werden

(DUNSFORD et al. 1989, MILLER et al. 1984, KELLY et al. 1990).

Die in der postnatalen Phase ablaufenden Veränderungen auf funktioneller Ebene

insbesondere auf die Anpassung der Transportvorgänge für die Hauptnährstoffe und

Mineralstoffe sind mindestens so komplex wie die morphologischen Veränderungen. Es soll

an dieser Stelle nicht näher darauf eingegangen werden, stattdessen wird auf die

umfangreichen Arbeiten zur postnatalen Entwicklung des Schweinedarms der Arbeitsgruppe

um R.K. Buddington hingewiesen (BUDDINGTON u. DIAMOND 1989, PUCHAL u.

BUDDINGTON 1992, BUDDINGTON 1994, BUDDINGTON u. MALO 1996, ZHANG et

al. 1997, 1998, BUDDINGTON et al. 2001).

13

Literaturübersicht 2.7 Besonderheiten des Ca2+-Transports bei Saugferkeln

Bei neugeborenen Ferkeln wurde im Gegensatz zu den Absetzferkeln, bei denen die

intestinale Ca2+-Absorption deutlich durch Calcitriol stimuliert wurde, gezeigt, dass die aktive

Ca2+-Absorption im vorderen Dünndarm in den ersten 2 bis 4 Lebenswochen nicht oder nur

partiell durch das Calcitriol/VDR-System kontrolliert wird (KAUNE et al. 1990,

SCHRÖDER et al. 1990, 1993). In den ersten 10 Lebenstagen ist nicht nur der vordere

Dünndarm, sondern auch das Ileum zur aktiven Ca2+-Resorpion befähigt (RADDE et al.

1980). Bei milchfrei ernährten Saugferkeln ist der aktive Ca2+-Transport signifikant

erniedrigt, was auf eine calcitrophische Wirkung bestimmter Milchinhaltsstoffe hinweist

(KLEIN 1999). Sowohl im Duodenum als auch im Jejunum wurde eine Abnahme der aktiven

Ca2+-Absorption bei 15 bis 35 Tage alten Ferkeln nach dem Absetzen im Vergleich zu 1 bis

14 Tage alten Saugferkeln nachgewiesen, jedoch war dieser Alterseffekt nicht signifikant

(RADDE et al. 1980).

Über den genauen Mechanismus der Ca2+-Absorption und die einzelnen Teilschritte beim

Saugferkel ist relativ wenig bekannt. Ferkel mit unphysiologisch niedrigem Plasma-

Calcitriolspiegel, wie z. B. bei Neugeborenen mit angeborenem Calcitriolmangel, können

Ca2+ in der gleichen Größenordnung resorbieren wie gesunde Tier mit physiologischen

Plasma-Calcitriolspiegel (LACHENMAIER-CURRLE u. HARMEYER 1988, SCHRÖDER

et al. 1998a). Ob die Durchschleusung von Ca2+ durch die Zelle bei Schweinen dieses Alters

weniger von calcitriol-induziertem Calbindin abhängig ist, oder ob noch andere Mechanismen

eine Rolle spielen ist nicht geklärt. Untersuchungen an Küken und jungen Ratten haben

Hinweise auf eine Beteiligung von Mikrotubuli und Actinfilamenten gegeben (NEMERE et

al. 1984, NASSAR et al. 1988), die möglicherweise auch beim Saugferkel eine Rolle spielen

(SCHRÖDER et al. 1998b).

14

Material und Methoden 3. MATERIAL UND METHODEN

3.1 Versuchstiere

Bei den verwendeten Schweinen handelte es sich um Kreuzungen der Rassen Deutsches

Edelschwein und Pietrain aus dem Lehr- und Forschungsgut Ruthe der Tierärztlichen

Hochschule Hannover. Dabei standen drei Altersgruppen zur Verfügung (Tabelle 1). Die

Saugferkel waren zwischen 5 und 6 Tage alt und wogen zwischen 2,1 und 2,8 kg. Bis zum

Zeitpunkt der Schlachtung wurden sie bei der Muttersau gehalten und ausschließlich mit

Muttermilch ernährt. Die Absetzferkel waren 60 Tage alt und wogen zwischen 8,1 und

11,7 kg. Sie wurden nach der dritten Woche abgesetzt und mit handelsüblichem Ferkel-Starter

Futter ernährt. Die Mastferkel waren zwischen 88 und 117 Tage alt und wogen zwischen 16,8

und 25,5 kg. Sie wurden mit handelsüblichem Anfangsmastfutter ernährt.

Tabelle 1: Lebendgewicht und Alter der Versuchstiere zum Zeitpunkt der Schlachtung.

( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere)

Gruppe n Alter [Tage] Gewicht [kg]

Saugferkel 5 5,2 ± 0,2 2,4 ± 0,1

Absetzferkel 5 60 ± 0 10,0 ± 0,6

Mastferkel 5 102,4 ± 4,7 19,2 ± 1,6

15

Material und Methoden 3.2 Probenentnahmen

Die Tiere wurden durch einen Bolzenschuss betäubt und anschließend durch Eröffnen der

Arteriae carotides communes, der Venae jugulares externae und internae entblutet. Danach

wurde die Bauchhöhle eröffnet und das gesamte Darmkonvolut entnommen.

3.2.1 Probenentnahme für die Präparation von Bürstensaummembran-

vesikeln

Für die Herstellung der Bürstensaummembranvesikel (BSMV) wurde das restliche

Duodenum, je nach Größe des Tieres, mit einer Länge von 15 bis 80 cm, caudal der

Entnahmestelle für die RNA-Präparation (Kap. 3.2.2) entnommen. Der Darmabschnitt wurde

mit eiskalter physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9 % w/v) gespült, am Mesenterial-

ansatz eröffnet und in etwa 10 cm lange Stücke geschnitten, die in flüssigem Stickstoff

tiefgefroren und bis zur Präparation der Vesikel bei mindestens –70 °C gelagert wurden. Das

Gewebe der Saugferkel wurde maximal drei Tage bis zur Präparation aufbewahrt. Das

Gewebe der übrigen Ferkel wurde nicht länger als 5 Wochen eingefroren.

3.2.2 Probenentnahme für die RNA-Präparation

Es wurden jeweils die ersten 10 cm des Duodenums, des Jejunums, des Ileums, des

proximalen Colons sowie des distalen Colons entnommen, am Mesenterialansatz

aufgeschnitten und in eiskalter physiologischer Kochsalzlösung partikelfrei gespült. Danach

wurde das Darmstück mit der serosalen Seite auf eine Glasplatte gelegt und mittels zweier

Objektträger wurde die Darmwand im Bereich der Tunica mucosa, bestehend aus Lamina

epithelialis mucosae und Lamina propria mucosae, von der Lamina muscularis mucosae, der

Tela submucosa, der Tunica muscularis und von der Lamina serosa (soweit noch vorhanden)

getrennt. Die Mucosa wurde in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren

Verwendung bei mindestens –70 °C gelagert. Die restlichen Darmschichten wurden

verworfen.

16

Material und Methoden 3.3 Präparation der Bürstensaummembranvesikel

3.3.1 Prinzip

Die verschiedenen Membranen der Zelle, die nach mechanischem und osmotischem

Aufbrechen der Zellen bzw. Abtrennen der schweren Organellen zurückbleiben, so dass sie in

unterschiedlichem Maße mit Magnesiumionen aggregieren. Dieser Umstand kann bei

geeigneter Zentrifugation dazu verwendet werden, verschiedene Membranfraktionen

voneinander zu trennen.

3.3.2 Durchführung

Die Präparation der BSMV erfolgte nach einer modifizierten Mg2+-EGTA-

Präzipitationsmethode mit Differentialzentrifugation (KAUNE el al. 1992, SCHRÖDER et al.

1998c). Abbildung 4 gibt die Präparationsschritte in einer Übersicht wieder.

Das Gewebe wurde 24 Stunden vor der Präparation bei –20 °C gelagert, um den

Auftauvorgang zu beschleunigen. Die gesamte Präparation erfolgte anschließend bei 0-4 °C

auf Eis. Zwischen 3,5 und 40 g Gewebe wurden mit der gleichen Menge an

Präparationspuffer I aufgetaut. Anschließend wurden die Enterozyten mit einem Vibro Mixer

(E1; Chemap AG, CH-8604 Volketswil) 10 min bei höchster Stufe von der Darmwand gelöst.

Die Flüssigkeit wurde durch ein herkömmliches Haushaltssieb gegeben und mit der 4fachen

Menge (bezogen auf das Volumen des Präparationspuffers I) H2O nachgespült. Dadurch

konnten die Enterozyten osmotisch aufgebrochen werden. Die Darmreste im Sieb wurden

verworfen und die Zellsuspension in einem Küchenmixer (Turboblender, Modell D70,

Moulinex) dreimal je 1 min auf der 4. Stufe homogenisiert. Bei dem Material der Saugferkeln

wurde der letzte Schritt durch eine zweimalige Homogenisierung mit dem Ultraturrax

(Heidolph DIAX 900, Stufe 5, Heidolph Instruments, D-91126 Schwabach) von je 30 s

ersetzt. Nach jedem Homogenisierungsschritt wurde der entstandene Schaum, nachdem er

sich 1 min abgesetzt hatte, mit einer Wasserstrahlpumpe abgesaugt. Nach Entnahme von bis

zu 1 ml Homogenat, zur Bestimmung des anfänglichen Proteingehaltes und der

17

Material und Methoden Ausgangsenzymaktivitäten, wurde dem restlichen Homogenat MgCl2 bis zu einer

Endkonzentration von 10 mmol.l-1 unter langsamem Rühren hinzugefügt und 15 min

inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Homogenat 15 min lang bei 3295 g und 4 °C

zentrifugiert (Zentrifuge RC5C, Sorvall Instruments, Du Pont Company, Wilmington Delware

19898, USA; Rotor GSA), das Pellet verworfen und der Überstand 33 min lang bei 16270 g

und 4 °C zentrifugiert. Bei den Saugferkeln wurde das Homogenat 15 min bei 2987 g und

4 °C (Rotor SS34) und der entstandene Überstand 30 min bei 26890 g zentrifugiert. Nach

dieser Zentrifugation wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit der dreifachen

Menge Präparationspuffer II, in Bezug auf die eingesetzte Gewebemenge, jedoch maximal

35 ml, in einem Elvehjem-Potter (Potter S 30; B. Braun, D-34212 Melsungen) mit

10 Schüben bei 1500 rpm homogenisiert. Diesem Homogenat wurde MgCl2 bis zu einer

Endkonzentration von 10 mmol.l-1 unter langsamem Rühren hinzugefügt und 15 min

inkubiert. Nach der Inkubation wurde das Homogenat 15 min bei 2987 g und 4 °C

zentrifugiert (Rotor SS34), das Pellet verworfen und der Überstand 30 min bei 26890 g und

4 °C zentrifugiert. Diesmal wurde der Überstand verworfen, das Pellet mit 30 ml

Vesikelpuffer in einem Elvehjem-Potter mit 10 Schüben bei 1500 rpm homogenisiert und das

Homogenat 40 min bei 26890 g und 4 °C zentrifugiert. Das entstandene Pellet wurde unter

Zugabe von 0,7 bis 3 ml Vesikelpuffer mit einer 1 ml-Spritze (Kanüle 0,45 x 0,23 mm)

homogenisiert. Es wurden bis zu 500 µl Vesikelsuspension zur Bestimmung der

Endproteinkonzentration und Enzymaktivitäten entnommen und bei –20 °C gelagert. Der Rest

der Vesikelsuspension wurde in flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur weiteren

Verwendung bei mindestens –70 °C gelagert. Die Vesikelsuspension der Saugferkel wurde

nicht eingefroren, sondern unmittelbar bei den Aufnahmestudien eingesetzt.

18

Material und Methoden 3.3.3 Präparationspuffer

Präparationspuffer I 300 mmol.l-1 D-Mannit

12 mmol.l-1 Tris, basisch

5 mmol.l-1 EGTA

HCl (1 mol.l-1) pH 7,4 bei 4 °C

Präparationspuffer II 60 mmol.l-1 D-Mannit

2,4 mmol.l-1 Tris, basisch

1 mmol.l-1 EGTA

HCl (1 mol.l-1) pH 7,4 bei 4 °C

Vesikelpuffer 100 mmol.l-1 D-Mannit

100 mmol.l-1 KCl

10 mmol.l-1 HEPES

Tris, basisch (1 mol.l-1) pH 7,4 bei 20 °C

19

Material und Methoden

Enterozyten gewinnen

Zellen mit hypoosmotischem Schock aufbrechen

Zellsuspension homogenisieren

Proben für Protein- und Enzymbestimmung

1. MgCl2-Fällung

Pellet verwerfen

1. Zentrifugation, 15 min bei 3295 g

Überstand


Pellet resuspendieren 2. MgCl2-Fällung


Überstand


Pellet resuspendieren 5. Zentrifugation, 40 min bei 26890 g

Pellet resuspendieren

Suspension in flüssigem Stickstoff tiefgefrieren

Abbildung 4: Schematische Darstellung der Mg2+-EGTA-Präzipitation zur

Bürstensaummembranen bei nicht mehr milchernährten Schweinen (g

Zeitangaben beziehen sich auf die gesamte Zentrifugationsdauer)

20

Neuen Überstand verwerfen

Neues Pellet verwerfen
Neuen Überstand verwerfen Überstand verwerfen
Proben für Protein- und Enzymbestimmung

Anreicherung von

bezieht sich auf r = rave,

Material und Methoden 3.4 Messung der Aufnahmeraten in die Bürstensaummembranvesikel

Die BSMV der Absetz- und der Mastferkel wurden bei RT aufgetaut. Die Aufnahmestudien

wurden bei RT durchgeführt. Vor dem Einsatz der Vesikelsuspension wurde diese nochmals

mittels 1 ml-Spritze (Kanüle 0,45 x 0,23 mm) homogenisiert. Je Messpunkt wurde der

Inkubationsansatz mit der Vesikelsuspension im Verhältnis 60 µl zu 20 µl versetzt und auf

einem Schüttler (Heidolph Reax 2000, Heidolph Instruments, D-91126 Schwabach)

durchmischt. Nach der Inkubation wurden bis zu 100 µl entnommen und die Ca2+-Aufnahme

durch Zugabe von 1 ml eiskalter Stopp-Lösung (Kap. 3.4.1) beendet. Anschließend wurden

die Vesikel durch Schnellfiltration (Cellulose-Nitrat-Filter, Porengröße 0,65 µm, Sartorius, D-

55555 Göttingen) von dem Reaktionsmedium getrennt, das Reaktionsgefäß mit 1 ml eiskalter

Stopp-Lösung gespült und der Filter nochmals zweimal mit je 5 ml eiskalter Stopp-Lösung

nachgespült. Die Filter wurden mit 4,3 ml Szintillationsflüssigkeit gemischt und die Aktivität

in einem Flüssigkeitsszintillationsmessgerät (Tri-Carb 2500; Canberra Packard GmbH, D-

63266 Dreieich) bestimmt. Die Zähldauer betrug stets 10 min. Der statistische Zählfehler

betrug 2-3 %. Alle Proben wurden in Doppelbestimmung gemessen.

3.4.1 Puffer für die Aufnahmestudien

Transportpuffer-NaCl 200 mmol.l-1 D-Mannit

(zweifach konzentriert) 200 mmol.l-1 NaCl

20 mmol.l-1 HEPES


Transportpuffer-KCl 200 mmol.l-1 D-Mannit

(zweifach konzentriert) 200 mmol.l-1 KCl

20 mmol.l-1 HEPES


21

Material und Methoden Stopp-Lösung 5 mmol.l-1 D-Mannit

150 mmol.l-1 NaCl/KCl

10 mmol.l-1 HEPES

Tris, basisch ( 1 mol.l-1) pH 7,4 bei 4 °C

CaCl2-Stammlösung 10 mmol.l-1

Valinomycin in Methanol 500 µmol.l-1

A23187 in DMSO 1 mg.ml-1

EGTA in H2O 10 mmol.l-1

Glucose in H2O 0,5 mmol.l-1

3.4.2 Kalkulation von [Ca2+]f

[Ca2+]f wurde mit Hilfe des Computerprogrammes Chelator ermittelt (SCHOENMAKERS et

al. 1992). Die Gesamt-Ca2+-Konzentrationen [Ca2+]ges in Bezug auf [Ca2+]f sind unter den

Bedingungen der Inkubationsansätze in Tabelle 2 wiedergegeben. Der Anteil an Ca2+-Ionen,

der durch die Applikation des Radiotracers 45Ca zusätzlich in den Inkubationsansatz verbracht

wurde, musste berücksichtigt werden und wurde deshalb über die spezifische Aktivität

(spez. A.) der Tracer-Stammlösung ermittelt:

X [mCi] . 1000 Ca-Konzentration [mmol.l-1]: . durch Zugabe von 45Ca 40,08 [g.mol-1] . spez. A. [mCi.mg-1] . Volumen [ml] Tabelle 2: Vergleich der Gesamt-Ca2+-Konzentrationen [Ca2+]ges mit den freien Ca2+-

Konzentrationen [Ca2+]f unter den Bedingungen im Inkubationsansatz mit 0,5 mmol.l-1 EGTA.

22

[Ca2+]ges [mmol.l-1] 0,5107 0,5278 0,5893 0,8998 1,2499 2,5 4,5

[Ca2+]f [mmol.l-1] 0,015 0,03 0,09 0,4 0,75 2,0 4,0

Material und Methoden 3.4.3 Studien zur zeitabhängigen Glucose-Aufnahme

Für die zeitabhängigen Messungen der Glucose-Aufnahmen wurde zum Zeitpunkt t = 0 min

570 µl Inkubationsansatz mit 190 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5,

1, 2, 3, 5 60 und 180 min wurden je 100 µl entnommen und wie in Kap. 3.4 beschrieben

weiter bearbeitet.

Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit von Na+-Ionen im extravesikulären

Kompartiment durchgeführt.

Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer (KCl bzw. NaCl), Glucose-Stammlösung und

radioaktiv markierter 3H-Glucose (~10 µCi bzw. 0,37 x 106 Bq) wurde der Inkubationsansatz

mit einem Gesamtvolumen von 1,5 ml hergestellt. Die Endkonzentration für Glucose betrug

10 µmol.l-1.

Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden 75 µl Inkubationsansatz direkt mit

Szintillationsflüssigkeit gemischt und gemessen.

Zur Bestimmung des Leerwertes wurden 75 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben

filtriert und gemessen.

Die Glucose-Aufnahmen in die BSMV als Funktion der Zeit werden in nmol Glucose je mg

Protein angegeben. Die Berechnung der Glucoseaufnahmen erfolgte analog zu der

Berechnung der Calciumaufnahmen (siehe Kap. 3.4.4).

3.4.4 Studien zur zeitabhängigen Calcium-Aufnahme

Für die zeitabhängigen Messungen der Ca2+-Aufnahmen wurde zum Zeitpunkt t = 0 min

570 µl Inkubationsansatz mit 190 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5,

1, 2, 6, 10 und 60 min wurden je 100 µl entnommen und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter

bearbeitet.

Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187

durchgeführt.

Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer-KCl, EGTA-Stammlösung, Valinomycin-

Stammlösung, A23187-Stammlösung bzw. DMSO, Ca2+-Stammlösung und radioaktivem

23

Material und Methoden 45Ca (~50 µCi bzw. 2,05 x 106 Bq) wurde der Inkubationsansatz mit einem Gesamtvolumen

von 1,5 ml hergestellt. Die Endkonzentrationen betrugen für EGTA 0,5 mmol.l-1, für

Valinomycin 5 µmol.l-1, für A23187 10 µg.ml-1 und für [Ca2+]f 0,03 mmol.l-1.

Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden 75 µl Inkubationsansatz direkt mit


Zur Bestimmung des Leerwertes wurden 75 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben


Die Ca2+-Aufnahme (CA) in die BSMV als Funktion der Zeit werden in nmol Ca2+ je mg

Protein angegeben und lassen sich nach folgender Formel berechnen:

(cpmP-cpmL) . [Ca2+]f CA = cpmT . Pr

mit

cpmP = gezählte Zerfälle pro Minute in der Probe [cpm],

cpmL = gezählte Zerfälle pro Minute im Leerwert [cpm],

[Ca2+]f = Konzentration an ionisiertem, freiem Ca2+ je Probe [µmol.l-1],

cpmT = Gesamtaktivität je Probe [cpm],

Pr = Proteinkonzentration im Inkubationsansatz [mg.l-1].

Die Ca2+-Aufnahmen in Abhängigkeit der Inkubationsdauer können durch eine exponentielle

Sättigungskurve der Gleichung y = a . (1-e-kt) annähernd beschrieben und damit die Parameter

a und k sowie der Standardfehler ermittelt werden. Dazu wurde das Programm „GraphPad

Prism“ (ISI, Philadelphia, USA; www.graphpad.com) benutzt.

24

Material und Methoden 3.4.5 Studien zur konzentrationsabhängigen Calcium-Aufnahme

Für die Messungen der Ca2+-Aufnahme als Funktion der [Ca2+]f wurde zum Zeitpunkt t = 0

min 60 µl Inkubationsansatz mit 20 µl Vesikelsuspension versetzt und durchmischt. Nach 0,5

min wurde die Reaktion gestoppt und wie in Kap. 3.4 beschrieben weiter bearbeitet.

Es wurden Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187

durchgeführt.

Aus zweifach konzentriertem Transportpuffer (KCl), EGTA-Stammlösung, A23187-

Stammlösung bzw. DMSO, Ca2+-Stammlösung und radioaktivem 45Ca (~40 µCi bzw.

1,48 x 106 Bq) wurden die Inkubationsansätze mit einem Gesamtvolumen von je 1,2 ml

hergestellt. Die Endkonzentrationen betrugen für EGTA 0,5 mmol.l-1, für A23187 10 µg.ml-1

und für [Ca2+]f 0,015; 0,03; 0,09; 0,4; 0,75; 2 und 4 mmol.l-1 (Tabelle 2). In Anwesenheit von

A23187 wurde ein Ansatz mit 0,03 mmol.l-1 an [Ca2+]f untersucht.

Zur Bestimmung der Gesamtaktivität je Probe wurden je 60 µl Inkubationsansatz direkt mit


Zur Bestimmung des Leerwertes wurden je 60 µl Inkubationsansatz analog zu den Proben


25

Material und Methoden 3.4.6 Kalkulation der kinetischen Kenngrößen der Ca2+-Aufnahme

Die Ca2+-Aufnahmeraten in Abhängigkeit von [Ca2+]f wurden mit Hilfe eines Algorithmus

des Programmpakets „GraphPad Prism“ (ISI, Philadelphia, USA) ermittelt. Dabei wurde

folgende Formel zu Grunde gelegt:

Vmax . [Ca2+]f Ca2+-Aufnahme = + U . [Ca2+]f Km + [Ca2+]f mit

Vmax = Maximum der sättigbaren Aufnahme [nmol.mg-1],

Km = Michaelis-Menten-Konstante [mmol.l-1],

[Ca2+]f = Konzentration des freien Calciums [mmol.l-1],

U = nicht sättigbarer Anteil der Ca2+-Aufnahme. Dies ermöglicht die Kalkulation von Vmax und Km im Sinne einer typischen Michaelis-

Menten-Kinetik.

26

Material und Methoden 3.4.7 Ermittlung des Vesikelvolumens

Aus der Glucoseaufnahme zum Equilibriumszeitpunkt nach 180 min Inkubation wurde das

Vesikelvolumen berechnet. Das Vesikelvolumen wird in µl.mg-1 Protein angegeben und

errechnet sich durch Anwendung folgender Formeln:

VA cpmp - cpmL VV = ; VA = . AV ; P = Pr . AV P cpmT mit

VV = Vesikelvolumen [µl.mg-1],

VA = Vesikelvolumen im Ansatz [µl],

cpmp = gezählte Zerfälle pro Minute in der Probe beim Ausgleichswert [cpm],

cpmL = gezählte Zerfälle pro Minute im Leerwert [cpm],

cpmT = gezählte Zerfälle pro Minute im Gesamtansatz je Probe [cpm],

P = Proteinmenge im Ansatz [mg],

Pr = Proteinkonzentration im Ansatz [mg.l-1],

AV = Ansatzvolumen [ml].

27

Material und Methoden 3.5 Protein- und Enzym-Bestimmungen im Mukosahomogenat und in der

Vesikelsuspension

3.5.1 Protein

3.5.1.1 Prinzip

Der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G 250 hat die Eigenschaft, sich im sauren Milieu an

Protein zu binden. Das ursprünglich rote Kation wird durch die Bindung als blaues Anion

stabilisiert, was zu einer Verschiebung des Absorptionsmaximums von 465 nm nach 595 nm

führt. Somit kann die Menge des gebildeten Farbstoffes bei 595 nm photometrisch bestimmt

werden. Die Menge des gebildeten Farbstoffes ist dabei proportional zur Proteinmenge. Vor

der Farbreaktion wird den Proben oberflächenaktives Saponin zugegeben, um möglichst alle

Proteinbindungsstellen zugänglich zu machen.

3.5.1.2 Durchführung

Die Proteinbestimmung erfolgte nach der von BRADFORD (1976) beschriebenen Methode.

Das Farbstoffkonzentrat wurde 1:5 mit H2O verdünnt. Fünfzig µl der Probe wurden mit 50 µl

1%igem Saponin versetzt und 20 min bei 20 °C inkubiert. Nach Zugabe von 2,5 ml

verdünntem Farbkonzentrat wurde die Probe erneut 20 min bei 20 °C inkubiert. In gleicher

Weise wurde mit einer Standardreihe aus bovinem γ-Globulin aus Plasma sowie H2O als

Leerwert verfahren. Danach wurden die Proben im Photometer (DU®-8 Spectrophotometer;

Beckman Instruments GmbH, D-80807 München) bei 595 nm gegen den Leerwert gemessen.

Schließlich wurden den Proben Proteinwerte auf der linearen Regressionsgeraden der

Standardreihe zugeordnet.

28

Material und Methoden 3.5.2 Aktivität der alkalische Phosphatase (AP)

3.5.2.1 Prinzip

Die AP hat die Eigenschaft p-Nitrophenylphosphat hydrolytisch in p-Nitrophenyl und

Phosphat zu spalten. Die entstandene Menge an gelbem p-Nitrophenyl ist proportional zur

Aktivität der AP und kann photometrisch bei 405 nm gemessen werden.

3.5.2.2 Durchführung

Die Bestimmung der Aktivität der AP erfolgte nach der von KAWADE (1964) beschriebenen

Methode. Je 50 µl Probe wurden mit 3 ml AP-Puffer (1,02 mol.l-1 Diethanolamin,

0,51 mmol.l-1 MgCl2, 10 mmol.l-1 Na-Nitrophenylphosphat, mit HCl auf pH 9,8 eingestellt)

versetzt und gemischt. Im Photometer (Kap. 3.5.1.2) wurde nach 1, 2 und 3 min die

Extinktion bei 405 nm gegen Luft gemessen. Zur Berechnung wurde die Differenz der

Extinktion pro Minute mit dem versuchsinternen Faktor 3300 bei 1 cm Schichtdicke

entsprechend dem Lambert-Beerschen Gesetz multipliziert. Daraus ergab sich die Einheit

U.l-1, die anschließend in U.g-1 Protein umgerechnet wurde.

3.5.3 Aktivität der Na+/K+-ATPase

3.5.3.1 Prinzip

Ouabain hat die Eigenschaft, spezifisch die Aktivität der Na+/K+-ATPase zu hemmen.

Üblicherweise wird durch die intakte ATPase-Aktivität anorganisches Phosphat frei gesetzt,

das in saurer Lösung mit Molybdat Phosphormolybdänsäure bildet, die zu Molybdänblau

reduziert werden kann. Die Extinktion dieses blauen Farbkomplexes wird bei 609 nm

photometrisch gemessen. Die Aktivität der Na+/K+-ATPase entspricht der Differenz der

ATPase-Aktivität mit und ohne Ouabainzusatz.

29

Material und Methoden 3.5.3.2 Durchführung

Die Bestimmung der Na+/K+-ATPase-Aktivität erfolgte nach der von FUJITA et al. (1971)

beschriebenen Methode. Von der Probe wurden 20 µl mit 0,5 ml Assaymix-Puffer ohne

Ouabain (5 mmol.l-1 MgCl2; 100 mmol.l-1 NaCl; 10 mmol.l-1 KCl; 100 mmol.l-1 Tris, basisch;

2 mmol.l-1 ATP; 3 mmol.l-1 EDTA; 32%ige HCl pH 7,4 bei 37°C) bzw. 0,5 ml Assaymix-

Puffer mit Ouabain (5 mmol.l-1 MgCl2; 100 mmol.l-1 NaCl; 10 mmol.l-1 KCl; 100 mmol.l-1

Tris, basisch; 2 mmol.l-1 ATP; 3 mmol.l-1 EDTA; 5 mg.ml-1 Ouabain, 32%ige HCl pH 7,4

bei 37°C) 30 min bei 37 °C inkubiert. Als Leerwert wurden 20 µl H2O als Probe eingesetzt.

Nach der Inkubation wurde die Reaktion mit 1,5 ml eiskaltem Farbreagenz (760 mmol.l-1

H2SO4; 730 mg.ml-1 Ammoniumheptamolybdat; 2,667 g.ml-1 FeSO4.7H2O; 16,7 mg.ml-1

Trichloressigsäure) gestoppt und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die

Extinktion in einem Photometer (Kap. 3.5.1.2) bei 690 nm gegen den Leerwert gemessen. Zur

Berechnung wurde die Extinktion der Probe mit Ouabain von der Extinktion der Probe ohne

Ouabain subtrahiert und die Differenz mit dem Faktor 862 bei 1 cm Schichtdicke gemäß einer

Standardreihe multipliziert. Daraus ergab sich die Einheit U.l-1, die anschließend in U.g-1

Protein umgerechnet wurde.

3.6 Gesamt-RNA-Isolierung und DNase-Verdau

Zur Gesamt-RNA-Isolierung wurde ein kommerziell erhältliches System (RNeasy Mini Kit

(50)) der Firma Quiagen (Quiagen GmbH, D-40724 Hilden) verwendet, das mit dem DNase-

Set (RNase-Free DNase Set (50)) derselben Firma kombiniert wurde

(www.quiagen.com/literature/malit.asp).

30

Material und Methoden 3.6.1 Prinzip

Die Zellmembranen des Gewebes werden mechanisch und chemisch desintegriert und damit

die RNA freigesetzt. Die freigesetzte RNA wird bei hohen Salzkonzentrationen reversibel an

eine Kieselgel-Membran gebunden. Diese Membran wird gewaschen, getrocknet und

anschließend wird die RNA mit H2O eluiert. Um eine Kontamination der RNA mit

genomischer DNA auszuschließen, wird die an die Kieselgel-Membran gebundene RNA vor

der Elution mit DNase behandelt.

3.6.2 Durchführung

Ein ca. 1 g schweres Stück Gewebe wurde mit Hilfe eines Mörsers und eines Pistills in

flüssigem Stickstoff zu einem Pulver verrieben. Von diesem Pulver wurden 30 mg in einem

vorgekühlten Polyethylen-Gefäß (Eppendorf-Gefäß) mit 600 µl RLT-Puffer, dem 1 %

Mercapto-Ethanol zugesetzt worden war, versetzt und mit einer 1-ml Spritze und einer 20 G-

Kanüle durch fünfmaliges Aufziehen homogenisiert. Das Homogenat wurde 3 min bei

13000 rpm und RT in einer Zentrifuge (Biofuge pico; Heraeus Instruments GmbH, D-63450

Hanau) zentrifugiert. Der separierte und klare Überstand wurde mit 600 µl Ethanol (70 % v/v)

versetzt und gemischt. Dieses Gemisch wurde in zwei Partien auf eine Kieselgel-Membran-

Säule gegeben und jeweils 15 s bei 10000 rpm und RT zentrifugiert. Die Säule wurde mit

350 µl RW1-Puffer gewaschen, indem der Puffer auf die Säule gegeben wurde und diese

anschließend 15 s bei 10000 rpm und RT zentrifugiert wurde. Daraufhin wurde die Säule

15 min bei RT mit 10 µl DNase und 70 µl RDD-Puffer inkubiert und noch einmal mit 350 µl

RW1-Puffer wie oben angegeben gewaschen. In analoger Weise wurde die Säule mit 500 µl

RPE-Puffer gewaschen. Anschließend wurde die Säule mit 500 µl RPE-Puffer gewaschen,

wobei die Säule 2 min bei 13000 rpm und RT zentrifugiert wurde, um diese zu trocknen. Zur

Eluierung der RNA wurden 50 µl H2O auf die Säule gegeben und 1 min bei 10000 rpm und

RT zentrifugiert. Die Gesamt-RNA wurde photometrisch quantifiziert (Eppendorf

Biophotometer; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, D-22331 Hamburg) und bis zur weiteren

Verwendung bei –20 °C gelagert.

31

Material und Methoden 3.7 cDNA-Synthese

3.7.1 Prinzip

Das Enzym Reverse Transkriptase vermittelt die Umsetzung einer RNA-Sequenz in eine

entsprechende cDNA. Es benötigt dazu geeignete Temperatur-Bedingungen und

Salzkonzentrationen sowie die einzelnen Bestandteile der DNA und unspezifische Primer.

3.7.2 Durchführung

In einem 0,5 ml fassenden Eppendorf-Gefäß wurde 1 µg in H2O gelöster Gesamt-RNA mit

1 µl Oligo-dT-Primer (500 µg.ml-1) und 1 µl dNTP-Mix (je 10 mmol.l-1) versetzt, auf 13 µl

mit H2O aufgefüllt, gemischt, 4 s in der Zentrifuge (Kap. 3.6.2) angeschleudert und 5 min bei

65 °C in einem Thermomixer (Thermomixer comfort, 1,5 ml; Eppendorf-Netheler-Hinz

GmbH, D-22331 Hamburg) inkubiert. Anschließend wurde dieses Gemisch 2 min in Eis

(0-4 °C) inkubiert. Nach der Inkubation wurde dem Gemisch 4 µl Puffer (250 mmol.l-1 Tris-

HCl, pH 8,3; 375 mmol.l-1 KCl; 15 mmol.l-1 MgCl2; 50 mmol.l-1 Dithiothreitol (DTT)) und

2 µl DTT (0,1 mol.l-1) hinzugefügt, angeschleudert und 2 min bei 42 °C im Thermocycler

(Mastercycler gradient; Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, D-22331 Hamburg) inkubiert.

Daraufhin wurde 1 µl Superscript II RNase H-RT (200 U.µl-1) zu dem Gemisch hinzugegeben,

wiederum angeschleudert und 50 min bei 42 °C im Thermocycler inkubiert. Hiernach erfolgte

eine Inkubation von 15 min bei 70 °C im Thermomixer. Bis zur weiteren Verwendung wurde

die cDNA bei –20 °C gelagert.

32

Material und Methoden 3.8 Polymerasekettenreaktion (PCR)

3.8.1 Prinzip

Die Polymerase bildet mit Hilfe von zielsequenzspezifischen Primern Kopien von DNA-

Einzelsträngen. Dieser Vorgang wird bis zu 40-mal wiederholt.

Jede PCR stellt eine mehrfache Abfolge von Zyklen dar, wobei jeder Zyklus aus drei Schritten

besteht. Bei dem ersten Schritt, der „Denaturierung“, werden durch Erhitzen auf eine

Temperatur von 95 °C die beiden Stränge der DNA bzw. cDNA (Kap. 3.7) voneinander

getrennt, indem die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären Basen

durch Hitze zerstört werden. Bei dem zweiten Schritt, dem „Annealing“, lagern sich zwei

Primer über Wasserstoffbrückenbindungen an die DNA-Einzelstränge. Primer sind kleine

synthetisch hergestellte Abschnitte von einzelsträngiger DNA mit einer Länge von 15 bis 35

Nukleotiden (Oligonukleotide). Sie werden so ausgewählt, dass sie komplementär zu den

Zielsträngen sind, wobei sie die zu vermehrende Region begrenzen und ein Primer der

Sequenz des einen DNA-Stranges entspricht (sense) und der andere der Sequenz des

komplementären Stranges (antisense). Die Primer werden im relativen Überschuß zur Menge

an Ziel-DNA zum Reaktionsansatz gegeben, so dass sich statistisch gesehen die beiden

komplementären Zielstränge der denaturierten Matrize häufiger mit den Primern als

untereinander verbinden. Die Annealing-Temperatur hängt von der Basenzusammensetzung

der Primer ab und liegt üblicherweise zwischen 50 °C und 60 °C. Sie sollte möglichst hoch

gewählt werden, um unspezifische Produkte zu vermeiden (RYCHLIK et al. 1990). Bei dem

dritten Schritt der PCR, der „Elongation“, synthetisiert eine DNA-Polymerase ausgehend von

dem Primer als Startpunkt matrizenabhängig den komplementären Strang der DNA. Die

optimale Arbeitstemperatur der für die PCR verwendeten, hitzestabilen Enzyme liegt bei 72

°C. Die Zeitdauer der einzelnen Schritte ist von der Länge des PCR-Produktes und den

verwendeten Reagenzien und Geräten abhängig und liegt zwischen 15 s und 2 min. Diese

Zyklen werden etwa 25 bis 40-mal wiederholt. Nach jedem Zyklus verdoppelt sich theoretisch

die Anzahl der amplifizierten Fragmente (1, 2, 4, 8, 32, 64, ... ) (NEDELMAN et al. 1992).

33

Material und Methoden Von BELL u. DEMARINI (1991) werden kurze Reaktionszeiten und möglichst wenige Zyklen

zur Vermeidung von unspezifischen Amplifikaten empfohlen.

Ein Reaktionsansatz für die PCR besteht aus der DNA, Puffer-Systemen (Salzen),

Magnesiumchlorid, Primern, Nukleotiden und der thermostabilen DNA-Polymerase

(REMICK et al. 1990). Die eingesetzten thermostabilen Polymerasen haben ihr

Aktivitätsmaximum bei einem pH-Wert oberhalb von 8,0. Zur Pufferung wird am häufigsten

ein Tris-Puffer mit einem pH-Wert von 8,5 bis 9,0 verwendet. Kaliumchlorid und

Ammoniumsulfat werden zur Steigerung der Ausbeute dem PCR-Ansatz zugesetzt.

Natriumchlorid kann die Amplifikation hemmen (MUELHARDT 2002). Magnesiumionen sind

der wichtigste Kofaktor der DNA-Polymerase und stimulieren ihre Aktivität. Außerdem bilden

sie zusammen mit den Nukleotiden einen löslichen Komplex, der für den Nukleotid-Einbau

entscheidend ist. Auch beeinflussen sie die Bindung der Primer und die Annealing-

Temperatur. Die Magnesiumchlorid-Konzentration ist somit für die Spezifität und Ausbeute

der PCR von wesentlicher Bedeutung. Sie variiert in einem Bereich zwischen 0,5 mmol.l-1 und

5 mmol.l-1. Je niedriger die Magnesiumchlorid-Konzentration ist, desto weniger unspezifische

Amplifikate treten auf (LYONS 1992). Entscheidend für den Erfolg der PCR sind die Primer.

