Журнал биологии развития ОНТОГЕНЕЗontogenez.org/archive/2020/4/Ont4_20v51.pdf · 2020-07-07 · Журнал биологии развития ОНТОГЕНЕЗ

Российская академия наук

Журнал биологии развития

ОНТОГЕНЕЗ

Том 51 № 4 2020 ИЮЛЬ–АВГУСТЖурнал основан в 1970 году академиком Б.Л. Астауровым

Выходит 6 раз в годISSN: 0475-1450

Журнал издается под руководствомОтделения биологических наук РАН

Главный редакторА.В. Васильев

Редакционная коллегия:

И.И. Адамейко, Ю.Д. Богданов, И.Ю. Баклушинская (зам. гл. редактора), Е.С. Васецкий (зам. гл. редактора), С.Г. Васецкий, О.А. Гусев,

В.Е. Дьяконова, Т.А. Ежова, Г.Н. Ениколопов, А.В. Ересковский, А.Г. Зарайский, Ю.А. Краус (отв. секретарь), Р.П. Костюченко,

Г.С. Левит, В.С. Михайлов, Н.Д. Озернюк, Г.Е. Онищенко,Д.В. Онищук, М.В. Ремизова, С.В. Рожнов,

О.Л. Серов, А.Н. Томилин

Редакционный совет:

М.А. Александрова, В.Я. Бродский, Скотт Гилберт,В.А. Голиченков, Э.Н. Григорян, С.М. Закиян, И.С. Захаров,

В.Б. Иванов, А.М. Куликов, И.В. Лядова, А.В. Марков,А.М. Оловников, О.Б. Симонова, Д.А. Сахаров,

О.Г. Строева, В.С. Тарабыкин, М.В. Угрюмов, Н.П. Шарова

Адрес редакции: 119334 Москва, ул. Вавилова, 26E-mail: [email protected]

Зав. редакцией E.Д. Гасило

© Российская академия наук, 2020© Редколлегия журнала “Онтогенез”

(составитель), 2020

МоскваООО «ИКЦ «АКАДЕМКНИГА»

Оригинал-макет подготовлен ООО «ИКЦ «АКАДЕМКНИГА»

Подписано к печати 01.12.2019 г. Формат 60 × 881/8 Уч.-изд. л. 9.75 Усл. печ. л. 9.53Тираж 24 экз. Зак. 2811 Бесплатно

Учредитель: Российская академия наук,Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Издатель: Российская академия наук, 119991 Москва, Ленинский пр., 14Исполнитель по госконтракту № 4У-ЭА-037-19 ООО «ИКЦ «АКАДЕМКНИГА»,

117342, Москва, ул. Бутлерова 17Б, а/я 47Отпечатано в типографии «Book Jet» (ИП Коняхин А.В.),

390005, г. Рязань, ул. Пушкина, 18, тел. (4912) 466-15116+

Свидетельство о регистрации средства массовой информации ПИ № ФС77-66702 от 28 июля 2016 г., выдано Федеральной службой по надзору в сфере связи,

информационных технологий и массовых коммуникаций (Роскомнадзор)

СОДЕРЖАНИЕ

Том 51, номер 4, 2020

ОБЗОРЫDrosophila melanogaster как модель генетики развития: современные подходы и перспективы

Л. Н. Нефедова 243Репрограммирование дифференцированного ретинального пигментного эпителия млекопитающих и человека: современные достижения и перспективы

Л. А. Ржанова, А. В. Кузнецова, М. А. Александрова 254Церебральные органоиды: модель развития мозга

К. К. Сухинич, М. А. Александрова 275

БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ ЖИВОТНЫХ (БЕСПОЗВОНОЧНЫХ И ПОЗВОНОЧНЫХ)

Гетерохрония экспрессии генов Lanf и FoxG1 у миноги подтверждает появлениеконечного мозга как эволюционно молодой надстройки в центральной нервной системе позвоночных

Г. В. Ермакова, А. В. Кучерявый, А. Г. Зарайский, А. В. Байрамов 292Эндогенные биоритмы интенсивности потребления кислорода в индивидуальном развитии Planorbarius corneus (Planorbidae, Gastropoda)

А. А. Зотин 302

ТОЧКА ЗРЕНИЯНарушения межклеточных взаимодействий при старении могут быть исправлены

В. Я. Бродский 309Терапия мезенхимальными стволовыми клетками – сосуд наполовину полонили наполовину пуст?

Ю. В. Суханов, Е. А. Воротеляк, И. В. Лядова, А. В. Васильев 316

Contents

Vol. 51, No. 4, 2020

REVIEWSDrosophila melanogaster as a Model of Development Genetics: Modern Approaches and Prospects

L. N. Nefedova 243Reprogramming of Differentiated Mammalian and Human Retinal Pigment Epithelium:Current Achievements and Prospects

L. A. Rzhanova, А. V. Kuznetsova, and М. A. Aleksandrova 254Cerebral Organoids: Brain Development Model

K. K. Sukhinich and M. A. Aleksandrova 275

BIOLOGY OF ANIMAL DEVELOPMENT (INVERTEBRATES AND VERTEBRATES)

Heterochrony of the Expression of Lanf and Foxg1 in Lamprey Confirms the Appearanceof the Telencephalon as an Evolutionarily Young Superstructurein the Central Nervous System of Vertebrates

G. V. Ermakova, A. V. Kucheryavyy, A. G. Zaraisky, and А. V. Bayramov 292Endogenous Biorhythms of Mass Specific Rate of Oxygen Consumption in Individual Development of Planorbarius corneus (Planorbidae, Gastropoda)

A. A. Zotin 302

POINT OF VIEWCell-Cell Interaction Disorders Associated with the Senescence Can Be Repaired

V. Ya. Brodsky 309News and Views Mesenchymal Stem Cells Therapy – Is a Glass Half Full or Half Empty?

Yu. V. Sukhanov, E. A. Vorotelyak, I. V. Lyadova, and A. V. Vasiliev 316

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 243–253

243

DROSOPHILA MELANOGASTER КАК МОДЕЛЬ ГЕНЕТИКИ РАЗВИТИЯ: СОВРЕМЕННЫЕ ПОДХОДЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ

© 2020 г. Л. Н. Нефедова*Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова,

Москва, 119234 Россия*e-mail: [email protected]

Поступила в редакцию 14.02.2020 г.После доработки 26.02.2020 г.

