Expression of white root resistance related genes in ...natres.psu.ac.th/office/foreign/res/2017_Mar_WhiteRootResistance.pdf · (1) บทคัดย่อ Rigidoporus microporus

รายงานวจยฉบบสมบรณ

การแสดงออกของยนทเกยวของกบการควบคมความตานทานตอ เชอราทกอใหเกดโรครากขาวในยางพารา

Expression of white root resistance related genes in rubber tree

คณะนกวจย

ดร.กรกช นาคคนอง รองศาสตราจารย ดร. จรสศร นวลศร

โครงการวจยนไดรบทนสนบสนนจากงบประมาณแผนดน

มหาวทยาลยสงขลานครนทร

รายงานวจยฉบบสมบรณ

การแสดงออกของยนทเกยวของกบการควบคมความตานทานตอ เชอราทกอใหเกดโรครากขาวในยางพารา

Expression of white root resistance related genes in

rubber tree

คณะนกวจย

ดร.กรกช นาคคนอง รองศาสตราจารย ดร. จรสศร นวลศร

โครงการวจยนไดรบทนสนบสนนจากงบประมาณแผนดน มหาวทยาลยสงขลานครนทร

ประจ าปงบประมาณ 2557 รหสโครงการ (NAT570186S)

(1)

บทคดยอ

Rigidoporus microporus เปนเชอกอโรคสาคญในยางพาราทเปนสาเหตของโรครากขาวและ

ทาใหตนยางทเปนโรคยนตนตาย การศกษากลไกการแสดงออกของยนทเกยวของกบการผลตสารทมฤทธตานทานเชอราและเกยวของกบการตานทานโรคในระบบ SAR เพอเปนขอมลพนฐานในการคดเลอกตนตอยางพาราจงเปนประเดนทนาสนใจ การโคลนยนทเกยวของกบการผลตสารทมฤทธตานทานเชอรา (HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5) พบวา ยน HbPR-1 ม Open reading frame 492 คเบส สามารถแปลรหสเปนกรดอะมโนจานวน 163 กรดอะมโน มนาหนกโมเลกล 17.69 kDa และมคา pI 8.57 ในขณะทยน HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 สามารถโคลนไดเพยงบางสวนของยน โดยมขนาด 1,120, 390, 233 และ 517 คเบส ตามลาดบ การศกษาความจาเพาะของยน HbPR-1 และ HbPR-3 ทแสดงออกในเนอเยอของพช พบวา มการแสดงออกในทกเนอเยอททาการศกษา โดยมการแสดงออกสงสดในเปลอก เมลดออน เมลดแก ใบออน และใบแก ตามลาดบ เมอศกษาการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 ในยางพารา 5 พนธ ไดแก PB5/51 (ผานการทดสอบวาทนทานตอโรครากขาว) BPM 24, RRIM600, Bangrak และ PSU1 หลงจากการปลกถายเชอ R. microporus เปนเวลา 0, 12, 24, 48, 72 และ 96 ชวโมง โดยใชเทคนค Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR) พบวาตนกลายางพาราพนธ PB5/51 มแนวโนมในการแสดงออกของยนทง 5 กลมสงทสด โดยเฉพาะยน HbPR-4 และ HbPR-5 ในตนกลายางพาราพนธ BPM 24 มการแแสดงออกของยนในกลม HbPR-1, HbPR-4 และ HbPR-5 เพมมากขนในชวงตน และคอยๆลดลงหลงปลกเชอเปนเวลา 48 ชม. ในขณะทยน HbPR-2 และ HbPR-3 มการแสดงออกคอนขางตา สาหรบยางพาราพนธ RRIM600 พบวามการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-3 และ HbPR-5 เพมขนมากในชวง 24 ชม.หลงปลกเชอและคอยๆลดลงหลงปลกเชอ 48 ชวโมง สวนการแสดงออกของอกสองยนคอ HbPR-2 และ HbPR-4 ลดลง การแสดงออกของยนทง 5 ยนในยางพาราพนธพนเมอง Bangrak และ PSU1 พบวามการแสดงออกนอยกวาในพนธอนๆอยางมนยสาคญทางสถต จากผลการทดลองชใหเหนถงความแตกตางในการแสดงออกของยนทเกยวของกบตานทานโรครากขาวในยางพารา และการตอบสนองตอกลไกการปองกนตนเองของยางพาราในพนธทนทานตอโรครากขาว PB5/51 มการแสดงออกของกลมยน PRs สง โดยเฉพาะยน HbPR-4 และ HbPR-5 ค ำหลก: Rigidoporus microporus, โรครากขาว ยางพารา, PR genes, การแสดงออกของยน, ตนตอยาง

(2)

Abstract

Rigidoporus microporus is an important fungal pathogen of Hevea brasiliensis

Muell. Arg. (rubber tree) which is the causative agent of white root disease and kills rubber trees. Study on the molecular mechanism of antifunfal genes and defend machanism involved in systemic aquire resestance (SAR) are important for selection rubber rootstock tolerant to the white root disease. In the present study, cDNA of antifungal genes (HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5) was isolated from Hevea brasiliensis Muell. Arg and their properties were investigated. It was found that the ORF is 492 bp with a deduced amino acid sequence of 163 residues and encodes a 163-amino acid protein with a deduced molecular weight of 17.69 kDa and an isoelectronic point (pI) is 8.57. The partial gene of HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 were isolated with 1120, 390, 233 and 517 bp, respectively. Gene expression levels of pathogenesis-related proteins (HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5) were compared in five Hevea brasiliensis seedlings from various clones including PB5/51 (tolerate to the white root disease), BPM 24, RRIM600, Bangrak and PSU1 after inoculation at 0, 12, 24, 48, 72 and 96 hr with the white rot fungus, Rigidoporus microporus using Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR). Five genes were found at the highest up-regulated after inoculation in seedlings of PB5/51, particular HbPR-4 and HbPR-5 in response to the pathogen when compared with other clones. HbPR-1, HbPR-4 and HbPR-5 were upregulated in BPM 24 but slow down at 48 hr. after inoculation. In RRIM600, high expression level of HBPR-1, HbPR-3 and HbPR-5 genes was observed initially and gradually decrease post-inoculation 48 hr. The expression level of antifungal genes in seedlings from Bangrak and PSU1 clones was downregulated when compared with other clones. The results demonstrated the variability in gene expression profiles in different clones of rubber tree. The candidate defense genes to the white root disease were observed in PB5/51 seedlings, particular HBPR-4 and HBPR-5. Key words: Rigidoporus microporus, white root disease, rubber tree, PR genes, gene expression, rubber rootstock

(3)

สำรบญ

เรอง หนำ บทคดยอ (1) Abstract (2) สารบญตาราง (4) สารบญรป (5) คาอธบายสญลกษณและคายอทใชในการวจย (7) 1. บทนา 1

วตถประสงค 3 2. การตรวจเอกสาร 4 3. วสด อปกรณ และวธการทดลอง 22 4. ผลการทดลอง 35 5. วจารณผลการทดลอง 65 6. สรปผลการทดลอง 70 เอกสารอางอง 73 ภาคผนวก 81

(4)

สำรบญตำรำง

ตำรำงท หนำ

ตารางท 1 กลมของโปรตน PRs 12

ตารางท 2 กลมของโปรตน PR-2 16

ตารางท 3 ชอสารเคมเกรดวเคราะหและบรษทผผลต 22

ตารางท 4 ชอสารเคมเกรดอณชววทยาและบรษทผผลต 23

ตารางท 5 สารทใชในการสงเคราะหสาย cDNA 26

ตารางท 6 สารทใชในการสงเคราะหสาย cDNA 26

ตารางท 7 การออกแบบ Degenerate primers 27

ตารางท 8 specific primers ทใชในการทา qRT-PCR 34

(5)

สำรบญรป

รปท หนำ

รปท 1 ลกษณะใบ ผล ชอดอกของยางพารา 4

รปท 2 วงจรการเกดโรครากขาวในยางพารา 7

รปท 3 ลกษณะของเชอรา R. microporus 9

รปท 4 เชอ R. microporus บนอาหาร PDA 32

รปท 5 แสดงตวอยางตนกลายางพาราทปลกถายเชอ R. microporus 33

รปท 6 Total RNA ทสกดดวย Extraction buffer 35

รปท 7 ลาดบเบสบางสวนของยน HbPR-1 36

รปท 8 PCR product ทไดจาการทา 5’และ 3’RACE ของยน HbPR-1 37

รปท 9 การวเคราะหยนเสนสมบรณของยน HbPR-1 38

รปท 10 การ alignment โดยใช ClustalX ของยน HbPR-1 ในยางพารา 39

รปท 11 conserved domain ของโปรตน HbPR-1 40

รปท 12 การ alignment ลาดบกรดอะมโนของโปรตน HbPR-1 41

รปท 13 PCR product ทไดจากการทา PCR ของยน HbPR-2 42

รปท 14 ลาดบนวคลโอไทดบางสวนของยน HbPR-2 43

รปท 15 ลาดบกรดอะมโนของยน HbPR-2 ทเรมแปลรหสได 44

รปท 16 ผลการทา sequence alignment โดยใช Clustal-X alignment ของยน HbPR-2 45


รปท 18 ผลการทา sequence alignment ของโปรตน HbPR-2 จากยางพารา 47



รปท 21 ลาดบกรดอะมโนบางสวนของโปรตน HbPR-3 50


รปท 23 ผลการทา sequence alignment ของโปรตน HbPR-3 จากยางพารา 51


(6)

รปท หนำ



รปท 27 ตาแหนงของ Barwin domain ทไดจากการ blastp ของโปรตน HbPR-4 54

รปท 28 ผลการทา sequence alignment ของโปรตน HbPR-4 55




รปท 32 ตาแหนงของ GHG4-TLP-SF domain ทไดจากการ blastp ของโปรตน PR-5 58

รปท 33 ผลการทา sequence alignment ของโปรตน HbPR-5 59

รปท 34 การแสดงออกของยน HbPR-1 และ HbPR-3 ในเนอเยอตาง ๆ ของยางพารา 60

รปท 35 การแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 63

ในยางพาราโคลน PSU1, Bangrak, PB5/51, RRIM600 และ BPM24 ดวยเทคนค qRT-PCR โดยใช specific primer และ 18S rRNA เปน internal control หลงจากปลกถายเชอ R.microporus ทเวลา 0, 12, 24, 48,

72 และ 96 ชวโมง โดย ก: การแสดงออกของยน HbPR-1,

ข: การแสดงออกของยน HbPR-2, ค: การแสดงออกของยน HbPR-3,

ง: การแสดงออกของยน HbPR-4 และ จ: การแสดงออกของยน HbPR-5

รปท 36 แนวโนมการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ 64

HbPR-5 ในตนกลายางพาราอาย 2 เดอนหลงจากปลกถายเชอรากอโรครากขาว

(R. microporus) เปนเวลา 0, 12, 24, 48, 72 และ 96 ชวโมง

(7)

สญลกษณค ำยอและตวยอ

α = alpha bp = base pairs ß = beta EDTA = ethylenediaminetetraacetic acid h = hour kDa = kilodalton pH = -log hydrogen ion concentration Tm = melting temperature ml = milliliter mM = millimolar O.D. = optical density % = percent SDS = sodium dodecyl sulphate Tris-HCl = Tris (hydroxymethylaminomethane) hydrochloride v/v = volume per volume w/v = weight per volume UV = ultraviolet

1

บทน ำ

ยางพารา (Hevea brasiliensis Muell Arg.) เปนพชทนารายไดเขาสประเทศจานวนมากจงม

ความสาคญตอเศรษฐกจและชวตความเปนอยของประชากรไทยเปนอยางมาก อยางไรกตามประเทศไทยมลกษณะภมอากาศเปนแบบรอนชน ซงเหมาะสมกบการเจรญเตบโตของเชอโรคตางๆ ทาใหเกดปญหาการแพรระบาดของโรคตางๆ ไดงาย โรคสาคญในยางพาราไดแก โรคใบรวงทเกดจากเชอไฟทอปธอรา โรคใบจดกางปลา โรคเสนดา และโรครากขาว เปนตน โดยเฉพาะโรครากขาวในปจจบนพบวามการระบาดเพมขนมาก ทาใหเกษตรกรตองสญเสยทงผลผลตและรายได อกทงมการใชสารปองกนในการแกปญหาเป นผลให เกดภาวะสารตกคางในสภาพแวดลอม โรครากขาวมสาเหตมาจากเชอรา Rigidoporus microporus เชอราโรครากขาวสามารถเขาทาลายรากยางพาราไดทกระยะการเจรญเตบโต ตงแตอาย 1 ปขนไป ในระยะเรมแรกจะไมเหนลกษณะผดปกตของตนยางพาราสวนทอยเหนอพนดน เมอสวนรากถกทาลายเสยหายจนไมสามารถดดนาและธาตอาหารได จงแสดงอาการใบเหลองและใบรวง สาหรบตนยางเลกทเปนโรค พมใบทงหมดจะมสเหลองผดปกต ถาเปนตนยางใหญ พมใบบางสวนจะดเสมอนวาแกจดและเหลอง ซงจะแตกตางกบสเขยวเขมของพมใบตนยางทส มบรณอยางเหนไดชด ขอมลจากกรมวชาการเกษตรพบวาหากรวมความเสยหายจากโรครากขาวในพนทปลกยางภาคใตของประเทศไทยทงหมดในป 2551-2553 คาดวามความเสยหายเปนมลคาไมนอยกวา 1 ,600 ลานบาท และภายใน 10 ปคาดวาประเทศไทยจะสญเสยรายไดจากยางพาราไมตากวา 50,000 ลานบาท (อารมณ, 2553)

เมอพชสมผสกบเชอรา แมวาพชไมมระบบสรางภมคมกนแบบเดยวกบมนษย แตพชกสามารถสรางกลไกการปองกนตวเองโดยการสรางสารชวโมลกลนาหนกโมเลกลตา ซงเรยกวาไฟโตอเลกซน (Phytoalexins) เปปไทดตานจลชพ (antimicrobial peptides) และโปรตนโมเลกลขนาดเลก (small proteins) เชน thionins, defensins , hevein-like proteins และ knottin-like peptides (Bloch et al., 1998; Broekaert et al., 1995; Florack and Stiekema, 1994; Segura et al., 1993) รวมทงมการแสดงออกของโปรตนตานจลชพเพมสงขนดวย (antimicrobial proteins) เรยกโปรตนในกลมนวา pathogenesis-related (PR) proteins ซงโปรตนในกลมนเมอจาแนกตามซรมวทยาและลาดบกรดอะมโนสามารถแยกออกเปน 5 กลม ไดแก PR-1, PR-2, PR-3, PR-4 และ PR-5 (Segura et al., 1993; Selitrennikoff, 2001) โดยโปรตนเหลานมสมบตในการตานเชอรา (Antifungal protein) (Gun Lee et al., 1999; Guo et al., 1999; Wnendt et al., 1994)

โดยทวไปพชสามารถชกนาระบบการปองกนตนเองใหมการตานทานโรคเพมขนได โดยการใชตวกระตนทเปนสงมชวต หรอสารทมาจากเชอโรค หรอมาจากการทาปฏกรยาระหวางพชอาศยกบเชอ

2

โรค และสงไมมชวต ในขนตนพชมระบบปองกนตวเองเชงกายภาพ นนกคอมชนควตเคลปองกนไมใหเชอกอโรคเขามารกราน โดยมสารควตน (Cutin) แวกซ (Wax)และซเบอรน (Suberin) เคลอบอย

นอกจากนพชยงมการปองกนตนเองทางชวเคม เรยกวา hypersensitive response (HR) เมอการรกรานของเชอประสบความสาเรจ พชจะมการตอบสนองโดย receptor ทรบรถงการบกรก และกระตนใหมการสราง reactive oxygen species ซงไดแก O2 radical hydrogenperoxide และ hydroxyl radicle สงผลใหบรเวณทมการตอบสนองมการตายของเซลลเกดขน ชวยในการทาลายแหลงอาหาร และยบยงการแพรกระจายของเชอ เรยกกระบวนการนวา programmed cell death กระบวนการดงกลาวยงตองอาศยสารสญญาณอกชนดหนงคอ NO (nitric oxide) เมอภายในเซลลม NO และ reactive oxygen species เกดขน (Gao et al., 2015; Torres et al., 2006) จะกระตนใหเกดการสงเคราะหเอนไซมตาง ๆ ททาหนาทในวถการสงเคราะหสารปกปอง เชน ลกนน ไฟโตอเลกซน และกรดซาลไซลกซงชวยปองกนและทาลายเชอโรค กระบวนการทางชวเคมทชกนาใหพชเกดการตานทานโรคไดสวนหนงเกดจากการกระตนใหมการผลตโปรตนหรอสารเคมทยบยงการเจรญเตบโตของเชอโรคไดโดยผานกระบวนการสาคญทเรยกวา Systemic Acquired Resistance (SAR) (Conrath, 2006; Ryals et al., 1995)

ระบบ SAR เปนกระบวนการทเกดขนหลงจากทไดรบสารสญญาณทมาจาก hypersensitive response ซงมโมเลกลสงสญญาณคอ salicylic acid สญญาณดงกลาวจะไปกระตนใหเกดการสงเคราะหสารทตยภม (secondary metabolite) ซงกระบวนการนจะเกดขนหลงกระบวนการตดเชอ และพชสามารถรอดตายจากการตดเชอนนการควบคมกลไกตาง ๆ นนถกกาหนดโดยยนทเรยกวา PR genes ซงจะเปนตวกาหนดควบคมความตอบสนองตอเชอ และกระบวนการตอตานเชอ PR genes นนพบไดหลายชนดในตนเดยว และมกจะอยเปนชด ๆ ผลผลตของ PR genes สวนหนงจะกระจายไปอยตาม membrane เพอเปน receptor เมอมการเกาะของเชอ หรอกระจายอยใน cytoplasm เพอตอบสนองตอโมเลกลของเชอทเกดมาจากการรกราน ระบบ SAR นสามารถชกนาใหเกดการตานทานโรคของพชบางชนดโดยไมจาเพาะเจาะจงกบเชอโรคชนดใดชนดหนง และมความตานทานทงบรเวณทถกบกรกโดยตรง และบรเวณทไกลออกไปทไมไดสมผสกบเชอโรค ระบบ SAR สามารถคงอยไดเปนระยะเวลานาน สงผลใหพชนนมความทนทานตอเชอบกรกหลายๆ ชนดไดในระยะหนง (Van Loon et al., 2006) โปรตน PRS มกถกใชเปนเครองหมายบงบอกภาวะการเกดระบบ SAR เนองจาก SA ทเปนโมเลกลสงสญญาณในระบบ SAR จะสงสญญาณกระตนโปรตน NPR1/NIM1 ทควบคม transcription factor ของยน PR-1 แลวเกดการสรางโปรตน PR-1 เปนจานวนมาก (Fu and Dong, 2013; Van Loon and Van Strien, 1999) ดงนนการศกษาการแสดงออกของยนทเกยวของกบการผลตโปรตนทมฤทธตานทานเชอราและเกยวของกบการตานทานโรคในระบบ SAR เพอเปนขอมลพนฐานในการชกนาการตานทานโรคในตน

3

กลายางพาราและการคดเลอกตนตอยางพาราจงเปนประเดนทนาสนใจ โดยศกษายน PRs ซงเปนเครองหมายสาหรบบงบอกการเกดระบบ SAR ในยางพารา ทงในแงของการศกษาการแสดงออกของยน PRs เมอผานการกระตนโดยเชอกอโรครากขาวของยางพารา และการแสดงออกของยน PRs ในเนอเยอตางๆ ของยางพารา เพอหาความสมพนธระหวางยน PRs และความสามารถในการตานทานโรคของยางพาราแตละพนธ สาหรบเปนขอมลพนฐานในการศกษาตอ และเปนแนวทางในการแกปญหาสาคญทพบในการผลตยางพาราตอไป

วตถประสงคของโครงกำรวจย

ศกษาการแสดงออกของยนในกลม pathogenesis-related proteins (PRs) ในรากยางพาราททนทานและพนธออนแอตอโรครากขาว เมอถกปลกเชอดวยเชอ R. microporus

4

กำรตรวจเอกสำร

1. ยำงพำรำ ประเทศไทยมพนทปลกยางพาราทงหมดประมาณ 16.89 ลานไรโดยกระจายอยในภาคใตรอยละ 90 สวนทเหลออกรอยละ 10 กระจายอยในภาคตะวนออก ตะวนออกเฉยงเหนอและภาคเหนอ ในพนทปลกจานวนดงกลาวเปนพนททเปดกรดแลวประมาณ 10.53 ลานไร สามารถสรางอาชพทมนคงใหเกษตรกรมากกวา 6 ลานคน หรอประมาณ 1 ลานครวเรอน (กรมวชาการเกษตร, 2553) ดงนนการพฒนางานวจยทเกยวของกบยางพาราจงเปนประโยชนในการเพมผลผลตใหกบเกษตรกรเปนอยางมาก ยางพารามชอวทยาศาสตรวา Hevea brasiliensis Muell. Arg. เปนพชใบเลยงคมลกษณะใบ ผล ชอดอกและตนกลาดงรปท 1 ยางพาราเปนไมยนตนขนาดใหญทมอายยนยาวหลายสบปมถ นกาเนดอยบรเวณลมนาอเมซอนประเทศบราซลและประเทศเปรในทวปอเมรกาใต จดอยในสกล Hevea วงศ Euphorbiaceae มโครโมโซม 2n = 2x = 36 โดยพชสกล (Genus) Hevea มจานวนทงหมด 10 ชนดดวยกน (Wycherley, 1992 อางโดย อารมณ, 2541) โดย H. brasiliensis มคณสมบตใหผลผลตนายางสง และสามารถปรบตวเขากบสภาพแวด ลอมไดดทสด จงมการนามาปลกและแพรกระจายเขามายงทวปเอเชย โดยเฉพาะประเทศไทย มาเลเซย และอนโดนเซย เปนตน ลกษณะทางพฤกษศาสตรยางพาราดงแสดงในรปท 1

รปท 1 ลกษณะใบ ผล ชอดอกของยางพารา

5

2. โรคยำงพำรำทพบในประเทศไทย

ยางพาราเปนไมยนตนทเกษตรกรมกประสบปญหาเรองโรคระบาดในระยะใดระยะหนงของการทาสวนยางพารา ซ งสามารถเกดข นไดในทกระยะการเจรญเตบโตและพบไดในทกสวนของยางพารา โรคยางพาราทระบาดในประเทศไทยสวนใหญมสาเหตมาจากเชอรา สามารถจาแนกไดตามสวนตางๆ ของยางพาราทถกเชอราเขาทาลายไดแกใบ กงกาน ลาตนและราก โดยเชอราดงกลาวสามารถอาศยอยขามฤดและปนอยกบซากพชทเคยเปนโรค เศษอนทรยวตถในดน หรออยบนพชอาศยบางชนดตวอยางโรคทเกดในยางพารา (สถาบนวจยยาง, 2553) ตวอยางโรคในยางพารามดงตอไปน 2.1 โรคใบจดตำนก (bird’s eye spot)

มกพบในแปลงกลายางพาราทปลกไวเปนตนตอ มสาเหตมาจากเชอรา Drechslera heveae

2.2 โรครำแปง (powdery mildew) ระบาดบนใบยางพาราออนทแตกออกมาใหมภายหลงจากการผลดใบประจาปจง

เปนสาเหตใหใบยางพารารวงและกงแขนงบางสวนอาจแหงตายไป โรคราแปงมสาเหตมาจากเชอรา Oidium heveae 2.3 โรคเสนด ำ (black stripe)