Neben ihrer Länge ist auch die Basenzusammensetzung von Bedeutung. Der G/C-Gehalt

sollte bei ca. 50 % liegen. Des Weiteren sollten komplementäre Bereiche zwischen den

Primern, die zur Bildung von Primer-Dimeren führen können und auch signifikante

Sekundärstrukturen der Primer-Sequenzen vermieden werden. Die optimale

Primerkonzentration liegt zwischen 0,1 µmol.l-1 und 1 µmol.l-1. Die Nukleotide stellen die

Grundbausteine der neu zu bildenden DNA dar. Ihre optimale Konzentration hängt von der

Länge des zu amplifizierenden Produktes, der Primerkonzentration und der

Magnesiumchlorid-Konzentration ab. Die normalerweise verwendete Konzentration der

Nukleotide liegt bei etwa 100 µmol.l-l. Bei niedrigen Konzentrationen arbeitet die DNA-

Polymerase präziser (FINCKH et al. 1991). Eine Voraussetzung zur automatischen

Durchführung der PCR, ohne die nach jedem Denaturierungsschritt neue DNA-Polymerase

zum Reaktionsansatz hinzugegeben werden müsste, ist der Einsatz von thermostabilen

Polymerasen (SAIKI et al. 1988). Thermostabile Polymerasen ergänzen, ausgehend vom 3‘-

Ende der an die Ziel-DNA gebundenen Primer, die einzelsträngige Matrize durch Einbau der

vier Nukleotide im Sinne einer komplementären Basenpaarung zu einem Doppelstrang. Sie

34

Material und Methoden wurden ursprünglich aus thermostabilen Mikroorganismen isoliert (z. B. Thermus aquaticus:

Taq-Polymerase, CHIEN et al. 1976; Thermus thermophilus: Tth-Polymerase, MYERS u.

GELFAND 1991) und werden inzwischen gentechnisch hergestellt. Sie unterscheiden sich

bezüglich der Thermostabilität, der Aktivität und der 3‘-5‘-Exonuklease-Funktion, die einer

Korrekturaktivität entspricht und damit deutlich verringerte Fehlerraten ermöglicht (CLINE

et al. 1996, TINDALL u. KUNKEL 1988).

3.8.2 Durchführung

In den Reaktionsansatz wurden folgende Substanzen gegeben: 2 µl cDNA (Kap. 3.7), 5 µl

Puffer (0,1 mol.l-1 Tris HCl, pH 8,3; 0,5 mol.l-1 KCl; 1 mg.ml-1 Gelatine; 25 mmol.l-1 MgCl2),

0,5 µl Primer1 (10 pmol.l-1), 0,5 µl Primer2 (10 pmol.l-1), 0,5 µl dNTPs (10 mmol.l-1), 41 µl

H2O und 0,2 µl Taq-Polymerase (5 U.µl-1). Bei mehr als 4 Ansätze wurden die Substanzen

erst als Mix gemischt und dann auf die Reaktionsansätze verteilt.

Soweit nichts anderes beschrieben ist, lief folgendes Programm in dem Thermocycler

(Kap. 3.7.2, MOSSA et al. 1991) ab:

1. 94 °C 2 min lang,

2. 94 °C 30 s lang,



5. 39-mal Wiederholung der Schritte 2 bis 4,

6. 72 °C 15 min lang,

Die verwendeten Primer wurden aus bekannten Sequenzen anderer Spezies hergeleitet und

wurden über die GenBank (National Center for Biotechnology Information [NCBI], Bethesda,

MD, USA) ermittelt.

Für den konservierten ECaC-Bereich, also für den Bereich in dem sich ECaC1 und ECaC2

nur geringfügig unterscheiden, wurden folgende Primer gewählt:

5`>CAGATGTACAACCTGCTGCT<3`, s, ECaC1 (Kaninchen, AJ133128, Basen: 738ff),

5`>CACATGGTGAGCAGATGATG<3`, as, ECaC2 (Mensch, AF365927, Basen: 1233ff).

35

Material und Methoden Für den hypervariablen Bereich des ECaC1 und ECaC2 wurden folgende Primer gewählt:

ECaC1

5`>GAATCCGTATCGAGTACTT<3`, s, ECaC1 (Ratte, AB032019, Basen: 2061ff),

5`>GGAGAATTTCCCATCCACGG<3`, as, ECaC1 (Ratte, AB0322019, Basen: 2241ff),

ECaC2

5`>GGCCCTGCGAACTATGACGTGGATCTGCCCTT<3`, s, ECaC2 (Maus, AB037373,

Basen: 1826ff),

5`>TGGAAGGCCTGTGCGTAGCG<3`, as, ECaC2 (Mensch, AF365927, Basen: 2157ff).

3.9 Darstellung der DNA auf einem Agarosegel

3.9.1 Prinzip

Die DNA wird im Agarosegel durch Anlegen eines elektrischen Feldes größenfraktioniert und

anschließend mit Ethidiumbromid angefärbt. Ethidiumbromid bindet an DNA und kann im

ultravioletten Licht sichtbar gemacht werden (KEMP et al. 1989). Durch einen parallel

aufgetragenen Größenmarker (GM) lässt sich die Größe des DNA-Stückes bestimmen

(MULLIS u. FALOONA 1987).

3.9.2 Durchführung

500 mg Agarose wurden mit TAE-Puffer (Tris, basisch, 242,0 g.l-1; Eisessig 57,1 ml.l-1;

EDTA-Na.2 H2O 100 ml.l-1, pH 8,0) versetzt, in einer Mikrowelle zweimal bis zum Kochen

erhitzt und in einen Gelgießstand verbracht. Anschließend wurde ein Kamm in den

Gelgießstand gehängt, so dass im Gel Taschen von etwa 15 µl Fassungsvermögen entstanden.

Nachdem das Gel erstarrt war, wurde es in die Elektrophorese-Kammer (wide mini Sub® Cell

GT; Bio-Rad-Laboratories GmbH, D-80939 München) überführt und mit TAE-Puffer

bedeckt. Je 5 µl des PCR-Gemisches wurden mit 2 µl Loading-dye (DNA) gemischt und in

die Taschen des Agarosegels gegeben. Die DNA wurde bei 60 Volt (Spannungsgeber: Power

Pac 3000; Bio-Rad-Laboratories GmbH, D-80939 München) über 25 min größenfraktioniert,

36

Material und Methoden anschließend 10 min in einer Ethidiumbromidlösung geschwenkt und nochmals 10 min in

H2O geschwenkt. Schließlich wurde das Gel über einer ultravioletten Lampe (Biometra TI 1;

Biometra, D-37079 Göttingen) betrachtet und in dieser Form abgelichtet.

3.10 Isolierung der PCR-Produkte

3.10.1 Prinzip

Die Agarosegel-Struktur wird zerstört und die DNA in Lösung gebracht. DNA bindet bei

hohen Salzkonzentrationen reversibel an Glas und kann nach Separierung wieder mit H2O

abgelöst werden.

3.10.2 Durchführung

Es wurde der QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen GmbH, D-40724 Hilden) nach

Anleitung des Herstellers verwendet, wenn im Agarosegel nur ein PCR-Produkt nachweisbar

war (www.quiagen.com/literature/cleanlit.asp):

Zu 45 µl PCR-Mix wurden 225 µl PB-Puffer hinzugegeben und gemischt. Dieses Gemisch

wurde auf eine QIAquick-Säule gegeben und bei 10000 g und RT 1 min lang zentrifugiert

(Zentrifuge: Kap. 3.6.2). Dann wurden 0,75 ml PE-Puffer auf die Säule gegeben und zweimal

je 1 min bei 10000 g und RT zentrifugiert. Schließlich wurden 30 µl EB-Puffer auf die Säule

gegeben, 1 min bei RT inkubiert und bei 10000 g und RT 1 min zentrifugiert. Das Eluat

enthielt die DNA und wurde bis zum weiteren Gebrauch bei –20 °C gelagert. Zur Kontrolle

wurden 5 µl des Eluates auf ein Agarosegel aufgetragen (Kap. 3.9).

Waren zwei oder mehr PCR-Produkte im Agarosegel sichtbar, wurde der QIAEX II Agarose

Gel Extractions-Kit (Quiagen GmbH, D-40724 Hilden) verwendet (www.quiagen.com/

literature/cleanlit.asp):

Die DNA wurde im Agarosegel sichtbar gemacht, das gewünschte PCR-Produkt mit einem

sterilen Skalpell herausgeschnitten und gewogen. Zu 100 mg Gel wurden in einem

Eppendorf-Gefäß 300 µl QX1-Puffer hinzugefügt und mindestens 30 s geschüttelt. Dem

37

Material und Methoden Gemisch wurden 30 µl QIAEX II hinzugefügt, gemischt und bei 50 °C 10 min im Wasserbad

inkubiert, wobei die Suspension alle 2 min geschüttelt wurde. Es folgte ein

Zentrifugationsschritt bei 10000 g und RT für eine Dauer von 30 s. Der Überstand wurde

sorgfältig entfernt und das Pellet in 500 µl QX1-Puffer durch Schütteln resuspendiert.

Wiederum wurde 30 s bei 10000 g und RT zentrifugiert und der Überstand sorgfältig entfernt.

Diesmal wurde das Pellet in 500 µl PE-Puffer durch Schütteln resuspendiert, bei 10000 g und

RT 30 s lang zentrifugiert und der Überstand sorgfältig entfernt. Das Pellet wurde ein zweites

Mal in 500 µl PE-Puffer durch Schütteln resuspendiert, bei 10000 g und RT 30 s lang

zentrifugiert, der Überstand sorgfältig entfernt, und schließlich wurde das Pellet 10 min bei

RT getrocknet. Dem getrocknetem Pellet wurden 20 µl H2O hinzugefügt und geschüttelt.

Nach einer Inkubation von 5 min bei RT wurde bei 10000 g und RT 30 s lang zentrifugiert.

Der DNA-haltige Überstand wurde separiert und bis zum weiteren Gebrauch bei –20 °C

gelagert. Zur Kontrolle wurden 5 µl des Eluates auf ein Agarosegel aufgetragen (Kap. 3.9).

3.11 Ligation der PCR-Produkte

3.11.1 Prinzip

Die PCR-Produkte werden zur späteren Vermehrung in Bakterien zuerst durch eine Ligase in

einen spezifischen Vektor ligiert. Auf diesem Vektor befindet sich zur Selektion der Bakterien

eine Ampicillin-Resistenz.


Zu 5 µl PCR-Produkt wurden 1 µl Vektor (pGEMEX®-2 Vector; Promega GmbH, D-68199

Mannheim), 1 µl Ligase und 7 µl Ligations-Puffer (60 mmol.l-1 Tris-HCl, pH 7,8; 20 mmol.l-1

MgCl2; 20 mmol.l-1 DTT, 2 mmol.l-1 ATP) hinzugegeben, gemischt und 5½ Stunden bei RT

inkubiert.

38

Material und Methoden 3.12 Transformation der Bakterien

3.12.1 Prinzip Bei der Transformation werden z. B. Bakterien, sogenannte Kompetente Zellen, verwendet,

die die Eigenschaft haben, zugefügte Plasmide unter bestimmten Salzkonzentrationen und

Temperaturbedingungen aufzunehmen.


Zu dem Ligationsansatz (Kap. 3.11) wurden 100 µl CaCl2 (0,1 mol.l-1) hinzugefügt, gemischt

und auf Eis 10 min inkubiert. Danach wurden 10 µl Bakteriensuspension (Select 96™

Competent Cells) hinzugefügt, gemischt und 20 min auf Eis inkubiert. Es folgte ein

Hitzeschock bei 42 °C von exakt 90 s im Wasserbad mit anschließender Kühlung der

Suspension auf Eis über eine Dauer von 2 min. Nach Zugabe von 800 µl Luria-Bertani-

Medium (LB-Medium, WANG u. KOCH 1978) wurde die Suspension 35 min im Wasserbad

bei 37 °C inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde die Suspension bei 9000 g (Zentrifuge,

Kap. 3.6.2) und RT 1 min lang zentrifugiert und der Überstand bis auf etwa 100 µl reduziert.

Anschließend wurde das Pellet in dem Rest des Überstandes resuspendiert und dieses

Gemisch auf LB-Medium-Agarplatten mit Ampicillin (0,1 mg.ml-1) ausgestrichen und 12 bis

14 Stunden bei 37 °C im Brutschrank (BBD 6220; Heraeus Instruments, D-63450 Hanau)

inkubiert. Die gewachsenen Bakterienkolonien wurden bis zum weiteren Gebrauch auf den

Platten im Kühlschrank aufbewahrt. Einzelne Kolonien wurden je in 2,5 ml LB-Medium mit

Ampicillin (0,1 mg.ml-1) versetzt und 12-14 Stunden bei 37°C und 180 rpm im

Schüttelinkubator (Typ 3031; GFL, Gesellschaft für Labortechnik mbH, D-30938 Burgwedel)

inkubiert.

39

Material und Methoden 3.13 Plasmidpräparation

Bei der Plasmidpräparation fand ein kommerziell erhältliches System (GenElute™ Plasmid

Purification Kit Miniprep; Sigma-Aldrich Chemicals, D-82041 Deisenhofen) Anwendung

(www.sigmaaldrich.com).

3.13.1 Prinzip

Nach Lyse der Bakterien mit alkalischem SDS und anschließender Neutralisation werden die

Plasmide reversibel an eine glasbeschichtete Säule gebunden. Die Säule wird gewaschen und

danach werden die Plasmide wieder eluiert.


1,5 ml der Bakterienkultur (Kap. 3.12) wurden bei 12000 g und RT 1 min lang zentrifugiert

(Zentrifuge, Kap. 3.6.2) und der Überstand sorgfältig entfernt. Das Pellet wurde in 200 µl

Resuspensionspuffer mit der Pipette resuspendiert. Der Suspension wurden 200 µl

Lysispuffer zugefügt, vorsichtig geschwenkt und 10 min bei 12000 g und RT zentrifugiert.

Der Überstand wurde auf eine Säule gegeben und diese bei 12000 g und RT 1 min lang

zentrifugiert. Die Säule wurde mit 500 µl Optional-Wasch-Lösung versetzt und 1 min bei

12000 g und RT zentrifugiert. Anschließend wurden 750 µl Wasch-Lösung auf die Säule

gegeben und diese 1 min bei 12000 g und RT zentrifugiert. Um die Säule zu trocknen wurde

ein erneuter Zentrifugationsschritt bei 12000 g und RT für eine Dauer von 1 min angehängt.

Die DNA wurde nun mittels 50 µl Elutions-Puffer, der auf die Säule gegeben wurde welche

hiernach bei 12000 g und RT 1 min lang zentrifugiert wurde, eluiert.

40

Material und Methoden 3.14 Restriktionsverdau

3.14.1 Prinzip

In unmittelbarer Nähe der Ligationsstellen im Plasmid liegen spezifische Enzymschnittstellen.

Mit dem entsprechenden Enzym ist es möglich, das spezifische PCR-Produkt mit einem

geringen Überhang wieder aus dem Plasmid zu schneiden, auf ein Agarosegel aufzutragen

und die Größe mit dem erwarteten PCR-Produkt zu vergleichen.


Zu 2 µl Plasmidlösung wurden 15 µl H2O, 2 µl Puffer (10 mmol.l-1 MgCl2, 100 mmol.l-1

NaCl, 0,1 mg.ml-1 bovines Serum-Albumin, Tris/HCl pH 7,5 bei 37 °C) und 1 µl Enzym

(EcoRI) hinzugegeben, gemischt und bei 37 °C 1,5 Stunden im Wasserbad inkubiert.

Anschließend wurden 5 µl auf ein Agarosegel aufgetragen (Kap. 3.9).

3.15 Sequenzierung

Zur Sequenzierung wurden die Plasmide zum Sequenzierservice der „Faculty of Medical

Sciences“ der Universität Nijmwegen (Niederlande) gegeben. Um auszuschließen, dass eine

fehlerhafte Sequenz sequenziert wurde, die dadurch entsteht, dass die Polymerase einen

Einbaufehler hat (CLINE et al. 1996), wurden stets mehrere Plasmide sequenziert.

41

Material und Methoden 3.16 mRNA-Isolierung

3.16.1 Prinzip

Die Poly (A)+-Überhänge der mRNA binden bei hohen Salzkonzentrationen reversibel in einer

Säule an Oligo-dT-Zellulose (AVIV u. LEDER 1972). Diese wird gewaschen und

anschließend wird die mRNA aus dem Säulenmaterial eluiert. Bevor die Gesamt-RNA auf die

Säule gegeben wird, wird sie hitzedenaturiert.


Die Gesamt-RNA wurde auf Eis aufgetaut und mit 14000 rpm bei 4 °C 20 min lang

zentrifugiert (Megafuge 1.0R, Rotor-Nummer: 3041; Heraeus Instruments, D-63450 Hanau).

Das entstandene Pellet wurde zweimal mit je 500 µl Ethanol (70 % v/v) überschichtet,

gemischt, mit 14000 rpm bei 4 °C 3 min lang zentrifugiert und der Überstand anschließend

sorgfältig entfernt. Nach einer zweiminütigen Trocknung in der Vakuum-Zentrifuge (Speed

VacR Plus SC 110A; Savant Instruments Inc., Holbrook, NY, USA) wurde das Pellet in

800 µl H2O gelöst und nach einer fünfminütigen Inkubation bei 65 °C im Thermomixer

(Kap. 3.7), 3 min auf Eis inkubiert. Die Probe wurde mit 100 µl einer NaCl-Lösung

(5 mol.l-1), 100 µl einer Sodiumdodecylsulfat (SDS)-Lösung (1% w/v) und 10 µl einer

Tris/HCl-Lösung (1 mol.l-1) versetzt, gemischt und mit 13000 rpm bei RT 2 min lang

zentrifugiert (Kap. 3.6.2). Dieses Gemisch wurde auf eine Oligo-dT-Zellulose-Säule, die

zuvor 5-mal mit je 1 ml Loading-Puffer (10 mmol.l-1 Tris/HCl; 0,5 mol.l-1 NaCl; 0,1% SDS)

gespült worden war, zusammen mit 500 µl Loading-Puffer gegeben, aufgefangen und noch

insgesamt 4-mal über die Säule gegeben. Anschließend wurde die Säule 5-mal mit je 1 ml

Loading-Puffer und 5-mal mit je 1 ml Washing-Puffer (10 mmol.l-1 Tris/HCl; 0,1 mol.l-1

NaCl) gespült. Die mRNA wurde schließlich mit 2,5 ml Elution-Puffer (10 mmol.l-1 Tris/HCl)

wieder aus der Säule eluiert. Je 0,5 ml Eluat wurden mit 10 µl Glycogen (Typ IX, 2 mg.ml-1),

50 µl Natriumacetat (2 mol.l-1) und 500 µl Isopropanol versetzt, gemischt und in mindestens 8

Stunden bei –20 °C ausgefällt.

42

Material und Methoden 3.17 Northern-Blot

3.17.1 Prinzip

Die mRNA wird in einem denaturierendem Agarosegel der Größe nach elektrophoretisch

aufgetrennt. Durch Kapillarkräfte wird die RNA aus dem Gel auf eine Nitrozellulosemembran

transferiert. Die spezifische RNA wird mit Hilfe einer radioaktiv markierten DNA-Sonde, die

aus einem Stück komplementärer Basensequenz zur gesuchten RNA besteht, hybridisiert und

anschließend auf einem Film sichtbar gemacht (modifizierte Methode von SOUTHERN 1975).