Принята к публикации 29.02.2020 г.

Плодовая мушка Drosophila melanogaster уже более ста лет успешно служит универсальной модельюв различных генетических исследованиях, в том числе в исследованиях генетического контроля ин-дивидуального развития. К настоящему времени для дрозофилы разработан целый арсенал методовобратной генетики, позволяющих довольно легко манипулировать с ее геномом, что позволяет счи-тать дрозофилу одной из самых мощных моделей генетики развития. В обзоре рассмотрены основ-ные современные методы исследования экспрессии и функции генов у дрозофилы и перспективыих применения.

Ключевые слова: дрозофила, генетика развития, модель, экспрессия геновDOI: 10.31857/S0475145020040059

ВВЕДЕНИЕПлодовая мушка Drosophila melanogaster уже

более ста лет успешно служит универсальной мо-делью в различных генетических исследованиях.За это время на дрозофиле был сделан целый рядзнаменательных открытий, касающихся структу-ры гена, генетического сцепления, механизмовмутагенеза и рекомбинации, генетической неста-бильности и микроэволюционных процессов впопуляциях. Дрозофила как модель помогла сде-лать важнейшие фундаментальные открытия и вобласти биологии развития: с ее помощью былирасшифрованы базовые консервативные генети-ческие механизмы, регулирующие отдельныеэтапы индивидуального развития.

Для поиска генов, контролирующих развитие,долгое время применяли классический подход:индукция мутаций с помощью химического илирадиационного мутагенеза и анализ мутантногофенотипа методами гибридологического анали-за, с последующим тщательным генетическимкартированием генов (Riggleman et al., 1989). Око-ло 20 лет назад геном D. melanogaster был полно-стью секвенирован и аннотирован. Это сделаловозможным применение стратегии обратной ге-нетики в генетическом анализе развития дрозо-филы. Одним из основных подходов исследова-ния функции гена методами обратной генетикиявляется его направленная инактивация с после-дующим изучением мутантного фенотипа. В

2000-е годы была предложена система инактива-ции генов у дрозофилы, основанная на гомоло-гичной рекомбинации (Rong et al., 2000). Затембыли усовершенствованы методы выключениягенов с использованием систем транспозонногомутагенеза (Nagarkar-Jaiswal et al., 2015), внедренаметодика выключения и редактирования геновCRISPR-Cas (Ewen-Campen et al., 2017). Полноевыключение генов, контролирующих онтогенез,часто сопровождается летальным фенотипом, чтозатрудняет исследование функций таких генов.Проблему позволяют преодолевать системы дляинактивации генов, которую можно осуществ-лять направленно в специфических тканях илидаже в определенных индивидуальных клетках(Theodosiou et al., 1998; Lee, Luo, 2001; Ryder, Rus-sell, 2003). Разработаны также системы для иссле-дования ткане- и возрастоспецифичной экспрес-сии отдельных генов (McGuire et al., 2004).

В настоящее время D. melanogaster – один из наи-более изученных видов живых организмов. А благо-даря огромному арсеналу методов, позволяющихдовольно легко манипулировать с ее геномом, дро-зофила является одной из самых мощных биологи-ческих моделей. В обзоре будут рассмотрены основ-ные современные методы исследования экспрес-сии и функции генов у дрозофилы.

УДК 575.16

ОБЗОРЫ

244

ОНТОГЕНЕЗ том 51 № 4 2020

НЕФЕДОВА

ТРАНСПОЗОННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

В 1980-е годы Рубиным и Спрадлингом быларазработана методика транспозонного мутагене-за для дрозофилы с использованием Р-элемента(Rubin, Spradling, 1982). Применение этой мето-дики позволило получать мутанты, несущие ин-серции транспозона в произвольном месте генома,в том числе внутри генов. Разработке методики спо-собствовало открытие явления, которое носит на-звание гибридного (гонадального) дисгенеза. Ги-бридный дисгенез проявляется у потомства в видеповышенной частоты транспозиции мобильныхэлементов, что сопровождается генными и хромо-сомными мутациями, рекомбинацией у самцов, атакже стерильностью гибридов (Kidwell, 1985). Ги-бридный дисгенез был описан не только для Р-эле-мента, но и для некоторых других транспозонов иретротранспозонов. Скрещивания могут бытьдисгенными только в том случае, если самцы не-сут транспозиционно активный мобильный эле-мент, а самки – нет. Это явление объясняется се-годня тем, что самки, имеющие в геноме копииопределенного мобильного элемента, приобрета-ют защитные механизмы, основанные на piРНК-интерференции и подавляющие его транспози-цию в тканях яичников (Duc et al., 2019).