เปนโรคทางลาตนทมความสาคญมากโรคหนง เนองจากเชอจะเขาทาลายหนากรดยางพาราซงเปนบรเวณเกบเกยวผลผลต จงไมสามารถกรดยางพาราซาบนเปลอกทงอกใหมทาใหระยะเวลาการให ผลผล ตส นลงและได น ายางพาราท น อยลง ซ ง โรคน ม สา เหต มาจากเช อ Phytophthora botryosa และ P. palmivora

2.4 โรคใบรวงจำกเชอไฟทอปธอรำ (Phytophthora leaf fall) มกระบาดในชวงฤดฝนเช อ Phytophthora จะเขาทาลายสวนตางๆ ของตน

ยางพาราทงใบ ฝก กงกานและหนากรดยางพารา ฝกทถกทาลายจะเนาและเปนสดาคางอยบนตนยางพารา ไมแตกและรวงหลนตามธรรมชาตกลายเปนแหลงพกของเชอทสาคญ โรคนมสาเหตมาจากเชอ Phytophthora botryosa, Phytophthora palmivora และ Phytophthora parasitica var. nicotianae

2.5 โรคใบจดนน (Colletotrichum leaf spot) เกดจากเชอรา Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. ใบออนทถก

เชอเขาทาลาย ปลายใบจะบดงอ เหยวเนาดาและหลดลวง ในระยะใบเพสลาด ใบบางสวนอาจบดงอและพบจดแผลสนาตาล ขอบแผลสเหลอง ขนาดประมาณ 1-2 มม. เมอใบมอายมากขน เนอตรงกลางแผลอาจทะลเปนร ถาระบาดรนแรงอาจพบแผลบนกงออนหรอยอดออน และทาใหเกดอาการตายจาก

6

ยอดได ระบาดรนแรงกบยางทแตกใบออน ในชวงทฝนตกชก ความชนสง เชอแพรระบาดโดยนาฝน ลมและแมลง

2.6 โรคใบจดกำงปลำ (Corynespora leaf) เกดจากเชอรา Corynespora cassiicola ใบออนแสดงอาการเปนแผลจดกลม

ขอบแผลสนาตาลดา กลางแผลสซดหรอเทา ถารนแรงใบจะบดงอและรวง ระยะใบเพสลาดแผลจะกลมทบสนาตาลหรอดา ขอบแผลสเหลองและขยายลกลามเขาไปตามเสนใบ ทาใหแผลมลกษณะคลายกางปลา เนอเยอบรเวณรอยแผลมสเหลองถงนาตาลและใบรวงในทสด ถาเชอเขาทาลายสวนของกานใบ กงแขนงและลาตนทเปนสเขยวจะเปนแผลสดามลกษณะยาวร เนอเยอตรงกลางแผลบมลง ถาอากาศเหมาะสมจะขยายขนาดและลกลาม ทาใหกงหรอยอดทเปนโรคแหงตาย

2.7 โรครำกขำว (White root disease) โรครากขาวยางพารา (White root disease) เกดจากเชอรา Rigidoporus

microporus (Sw.) เชอราโรครากขาวสามารถเขาทาลายรากยางพาราไดทกระยะการเจรญเตบโต ตงแตอาย 1 ปขนไป ในระยะเรมแรกจะไมเหนลกษณะผดปกตของตนยางพาราสวนทอยเหนอพนดน เมอสวนรากถกทาลายเสยหายจนไมสามารถดดนาและธาตอาหารได จงแสดงอาการใบเหลองและใบรวง สาหร บตนยางเลกทเปนโรค พมใบทงหมดจะมสเหลองผดกต ถาเปนตนยางใหญ พมใบบางสวนจะดเสมอนวาแกจดและเหลอง ซงจะแตกตางกบสเขยวเขมของพมใบตนยางทสมบรณอยางเหนไดชด

2.7.1 ลกษณะอำกำรของโรครำกขำว เมอระบบรากถกทาลายมากขน จะแสดงอาการใหเหนททรงพม ซงเปนระยะท

รนแรงและไมสามารถรกษาได บรเวณรากทถกเชอเขาทาลายจะปรากฏกลมเสนใยสขาวเจรญแตกสาขาปกคลม และเกาะตดแนนกบผวราก เมอเสนใยอายมากขนจะกลายเปนเสนกลมนนสเหลองซด เนอไมของรากทเปนโรคในระยะแรกจะแขงกระดางเปนสนาตาลซด ในระยะรนแรงจะกลายเปนสครม ถาอยในทชนแฉะจะออนนม ดอกเหดมลกษณะเปนแผนครงวงกลมแผนเดยวหรอซอนกนเปนชนๆ ผวดานบนเปนสเหลองสม โดยมสเขมออนเรยงสลบกนเปนวง ผวดานลางเปนสสมแดงหรอสนาตาล ขอบดอกเหดเปนสขาว (Louanchi et al., 1996) แตในพชทยงเปนตนออนหรออายนอยตองใชความเชยวชาญพเศษในการตรวจพบ (Guyot and Flori, 2002)

2.7.2 กำรแพรระบำดของโรครำกขำว เชอราเจรญเตบโตและระบาดอยางรวดเรวในชวงฤดฝน อากาศมความชนสง และสามารถแพรกระจายได 2 ทาง คอ 1. โดยการสมผสกนระหวางรากทเปนโรคกบรากจากตนปกต ทาใหเชอเจรญลกลามตอไป

7

2. โดยสปอรของเชอราปลวไปตามลม ตดไปกบขาแมลง หรอลอยไปตามนา แลวไปตกบนบาดแผลของตอยางใหม เมอมความชนเพยงพอจะเจรญลกลามไปยงระบบรากกลายเปนแหลงเชอโรคแหลงใหมตอไป 2.7.3 วงจรกำรเกดโรครำกขำวในยำงพำรำ การเขาทาลายตนยางพาราของโรครากขาวเรมตนจากตนตอของยางพาราทเคยเปนโรคแพรกระจายโรคไปยงตนยางพาราตนอนๆ ดงแสดงในรปท 2 โดยเมอเชอแพรกระจายไปยงตนยางตนอนๆ จะเกดกลไกการเขาทาลายตนยางดวยกระบวนการทสาคญ 3 กระบวนการ ไดแก Penetration, Colonization และ Degradation (Omorusi, 2012)

รปท 2 วงจรการเกดโรครากขาวในยางพารา ทมา: Omorusi (2012)

8

2.7.3 พชอำศยของเชอโรครำกขำว

พชอาศยของเชอรา R. microporus มหลายชนด ไดแก ทเรยน ขนน จาปาดะ มงคด มะพราว ไผ สม โกโก ชา กาแฟ เนยงนก พรกไทย พรกขหน นอยหนา มนสาปะหลง สะเดาบาน สะเดาเทยม ทง มะเขอเปราะ กระทกรก มนเทศ นอยหนา ลองกอง (เสมอใจ, 2552)

3. เชอรำ Rigidoporus microporus

เชอรา Rigidoporus microporus เปนเชอราจาพวกเหดชนสง มกระบาดในชวงฤดฝน เมอรากยางปลกใหมไปสมผสกบแหลงแพรเชอดงกลาว จะทาใหรากตดเชอและลกลามเขาสรากแกว ทาใหตนยางเปนโรคตาย สามารถจาแนกอนกรมวธานของเชอได ดงน

Kingdom: Fungi

Phylum: Basidiomycota

Class: Basidiomycetes

Subclass: Agaricomycetidae

Order: Polyporales

Family: Meripilaceae

Genus: Rigidoporus

Species: R. microporus

เสนใยของเชอราสาเหตของโรคนจะแตกสาขา เปนรางแหจบตดแนน และแผคลมทวผวรากทเปนโรค เสนใยจะมสขาว และปลายแบน (แตถาเสนใยสขาวสานกน และหลวมจะไมใชเสนใยของเชอสาเหต) เมอเสนใยแกจะนนกลม และมสเหลองจนถงนาตาลแดงซด (Kaewchai et al., 2010) เนอไมทเปนโรคจะม สขาวหรอครม และแขงกระดาง ดงแสดงในรปท 3 แตถาอยในดนทชนแฉะจะเหลวเละ ดอกเหดจะเกดในระยะทมฝนตกตรงบรเวณโคนตนทเปนโรค หรอสวนรากทโผลพนผวดน และเกดซอนกนหลายชน ผวบนของ ดอกเหดจะมสเหลองสม ขอบขาว ผวลางมสสมแดงหรอสนาตาล เมอตดดอกเหดตามขวางจะเหนชนบนเปนสขาว และชนลางเปนสนาตาลแดงอยางชดเจน เชอโรคสามารถแพรกระจาย

9

ไดดวยการสมผสระหวางรากทเปนโรคกบรากของตนขางเคยงลกลามตอไป ทงในระหวางตนและระหวางแถวยาง นอกจากนสปอรเชอรายงแพรกระจายไดโดยนา ลม และแมลง สามารถเขาทาลายตนยางทางบาดแผล ทาใหตนยางเปนโรคและเปนแหลงแพรเชอใหม

รปท 3 ลกษณะของเชอรา R. microporus Colony on PDA at 6 days (a): โคโลนทเลยงบนอาหาร PDA เปนเวลา 6 วน , (b): เสนใย (hypha), (c): ผวดานบนของดอกเหด (fruiting body), (d): ผวดานลางของดอกเหด, (e): ลกษณะรบรเวณผวดานลางของดอกเหดซงเปนทอยของสปอร, (f): การสรางเสนใย, (g): hymenium และ (h): basidiospores

ทมา: (Kaewchai et al., 2010)) 4. กลไกกำรตอบสนองของพชตอเชอกอโรค ความตานทานโรคทเกดขนในพช สามารถจาแนกได 2 ประเภท ขนอยกบการเหนยวนา และกลไกของความตานทานของพช ไดแก ความตานทานทมอยแลวในพช (constitutive resistance) และ ความตานทานทพชถกเหนยวนาใหสรางขน (induced resistance) เมอพชถกรกรานจากเชอโรค พชสามารถตอบสนองตอเชอโรคโดยมกลไกการปองกนตนเองจากเชอโรคได 2 ทางไดแก กลไกการปองกนตนเองทางโครงสรางของพช และทางชวเคม (Marques et al., 2015) ดงน

10

4.1 กลไกทำงโครงสรำงของพช (Structural or morphological defense

mechanism) เปนกลไลทางโครงสรางของพชทมตามธรรมชาตทจะปองกนไมใหเชอผานเขาสพชไดอยางงายดาย เกดขนไดทงกอนและหลงการตดเชอ โครงสรางของพชทมกอนการตดเชอ เชนการทพชสรางแวกซทเคลอบผวไวซงจะปองกนการเกาะตดของนาทเปนแหลงสะสมของเชอ การมชนควตเคลหนาจะชวยใหพชทนตอการถกเชอเจาะได นอกจากนขนาด ตาแหนงทอย และรปรางของปากใบ มความสาคญตอเชอทสามารถทาใหพชตดโรคผานทางปากใบ รวมทงความหนาของผนงเซลลทจะปองกนการงอกของสปอรของเชอราซงจะเปนเกราะปองกนของพชทางโครงสรางอกชนหนง นอกจากนยงมโครงสรางทเกดขนหลงจากการตดเชอ ซงจะมการผลตขนหลงจากพชถกกระตนดวยเชอโรค เนองจากเชอโรคหลายชนดจะมการปลอยสารเคมทไมจาเพาะ เชน การผลตสารพษตางๆ สารพวกไกลโคโปรตน รวมทงเอนไซมของจลนทรยตางๆ ไดแกเอนไซมโปรตเอส เปนตน ซงสารเคมดงกลาวนจะถกพชจดจาและทาใหมการสงสญญาณไปยงตวรบเพอใหพชเกดการสรางระบบการปองกนตนเองขน เชน การทพชผลตเซลลโลสเพอสรางผนงเซลลใหหนาขน ทาใหพชมความทนทานตอการแพรกระจายของเชอมากขน รวมทงการสะสมแคลโลสบรเวณผนงเซลลชนในของพช เชอโรคจงไมสามารถแทรกตวเขามาภายในเซลลได การสราง cork layers หรอเซลลทเจรญเปนชนๆ สามารถยบยงการบกรกของเชอและปองกนการแพรกระจายของเชอได การปรแตกของเนอเยอ (abscission regions) เพอปองกนการกระจายเปนวงกวางของเชอ การสะสมยางเหนยว (gums) ทาใหเชอโรคบางชนดหยดการเจรญเตบโตและตายไปในทสด รวมทงการเกด hypersensitive cell death ซงเปนการตอบสนองโดยการตายอยางรวดเรวของพชบรเวณทตดเชอทาใหเชอไมสามารถแพรกระจายไปยงเซลลและเนอเยอขางเคยงได โดยจะสงเกตเหนเปนรอยไหมสนาตาลอยางชดเจน (Marques et al., 2015; Meyers, 1995)

4.2 กลไกทำงชวเคม (Biochemical defense mechanism)

แมวาพชจะมการปองกนตวเองโดยโครงสรางของพชเองแลว แตเชอโรคตางๆ กยงสามารถรกรานเขาไปในพชไดอยางไรกตามพชยงมการปองกนทางชวเคมอกทางหนง นนคอการผลตสารทมความเปนพษตอเชอ และยบยงไมใหเชอแพรกระจายลกลามในตนพชได สามารถเกดขนไดทงกอน และหลงการตดเชอเชนเดยวกบการปองกนทางโครงสราง สารเคมทพชผลตขนกอนการตดเชอ เชน ในมะเขอเทศและบทรทจะมการผลตสารหลงทเปนพษตอเชอโรค ซงจะสามารถยบยงการงอกของซโอสปอรของเชอโรคไดหรอในพชบางชนดจะมการผลต phytoanticipins กอนทพชจะมการตดเชอ รวมทงยงผลตสารประกอบฟนอลกตางๆ ดวย (Agrios, 1997) หรอในบางกรณสารทพชหลงออกมาเปนปกตอยแลว กอาจมความเปนพษตอเชอโรคไดเชนเดยวกน เชน ไดอน (dienes) เปนสารประกอบทคลายกรดไขมนชนดหนงจะมการผลตในปรมาณสงในเซลลของใบ และผลออนสงผลใหใบและผลออนนนมความตานทานตอ

11

เชอมากกวาเซลลทแกกวา สวนสารเคมทพชผลตขนภายหลงจากการตดเชอ เชน ไฟโตอเลกซน (phytoalexins) ซงเปนสารปฏชวนะทเปนพษตอเชอกอโรค ในยางพารามการศกษากลไกการตอบสนองตอเชอเปนครงแรกโดย Tan และ Low (1975) โดยพบการเกดสารเรองแสงภายใตแสง UV ในเนอเยอใบ ภายใตการตอบสนองตอเชอรา Colletotrichum gloeosporioides สารประกอบดงกลาวยงถกชกนาใหมการผลตขนในยางพาราหลงจากตดเชอ Microcyclus ulei ดวย และพบวาสารเรองแสงดงกลาวคอ hydroxycoumarin ใหชอวา สคอพอลตน (Giesemann et al., 1986) ซงเปนไฟโตอเลกซนชนดหนง พนธวศร (2547) บมแคลลสยางพาราพนธ GT1 (คอนขางตานทาน) และพนธ RRIM600 (พนธออนแอ) ดวยซโอสปอรของเชอ P. palmivora พบวาซโอสปอรสามารถกระตนแคลลสใหมการสงเคราะหสคอพอลตนในพนธ GT1 มากกวาพนธ RRIM600 โดยปรมาณและอตราเรวในการสงเคราะหสคอพอลตนแปรผนตรงกบระดบความตานทานโรคของยางพารา นอกจากนยงมการเกด hypersensitive cell death ซงเปนปฏกรยาของกลไกปองกนโรคทสาคญมากทสดแบบหนง ในทางชวเคมการเกด hypersensitive cell death จะมการปลอยสารพษทจะทาใหเนอเยอบรเวณทตดเชอตายอยางรวดเรว ซงทาใหเชอตายลงเชนเดยวกน นอกจากนยงมการปลอยสารยบยงการเจรญของเชอ เชน pathogenesis-related proteins (PRs) เพอปองกนการแพรขยายเปนวงกวางของเชออกดวย

5. Pathogenesis-related proteins (PRs)

PR protein เปนโปรตนขนาดเลกทมขนาดมวลโมเลกล 10–40 กโลดาลตน ซงพชผลตขนภายหลงจากถกกระตนดวยเชอโรค หรอภาวะเครยดตางๆ (Antoniw et al., 1980) เชน ความเครยดจากสารเคมและฮอรโมนพชบางชนด รวมทงการเกดบาดแผลและการกระตนจากอลซเตอรตางๆ เพอปองกนอนตรายใหกบตนเอง ซงเมอพชผลตโปรตนชนดนแลว จะมความเปนพษตอเชอโรคทมารกราน PR proteins จะถกสะสมนอกเซลลในขณะทพชตดเชอ โดยโปรตนนจะทนทานตอ proteolytic degradation ไดด และโปรตนนมกจะมคา isoelectric point สง การผลต PRs ในพชนนไมใชเพยงแตจะผลตเพอปองกนเชอโรคบรเวณทถกรกรานโดยตรงเทานน แตยงมความสมพนธกบการเกดระบบ SAR อกดวย (Van Loon and Van Strien, 1999) ดงนนโปรตนกลมนจงมบทบาทสาคญตอพชในการปองกนตนเองจากเชอโรค รวมทงมความสาคญตอการปรบตวเพอการดารงชวตของพชในสภาพแวดลอมทไมเหมาะสมได (Edreva, 2005) สาหรบโปรตน PRs นน พบไดทกสวนของตนพช ทง ใบ ลาตน ผล และดอก (Van Loon, 1999) แตทใบจะมการสะสมมากกวา สวนอนๆ โดยจะพบ PR-proteins ประมาณ 5-10% ของโปรตนทพบทใบ

โปรตน PRs มกถกแบงกลมตามหนาท ลาดบกรดอะมโน ความสมพนธทางซรมวทยา (serological relationship) รวมทงนาหนกโมเลกลของโปรตนนนๆ ในปจจบนสามารถจดแบง PRs ออกเปน 17 กลมดงแสดงในตารางท 1 และไดมการระบคณสมบตตางๆ โดยพบวา PR1-PR5 นน

12

เกยวของกบการผลต antifungal protein (Antoniw et al., 1980; Sels et al., 2008; Van Loon and Van Strien, 1999)

ตารางท 1 กลมของโปรตน PRs Family Type member Typical size

(kDa) Properties

PR-1 Tobacco PR-1a 15 Antifungal PR-2 Tobacco PR-2 30 b-1,3-Glucanase PR-3 Tobacco P, Q 25-30 Chitinase (class I,II,

IV,V,VI,VI) PR-4 Tobacco ‘R’ 15-20 Chitinase class I,II PR-5 Tobacco S 25 Thaumatin-like PR-6 Tomato Inhibitor I 8 Proteinase-inhibitor PR-7 Tomato P69 75 Endoproteinase PR-8 Cucumber chitinase 28 Chitinase class III PR-9 Tobacco ‘lignin-forming peroxidase’ 35 Peroxidase PR-10 Parsley ‘PR1 17 ‘Ribonuclease-like’ PR-11 Tobacco ‘class V’ chitinase 40 Chitinase class I PR-12 Radish Rs-AFP3 5 Defensin PR-13 Arabidopsis THI2.1 5 Thionin PR-14 Barley LTP4 9 Lipid-transfer protein PR-15 Barley OxOa (germin) 20 Oxalate oxidase PR-16 Barley OxOLP 20 ‘Oxalate oxidase-like PR-17 Tobacco PRp27 27 Unknown

13

5.1 PR-1 proteins

โปรตน PR-1 มนาหนกโมเลกลประมาณ 15-17 kDa และมความคลายคลงกบ superfamily ของ cysteine-rich proteins เปนชนดแรกทมการคนพบในใบยาสบทตดเชอไวรสใบยาสบดาง (Tobacco Mosaic Virus) มการสะสมสงขนภายหลงทพชตดเชอและมสมบตเปน antifungal protein โดยไดมการศกษาบทบาทหนาทของโปรตนชนดนทแยกไดจากใบมะเขอเทศหลงตดเชอ Phytophthora infestans พบวาโปรตน P14a, P14b และ P14c ซงเปนโปรตน PR-1 แสดงฤทธตานเชอรา P. infestans โดยยบยงการงอกของ zoospore ในหลอดทดลอง (in vitro) และ ยงทาใหการตดเชอในใบมะเขอเทศ (in vivo) ลดลงอกดวย (Niderman et al., 1995; Tahiri-Alaoui et al., 1993) โปรตน PR-1 มการสะสมอยในพชหลายชนด เชน ขาว ขาวสาล ขาวโพด ยาสบ ขาวบารเลย และ อะราบดอพซส (Selitrennikoff, 2001) และมฤทธตานทานเชอราในระดบไมโครโมลารซงสามารถตานทานจานวนของเชอราทกอโรคในพชโดยรวมถงเชอรา Uromyces fabae, P. infestans, และ Erysiphe graminis ดวย (Niderman et al., 1995) ปจจบนนกวทยาศาสตรยงไมสามารถระบบทบาทและหนาทของโปรตน PR-1 ตอการทางานในเซลลและโมเลกลเปาหมาย และยงไมสามารถหาปฏสมพนธระหวางโปรตน PR-1 กบโปรตนชนดอนๆ ได ทราบแตเพยงวามการกระตนใหมการสรางโปรตน PR-1 เพมขนเปนจานวนมากเมอพชตดเชอ เกดบาดแผลหรอไดรบการกดดนจากสงแวดลอม ดงนนการศกษาโปรตนนจงมกอาศยความสมพนธทางซรมวทยาของโปรตน PR-1 จงทาใหสามารถคนหาโปรตนชนดนโดยการใช PR-1 antiserum จากยาสบ เชน การศกษาของ White และคณะ (1987) ใช PR-1a antiserum ในการหาโปรตน PR-1 จากขาวโพด ขาวบารเลย มะเขอเทศ มนฝรง บานไมรโรย มนฝรง (Solanum demissum) และ goosefoot (Chenopodium amaranticolor) นอกจากนการสบคนลาดบนวคลโอไทดของยน PR-1 ผานทางฐานขอมลของ GenBank เพอศกษายอนกลบไปยงโปรตนกยงสามารถทาไดดวย เนองจากกลมยน PR-1 นมบรเวณทมความอนรกษสง (conserved regions) และปรากฏยนนในพชทกชนดเทาทมการศกษากอนหนานรวมทงยงพบโปรตน homologous PR-1 ไดในสงมชวตอนๆ ดวย เชน ยสต แมลงและสตวมกระดกสนหลง (Van Loon et al., 2006) Sarowar (2005) พบวาลาดบนวคลโอไทดของ cDNA จากพษของแตนชนดหนงแลวมความคลายคลงกบยน PR-1a ในยาสบ การศกษาเกยวกบการแสดงออกของโปรตน PR-1 กลม basic ในพรกไทยหลงจากทดสอบดวย SA และ BABA โดยการฉดพนลงบนตนออนของพรกไทย ผลการทดลองพบวามการแสดงออกของโปรตน PR-1 ในระดบสงเพมขน (Jin Kim and Kook Hwang, 2000) Hong และ Hwang (2002) ศกษาการตอบสนองของโปรตน PR-1 ในมะเขอเทศเมอมการกระตนดวยเชอ P. capsici และวเคราะหผลดวยวธ Western blot พบการแสดงออกของโปรตน PR-1 (นาหนกโมเลกล 17 กโลดาลตน) ในปรมาณสงหลงจากการตดเชอไปแลว 12-24 ชวโมง