3.17.2 Größenfraktionierung der RNA in einem denaturierenden

Agarosegel Zur Auftrennung der mRNA nach dem Molekulargewicht wurden intramolekulare

Basenpaarungen geschmolzen und die denaturierte RNA-Struktur durch Formaldehyd und

Formamid fixiert. Zuvor musste die mRNA (Kap. 3.16) in H2O gelöst werden. Dazu wurde

sie bei 13000 rpm (Zentrifuge, Kap. 3.16.2) und 4 °C 20 min lang zentrifugiert und der

Überstand sorgfältig entfernt. Das entstandene Pellet wurde mit 500 µl Ethanol (70 % v/v)

überschichtet und nach einer 3 min langen Zentrifugation bei 13000 rpm und 4 °C wurde der

Überstand sorgfältig entfernt. Dieser Schritt wurde einmal wiederholt. Um das Ethanol zu

entfernen, wurde die RNA in einer Vakuum-Zentrifuge (Kap. 3.16.2) in 2 min auf kleiner

Stufe getrocknet. Danach wurde die pelletierte RNA zum Lösen in 800 µl H2O je Probe

15 min auf Eis inkubiert. Die gelöste RNA wurde in einem Photometer (Kap. 3.6.2)

quantifiziert. Etwa 10 µg RNA wurden mit 10 µl Loading-Puffer (48 % Formamid, 17,5 %

Formaldehyd (37%ig), 35 % Loading dye (RNA); v/v) versetzt, gemischt und 3 min bei 95 °C

denaturiert. Anschließend wurde das Gemisch 3 min auf Eis inkubiert, um eine Renaturierung

zu verhindern. Vor dem Auftragen der Proben auf das Gel wurden diese in der Zentrifuge

angeschleudert.

43

Material und Methoden Zur Anfertigung des Gels wurden 1 g Agarose mit 85 ml H2O zweimal in der Mikrowelle

aufgekocht. Nachdem sich das Gel auf etwa 50 °C abgekühlt hatte, wurden diesem 10 ml

sterilfiltrierter 10x MOPS-Puffer (0,2 mol.l-1 MOPS; 0,05 mol.l-1 EDTA-Natriumsalz; pH 5,5

bei RT) und 5,4 ml Formaldehydlösung (37 % v/v) zugesetzt und das Gel in einem

Gelgießstand gegossen. Anschließend wurde ein Kamm in den Gelgießstand gehängt, so dass

im Gel Taschen von etwa 25 µl Fassungsvermögen entstanden. Nachdem das Gel erstarrt war,

wurde es in die Elektrophorese-Kammer (Kap. 3.9.2) überführt und mit 1x MOPS-Puffer (10x

MOPS-Puffer, 1 zu 10 verdünnt) bedeckt.

Neben den Proben wurde ein kommerziell erhältlicher RNA-Größenmarker mit auf das Gel

aufgetragen. Die RNA wurde bei 40 V (Spannungsgeber, Kap. 3.9.2) über 4 Stunden

größenfraktioniert. Anschließend wurde der Größenmarker abgeschnitten, 10 min in

Ethidiumbromidlösung und 15 min in H2O geschwenkt und über einer ultravioletten Lampe

(Kap. 3.9.2) betrachtet. Zur späteren Analyse wurde der Größenmarker zusammen mit der

mm-Einteilung eines Lineals abgelichtet.

3.17.3 Übertragen der RNA auf eine Nitrocellulosemembran

Das Agarosegel (Kap. 3.17.2) wurde 15 min in H2O und 15 min in 20x SSC-Puffer (3 mol.l-1

NaCl, 0,3 mol.l-1 Natriumcitrat; pH 7,0 bei RT) geschwenkt, um es von dem MOPS-Puffer zu

reinigen und bereits mit dem Transfer-Puffer vorzuinkubieren. Danach wurde der Anteil,

welcher die mRNA-Proben enthielt, aus dem Gesamtgel herausgeschnitten.

Eine Glaswanne wurde mit 20x SSC-Puffer gefüllt und mit einer Glasplatte abgedeckt, so

dass zwei gegenüberliegende Seiten der Wanne nicht durch sie bedeckt waren. Aus Whatman-

Papier (Biometra, D-37079 Göttingen) wurde eine, zuvor in den Puffer eingeweichte, Brücke

luftblasenfrei über die Glasplatte gelegt, wobei die Enden der Brücke in den 20x SSC-Puffer

tauchten. Das Gel wurde mit den Taschenöffnungen nach unten ebenfalls luftblasenfrei auf

die Whatman-Papierbrücke gelegt und die Ränder des Gels mit Parafilm (American National

CanTM, USA) abgedeckt, um zu verhindern, dass der Transfer-Puffer an dem Gel vorbei

gelangen konnte. Auf das Gel wurde eine Nitrocellulosemembran (Hybond N+; Amersham

Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), welche zuvor auf die exakte Größe des Gels

geschnitten worden und nach Anfeuchtung mit H2O 10 min in 20x SSC-Puffer inkubiert

44

Material und Methoden worden war, gelegt. Diese wurde wiederum mit 3 Lagen exakt geschnittenem Whatman-

Papier, das in 20x SSC-Puffer vorgeweicht worden war, abgedeckt. Auf das Whatman-Papier

wurde ein mindestens 8 cm hoher Turm aus Saugpapier (Handy Einzeltücher; Migros-

Genossenschaftsbund, CH-8031 Zürich) gelegt, der mit einem Gewicht von etwa 300 g

beschwert wurde. In 12 Stunden wurde die negativ geladene RNA durch Kapillarkräfte auf

die positiv geladene Nitrocellulosemembran transferiert und dort kovalent gebunden. Auf der

Membran wurde die Höhe der Taschen im Gel markiert, um den Startpunkt der

Elektrophorese auch auf der Membran nachvollziehen zu können. Daraufhin wurde sie

10 min in 2x SSC-Puffer inkubiert. Die im Anschluß luftgetrocknete Membran wurde

zwischen 2 Whatman-Papierstücke gelegt und unter Vakuum (Slab Gel Dryer SGD 2000;

Savant Instruments Inc., Holbrook, New York) 2 Stunden lang bei 80 °C getrocknet. Die

Nitrocellulosemembran wurde bis zum weiteren Gebrauch bei –20 °C gelagert.

Abbildung 5: Schematische Darstellung des Kapillar-Blot-Verfahrens

Nitrocellulosemembran

Whatman-Papierbrücke Glasplatte

3x Whatman-Papier Agarosegel

20x SSC

45

Material und Methoden 3.17.4 Erstellung von spezifischen, radioaktiv markierten Sonden

Die radioaktiv markierten Sonden wurden nach der „Random priming“-Methode

(FEINBERG u. VOGELSTEIN 1984) unter Verwendung des „Rediprime II“-Kits

(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden), eines kommerziell erhältlichen

Systems, hergestellt. Hierfür wurden 5 µl des PCR-Produktes der Primer, die auch für die

Real-Time-PCR (Kap. 3.18) verwendet wurden, mit TE-Puffer (10 mmol.l-1 Tris/HCl,

1 mmol.l-1 EDTA, pH 8,0) auf 40 µl aufgefüllt und 5 min bei 95 °C im Wasserbad denaturiert.

Um den denaturierten Zustand der DNA zu erhalten, wurde sie anschließend sofort 5 min lang

auf Eis inkubiert. Diese 40 µl wurden kurz angeschleudert (Zentrifuge, Kap. 3.6.2),

zusammen mit 50 µCi (2,05 x 106 Bq) α32P-dCTP in das „Rediprime“-Reaktionsgefäß

gegeben und mit TE-Puffer auf ein Gesamtvolumen von 50 µl aufgefüllt. In dem

Reaktionsgefäß befand sich das sogenannte Klenow-Fragment, das große Fragment der DNA-

Polymerase I aus Escherichia coli. Dieses Enzym synthetisiert, nach Anlagerung von

Random-Primern, unter gleichzeitigem Einbau von α32P-dCTP den komplementären DNA-

Strang. Dem Klenow-Fragment fehlt die 5` 3`-Exonukleaseaktivität. Dadurch ist es nicht in

der Lage, das 5`-Ende der an die Matrizen-DNA gebundenen Primer zu entfernen. Da

mehrere Primer an einen Strang binden, wodurch Teilsequenzen erstellt werden, entsteht ein

Gemisch aus unterschiedlich langen komplementären DNA-Stücken. Das Gemisch in dem

„Rediprime“-Reaktionsgefäß wurde durch 12-maliges auf- und abpipettieren gemischt und

1 Stunde bei 37 °C im Thermomixer (Kap. 3.7.2) inkubiert. Die Reaktion wurde mit 5 µl

EDTA-Lösung (0,2 mol.l-1) gestoppt. Zur Kontrolle der Einbaurate wurden 1 µl der Sonde mit

49 µl H2O versetzt. Fünf µl der verdünnten Sonde wurden mit 2,5 µl „Herring Sperm“ DNA

(10 mg.ml-1), 22,5 µl H2O und 1 ml eisgekühlter Trichloressigsäure (10 % w/v) versetzt und

10 min auf Eis inkubiert, um die DNA zu fällen. Diese Probe wurde auf einen Glasfaserfilter

(APFCO2500, Millipore, Irland) gegeben und zunächst 10-mal mit je 1 ml Trichloressigsäure

und anschließend 10-mal mit je 1 ml Ethanol (100%ig) gewaschen. Der Filter wurde

luftgetrocknet, in einem Glasszintillationsgefäß mit 12 ml Szintillationsflüssigkeit versetzt

und nach sorgfältigem Schütteln im Szintillationsmessgerät (Kap. 3.4) gemessen. Die

Zähldauer betrug stets 10 min. Der statistische Zählfehler betrug 2-3 %.

46

Material und Methoden 3.17.5 Hybridisierung der RNA mit den spezifischen, radioaktiv markierten

Sonden

Um alle unspezifischen Bindungsstellen der Nitrocellulosemembran (Kap. 3.17.3) zu

besetzen, wurde diese mit 200 µl „Herring Sperm“ DNA (10 mg.ml-1) im Prähybridisierungs-

puffer (5x Denhardt`s-Reagenz, 0,1 % w/v SDS, 5x SSC, 40 % v/v Formamid) versetzt und

7 Stunden bei 42 °C im Hybridisierofen (Rolleninkubator 4020; Gesellschaft für

Labortechnik mbH, D-30938 Burgwedel) prähybridisiert. Dazu wurde die „Herring Sperm“

DNA zuerst bei 95 °C 3 min lang denaturiert, dann 3 min auf Eis inkubiert und anschließend

zusammen mit 15 ml Prähybridisierungspuffer auf die Membran in die Prähybridisierröhren

gegeben. Die Membran wurde zuvor in der Waschlösung I (2x SSC, 0,1 % w/v SDS)

vorgeweicht und mit der RNA-behafteten Seite zum Lumen der Prähybridisierröhre zeigend,

luftblasenfrei an die Wand der Röhre angelegt.

Nach der Prähybridisierung wurden 5 ml Prähybridisierungspuffer mit „Herring Sperm“ DNA

aus der Röhre entfernt und eine spezifische, radioaktiv markierte Sonde (Kap. 3.17.4) in den

verbliebenen Puffer gegeben. Die Sonde wurde zuvor bei 95 °C 3 min lang denaturiert, 3 min

auf Eis inkubiert und anschließend kurz angeschleudert (Zentrifuge: Kap. 3.6.2). Die

Nitrocellulosemembran wurde 16 Stunden bei 42 °C hybridisiert.

Nach der Hybridisierung mussten eventuell unspezifisch gebundene Sondenanteile, nicht

gebundene Sondenanteile und freie radioaktive Nukleotide entfernt werden. Dies wurde durch

wiederholte Waschschritte mit abnehmender Salzkonzentration und zunehmender Temperatur

durchgeführt, wobei sich die Stringenz in jedem Waschvorgang erhöhte. Die Stringenz kann

auch über die Waschdauer beeinflusst werden. Durch eine höhere Spezifität können über

einen größeren Bereich mehr Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären

Basenpaaren ausgebildet werden, wodurch eine höhere Stringenz beim Waschvorgang

gewählt werden kann, was zu einer höheren Spezifität und geringerem Hintergrund des

resultierenden Signals führt (LOTTSPEICH und ZORBAS 1998).

Der erste Waschschritt wurde nach Abgießen der Sonde bei RT durchgeführt. Die Membran

wurde im Hybridisierofen 10 min lang mit je 15 ml Waschpuffer 1 gewaschen, wobei der

Puffer zweimal gewechselt wurde.

47

Material und Methoden Der zweite Waschschritt wurde bei 37 °C mit dem Waschpuffer 2 (0,5x SSC, 0,1 % w/v SDS)

im Hybridisierofen für eine Dauer von 10 min mit je 15 ml Puffer durchgeführt, wobei der

Puffer zweimal gewechselt wurde.

Der dritte Waschschritt erfolgte analog der ersten beiden Waschschritte, jedoch mit dem

Waschpuffer 3 (0,2x SSC, 0,1 % w/v SDS) bei 42 °C.

Nach diesen Waschschritten wurde die Membran zum Trocknen auf ein Whatman-Papier

(Kap. 3.17.3) gelegt und in eine „Saran Wrap“ Folie eingeschlagen.

3.17.6 Darstellung der RNA

Mit Hilfe eines Phosphor-Imagers (Personal molecular imager FX, Bio-Rad Laboratories

GmbH, D-80939 München) wurden die Banden auf der Nitrocellulosemembran (Kap. 3.17.5)

detektiert. Dafür wurde ein mit BaFBr:Eu-Kristallen beschichteter „Film“ (Imaging Screen K

20x25 cm; Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München) auf die Membran in einer

Photofilmkassette (Exposure Cassette-K, 20x25 cm; Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939

München) gelegt und 4 Stunden exponiert. In dieser Zeit strahlte die radioaktiv markierte

Sonde ionisierende Energie ab und überführte die BaFBr:Eu-Kristalle in einen stabilen,

angeregten Zustand (Eu Eu2+). Der Screen wurde anschließend in den Phosphor-Imager

verbracht, wo er von einem Laser mit einer Wellenlänge von 635 nm abgetastet wurde. Durch

das Abtasten wurden die Kristalle weiter angeregt und somit in einen instabilen Zustand

(Eu2+ Eu3+) überführt. Die Elektronen fallen in ihren Grundzustand zurück (Eu3+ Eu) und

geben dabei Energie in Form von Photonen ab, die im Phosphor-Imager gemessen wird

(MUELHARDT 2002).

3.17.7 Auswertung der Northern-Blots

Die Auswertung der Daten aus Kap. 3.17.6 erfolgte mit der Quantifizierungs-Software

„Quantity One“ für Windows (Bio-Rad-Laboratories GmbH, D-80939 München). Diese

Software stellt die Energie, die von den BaFBr:Eu-Kristallen freigesetzt wurde, graphisch dar.

So entstehen Banden auf den RNA-Spuren, die spezifisch für die gewählte Sonde

48

Material und Methoden (Kap. 3.17.4) sind. Jede dieser Banden wurde vermessen, wobei sowohl Fläche als auch die

Pixeldichte (Intensität) berücksichtigt wurden. Da diese Quantifizierung der RNA abhängig

von der aufgetragenen RNA-Menge ist, wurde ein interner Standard gewählt, um die Werte

zu relativieren und vergleichbar zu machen. Dies führt zu einer semiquantitativen

Bestimmung der spezifischen mRNA-Menge. Als interner Standard wurde das in jeder

Körperzelle vorkommende β-Aktin gewählt. Jeder Blot wurde mit einer spezifischen Sonde

für das β-Aktin hybridisiert und die RNA-Menge des β-Aktins ermittelt. Bei verschiedenen

Tieren kann so der Quotient aus der Menge an gesuchter RNA und der Menge an β-Aktin-

RNA verglichen werden.

3.18 Real-Time-PCR

3.18.1 Prinzip

Die sogenannte Real-Time-PCR funktioniert im Prinzip wie eine standardmäßige PCR

(Kap. 3.8), jedoch wird dem PCR-Ansatz ein Farbstoff zugegeben, der die Eigenschaft hat,

sich an Doppelstrang-DNA zu binden und der in diesem Zustand detektiert werden kann.

Eingeführt wurde diese Technik von HIGUCHI et al. 1993. Dabei wurde mit einer

Videokamera die in der PCR entstandene DNA mit Hilfe von Ethidiumbromid detektiert.

Diese Technik wurde weiterentwickelt, indem eine digitale Aufnahmetechnik eingeführt wurde

und ein fluoreszierender Farbstoff zur Verfügung stand, der sich durch eine erhöhte

Sensitivität auszeichnete (BECKER et al. 1996). Die modernste Version der Real-Time-PCR

erlaubt die Echtzeit-Messung der ansteigenden Fluoreszenz mit jedem Zyklus. Der Anstieg

der Fluoreszenz wird, um die Hintergrundfluoreszenz korrigiert, für jeden einzelnen Zyklus

dargestellt und lässt sich im linearen Abschnitt der aufsteigenden Kurve prinzipiell direkt mit

der Menge an vorliegender DNA korrelieren (WOO et al. 1998, MORRISON et al. 1998).

49

Material und Methoden 3.18.2 Durchführung

Bei der Durchführung der Real-Time-PCR wurde der BrilliantTM Quantitative PCR Core

Reagent Kit der Firma Stratagene (La Jolla, Ca 92037, USA) nach Anweisung des Herstellers

verwendet. Zum Nachweis der DNA diente der fluoreszierende Farbstoff SYBR® Green I

nucleic acid gel stain der Firma Molecular Probes (Molecular Probes Europe BV, Nl-2333

AA Leiden). Die Reaktion lief in einer Real-Time-PCR-Maschine (Mx4000TM Multiplex

Quantitative PCR System; Stratagene, La Jolla, Ca 92037, USA) ab.

Zunächst wurden die optimalen Reaktionsbedingungen für jedes einzelne PCR-Produkt

ermittelt. In jeden Reaktionsansatz wurden folgende Substanzen gegeben: cDNA (Kap. 3.7),

Puffer (10fach konzentriert), Primer1 (10 pmol.l-1), Primer2 (10 pmol.l-1), dNTPs

(20 mmol.l-1), H2O, SYBR® Green I (1/3000), ROX (1mmol.l-1) und Sure StartTM Taq DNA

polymerase (5 U.µl-1). Dabei wurden immer 1 µl dNTPs, 2,5 µl SYBR® Green I, 0,375 µl

ROX (1/200) und 0,25 µl Sure StartTM Taq DNA Polymerase eingesetzt. Der Reaktionsansatz

wurde mit H20 auf 25 µl aufgefüllt. Die Menge an eingesetztem MgCl2, Primern und cDNA

wurde über Konzentrationsreihen ermittelt, wobei sich für die verschiedenen zu

untersuchenden Sequenzen folgende Mengen als optimal erwiesen:

ECaC1: 1,5 µl MgCl2, 0,25 µl je Primer und 4 µl cDNA,

ECaC2: 2,0 µl MgCl2, 0,1 µl je Primer und 1 µl cDNA,

β-Aktin: 1,5 µl MgCl2, 1,5 µl je Primer und 0,1 µl cDNA.

Bei jedem Durchgang wurde ein Doppelansatz untersucht.

Die verwendeten Primer waren spezifische Primer für die bekannten bzw. ermittelten

Teilsequenzen der entsprechenden RNAs. Die Teilsequenz für das β-Aktin ist unter

AF054837 in der GenBank (National Center for Biotechnology Information [NCBI],

Bethesda, MD, USA) zu finden, die Teilsequenzen von ECaC1 und ECaC2 wurden wie in

Kap. 3.8 beschrieben ermittelt. Die Primer wurden so gewählt, dass bei den verschiedenen

Produkten Bereiche von 110 bis 139 Basenpaaren amplifiziert wurden. Ihre Spezifität wurde

durch das Programm BLAST der Genbank überprüft. Für das β-Aktin sind die Lokalisationen

der Primer in Abbildung 6 dargestellt. Diese wurden so gewählt, dass sie aus zwei

verschiedenen Exons stammen, um eine Kontamination der cDNA mit genomischer DNA

50

Material und Methoden auszuschließen. Diese Primer bilden mit der cDNA-Matrize ein kurzes Produkt und würden

mit genomischer DNA ein zweites, größeres Amplifikat erzeugen. Die Lokalisationen der

Primer für ECaC1 und ECaC2 sind in Kap. 4.4 und 4.5 dargestellt.