В экспериментах Рубина и Спрадлинга на ос-нове плазмидного вектора была получена кон-струкция, содержащая P-элемент, у которого 5'- и3'-концевые повторы, необходимые для узнава-ния транспозазой, были сохранены, а централь-ная часть (включая ген транспозазы) заменена наген rosy+. Эту конструкцию инъецировали в ран-ние эмбрионы дрозофилы совместно с плазми-дой-помощницей, экспрессирующей транспоза-зу, или несущую полноразмерный Р-элемент(рис. 1). Для инъекций использовали мутантныепо гену rosy эмбрионы, в геномах которых отсут-ствовал Р-элемент. В данном эксперименте 8%инъецированных эмбрионов развились в фер-тильных имаго и 39% из них дали потомство с фе-нотипом rosy+, т.е. несли в геноме инсерциютранспозона. Далее проводили отбор мутантов поинтересующему фенотипу и осуществляли поисклокализации инсерции транспозона. Таким обра-зом, был разработан эффективный для своеговремени метод исследования функции генов дро-зофилы путем отбора мутантов после ненаправ-ленного транспозонного мутагенеза.

Этот метод получил дальнейшее развитие, и входе реализации проекта “Геном дрозофилы”(Berkeley Drosophila Genome Project, BDGP) былапоставлена задача инактивировать каждый гендрозофилы путем введения Р-элемента. В рамкахэтой задачи было получено более 30000 линиймух, несущих транспозон в различных участкахгенома. Более 6000 линий были отобраны для по-полнения коллекции линий дрозофил центра

Блумингтона (Bloomington Stock Center). В сово-купности около 40% генов дрозофилы на сего-дняшний день содержат вставки Р-элемента в ко-дирующей или регуляторной части гена (Bellenet al., 2004).

Позже были разработаны аналогичные системытранспозонного мутагенеза, основанные на ис-пользовании транспозонов Minos D. hydei (Loukeriset al., 1995) и piggyBack чешуекрылых (Lobo et al.,1999). Оба транспозона не встречаются в геномеD. melanogaster, а, значит, используемые длятрансгенеза линии D. melanogaster априори ока-жутся для них дисгенными.

МУТАГЕНЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИСТЕМЫ GAL4/UAS: УПРАВЛЕНИЕ

ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНАМетод транспозонного мутагенеза получил

широкое распространение и стал использоватьсяне только для выключения генов, но и для управ-ления экспрессией клонированных генов. Транс-позонный мутагенез с использованием системыGAL4/UAS был впервые применен в работе(Brand, Perrimon, 1993) для исследования функ-ции гена even-skipped, участвующего в контролесегментации у дрозофилы. Система состоит издвух конструкций, одна из которых содержит ген,кодирующий дрожжевой транскрипционный ак-тиватор GAL4, а другая – исследуемый ген, в 5'-регуляторную часть которого введен сайт связы-вания GAL4 – энхансер UAS (CGG-N11-CCG).Конструкции работают в двух разных трансген-ных линиях мух. Одна линия – драйвер – экс-прессирует GAL4 под управлением геномного эн-хансера, другая линия содержит исследуемый генпод регуляцией UAS (рис. 2). При скрещиванииэтих двух линий у гибридного потомства проис-ходит активация исследуемого гена, которуюможно осуществлять во всех клетках организма(например, воздействуя повышенной температу-рой, если экспрессия GAL4 находится под кон-тролем промотора гена теплового шока) или тка-неспецифично (в том случае если GAL4 экспрес-сируется в определенном типе клеток или тканипод тканеспецифичным промотором). Показано,что продукт дрожжевого гена GAL4 не оказываетзначительного влияния на фенотип мух. К насто-ящему времени получена коллекция линий, кото-рые экспрессируют GAL4 в разных тканях; эти ли-нии так и называют – GAL4-линии. К ним относят-ся GMR-GAL4 (экспрессия в постмитотическихклетках глаза), CG7077-GAL4 (экспрессия в пиг-ментных клетках), sNPF-GAL4 (экспрессия в клет-ках центральной нервной системы), elav-GAL4(экспрессия в нейронах мозга), e22c-GAL4 (экс-прессия в фолликулярных стволовых клетках) имногие другие (более полный список см. на сай-тах http://flystocks.bio.indiana, http://flybase.org/).


DROSOPHILA MELANOGASTER КАК МОДЕЛЬ ГЕНЕТИКИ РАЗВИТИЯ 245

Применение системы GAL4/UAS открываетширокие перспективы для управления экспрес-сией генов, поскольку она позволяет избиратель-но (клеточно- или тканеспецифично) активиро-вать или подавлять транскрипцию исследуемогогена. Последнее возможно при использованиилиний-помощниц, экспрессирующих репрессорGAL4 – GAL80.

МУТАГЕНЕЗ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕКОМБИНАЗ: ГЕННЫЕ И БЕЛКОВЫЕ ЛОВУШКИ

Прорывным этапом обратной генетики дрозо-филы стала разработка метода сайт-специфиче-ской интеграции заданной последовательности вгеном. Эта методика первоначально предназна-чалась для генома мыши (Branda, Dymecki, 2004).Для дрозофилы были адаптированы системы Flp-FRT (Golic, Golic, 1996), PhiC31 (Groth et al.,2004) и Cre-Lox (Nakazawa et al., 2012).

Система рекомбинации Cre-Lox бактериофагаP1 состоит из фермента рекомбиназы Cre, котораяузнает две коротких последовательности-мишени,LoxP, и осуществляет рекомбинацию между ними.Система рекомбинации Flp-FRT из 2-микроннойплазмиды дрожжей Saccharomyces cerevisiae анало-гична Cre-Lox, и включает рекомбиназу (флиппазу)Flp, которая осуществляет рекомбинацию междусайтами-мишенями, FRT. На основе этих двух си-стем получены трансгенные линии дрозофилы, не-сущие ген рекомбиназы и сайты узнавания (рис. 3).