14

การวเคราะหโครงสรางของโปรตน PR-1 ในมะเขอเทศ โดยใชเทคนค nuclear

magnetic resonance (NMR) พบวาโครงสรางของโปรตน PR-1 มลกษณะจาเพาะซงประกอบดวย 4

α-helixes และ 4 ß-strands เปนบรเวณทมการอนรกษของกรดอะมโนซสเตอน (conserved

cysteine) จานวน 6 residues เมอเปรยบเทยบกบโปรตน PR-1 จากพชหลายๆ ชนด โครงสราง 4α-

helixes และ 4 ß-strands มการจดเรยงแบบ antiparallel ระหวางเกลยวของ α-helix สวนทเปน

α-helix จะอดตวแนนอยทง 2 ดานของ ß-strand เปนโครงรป α- ß-α sandwich ทาใหมองเหนเปนโครงรปทอดแนน มลกษณะเปน 2 โมเลกล ทมแกนตรงกลาง โครงรปนเสถยรไดดวยพนธะไฮโดรโฟบก (hydrophobic interaction) และพนธะไฮโดรเจนจานวนมาก ดวยเหตนโครงสรางของโปรตน PR-1 จงนาจะทาใหโปรตนชนดนมความเสถยรสงและสามารถทนทานตอการยอยของเอนไซม proteases ได (Fernández et al., 1997) นอกจากนยงมบรเวณทมความอนรกษระหวางโปรตน PR-1 ในพชและโปรตน homologous PR-1 ทพบในสงมชวตชนดอนดวย โดยมบรเวณทมลาดบกรดอะมโนเปน CGHYTQVVW[R/K]X[S/T][V/T][R/S]XGC (Van Loon and Van Strien, 1999) จากการศกษายน PR-1 ในยาสบ (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun-NN) ทตดเชอไวรส สามารถจาแนกโปรตน PR-1 ได 2 กลม คอกลม acidic และ basic โดยมคณสมบตทางชวภาพทแตกตางกน

1) โปรตน PR-1 กลม acidic โปรตน PR-1 กลม acidic ทนาหนกโมเลกลประมาณ 14-16 kDa มการคนพบเปน

ครงแรกในใบยาสบ และพชอนๆ อกหลายชนด เชน มะเขอเทศ ขาวบารเลย ขาวโพด ผกชฝรง และอะราบดอพซส (Gordon-Weeks et al., 1997) จากการศกษาในใบยาสบพบวาประกอบดวยโปรตน 3 กลม ไดแก PR-1a, PR-1b และ PR-1c แบงเปนกลม a b และ c ไดตามการเคลอนทของประจในสนามไฟฟา นอกจากนยงมความสมพนธกนในทางซรมวทยาของโปรตน PR-1 ระหวางพชแตละชนด เมอพจารณาเฉพาะโปรตน PR-1 กลม acidic ของใบยาสบแลว พบวาทง 3 ชนดจะมความคลายคลงกนของลาดบกรดอะมโนมากกวา 90% โปรตน PR-1 กลม acidic ม open reading frame 168 กรดอะมโน ประกอบไปดวย signal peptide 30 กรดอะมโน และ coding sequences 138 กรดอะมโนซงประกอบดวย N-terminal amino acid signal peptide สามารถตรวจพบโปรตน PR-1 กลม acidic ไดบรเวณ extracellular space ของทอลาเลยงนาและแรธาต (xylem) ของใบยาสบทตดเชอ TMV และจะมการสะสมโปรตน PR-1a และ PR-1b กลม acidic นไวใน vacuole 15 (crystal idioblast) ของใบยาสบเพมขนถง 10,000 เทา หรอคดเปน 1-2% ของโปรตนทผลตขนทงหมดภายในใบ (Cornelissen et al., 1986b) นอกจากนยงมรายงานวาผลจากการทาบรสทธโปรตน PR-1a จากถว

15

ลนเตา ทดสอบกบเชอ Uromyces fabae ซงเปนเชอกอโรคใบสนม โปรตนดงกลาวสามารถยบยงการเจรญของเชอชนดนได (Rauscher et al., 1999)

2) โปรตน PR-1 กลม basic โปรตน PR-1 กลม basic มคา isoelectric point (pI) ประมาณ 10.7 ลาดบกรดอะ

มโนของโปรตน PR-1 กลม basic ม open reading frame 177 กรดอะมโน ประกอบดวย N-terminal ทไมชอบนา (hydrophobic) 30 กรดอะมโน ซงทาหนาทเปน signal peptide เพอนาโปรตน PR-1 ไปยง endoplasmic reticulum และดาน C-terminal ประกอบดวย 18 กรดอะมโนทม vacuolar targeting signals (Eyal et al., 1992) และเมอเปรยบเทยบลาดบกรดอะมโนของโปรตน PR-1 ของใบยาสบกลม basic พบวาคลายคลงกบลาดบกรดอะมโนของโปรตน PR-1 กลม acidic 67% Van Loon และ Van Strien (1999) ไดรายงานวาโปรตน P14 ทสกดจากมะเขอเทศมคณสมบตเหมอนกบโปรตน PR-1 กลม basic ทสกดไดจากยาสบ และยงมความสามารถในการยบยงเชอราทงการทดลองแบบ in vitro โดยยบยงการงอกของซโอสปอรและการเจรญของ mycelium ของเชอ P. infestans และแบบ in vivo โดยสามารถลดการตดเชอบรเวณใบของมะเขอเทศได นอกจากน Niderman และคณะ (1995) พบวาม isoform ของ โปรตน PR-1 กลม basic อนๆ อกหลายชนดทมสมบตในการตานเชอราอกดวย

5.2 PR-2 proteins (ß-glucanses) โปรตน PR-2 มบทบาทสาคญในกระบวนการปองกนตวเองของพชจากการเขาทาลาย

ของเชอรา มสมบตเปนเอนไซม ß-1,3 glucanase ซงเปนเอนไซมในกลม hydrolytic enzyme ทาหนาทเปนตวกระตนการยอยสายโพลเมอรของโปรตน ß-1,3 glucans แบบ endo-type โดยอาศยปฏกยา hydrolytic cleavage ทาหนาทยอยสลายพนธะของ 1,3 ß-D-glucosidic linkages ท เปนองคประกอบหลกของเชอราชนสง (Simmons, 1994) ยกตวอยางเชน ในเชอรา P. infestans ซงเปนราในคลาส oomycete เชอสาเหตของโรคใบไหม (late blight) ในมะละกอและมนฝรง เชอราในกลมนม ß-1,3-glucan เปนองคประกอบของผนงเซลลประมาณรอยละ 80-90 ซง ß-1,3-glucan นเปนสารตงตน (substrate) ของเอนไซม ß-1,3 glucanases ดงนนเอนไซมชนดนจงมบาทบาทหนาทในการปองกนการเขาทาลายจากเชอราไดโดยการยอยผนงเซลลของเชอรา การสงเคราะหเอนไซม ß-1,3 glucanases สามารถถกชกนาจากเชอโรคและสงกระตนอนๆ พบมากในเนอเยอพชและการสรางเซลลโลส ใบ และระบบราก

เอนไซม ß-1,3 glucanases พบในพชหลายชนดและมหลายไอโซฟอรม มความแตกตางกนของขนาด คา isoelectric point โครงสรางปฐมภม และตาแหนงทตงในเซลล (Gerhard and Frederick, 1999) ซงขนอยกบการตอบสนองของพชเมอมเชอโรคเขาทาลาย ขอมลลาดบนวคลโอไทดของไอโซฟอรมเหลานไดมาจากการโคลน cDNA และ Genomic ในใบยาสบ ซงมรปแบบเปน

16

multigene family สามารถจาแนกโปรตน PR-2 ไดเปน 4 กลม ดงแสดงในตารางท 2 โดยอาศยขอมลจากลาดบกรดอะมโน

ตารางท 2 กลมของโปรตน PR-2

ทมา: Sudisha และคณะ (2012) class I glucanase เปน basic proteins มนาหนกประมาณ 33 kDa ถกผลตขนเปน

preproprotein ม signal peptide ทางดานปลาย N-terminal ทไมชอบนา (hydrophobic) ซงจะถกเคลอนยายออกไปดวยวธ co-translation และดานปลาย C-terminal จะเกดกระบวนการ Glycosylation ซงเปนการเตมคารโบไฮเดรตในตาแหนง N ของกรดอะมโน asparagine 1 ตาแหนง โดย C-terminal มสญญาณสงตอโปรตนจาก endoplasmic reticulum ผาน Golgi compartment ไปยง vacuole ของเซลลพช (Gerhard and Frederick, 1999) โปรตน ß-1,3 glucans class I, II, III และ IV ไมม C-terminal extension มเพยง single site สาหรบสงตอโปรตนไปยง vacuole เทานน สาหรบโปรตนชนดนใน class II, III และ IV เปน acidic proteins (extracellular proteins) มขนาดประมาณ 35 kDa นอกจากน ß-1,3 glucanase isoforms ยงจาแนกไดจากพชอนอกหลายชนด เชน ขาว ขาวโพด ขาวฟาง ขาวบารเลย ขาวสาล ถวเขยว ถวเหลอง และขาวโพด (Sudisha et al., 2012)

ในภาวะปกตปรมาณเอนไซม ß-1,3 glucanase จะมการสะสมอยในระดบทตาในเนอเยอพชทวไป และถกชกนาไดถกเชอกอโรคเชอรา ไวรส แบคทเรยเขาทาลาย หรอเมอไดรบสงกระตน (elicitors) (Jin Kim and Kook Hwang, 1994) ในป 1994 Van Kan และคณะรายงานวา ß-1, 3-glucanase ในมะเขอเทศซงเปนโปรตนทอยในกลม acidic มการแสดงออกในระดบสงมากขนในใบมะเขอเทศทไดรบเชอรา Cladosporium fulvum ซงเปนเชอกอโรครากามะหย (Leaf mold) (Beerhues and Kombrink, 1994) จากนนในป 1995 Alonso และคณะ ไดทาการศกษาระดบการแสดงออกของเอนไซม ß-1, 3-glucanase ในใบยาสบหลงการตดเชอแบคทเรย Pseudomonas syringae pv syringae พบวาเอนไซมดงกลาวถกชกนาใหแสดงออกเพมขนเปน 21 เทาเมอเปรยบเทยบ

17

กบชดควบคม ซงการทดลองนสอดคลองกบการทดลองกอนหนานของ Castresana และคณะ (Alonso et al., 1995; Castresana et al., 1990)

การชกนาการแสดงออกของโปรตน PR-2 จากเชอโรคมความแปรปรวนในโคลนทแตกตางกนของพชชนดเดยวกน กลาวคอเมอ ß-1, 3-glucanase ถกกระตนใหผลตขนจากเชอ Corynespora cassiicola โดยเปรยบเทยบการแสดงออกในโคลนทแตกตางกนของยางพารา และสงเกตความแปรปรวนของเอนโปรตนดงกลาวพบวามการแสดงออกแตกตางกนอยางมนยสาคญในระหวางการเกดโรค โดยโปรตนชนดนมการแสดงออกเพมขนในโคลนทมความทนทานในขณะทโคลนทออนแอมการแสดงออกของโปรตนลดตาลง (Philip et al., 2001)

5.3 PR-3 proteins (chitinases) PR-3 proteins (chitinases) มสมบตเปนเอนไซม chitinases มนาหนกโมเลกลอย

ในชวง 26-44 kDa (Nielsen et al., 1997; Watanabe et al., 1999) เอนไซม chitinases สามารถจดเปนกลมได 5 กลม ไดแก

- class I chitinases ประกอบดวย N-terminal cysteine-rich domain ประมาณ 40 กรดอะมโนซงมชอเรยกอกอยางหนงวา chitin-binding hevein-like domain โปรตนในกลมนมนาหนกโมเลกลประมาณ 32 kDa ซงมการคนพบ class I chitinases ในพรกไทย (Young and Byung, 1996)

- Class II chitinases เปนโปรตนทมลาดบกรดอะมโนคลายกนกบ class I chitinases แตขาดสวนของ N-terminal cysteine-rich domain และมขนาดมวลโมเลกลประมาณ 27-28 kDa (Porat et al., 2001)

- Class III chitinases เปนโปรตนทไมมลาดบกรดอะมโนใกลเคยงกบกลมอนๆ มขนาดมวลโมเลกลประมาณ 28-30 kDa พบเอนไซมชนดนในตาแย (Utrica doica)

- Class IV chitinases เปนโปรตนทมลาดบกรดอะมโนคลายกนกบ class I chitinases และ Class II chitinases แตโปรตนชนดนมนาหนกนอยกวาอยางมนยสาคญเนองจากมการขาดหายไปกรดอะมโน 4 ชนด (Porat et al., 2001)

- Class V chitinases มลาดบกรดอะมโนคลายกนกบ exochitinases ในแบคทเรย และมนาหนกโมเลกลประมาณ 41-43 kDa (Velazhahan et al., 2000)

เอนไซม chitinases สามารถแยกไดจากสงมชวตหลายชนด เชน เชอรา แบคทเรย และพชหลายๆ ชนด เอนไซมเหลานเมอผลตขนแลวจะมบทบาทหนาทเกยวของกบการตานทานโรคทงในมนษยและพช โปรตน PR-3 ซงเปนเอนไซม endochitinases มความสามารถในการแยกสาพอลเมอรของไคตนในผนงเซลลของเชอราได ดงนนจากหลายๆ งานทดลองจงเหนไดวาโปรตน PR-2 (ß-glucanases) และ PR-3 (chitinases) บทบาทหนาทและการทางานรวมกนในการยงยงการเจรญเตบโตของเชอรา (Jach et al., 1995)

18

5.4 PR-4 proteins (chitin-binding) โปรตน PR-4 เปนโปรตนประเภท chitin-binding proteins มนาหนกโมเลกลประมาณ

9-30 kDa และมคา pI เปนเบส (Borad and Sriram, 2008) โปรตนชนดนสามารถแยกไดออกเปน 2 กลม ไดแก

- Class I PR-4 มลาดบกรดอะมโนคลายกนกบโปรตน hevein และ Win ในนายาง (Friedrich et al., 1991; Koo et al., 1998; Sudisha et al., 2012) และจดอยใน superfamily ของ chitin-binding lectins

- Class II PR-4 เปนกลมทพบในใบยาสบซงเกยวของกบกลไกการปองกนตวเองของพข โปรตน PR-4 มการศกษาในพชหลายชนด เชน มนฝรง ยาสบ ขาวบารเลย มะเขอเทศ

เปนตน (Friedrich et al., 1991; Hejgaard et al., 1992; Koo et al., 1998; Van Damme et al., 1999) การศกษาเกยวกบบทบาทหนาทของโปรตนชนดนพบวาโปรตนทง 2 class มสมบตในการตานทานเชอราทงในพชและในสตว เชน ตานทานตอเชอ Trichoderma harzianum, Fusarium culmorum, F. graminearum, and B. cinerea การศกษาการแสดงออกของโปรตน PR-4 ในพรก (Capsicum annuum L.) พบวามการแสดงออกเพมขนเมอพรกถกเขาทาลายจากเชอ Xanthomonas euvesicatoria โดยมปฏสมพนธแบบ incompatible interaction ซงเปนปฏสมพนธทเกดการรบรจดจาระหวาง avr gene และ R gene ลกษณะฟโนไทปของปฏสมพนธนคอปฏกรยาตอบสนองอยางเฉยบพลน (hypersensitive response: HR) ทาใหพชไมเกดโรค และยงพบวาโปรตนในกลมนสามารถถกกระตนไดจาก abiotic ไดแก เอทฟอน (ethephon) เมทลแจสโมเนท (methyl jasmonate) และการเกดบาดแผล (wounding) อกทงยงพบวาโปรตนชนดนมการแสดงออกอยางความจาเพาะในเนอเยอพชโดยพบการแสดงออกของโปรตน PR-4 ในทอลาเลยงอาหารของใบพรกไทย (Lee et al., 2001; Wan et al., 2008) นอกจากนในป 2014 Hwang และคณะ ไดทาการศกษาโปรตน PR4b ในพรก (Capsicum annuum) เพอศกษากลไกการปองกนตนเองของพชและการสงสญญาณการตายของเซลล พชม receptor ทเปนตาแหนงจดจาการเขาทาลายจากเชอโรคได เชน leucine-rich repeat (LRR) proteins (Hwang et al., 2014) เชนเดยวกบพรก LRR1 สามารถทาปฏกรยากบโปรตน PR4b ใน plasma membrane การจบกนของโปรตน PR4b และ LRR1 อาศย domain ทสาคญของ PB4b นนกคอ chitin-binding domain ซงโปรตน PR4b ถกสงเคราะหใน endoplasmic reticulum และยงพบวาการทาบรสทธโปรตน PR4b สามารถยบยงการงอกของสปอรเชอราและการเจรญเตบโตของ mycelial ได นอกจากน Hwang และคณะ ยงไดทาการศกษาการแสดงออกของยน PR4b แบบ Transient expression พบวา ยน PR4b สามารถกระตนการเกด hypersensitive cell death ใน

19

พรกไทย และยงพบวาการทายน PR4b ใหเกดการกลายพนธในอะราบดอพซส สงผลใหอะราบดอพซสออนแอตอการตดเชอ Hyaloperonospora arabidopsidis

5.5 PR-5 protein โปรตน PR-5 มความคลายกนกบโปรตน thaumatin ทไดมาจาก Thaumatococcus

danielli (Bennett) Benth อยางมนยสาคญ โปรตนชนดนจงถกเรยกวา Thaumatin-like proteins (TL proteins) (Borad and Sriram, 2008; Cornelissen et al., 1986a) TL protein มการศกษาในพชมากมายหลายชนด โดยสามารถตรวจพบโปรตนชนดนในใบออนของมะเขอเทศ ยาสบ มนฝรง พชตระกลกระหลา ขาว พารสเลย (Parsley) ขาวโพด และถว TL proteins มการแสดงออกในเนอเยอพชหลายสวนดวยกนไดแก ราก เปลอกชนนอก (epidermis peel) วงกลบดอก (Corolla) ตาดอก (flower bud) เมลดธญพชตางๆ สวนใหญเปน soluble proteins มการสะสมอยทง subcellular และ extracellular (Borad and Sriram, 2008; Sudisha et al., 2012; Velazhahan et al., 1999) และมนาหนกโปรตนประมาณ 16-26 KDa TL proteins มการแบงกลมทง acidic และ basic คา pI ขนอยกบตาแหนงทอยของโปรตน โดยหากโปรตนชนดนมตาแหนงอยใน extracellular จดอยในประเภทของ acidic สาหรบกลม basic ตาแหนงของโปรตนอยใน vacuole โปรตนชนดนไมมกระบวนการ glycosylation เหมอนกลมอนๆ และทนทานตอการถกยอยจากเอนไซมโปรตเอส (proteases) เนองจากม 16-cysteines (Capelli et al., 1997; Roberts and Selitrennikoff, 1990) โครงสรางของ TL proteins ทไดมาจากเมลกขาวโพดมโครงสรางแบบ ß-pleated sheet ประกอบดวย 2 โดเมนยดเกาะกนดวยพนธะไดซลไฟด (disulfide bonds) นอกจากนโปรตน osmotins และ osmotin like proteins จดอยในโปรตนกลมนดวย โดยมคาความเหมอนกนของกรดอะมโน 76%

แมวาบทบาทหนาทของ TL proteins จะยงไมทราบแนชดแตโปรตนในกลมนกเกยวของกบระบบ Acquired systemic resistance ซงมการตอบสนองตอ biotic stress ยบยงการเจรญเตบโตของเสนใยเชอราและการงอกของสปอร (Thompson et al., 2007) การศกษาบทบาทการทางานของ TL proteins ทแยกไดจากเมลดปาน (flax seeds) พบวา TL proteins แสดงฤทธตานทานตอเชอรา Alternaria alternata โดยกลไกความสามารถในการซมผานของเยอหมชนนอก (membrane permeabilization) ซงความเขมขนของโปรตนและไขมนทเปนองคประกอบของผนงเซลลเชอรามบทบาทสาคญในกระบวนการน (Anzlovar et al., 1998) นอกจากนยงมการศกษา TL proteins ในเชอร แอปเปล และกลวย ซงพบวาโปรตนดงกลาวนมกลไกออกฤทธตานทานตอเชอรา Verticillium alboatrum เชนเดยวกน และยงทางานรวมกนกบ endo- â1,3-glucanase อกดวย (Borad and Sriram, 2008) การศกษาการแสดงออกของยน PRs (PR1, PR3, PR5, PR8 และ PR9) ในยางพารา โคลน RRIM612 และ PR107 ภายหลงจากการปลกถายเชอ R.microporus โดย Oghenekaro

20

และคณะ (2016) พบวาหลงจากปลกถายเชอราดงกลาวผานไป 5 สปดาห PR3 class I chitinase มการแสดงออกเพมมากขนในโคลน RRIM612 เม อเปรยบเทยบกบชดควบคม PR9 class IV peroxidase มการแสดงออกเพมมากขนในโคลน PR107 สาหรบ PR1 และ PR8 มการแสดงออกสงในชดควบคมสงกวาชดการทดลองทมการปลกถายเชอลงไป ซงผลการทดลองของเขาแสดงใหเหนวาลกษณะทางพนธกรรมแตละโคลนของยางพารามบทบาทสาคญตอการแสดงออกของยนทเกยวของกบกลไกการตานทานโรค (defence gene expression) (Oghenekaro et al., 2016)

6. โปรตน PRs ทเกยวของกบระบบ Systemic Acquired Resistance (SAR) ความสมพนธระหวางโปรตน PRs และความตานทานในพชเปนกลไกทซบซอนและเขาใจได

ยาก ปจจบน Edreva (2005) ไดสรปความสมพนธดงกลาวไววา ระหวางทพชพนธตานทานตดเชอโรคจะมการสะสมโปรตน PRs ในปรมาณมากกวาพชพนธทออนแอหลายเทา ดงนนในพชทมความตานทานสงอยแลวในธรรมชาต (พชพนธตานทาน) จงมกจะมการแสดงออกของPRs ในระดบสง สาหรบพชทมการตดแตงพนธกรรมใหมยน PRs แสดงออกมากเกนพอ จะมความตานทานตอโรคเพมมากขนเชนยาสบทมยน PR-1a จะทนตอเชอ Peronospora tabacina และ P. parasitica var. nicotianae และการสะสมโปรตน PRs ในพชจะทาใหเกดความตานทานในพชทงบรเวณทตดเชอ (local resistance) และบรเวณอนทไกลออกไป (systemical resistance) ยน PRs จงมกถกใชเปนเครองหมาย (marker) สาหรบการเกดภาวะ systemic acquired resistance หรอ ภาวะ SAR และเรยกยน PR (PR-genes) ทเกยวของกบระบบ SAR วา SAR-genes