1 10 20 30 40 50 60 70 ATGTTTGAGACCTTCAACACGCCGGCCATGTACGTGGCCATCCAGGCTGTGCTGTCCCTGTACGCCTCTG 80 90 100 110 120 130 140 GCCGCACCACTGGCATTGTCATGGACTCTGGGGATGGGGTCACCCACACGGTGCCCATCTACGAGGGGTA 150 160 170 180 190 200 210 CGCCCTGCCCCACGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGCTGGCCGGGACCTGACCGACTACCTCATGAAGATC 220 230 240 250 260 270 280 CTCACGGAGCGGGGCTACAGCTTCACCACCACGGCCGAGCGGGAGATCGTGCGGGACATCAAGGAGAAGC 290 300 310 320 330 340 350 TCTGCTACGTCGCCCTGGACTTCGAGCAGGAGATGGCCACGGCCGCCTCCTCCTCCTCCCTGGAGAAGAG 360 370 380 390 400 410 420 CTACGAGCTGCCCGACGGGCAGGTCATCACCATCGGCAACGAGCGCTTCCGGTGTCCAGAGGCGCTCTTC 430 440 450 460 470 480 490 CAGCCCTCCTTCCTGGGCATGGAGTCCTGCGGCATCCACGAGACCACCTTCAACTCGATCATGAAGTGCG 500 510 520 530 540 550 560 ACGTGGACATCAGGAAGGACCTCTACGCCAACACGGTGCTGTCTGGCGGGACCACCATGTACCCCGGCAT 570 580 590 600 610 620 630 CGCCGACAGGATGCAGAAGGAGATCACGGCCCTGGCGCCCAGCACCATGAAGATCAAGATCATCGCCCCT

Abbildung 6: Sus scrofa, β-Aktin, Teilsequenz; die ausgewählten Primer sind mit grauem Hintergrund abgesetzt,

der schwarze Pfeil markiert den Übergang von zwei verschiedenen Exons.

In der Real-Time-PCR-Maschine lief folgendes Programm ab:

1. 95 °C 10 min lang,

2. 95 °C 15 s lang,


4. 39-mal Wiederholung der Schritte 2 und 3,

5. schrittweise Temperaturerhöhung zur Erstellung einer

Schmelzkurve.

Die Verwendung eines modifizierten Programms erzielte keine besseren Ergebnisse.

51

Material und Methoden 3.18.3 Auswertung der Real-Time-PCR

Bei der Auswertung der Real-Time-PCR wurde die Software des Mx4000TM Multiplex

Quantitative PCR System (Kap. 3.19.2) verwendet. Stellt man die Zunahme an Fluoreszenz

abzüglich der Hintergrundfluoreszenz (dRn) gegenüber der Zykluszahl graphisch dar und legt

eine Basislinie oberhalb der Hintergrundfluoreszenz, so ergibt sich ein gemeinsamer

Schnittpunkt im Bereich der linearen Zunahme. Es wurden immer die Mittelwerte des

Doppelansatzes betrachtet. Der Schnittpunkt kann durch die entsprechende Zyklusanzahl

charakterisiert werden (Ct-Wert). Um alle Versuchsproben zu vergleichen, wurden sie mit

dem internen Standard, β-Aktin, gleichgesetzt. Dies bedeutet, dass zur weiteren Auswertung

die Differenzen der Ct-Werte der Ziel-DNA und dem dazugehörigen β-Aktin betrachtet

wurden. Die so ermittelten Differenzen der Ct-Werte verschiedener Tiere wurden nun

miteinander verglichen: eine um 1 Ct-Wert größere Differenz des einen Tieres gegenüber

eines anderen lässt den Schluss zu, dass in der cDNA nur die Hälfte der Matrize der Ziel-

DNA vorhanden war. Dabei wurde vorausgesetzt, dass sich die Anzahl der amplifizierten

Fragmente nach jedem Zyklus verdoppelt (NEDELMANN et al. 1992), jedoch muss bei der

Interpretation der Ergebnisse kritisch betrachtet werden, dass die Effizienz eines jeden Zyklus

niedriger ist (WANG et al. 1989). MUEHLHARDT (2002) gibt die Effizienz mit 1,6 bis 1,7

pro Zyklus an, allerdings gibt es Untersuchungen unter Verwendung der Real-Time-PCR, die

eine Effizienz von annähernd 2 zeigten (PFAFFL 2001).

Setzt man die größte vorhandene Matrizenanzahl (Tier1) mit 100 % gleich, so ergibt sich für

die anderen Tiere:

M = . 100 %, 1 D2

mit

M = relative Anzahl der Matrizen [%],

D = Ct-Wert-Differenz Tier2 – Ct-Wert-Differenz Tier1.

52

Material und Methoden 3.19 Chemikalien

Soweit die Chemikalien nicht im Folgenden aufgeführt werden, wurden sie von Sigma-

Aldrich Chemie GmbH, D-89552 Steinheim bezogen und hatten mindestens den

Qualitätsstandard pro Analysis.

α32P-dCTP; Hartmann Analytic, D-38124 Braunschweig

Agarose; Qualex Gold™ Agarose, Hybaid GmbH, D-69123 Heidelberg

Bovines Plasma γ-Globulin; Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München 45Ca, Calcium 45 (NEZ-013); Perkin Elmer™, B-1930 Zaventem

DNA-Größenmarker 100 bp (0,5 mg.ml-1); MBI Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

dNTP-Mix (10 mmol.l-1); MBI Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

DTT (0,1 mol.l-1); Gibco™ Invitrogen GmbH, D-76131 Karlsruhe

EcoRI; MBI Fermentas GmbH, D-68789 St. Leon-Rot

Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G 250; Bio-Rad Laboratories GmbH, D-80939 München

„Herring Sperm“ DNA (10 mg.ml-1); Gibco™ Invitrogen GmbH, D-76131 Karlsruhe 3H-Glucose, Tritium-markierte Glucose (NET-238C); Perkin Elmer™, B-1930 Zaventem

Oligo-dT-Primer (500 µg.ml-1); Promega GmbH, D-68199 Mannheim

Primer; Carl Roth GmbH + Co, D-76185 Karlsruhe

Select 96™ Competent Cells; Promega GmbH, D-68199 Mannheim

Superscript II RNase H-RT (200 U.l-1); Gibco™ Invitrogen GmbH, D-76131 Karlsruhe

Szintillationsflüssigkeit, Lumasafe™ Plus; Canberra Packard GmbH, D-63266 Dreieich

Taq Polymerase; Gibco™ Invitrogen GmbH, D-76131 Karlsruhe

53

Material und Methoden 3.20 Statistik

Aus den Versuchsdaten wurden arithmetische Mittelwerte ( x ) und Standardfehler der

Mittelwerte (SEM) berechnet. Aus früheren Untersuchungen mit vergleichbaren Tiergruppen

und Messparametern war bekannt, dass die zu erhaltenen Werte bei den Aufnahmestudien

normalverteilt sind (SCHRÖDER et al. 1993, SCHRÖDER et al. 1998a). Die statistische

Prüfung der vorliegenden Werte erfolgte daher mit parametrischen Testverfahren („One way

ANOVA“). Ergaben sich daraus signifikante Unterschiede, erfolgte der Gruppenvergleich

über einen nachfolgenden Tukey-Test. Wurden nur zwei Gruppen miteinander verglichen, so

erfolgte dies über den Student´s t-Test.

Insgesamt wurden folgende statistische Verfahren angewandt:

-„One way ANOVA“ mit nachfolgendem Tukey-Test

-Student´s t-Test für verbundene oder unverbundene Stichproben.

Die statistischen Berechnungen wurden mit GraphPad Prism (GraphPad Software Inc.,

Philadelphia, USA) durchgeführt.

Für die Signifikanzangaben gilt:

n.s. = nicht signifikant,

p<0,05 = *, schwach signifikant,

p<0,01 = **, signifikant,

p<0,001 = ***, hoch signifikant.

Bei der Ermittlung der linearen Regressionsgeraden für die Proteinbestimmung und bei der

Berechnung der Aufnahmeraten in die BSMV wurde die Software „GraphPad Prism“

(Kap. 3.4.9) genutzt.

Die Auswertung der Northern Blots erfolgte mit der Software „Quantity One“ für Windows

(Kap. 3.17.7).

Die Auswertung der Real-Time-PCR erfolgte mit der Software des Mx4000™ Multiplex

Quantitative PCR Systems (Kap. 3.18.3).

54

Ergebnisse 4 ERGEBNISSE

4.1 Effekte des Alters der Versuchstiere auf die Ca2+-Aufnahme in BSMV

4.1.1 Charakterisierung der BSMV

Zur Abschätzung der Anreicherungen der BSMV wurden charakteristische

Membranleitenzyme für das Ausgangshomogenat und die Vesikelsuspension untersucht. Als

spezifische Markerenzyme wurden für die Bürstensaummembranen die Aktivität der

alkalischen Phosphatase und für die basolateralen Membranen die Aktivität der Na+/K+-

ATPase bestimmt.

Tabelle 3: Spezifische Aktivität der alkalischen Phosphatase als Leitenzym für die

Bürstensaummembranen und der Na+/K+-ATPase als Leitenzym der basolateralen

Membranen im Homogenat und der Vesikelsuspension und deren Anreicherungen

in den verschiedenen Altersgruppen. Der Anreicherungsfaktor ergab sich aus dem

Vergleich der entsprechenden Aktivitäten im Homogenat und der

Vesikelsuspension. ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere).

Aktivität der alkalischen Phosphatase Aktivität der Na+/K+-ATPase

Gruppe Homogenat U.g-1 Protein

Vesikel-suspension

U.g-1 Protein

Anreicher-ungsfaktor

Homogenat U.g-1 Protein

Vesikel-suspension

U.g-1 Protein

Anreicher-ungsfaktor

Saugferkel (n = 5)

197 ± 10

1971 ± 152

10,1 ± 0,8

33,6 ± 3,8

73,0 ± 13,0

2,3 ± 0,5

Absetzferkel (n = 5)

174 ± 14

2476 ± 359

15,1 ± 1,3

34,7 ± 3,7

107,7 ± 23,8

3,3 ± 0,8

Mastferkel (n = 5)

165 ± 18

2155 ± 347

12,5 ± 0,9

36,8 ± 4,1

116,4 ± 14,5

3,2 ± 0,3

55

Ergebnisse Weder für die Anreicherungen der AP noch für die der Na+/K+-ATPase zeigte sich ein

nennenswerter Alterseffekt.

Der Anteil der Bürstensaummembranen war gegenüber dem Anteil der basolateralen

Membranen um das 4-6fache erhöht (Tabelle 4). Die Proteinausbeuten lagen zwischen 2 und

3 %.

Tabelle 4: Relative Anreicherungen der Membranen als Quotient der verschiedenen

Anreicherungsfaktoren der Bürstensaummembranen und der basolateralen

Membranen und die Proteinausbeuten ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere).

Gruppe relative Anreicherung Proteinausbeute [%] Saugferkel

(n = 5) 5,51 ± 1,6 2,62 ± 0,4

Absetzferkel (n = 5) 6,21 ± 2,0 2,08 ± 0,1

Mastferkel (n = 5) 4,08 ± 0,5 2,37 ± 0,1

Zur Überprüfung der Vesikel auf ihre Funktionstüchtigkeit und Dichtigkeit wurden die

Glucoseaufnahmen in An- und Abwesenheit eines einwärtsgerichteten Na+-Gradienten

ermittelt. Es zeigt sich in Anwesenheit des Gradienten ein deutliches Overshoot-Phänomen,

welches nur mit intakten Vesikeln darzustellen ist. In der Abbildungen 7 und 8 ist dies

exemplarisch für ein Saug- bzw. ein Absetzferkel dargestellt. Die Glucoseaufnahme erreichte

mit Na+-Gradienten nach 3 bis 5 min ein Maximum und fiel dann wieder ab. Nach mindestens

180 min war der so genannte Ausgleichswert ([Glucose]intravesikulär = [Glucose]extravesikulär)

erreicht, der zur Vesikelvolumenbestimmung verwendet wurde. Das Maximum der Aufnahme

lag bei allen Saugferkeln bei 25 nmol.mg-1 Protein und bei den Absetzferkeln bei

30 nmol.mg-1 Protein. Das errechneten Vesikelvolumen beträgt bei den Saugferkeln

0,92 ± 0,06 µl.mg-1 Protein, bei den Absetzferkeln 0,83 ± 0,04 µl.mg-1 Protein und bei den

Mastferkeln 1,15 ± 0,11 µl.mg-1 Protein ( x ± SEM, n = 5), ohne dass sich ein statistisch

gesicherter Unterschied ergab.

56

Ergebnisse

0.1 1 10 100 10000

10

20

30mit Na+-Gradientenohne Na+-Gradienten

Zeit [min]

Glu

cose

-Auf

nahm

erat

e[n

mol

. mg-1

Pro

tein

]

Abbildung 7: Zeitlicher Verlauf der Glucose-Aufnahme in duodenale BSMV eines Saugferkels bei RT und einer

Glucose-Konzentration von 10 µmol.l-1 in An- und Abwesenheit eines einwärtsgerichteten Na+-

Gradienten. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer Doppelbestimmung dar.

57

Ergebnisse

0.1 1 10 100 10000

10

20

30

40mit Na+-Gradientohne Na+-Gradient

Zeit [min]

Glu

cose

-Auf

nahm

erat

e[n

mol

. mg-1

Pro

tein

]

Abbildung 8: Zeitlicher Verlauf der Glucose-Aufnahme in duodenale BSMV eines Absetzferkels bei RT und

einer Glucose-Konzentration von 10 µmol.l-1 in An- und Abwesenheit eines einwärtsgerichteten

Na+-Gradienten. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer Doppelbestimmung dar.

Bei den übrigen Tieren wurden die Glucoseaufnahmen bei 3, 5 und 120 min untersucht. Dies

reichte in der Regel, um einen Overshoot nachzuweisen. War die Glucose-Aufnahme mit

Na+-Gradienten bei 3 oder 5 min größer als das 5fache der Glucose-Aufnahme ohne Na+-

Gradienten und näherten sich beide nach 120 min einem Equilibrierungswert an, galten die

BSMV als intakt. Zur weiteren Überprüfung der Vesikelfunktion wurden Ca2+-

Aufnahmestudien in An- und Abwesenheit des Calcium-Ionophors A23187 durchgeführt.

Ohne Ionophor wurde Ca2+ relativ langsam in die BSMV transportiert, während die Vesikel,

die mit dem Ionophor inkubiert wurden, Ca2+ innerhalb weniger Sekunden bis zu einem

Maximum aufnehmen. In Abbildung 9 sind die zeitabhängigen Ca2+-Aufnahmen in duodenale

BSMV eines Mastferkels exemplarisch dargestellt. Bei den anderen Schweinen wurde zur

Überprüfung der Vesikelintegrität nur der 30 Sekunden-Wert in An- und Abwesenheit von

A23187 kontrolliert, indem der Quotient aus der Ca2+-Aufnahme mit Ionophor und der Ca2+-

Aufnahme ohne Ionophor betrachtet wurde. Die Vesikel galten als intakt, wenn der Quotient

mindestens größer als 2 war (Abbildung 10).

58

Ergebnisse

0 10 20 30 40 50 60 700.0

0.1

0.2

0.3

0.4ohne A23187mit A23187

Zeit [min]

Ca-

Auf

nahm

erat

e[p

mol

. mg-1

Pro

tein

]

Abbildung 9: Zeitabhängige Ca2+-Aufnahmen in duodenale BSMV eines Mastferkels mit und ohne Zusatz des Calcium-Ionophors A23187 bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von 0,03 mmo.l-1. Jeder Punkt stellt den Mittelwert einer Doppelbestimmung dar.

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

Altersgruppen

A23

187-

Quo

tient

SaugferkelAbsetzferkelMastferkel

n = 5 n = 5 n = 5

Abbildung 10: Darstellung der A23187-Quotienten (Quotient der Ca2+-Aufnahme mit und ohne Zusatz des

Calcium-Ionophors A23187 nach 30 s bei RT und einer freien Ca2+-Konzentration von

0,03 mmol.l-1) bei den verschiedenen Altersgruppen ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere).

59

Ergebnisse 4.1.2 Ca2+-Aufnahmeraten in die BSMV

Die Gesamt-Ca2+-Aufnahmeraten in duodenale BSMV der verschiedenen Altersgruppen sind

in Abbildung 11 dargestellt. Dabei waren die Ca2+-Aufnahmeraten in BSMV der Saugferkel

jeweils höher als die in BSMV der Absetz- und Mastferkel, die sich ihrerseits nicht

wesentlich unterschieden. Die Gesamt-Aufnahmerate setzt sich aus einem unspezifischen,

nicht sättigbarem Anteil und einem sättigbarem Anteil zusammen, dessen Kurvenverlauf

einer typischen Michaelis-Menten-Kinetik entspricht und aus dem sich die Parameter Km und

Vmax bestimmen lassen. Die Michaelis-Menten-Konstante (Km), die die Menge an Substrat

angibt, die für die halbmaximale Transportrate notwendig ist, ist ein Maß für die Ca2+-

Affinität des Transportsystems und die maximale Transportrate (Vmax) gibt einen Hinweis auf

die Transportkapazität bzw. Anzahl der Transporter. Berechnet man die Parameter Km, Vmax

und den unspezifischen Anteil mit den Mittelwerten der gemessenen Aufnahmen für die

jeweiligen Tiergruppen, so ergeben sich für die Saugferkel eine Vmax von

3,39 nmol.mg-1 Protein.30s-1, eine apparente Km von 1,41 mmol.l-1 bei einem

Bestimmtheitsmaß (r2) von 0,89 , für die Absetzferkel eine Vmax von

2,04 nmol.mg-1 Protein.30s-1, eine apparente Km von 1,19 mmol.l-1 bei einem r2 von 0,97 und

für die Mastferkel eine Vmax von 2,08 nmol.mg-1 Protein.30s-1 und eine apparente Km von

1,11 mmol.l-1 bei einem r2 von 0,98.

60

Ergebnisse

0 1 2 3 4 50

1

2

3

4

5Saugferkel (n = 5)Absetzferkel (n = 5)Mastferkel (n = 5)

freie Ca2+-Konzentration [mmol .l-1]

Ca2+

-Auf

nahm

erat

e[n

mol

. mg-1

Pro

tein

. 30 s

-1]

Abbildung 11: Darstellung der Gesamt-Ca2+-Aufnahmeraten in duodenale BSMV der verschiedenen

Altersgruppen in Abhängigkeit der Ca2+-Konzentration ( ± SEM, n = Anzahl der Tiere). x

Zur Bestimmung der spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten wird von der Gesamt-Aufnahmerate

die linear verlaufende transporterunabhängige Aufnahmerate subtrahiert. Abbildung 12 zeigt

dies exemplarisch für ein Absetzferkel.

61

Ergebnisse

0 1 2 3 4 50.0

0.5

1.0

1.5

2.0Gesamt-Aufnahmeunspezifische Aufnahmespezifische Aufnahme

freie Ca2+-Konzentration [mmol .l-1]

Ca2+

-Auf

nahm

erat

e[n

mol

. mg-1

Pro

tein

. 30 s

-1]

Abbildung 12: Darstellung der Ca2+-Gesamt-Aufnahmeraten in duodenale BSMV eines Absetzferkels bei RT

mit den dazugehörigen unspezifischen Aufnahmeraten und den jeweils resultierenden

spezifischen Ca2+-Aufnahmeraten. Bei diesem Tier ergab sich für die Vmax

1,68 nmol.mg-1 Protein.30 s-1 und für die apparente Km 1,14 mmol.l-1 (r2 = 1).

Die Vmax- und Km-Werte sind für die Einzeltiere und als Gruppen-Mittelwerte (± SEM) in

Tabelle 5 aufgeführt (Graphische Darstellungen siehe Abbildungen 13 und 14).

Die Vmax-Werte waren in der Saugferkelgruppe signifikant mit p < 0,01 im Vergleich zu den

Absetzferkeln und p < 0,05 im Vergleich zu den Mastferkeln erhöht.

Die apparenten Km-Werte waren in der Saugferkelgruppe mit p < 0,05 signifikant gegenüber

den anderen beiden Gruppen erhöht.