Сравнительный анализ эффективности “нока-ута” генов с использованием рекомбиназ Flp иCre у D. melanogaster был проведен в работе (Fric-kenhaus et al., 2015). Авторы использовали систе-мы GAL4/UAS-Flp и GAL4/UAS-Cre для специ-фической экспрессии соответствующих реком-биназ в нейронах и в мышцах с цельюинактивации гена cabeza. Авторы пришли к выво-ду, что как инструмент “нокаута” рекомбиназаFlp более эффективна, чем рекомбиназа Cre, чтоони связали с недостаточной экспрессией Cre в

Рис. 1. Транспозонный мутагенез с использованием Р-элемента. Метод основан на коинъекции ранних эмбрионов сгенотипом white конструкциями с геном rosy+, фланкированным концами Р-элемента, и с геном Р-транспозазы. По-лученные после инъекции химерные особи после скрещивания с некоторой вероятностью дают потомков с розовымиглазами (трансгенный потомок выделен рамкой).

rosy+ P-транспозаза

246


НЕФЕДОВА

Рис. 2. Метод управления экспрессией гена с использованием системы GAL4/UAS. При скрещивании линий, одна из кото-рых содержит в геноме исследуемый ген Х под контролем дрожжевого энхансера UAS, а другая – GAL4 под контролем ге-номного энхансера, у гибридов происходит активация транскрипции исследуемого гена. Вместо последовательности гена Xв геном линии UAS может быть интегрирована конструкция для подавления экспрессии гена Х путем РНК-интерференции.

UAS-Ген XГеномныйэнхансер-GAL4

ЭнхансерGAL4

GAL4

Ген XUAS

Тканеспецифическаяэкспрессия GAL4 Активация транскрипции гена X

Рис. 3. Один из возможных подходов управления экспрессией генов с использованием системы рекомбинации Flp/FRT. Вданном примере флиппаза Flp находится под контролем промотора гена теплового шока, индукция экспрессии Flp приво-дит к рекомбинации по сайтам FRT, что активирует экспрессию гена GAL4, находящуюся под контролем промотора генаактина. Продукт GAL4, в свою очередь, запускает экспрессию гена флуоресцентного белка и/или исследуемого гена Х.

Тепловойшок

FlpPhsp70

Pact PactGAL4 GAL4

UAS

UAS

STOP

STOP

FRT FRT

GFP

Ген X

и/или



исследуемых клетках. Кроме того, авторы обна-ружили токсичность белка Cre для дрозофилы,что не наблюдается при использовании белка Flp.

Система рекомбинации Flp-FRT была исполь-зована для получения хромосомных перестроек удрозофилы. Усилия проектов консорциумовDrosDel (Bloomington Drosophila Stock Center) иExelixis были направлены на получение делеци-онных мутаций по нескольким тысячам генов.Для получения перестроек была использованаколлекция линий, несущих инсерции FRT-сай-тов, между которыми проводили массовые скре-щивания. Так, в ходе реализации проекта DrosDelбыла получена библиотека делеционных мута-ций, в совокупности покрывающих около 80% ге-нома (Ryder et al., 2007). Всего в ходе реализациипроектов DrosDel и Exelixis было получено более500000 делеций, размером от 1 пн до 1 млн пн.

Система рекомбинации фага phiC31 оказаласьособенно полезным инструментом для получе-ния линий трансгенных мух, поскольку наиболееэффективно позволяет вставлять различныетрансгенные последовательности в один и тот жесайт в геноме (Groth et al., 2004; Bischof et al.,2007). PhiC31 кодирует интегразу, обеспечиваю-щую рекомбинацию между сайтами attP и attB.При рекомбинации между сайтами attP и attB об-разуются гибридные сайты attL и attR, которыеферментом не узнаются. К настоящему времениполучен набор линий, содержащих сайты посад-ки интегразы по всему геному и доступных в раз-личных коллекционных центрах (Knapp et al.,2015). Недавно была получена мутантная инте-граза phiC31, которая способна осуществлять нетолько интеграцию, но и эксцизию (вырезание)по сайтам узнавания, что полезно для получениякомбинаций различных трансгенов в пределаходного гена.

С использованием рекомбинации phiC31 былразработан метод обмена кассет, опосредованно-го рекомбиназой (recombinase-mediated cassetteexchange, RMCE) (Bateman et al., 2006). При ис-пользовании такого подхода сайт геномной по-садки, содержащий маркерный ген, фланкиро-ванный сайтами attP, может быть заменен любойдругой последовательностью ДНК через плазми-ду, содержащую интересующий ген, фланкиро-ванный сайтами attB (рис. 4а). Важно отметить,что эта технология позволяет интегрировать в геномдаже немаркированные конструкции в дрозофилу,т.е. даже те, в которых отсутствуют функциональ-ные гены, а содержатся регуляторные или служеб-ные последовательности (например, множествен-ные сайты клонирования).

Одной из наиболее полезных и гибких страте-гий, основанных на транспозонах и системе RCME,является система MiMIC (Minos-mediated integra-tion cassette) (Venken et al., 2011). Конструкция

MiMIC содержит транспозон Minos, фланкиро-ванный двумя инвертированными сайтами узна-вания рекомбиназы phiC31, attP, внутрь котороговставлены кассеты с генной ловушкой – геномзеленого флуоресцентного белка GFP – и селек-тивным маркером yellow+, а непосредственно пе-ред ними локализованы акцепторный сайт сплай-синга и стоп-кодоны в трех рамках считывания.Сайты attP позволяют заменять внутреннюю по-следовательность транспозона любой другой по-следовательностью через опосредованный реком-биназой обмен кассет (RMCE) (рис. 4б). Вставкаконструкции MiMIC в правильной ориентации винтрон кодирующего гена будет способствоватьтрансляции усеченного белка из-за наличия ак-цептора сплайсинга и стоп-кодонов, таким обра-зом, вставка будет действовать в качестве геннойловушки. Уникальность системы MiMIC – этовозможность вводить в состав последовательно-стей исследуемого гена регуляторные гены, такойкак GAL4 или Flp, и функциональные репортеры,например GFP (рис. 4в).