SAR เปนระบบปองกนตนเองทพชสามารถชกนาใหเกดการตานทานตอโรคไดโดยไมจาเพาะเจาะจงและมความตานทานทงบรเวณทถกบกรกโดยตรงและบรเวณทไกลออกไปทไมไดสมผสกบเชอโรค ระบบปองกนตวของพชเรมตนจากกระบวนการจดจา (recognition) ระหวางพชกบเชอโรคซงทาใหการตอตานเฉพาะทในขนท 1 เรมทางาน เมอเกด HR ขน หรอเกดปฏกรยาออกซเดชนอยางรนแรง (oxidative birst) เซลลพชในบรเวณนนจะสงเคราะหกรดซาลไซลค (salicylic acid; SA) ขนมาซง SA นจะไปกระตนให PR gene สราง mRNA ขนมาปรมาณมากเพอนาไปสงเคราะห PR-protein (Silverman et al., 2005) ระบบ SAR จะเกดขนในชวงเวลาสนๆ ภายหลงจากการตดเชอโรคแตจะ สามารถคงอยไดเปนระยะเวลานาน สงผลใหพชนนมความทนทานตอเชอบกรกหลายๆ ชนดในเวลาตอมาได (Cameron et al., 1994; Dempsey, 1993; Yalpani, 1993) โดยพชทมระบบ SAR จะสามารถตานทานตอเชอบกรกครงตอไป ซงอาจเปนเชอชนดเดมหรอเปนเชอทแตกตางจากเดมกได พนฐานของระบบ SAR แตกตางจากความจาเพาะระหวางแอนตเจน (antigen) และแอนตบอด (antibody) ทเปนตวกลางในการตอบสนองของระบบภมคมกนในสตวเลยงลกดวยนมเพราะการเกด

21

SAR ไมมความจาเพาะเจาะจงตอเชอโรคชนดใดชนดหนงและมชวงเวลาในการแสดงทสนกวาระบบภมคมกน การเกด SAR ทาใหเกดการแผขยายออกของนโครซสอยางชาๆ ซงในพชทไดรบการกระตนใหเกด SAR ทาใหเกดการตอบสนองในการปองกนตวเองทเรวและมากกวา ในพชทไมเคยไดรบการกระตน ระบบ SAR มโมเลกลสงสญญาณคอ SA และเกยวของกบการสะสม PRs โดยเฉพาะโปรตน PR-1 (Alexander et al., 1992; Ward et al., 1991)

การเกด SAR จาเปนตองม SA ทาหนาทเปนสญญาณลาเลยงไปยงสวนตางๆ ของพชเพอกระตนการทางานของยน ซง 69% ของ SA ทพบทงหมดถกสรางและลาเลยงจากสวนของพชทถกเชอโรคเขาทาลายพช (Shulaev et al., 1994) Gaffney และคณะ (1993) ทาการทดสอบหาความสมพนธระหวาง SA และ SAR โดยการถายยน nahG เขาสตนยาสบและ Arabidopsis ซง nahG นทาหนาทสรางสาร salicylate hydroxylase โดยสารนจะไปทาลาย SA และเมอปลกเชอโรคพชใหแกตนพชทงสองชนด พบวาพชมการสราง SA ในปรมาณทนอยมาก และไมพบการแสดงออกของ PRs gene

22

วสดอปกรณ และวธกำรทดลอง

วสด/อปกรณกำรท ำวจย วสด

1. เคมภณฑ 1.1 สำรเคมชนดเกรดวเครำะห (Analytical grade)

ตำรำงท 3 ชอสารเคมเกรดวเคราะหและบรษทผผลต สารเคม บรษททผลต Absolute ethanol Merck Boric acid BDH Tris-base BDH Calcium carbonate Fluka Chloroform Merck Ethyl alcohol Sigma Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) BDH Formamind Sigma

Glycerol Merck Hydrochloric acid Fluka Isopropyl alcohol Sigma Phenol, Saturated, pH 6.6/7.9 Amresco Potato dextrose agar Difco Sodium chloride (NaCl) BDH Sodium dodecyl sulfate (SDS) Merck

Sodium thiosulfate Merck Tryptone Difco Urea BDH Yeast extraction Sigma Difco

23

2.2 สำรเคมชนดเกรดอณชววทยำ (Molecular biology grade)

ตำรำงท 4 ชอสารเคมเกรดอณชววทยาและบรษทผผลต สารเคม บรษททผลต

100bp DNA Ladder Promega Agarose Merck Ampicillin Sigma PstI Promega Deoxyribonuclease I (DNase I) Sigma EcoRI Promega Ethidium bromide Sigma Ribonuclease A (RNase A) Merck QIA prep Spin Miniprep Kit QIAGEN QIA quick Gel Extraction Kit QIAGEN QIA quick PCR Purification Kit QIAGEN T4 DNA ligase Promega Taq DNA polymerase Invitrogen TRIzol®LS Reagent GIBCO BRL®

24

2. ตวอยำงพช ทาการเกบรวบรวมเมลดพนธยางพนธดงเดมทมการศกษามากอนหนานแลววาทนทานตอการเขาทาลายจากโรครากขาวโดย Wattanasilakorn และคณะ (2012) จานวน 2 โคลน ไดแก โคลน PSU1 ในพนทมหาวทยาลยสงขลานครทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา และ โคลนบางรก อ.กนตง จ.ตรง จากสถานทตางๆ โดยเฉพาะทางภาคใตของประเทศไทย รวมทงยางพาราพนธ PB5/51 และสายพนธยางพาราทมการรายงานวาออนแอตอโรครากขาว ไดแก พนธ RRIM600 และ BPM 24 (จรสศร และคณะ, 2558) ทาการเพาะเมลดยาง จนตนกลายางมอาย 3 เดอน จงทาการปลกถายเชอรา R. microporus 3.จลนทรย

3.1 แบคทเรย Escherichia coli สายพนธ TOP10 (Invitrogen) 3.2 เชอ Rigidoporus microporus ซงไดรบมาจากภาควชาการจดการศตรพช คณะ

ทรพยากรธรรมชาต ม.สงขลานครนทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา อปกรณ 1. หลอดสาหรบทา PCR ขนาด 0.2 และ 0.5 มลลเมตร

2. หลอดไมโครเซนตรฟวจ ขนาด 1.5 และ 2.0 มลลเมตร 3. เครองวดการดดกลนแสงอลตราไวโอเลต

4. เครองชง 2 ตาแหนง 5. เครองชงทศนยม 4 ตาแหนง 6. เครองเขยาทควบคมอณหภมได 7. เครองวดพเอช 8. เครองหมนเหวยง 9. เครองหมนเหวยงทควบคมอณหภมได 10. กลองจลทรรศน 11. ตบมเชอ 37 องศาเซลเซยส 12. ตเกบเชอ -20 องศาเซลเซยส 13. ตบมเชอ -80 องศาเซลเซยส 14. หมอนงความดน รน HA-300 M II 15. ตอบเครองแกว 16. เครองตรวจสอบดเอนเอดวยกระแสไฟฟา (Agarose gel electrophoresis system) 17. ตปราศจากเชอ Laminar flow

25

18. เครองสงเคราะหดเอนเอ Polymerase Chain Reaction 19. เครองจายกระแสไฟฟา 20. เครองบนทกแผนภาพดเอนเอ 21. ไมโครออโตปเปต พรอมทป ขนาด 0.1-2, 2-20, 10-100 และ 200-1000

22. Cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 เซนตเมตร 23. Nanodrop Spectrofluorometer 24. ชอนโลหะและชอนพลาสตกสาหรบตกสาร 25. จานอาหารเลยงเชอขนาดเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร 26. โกรงบดตวอยาง 27. เครองแกวพนฐาน (กระบอกตวง ขวดปรบปรมาตร บกเกอร และหลอดทดลอง) วธกำรทดลอง 1. กำรเตรยมตวอยำงพช

ทาการเกบรวบรวมเมลดพนธยางพนธดงเดมทมการศกษามากอนหนานแลววาทนทานตอการเขาทาลายจากโรครากขาวโดย วฒนาศลากร และคณะ (2012) จานวน 2 โคลน ไดแก โคลน PSU1 ในพนทมหาวทยาลยสงขลานครทร อ.หาดใหญ จ.สงขลา และ โคลนบางรก อ.กนตง จ.ตรง จากสถานทตางๆ โดยเฉพาะทางภาคใตของประเทศไทย รวมทงยางพาราพนธ PB5/51 และสายพนธยางพาราทมการรายงานวาออนแอตอโรครากขาว ไดแก พนธ RRIM600 และ BPM 24 ทาการเพาะเมลดยาง จนตนกลายางมอาย 3 เดอน จงทาการปลกถายเชอรา R. microporus 2. โคลนและศกษำสมบตของยน PRs

2.1 กำรท ำ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) 2.1.1 กำรสงเครำะหสำย cDNA

นา RNA จากใบยางพารามาทาการสรางสาย cDNA โดยใชวธการตามบรษท Thermo sciencetific โดยเรมจากทาการผสมสารตางๆ ดงน (ตารางท 5)

26

ตารางท 5 สารทใชในการสงเคราะหสาย cDNA

สารเคม ปรมาตร (หนวยเปน ไมโครลตร) Total RNA (ปรมาณสดทาย 2.0ไมโครกรม) X Oligo dT primer 1 10 mM dNTP mix 1 DI-DEPC Y

ปรมาตรทงหมด 15

นาสารละลายผสมขางตน บมทอณหภม 65 องศาเซลเซยสเปนเวลา 5 นาท ตอมานาไปวางบนนาแขงเปนเวลาอยางนอย 2 นาท หลงจากนนทาการเตมสารดงตอไปน (ตารางท 6)

ตำรำงท 6 สารทใชในการสงเคราะหสาย cDNA

นาสารละลายผสมบมทอณหภม 50 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง เมอครบกาหนดเวลา

หยดปฏกรยาโดยนาสารละลายผสมบมทอณหภม 70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท ตอมาทาการยอยอารเอนเอตนแบบโดยใช 2U RNase H ปรมาตร 1 ไมโครลตร นามาบมตอทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท

2.1.2 กำรเพมปรมำณดเอนเอ นา cDNA ความเขมขน 200 นาโนกรม ทไดจากขอ 2.1 มาทาปฏกรยา PCR โดยใช

Degenerate primer (ตารางท 5) กบยน PR1, PR2, PR3, PR4 และ PR5 ดงแสดงในตารางท ซงเปนยนทเกยวของกบ antifungal gene และกาหนดโปรแกรม PCR ดงน

สารเคม ปรมาตร (หนวยเปน ไมโครลตร) 5x RT buffer 4 Maxima H Minus Enzyme Mix 1 ปรมาตรทงหมดจากเรมตน 20

27

โปรแกรมท 1 Initial denaturation ท 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 นาท 1 รอบ โปรแกรมท 2

Denaturation ท 95 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท 40 รอบ Annealing ท 55 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท Extension ท 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 นาท

โปรแกรมท 3 Extension ท 72 องศาเซลเซยส เปนเวลา 10 นาท 1 รอบ

ท 4 องศาเซลเซยส ∞ นา PCR product ทไดมาตรวจสอบโดยวธ gel electrophoresis บน 1.5% (w/v)

agarose gel และยอม DNA ดวย ethidium bromide เปรยบเทยบขนาดของ DNA ทไดกบ100 bp DNA ladder plus

ตารางท 7 การออกแบบ Degenerate primers

Gene Direction Sequence (5’ 3’) PR1 Forward

Reverse TCTTGTGCATTCCAGCAATC CACCTCACCTTAGCACATCCT

PR2 Forward Reverse

GTGGAGYWGGAACCATCAAG ATTTGCWAKAAGRTARGCCTCAA

PR3 Forward Reverse

ATGGGCWACWGCACCAGACGG CCACCGTTRATGATGTTYGT

PR4 Forward Reverse

GAGCAACWTACMATWWCTACAA GCAYTGATCMACKATTCTCAC

PR5 Forward Reverse

AACAACTGCCCCWACMCKRTCT TTAGGGTARCTRTAAGCATC

28

2.2 กำรท ำบรสทธดเอนเอ นาดเอนเอทไดไปแยกดวย 1.5% agarose gel electrophoresis จะเหนแถบดเอนเอขนาด

ทตองการ ตดเจลสวนทเปนแถบดเอนเอ เตมสารละลาย QG 10 ไมโครลตรตอเจลนาหนก 10 มลลกรม ผสมใหสารละลายเขากน นามาบมทอณหภม 55 องศาเซลเซยสจนเจลละลายหมด จากนนถายโอนสารจากหลอดทดลองมาใสหลอดท เปนคอลมน บมทอณหภมหองเปนเวลา 5 นาท นามาหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใส ลางคอลมนดวยสารละลายลางคอลมน (ซงม 95% ethanol) ปรมาตร 500 ไมโครลตร นามาหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 5 นาท ทงสวนใส นามาหมนเหวยงอกครงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ยายคอลมนไปยงหลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร ใชนาปราศจาก Nuclease ชะสวนกลางของคอลมน บมทอณหภมหอง เปนเวลา 5 นาท นามาหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ตรวจสอบผลทไดดวย 1.5 % Agarose gel electrophoresis และเกบสารละลายท 4 องศาเซลเซยส

2.3 กำรโคลน DNA ของยน PRs กบ RBC TA cloning vector ทาการเชอมดเอนเอของ PRs ทไดจากการทาใหดเอนเอบรสทธกบเวคเตอร TA cloning

vector โดยมสวนประกอบทใชในการทาปฏกรยาในปรมาตรรวม 10 ไมโครลตร ดงน ดเอนเอ 300 นาโนกรม, TA cloning vector 25 นาโนกรม, 10X ligation buffer 1 ไมโครลตร และ 0.3 U T4 DNA ligase 0.5 ไมโครลตร บมทอณหภม 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16 -18 ชวโมง จากนนถายโอนดเอนเอลกผสมเขาสเซลลเจาบาน E.coli Top 10 F’ โดยนาเซลลเจาบาน 200 ไมโครลตร แชบนนาแขงใหละลาย เตมดเอนเอท ligate แลวแชบนนาแขงเปนเวลา 30 นาท นาไปบมทอณหภม 42 องศาเซลเซยส เปนเวลา 90 วนาท แลวแชบนนาแขงทนท เปนเวลา 5 นาท นามาเตมอาหารเลยงเชอเหลว LB ปรมาตร 800 ไมโครลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 1 ชวโมง แลวนามาเกลยเชอบนอาหารแขง LB ทม Ampicillin ความเขมขน 80 ไมโครกรมตอมลลลตร บมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16-18 ชวโมง

สมเลอกโคโลนเดยวแบบสมมาจานวน 10 โคโลน มาเลยงในอาหารเหลว LB ทม Ampicillin ความเขมขน 80 ไมโครกรมตอมลลลตร หลอดละ 2 มลลลตร โดยเลยงในเครองเขยาทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16-18 ชวโมง จากนนนามาปนแยกเซลลออกจากอาหารเลยงเชอเหลว ทความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใส ละลายตะกอนดวยสารละลาย STET buffer (8% (w/v)glucose, 5%(v/v)Triton X-100, 50 mM EDTA และ 50 mM Tris-HCl pH 8.0) ปรมาตร 350 ไมโครลตร เขยาเพอใหตะกอนละลายดวยการ Vortex วางทงไวทอณหภมหองเปนเวลา 15 นาท นามาตมในนาเดอดนาน 40 วนาท วางบนนาแขงทนทเปนเวลา 15 นาท นาไป

29

หมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท หลงจากนนเขยตะกอนออกโดยใชไมจมฟนทปลอดเชอ แลวเตม isopropanol ปรมาตร 1 เทาของ STET buffer ผสมใหเขากน นาไปตกตะกอนท –70 องศาเซลเซยส เปนเวลา 25 นาท จากนนนามาหมนเหวยงทความเรว 12,000 รอบตอนาท เปนเวลา 15 นาท เทสวนใสทง แลวทาใหตะกอนแหง ละลายตะกอนดวยนากลน ตรวจสอบผลวามดเอนเอลกผสมอยในเซลลเจาบานหรอไม โดยใช 1% agarose gel electrophoresis คาดคะเนจากการเทยบแถบดเอนเอทไดจากการสกดพลาสมดดเอนเอกบแถบพลาสมดดเอนเอทไมมยน PRs ซงแถบดเอนเอทไดจากการสกดพลาสมดควรมแถวดเอนเอเหนอแถบพลาสมดดเอนเอทไมมยน PRs จากนนเลอกพลาสมดดเอนเอลกผสมทคาดวามยน PRs มาทาการตดดวยเอนไซมตดจาเพาะ สวนประกอบทใชในปฏกรยาในปรมาตรรวม 20 ไมโครลตร มดงน ดเอนเอ 8 ไมโครลตร , 10X bufferH 2 ไมโครลตร, RNaseA 1 ไมโครลตร และ เอนไซม EcoRI (5,000U) 0.5 ไมโครลตร แลวปรบปรมาตรดวยนากลนบรสทธทผานการฆาเชอแลว ผสมสารละลายใหเขากน นาไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 3 ช วโมง แลวตรวจสอบผลท ไดดวย 1.5% Agarose gel electrophoresis

2.4 กำรท ำพลำสมดใหบรสทธเพอหำล ำดบเบสของยน PRs นาเชอทผานการตรวจสอบวามพลาสมดดเอนเอลกผสมมาทาใหบรสทธดวย QIAprep®

Spin Miniprep Kit โดยเลยงเชอในอาหารเหลว LB (ทม Ampicillin ความเขมขน 80 ไมโครกรมตอมลลลตร) 5 มลลลตร ในเครองเขยาทอณหภม 37 องศาเซลเซยส เปนเวลา 16 -18 ชวโมง นามาหมนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 1 นาท ทงสวนใสแลวละลายตะกอนดวยสารละลาย P1 ปรมาตร 250 ไมโครลตร แลวเตมสารละลาย P2 ปรมาตร 250 ไมโครลตร ผสมสารละลายใหเขากนเตมสารละลาย N3 ปรมาตร 350 ไมโครลตร ผสมสารละลายใหเขากนโดยควาหลอดไปมา 4 -6 ครง นามาหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 10 นาท ดดสวนใสมาผานคอลมน นาไปหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท ทงสวนใสแลวลางคอลมนดวยสารละลาย PB ปรมาตร 500 ไมโครลตร นามาหมนเหวยงดวยความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวลางคอลมนอกครงดวยสารละลาย PE buffer 750 ไมโครลตร นาไปหมนเหวยงทความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท เทสวนใสทง แลวนามาหมนเหวยงซาอกครงเพอกาจด เอทานอลออกใหหมด แลวยายคอลมนมาใสในหลอดทดลองขนาด 1.5 มลลลตร แลวชะคอลมนดวยนากลนปราศจากเชอ ปรมาตร 50 ไมโครลตร วางทงไว 10 นาท นาไปหมนเหวยงดวย

30

ความเรว 10,000 รอบตอนาท เปนเวลา 2 นาท ตรวจสอบคณภาพของดเอนเอลกผสมทไดดวย 1.0% Agarose gel electrophoresis และวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 260 และ 280 นาโนเมตร คานวณหาความเขมขนของพลาสมด เกบพลาสมดทไดท -20 องศาเซลเซยส จนกวาจะใชงาน

2.5 กำรศกษำล ำดบเบส (sequencing) ศกษาลาดบเบสของโคลนทไดจากขอ 1.5 โดยใชเครอง ABI PRISM 377 DNA sequencer

(Version 3.2) และ ABI PRISMTM BigDyeTM Termination kit ของบรษท Macrogen ประเทศเกาหล เพอศกษาลาดบเบสของยนทมการเชอมตอกบดเอนเอพาหะและสามารถแปลรหสเปนโปรตนทถกตองได 3. กำรหำล ำดบนวคลโอไทดทงหมด (full-length) ของยน PRs ในยำงพำรำดวยวธ Rapid Amplification of cDNA ends (RACE)

3.1 กำรหำล ำดบนวคลโอไทดทำงดำนปลำย 5′ สรางสาย first-strand cDNA ดวยเอนไซม reverse transcriptase ตามขนตอนของบรษท

Thermo sciencetific ตอสายปลาย 3’ ดวย dCTP โดยใชเอนไซม Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) เพอเปนตาแหนงในการจบของ oligo dC-anchor primer จากนนทาปฏกรยา PCR โดยใช oligo dC-anchor primer และ specific reverse primer 1 (5’AAGGTTCTCCCCGTAAGGAC 3’) เพอเพมปรมาณยน PR1 ทางดานปลาย 5′ และสรางทาปฏกรยา PCR ครงท 2 โดยใช specific reverse primer 2 เพอใหมความจาเพาะตอยน PRs มากยงขน จากนนจงจะเขาสปฏกรยาทวไปของวธ PCR ตรวจสอบแถบ DNA ทไดดวยวธ gel electrophoresis บน 1.5% (w/v) agarose gel และทาบรสทธแถบ DNA ทไดตามวธการในขอ 2.2-2.5 เพอหาลาดบนวคลโอไทดแลวนาไปตรวจสอบลาดบนวคลโอไทดทไดกบฐานขอมลใน GenBank

3.2 กำรหำล ำดบนวคลโอไทดทำงดำนปลำย 3′ สรางสาย first-strand cDNA ดวย Oligo dT primer ตามดวยปฏกรยาทวไปของวธ PCR ครง

ท 1 โดยใช B26 primer (5’GACTCTAGACGACATCGATTTTTTTTTTTTTTTTTT3’) ซงเปน primer ท complementary กบ oligo dT และ specific forward primer 1 และ PCR anchor primer (-anchor primer) เปน reverse primer เพอเพมปรมาณยน PR-1 ทางดานปลาย 3′ ดงรปท 2.9 ตรวจสอบแถบ DNA ทไดดวยวธ gel electrophoresis บน 1.5% (w/v) agarose gel จากนนทา

31

บรสทธแถบ DNA ทไดตามวธการในขอ 2.2-2.5 เพอหาลาดบนวคลโอไทดแลวตรวจสอบกบฐานขอมลใน GenBank

4. ศกษำกำรแสดงออกของยน PRs ในเนอเยอตำงๆ ของยำงพำรำ ศกษาการแสดงออกของยน PR1 และยน PR3 เพอดการแสดงออกของยนในเนอเยอทจาเพาะของยางพาราโดยใชไพรเมอรท จาเพาะตอยน PR1 ซ งมลาดบเบสคอ forward 5’ TCTTGTGCATTCCAGCAATC 3’, reverse 5’ CACTTCACCTTAGCACATCCT 3’ และยน PR3 forward 5’ ATGGGCTACTGCACCAGACGGA 3’, reverse 5’ CCACCGTTRATGATGTTYGT ในเนอเยอตางๆ ของยางพารา ไดแก เมลดออน เมลดแก ใบออน ใบแก เปลอก โดยการนาชนสวนตางๆ ดงกลาวมาสกด RNA ตามวธในหวขอท 3.1 และดการแสดงออกของยน PRs ดวยเทคนค RT-PCR 5. กำรสกด Total RNA