62

Ergebnisse Tabelle 5: Vmax- und Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in duodenale BSMV der Einzeltiere und

entsprechende Gruppen-Mittelwerte ( x ± SEM, r2 war bei allen Berechnungen

> 0,98).

Vmax [nmol.mg-1 Protein.30s-1]

apparente Km [mmol.l-1]

Einzelwerte x SEM Einzelwerte x SEM 4,90 1,50 3,32 1,50 4,50 1,56 2,91 1,43

Saugferkel

2,57

3,64 0,45

1,22

1,44 0,06

1,45 1,29 1,57 0,99 2,48 1,10 1,68 1,14

Absetzferkel

2,27

1,89 0,20

1,18

1,14 0,05

2,57 1,44 2,21 1,13 1,38 0,93 2,34 1,12

Mastferkel

2,13

2,13 0,20

1,04

1,13 0,09

63

Ergebnisse

0,00,5

1,01,5

2,02,5

3,03,5

4,04,5

Altersgruppen

Vm

ax

[nm

ol . m

g-1Pr

otei

n . 30s-1

]

Saugferkel (n = 5)Absetzferkel (n = 5)Mastferkel (n = 5)

p < 0,01p < 0,05

Abbildung 13: Maximale Transportkapazitäten der Ca2+-Aufnahmen in duodenale BSMV der verschiedenen

Altersgruppen ( ± SEM, n = Anzahl der Tiere). x

0,000,250,500,751,001,251,501,75

Altersgruppen

Km

[mm

ol . l-1

]

Saugferkel (n = 5)Absetzferkel (n = 5)Mastferkel (n = 5)

p < 0,05p < 0,05

Abbildung 14: Apparente Km-Werte der Ca2+-Aufnahme in duodenale BSMV der verschiedenen Altersgruppen

( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere).

64

Ergebnisse 4.2 Ergebnisse der PCR

Mit Hilfe der Primer für den konservierten Bereich aus dem ECaC (Kap. 3.8.2) konnte bei der

Darstellung des PCR-Produktes (DNA, Kap. 3.9) eine Bande im Bereich von 400

Basenpaaren (bp) detektiert werden. Für den hypervariablen Bereich konnte beim ECaC1 und

beim ECaC2 mit den in Kap. 3.8.2 beschriebenen Primern je eine Bande dargestellt werden,

von denen die des ECaC1 im Bereich von 200 Basenpaaren und die des ECaC2 im Bereich

von ca. 350 Basenpaaren lag (Abbildung 15).

500 bp 400 bp

300 bp 250 bp 200 bp

GM ECaC ECaC1 ECaC2

Abbildung 15: Darstellung der PCR-Produkte, ECaC, ECaC1 und ECaC2 aus der duodenalen Präparation eines

Absetzferkels in einem Agarosegel; zur Einordnung der Größe wurden Größenmarker (GM)

aufgetragen (bp = Basenpaare).

65

Ergebnisse 4.3 Teilsequenz des ECaC im konservierten Bereich

Die ermittelte Basensequenz für den ECaC im konservierten Bereich besteht aus 398

Basenpaaren und wird im Folgenden mit der dazugehörigen Aminosäurensequenz dargestellt.

9 18 27 36 45 54 5' CAG ATG TAC AAC CTG CTG CTG TCC TAT GAC GGT CGT GGG GAC CAC CTA CAG TCC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- Q M Y N L L L S Y D G R G D H L Q S 63 72 81 90 99 108 CTG GAG CTC GTG CCC AAT CAC GAG GGT CTC ACC CCG TTC AAG CTG GCC GGA GTG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- L E L V P N H E G L T P F K L A G V 117 126 135 144 153 162 GAG GGC AAC ACC GTG ATG TTC CAG CAC CTG ATG CAG AAG CGG AAG CAC ATC CAG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- E G N T V M F Q H L M Q K R K H I Q 171 180 189 198 207 216 TGG GTC CTC GGG CCC CTG ACC TCC ACT CTC TAC GAC CTG ACG GAG ATC GAC TCC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- W V L G P L T S T L Y D L T E I D S 225 234 243 252 261 270 TCG GGG GAT GAG CAG TCC CTG CTG GAA CTT CTT GTC ACC TCC AAG AAG CGG GAG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- S G D E Q S L L E L L V T S K K R E 279 288 297 306 315 324 GCT CGC CAG ATC CTG GAC CAG ACG CCA GTG AAG GAG CTG GTG AGC CTC AAG TGG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- A R Q I L D Q T P V K E L V S L K W 333 342 351 360 369 378 AGG AGA TAC GGG CGG CGG TAC TTC TGG GGG CTG GCT GCT GGG TAC CTG CTG TAC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- R R Y G R R Y F W G L A A G Y L L Y 387 396 ATC ATC TGC TTC ACC ATG TG 3' --- --- --- --- --- --- -- I I C F T M

Abbildung 16: Darstellung der Basensequenz mit der dazugehörigen Aminosäurensequenz des ECaC im

konservierten Bereich aus dem Duodenum eines Absetzferkels ( = Primer siehe Kap. 3.8.2).

66

Ergebnisse Die Basensequenz hat eine 84%ige Homologie zu der des ECaC1 des Kaninchen und eine

88%ige Homologie zu der des ECaC2 des Menschen.

Die Aminosäurensequenz hat eine 81%ige Homologie zu der des ECaC1 des Kaninchen und

eine 86%ige Homologie zu der des ECaC2 der Ratte (Abbildung 19).

Die gesamte Basensequenz mit ihrer Länge von 398 Basenpaaren wurde als „ECaC-Sonde“

beim Northern-Blot (Kap. 3.17) eingesetzt.

4.4 Teilsequenz des ECaC1 im hypervariablen Bereich

Die ermittelte Basensequenz für den ECaC1 im hypervariablen Bereich besteht aus 201


10 19 28 37 46 55 5'G AAT CCG TAT CGA GTA CTT CGA TAT GTG GAA GCT TTC AAA TCT TCA GAC AAA GAG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- N P Y R V L R Y V E A F K S S D K E 64 73 82 91 100 109 GAA GTA CAA GAG CAG CTA TCT GAG AAA CAA CCT TCT GGG ACT GAG ACT GGG ACT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- E V Q E Q L S E K Q P S G T E T G T 118 127 136 145 154 163 TTA GCT AGA GGC TCT GTG GTT CTC CAA ACA CCT CCT TTG TCC AGG ACT ACA TCC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- L A R G S V V L Q T P P L S R T T S 172 181 190 199 CTA AGC AGC AAT AGC CAC CGT GGA TGG GAA ATT CTC C 3' --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- - L S S N S H R G W E I L Abbildung 17: Darstellung der Basensequenz mit der dazugehörigen Aminosäurensequenz des ECaC1 im

hypervariablen Bereich aus dem Duodenum eines Absetzferkels ( = Primer siehe Kap. 3.8.2, = schweinespezifische Primer für die Real-Time-PCR und die „ECaC1-Sonde“ beim Northern-Blot).

67

Ergebnisse Die Basensequenz hat eine 95%ige Homologie zu der des ECaC1 der Ratte und eine 33%ige

Homologie zu der des ECaC2 des Menschen.

Die Aminosäurensequenz hat eine 97%ige Homologie zu der des ECaC1 der Ratte und eine

33%ige Homologie zu der des ECaC2 der Ratte (Abbildung 19).

Von dieser Sequenz wurden für die Real-Time-PCR schweinespezifische Primer abgeleitet:

5`>GGAAGTACAAGAGCAGCTATCTGAGA<3`, s, ECaC1 (Schwein, Basen: 55ff),

5`>GGGATGTAGTCCTGGACAAAGG<3`, as, ECaC1 (Schwein, Basen: 143ff).

Die Basensequenz zwischen und mit diesen Primern wurde als „ECaC1-Sonde“ mit einer

Länge von 109 Basenpaaren beim Northern-Blot (Kap. 3.17) eingesetzt.

68

Ergebnisse 4.5 Teilsequenz des ECaC2 im hypervariablen Bereich

Die ermittelte Basensequenz für den ECaC2 im hypervariablen Bereich besteht aus 329


9 18 27 36 45 54

5' GGC CCT GCG AAC TAT AGC GTG GAT CTG CCC TTC ATG TAC AGC GTC ACC TAT GCC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- G P A N Y S V D L P F M Y S V T Y A 63 72 81 90 99 108 GCC TTC GCC ATC ATT GCC GCT CTG CTC ATG CTC AAC CTC CTT ATC GCC ATG ATG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- A F A I I A A L L M L N L L I A M M 117 126 135 144 153 162 GGT GAC ACG CAC TGG CGG GTG GCC CAC GAG CGG GAT GAG CTC TGG CGG GCC CAG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- G D T H W R V A H E R D E L W R A Q 171 180 189 198 207 216 GTC GTG GCC ACC ACA GTG ATG CTG GAA CGG AAG CTG CCT CGC TGC CTG TGG CCT --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- V V A T T V M L E R K L P R C L W P 225 234 243 252 261 270 CGC TCC GGG ATC TGC GGG TAC AAG TTT GGG CTG GGG GAC CGC TGG TTC CTG CGG --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- R S G I C G Y K F G L G D R W F L R 279 288 297 306 315 324 GTG GAA GAC AGA CAG GAT ATC AAC CGG CAG CGT GTC CAG CGC TAC GCA CAG GCC --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- --- V E D R Q D I N R Q R V Q R Y A Q A TTC CA 3' --- -- F

Abbildung 18: Darstellung der Basensequenz mit der dazugehörigen Aminosäurensequenz des schweinespezifischen ECaC2 im hypervariablen Bereich aus dem Duodenum eines Absetzferkels ( = Primer siehe Kap. 3.8.2, = schweinespezifische Primer für die Real-Time-PCR und die „ECaC2-Sonde“ beim Northern-Blot).

69

Ergebnisse Die Basensequenz hat eine 81%ige Homologie zu der des ECaC1 der Ratte und eine 88%ige

Homologie zu der des ECaC2 des Menschen.

Die Aminosäurensequenz hat eine 84%ige Homologie zu der des ECaC1 des Kaninchen und

eine 93%ige Homologie zu der des ECaC2 der Ratte (Abbildung 19).

Von dieser Sequenz wurden für die Real-Time-PCR schweinespezifische Primer abgeleitet:

5`>CCACCACAGTGATGCTGGAA<3`, s, ECaC1 (Schwein, Basen: 170ff),

5`>GGTTGATATCCTGTCTGTCTTCCA<3`, as, ECaC1 (Schwein, Basen: 272ff).

Die Basensequenz zwischen und mit diesen Primern wurde als „ECaC2-Sonde“ mit ihrer

Länge von 126 Basenpaaren beim Northern-Blot (Kap. 3.17) eingesetzt.

70

Ergebnisse

71

ensch

MGGFLPKAEGPGSQLQKLLPSFLVREQDWDQHLDKLHMLQQKRILESPLLRASKENDLSVLRQLLLDCTCDVRQRGALGETALHIAALYDNLEAAL

aninchen

MGACPPKAKGPWAQLQKLLISWPVGEQDWEQYRDRVNMLQQERIRDSPLLQAAKENDLRLLKILLLNQSCDFQQRGAVGETALHVAALYDNLEAAT

atte

MGWSLPKEKGLILCLWNKFCRWFHRRESWAQSRDEQNLLQQKRIWESPLLLAAKENNVQALIKLLKFEGCEVHQKGAMGETALHIAALYDNLEAAM

ensch

VLMEAAPELVFEPTTCEAFAGQTALHIAVVNQNVNLVRALLARRASVSARATGTAFRRSPCNLIYFGEHPLSFAACVNSEEIVRLLIEHGADIRAQ

aninchen

LLMEAAPELAKEPALCEPFVGQTALHIAVMNQNLNLVRALLARGASVSARATGAAFRRSPHNLIYYGEHPLSFAACVGSEEIVRLLIEHGADIRAQ

atte

VLMEAAPELVFEPMTSELYEGQTALHIAVINQNVNLVRALLARGASVSARATGSVFHYRPHNLIYYGEHPLSFAACVGSEEIVRLLIEHGADIRAQ

ensch

DSLGNTVLHILILQPNKTFACQMYNLLLTYDRHGDHLQPLDLWPNHQGLTPFKLAGVEGNTVMFQHLMQKRKHVQWTCGPLTSTLYDLTEIDSWGE

aninchen

DSLGNTVLHILILQPNKTFACQMYNLLLSYDEHSDHLQSLELVPNHQGLTPFKLAGVEGNTVMFQHLMQKRKHVQWTCGPLTSTLYDLTEIDSWGE

atte

DSLGNTVLHILILQPNKTFACQMYNLLLSYD-GGDHLKSLELVPNNQGLTPFKLAGVEGNIVMFQHLMQKRKHIQWTYGPLTSTLYDLTEIDSSGD

Schwein

QMYNLLLSYDGRGDHLQSLELVPNHEGLTPFKLAGVEGNTVMFQHLMQKRKHIQWVLGPLTSTLYDLTEIDSSGD

ensch

ELSFLELVVSSDKREARQILEQTPVKEPVSFKWNKYGRPYFCILAALYLLYMICFTTCCVYRPLKFRGGNRTHSRDITILQQKLLQEAYETREDII

aninche

ELSFLELVVSSKKREARQILEQTPVKELVSFKWKKYGRPYFCVLASLYILYMICFTTCCIYRPLKLRDDNRTDPRDITILQQKLLQEAYVTHQDNI

atte

DQSLLELIVTTKKREARQILDQTPVKELVSLKWKRYGRPYFCVLGAIYVLYIICFTMCCVYRPLKPRITNRTNPRDNTLLQQKLLQEAYVTPKDDL

Schwein

EQSLLELLVTSKKREARQILDQTPVKELVSLKWRRYGRRYFWGLAAGYLLYIICFTM

ensch

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aninchen

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atte

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ensch

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aninchen

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Schwein

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ensch

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aninchen

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atte

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Schwein

MMGDTHWRVAHERDELWRAQVVATTVMLERKLPRCLWPRSGICGYKFGLGDRWFLRVEDRQDINRQRVQRYAQAF

Schwein

NPYRVLRYVEAFKSSDKEEVQEQLSEKQPSGTE

ensch

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aninchen

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MARPFGAYLSFPTPSVSRSTSRSSTN---WDRLRQGALRKDLQGIINRGLEDGEGWE-YQI

Schw

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Schwein

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5

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e, P

OR

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Pore

nreg

ion)

.

Ergebnisse 4.6 Northern-Blots mit verschiedenen Sonden entlang der Darmachse

4.6.1 Northern-Blot mit der „ECaC-Sonde“

Für den Northern-Blot mit der „ECaC-Sonde“ wurde die mRNA von 5 verschiedenen

Darmabschnitten eines Absetzferkels im Gel aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran

transferiert. Diese Membran wurde mit der „ECaC-Sonde“, die eine Aktivität von 70267 cpm

pro in einem µl Sonde enthaltener DNA aufwies, hybridisiert. Die Sonde hatte eine Länge von

398 Basenpaaren.

D = Duodenum J = Jejunum I = Ileum pC = proximales Colon dC = distales Colon

-- β-Aktin

-- ECaC

D J I pC dC

9,0 3,0 0,0 0,5 0,7 -- ECaC/β-Aktin-Verhältnis Abbildung 20: Darstellung der ECaC-Expression entlang der cranial-caudalen Darmachse eines Absetzferkels

mittels Northern-Blot und der „ECaC-Sonde“. Das ECaC/β-Aktin-Verhältnis lässt einen

relativen Vergleich der ECaC-Expression der einzelnen Darmabschnitte zu.

Mit der „ECaC-Sonde“ wurde maximal eine Bande je Darmabschnitt erzeugt. Das ECaC/β-

Aktin-Verhältnis zeigt eine deutlich höhere ECaC-Expression im Duodenum als in den

anderen Darmabschnitten. Im Jejunum war im Gegensatz zum Ileum, wo das ECaC/β-Aktin-

Verhältnis Null war noch eine relativ hohe Expression nachzuweisen. Gering, aber deutlich

nachweisbar war die Expression in beiden Abschnitten des Colons.

72

Ergebnisse 4.6.2 Northern-Blot mit der „ECaC1-Sonde“

Für den Northern-Blot mit der „ECaC1-Sonde“ wurde die mRNA von 5 verschiedenen

Darmabschnitten eines Absetzferkels und eines Saugferkels im Gel aufgetrennt und auf eine

Nitrocellulosemembran transferiert. Diese Membran wurde mit der „ECaC1-Sonde“, die eine

Aktivität von 57143 cpm pro in einem µl Sonde enthaltener DNA aufwies, hybridisiert. Die

Sonde hat eine Länge von 109 Basenpaaren.

-- β-Aktin

-- Bande 2

-- Bande 1

Saugferkel Absetzferkel D J I pC dC D J I pC dC D = Duodenum

J = Jejunum I = Ileum pC = proximales Colon dC = distales Colon

Abbildung 21: Darstellung der ECaC-Expression entlang der cranial-caudalen Darmachse eines Saugferkels

und eines Absetzferkels mittels Northern-Blot und der „ECaC1-Sonde“.

Mit der „ECaC1-Sonde“ wurden zwei Banden dargestellt. Eine Zuordnung der Banden zu

ECaC1 oder ECaC2 war nicht möglich.

4.6.3 Northern-Blot mit der „ECaC2-Sonde“

Für den Northern-Blot mit der „ECaC2-Sonde“ wurde die mRNA von 5 verschiedenen

Darmabschnitten eines Absetzferkels und eines Saugferkels im Gel aufgetrennt und auf eine

Nitrocellulosemembran transferiert. Diese Membran wurde mit der „ECaC2-Sonde“, die eine

Aktivität von 79604 cpm pro in einem µl Sonde enthaltener DNA aufwies, hybridisiert. Die

Sonde hat eine Länge von 126 Basenpaaren.

73

Ergebnisse

-- β-Aktin

-- Bande 2

-- Bande 1

Saugferkel Absetzferkel D J I pC dC D J I pC dC D = Duodenum

J = Jejunum I = Ileum pC = proximales Colon dC = distales Colon

Abbildung 22: Darstellung der ECaC-Expression entlang der cranial-caudalen Darmachse eines Saugferkels

und eines Absetzferkels mittels Northern-Blot und der „ECaC2-Sonde“.

Auch mit der „ECaC2-Sonde“ wurden zwei Banden dargestellt. Erneut war eine Zuordnung

der Banden zu entweder ECaC1 oder ECaC2 nicht möglich.

4.7 Ergebnisse der Real-Time-PCR bei Saug- und Absetzferkeln

Mit Hilfe der Real-Time-PCR wurden die mRNA-Gehalte der Saug- und Absetzferkel an

ECaC1 und ECaC2 relativ zum β-Aktin verglichen. Dies stellt eine semiquantitative

Bestimmung der mRNA-Gehalte dar. Jede Tierprobe wurde im Doppelansatz gemessen und

jeder Doppelansatz wurde wiederholt. Bei den Absetzferkeln konnte für 5 Tiere der ECaC1,

der ECaC2 und das β-Aktin quantifiziert werden. Für 5 Saugferkel konnte der quantitative

Nachweis des ECaC2 und des β-Aktins geführt werden, der quantitative Nachweis für den

ECaC1 gelang bei 4 Tieren, bei einem Tier lagen die Werte unterhalb der Nachweisgrenze.

Die Abbildung 23 zeigt die hintergrundkorrigierte Fluoreszenz-Zunahme (dRn) exemplarisch

für ein Saug- und ein Absetzferkel bei ECaC1, ECaC2 und β-Aktin. Für jede

Primerkombination wurde ein Leerwert, dem H2O anstelle der cDNA zugegeben wurde,

quantifiziert.

74

Ergebnisse

ECaC2 und β-Aktin

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Zyklen

Fluo

resz

enz

[dR

n]

-Aktin, Saugf. -Aktin, Absetzf.ECaC2, Saugf.ECaC2, Absetzf.