В работе (Venken et al., 2011) была полученаколлекция из более чем 6000 инсерций MiMIC врегуляторные последовательности и интроны ге-нов. Примерно 2000 генов в настоящее времяимеют MiMIC-вставки в интронах, но примене-ние технологии CRISPR (см. ниже) для введениявставок MiMIC в геном, как предполагается, по-может сильно расширить возможности метода.

Метод белковой ловушки (protein trapping) ос-нован на применении конструкций MiMIC, ко-торые несут последовательность флуоресцентно-го белка, фланкированного SA и DS. Если такаяконструкция встраивается в интрон, репортер(обычно ген GFP) попадает в одну рамку считы-вания с “захваченным” геном (рис. 4в). Этот под-ход был успешно использован у ряда модельныхорганизмов, в том числе у дрозофилы, для кото-рой созданы коллекции линий мух, экспрессиру-ющих GFP в составе конструкции MiMIC, встро-енных в интроны разных генов.

GFP-ловушки в основном используются дляизучения характера экспрессии захваченных ге-нов или клеточной локализация их белковых про-дуктов. GFP-ловушка также может быть исполь-зована для подавления посредством РНК-интер-ференции транскрипции гена, слитых в однойрамке с GFP. Этот метод называют “тег-опосре-дованной потерей функции” (tag-mediated loss-of-function), он устраняет основные недостаткиклассического подхода нокдауна с использовани-ем РНК-интерференции, в котором ген-специ-фические последовательности являются мише-нями для малых РНК. В работе (Neumüller et al.,2012) было проведено исследование материнско-го эффекта нескольких генов (Spt6, Cp1, Pabp2 иpar-6) в эмбриогенезе путем тканепецифичного

248


НЕФЕДОВА

выключения вышеописанным методом тран-скрипции генов в клетках зародышевой линии.

РНК-ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ: НОКДАУН ГЕНА

РНК-интерференция (РНКи) является эндоген-ным клеточным механизмом, запускаемым двухце-почечной РНК (дцРНК), которая приводит к дегра-дации гомологичных ей РНК и подавлению экс-прессии гена на посттранскрипционном уровне(Ameres, Zamore, 2013). Механизм РНКи был впер-вые обнаружен в Caenorhabditis elegans, но потом былоткрыт в клетках многих эукариот: у животных, рас-тений и грибов.

Детальное исследование механизмов РНКипозволило разработать ряд подходов, использую-щих РНКи для направленного выключения экс-прессии гена – нокдауна гена. РНКи как меха-низм подавления экспрессии генов у дрозофилы

был впервые применен путем прямой инъекциидцРНК в ранние эмбрионы для исследования ро-ли генов Frizzled и Frizzled2 в ходе раннего разви-тия эмбрионов (Kennerdell, Carthew, 1998). Позжебыли получены коллекции линий мух, экспрес-сирующие короткие дцРНК-шпильки (shRNA),комплементарные определенным генам. дцРНК-шпильки экспрессируется под контролем систе-мы Gal4/UAS, позволяя направленно подавлятьэкспрессию гена у гибридов. Коллекция транс-генных линий для нокдауна на сегодняшний деньохватывает около 12000 генов, что составляет бо-лее 80% всех известных белок-кодирующих генову дрозофилы. Коллекции доступны в Гарвард-ском центре – Harvard Drosophila RNAi ScreeningCenter (DRSC) (Ramadan et al., 2007) и Венскомцентре – Vienna Drosophila RNAi Center (VDRC)(Dietzl et al., 2007).

Рис. 4. Методы управления экспрессией гена с использованием системы рекомбинации PhiC31. (а) Ген X может бытьвстроен в геном, в определенный сайт которого предварительно встроены сайты узнавания PhiC31 – attP. Для запускапроцесса рекомбинации используют систему скрещиваний линий мух, несущих ген рекомбиназы PhiC31 и сайты ееузнавания, и плазмиду-донор трансгена. (б) Схема замещения гена mini-white на ген yellow с использованием донорнойплазмиды – метод RCME. (в) Система MiMIC. Конструкция состоит из двух инвертированных повторов транспозонаMinos (L и R), двух инвертированных сайтов attP PhiC31 (P), кассеты-ловушки для гена, состоящей из акцепторногосайта сплайсинга (SA), за которым следуют стоп-кодоны в трех рамках считывания (красный круг), ген GFP с сигна-лом полиаденилирования (pA) и ген yellow+. Последовательность между сайтами attP может быть заменена черезRMCE, в результате чего два образуются гибридные сайты attR. Плазмидой-донором для RMCE может служить плаз-мида, состоящая из полилинкерного сайта для клонирования, плазмида с геном-эффектором (например, GAL4), сли-тым с SA, или плазмида-“белковая ловушка”, состоящая из репортера (например, GFP), фланкированного SA и до-норным сайтом сплайсинга (SD).