สกด Total RNA จากใบยางพารา ประมาณ 0.1 กรม บดใหละเอยดดวยไนโตรเจนเหลวโดยใชโกรงบด เตมสารละลาย Extraction buffer ปรมาตร 0.5 มลลลตร ผสมใหเขากน เตม Phenol-Chloroform-isoamyl ปรมาตร 0.5 มลลลตร หมนเหวยงทความเรว 4,200 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสดานบนมาเตม Phenol-Chloroform-isoamyl ปรมาตร 1 เทาของสวนใสทได ผสมใหเขากน หมนเหวยงทความเรว 4,200 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสดานบนมาเตม Chloroform-isoamyl ปรมาตร 1 เทาของสวนใสทได ผสมใหเขากน หมนเหวยงทความเรว 4,200 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ดดสวนใสดานบนมาเตม isopropanol ปรมาตร 1 เทาของสารละลาย และ Sodium acetate ปรมาตร 1/10 เทาของสวนใสทได ตกตะกอนท 4 องศาเซลเซยส 16 ชวโมง จากนนหมนเหวยงทความเรว 4,200 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 20 นาท ลางตะกอนดวย 70 % เอทานอล นาตะกอนไปทาใหแหง ละลายดวยนาทปราศจาก RNase ปรมาตร 50 ไมโครลตร จากนนนา RNA ทไดมาทาใหบรสทธอกครงโดยการเตม extraction buffer 50 ไมโครลตร ผสมใหเขากน เตม Phenol-Chloroform-isoamyl ปรมาตร 0.1 มลลลตร ผสมใหเขากน หมนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท ดดสวนใสดานบนมาเตม Chloroform-isoamyl ปรมาตร 1 เทาของสวนใสทได ผสมใหเขากน หมนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท ดดสวนใสดานบนมาตกตะกอนดวย 8 M LiCl2 ตกตะกอนท 4 องศาเซลเซยส 12 ชวโมง จากนนหมนเหวยงทความเรว 13,000 รอบตอนาท ท 4 องศาเซลเซยส เปนเวลา 2 นาท ลางตะกอนดวย 2 M LiCl2 ตากตะกอนให

32

แหง ละลายดวยนาทปราศจาก RNase ปรมาตร 30 ไมโครลตร ตรวจสอบคณภาพอารเอนเอทไดโดยใช 1% agarose gel electrophoresis ใน 0.5x TAE buffer (ประกอบดวย 40 mM Tris-borate, 1 mM EDTA) และวเคราะหปรมาณอารเอนเอ โดยวดคาการดดกลนแสงทความยาวคลน 260 และ 280 นาโนเมตร เกบสารละลาย อารเอนเอทไดทอณหภม -20 องศาเซลเซยส 6. เตรยมเชอ R. microporus เพอใชศกษำกำรแสดงออกของยนในกลม PRs ในตนกลำยำงพำรำ

6.1 กำรเตรยมเชอ R. microporus นาเชอ R. microporus ซงไดรบความอนเคราะหจากภาควชาการจดการศตรพช คณะ

ทรพยากรธรรมชาต ม.สงขลานครนทร มาแยกอกครงโดยการเกลย Basidiospore บนอาหารเลยงเชอ potato dextrose agar (PDA, ดภาคผนวก) จากนนยายใช Cork borer ขนาดเสนผานศนยกลาง 0.5 เซนตเมตร ยายเชอทไดลงบนอาหาร PDA ถาดใหม เลยงไวทอณหภม 25 ± 2 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วน กอนนาไปใชงาน (รปท 4)

รปท 4 เชอ R. microporus บนอาหาร PDA เลยงไวทอณหภม 25 ± 2 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 วน

6.2 กำรปลกเชอ R. microporus นาตนกลายางพาราโคลนตางๆ มาปลกถายเชอ R. microporus (รปท 5) และทาการเกบใบ

ยางพาราทเวลา 0, 12, 24, 48, 72 และ 96 ชวโมง เพอสกด total RNA

33

รปท 5 ตวอยางตนกลายางพาราทปลกถายเชอ R. microporus 7. ศกษำกำรแสดงออกของยนในยำงพำรำสำยพนธตำงๆ

ศกษาการแสดงออกของยนในยางพาราสายพนธดงเดมจากแหลงตางๆ เปรยบเทยบกบ RRIM 600 หลงจากปลกเชอรา R. microporus ซงเปนเชอสาเหตของโรครากขาวเปรยบเทยบกบชดควบคม (ปลอดเชอ) รายละเอยดดงน

7.1 ศกษำกำรแสดงออกของยน PRs ในยำงพำรำสำยพนธตำงๆ โดยใชเทคนค qRT-PCR โดยนา RNA ทสกดไดจากหวขอ 4.1 มาสงเคราะห cDNA ตามวธการในหวขอยอย 2.1.1 และตรวจสอบการแสดงออกของยน PR1, PR2, PR3, PR4 และ PR5 โดยใชไพรเมอรดงแสดงในตารางท6 ใช Ssoadvanced SYBR Green Universal Supermix ของบรษท Thermo sciencetific ในการตรวจสอบการแสดงออกของยน ซงมปฏกรยาดงน Ssoadvanced SYBR Green Universal Supermix 5 ไมโครลตร Forward primer (500 nM) 1 ไมโครลตร Reverse primer (500 nM) 1 ไมโครลตร cDNA template (100 ng/µl) 1 ไมโครลตร DEPC water 2 ไมโครลตร ปรมาตรรวมมงหมด 10 ไมโครลตร

34

และกาหนดโปรแกรม PCR โดยใชเครอง Applied Biosystems 7300 Real Time PCR System ดงน

Initial denaturation 95°C 10 นาท Denaturation 95°C 15 วนาท 35 รอบ Annealing และ Polymerization 60°C 1 นาท

ตำรำงท 8 specific primers ทใชในการทา qRT-PCR

Gene Direction Sequence (5’ 3’) Amplicon size (bp) PR1 Forward

Reverse GCCTGCTTAACCCTACCCTT CCGTAAGGACGATTGCTGGA

190

PR2 Forward Reverse

AGCCCTTAGAGGCTCAAACA ACCAGAAGCCACGAACATTT

119

PR3 Forward Reverse

TACGGTAGAGGTCCCATCCAA CCACCGTTGATGATGTTCGT

269

PR4 Forward Reverse

GAGCAACTTACCATTTCTACAA GCATTGATCACCGATTCTCAC

233

PR5 Forward Reverse

CTTGGCCGAATATGCACTAA TCCAGGGACCTTCAATTCAT

174

35

ผลกำรทดลอง

ผลกำรโคลนและศกษำสมบตของยน PRs เมอสกด RNA จากใบยางพาราดวย Extraction buffer ผลของ total RNA ทสกดได พบวา Total RNA มความบรสทธสง ดงแสดงในรปท 6 จากการสกดดวยวธดงกลาวน ไดปรมาณ Total RNA ทมคณภาพและมปรมาณเยอะ อกทงวธการสกดกไมยงยากซบซอน รปท 6 Total RNA ทสกดดวย Extraction buffer เมอนา RNA ไดสกดไดเปนแมแบบในการสงเคราะหสาย cDNA เพอใชเปนแมแบบในการโคลนยน ผลโคลนและศกษาสมบตของยน PRs สามารถโคลนยนในกลม Pathogenesis related proteins ทเกยวของกบการผลต antifungal protein ไดทง 5 ยน ไดแก ยน PR1, PR2, PR3, PR4 และ PR5 โดยมรายละเอยดตางๆ ดงน 1. ผลกำรศกษำและกำรวเครำะหล ำดบเบสของยน PR1

การเพมปรมาณ DNA ของยน PR-1 โดยใช specific forward primer (Hb-PR1F) (5’ TCTTGTGCATTCCAGCAATC 3’) และ specific reverse primer (Hb-PR1R) (5’ CACCTCACCTTAGCACATCCT 3’) ซงเปนไพรเมอรทไดจากยรฉตร (2554) เรองการชกนาการตานทานโรคและการแสดงออกของยน PR-1 ในยางพาราโดยใชตวกระตนชนดตางๆ สามารถโคลนบางสวนของยน PR1 โดยมลาดบเบส 205 bp ดงแสดงในรปท 7 จงทาการวเคราะหลาดบเบสทไดกบพชชนดอนๆ บนฐานขอมล NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) ผลการ blast พบวา ยน PR1 ในยางพารามสวนคลายกบพชอนๆ คอนขางสง ไดแก Populus euphratica Accession number XM_011004299 86% ,Populus trichocarpa Accession number XM_00637909485%, Citrus sinensis Accession number XM_006486757 82% และ Ricinus communis Accession number XM_002522020 81%

36

รปท 7 แสดงลาดบเบสบางสวนของยน HbPR-1 โดยตวอกษรสแดงแสดงลาดบเบสของไพรเมอร Hb-PR1F และ Hb-PR1R

1.1 ผลกำรหำล ำดบนวคลโอไทดทงหมด (full-length) ของยน PR1 ในยำงพำรำดวยวธ

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) เมอไดขอมลลาดบเบสของยน PR1 บางสวนแลว จากนนจงออกแบบไพรเมอรเพอโคลนยนเสน

สมบรณโดยใชเทคนค 5’ - 3’RACE โดยใช gene specific primer ผลจากการทา 5’ และ 3’RACE ไดผลผลต PCR ขนาดประมาณ 350 และ 300 bp ดงรปท 8ก และ 8ข ตามลาดบ จงทาการโคลนและวเคราะหลาดบเบส

37

รปท 8 PCR product ทไดจาการทา 5’และ 3’RACE ของยน HbPR-1 โดยรป ก แสดงผลการทา 5’RACE และรป ข แสดงผลการทา 3’RACE โดยใช cDNA จากใบยางพาราพนธ RRIM600 หลงจากการทาบรสทธเจลและโคลนยนเพอศกษาลาดบนวคลโอไทด ผลการวเคราะหลาดบเบส

จากการทา 5’- 3’ Rapid Amplification of cDNA Ends พบวา ไดเสนสมบรณของยน PR1 ซงมลาดบนวคลโอไทด 492 bp สามารถแปลงเปนกรดอะมโนได 163 amino acid มนาหนกโมเลกล 17.69 กโลดาลตน และ pI 8.57 โดยทางดานปลาย 5’RACE คนพบบรเวณ poly G กอนถงจด start codon สาหรบดานปลาย 3’RACE คนพบบรเวณ poly A tail และจด stop codon ดงแสดงในรปท 9

ก ข

ก ข

38

รปท 9 การวเคราะหยนเสนสมบรณของยน HbPR-1

เมอนาเสนสมบรณของยน HbPR-1 ไปบลาส และ alignment โดยใช ClustalX (รปท 10)

พบวามความคลายกนกบพชตางๆ ดงน Populus trichocarpa (accession number XP_006379156.1) 78%, Citrus sinensis (accession number XP_006486820.1) 75% และ Nicotiana sylvestris (accession number XP_009787159.1) 74%

39

รปท 10 การ alignment โดยใช ClustalX ของยน HbPR-1 ในยางพาราเปรยบเทยบกบพชอนๆ ไดแก Populus trichocarpa (accession number XP_006379156.1), Citrus sinensis (accession number XP_006486820.1) และ Nicotiana sylvestris (accession number XP_009787159.1)

40

หลงจากการ blast กบฐานขอมลของ GenBank พบบรเวณสาคญของลาดบกรดอะมโนคอ

SCP (rodent sperm-coating glycoprotein) _PR-1 like domain (รปท 11) ซงเปน domain หลก ของโปรตนกลมทถกขนสงออกนอกเซลล (extracellular protein) และจดอยในกลม cysteine-rich secretory proteins (CRISP) family ประกอบดวย cysteine 6 residues โดยลกษณะเหลานจดเปนลกษณะเดนของโปรตน PR1 สาหรบ domain ทพบประกอบไปดวย 2 บรเวณ ไดแก CRISP1 บรเวณกรดอะมโนตาแหนงท 120-130 (GHYTQVVWrnS) และยงเปนบรเวณทมความอนรกษสงตดตอกนถง 8 residues คอ GHYTQVVW ซงตรงกบ CRISP1 และพบในทกโปรตน HbPR-1 ทนามาเปรยบเทยบเนองจากเปน domain ทสาคญของโปรตนชนดน และ CRISP2 ตาแหนงท 146-157 (FIgCNYdPpGNF) วเคราะหลาดบนวคลโอไทดทไดและโปรตน HbPR-1 ในพชอนพบตาแหนง CRISP1 มความอนรกษ 100% ระหวางโปรตนดงกลาว ในขณะทตาแหนง CRISP2 แมวาจะไมเปนลาดบอนรกษ 100% แตจดวามลาดบอนรกษสง (รปท 12)

รปท 11 conserved domain ของโปรตน HbPR-1 ทไดกบฐานขอมล GenBank พบตาแหนง SCP_PR-1 like domain โดยใชโปรแกรม Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)

41

รปท 12 การ alignment ลาดบกรดอะมโนของโปรตน PR1 โดยใช ClustalX เปรยบเทยบกบโปรตน HbPR-1 จากพชชนดอนๆ ไดแก Populus trichocarpa (PtPR1) Accession number: XP_006379156, Populus euphratica (PePR1) Accession number: XP_011002601, Jatropha curcas (JcPR1) Accession number: XP_012072756, Ricinus communis (RcPR1) Accession number: XP_002522065 และ Gossypium raimondii (GrPR1) Accession number: XP_012436490 บรเวณแถบสดาแสดงสวนทมความอนรกษ 100% และในกรอบสเหลยมเปน Domain ทมความสาคญของโปรตน HbPR-1 ประกอบดวย 2 สวนคอ CRISP1 และ CRISP2 บรเวณทลกศรชลงแสดงใหเหนบรเวณ cysteine residue ทเปนกรดอะมโนสาคญของโปรตน PR-1

42

2. ผลกำรศกษำและกำรวเครำะหล ำดบเบสของยน HbPR-2

การเพมปรมาณ DNA ของยน HbPR-2 หรอ ยน beta-1,3-glucanase โดยใช degenerate primer ซงมขนาดประมาณ 1,120 bp ออกแบบจากพช Vigna angularis accession no. EU046566, Hevea brasiliensis accession no และ Arabidopsis thaliana accession no. NM_115586.2 U22147.1 ผลผลต PCR (รปท 13) จากตวอยาง RNA ทสกดได โดยใชไพรเมอร HbPR-2 พบวาผลจากการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชไพรเมอรคดงกลาว ไดขนาดชนยน HbPR-2 ใกลเคยงกบขนาดทไดทาการออกแบบไพรเมอร จากนนจงทาการโคลนยน และวเคราะหลาดบเบส

รปท 13 PCR product ทไดจากการทา PCR โดยใช denenerate primer PR-2 ขนาด 1200 bp; เลน M: 100 bp plus DNA ladder, เลน 2 และ 3: PCR product จาก cDNA ของใบยางพาราพนธ RRIM600 และเลน 4: Negative control

43

ผลจากการโคลนยนและวเคราะหลาดบเบสพบวาไดยน HbPR-2 มาบางสวน ดงแสดงในรปท 14

เมอนาลาดบนวคลโอไทดไปเปรยบเทยบกบขอมลในฐาน NCBI พบวา ยน HbPR-2 มความคลายคลงกนกบยน beta-1,3-glucanase ใน Hevea brasiliensis clone GT 1 99% (accession no. EF222320.1) และ Hevea brasiliensis clone PB86 (accession no. DQ649474.1) 99% จากนนทาการแปลลาดบนวคลโอไทดทไดเปนลาดบกรดอะมโนเพอหาบรเวณทเปน coding sequences ผานทางโปรแกรมในเวบไซตhttp://au.expasy.org/tools/dna.html และโปรแกรม http://reverse-complement.com/translate_protein/ พบวาลาดบนวคลโอไทดทเรมแปลรหสไดเรมจากตาแหนง GCG ซงเปนตาแหนงของกรดอะมโนอะลานน (Alanine; A) ได และมตาแหนง stop codon คอ TGA รปท 15 ซงตาแหนง stop codon นเปนตาแหนงเดยวกนกบยน PR-2 ในยางพาราพนธ GT 1 และ ยางพาราพนธ PB86 (รปท 16)

รปท 14 ลาดบนวคลโอไทดบางสวนของยน HbPR-2

44

รปท 15 ลาดบกรดอะมโนของยน HbPR-2 ทเรมแปลรหสไดและตาแหนง stop codon โดยตาแหนงแรกทสามารถแปลรหสเปนกรดอะมโนไดคอ GCG แปลรหสเปน Alanine (A) และตาแหนง stop codon คอ TGA

45

รปท 16 ผลการทา sequence alignment โดยใชโปรแกรม Clustal-X alignment ลาดบนวคลโอไทดของยน HbPR-2 เปรยบเทยบกบ Hevea brasiliensis clone GT 1 99% (accession no. EF222320.1) และ Hevea brasiliensis clone PB86

46

การว เคราะหล าดบกรดอะม โนของโปรตน HbPR-2 โดยใช โปรแกรม Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) กบฐานขอมลของ GenBank พบวาลาดบกรดอะมโนดงกลาวนมความคลายคลงกบยน beta-1,3-glucanase (ABG49448.1, ABN09653.1 และ AFJ97274.1) ของยางพาราซงมเปอรเซนตความเหมอนอยในชวง 96-97% นอกจากนยงพบบรเวณสาคญของลาดบกรดอะมโน คอ Glyco_hydro_17 (Glycosyl hydrolases family 17) (รปท 17) ซงเอนไซม Glycosyl hydrolases เปนเอนไซมสาคญทมบทบาทเกยวของกบกระบวนการสรางและสลายคารโบไฮเดรต (Carbohydrate metabolism) Glyco_hydro_17 เปนโดเมนหลกทใชในการจาแนกประเภทของกลมโปรตน โดยพบวา Glycosyl hydrolases family 17 signature จดอยในกลม basic มสญญาณเปนกรดอะมโน 14 ตว คอ LeVVVSESGWPSaG (รปท 18) บรเวณอนรกษลาดบเบสของโปรตนชนดนประกอบไปดวย tryptophan residue ซาๆ กน ซงเปนบรเวณสาคญทเกยวของกบการทาปฏกรยากนของ glucan substrates

รปท 17 โดเมน Glyco_hydro_17 ของโปรตน HbPR-2 โดยใชโปรแกรม Blastp (http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi)

47

รปท 18 ผลการทา sequence alignment ของลาดบกรดอะมโนทแปลมาจากลาดบนวคลโอไทด กบโปรตน HbPR-2 จากยางพารา (ABG49448.1, ABN09653.1 และ AFJ97274.1) บนฐานขอมล NCBI ใชโปรแกรม Clustal-X alignment

48


ผลการทา PCR (รปท 16) โดยใช cDNA เปนแมแบบจากใบยางพารา โดยใช Degenerate primer ของยน HbPR-3 ซงไพรเมอร (Forwars: 5’ ATGGGCWACWGCACCAGACGG 3’, Reverse: 5’ CCACCGTTRATGATGTTYGT 3’) ซงออกแบบมาจาก Bupleurum kaoi (Accession no. FN667836.1), Vigna unguiculata (Accession no. AB027154.1), และ Bupleurum kaoi (Accession no. FN667836.1) ยน PR-3 เปนยนทเกยวของกบการผลตและสะสมโปรตนในพชทถกรกรานจากเชอโรค โปรตนดงกลาวมบทบาทตอตานการเจรญเตบโตของเชอรา (antifungal protein) โดยไพรเมอรทใชในการเพมปรมาณ DNA ของยน HbPR-3 มขนาดประมาณ 400 bp หลงการเพมปรมาณ PCR พบวาไดผลผลต PCR ขนาดประมาณ 400 คเบส (รปท 19) ซงใกลเคยงกนกบขนาดไพรเมอรทไดออกแบบไว จงไดทาการโคลนยนและสงตวอยางวเคราะกลาดบเบส

รปท 19 PCR product ทไดจากการทา PCR โดยใช denenerate primer ของยน HbPR-3 ขนาดประมาณ 400 bp; เลน M: 100 bp plus DNA ladder, เลน 2: Negative control และเลน 3: PCR product ของยน HbPR-3 จาก cDNA ของใบยางพาราพนธ RRIM600

49

หลงจากสง PCR product ทเพมปรมาณไดไปหาลาดบนวคลโอไทดพบวาไดลาดบนวคลโอไทด

ของยน HbPR-3 ดงแสดงในรปท 20 ซงอานลาดบนวคลโอไทดได 390 คเบส ผลจากการบลาสนวคลโอไทด (Blastn) ของยน HbPR-3 พบวายนดงกลาวมสวนคลายกบยน class I chitinase ในยางพารา (Accession no. AJ431363.1, AJ238579.1, KF648872.1, และ KF648873.1) 98-99%

รปท 20 ลาดบเบสบางสวนของยน HbPR-3 ทไดจากการออบแบบ Degenerate primer จาก

Bupleurum kaoi (Accession no. FN667836.1), Vigna unguiculata (Accession no. AB027154.1), และ Bupleurum kaoi (Accession no. FN667836.1)

จากนนทาการแปลลาดบนวคลโอไทดทไดเปนลาดบกรดอะมโนเพอหาบรเวณทเปน coding sequences ผานทางโปรแกรมในเวบไซตhttp://au.expasy.org/tools/dna.html และโปรแกรม http://reverse-complement.com/translate_protein/ พบวาลาดบนวคลโอไทดทเรมแปลรหสไดมทงหมด 129 กรดอะมโน เรมจากตาแหนง TGG ซงเปนตาแหนงของกรดอะมโนทรปโตแฟน (Tryptophan; Trp, W) (รปท 21)

50

รปท 21 ลาดบกรดอะมโนบางสวนของโปรตน HbPR-3 โดยรหสแรกทเรมตนแปลรหสไดคอ TGG (Tryptophan; Trp, W)

Chitinases เปนเอนไซมททาหนาทเปนตวเรงปฏกรยาการเกด hydrolysis ของ ß-1,4-N-

acetyl-D-glucosamine linkages ในสายพอลเมอรของ chitin และเปนหนงในสมาชกของ glycosyl hydrolases หลงจากการ blast ลาดบกรดอะมโนของโปรตน HbPR-3 กบฐานขอมล GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) พบบร เ วณส าคญของล าดบกรดอะม โน คอ chitinase_glyco_hydro_19 หรอ CHITINASE_19_2 ดงแสดงในรปท 22 Chitinases family 19 เปนเอนไซมทไดมาจากพช ทาหนาทในการปองกนตวเองจากเชอราและแมลงดวยการยอยทาลายผนงเซลลของเชอราและแมลงทม chitin เปนองคประกอบ Chitinases family 19 ม Domain ทสาคญเรยกวา chitinase_glyco_hydro_19 หรอ CHITINASE_19_2 โดยมลาดบกรดอะมโนคอ ISFkAAIWFWM (รปท 23) ทาหนาทเปนตวสงสญญาณ

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

51

รปท 22 แสดงตาแหนงของโดเมน chitinase_glyco_hydro_19 ทไดจากการ blastp ของโปรตน HbPR-3

รปท 23 ผลการทา sequence alignment ของลาดบกรดอะมโนทแปลมาจากลาดบนวคลโอไทด กบโปรตน HbPR-3 จากยางพารา (Accession no. CAD24068.1, CAC42881.1, และ AHF88836.1) บนฐานขอมล NCBI ใชโปรแกรม Clustal-X alignment

52


HbPR-4 เปนกลมของยนทมบทบาทเกยวของกบกลไกการปองกนตนเองของพชเมอถกรกรานจากเชอราเชนเดยวกบ HbPR-1, HbPR-2 และ HbPR-3 ทาการออกแบบ Degenerate primer (Forward: 5’ GAGCAACWTACMATWWCTACAA 3’, Reverse: 5’ GCAYTGATCMACKATTCTCAC 3’) เพอศกษาการแสดงออกของยนดงกลาวโดยใช cDNA จากใบยางพาราเปนแมแบบในการทาปฏกรยา PCR

ผลการทา PCR (รปท 24) จากตวอยาง cDNA โดยใช Degenerate primer PR-4 (PR4_F1, PR4_R1) และ ซงมขนาดประมาณ 200 bp ผลจากการเพมปรมาณดเอนเอโดยใชไพรเมอรคดงกลาว พบวาไดยนขนาดใกลเคยงกบทไดทาการออกแบบไพรเมอร จากนนจงทาการโคลนยน และวเคราะหลาดบเบส