ββ

ECaC1

-0,01000

-0,00500

0,00000

0,00500

0,01000

0,01500

0,02000

0,02500

0,03000

0,03500

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39

Zyklen

Fluo

resz

enz

[dR

n]

ECaC1, Saugf.ECaC1, Absetz.

Abbildung 23: Darstellung der hintergrundkorrigierten, bei der Real-Time-PCR gemessenen Fluoreszenz [dRn]in Abhängigkeit der Zyklenzahl für den ECaC1, den ECaC2 und das β-Aktin bei einemSaugferkel (Saugf.) und einem Absetzferkel (Absetz.)

75

Ergebnisse Bei den Primerkombinationen für den ECaC2 und das β-Aktin entstand im Leerwert ein

unspezifisches Produkt, das jedoch mindestens drei Zyklen später auftrat als der ECaC2 bzw.

das β-Aktin in der Tierprobe mit der geringsten Konzentration an Ziel-cDNA. Diese

unspezifischen Produkte konnten in der Schmelzkurve, die am Ende des 40. Zyklus erstellt

wurde, eindeutig von dem eigentlichen Produkt differenziert werden. In dem Leerwert

entstand dieses unspezifische Produkt nicht (Abbildung 24).

0

50

100

150

200

55,3

57,5

59,5

61,5

63,5

65,5

67,5

69,5

71,5

73,5

75,5

77,5

79,5

81,5

83,5

85,5

87,5

89,5

91,5

93,5

Temperatur [°C]

Fluo

resz

enz Absetzf. 1

Absetzf. 2Absetzf. 3Absetzf. 4Absetzf. 5Leerwert

Abbildung 24: Darstellung der Schmelzkurve für den ECaC2 bei den Absetzferkeln (Absetzf.). Bei 90-91 °C

entstand das spezifische ECaC2-Produkt bei den Absetzferkeln und kein Produkt im Leerwert,

während bei 75,5 °C im Leerwert ein unspezifisches Produkt entstand. Die Fluoreszenz befand

sich in diesem Temperaturbereich auf Hintergrundniveau.

Der Schnittpunkt des Fluoreszenz-Graphen mit der Basislinie, die oberhalb der

Hintergrundfluoreszenz liegt und den Graphen im Bereich der linearen Zunahme schneidet,

wird durch eine Zyklenzahl charakterisiert (Ct-Wert, Kap. 3.18.3). Dieser Ct-Wert ist

abhängig von der in der cDNA vorhandenen Matrizenzahl, die wiederum von der

Gesamtmenge an cDNA abhängig ist. Die Gesamtmenge an cDNA wird über das β-Aktin

durch Differenzbildung der Ct-Werte für alle Tiere gleichgesetzt. Dadurch betrachtet man die

relativen Unterschiede verschiedener Tiere. Für jedes Tier wurden zwei Doppelbestimmungen

durchgeführt und bei der Berechnung wurden die Mittelwerte der vier Messungen

berücksichtigt. Die Ct-Wert-Differenzen lagen beim ECaC1 für die Absetzferkel zwischen

76

Ergebnisse 15,5 und 19,1 (17,1 ± 0,6, x ± SEM, n = 5) und lassen sich statistisch nicht signifikant von

denen der Saugferkel unterscheiden, die zwischen 16,9 und 17,2 (17,1 ± 0,1, n = 4) lagen.

Beim ECaC2 lagen die Ct-Wert-Differenzen für die Absetzferkel zwischen 6,9 und 8,1

(7,5 ± 0,2, x ± SEM, n = 5) und bei den Saugferkeln zwischen 8,0 und 12,5 (9,2 ± 0,8, n = 5)

(Abbildung 25). Statistisch gesicherte Unterschiede zwischen den Altersgruppen ergaben sich

nicht.

579

1113151719

1

ECaC1, Saugferkel (n = 4)ECaC1, Absetzferkel (n = 5)ECaC2, Saugferkel (n = 5)ECaC2, Absetzferkel (n = 5)

Abbildung 25: Darstellung der Ct-Wert-Differenzen zu β-Aktin für den ECaC1 und ECaC2 bei Saug- und

Absetzferkeln ( x ± SEM, n = Anzahl der Tiere).

Mit Hilfe der Ct-Wert-Differenzen des ECaC1 und ECaC2 wurden die beiden Altersgruppen

miteinander verglichen (Kap. 3.18.3). Dabei wurde zum einen der Mittelwert der Absetzferkel

für den ECaC1 und zum anderen der Mittelwert der Saugferkel für den ECaC2 auf 100 %

gesetzt. In Abbildung 26 ist zu erkennen, dass sich die mRNA-Gehalte für den ECaC1

zwischen den beiden Altersgruppen nicht nennenswert unterscheiden. Es ergab sich für den

mRNA-Gehalt der Absetzferkel ein Wert von 99,1 %. Ein deutlicher Alterseffekt ist aber bei

den mRNA-Gehalten für den ECaC2 zu beobachten. Saugferkel hatten einen ECaC2 mRNA-

Gehalt von 32,1 %. Dieser Effekt ist aber aufgrund der hohen Streuung innerhalb der Gruppen

nicht signifikant.

77

Ergebnisse

0

20

40

60

80

100

120

ECaC1 ECaC2

[%] Absetzferkel

Saugferkel

n = 5 n = 4 n = 5 n = 5

Abbildung 26: Darstellung der relativen mRNA-Gehalte in % für den ECaC1 und den ECaC2 in Abhängigkeit

vom Alter (Darstellung der Mittelwerte; ECaC1, Saugferkel = 100 %; ECaC2, Absetzferkel =

100 %, n = Anzahl der Tiere).

78

Diskussion 5 DISKUSSION

In der vorliegenden Arbeit wurde die Ca2+-Aufnahme in duodenale BSMV während der

postnatalen Entwicklung untersucht. Außerdem wurde mit der RT-PCR gezeigt, dass beim

Schwein wie bei verschiedenen anderen Säugerspezies mindestens zwei verschiedene Ca2+-

Kanäle an der aktiven intestinalen Ca2+-Absorption beteiligt sind (WEBER et al. 2001,

SLEPCHENKO u. BRONNER 2001), die möglicherweise in unterschiedlichem Ausmaß

unter Kontrolle von Calcitriol stehen. Da es aus Untersuchungen auf funktioneller Ebene

sichere Hinweise gab, dass der transepitheliale Ca2+-Transport in der frühen postnatalen Phase

nicht wie später im Absetzalter durch Calcitriol reguliert wird (SCHRÖDER et al. 1990,

1993, 1998a), lag es nahe, die jeweils anteilige Expression der Ca2+-Kanäle während der

Umstellung von flüssiger auf feste Nahrung zu untersuchen, um damit zum Verständnis der

Rolle des Vitamin D-Hormonsystems bei diesen Vorgängen erweiternd beizutragen.

5.1 Untersuchungen zur Funktion der Ca2+-Kanäle

Die BSMV wurden in Anlehnung an eine für Absetzferkel etablierte Methode von

Enterozyten des Duodenums mittels Mg2+-Präzipitation und Differentialzentrifugation

hergestellt (KAUNE et al. 1992, SCHRÖDER et al. 1998c). In zahlreichen Arbeiten wurde

schon zuvor der Ca2+-Transport in BSMV sowohl bei Schweinen (KASSIANOFF 1989,

KAUNE 1992, SCHRÖDER et al. 1998a, DAHL 1999) als auch bei anderen Spezies

untersucht (RASMUSSEN et al. 1979, WILSON u. LAWSON 1980, MILLER u. BRONNER

1981, SHULTZ et al. 1982, BIKLE et al. 1983, KREUTTER et al. 1984, SCHEDL u.

WILSON 1985, LIANG et al. 1986, GHISHAN et al. 1989, WILSON et al. 1989). Generell

hat sich dabei ergeben, dass die BSMV eine große Oberfläche für den Stoff- und

Flüssigkeitstransport bieten und dass sie eine für die Versuchsdauer ausreichende

mechanische Stabilität aufweisen. Durch die Isolierung der Bürstensaummembranen unter

weitgehendem Ausschluss bzw. Abreicherung anderer Zellkomponenten können die

79

Diskussion Vorgänge an der apikalen Zellmembran solitär betrachtet und beschrieben werden. Durch die

Trennung zwischen intra- und extravesikulärem Kompartiment können die

Transportbedingungen variiert und die Wirkungen verschiedener Substanzen auf den

betrachteten Transportvorgang untersucht werden. Dazu müssen in den Präparationsschritten

die Bürstensaummembranen gegenüber anderen Membranfragmenten wie z. B. denen der

basolateralen Zellseite ausreichend angereichert werden.

Die Anreicherung der Bürstensaummembranen als Qualitätsmerkmal der BSMV-Präparation

lässt sich mit Hilfe von membrantypischen Leitenzymen bestimmen, die in dem

Ausgangshomogenat und der Vesikelsuspension bestimmt und miteinander verglichen werden

(MIRCHEFF u. WRIGHT 1976). Als Leitenzym für die Bürstensaummembranen wurde die

Aktivität der alkalischen Phosphatase gemessen, die im Mittel um das 12fache angereichert

werden konnte, wobei kein Unterschied zwischen den unterschiedlich alten Ferkeln auftrat.

Ähnliche Anreicherungen wurden auch in anderen Arbeiten über den Schweinedarm ermittelt

(KELJO et al. 1985, BRANDIS et al. 1987, KASSINOFF 1989, KAUNE et al. 1992,

HATTENHAUER 1998, DAHL 1999). Auch für weitere Spezies wurden Werte in dieser

Größenordnung angegeben (Hühner: BIKLE et al. 1983, Kaninchen: DANISI et al 1984,

AHEARN u. MURER 1984, Schaf: SHIRAZI-BEECHEY et al. 1991, Ziege: RÜBELT

1995). Als Leitenzym für die basolateralen Membranen wurde die Aktivität der Na+/K+-

ATPase bestimmt. Diese war im Mittel nur um das 3fache angereichert und lag somit in

einem Bereich, wie er bei anderen Spezies gefunden wurde (MILLER u. BRONNER 1981,

AHEARN u. MURER 1984, KELJO et al. 1985, SCHEDL u. WILSON 1985, KASSIANOFF

1989, KAUNE 1992, RÜBELT 1995, HATTENHAUER 1998). Eine gewisse Kontamination

der apikalen Vesikelsuspension mit basolateralen Membranen ist bei der Präzipitation mit

divalenten Kationen (Ca2+ oder Mg2+) und Differentialzentrifugation nicht zu vermeiden

(MURER et al. 1989), aber entscheidend ist die deutlich höhere Anreicherung der

Bürstensaummembranen gegenüber den basolateralen Membranen.

Mit Hilfe der zeitabhängigen Glucose-Aufnahme in Anwesenheit eines einwärts gerichteten

Na+-Gradienten wurde wie von HOPFER et al. (1973, 1976) vorgeschlagen die funktionelle

Integrität der BSMV bestimmt. Durch die Triebkraft des Na+-Gradienten wird initial mehr

Glucose in die Vesikel aufgenommen als bei einem Konzentrationsausgleich zwischen extra-

und intravesikulärem Kompartiment zu erwarten wäre (Abbildung 6). Diese übermäßige

80

Diskussion Aufnahme wird als „Overshoot“ bezeichnet, dessen Maximalwert unter den gewählten

Versuchsbedingungen bei den Saugferkeln nach 2 min und bei den Absetzferkeln nach 3 min

erreicht war. Zu diesem Zeitpunkt war die Glucose-Aufnahme in Gegenwart des Na+-

Gradienten 10-mal höher als ohne Na+-Gradient. Der Maximalwert ist u. a. abhängig von der

Inkubationstemperatur, der Lokalisation der zur Präparation genutzten Dünndarmabschnitte

und dem Alter des jeweiligen Versuchstieres (BUDDINGTON u. MALO 1996). Das

„Overshoot“-Phänomen kann ausschließlich bei einem geschlossenen Kompartiment

beobachtet werden. In Abwesenheit von Na+ gelangt die Glucose entlang ihres chemischen

Gradienten per Diffusion in die Vesikel und erreicht den Maximalwert unter den vorliegenden

Bedingungen nach 120 min, wenn die extra- und intravesikuläre Glucosekonzentration im

Equilibrium vorliegt. Auch in Anwesenheit des Na+-Gradienten erfolgt während der 120-

minütigen Inkubation ein Konzentrationsausgleich (Abbildung 6). Der Ausgleichswert wurde

zur Bestimmung der Vesikelvolumina herangezogen, die altersunabhängig bei ca. 1 µl.mg-1

Protein lagen und damit eine ähnliche Größenordnung aufwiesen wie in anderen

Untersuchungen mit Enterozyten beschrieben (BERNER et al. 1976, BOROWITZ u.

GHISHAN 1985, RÜBELT 1995, WALTER 1999, HATTENHAUER 1998).

Die Untersuchung der zeitabhängigen Ca2+-Aufnahme in An- und Abwesenheit des Ca2+-

Ionophors A23187 stellt prinzipiell eine weitere Möglichkeit dar, die Vesikelintegrität zu

überprüfen. Werden intakte BSMV mit dem Ionophor vermischt, so werden sie permeabel für

Ca2+ und füllen sich ungehindert. Dies führt zu einer „Ad hoc-Aufnahme“ von Ca2+ in die

BSMV, was sich graphisch durch einen steileren Kurvenverlauf als bei der erleichterten

Diffusion durch die Bürstensaummembran darstellt (Abbildung 7). Um die Integrität der

Vesikel zu beurteilen, wurden regelmäßig die Ca2+-Aufnahmewerte nach 30 s in An- und

Abwesenheit des Ca2+-Ionophors verglichen. Dabei ergab sich eine um das 3,3 bis 6,3fache

initial höhere Ca2+-Aufnahme, was nur bei einem geschlossenen Kompartiment auftritt.

Erneut ergaben sich keine nennenswerten Unterschiede zwischen den Altersgruppen. Dieser

Befund deckt sich mit den Schätzungen der Vesikelvolumina aus den Glucose-

Ausgleichswerten, die ebenfalls keinen Alterseffekt aufwiesen (Abbildung 8).

Insgesamt ist also davon auszugehen, dass für alle Tiergruppen ausreichend angereicherte

BSMV-Suspensionen mit adäquater funktioneller Integrität zur Bestimmung der kinetischen

Parameter des Ca2+-Transportes durch duodenale Bürstensaummembranen vorlagen.

81

Diskussion Bei der Beurteilung der Ca2+-Aufnahmeraten in BSMV ist des Weiteren zu beachten, dass

mittels der Schnellfiltrationsmethode zunächst der Gesamttransport ermittelt wird, der sich

seinerseits aus einer sättigbaren und einer nicht sättigbaren Komponente zusammensetzt

(SCHEDL u. WILSON 1985, GHISHAN et al. 1989, KAUNE 1992). Einen wichtigen Anteil

an der unspezifischen Komponente des Ca2+-Transportes bildet die Proteinbindung von Ca2+,

die sowohl an der Außen- als auch Innenseite der isolierten Bürstensaummembran erfolgen

kann. Diese Proteinbindung wurde durch den Vergleich der aus Glucose- und Ca2+-

Aufnahmeversuchen berechneten Vesikelvolumina geschätzt und betrug bei MILLER u.

BRONNER (1981) 50%, bei KASSIANOFF (1989) 90 % und bei MERRIL et al. (1986)

100 %.

Die sättigbare Komponente kann im Gegensatz zur nicht sättigbaren Komponente mit dem

aktiven Ca2+-Transport korreliert werden (SCHEDL u. WILSON 1985), und es lassen sich

aus den Daten der Ca2+-Aufnahmeraten als Funktion von [Ca2+]f nach der Theorie von

Michaelis-Menten die kinetischen Parameter Vmax und Km kalkulieren. Dabei muss beachtet

werden, dass die „schnellen“ Ca2+-Aufnahmeraten innerhalb der ersten Minute für die

Berechnung berücksichtigt werden, da später gemessene Werte für die gewählte

Konzentration nicht mehr repräsentativ sind (GHIJSEN et al. 1987). Die apparenten Km-

Werte für die Absetz- und Mastferkel lagen bei 1,1 mmol.l-1 und waren damit signifikant von

den Km-Werten der Saugferkel verschieden, die bei 1,4 mmol.l-1 lagen. Ähnliche Km-Werte

wurden für BSMV aus Hühnerenterozyten beschrieben (RASMUSSEN et al. 1979). Eine

Überprüfung der kinetischen Daten in Scatchard-Plots zeigte eine lineare Beziehung und gab

damit keinen Hinweis auf die Existenz von mehreren, sich deutlich unterscheidenden

Transportsystemen. Es soll darauf hingewiesen werden, dass die hier kalkulierten Km-Werte

je nach Ausmaß der Präsenz von ECaC1 oder ECaC2 bzw. Koexistenz beider Systeme in der

Bürstensaummembran die Ca2+-Affinität entweder des einen oder anderen oder den

Mittelwert beider Systeme darstellen können. Insofern können die unterschiedlichen Km-

Werte als Hinweis auf die unterschiedliche Expression von ECaC1 und/oder ECaC2 bei

Absetz-/Mastferkeln bzw. Saugferkeln gewertet werden. Jedoch sind die Km-Werte trotz der

statistischen Unterschiede aus transporterphysiologischer Sicht so ähnlich, dass eine

Unterscheidung der Ca2+-Kanäle anhand der Km-Werte nicht möglich ist. Hierfür müssen

erfahrungsgemäß Unterschiede bei den Km-Werten von mindestens einer Zehnerpotenz

82

Diskussion bestehen. Erst dann ist eine Unterscheidung unter Verwendung eines „Two-side-binding“-

Modells (Annahme der Beteiligung von 2 unterschiedlichen Transportersystemen)

rechnerisch sinnvoll und möglich. Im vorliegenden Fall wurde nach KAUNE et al. (1992) ein

„One-side-binding“-Modell zur Berechnung von Vmax und Km verwendet, dass den Gesamt-

Vmax-Wert aller potenziellen Ca2+-Transportsysteme angibt und für den altersabhängigen

Gruppenvergleich verwendet werden konnte.

Im Gegensatz zu den hier dargestellten Werten haben KAUNE et al. (1992) eine apparente

Km für das Absetzferkel von 0,03 mmol.l-1 ermittelt. Diese Abweichung kann am Besten

dadurch erklärt werden, dass bei den Untersuchungen von Kaune die Km-Werte in

Anwesenheit eines vesikelauswärts gerichteten Kalium-Gradienten ermittelt wurden, was zu

einer transmembranalen Potentialdifferenz (Vesikelinneres negativ) führte. Inzwischen ist

gesichert, dass intestinale Ca2+-Kanäle spannungssensitiv sind (HOENDEROP et al. 1999b),

und es ist damit davon auszugehen, dass die von KAUNE et al. vorgelegte Kalium-

Spannungsklemme einen signifikanten Einfluss auf die Kinetik des Ca2+-Transportes hatte. Es

soll an dieser Stelle darauf hingewiesen werden, dass in zukünftigen Experimenten zur

Charakterisierung des Ca2+-Transportes über die duodenale Bürstensaummembran bei der

Auswahl der Versuchsbedingungen eine Vereinheitlichung der membranalen

Spannungsverhältnisse notwendig erscheint.

Für die beiden bisher bekannten Ca2+-Kanäle sind die Km-Werte mit ECaC-exprimierenden

Oozyten von Xenopus laevis bestimmt worden. Sie variierten beim ECaC1 von 0,2 mmol.l-1

(HOENDEROP et al. 1999a) bis 0,66 mmol.l-1 (PENG et al. 2000b) und beim ECaC2 von

0,25 mmol.l-1 (PENG et al. 2000a) bis 0,44 mmol.l-1 (PENG et al. 1999), was in der

Größenordnung zumindest teilweise eher den in dieser Arbeit gezeigten Km-Werten entspricht

als den von KAUNE et al. beschriebenen.