(а) (б)

(в)

Плазмида-донор


ГеномнаяДНК


PhiC31

Ген X

Ген X

attB

attP

attR attL

attP

attB

attP

attB

mini-white+

yellow+

yellow+

attR attRRMCE(w– y+)




L attP

L attP

attB

attP R

attB

attR R

SA

SA

SA SD

GFP pA yellow+

MiMIC

Любая ДНКЭффектор

Репортер

Любая ДНК



РНКи приводит к направленной деградацииопределенной мРНК в цитоплазме, процесс, ко-торый как правило, приводит к снижению экс-прессии гена, но не к полному отсутствию экс-прессии гена. Недавний анализ эффективностинокдауна гена методом РНК и показал, что 90%линий in vivo демонстрируют остаточную экс-прессию выключаемых генов (25% или больше)(Perkins et al., 2015). Следовательно, РНКи обыч-но приводит к гипоморфному фенотипу, при ко-тором количество продукта, кодируемого геном,значительно уменьшается, но не отсутствует пол-ностью. Это может быть преимуществом, напри-мер, для изучения жизненно важных генов, пол-ное выключение которых летально для организ-ма. Однако в некоторых случаях, гипоморфныйфенотип мешает исследованию, например, в томслучае, если ген в норме экспрессируется на низ-ком или очень низком уровне. Особенно сложноуправлять экспрессией генов во время индивиду-ального развития, когда экспрессия будет сильнозависеть от возраста.

РНКи обычно приводит к нокдауну с примерноодинаковой эффективностью во всех GAL4-экс-прессирующих клетках, хотя в некоторых случаяхмогут наблюдаться мозаичные эффекты (Boschet al., 2016). Эффективность РНКи ограниченаконцентрациями молекул малых РНК. Таким об-разом, эффект РНКи нестабилен и прекращаетсяпосле прекращения синтеза дцРНК. Побочныеэффекты РНКи могут возникать в случае, когдавводимая молекула РНК имеет последователь-ность, комплементарную нескольким генам од-новременно, что приводит к снижению экспрес-сии сразу нескольких генов. В настоящее времяразработан целый ряд компьютерных программ,позволяющих подбирать интерферирующие РНКс высокой степенью надежности. Хорошие ре-зультаты дает использование методики “тег-опо-средованной потери функции гена”, когда иссле-дуемый ген сливают в одной рамке трансляции сгеном GFP, и для РНКи используют малые ин-терферирующие РНК против GFP (Neumülleret al., 2012).

САЙТ-НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗИ РЕДАКТИРОВАНИЕ ГЕНА

Важным этапом обратной генетики стала раз-работка метода направленной инактивации ге-нов с использованием бактериальной системыCRISPR/Cas9. РНК, транскрибирующиеся с ло-куса CRISPR (crРНК), вступают в комплекс странс-кодируемыми CRISPR-РНК (tracrРНК) и сферментом каспазой Cas9. Комплекс связываетсяс комплементарной ДНК, которую каспаза разру-шает. Для проведения экспериментов с использо-ванием системы CRISPR/Cas9 малые РНК объ-

единяют в одну, которую называют гидовой РНК(gРНК).

Недавно получены трансгенные линии дрозо-филы, экспрессирующие Cas9 под контролемпромоторов генов nanos (nos) или vasa (рис. 5).Эти линии использовали в качестве реципиентовдля инъекции плазмид, экспрессирующих gРНКпод промотором малой ядерной РНК U6, что поз-волило значительно повысить эффективностьметода (Kondo, Ueda, 2013; Port et al., 2014).

Самый простой способ модификации гена наоснове технологии CRISPR/Cas9 – это введениекоротких вставок/делеций (индел) путем стиму-лирования негомологичного соединения концовДНК, которое часто приводит к мутациям сдвигарамки считывания и, следовательно, к выключе-нию гена или синтезу усеченного белка. Посколь-ку размер индел является случайным, значитель-ное количество клеток будет содержать мутации,которые не нарушают функцию гена. В результа-те, полученные особи – это, как правило, генети-ческие мозаики, состоящие из клеток с двумя, содной или без функциональной копии нокаути-руемого гена (Port et al., 2014).

Недавно показано, что несколько событийCRISPR могут происходить в одной клетке одно-временно. Метод ко-CRISPR или метод совмест-ной конверсии, первоначально разработанныйдля C. elegans, успешно применен и у дрозофилы(Kane et al., 2017). Метод основан на одновремен-ной инъекции эмбрионов nos-Cas9 смесью gРНКк интересующему гену и селективному маркеру –гену ebony. Ожидается, что в любой клетке, в кото-рой будет выключен ebony, следует ожидать мутациив исследуемом гене. Таким образом, потомство, де-монстрирующее потерю ebony, отбирают для моле-кулярного анализа целевого гена (Kane et al., 2017).

Использование каспазы Cas9, сшитой с флуо-ресцентным белком, лежит в основе нового методаCASFISH (флуоресцентной гибридизации in situ,опосредуемой CRISPR-Cas9), который позволяетфлуоресцентно метить локусы-мишени (Port et al.,2014). Каспазу можно использовать для подавлениятранскрипции гена-мишени (в случае, когда онасвязывается с ним в области промотора, регулятор-ных областей или начала кодирующей области);кроме того, для подавления транскрипции к каспа-зе может быть пришит репрессор или активатортранскрипции. Введенные белковые метки могутбыть не только регуляторами, но и репортерами,например, флуоресцентными белками (YFP,GFP, mCherry и т.д.) или эпитопами (FLAG,STREPII, Myc и т.д.) (Thorn, 2017). Меченые белкиможно визуализировать in vivo с помощью флуорес-центной микроскопии или иммуногистохимии, аэпитомы также можно использовать в биохимиче-ских исследованиях, например, в комплекснойочистке целевого белка.