รปท 24 PCR product ทไดจากการทา PCR โดยใช denenerate primer ของยน HbPR-4 ขนาด

ประมาณ 200 bp; เลน M: 100 bp plus DNA ladder, เลน 2 และ เลน 3: PCR product ของยน PR-4 จาก cDNA ของใบยางพาราพนธ RRIM600

สาหรบการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดบางสวนของยน HbPR-4 จากไพรเมอรทไดทาการ

ออกแบบพบวานวคลโอไทดของยน HbPR-4 มขนาด 233 bp ดงแสดงในรปท 25 ซงใกลเคยงกบขนาดของยน PR-4 ทไดออกแบบไพรเมอรไว และเมอทาการเปรยบเทยบลาดบเบสยน HbPR-4 กบฐานขอมล

53

ใน Genbank พบวายน HbPR-4 สวนคลายกบโปรตน PR4 ในพชอนๆ ไดแก Vitis vinifera (Accession no. AAC33732.1) 81%, Vaccinium virgatum (Accession no. AIE39008.1) 81%, และ Populus euphratica (Accession no. XP_011038567.1) 79%

รปท 25 ลาดบเบสบางสวนของยน HbPR-4 ทไดจากการออบแบบ Degenerate primer จาก Vitis vinifera (Accession no AF061329.1), Vitis pseudoreticulata (Accession no. JN977472.1), และ Vaccinium virgatum (Accession no. KJ746904.1)

การแปลลาดบนวคลโอไทดทไดเปนลาดบกรดอะมโนเพอหาบรเวณทเปน coding sequences

ของยน HbPR-4 พบวาสามารถแปลรหสได 80 กรดอะมโน โดยเรมตนแปลรหสไดทรหส GCA แปลรหสไดกรดอะมโนอะลานน (Alanine; A) (รปท 26)

54

รปท 26 ลาดบกรดอะมโนบางสวนของโปรตน HbPR-4 โดยรหสแรกทเรมตนแปลรหสไดคอกรดอะมโนอะลานน (Alanine; A (CGA))

เม อน าล าดบกรดอะม โนของโปรตน HbPR-4 มาว เคราะห โดย ใช โปรแกรม Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) กบฐานขอมลของ GenBank พบวาลาดบกรดอะมโนดงกลาวนมความคลายคลงกบโปรตน HbPR-4 ในพชอนๆ ดงน Populus trichocarpa (XP_002319077.1) 81%, Vitis vinifera (ABN09653.1) 81% และ Populus euphratica (AFJ97274.1) 79%

รปท 27 ตาแหนงของ Barwin domain ทไดจากการ blastp ของโปรตน HbPR-4 โดยใชฐานขอมลใน

GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)


55

นอกจากนยงพบบรเวณสาคญของลาดบกรดอะมโน คอ Barwin ซงเปนโดเมนทใชในการจาแนกประเภทของกลมโปรตนชนดน จดอยในกลม Barwin superfamily (รปท 27) โดเมนดงกลาวนมบรเวณ Consensus pattern เปน C-G-[KR]-C-L-x-V-x-N ซงเมอวเคราะหลาดบกรดอะมโนของโปรตน HbPR-4 พบวามบรเวณ Consensus pattern ในตาแหนงท 54-62 โดยมลาดบกรดอะมโนคอ CGKCLsVtN ยงไปกวานน Barwin domain signature ยงเปนตาแหนงสาคญในการจบกบ chitin ซงเปนผนงเซลลของเชอรา Barwin superfamily ประกอบดวย 6 cysteines ซงเกยวของกบการสรางพนธะไดซลไฟดของโปรตน (รปท 28) จากรปแสดงตาแหนงของ cysteine เพยง 5 ตาแหนงเทานน (ลกศรเสนทบ) ซงยงขาด cysteine อก 1 ตาแหนง (ลกศรเสนประ)

รปท 28 ผลการทา sequence alignment ของลาดบกรดอะมโนทแปลมาจากลาดบนวคลโอไทดกบโปรตน HbPR-4 จากพชอนๆ ไดแก Vitis vinifera (Accession no. AAC33732.1), Populus euphratica (Accession no. XP_011032398.1) และ Vaccinium virgatum (Accession no. AIE39008.1) บนฐานขอมล NCBI ใชโปรแกรม Clustal-X alignment โดยกรอบสเหลยมสแดงแสดงตาแหนง Consensus pattern ลกศรเสนทบสเขยวแสดงตาแหนง cysteine 5 ตาแหนง ทสามารถแปลรหสไดจากลาดบนวคลโอไทดและลกศรเสนประสเขยนแสดงตาแหนงของ cysteine ทขาดหายไป

56


โปรตน PR-5 มความคลายกนกบโปรตน thaumatin จงถกเรยกอกอยางหนงวา Thaumatin-like proteins (TL proteins) โปรตนในกลมนมความเกยวของกบระบบ Acquired systemic resistance ยบยงการเจรญเตบโตของเสนใยเชอราและการงอกของสปอร จากการออกแบบ Degenerate primer (PR5_F1, PR5_R2) สาหรบศกษาลาดบนวคลโอไทดของยน HbPR5 พบวาสามารถเพมปรมาณชนยนของยนดงกลาวไดประมาณ 500 คเบส ดงแดงในรปท 29 ซงขนาดใกลเคยงกบทไดทาการออกแบบไพรเมอร จากนนจงทาการโคลนยน และวเคราะหลาดบเบส

รปท 29 PCR product ทไดจากการทา PCR โดยใช denenerate primer ของยน HbPR5 ขนาดประมาณ 500 bp; เลน M: 100 bp plus DNA ladder, เลน 2 และ เลน 3: PCR product ของยน PR-5 จาก cDNA ของใบยางพาราพนธ RRIM600

ผลการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดบางสวนของยน HbPR5พบวามขนาด 517 คเบส (รปท 30) ซงใกลเคยงกบขนาดของยน HbPR5ทไดออกแบบไพรเมอรไว และเมอทาการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของยน HbPR5กบพชชนดอนๆ โดยใชฐานขอมลใน Genbank พบวายน HbPR5มสวนคลายเคยงกบพชอนๆ ไดแก Ricinus communis (Accession no. XM_002509704.2) 60%, Citrus sinensis (Accession no. XM_006477370.2) 59% และ Gossypium raimondii (Accession no. XM_012616383.1) 58%

57

รปท 30 ลาดบเบสบางสวนของยน HbPR5ทไดจากการออบแบบ Degenerate primer ขนาด 517 ค

เบส

การแปลลาดบนวคลโอไทดทไดเปนลาดบกรดอะมโนเพอหาบรเวณทเปน coding sequences ของยน PR-5 พบวาสามารถแปลรหสได 172 กรดอะมโน โดยเรมตนแปลรหสไดทรหส AAC แปลรหสไดกรดอะมโนแอสพาราจน (Asparagine; N) (รปท 31) เมอนาลาดบกรดอะมโนของโปรตน PR-5 มาวเคราะหโดยใชโปรแกรม Blastp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) กบฐานขอมลของ GenBank พบวาลาดบกรดอะมโนดงกลาวนมความคลายคลงกบโปรตน HbPR-5 ในพชอนๆ ไดแก Ricinus communis (Accession No. XP_002509750.1), Citrus sinensis (Accession No. XP_006477433.1) และ Theobroma cacao (Accession No. XP_007040164.1)

นอกจากนผลจากการบลาสยงพบโดเมน ทสาคญ คอ GHG4-TLP-SF domain (รปท 32) ซงเปนโดเมนทมความสาคญในกลม Thaumatin family และมความเกยวของกบ pathogenesis-related group 5 (PR-5), เนองจาก TL proteins ทสะสมอยในพชสามารถตอบสนองตอการเขาทาลายจากเชอโรคของพชผานกจกรรม antifungal activity โดเมน GHG4-TLP-SF มรปแบบการสงสญญาณและบรเวณอนรกษ 16 cysteine residues จากรปท 33 (ลกศร) สามารถพบเพยง 10 cysteine residues เทานน ซงยงขาดอก 6 cysteine residues

58

รปท 31 ลาดบกรดอะมโนบางสวนของโปรตน HbPR-5 โดยรหสแรกทเรมตนแปลรหสไดคอกรดอะมโน

แอสพาราจน (Asparagine; N (ACC))

รปท 32 ตาแหนงของ GHG4-TLP-SF domain ทไดจากการ blastp ของโปรตน HbPR-5 โดยใช

ฐานขอมลใน GenBank (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)


59

รปท 33 ผลการทา sequence alignment ของลาดบกรดอะมโนทแปลมาจากลาดบนวคลโอไทดกบ

โปรตน HbPR-5 จากพชอนๆ ไดแก Ricinus communis (RcPR-5; XM_002509704.2), Gossypium raimondii (GrPR-5; XP_012471837.1) และ Theobroma cacao (TcOsmotin; XP_007040164.1)

60

6. ผลกำรแสดงออกของยน PRs ในเนอเยอตำงๆ ของยำงพำรำ

ศกษาการแสดงออกของยน HbPR-1 และ HbPR-3 ในเนอเยอตางๆ ของยางพาราพนธ RRIM600 ไดแก เมลดออน เมลดแก เปลอก ใบออน ใบแก โดยวธ Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) เพอศกษาการแสดงออกของยนในเนอเยอทเฉพาะเจาะจง (tissue specific gene) โดยใชไพรเมอรจาเพาะกบยน HbPR-1 และ HbPR-3 และใชยน 18S rRNA เปนยนเปรยบเทยบมาตรฐาน ผลการศกษาพบวายน HbPR-1 และ HbPR-3 มการแสดงออกในทกเนอเยอททาการศกษา โดยมการแสดงออกสงสดในเปลอกยาง เมลดแกสงกวาเมลดออน และใบแกสงกวาใบออน ดงแสดงในรปท 34

รปท 34 การแสดงออกของยน HbPR-1 และ HbPR-3 ในเนอเยอตาง ๆ ของยางพารา

61

7. ผลกำรแสดงออกของยนในยำงพำรำสำยพนธตำงๆ

การศกษาการแสดงออกของยนในกลม PRs (HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5) โดยเทคนค Quantitative real time PCR ใชวธการในการปลกเชอตนกลายางพาราในหองทดลอง โดยใชยางพาราพนธ PB5/51, RRIM600 และ BPM24 ซงผานการทดสอบความทนทานตอโรครากขาวแลวจากการทดลองของ จรสศรและคณะ (2558) โดยพบวา จากการนาเมลดยางพาราทเพาะไวในกระบะทราย จานวน 9 สายพนธ ไดแก BPM24, GT1, JVP80, PB235, PB5/51, RRIM600, RRIM623, RRIT251, และสงขลา36 สาหรบใชเปนตนกลาในการทดสอบโรครากขาว เมอตนกลามอาย 5 เดอน สามารถตงตวได และมการเจรญเตบโตทด จงทาการปลกเชอบรเวณรากยาง โดยเตรยม inoculum บนเปลอกหมเมลดยางพาราทผานการนงฆาเชอ เปนเวลา 15 วน และปลกเชอโดยวางเปลอกหมเมลดยางพาราทตดเชอราใหสมผสกบราก และคลมดวยใบยางพารา จากการประเมนระดบความรนแรงในการเกดโรคในตนยางพาราพนธตางๆ พบวา ยางพาราพนธ PB5/51 และ PB235 มความทนทานตอโรครากขาวมากทสด โดยมดชนการเกดโรค 44.25 และ 52.75% ตามลาดบ และมจานวนตนทรอดตายจากการเขาทาลายของเชอรากขาวมากกวา 80.00% รองลงมาคอ ยางพาราพนธ RRIM600, RRIM623, สงขลา36 และ RRIT251 ตามลาดบ โดยยางพาราพนธ BPM24 ออนแอตอการเขาทาลายของโรคมากทสดทงระดบการเกดโรคและจานวนตนทตาย ดงนนในการศกษาครงนจงไดคดเลอกตนกลาของยางพาราพนธ PB5/51, RRIM600 และ BPM24 รวมทงยางพาราพนธพนเมอง ไดแก PSU1 และ Bangruk มาใชในการเปรยบเทยบการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 ทาการตรวจสอบทชวโมงท 0, 12, 24, 48, 72 และ 96 ชวโมง หลงการปลกเชอราโรครากขาว เนองจากชวโมงท 3 และ 6 ททาการตรวจสอบเบองตนโดยเทคนค RT-PCR ใหผลการแสดงออกของยนไมแตกตางกนมากนก จากการตรวจสอบการแสดงออกของยนโดยเทคนค Quantitative real time PCR ในยางพาราทง 5 พนธ พบวายน HbPR4 และ HbPR5 มการแสดงออกสงกวายน PR อนๆ ในยางพาราพนธ BPM24 และ PB5/51 รองลงมาไดแก ยน HbPR1, HbPR3 และ HbPR2 ตามลาดบ โดยเฉพาะยน HbPR2 และ HbPR3 ทมการแสดงออกคอนขางนอยเมอเปรยบเทยบกบยน PR อนๆ ซงมแนวโนมเหมอนกนในยางพาราทง 3 พนธททาการศกษา (รปท 35) เมอพจารณาการแสดงออกของยน HbPR1, HbPR4 และ HbPR5 ในยางพาราพนธ PB5/51 ซงจดอยกลมทนทานตอโรครากขาว พบวายนทง 3 มแนวโนมการแสดงออกทสงขนตามระยะเวลาหลงการปลกเชอ โดยมการแสดงออกของยนสงทสดท 48 ชวโมง หลงจากนนจะมแนวโนมลดลงเลกนอยและจะเรมคงทจนถงชวโมงท 96 หลงการปลกเชอ สวนยน PR2 และ PR3 มการแสดงออกคงทตงแตชวโมงท 0-48 หลงการปลกเชอ และมการแสดงออกของยนเพมขนตามลาดบจากชวโมงท 48 จนถงชวโมงท 96 หลงการปลกเชอ

62

สวนยางพาราพนธ RRIM600 ซงจดวาเปนกลมของยางพาราทคอนขางออนแอตอโรครากขาว ม

รปแบบการแสดงออกของยนในกลม PRs ทแตกตางจากยางพาราพนธ PB5/51 คอ ในชวโมงท 0-24 หลงจากการปลกเชอการแสดงออกของยนในกลม PRs มแนวโนมคงท ยกเวนยน HbPR3 ทมการแสดงออกลดลง และยน HbPR2 ทมการแสดงออกสงขนมากกวายางพาราพนธอนๆ หลงจากชวโมงท 24 ยนในกลม PRs มแนวโนมของการแสดงออกเพมสงขน โดยเฉพาะยน PR5 และ PR1 ทมการแสดงออกสงทชวโมงท 48 หลงจากนนมแนวโนมคงท สวนยน PR4 มการแสดงออกสงสดทชวโมงท 48 หลงจากนนการแสดงออกของยนลดลงอยางเหนไดชด

ยางพาราพนธ BPM24 ซงเปนพนธออนแอตอโรครากขาว มรปแบบการแสดงออกของยนในกลม PRs ทคอนขางคลายคลงกบยางพาราพนธ PB5/51 แตมการแสดงออกของยนนอยกวา โดยพบวาการแสดงออกของยนในกลม PRs มแนวโนมเพมสงขนในชวโมงท 12-48 หลงการปลกเชอ หลงจากนนการแสดงออกยนจะคงทในยน HbPR1 และ HbPR5 และมการแสดงออกลดลงในยน HbPR2, HbPR3, และ HbPR4 (รปท 36)

เมอพจารณาถงความสมพนธระหวางการแสดงออกของยนในกลม PRs และความสามารถในการทนทานตอโรครากขาว พบวา ยนทมศกยภาพสามารถนามาใชเพอคดเลอกยางพาราทมความทนทานตอโรครากขาว นาจะเปนยน PR4 และ PR5 โดยยนดงกลาวมการแสดงออกสงในยางพาราพนธ PB5/51 ซงมความทนทานตอโรครากขาว ยางพาราพนธ PB5/51 มแนวโนมการแสดงออกของยนเปนไปในทางบวก กลาวคอ มการแสดงออกของยนเพมมากขนในทกยนททาการศกษาอยางมนยสาคญ ตรงขามกบกลมยางพาราทออนแอตอโรครากขาวทมการแสดงออกของยน PR4 และ PR5 นอยกวา โดย RRIM600 มการแสดงออกของยนลดตาลงเมอเขาสชวโมงท 48-96 ซงแนวโนมการแสดงออกของยนในโคลน RRIM600 นคลายกนกบแนวโนมการแสดงออกของยนในยางพาราพนธ BPM24 ในสวนของยางพาราพนธพนเมองทงสองพนธ คอ PSU1 และ Bangruk มการแสดงออกของยนในกลม PRs คอนขางตาตลอดระยะของการปลกเชอ เมอเปรยบเทยบกบยางพาราพนธอนๆ จงคาดวานาจะมแนวโนมทจะไมทนทานตอโรครากขาว อยางไรกตามควรการทดสอบการทนทานตอโรคในโรงเรอนเพอนาขอมลมาประกอบการตดสนใจ

63

รปท 35 การแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 ในยางพาราโคลน PSU1, Bangrak, PB5/51, RRIM600 และ BPM24 ดวยเทคนค qRT-PCR โดยใช specific primer และ 18S rRNA เปน internal control หลงจากปลกถายเชอ R.microporus ทเวลา 0, 12, 24, 48, 72 และ 96 ชวโมง โดย ก: การแสดงออกของยน HbPR-1, ข: การแสดงออกของยน HbPR-2, ค: การแสดงออกของยน HbPR-3, ง: การแสดงออกของยน HbPR-4 และ จ: การแสดงออกของยน HbPR-5

64

รปท 36 แนวโนมการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 ในตนกลายางพาราอาย 2 เดอนหลงจากปลกถายเชอรากอโรครากขาว (R. microporus) เปนเวลา 0, 12, 24, 48, 72 และ 96 ชวโมง

65

วจำรณผลกำรทดลอง

จากการศกษาของ Van Loon และ Van Strien (1999) พบวา โปรตน PR-1 มโครงสราง

จาเพาะคอ ม hydrophobic signal sequence จงเปน extracellular protein นอกจากนนยงประกอบดวย cysteine 6 residues เพอเปนองคประกอบสาคญในการสรางพนธะไดซลไฟด (disulfide

bond) และม 4α-helixes และ 4ß-strands ซงโครงสรางนจะทาใหการสรางพนธะไดซลไฟดของ cysteine ทง 6 residues มความเสถยรมากขน (Hoegen et al., 2002) นอกจากนเมอเปรยบเทยบลาดบกรดอะมโนทไดกบโปรตน P14a (PR-1b ของมะเขอเทศ) (Fernández et al.,1997) พบวา

HeveaPR-1_A และ HeveaPR-1_B ประกอบดวย 2α-helixes และ 3ß-strands ระดบการแสดงออกของโปรตน PR-1 ทมอยแลวในธรรมชาต นบวาอยในระดบทตามากเมอ

เทยบกบระดบการแสดงออกของโปรตน PR-1 ทเพมขนประมาณ 103 -104 เทาภายหลงจากการกระตนโดย TMV และอาจเพมมากขนถง 10% ของโปรตนทละลายนาไดในใบยาสบ (Hooft Van Huijsduijnen et al., 1986) จนอาจกลาวไดวาโปรตน PR-1 เปน PRs กลมทเพมมากทสดหลงจากการตดเชอ นอกจากนยงสามารถพบโปรตน PR-1 ไดทงบรเวณทตดเชอ บรเวณขางเคยงรวมทงบรเวณทหางไกลออกไปดวยมงานวจยทศกษาการแสดงออกของโปรตน PR-1 ทงในระดบโปรตนและระดบยนอยางกวางขวาง นบตงแตมการคนพบโปรตน PR-1 ในยาสบ ดงทกลาวขางตนแลววาจะมการผลตโปรตนชนดนมากเมอพชมการตดเชอหรอถกกระตนจากสารตางๆ นกวจยจงสนใจทจะชกนาใหพชมการผลตโปรตน PR-1 ในระดบสงโดยการกระตนพชดวยสารกระตนตางๆ เพอใหพชเกดภาวะ SAR จนสามารถตานทานตอเชอได ยกตวอยางจากการศกษาของ Rauscher และคณะ (1999) ซงใช SA และ 2,6-dichloro-isonicotinic acid (INA) ในการยบยงโรคใบสนมทเกดจากเชอรา U. fabae ในถวลนเตา พบวาสารกระตนทง 2 ชนดนชวยลดการตดเชอลงได โดยการลดความหนาแนนของตม (pustule) ทเกดจากโรคใบสนมไดและพบวาความตานทานทถกกระตนโดย SA และ INA เปนไปในทศทางเดยวกบการเพมขนของโปรตน PR-1a นอกจากนยงมการใช benzothiadiazole (BTH) ซงเปน analog กบ SA ในการเปนสารกระตนใหพชเกดภาวะ SAR ไดแก การศกษาของ Kohler (2002) ซงใช BTH ความเขมขน 100 ไมโครโมลาร ฉดพน Arabidopsis หลงจากนน 3 วน จงฉดพนดวยเชอ Pseudomonas syringae pv. tomato แลววเคราะหการแสดงออกของยนพบวามการแสดงออกของยน PR-1 ในระดบสงในขณะทมการตดเชอดงกลาวลดลง

นอกจากนยงพบวามการสะสมโปรตน PR-1 ในปรมาณทแตกตางกนในเนอเยอทแตกตางกนของพชดวย จากการศกษาของ Kim และ Hwang (2000) ซงศกษาโปรตน PR-1 กลม basic ในพรกไทย พบวามการแสดงออกของโปรตน PR-1 กลม basic มากทสดในใบทผานการทดสอบดวย SA และ

66

methyl jasmonate (MeJA) แตในเนอเยอชดควบคมทไมไดทดสอบใดๆ กลบพบวามการแสดงออกสงทสดในเนอเยอรากและดอก โดยไมพบการแสดงออกเลยในสวน ใบ ลาตนและผลสก ทงนอาจขนอยกบความตองการการปกปองจากเชอโรคทแตกตางกนในเนอเยอแตละชนด นอกจากนการแสดงออกของยน PRs นยงเกยวของกบระบบการสงสญญาณของกลไกการปองกนตนเองของพชดวย โดยพชสามารถสงสญญาณการปองกนตนเองไดทงจากบรเวณถกรกรานจากเชอโรคและบรเวณทไกลออกไป สาหรบการแสดงออกของยน PR-1 และ PR-3 ในเนอเยอทเฉพาะเจาะจง (tissue specific gene) ของยางพาราทไมเปนโรคโดยใชยน 18S rDNA เปนยนเปรยบเทยบมาตรฐาน พบวายน PR-1 และ PR-3 มการแสดงออกในทกเนอเยอททาการศกษา โดยมการแสดงออกสงสดในเปลอกยาง เมลดแกสงกวาเมลดออน และใบแกสงกวาใบออน ซงสอดคลองกบ Edreva (2005) ทไดกลาวไววาในธรรมชาตของพชนนพบวามการแสดงออกของยน PRs แตการแสดงออกของยนจะมากหรอนอยนนขนอยกบพนธกรรมของพชตนนนๆ โดยในพชทมความตานทานสงอยแลวในธรรมชาต (พชพนธตานทาน) มกจะมการแสดงออกของ PRs ในระดบสง (Edreva, 2005)

การศกษาการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 ในยางพาราพนธ PSU1, Bangrak, PB5/51, RRIM600 และ BPM24 หลงจากปลกถายเชอรา R. microporus ซงเปนเชอสาเหตของโรครากขาวในตนกลายางพาราอาย 2 เดอน จากรปท 35 ก เปนการแสดงออกของยน HbPR-1 ในยางพาราพนธ PSU1, Bangrak, PB5/51, RRIM600 และ BPM24 โดยจากรปพบวายางพาราพนธ PB5/51 มการแสดงออกของยน HbPR-1 เพมมากขนตงแตชวงเวลา 0-48 ชวโมง และมการแสดงออกลดลงเมอเขาสชวโมงท 72 แตมการแสดงออกของยนดงกลาวเพมอกครงในชวงเวลาท 96 ชวโมง และทชวงเวลานยงเปนชวงเวลาทมการแสดงออกของยนดงกลาวสงทสดดวย สาหรบยางพาราพนธ BPM24 มการแสดงออกของยน HbPR-1 เพมขนเรอยๆ ในชวง 0-24 ชวโมง และทชวโมงท 24 นยนยงมการแสดงออกสงสดดวย หลงจากชวโมงท 24 ยนมการแสดงออกลดลงเพยงเลกนอยและมการแสดงออกคงทซงคลายกนกบการแสดงออกของยน HbPR-1 ในโคลน Bangrak ทมการแสดงออกของยนสงสดในชวโมงท 12 แตหลงจากชวงโมงท 12 ยนมการแสดงออกลดลงเลกนอยและคอนขางคงท สาหรบยางพาราพนธ RRIM600 และ PSU1 มการแสดงออกของยนไปในทศทางเดยวกน กลาวคอในชวงแรกทมการปลกถายเชอ (0-24 ชวโมง) ยนดงกลาวมการแสดงออกลดตาลงเมอเทยบกบตวควบคมแตกลบมการแสดงออกเพมมากขนเมอผานชวงเวลาดงกลาวไปแลว (ชวโมงท 96) การแสดงออกของยน HbPR-2 และ HbPR-3 จากรปท 35 ข และ 35 ค มการแสดงออกของยนทง 2 กลมไปในทศทางเดยวกน กลาวคอ จากรปแสดงใหเหนวายางพาราพนธ PB5/51 มแนวโนมการแสดงออกของยนเพมมากขน แมวาในชวโมงท 24-48 มการแสดงออกลดลงแตหลงจากชวโมงท 48 ยน HbPR-2 มการแสดงออกเพมขนอยางตอเนอง ในขณะทพนธ RRIM600 แมวาในชวงแรกจะมการ

67

แสดงออกเพมขนแตเมอเวลาผานไปจนกระทงถงชวโมงท 96 ยนดงกลาวมการแสดงออกลดลงเรอยๆ เชนเดยวกบโคลน BPM24, Bangrak และ PSU1 สาหรบการแสดงออกของยน HbPR-4 พบวายางพาราพนธ PB5/51 มการแสดงออกสงขนเรอยๆ และสงทสดในชวโมงท 48 หลงจากชวโมงท 48 มการแสดงออกของยนคอนขางคงท สาหรบการแสดงออกของยางพาราพนธ BPM24 มรปแบบคลายกนกบพนธ PB5/51 กลาวคอมการแสดงออกของยนเพมมากขนในชวงแรก และคอนขางคงทหลงจากชวโมงท 48 ในขณะทยางพาราโคลน Bangrak, PSU1 และ RRIM600 มการแสดงออกของยนลดตาลงมากอยางมนยสาคญเมอเทยบกบชวโมงท 0 (รปท 35 ง)

ผลการทดลองในครงนแตกตางจากการศกษาของ Oghenekaro และคณะในป 2016 ททาการเปรยบเทยบการแสดงออกของยน PRs (PR1, PR3, PR5, PR8 และ PR9) ในยางพารา (Hevea brasiliensis) พนธRRIM612 ซงจดเปนพนธทออนแอมาก (highly susceptible) และ PR107 ซงจดเปนพนธทออนแอนอย (least susceptible) ภายหลงจากการปลกถายเชอ R. microporus พบวาหลงจากปลกถายเชอราดงกลาวผานไป 5 สปดาห ยางพาราพนธ PR107 มการแสดงออกของยน PR1 มากกวายางพาราพนธ RRIM612 แตการแสดงออกลดลง (down regulation) เมอเปรยบเทยบกบชดควบคมทไมไดปลกถายเชอ สวนยน PR3 class I chitinase มการแสดงออกเพมมากขนในพนธ RRIM612 นอกจากนไมพบความแตกตางของการแสดงออกของยน PR 5 ระหวางยางพาราทงสองพนธ เมอเปรยบเทยบกบชดควบคม ยน PR9 (class IV peroxidase) มการแสดงออกเพมมากขนในโคลน PR107 สาหรบ PR8 ใหผลเชนเดยวกบยน PR1 คอมการแสดงออกสงในชดควบคม ซงสงกวาชดการทดลองทมการปลกถายเชอลงไป จากการศกษานแสดงใหเหนวายน PRs มการแสดงออกในระดบทหลากหลายในยางพาราทง 2 พนธททาการศกษาซงผลการทดลองของเขาชใหเหนวาลกษณะทางพนธกรรมของยางพาราและพนธ มบทบาทสาคญตอการแสดงออกของยนทเกยวของกบกลไกการตานทานโรค (defence gene expression) Oghenekaro et al. (2016) ทงนระยะเวลาในการเกบตวอยางหลงการปลกเชอเพอนามาวเคราะหการแสดงออกของยนทสนใจอาจทาใหไดผลการทดลองทแตกตางกนดวย

นอกจากนมการศกษาการแสดงออกของยนในกลม PRs ในพชอนๆ อกหลายชนด และพบวาใหผลทแตกตางกนออกไป เชน ในมะเชอเทศทมการปลกถายเชอ Verticilium พบวามการแสดงออกของยน PR1, PR4 และ PR5 ทสงเมอเปรยบเทยบกบชดควบคมทไมไดทาการปลกเชอ (van Esse et al., 2009) อยางไรกตามการเปรยบเทยบการแสดงออกของยนในกลม PR ไดแก PR1, PR2, PR3, PR5 และ PR8 ใน Humulus lupulus (Hop) ใน hop 2 พนธ คอ พนธทนทาน (Wye Target) และพนธออนแอ (Celeia) หลงปลกเชอรา Verticilium albo-atrum ทระยะเวลา 10, 20 และ 30 วน

68

หลงการปลกเชอ พบวาในพนธทออนแอมการแสดงออกของยนในกลม PRs ทสงกวาพนธตานทาน (Cregeen et al., 2015)

จากผลการทดลองในครงนพบวายนทมบทบาทมากในการตอบสนองตอเชอสาเหตโรครากขาวในยางพารา ไดแก HbPR4 และ HbPR5 ซงผลการทดลองเปนไปในทางเดยวกบ การทดลองของ Prasath et al. (2011) ทเปรยบเทยบการแสดงออกของยน PR5 ในพชตระกลขง หลงถกปลกเชอ Ralstonia solanacearum ซงเปนสาเหตของโรคเหยว พบวาขงทมความทนทานตอเชอดงกลาวจะมการแสดงออกของยน PR5 เพมสงขนอยางรวดเรวตงแตชวโมงท 1 และสงสดท 4 ชวโมงหลงจากการปลกเชอ หลงจากนนการแสดงออกของยนจะคงท ตรงขามกบขงทมความออนแอตอเชอสาเหตดงกลาวทมการแสดงออกของยน PR5 ตากวา และคงทตลอดระยะเวลาททาการศกษา เชนเดยวกบการศกษาการแสดงออกของยน PR5 หรอเรยกอกอยางหนงวา OSM-1g ทสามารถผลตโปรตน Osmotin มบทบาทหนาทเกยวของกบ osmo-permeabilization ใน plasma membranes ของเชอรา การศกษาการแสดงออกของยน PR5 หลงปลกถายเชอรา Phytophthora infestans ซงเปนเชอกอโรคใบไหมในมนฝรง 2 สายพนธ ไดแก สายพนธ Hanna ซงเปนสายพนธตานทานโรค และสายพนธ Lady-Rosetta เปนสายพนธออนแอ หลงจากการปลกถายเชอเปนเวลา 6, 9, 12, 18, 24 และ 30 ชวโมง ผลการทดลองพบวา ยน PR5 มการแสดงออกแตกตางกนในมนฝรงทง 2 สายพนธหลงจากปลกถายเชอ โดยสายพนธ Hanna มการแสดงออกทเวลา 6 ชวโมงหลงปลกถายเชอ และการแสดงออกนเพมขนอยางตอเนองในชวง 9, 12, 18, 24 และ 30 ชวโมงหลงปลกถายเชอ ในขณะทสายพนธ Lady-Rosetta มการแสดงออกเรมตนทเวลา 12 hpi และเพมขนตอเนองจนถง 30 ชวโมงหลงปลกถายเชอ การแสดงออกอยางรวดเรวและเพมมากขนของยน PR5 ในสายพนธตานทานโรคของมนฝรงนชใหเหนวา ยน PR5 มความสมพนธกบกลไกการปองกนตนเองของมนฝรงตอเชอ Phytophthora infestans (El-Komy et al., 2010)

นอกจากนการศกษาการแสดงออกของยน LcPR4a ในถวเลนทล (Lens culinaris) สายพนธทออนแอและตานทานตอเชอ Ascochyta lentis ผลการทดลองชใหเหนวายน LcPR4a มการแสดงออกแตกตางกนในถวเลนทลทงสองสายพนธ โดยในชวง 2 ชวโมงแรกหลงการปลกถายเชอ A. lentis การแสดงออกของยนทงสองสายพนธมการแสดงออกเพมขนเลกนอยแตไมมความแตกตางทางสถต จากนน 6 ชวโมงหลงการปลกถายเชอ ยนดงกลาวมการแสดงออกลดลงเลกนอยซงไมมนยสาคญทางสตถเชนเดยวกน จนกระทง 12 ชวโมงหลงการปลกถายเชอระดบการแสดงออกของยนดงกลาวเพมขนอยางมนยสาคญในถวเลนทลทงสองสายพนธโดยมการแสดงออกในสายพนธทออนแอสงกวาสายพนธตานทาน แตอยางไรกตามหลงจากชวโมงท 12 พบวามเพยงสายพนธตานทานตอโรคเทานนทมการแสดงออกของยน LcPR4a เพมขนอยางตอเนอง (Vaghefi et al., 2013) ซงผลการทดลองนสอดคลองกบการ

69

แสดงออกของยน PRs ในยางพาราโคลน PB5/51 ทมการแสดงอยางตอเนองภายหลงจากการปลกถายเชอ

ในการทดลองของ ElMorsi et al. (2015) ทศกษาการแสดงออกของยน PR1, PR2, PR3, PR4 และ PR5 ในหวหอมทปลกถายเชอ Iris yellow spot virus ยน PR1 มการแสดงออกสงทสดเมอเปรยบเทยบกบยนในกลม PRs อนๆ โดยมการแสดงออกขนลงตลอดระยะเวลาการศกษา ตงแต 1 วนหลงปลกถายเช อ และแสดงออกสงสดในวนท 8 ; ยน PR2 มการแสดงออกนอยทสดเม อเปรยบเทยบกบยน PRs อนๆ แตการแสดงออกจะคอนขางคงทตลอดชวงระยะเวลาททาการศกษา คอ ตงแตวนท 1 ถง วนท 15 ของการปลกถายเชอ ; ยน PR3 มการแสดงออกสงรองลงมาจาก PR1 โดยมการแสดงออกสง 2 ชวง คอ ชวงแรกของการปลกถายเชอ (วนท 2 ; 20.19 เทา) หลงจากนนการแสดงออกลดลง และเพมขนอกครงในวนท 7-9 ของการปลกถายเชอ (25.90-46.99 เทา); ยน PR4 มการแสดงออกสงสดในวนท 1 ของการปลกถายเชอ (15.46 เทา) และรองลงมาในวนท 2 คอ 12.73 เทา หลงจากนนการแสดงลดลงตลอดชวงระยะเวลาศกษา สาหรบการแสดงออกของยน PR5 มการแสดงออกปานกลาง และมรปแบบการแสดงออกทขนลงตลอดระยะเวลาททาการศกษา โดยมการแสดงออกสงสดในวนท 1 หลงการปลกถายเชอ (5.38 เทา) หลงจากนนการแสดงออกของยนลดลง และเพมขนอกครง ในวนท 5 ของการปลกถายเชอ (4.72) ชวงเวลาในการเกบตวอยางหลงปลกถายเชอมผลอยางมากตอการศกษาการแสดงออกของยน เนองจากยนในกลม PRs อาจมการแสดงออกของยนทลดลง หรอเพมขนในบางระยะเวลาททาการศกษา และมความแตกตางกนไปในพชแตละชนด เชนเดยวกบผลการศกษาในคร งน ยนในกล ม PRs มการแสดงออกข นลงตลอดระยะเวลาททาการศกษา นอกจากนควรเพมระยะเวลาในการศกษาการแสดงออกของยนหลงปลกถายเชอใหนานขน เนองจากจะสงเกตเหนวา การแสดงออกของยนในกลม PRs ยงคงมการแสดงออกตอไปมไดลดลงดงเชนในงานทดลองอนๆ

70

สรปผลกำรทดลอง

กำรโคลนและศกษำสมบตของยนทมฤทธตำนทำนตอเชอรำ (antifungal protein) ในยำงพำรำ

Pathogenesis related genes ทเกยวของกบการผลตโปรตนซงมฤทธตอตานการเจรญเตบโตของเชอราแบงออกเปน 5 กลมไดแก PR-1, PR-2, PR-3, PR-4 และ PR-5 โดยยนกลมนมบทบาทสาคญในกลไกการปองกนตวเองของพชเมอถกรกรานจากเชอรา สาหรบในยางพาราสามารถโคลนยนทง 5 กลมนได โดยมรายละเอยดดงน

ยน PR-1 มขนาดเสนสมบรณของยน (coding sequences) 492 คเบส โดยผลจากการบลาสพบวายนชนดนมสวนคลายกนกบพช Populus trichocarpa (accession number XP_006379156.1) 78%, Citrus sinensis (accession number XP_006486820.1) 75% และ Nicotiana sylvestris (accession number XP_009787159.1) 74% สามารถแปลงเปนกรดอะมโนได 163 amino acid มนาหนกโมเลกล 17.69 กโลดาลตน และ pI 8.57 โดยทางดานปลาย 5’RACE คนพบบรเวณ poly G กอนถงจด start codon สาหรบดานปลาย 3’RACE คนพบบรเวณ poly A tail และ stop codon คอ TAA การวเคราะหลาดบกรดอะมโนพบโนเมนทสาคญคอ SCP_PR-1 like domain ซงเปน domain หลกของโปรตนกลมทถกขนสงออกนอกเซลลและจดอยในกลม cysteine-rich secretory proteins (CRISP) family ประกอบดวย cysteine 6 residues โดยลกษณะเหลานจดเปนลกษณะเดนของโปรตน PR-1 สาหรบ domain ทพบประกอบไปดวย 2 บรเวณ ไดแก CRISP1 บรเวณกรดอะมโนตาแหนงท 120-130 (GHYTQVVWrnS) และยงเปนบรเวณทมความอนรกษสงตดตอกนถง 8 residues คอ GHYTQVVW และ CRISP2 ตาแหนงท 146-157 (FIgCNYdPpGNF)

ยน PR-2 PR-3, PR-4 และ PR-5 สามารถโคลนยนเหลานไดเพยงบางสวน โดยสามารถโคลนยน PR-2 ไดเพยง 1120 คเบส ยน PR-2 มความคลายคลงกนกบยน beta-1,3-glucanase ใน Hevea brasiliensis clone GT 1 99% (accession no. EF222320.1) และ Hevea brasiliensis clone PB86 (accession no. DQ649474.1) 99% ลาดบนวคลโอไทดทเรมแปลรหสไดเรมจากตาแหนง GCG ซงเปนตาแหนงของกรดอะมโนอะลานน (Alanine; A) และมตาแหนง stop codon คอ TGA ซงตาแหนง stop codon นเปนตาแหนงเดยวกนกบยน PR-2 ใน Hevea brasiliensis clone GT 1 ผลการวเคราะหลาดบกรดอะมโนพบบรเวณสาคญของลาดบกรดอะมโน คอ Glyco_hydro_17 (Glycosyl hydrolases family 17) ซงเปนโดเมนทมความสาคญของโปรตนชนดน

สาหรบยน PR-3 นวคลโอไทดทสามารถโคลนไดมเพยง 390 คเบส ผลจากการบลาสนวคลโอไทด ของยน PR-3 พบวายนดงกลาวมสวนคลายกบยน class I chitinase ในยางพารา (Accession no. AJ431363.1, AJ238579.1, KF648872.1, และ KF648873.1) 98-99% ลาดบนวคลโอไทดทเรมแปล

71

รหสไดมทงหมด 129 กรดอะมโน เรมจากตาแหนง TGG ซงเปนตาแหนงของกรดอะมโนทรปโตแฟน ผลการวเคราะหลาดบกรดอะมโนพบบรเวณสาคญของลาดบกรดอะมโนคอ chitinase_glyco_hydro_19 ซงเปนโดเมนสาคญของเอนไซมชนดนทมความอนรกษสงในพช

ยน PR-4 ทสามารถโคลนไดมขนาด 233 คเบส ยน PR4 สวนคลายกบพชอนๆ ไดแก Vitis vinifera (Accession no. AAC33732.1) 81%, Vaccinium virgatum (Accession no. AIE39008.1) 81%, และ Populus euphratica (Accession no. XP_011038567.1) 79% สามารถแปลรหสได 80 กรดอะมโน โดยเรมตนแปลรหสไดทรหส GCA แปลรหสเปนกรดอะมโนอะลานน ผลการวเคราะหลาดบกรดอะมโนพบบรเวณสาคญของลาดบกรดอะมโน คอ Barwin ซงเปนโดเมนทใชในการจาแนกประเภทของกลมโปรตนชนดน เปนตาแหนงสาคญในการจบกบ chitin ซงเปนผนงเซลลของเชอรา Barwin superfamily ประกอบดวย 6 cysteines ซงเกยวของกบการสรางพนธะไดซลไฟดของโปรตน

ผลการวเคราะหลาดบนวคลโอไทดบางสวนของยน PR-5 พบวามขนาด 517 คเบส และเมอทาการเปรยบเทยบลาดบนวคลโอไทดของยน PR-5 กบพชชนดอนๆ พบวายน PR-5 มสวนคลายเคยงกบพชอนๆ ไดแก Ricinus communis (Accession no. XM_002509704.2) 60%, Citrus sinensis (Accession no. XM_006477370.2) 59% และ Gossypium raimondii (Accession no. XM_012616383.1) 58% สามารถแปลรหสได 172 กรดอะมโน โดยเรมตนแปลรหสไดทรหส AAC แปลรหสไดกรดอะมโนแอสพาราจน ผลจากการวเคราะหลาดบกรดอะมโนพบโดเมน GHG4-TLP-SF domain ซงเปนโดเมนทมความสาคญในกลม Thaumatin family และมความเกยวของกบโปรตน PR-5 เนองจาก TL proteins ทสะสมอยในพชสามารถตอบสนองตอการเขาทาลายจากเชอโรคของพชผานกจกรรม antifungal activity โดเมน GHG4-TLP-SF มรปแบบการสงสญญาณและบรเวณอนรกษ 16 cysteine residues แตผลจากการวเคราะหกรดอะมโนทไดจากการโคลนสามารถพบเพยง 10 cysteine residues เทานน ซงยงขาดอก 6 cysteine residues กำรแสดงออกของยน PRs โปรตนในกลมทออกฤทธตอตำนเชอรำ

การแสดงออกของยน PR-1 และ PR-3 ในเนอเยอทเฉพาะเจาะจง (tissue specific gene) ของยางพาราโดยใชยน 18S rDNA เปนยนเปรยบเทยบมาตรฐาน พบวายน PR-1 และ PR-3 มการแสดงออกในทกเนอเยอททาการศกษา โดยมการแสดงออกสงสดในเปลอกยาง เมลดแกสงกวาเมลดออน และใบแกสงกวาใบออน โดยการแสดงออกของยน PRs น เกยวของกบระบบการสงสญญาณของกลการการปองกนตนเองของพช โดยพชสามารถสงสญญาณการปองกนตนเองไดทงจากบรเวณถกรกรานจากเช อโรคและบรเวณทไกลออกไป การศกษาการแสดงออกของยน HbPR-1, HbPR-2, HbPR-3, HbPR-4 และ HbPR-5 ในยางพาราโคลน PSU1, Bangrak, PB5/51, RRIM600 และ BPM24 ดวยเทคนค qRT-PCR พบวา

72

ยางพาราทง 5 โคลนททาการศกษามการแสดงออกของยนแตละกลมแตกตางกน โดยยางพาราโคลน PB5/51 มแนวโนมในการแสดงออกของยนทง 5 กลมเพมมากขนภายหลงจากการตดเชอและยงสงกวายางพาราโคลนอนๆ สาหรบยางพาราโคลน RRIM600 พบวามการแสดงออกของยน HBPR-1, HbPR-3 และ HbPR-5 เพมมากขนแมภายหลงการแสดงออกของยนในกลมดงกลาวจะลดลงแตกยงมการแสดงออกมากกวาทเวลาเรมตน ซงตรงกนขามกบการแสดงออกของยน HbPR-2 และ HbPR-4 ทมการแสดงออกของยนลดลงแมวาในภายหลง HbPR-3 เรมมการแสดงออกทสงขนอกครงแตไมมนยสาคญทางสถตเมอเปรยบเทยบกบชวงเวลาเรมตนท 0 ชวโมง สาหรบในโคลน BPM 24 พบการแสดงออกของยนในกลม HbPR-1, HbPR-4 และ HbPR-5 เพมมากขนในขณะทยน HbPR-2 และ HbPR-3 มการแสดงออกลดลงอยางมนยสาคญเมอเทยบกบชวโมงท 0 การแสดงออกของยนทง 5 กลมในยางพาราพนธ Bangrakพบวายนทง 5 มการแสดงออกตาอยางมนยสาคญเมอเปรยบเทยบกบยางพาราโคลนอนๆ คลายกนกบ PSU1 ทมการแสดงออกของยนสวนใหญลดตาลงภายหลงจากการปลกถายเชอรากขาวแมวาจะมกลมของยน HbPR-1 แสดงออกมากขนในภายหลง จากผลการทดลองอาจกลาวไดวากลไกการปองกนตนเองของยางพาราเกยวของกบการผลตโปรตนในกลมทมฤทธตอตานเชอราซงภายหลงทมการตดเชอกอโรคจะมการสงสญญาณใหมการผลตโปรตนในกลมเหลาน โดยยนในกลมนมการแสดงออกรวมกนมากกวา 1 กลม ทงนการแสดงออกของยนทแตกตางกนในแตละพนธของตนกลายางพาราอาจขนอยกบพนธกรรมของตนกลายางพาราแตละตนดวยเชนกน

73

เอกสำรอำงอง

จรสศร นวลศร, กรกช นาคคนอง และปฏมาพร ปลอดภย. 2558. รายงานวจยฉบบสมบรณ: การคดเลอก

ต น ต อย า ง พ า ร า ท ม ค ว า ม ท น ท า น ต อ โ ร ค ร า ก ข า ว . ค ณ ะ ท ร พ ย า ก ร ธ ร ร ม ช า ต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

พนธวศร แสงสวรรณ. 2547. ปฏกรยาตอบสนองของแคลลสยางพาราตอเชอรา Phytophthora palmivora. ว ท ย า น พนธ ว ท ย า ศ า ส ต รม ห า บณ ฑ ต ค ณ ะว ท ย า ศ า ส ต ร มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

ไพโรจน จวงพานช. 2525. หลกวชาโรคพช. กรงเทพฯ : ภาควชาโรคพช คณะเกษตรมหาวทยาลยเกษตรศาสตร. 386 หนา.