Die Vmax-Werte für die Absetz- und Mastferkel lagen bei 1,89 und 2,12 nmol.mg-1 Protein und

waren signifikant von dem Vmax-Wert der Saugferkel verschieden, der bei 3,64 nmol.mg-1

Protein lag, was als Hinweis auf eine erhöhte Anzahl von ECaC gewertet werden kann.

Unterstützt wird diese Annahme durch Befunde aus Versuchen mit duodenalen Epithelien in

Ussing-Kammern, bei denen ein tendenziell erhöhter, transepithelialer Ca2+-Nettofluss beim

Saugferkel gegenüber Absetzferkeln gezeigt werden konnte (SCHRÖDER et al. 1993,

1998a,b).

83

Diskussion 5.2 Untersuchungen zur Struktur der Ca2+-Kanäle

Zunächst wurde mit Hilfe der RT-PCR untersucht, ob auch beim Schwein wie bei den bisher

untersuchten Spezies spezifische Ca2+-Kanäle am transepithelialen Ca2+-Transport im

Duodenum beteiligt sind. Für diesen Nachweis standen Primer, die vom ECaC1 des

Kaninchens bzw. ECaC2 des Menschen abgeleitet wurden, zur Verfügung. Damit konnte

zwar erstmals die Existenz von Ca2+-Kanälen im Schweinedünndarm nachgewiesen werden,

aber eine Typisierung war nicht möglich, da die identifizierte Teilsequenz aus einem Bereich

stammte, in dem sich ECaC1 und ECaC2 nur geringfügig unterscheiden. Deshalb wurden

anschließend Teilsequenzen identifiziert, die dies nun ermöglichen. Davon hatte die eine eine

95%ige Homologie zum ECaC1 der Ratte und nur eine 33%ige Homologie zum ECaC2 des

Menschen. Die entsprechende Aminosäuresequenz zeigte eine 97%ige Homologie zum

ECaC1 der Ratte und eine 33%ige Homologie zum ECaC2 der Ratte. Daraus kann

geschlossen werden, dass im Dünndarm des Schweines die mRNA, die für den ECaC1

codiert, präsent ist. Eine andere Teilsequenz überschnitt diese in 12 Aminosäuren, von denen

allerdings 5 unterschiedlich waren, so dass davon ausgegangen werden kann, dass diese

Teilsequenz dem ECaC2 zuzuordnen ist. Es gilt demnach als wahrscheinlich, dass im

Dünndarm des Schweines ebenfalls die mRNA, die für den ECaC2 codiert, präsent ist. Dies

wird dadurch untermauert, dass bei der Basensequenz eine höhere Homologie zum ECaC2

(88 % im Vergleich zum ECaC2 des Menschen) als zum ECaC1 (81 % im Vergleich zum

ECaC1 der Ratte) vorlag und beide Primer, die zu diesem PCR-Produkt führten, von einem

ECaC2 abgeleitet wurden.

84

Diskussion 5.3 Untersuchungen zur Quantifizierung der Ca2+-Kanäle

Um die jeweiligen quantitativen Anteile von ECaC1 und ECaC2 im Duodenum von Ferkeln

während der postnatalen Entwicklung näher zu charakterisieren, wurden zunächst Northern-

Blot-Analysen durchgeführt. Es gelang allerdings nicht, die mit den verschiedenen Sonden

dargestellten Banden dem ECaC1 oder ECaC2 zuzuordnen. Obwohl die „ECaC2-Sonde“ und

in besonderem Maße die „ECaC1-Sonde“ aus dem Bereich gewählt wurde, in dem sich

ECaC1 und ECaC2 deutlich unterscheiden müssten, entstanden bei beiden Sonden jeweils

zwei Banden und die „ECaC-Sonde“, die beide Kanäle hätte darstellen sollen, stellte nur eine

Bande dar. Die Ursachen für dieses paradoxe Phänomen sind nicht bekannt.

Mit den Ergebnissen entlang der cranial-caudalen Darmachse, die die höchste Expression des

ECaC im vorderen Dünndarm zeigten, lässt sich erstmals auf mRNA-Ebene bestätigen, dass

der vordere Dünndarm der Hauptort der aktiven Ca2+-Absorption ist, wie es von

Untersuchungen auf funktioneller Ebene seit langem bekannt ist (PARTRIDGE 1978, VAN

OS 1987, BRONNER 1992). Auch das Colon scheint beim Schwein zum aktiven Ca2+-

Transport befähigt, da auch in diesen Darmabschnitten die für die Ca2+-Kanäle codierende

mRNA nachgewiesen werden konnte.

Mit dem Verfahren der Real-Time-PCR war es möglich, die ECaC1- und ECaC2- Sequenzen

zu unterscheiden. Für den ECaC1 ergaben sich Ct-Werte, die größer als 37 waren, und somit

im Bereich der Nachweisgrenze lagen. Der Nachweis gelang bei 4 Saug- und 5 Absetzferkeln.

Für jeweils 5 Saug- und 5 Absetzferkel konnte der Nachweis auch für den ECaC2

durchgeführt werden. Es ergaben sich dabei Ct-Werte, die bei 21 lagen, und damit auf eine

höhere Präsenz von ECaC2 als von ECaC1 im Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln

hinweisen. Dies deckt sich mit Untersuchungen, die PENG at al. (2001) durchführten, wobei

sie in humanem Dünndarmgewebe nur den ECaC2 nachweisen konnten und der ECaC1

unterhalb der Nachweisgrenze lag. Real-Time Untersuchungen sind jedoch nur bedingt

geeignet, Aussagen zu treffen über den direkten Vergleich der mRNA-Gehalte von ECaC1

und ECaC2, da bei den PCR-Reaktionen unterschiedliche Bedingungen vorherrschen, wie

z. B. eine unterschiedliche Primer- oder MgCl2-Konzentration und die zu amplifizierenden

Stücke eine unterschiedliche Länge und Basensequenz haben.

85

Diskussion Um die Präparationen der Tiere miteinander vergleichen zu können, wurden die ermittelten

mRNA-Gehalte auf den internen Standard β-Aktin bezogen (PEIRCE u. CHEN 2001, DA

COSTA et al. 2002). Vom β−Aktin wird vorausgesetzt, dass es in gleicher Menge in den

Geweben bei den verschiedenen Tieren vorkommt (BISHOP et al. 2000, DA COSTA et al.

2002, KLEMCKE et al. 2001, LABUHN u. BRACK 1997, OUE et al. 1999, PEIRCE u.

CHEN 2001). Dadurch konnten Proben verglichen werden, deren Menge an vorhandener

cDNA nicht exakt gleich war.

Mit Hilfe der relativen ECaC1 und ECaC2 mRNA-Gehalte wurde der Alterseffekt untersucht.

Die mRNA-Gehalte für den ECaC1 unterschieden sich dabei nicht nennenswert zwischen den

Saug- und Absetzferkeln. Demnach scheint der ECaC1 auf m-RNA-Ebene nicht

altersabhängig reguliert zu werden. Ein deutlicher Alterseffekt, der aber aufgrund der hohen

Streuung innerhalb der Gruppen statistisch nicht gesichert werden konnte, deutet sich aber in

Bezug auf die mRNA-Gehalte des ECaC2 an. Beim Saugferkel war die Präsenz des ECaC2

um 2/3 niedriger als beim Absetzferkel.

5.4 Schlussbetrachtung und Ausblick

Möglicherweise wird mit dem ECaC1 eine Basisversorgung des Organismus mit Ca2+

erreicht, die in besonderem Maße beim Saugferkel, das mit einer höheren Ca2+-Konzentration

in der Nahrung versorgt wird, ausreichend ist, um die Ca2+-Homöostase aufrecht zu erhalten.

Mit zunehmendem Alter sinkt die Transporterkapazität am Epithel und in den BSMV,

gleichzeitig wird der mRNA-Gehalt für den ECaC2 in den Enterozyten hochreguliert. Dies

deutet auf eine Regulation auf Translationsebene, die noch untersucht werden muss. Da aber

der mRNA-Gehalt mit zunehmendem Alter ansteigt, liegt die Vermutung nahe, dass der

ECaC2 im Dünndarm der Schweine, wie es ebenfalls für Caco-2-Zellen gezeigt (WOOD et al.

2001) wurde, durch Calcitriol reguliert wird, da aus früheren Untersuchungen bekannt ist,

dass die Ca2+-Versorgung beim Schwein erst altersabhängig mehr und mehr unter die

Kontrolle dieses Hormons kommt. Dabei bleibt allerdings die Konzentration des Calcitriols

altersunabhängig konstant, jedoch steigt mit zunehmendem Alter die maximale

Bindungskapazität des Vitamin D-Rezeptors (SCHRÖDER et al. 1993). Demnach würde der

ECaC2 für die Feinregulation der Ca2+-Homöostase von Bedeutung sein. Diese Hypothesen

86

Diskussion über die physiologische Bedeutung der verschiedenen Ca2+-Kanäle müssen jedoch noch auf

der Proteinebene untersucht werden und können auch dadurch verifiziert werden, dass die

Regulation auf mRNA-Ebene bei verschiedenen Behandlungsmodellen mit Calcitriol

betrachtet wird. Für zukünftige Untersuchungen zur Charakterisierung der Rolle der Ca2+-

Kanäle bei der postnatalen Entwicklung des duodenalen Ca2+-Transportes beim Schwein

stehen nun Techniken zur Verfügung.

87

Zusammenfassung 6 ZUSAMMENFASSUNG Thomas Hinterding Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm von Saug- und

Absetzferkeln

Es wurden funktionelle Daten zur postnatalen Entwicklung des intestinalen Ca2+-Transportes

bei Schweinen erhoben und anschließend mit molekularbiologischen Methoden diejenigen

Ca2+-Kanäle, die für die Aufnahme von Ca2+ durch die Bürstensaummembran der Enterozyten

verantwortlich sind, qualitativ und altersabhängig quantitativ untersucht.

Zur Erfassung der funktionellen Daten wurden Bürstensaummembranvesikel von Enterozyten

aus dem vorderen Dünndarm von Saug-, Absetz- und Mastferkeln mittels Mg2+-Präzipitation

und Differentialzentrifugation hergestellt und die Ca2+-Aufnahmeraten mittels

Schnellfiltrationstechnik unter Verwendung des Radiotracers 45Ca untersucht.

Der qualitative Nachweis der epithelialen Ca2+-Kanäle (ECaC) erfolgte mit der RT-PCR und

Primern in Anlehnung an bekannte Sequenzen anderer Spezies.

Zur relativen Quantifizierung der ECaC auf mRNA-Ebene wurden Untersuchungen bei Saug-

und Absetzferkeln mit Hilfe von Northern-Blots und Real-Time-PCRs durchgeführt.

Die Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen:

(1) Die Kinetik der Ca2+-Aufnahme in duodenale BSMV des Ferkels konnte am Besten mit

einem „One-site-binding“-Modell angepasst werden. Die daraus erhaltenen kinetischen

Daten ergaben keinen unmittelbaren Hinweis für die Präsenz verschiedener ECaC im

Schweinedünndarm.

(2) Saugferkel hatten eine signifikant höhere maximale Ca2+-Aufnahmerate (Vmax) als

Absetzferkel (p < 0,01) oder Mastferkel (p < 0,05). Die Vmax-Werte der Saugferkel

betrugen 3,64 ± 0,45 nmol.mg-1 Protein.30s-1, die der Absetzferkel 1,89 ± 0,20 nmol.mg-1

Protein.30s-1 und die der Mastferkel 2,13 ± 0,20 nmol.mg-1 Protein.30s-1 ( x ± SEM,

n = 5).

88

Zusammenfassung (3) Saugferkel wiesen eine signifikant höhere apparente Km auf als Absetzferkel oder

Mastferkel (p < 0,05). Die Km-Werte der Saugferkel betrugen 1,44 ± 0,06 mmol.l-1 , die

der Absetzferkel 1,14 ± 0,05 mmol.l-1 und die der Mastferkel 1,13 ± 0,09 mmol.l-1

( x ± SEM, n = 5).

(4) Es wurden Teilsequenzen von Ca2+-Kanälen ermittelt, die sich teilweise überlagerten, was

auf die Präsenz zweier verschiedener Ca2+-Kanäle hinweist. Eine dieser Teilsequenzen

hatte eine deutlich höhere Homologie zum ECaC1 der Ratte (95 %) als zum ECaC2 des

Menschen (33 %). Die andere Teilsequenz wies eine höhere Homologie zum ECaC2 des

Menschen (88 %) als zum ECaC1 der Ratte auf (81 %).

(5) Mit der Real-Time-PCR-Methode konnte zwischen ECaC1 und ECaC2 differenziert

werden. Die mRNA für den ECaC1 war bei Saug- und Absetzferkeln in sehr geringem

Umfang vorhanden, der aber nicht unterschiedlich war. Ein Unterschied in Abhängigkeit

des Alters konnte nicht festgestellt werden. Der mRNA-Gehalt für den ECaC2 war beim

Saugferkel gegenüber dem Absetzferkel um 2/3 erniedrigt.

Die Ergebnisse zeigen, dass wie bei anderen bislang untersuchten Säugerspezies auch beim

Schwein zwei verschiedene Ca2+-Kanäle am intestinalen Ca2+-Transport beteiligt sind. Der

mRNA-Gehalt dieser Kanäle lässt sich über die Real-Time-PCR quantifizieren und zeigt für

den ECaC2 einen altersabhängigen Effekt.

89

Summary 7 SUMMARY Thomas Hinterding

Expression of the Ca2+-channels ECaC1 and ECaC2 in small intestines of suckling and

weaned piglets

Functional data from postnatal development of the intestinal Ca -absorption in pigs were

collected and the Ca -channels which are responsible for the Ca -uptake across the brush

border membrane of enterocytes were investigated qualitatively and age-dependent

quantitatively.

2+

2+ 2+

To collect the functional data brush border membrane vesicles were prepared from

enterocytes of the proximal small intestine of suckling and weaned piglets as well as porkers

by combined Mg2+-precipitation method and differential centrifugation and the Ca2+-uptakes

were investigated by the rapid filtration technique using the radiotracer 45Ca.

Epithelial Ca2+-channels (ECaC) were identified with RT-PCR using primers deduced from

well known sequences of other species.

For the relative quantification of ECaC on mRNA levels investigations were carried out with

preparations of suckling and weaned piglets by northern blots and real-time-PCRs.

Following results are to be emphasised:

(1) The kinetic of the Ca2+-uptake into the duodenal brush border membrane vesicles could

be fitted best with a “one-site-binding” model. The results did not support directly the

assumption of the presence of different ECaCs in the small intestine of pigs.

(2) Suckling piglets had a significantly higher maximal Ca2+-uptake (Vmax) compared with

weaned piglets (p < 0.01) or porkers (p < 0.05). Vmax values were 3.64 ± 0.45 nmol.mg-1

protein.30s-1 in suckling piglets, 1.89 ± 0.20 nmol.mg-1 protein.30s-1 in weaned piglets

and 2.13 ± 0.20 nmol.mg-1 protein.30s-1 in porkers ( x ± SEM, n = 5).

90

Summary (3) Suckling piglets had a significantly higher apparent Km compared with weaned piglets or

porkers (p < 0.05). Km values were 1.44 ± 0.06 mmol.l-1 in suckling piglets,

1.14 ± 0.05 mmol.l-1 in weaned piglets and 1.13 ± 0.09 mmol.l-1 in porkers ( x ± SEM,

n = 5).

(4) Partial sequences from the Ca2+-channels were detected which show to some extent

sequence overlay. That can be analysed as an evidence for the presence of two different

Ca2+-channels in porcine duodenum. One of the partial sequences had a higher homology

to the ECaC1 of rat (95 %) compared with ECaC2 of human (33 %). The other partial

sequence exhibited a higher homology to the hECaC2 (88 %) compared with the rECaC1

(81 %).

(5) With the real-time-PCR method differentiation of ECaC1 and ECaC2 was enabled. The

mRNA for ECaC1 was present in suckling and weaned piglets in rather small extent but

without a difference. The mRNA level for ECaC2 was lower by 66 % in suckling piglets

compared with weaned piglets.

In summary, the results show that two different Ca2+-channels are involved in Ca2+-absorption

from the small intestines, similarly to those shown recently in other mammalian species. The

mRNA levels of these channels can be quantified using the real-time-PCR method and the

results for the ECaC2 point to same kind of postnatal adaptation, which should be further

elucidated in following investigations.

91

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Hannover, den 25.August 2002

ERKLÄRUNG Hiermit erkläre ich, dass ich die Dissertation mit dem Titel: „Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm von Saug- und Absetzferkeln“ selbständig verfasst habe. Bei der Anfertigung wurden folgende Hilfen Dritter in Anspruch genommen: keine. Ich habe keine entgeltliche Hilfe von Vermittlungs- bzw. Beratungsdiensten (Promotionsberater oder anderen Personen) in Anspruch genommen. Niemand hat von mir unmittelbar oder mittelbar entgeltliche Leistungen für Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen. Ich habe die Dissertation am Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover angefertigt. Die Dissertation wurde bisher nicht für eine Prüfung oder Promotion oder für einen ähnlichen Zweck zur Beurteilung eingereicht. Ich versichere, dass ich die vorstehenden Angaben nach bestem Wissen vollständig und der Wahrheit entsprechend vorgenommen habe. ________________________

Thomas Hinterding

Danksagung Ich habe die Danksagung am Ende einer Dissertation immer für die Pflichterfüllung des

jeweiligen Doktoranden gegenüber den Angehörigen des Institutes, Freunden und

Verwandten angesehen. Heute weiss ich, dass sie wirklich Herzenssache ist aus Dankbarkeit

zum Überstehen einer schwierigen Lebensphase. Durch diese Zeit haben mich sehr viele

Menschen begleitet, von denen ich an dieser Stelle einige besonders hervorheben möchte.

Zuerst möchte ich mich bei Prof. Dr. G. Breves für die freundliche Aufnahme in der

Arbeitsgruppe bedanken.

In einem ganz besonderem Maße möchte ich mich bei Prof. Dr. Bernd Schröder für die

Überlassung des Themas und die nette Betreuung bedanken. Er hat sich immer die Zeit

genommen, Fragen und Probleme zu diskutieren und hat mich mit unzähligen hilfreichen

Ratschlägen immer ein Stück weiter gebracht auf dem Weg, diese Dissertation zu erstellen.

Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Dr. Korinna Huber, die mich in die Geheimnisse

der molekularbiologischen Techniken eingeführt hat und unter deren kritischen Blicken ich

gelernt habe, wissenschaftlich zu denken.

Frau Becker, Christina, Marion, Katrin und Kerstin danke ich für die gute Zusammenarbeit im

Labor und die Unterstützung, die ich durch sie erhalten habe.

Bedanken möchte ich mich natürlich auch bei den anderen Doktoranden (Alexandra, Eva,

Hakan, Magnus, Julia, Uta), mit denen ich in der ganzen Zeit sehr viel Spaß hatte.

Bei Yvonne, Michael und Maike möchte ich mich dafür bedanken, dass ich auch im Institut

dem Institut entkommen konnte, wenn es nötig war.

René J. M. Bindels und Joost G. J. Hoenderop danke ich ebenso wie ihrer gesamten

Arbeitsgruppe für die freundliche Aufnahme und die fachliche Unterstützung.

Mein Dank gilt auch dem Institut für Parasitologie, insbesondere Prof. Dr. G. von Samson,

dessen technische Ausrüstung ich nutzen durfte.

Der H. Wilhelm Schaumann Stiftung danke ich für die finanzielle Unterstützung.

Nicht zu letzt, aber an besonders exponierter Stelle, danke ich Corinna --- für alles! ;-)

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Expression der Ca2+-Kanäle ECaC1 und ECaC2 im Dünndarm … · 5.2 Untersuchungen zur Struktur der Ca2+-Kanäle 84 5.3 Untersuchungen zur Quantifizierung der Ca2+-Kanäle 85 5.4