250


НЕФЕДОВА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВВ ОТДЕЛЬНЫХ КЛЕТКАХ

Секвенирование транскриптомов отдельныхклеток (single cell RNA-sequencing, scRNA-seq) –чрезвычайно важный подход в онтогенетическихисследованиях. С помощью него уже удалосьпровести общий анализ раннего развития млеко-питающих. Для нематоды С. elegans был составленмолекулярный атлас эмбрионального развития склеточным разрешением. Дрозофила не стала ис-ключением. Одна из первых работ, сделанных сприменением секвенирований РНК единичныхклеток, была посвящена исследованию механиз-ма дозовой компенсации в ходе раннего эмбрио-нального развития (Lott et al., 2011).

Не менее перспективными представляютсяисследования развития центральной нервной си-

стемы, включая головной мозг. Мозг дрозофилысодержит около 100000 нейронов, количество ихпредшественников – примерно 200 нейробла-стов. Управление развитием может быть представ-лено в виде сети. Чтобы исследовать транскрипци-онные сети, лежащие в основе развития различныхлиний нейробластов, в работе (Yang et al., 2016) по-метили и выделили нейробласты, специфичныедля отдельных клеточных линий, и секвенирова-ли их транскриптомы. Конкретные нейробластыбыли маркированы с использованием системыGAL4/UAS и отслеживались на протяжении всегонейрогенеза.

Крыловой имагинальный диск дрозофилы яв-ляется важной модельной системой для изученияроста ткани, морфогенеза эпителия, межклеточ-ной передачи сигналов, клеточной конкуренциии др. Паттерны экспрессии подавляющего боль-

Рис. 5. Метод нокаута гена, с использованием системы CRISPR/Cas9. Активация системы происходит у гибридов прискрещивании самок, экпсрессирующих Cas9 под промотором гена nos, с самцами, экпсрессирующими гидовую РНКпод промотором U6. Полученные гибриды после скрещивания с диким типом могут давать потомков с выключеннымисследуемым геном, например, геном white (мутантные потомки выделены рамкой).

Pnos-Cas9

Pnos

PU6

PU6-gРНК

Сas9

Сas9

gРНК

ДНК-мишень

gРНКСкрещиваниес диким типом



шинства генов в крыловом диске неизвестны.Чтобы получить полный атлас экспрессии генов вкрыловом диске, в работе (Bageritz et al., 2019) ис-пользовали секвенирование отдельных клеток иразработали новый метод анализа данных scRNA-seq, основанный на корреляциях экспрессии генов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вековая история дрозофилы в биологии со-провождается постоянным расширением новыхметодов манипуляции с геномом, получениемколлекций доступных для исследователей транс-генных линий, которые насчитывают более 100000.Создаются и постоянно обновляются базы дан-ных геномных и генетических ресурсов дрозофи-лы, расширяются биоинформатические подходык анализу генома. С расширением методическойбазы расширяются и возможности использованиядрозофилы как модели для изучения отдельныхпроцессов развития. В табл. 1 перечислены неко-торые примеры использования дрозофилы как мо-дели с применением вышеописанных технологийв последние годы. Все это позволяет заключить,

что дрозофила, в ближайшее время будет по-преж-нему востребована как объект исследований в ге-нетике развития.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит д. б. н. О.Б. Симонову за плодо-творное обсуждение статьи.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫ

Работа выполнялась в рамках программы НИРбиологического факультета МГУ имени М.В. Ломоно-сова “Молекулярно-генетические механизмы неста-бильности генома и мутагенеза у животных и челове-ка” (АААА-А16-116021660038-4).

СОБЛЮДЕНИЕ ЭТИЧЕСКИХ СТАНДАРТОВ

Настоящая статья не содержит описания выпол-ненных автором исследований с участием людей илииспользованием животных в качестве объектов.

Таблица 1. Процессы развития, моделируемые на дрозофиле с использованием новых генетических технологийБиологический процесс Ссылки на публикации

Оогенез Gaziova et al., 2004;Hudson, Cooley, 2014;Rubin, Huynh, 2015;Rodal et al., 2015;Hsu et al., 2019

Раннее эмбриональное развитие Lott et al., 2011;Neumüller et al., 2012;Fernandez, Lagha, 2019;Mazina et al., 2019;Weisman, 2019;Zhou et al., 2019

Развитие мозга и нервной системы Jennett et al., 2012;Xue et al., 2014;Frickenhaus et al., 2015;Jin et al., 2016;Yang et al., 2016;Spirov, Myasnikova, 2019;Liu et al., 2020

Развитие крыла Schertel et al., 2015;Xu et al., 2017;Bageritz et al., 2019

Развитие мышц и регенерация Frickenhaus et al., 2015;Gunage et al., 2017;Kopke et al., 2020

Гемопоэз и развитие сердца Frasch, 2016;Banerjee et al., 2019

Развитие трахеи Chandran et al., 2014;Amourda, Saunders, 2017

252


НЕФЕДОВА

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ

Автор заявляет, что какой-либо конфликт интере-сов отсутствует.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫAmeres S.L., Zamore P.D. Diversifying microRNA sequence

and function // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2013. V. 14.№ 8. P. 475–488.

Amourda C., Saunders T.E. Gene expression boundary scalingand organ size regulation in the Drosophila embryo //Dev. Growth Differ. 2017. V. 59. №1. P. 21–32.

Bageritz J., Willnow P., Valentini E. et al. Gene expressionatlas of a developing tissue by single cell expression cor-relation analysis // Nat. Methods. 2019. V. 16. № 8.P. 750–756.

Banerjee U., Girard J.R., Goins L.M. et al. Drosophila as agenetic model for hematopoiesis // Genetics. 2019.V. 211. № 2. P. 367–417.