ยรฉตร ยอดโยธ. 2554. การชกนาการตานทานโรคและการแสดงออกของยน PR-1 ในยางพาราโดยใชตวกระตนชนดตางๆ. วทยานพนธ วทยาศาสตรมหาบณฑต คณะวทยาศาสตร มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

สถาบนวจยยาง. 2555. ขอมลวชาการยางพารา. กรมวชาการเกษตร. [Online] Available: http://www.rubber thai.com. [เขาถงเมอ 29 เมษายน 2555].

สถาบนวจยยาง กรมวชาการเกษตร. 2553. ขอมลวชาการยางพารา. กรงเทพฯ : โรงพมพชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย.

สถาบนวจยยาง. 2553. โรคและศตรยางพารา. กรมวชาการเกษตร. [Online] Available: http://124.109.2.78/about/pdf/all.pdf. [เขาถงเมอ 13 กรกฎาคม 2555].

เสมอใจ ชนจตต. 2552. โรครากขาวในยางพารา. ภาควชาการจดการศตรพช คณะทรพยากรธรรมชาต มหาวทยาลยสงขลานครนทร. [Online] Available: http://share.psu.ac.th/blog/fnr-service/14126. [เขาถงเมอ 9 สงหาคม 2555].

อารมณ โรจนสจตร. 2541. โรครากขาว [Rigidoporus lignosus (Klotzsch) Imaz.] ของยางพาราและแนวทางการควบคมโดยชววธ . วทยานพนธ วทยาศาสตรมหาบณฑต มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

อารมณ โรจนสจตร. 2553. ประเมนความสญเสยทางเศรษฐกจของยางพาราสาเหตจากโรครากขาวในพนทปลกยางของประเทศไทย . [Online] Available: http:// www. it.doa.go.th/refs/show.php?record=1527 [เขาถงเมอ 29 มถนายน 2555]

Agrios, G.N. 1997. Plant Pathology. New york : San Diego Academic Press. pp. 93-115.

74

Alexander, D.; Stinson, J.; Pear, J.; Glascock, C.; Ward, E.; Goodman, R.M.; Ryals, J. 1992. A

new multigene family inducible by tobacco mosaic virus or salicylic acid in tobacco. Molecular plant-microbe interactions: MPMI. 5(6): 513-515.

Alonso, E.; De Carvalho Niebel, F.; Obregón, P.; Gheysen, G.; Inzé, D.; Van Montagu, M.; Castresana, C. 1995. Differential in vitro DNA binding activity to a promoter element of the gn1β-1,3-glucanase gene in hypersensitively reacting tobacco plants. The Plant Journal. 7(2): 309-320.

Antoniw, J.F.; Ritter, C.E.; Pierpoint, W.S.; Van Loon, L.C. 1980. Comparison of three Pathogenesis-related Proteins from plants of two cultivars of tobacco infected with TMV. Journal of General Virology. 47(1): 79-87.

Anzlovar, S.; Serra, M.D.; Dermastia, M.; Menestrina, G. 1998. Membrane permeabilizing activity of pathogenesis-related protein linusitin from flax seed. Molecular plant-microbe interactions. 11(7): 610-617.

Beerhues, L.; Kombrink, E. 1994. Primary structure and expression of mRNAs encoding basic chitinase and 1,3-β-glucanase in potato. Plant Molecular Biology. 24(2): 353-367.

Bloch, C.; Patel, S.U.; Baud, F.; Zvelebil, M.J.J.M.; Carr, M.D.; Sadler, P.J.; Thornton, J.M. 1998. 1H NMR structure of an antifungal γ-thionin protein SIα1: Similarity to scorpion toxins. Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 32(3):334-349.

Borad, V.; Sriram, S. 2008. Pathogenesis-related proteins for the plant protection. Asian J Exp Sci. 22: 189-196.

Broekaert, W.F.; Terras, F.R.; Cammue, B.P.; Osborn, R.W. 1995. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant Physiology. 108(4): 1353-1358.

Cameron, R.K.; Dixon, R.A.; Lamb, C.J. 1994. Biologically induced systemic acquired resistance in Arabidopsis thaliana. The Plant Journal. 5(5): 715-725.

Capelli, N.; Diogon, T.; Greppin, H.; Simon, P. 1997. Isolation and characterization of a cDNA clone encoding an osmotin-like protein from Arabidopsis thaliana. Gene. 191(1): 51-56.

Castresana, C.; de Carvalho, F.; Gheysen, G.; Habets, M.; Inzé, D.; Van Montagu, M. 1990. Tissue-specific and pathogen-induced regulation of a Nicotiana plumbaginifolia beta-1,3-glucanase gene. The Plant Cell. 2(12): 1131-1143.

Conrath, U. 2006. Systemic Acquired Resistance. Plant Signaling & Behavior. 1(4):179-184.

75

Cornelissen, B.J.C.; Hooft van Huijsduijnen, R.A.M.; Bol, J.F. 1986. A tobacco mosaic virus-

induced tobacco protein is homologous to the sweet-tasting protein thaumatin. Nature. 321(6069): 531-532.

Cornelissen, B.J.C.; van Huijsduijnen, R.A.M.H.; Van Loon, L.C.; Bol, J.F. 1986. Molecular characterization of messenger RNAs for `pathogenesis-related' proteins 1a, 1b and 1c, induced by TMV infection of tobacco. The EMBO Journal. 5(1): 37-40.

Cregeen, S.; Radisek, S.; Mandelc, S.; Turk, B.; Stajner, N.; Jakse, J.; Javornik, B. 2015. Different Gene Expressions of Resistant and Susceptible Hop Cultivars in Response to Infection with a Highly Aggressive Strain of Verticillium albo-atrum. Plant Molecular Biology Reporter / Ispmb. 33(3): 689-704.

Dempsey, D.M.A. 1993. Resistance and Susceptible Responses of Arabidopsis thaliana to Turnip Crinkle Virus. Phytopathology. 83(10): 1021-1021.

Edreva, A. 2005. Pathogenesis-related proteins: research progress in the last 15 years. General and Applied Plant Physiology. 31(2): 105-124.

El-Komy, M.H.; Abou-Taleb, E.M.; Aboshosha, S.M.; El-Sherif, E.M. 2010. Differential expression of potato pathogenesis-related proteins upon infection with late blight pathogen: a case study expression of potato osmotin-like protein. Int J Agric Biol. 12(2): 179-186.

ElMorsi, A.; Abdelkhalek, A.; AlShehaby, O.; Hafez, E.E. 2015. Pathogenesis-related genes as tools for discovering the response of onion defence system against Iris yellow spot virus infection. Botany. 93(11): 735-744.

Eyal, Y.; Sagee, O.; Fluhr, R. 1992. Dark-induced accumulation of a basic pathogenesis-related (PR-1) transcript and a light requirement for its induction by ethylene. Plant Molecular Biology. 19(4): 589-599.

Fernández, C.; Szyperski, T.; Bruyère, T.; Ramage, P.; Mösinger, E.; Wüthrich, K. 1997. NMR solution structure of the pathogenesis-related protein P14a1. Journal of Molecular Biology. 266(3): 576-593.

Florack, D.E.A.; Stiekema, W.J. 1994. Thionins: properties, possible biological roles and mechanisms of action. Plant Molecular Biology. 26(1): 25-37.

Friedrich, L.; Moyer, M.; Ward, E.; Ryals, J. 1991. Pathogenesis-related protein 4 is structurally homologous to the carboxy-terminal domains of hevein, Win-1 and Win-2. Molecular and General Genetics MGG. 230(1): 113-119.

Fu, Z.Q.; Dong, X. 2013. Systemic Acquired Resistance: Turning Local Infection into Global Defense. Annual Review of Plant Biology. 64(1): 839-863.

76

Gao, Q.-M.; Zhu, S.; Kachroo, P.; Kachroo, A. 2015. Signal regulators of systemic acquired

resistance. Frontiers in Plant Science. 6:228. Gerhard, L.-M.; Frederick, M. 1999. Functions and Regulation of Plant Beta-1,3-Glucanases

(PR-2). In: Pathogenesis-Related Proteins in Plants. CRC Press. doi:10.1201/9781420049299.ch3.

Giesemann, A.; Biehl, B.; Lieberei, R. 1986. Identification of Scopoletin as a Phytoalexin of the Rubber Tree Hevea brasiliensis1. Journal of Phytopathology. 117(4): 373-376.

Gordon-Weeks, R.; Sugars, J.; Antoniw, J.; White, R. 1997. Accumulation of a novel PR1 protein in Nicotiana langsdorfii leaves in response to virus infection or treatment with salicylic acid. Physiological and molecular plant pathology. 50(4): 263-273.

Gun Lee, D.; Yub Shin, S.; Maeng, C.-Y.; Zhu Jin, Z.; Lyong Kim, K.; Hahm, K.-S. 1999. Isolation and Characterization of a Novel Antifungal Peptide from Aspergillus niger. Biochemical and Biophysical Research Communications. 263(3): 646-651.

Guo, B.; Cleveland, T.; Brown, R.; Widstrom, N.; Lynch, R.; Russin, J. 1999. Distribution of antifungal proteins in maize kernel tissues using immunochemistry. Journal of Food Protection®. 62(3): 295-301.

Guyot, J.; Flori, A. 2002. Comparative study for detecting Rigidoporus lignosus on rubber trees. Crop Protection. 21(6): 461-466.

Hejgaard, J.; Jacobsen, S.; Bjørn, S.E.; Kragh, K.M. 1992. Antifungal activity of chitin-binding PR-4 type proteins from barley grain and stressed leaf. FEBS Letters. 307(3): 389-392.

Hwang, I.S.; Choi, D.S.; Kim, N.H.; Kim, D.S.; Hwang, B.K. 2014. Pathogenesis-related protein 4b interacts with leucine-rich repeat protein 1 to suppress PR4b-triggered cell death and defense response in pepper. The Plant Journal. 77(4): 521-533.

Jach, G.; Görnhardt, B.; Mundy, J.; Logemann, J.; Pinsdorf, E.; Leah, R.; Schell, J.; Maas, C. 1995. Enhanced quantitative resistance against fungal disease by combinatorial expression of different barley antifungal proteins in transgenic tobacco. The Plant Journal. 8(1): 97-109.

Kim, J. Y.; Hwang, K. B. 1994. Differential accumulation of β-1,3-glucanase and chitinase isoforms in pepper stems infected by compatible and incompatible isolates of Phytophthora capsici. Physiological and Molecular Plant Pathology. 45(3): 195-209.

Kim, J. Y.; Hwang, K. B. 2000. Pepper gene encoding a basic pathogenesis-related 1 protein is pathogen and ethylene inducible. Physiologia Plantarum. 108(1):51-60.

77

Kaewchai, S.; Lin, F.C.; Wang, H.K.; Soytong, K. 2010. Characterization of Rigidoporus

microporus isolated from rubber trees based on morphology and ITS sequencing. Journal of Agricultural Technology 6(2): 10.

Koo, J.C., et al.,. 1998. Two hevein homologs isolated from the seed of Pharbitis nil L. exhibit potent antifungal activity. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1382(1): 80-90.

Lee, S.C.; Kim, Y.J.; Hwang, B.K. 2001. A Pathogen-Induced Chitin-Binding Protein Gene from Pepper: Its Isolation and Differential Expression in Pepper Tissues Treated with Pathogens, Ethephon, Methyl Jasmonate or Wounding. Plant and Cell Physiology. 42(12): 1321-1330.

Louanchi, M.; Robin, P.; Michels, T.; Balesdent, M.H.; Despréaux, D. 1996. In vitro characterization and in vivo detection of Rigidoporus lignosus, the causal agent of white root disease in Hevea brasiliensis, by ELISA techniques. European Journal of Plant Pathology. 102(1): 33-44.

Marques, J.P.R.; Amorim, L.; Silva-Junior, G.J.; Spósito, M.B.; Appezzato-da Gloria, B. 2015. Structural and biochemical characteristics of citrus flowers associated with defence against a fungal pathogen. AoB Plants. 7.

Meyers, R.A. 1995. Molecular biology and biotechnology: a comprehensive desk reference. John Wiley & Sons.

Niderman, T.; Genetet, I.; Bruyère, T.; Gees, R.; Stintzi, A.; Legrand, M.; Fritig, B.; Mösinger, E. 1995. Pathogenesis-related PR-1 proteins are antifungal. Isolation and characterization of three 14-kilodalton proteins of tomato and of a basic PR-1 of tobacco with inhibitory activity against Phytophthora infestans. Plant Physiology. 108(1): 17-27.

Nielsen, K.K.; Nielsen, J.E.; Madrid, S.M.; Mikkelsen, J.D. 1997. Characterization of a new antifungal chitin-binding peptide from sugar beet leaves. Plant Physiology. 113(1): 83-91.

Oghenekaro, A.O.; Omorusi, V.I.; Asiegbu, F.O. 2016. Defence-related gene expression of Hevea brasiliensis clones in response to the white rot pathogen, Rigidoporus microporus. Forest Pathology.n/a-n/a.

Omorusi, V.I. 2012. Effects of white root rot disease on Hevea brasiliensis (Muell. Arg.)-Challenges and control approach. INTECH Open Access Publisher.

Philip, S.; Joseph, A.; Kumar, A.; Jacob, C.K.; Kothandaraman, R. 2001. Detection of beta -1,3-glucanase isoforms against Corynespora leaf disease of rubber (Hevea brasiliensis). Indian Journal of Natural Rubber Research. 14(1): 1-6.

78

Porat, R.o.n.; Vinokur, V.; Holland, D.; Gregory McCollum, T.; Droby, S. 2001. Isolation of a

citrus chitinase cDNA and characterization of its expression in response to elicitation of fruit pathogen resistance. Journal of Plant Physiology. 158(12): 1585-1590.

Prasath, D.; El-Sharkawy, I.; Sherif, S.; Tiwary, K.S.; Jayasankar, S. 2011. Cloning and characterization of PR5 gene from Curcuma amada and Zingiber officinale in response to Ralstonia solanacearum infection. Plant Cell Reports. 30(10): 1799-1809.

Rauscher, M.; Ádám, A.L.; Wirtz, S.; Guggenheim, R.; Mendgen, K.; Deising, H.B. 1999. PR-1 protein inhibits the differentiation of rust infection hyphae in leaves of acquired resistant broad bean. The Plant Journal. 19(6): 625-633.

Roberts, W.K.; Selitrennikoff, C.P. 1990. Zeamatin, an antifungal protein from maize with membrane-permeabilizing activity. Microbiology. 136(9): 1771-1778.

Ryals, J.; Lawton, K.A.; Delaney, T.P.; Friedrich, L.; Kessmann, H.; Neuenschwander, U.; Uknes, S.; Vernooij, B.; Weymann, K. 1995. Signal transduction in systemic acquired resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92(10): 4202-4205.

Segura, A.; Moreno, M.; García-Olmedo, F. 1993. Purification and antipathogenic activity of lipid transfer proteins (LTPs) from the leaves of Arabidopsis and spinach. FEBS Letters. 332(3): 243-246.

Selitrennikoff, C.P. 2001. Antifungal proteins. Applied and environmental microbiology. 67(7): 2883-2894.

Sels, J.; Mathys, J.; De Coninck, B.M.A.; Cammue, B.P.A.; De Bolle, M.F.C. 2008. Plant pathogenesis-related (PR) proteins: A focus on PR peptides. Plant Physiology and Biochemistry. 46(11): 941-950.

Silverman, F.P.; Petracek, P.D.; Heiman, D.F.; Fledderman, C.M.; Warrior, P. 2005. Salicylate Activity. 3. Structure Relationship to Systemic Acquired Resistance. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 53(25): 9775-9780.

Simmons, C.R. 1994. The Physiology and Molecular Biology of Plant 1,3-β-D-Glucanases and 1,3;1,4-β-D-Glucanases. Critical Reviews in Plant Sciences. 13(4): 325-387.

Sudisha, J.; Sharathchandra, R.G.; Amruthesh, K.N.; Kumar, A.; Shetty, H.S. 2012. Pathogenesis Related Proteins in Plant Defense Response. In: Plant Defence: Biological Control. Dordrecht: Springer Netherlands. p. 379-403.

Tahiri-Alaoui, A.; Dumas-Gaudot, E.; Gianinazzi, S. 1993. Immunocytochemical localization of pathogenesis-related PR-1 proteins in tobacco root tissues infected in vitro by

79

the black root rot fungus Chalara elegans. Physiological and Molecular Plant Pathology. 42(1): 69-82.

Thompson, C.E.; Fernandes, C.L.; Souza, O.N.; Salzano, F.M.; Bonatto, S.L.; Freitas, L.B. 2007. Molecular modeling of pathogenesis-related proteins of family 5. Cell Biochemistry and Biophysics. 44(3): 385-394.

Torres, M.A.; Jones, J.D.G.; Dangl, J.L. 2006. Reactive Oxygen Species Signaling in Response to Pathogens. Plant Physiology. 141(2): 373-378.

Vaghefi, N.; Mustafa, B.M.; Dulal, N.; Selby-Pham, J.; Taylor, P.W.; Ford, R. 2013. A novel pathogenesis-related protein (LcPR4a) from lentil, and its involvement in defence against Ascochyta lentis. Phytopathologia Mediterranea. 52(1): 192.

Van Damme, E.J.M., et al.,. 1999. A Gene Encoding a Hevein-Like Protein from Elderberry Fruits Is Homologous to PR-4 and Class V Chitinase Genes. Plant Physiology. 119(4): 1547-1556.

van Esse, H.P.; Fradin, E.F.; de Groot, P.J.; de Wit, P.J.G.M.; Thomma, B.P.H.J. 2009. Tomato Transcriptional Responses to a Foliar and a Vascular Fungal Pathogen Are Distinct. Molecular Plant-Microbe Interactions. 22(3): 245-258.

Van Loon, L.C.; Van Strien, E.A. 1999. The families of pathogenesis-related proteins, their activities, and comparative analysis of PR-1 type proteins. Physiological and Molecular Plant Pathology. 55(2): 85-97.

Van Loon, L.C.; Rep, M.; Pieterse, C.M. 2006. Significance of inducible defense-related proteins in infected plants. Annu Rev Phytopathol. 44: 135-162.

Velazhahan, R.; Datta, S.K.; Muthukrishnan, S. 1999. The PR-5 family: thaumatin-like proteins. Pathogenesis-related proteins in plants Kluwer Academic CRC Presss, Dordrecht. 303.

Velazhahan, R.; Samiyappan, R.; Vidhyasekaran, P. 2000. Purification of an Elicitor-Inducible Antifungal Chitinase from Suspension-Cultured Rice Cells. Phytoparasitica. 28(2): 131-139.

Wan, J.; Zhang, X.-C.; Neece, D.; Ramonell, K.M.; Clough, S.; Kim, S.-y.; Stacey, M.G.; Stacey, G. 2008. A LysM Receptor-Like Kinase Plays a Critical Role in Chitin Signaling and Fungal Resistance in Arabidopsis. The Plant Cell. 20(2): 471-481.

Ward, E.R.; Uknes, S.J.; Williams, S.C.; Dincher, S.S.; Wiederhold, D.L.; Alexander, D.C.; Ahl-Goy, P.; Metraux, J.P.; Ryals, J.A. 1991. Coordinate Gene Activity in Response to Agents That Induce Systemic Acquired Resistance. The Plant Cell. 3(10): 1085-1094.

80

Watanabe, T.; Kanai, R.; Kawase, T.; Tanabe, T.; Mitsutomi, M.; Sakuda, S.; Miyashita, K.

1999. Family 19 chitinases of Streptomyces species: characterization and distribution. Microbiology. 145(12): 3353-3363.

Wattanasilakorn, S., Sadoodee, S., Nualsri, C. and Chuenchit, S. 2012. Screening of rubber (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) rootstocks for the white root disease resistance. Journal of Agricultural Technology. 8(7): 2385-2395.

Wnendt, S.; Ulbrich, N.; Stahl, U. 1994. Molecular cloning, sequence analysis and

expression of the gene encoding an antifungal-protein from Aspergillus giganteus. Current genetics. 25(6): 519-523.

Yalpani, N. 1993. Endogenous Salicylic Acid Levels Correlate with Accumulation of Pathogenesis-Related Proteins and Virus Resistance in Tobacco. Phytopathology. 83(9): 702-702.

Young, J.K.; Byung, K.H. 1996. Purification, N-terminal amino acid sequencing and antifungal activity of chitinases from pepper stems treated with mercuric chloride. Physiological and Molecular Plant Pathology. 48(6): 417-432.

81

ภำคผนวก

1. กำรเตรยมอำหำรเลยงเชอรำ Potato Dextrose Agar (PDA) นา PDA 39 กรม ละลายในนากลนปรมาตร 1 ลตร แลวนาไปนงฆาเชอ (autoclave) ท

อณหภม 121 องศาเซลเซยส ภายใตความดนไอนานาน 15 นาท กอนเทใสจานเลยงเชอเสนผานศนยกลาง 9 เซนตเมตร จานละ 10 มลลลตร

2. กำรเตรยมอำหำรเหลว Luria Bertaini (LB) ชง LB 20 กรม ปรบปรมาตรใน deionized water 1 ลตร ปรบ pH เทากบ 7.2-7.6 ดวย

NaOH ความเขมขน 1 นอรมอล แลวนาไปนงฆาเชอ ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ภายใตความดนไอนานาน 15 นาท กอนนาไปใชงาน

สาหรบอาหารแขง LB เตมผงวน 1.8% ซงเตรยมโดยผสมองคประกอบตางๆ ใหเสรจกอนจงเตมผงวน แลวนาไปนงฆาเชอ ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ภายใตความดนไอนานาน 15 นาท กอนนาไปเทใสจานเลยงเชอ

สาหรบอาหาร LB ทมการเตม ampicillin เตรยมโดยผสมสารละลาย ampicillin ลงในอาหารเลยงเชอทผานการฆาเชอแลวซงต งทงไวใหอณหภมประมาณ 60 องศาเซลเซยส เตมสารละลาย ampicillin มความเขมขนสดทายเปน 1 มลลกรมตอมลลลตร

3. กำรเตรยม ampicillin stock solution ชง ampicillin 0.1 กรม ละลายในนากลนทฆาเชอแลว 1 มลลลตร กรองผานกระดาษกรอง

ขนาด 0.22 ไมโครเมตร เกบท -20 องศาเซลเซยส 4. กำรเตรยม 50X TAE buffer Tris-base 242 กรม acetic acid 57.1 มลลลตร 0.5 โมลาร EDTA (pH 8.0) 100 มลลลตร ปรบปรมาตรดวยนากลนใหได 1 ลตร แลวนาไปนงฆาเชอ ทอณหภม 121 องศาเซลเซยส

ภายใตความดนไอนานาน 15 นาท กอนนาไปใชงาน เกบทอณหภมหอง 5. กำรเตรยม 3M Sodium acetate pH 5.2

82

ชง Sodium acetate 408.1 กรม ละลายนาใหไดปรมาตรประมาณ 750 มลลลตร เตม Glacial acetic acid จนได pH 5.2 ปรมาตรดวยนากลนใหได 1 ลตร นาไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส เปนเวลา 15 นาท

Documents

Expression of white root resistance related genes in ...natres.psu.ac.th/office/foreign/res/2017_Mar_WhiteRootResistance.pdf · (1) บทคัดย่อ Rigidoporus microporus