Bateman J.R., Lee A.M., Wu C.T. Site-specific transforma-tion of Drosophila via phic31 integrase-mediated cas-sette exchange // Genetics. 2006. V. 173. P. 769–777.

Bellen H.J., Levis R.W., Liao G. et al. The BDGP gene dis-ruption project: single transposon insertions associatedwith 40% of Drosophila genes // Genetics. 2004. V. 167.№ 2. P. 761–781.

Bischof J., Maeda R.K., Hediger M. et al. An optimizedtransgenesis system for Drosophila using germ-line-specific PhiC31 integrases // Proc. Natl. Acad. Sci.USA. 2007. V. 104. P. 3312–3317.

Bosch J.A., Sumabat T.M., Hariharan I.K. Persistence ofrnai-mediated knockdown in Drosophila complicatesmosaic analysis yet enables highly sensitive lineage trac-ing // Genetics. 2016. V. 203. № 1. P. 109–118.

Brand A.H., Perrimon N. Targeted gene expression as ameans of altering cell fates and generating dominantphenotypes // Development. 1993. V. 118. № 2. P. 401–415.

Branda C.S., Dymecki S.M. Talking about a revolution: Theimpact of site-specific recombinases on genetic analysesin mice // Dev. Cell. 2004. V. 6. № 1. P. 7–28.

Chandran R.R., Iordanou E., Ajja C. et al. Gene expressionprofiling of Drosophila tracheal fusion cells // GeneExpr. Patterns. 2014. V. 15. № 2. P. 112–123.

Dietzl G., Chen D., Schnorrer F., et al. A genome-wide trans-genic RNAi library for conditional gene inactivation inDrosophila // Nature. 2007. V. 448. № 7150. P. 151–156.

Duc C., Yoth M., Jensen S. et al. Trapping a somatic endog-enous retrovirus into a germline piRNA cluster immu-nizes the germline against further invasion // GenomeBiol. 2019. V. 20. № 1. P. 127.

Ewen-Campen B., Yang-Zhou D., Fernandes V.R. et al. Opti-mized strategy for in vivo cas9-activation in drosophila //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2017. V. 114. P. 9409–9414.

Fernandez C., Lagha M. Lighting up gene activation in livingdrosophila embryos // Methods Mol. Biol. 2019.V. 2038. P. 63–74.

Frasch M. Genome-wide approaches to drosophila heartdevelopment // J. Cardiovasc. Dev. Dis. 2016. V. 3.№ 2. pii:20.

Frickenhaus M., Wagner M., Mallik M. et al. Highly efficientcell-type-specific gene inactivation reveals a key functionfor the Drosophila FUS homolog cabeza in neurons // Sci-entific Reports. 2015. V. 5. P. 9107.

Gaziova I., Bonnette P.C., Henrich V.C., Jindra M. Cell-autonomous roles of the ecdysoneless gene in Dro-sophila development and oogenesis // Development.2004. V. 131. № 11. P. 2715–2725.

Golic K.G., Golic M.M. Engineering the Drosophila ge-nome: Chromosome rearrangements by design // Ge-netics. 1996. V. 144. P. 1693–1711.

Groth A.C., Fish M., Nusse R. et al. Construction of trans-genic Drosophila by using the site-specific integrasefrom phage PhiC31 // Genetics. 2004. V. 166. P. 1775–1782.

Gunage R.D., Dhanyasi N., Reichert H. et al. Drosophilaadult muscle development and regeneration // SeminCell Dev. Biol. 2017. V. 72. P. 56–66.

Hsu H.J., Bahader M., Lai C.M. Molecular control of thefemale germline stem cell niche size in Drosophila //Cell Mol. Life Sci. 2019. V. 76. № 21. P. 4309–4317.

Hudson A.M., Cooley L. Methods for studying oogenesis //Methods. 2014. V. 68. № 1. P. 207–217.

Jennett A., Rubin G., Ngo T. et al. A GAL4-driver line re-source for Drosophila neurobiology // Cell Rep. 2012.V. 2. № 4. P. 991–1001.

Jin M., Eblimit A., Pulikkathara M. et al. Conditionalknockout of retinal determination genes in differentiat-ing cells in Drosophila // FEBS J. 2016. V. 283. № 15.P. 2754–2766.

Kane N.S., Vora M., Varre K.J. et al. Efficient screening ofcrispr/cas9-induced events in Drosophila using a co-CRISPR strategy // G3 Genes Genomes Genet. 2017.V. 7. P. 87–93.

Kennerdell J.R., Carthew R.W. Use of dsRNA-mediated ge-netic interference to demonstrate that frizzled and friz-zled 2 act in the wingless pathway // Cell. 1998. V. 95.№ 7. P. 1017–1026.

Kidwell M.G. Hybrid dysgenesis in Drosophila melanogaster:nature and inheritance of P element regulation // Ge-netics. 1985. V. 111. P. 337–350.

Knapp J.M., Chung P., Simpson J.H. Generating customizedtransgene landing sites and multi-transgene arrays inDrosophila using PhiC31 integrase // Genetics. 2015.V. 199. P. 919–934.

Kondo S., Ueda R. Highly improved gene targeting by germ-line-specific Cas9 expression in Drosophila // Genetics.2013. V. 195. P. 715–721.

Kopke D.L., Leahy S.N., Vita D.J. et al. Carrier of wingless(cow) regulation of drosophila neuromuscular junctiondevelopment // eNeuro. 2020. pii: ENEURO.0285-19.2020.

Lee T., Luo L. Mosaic analysis with a repressible cell marker(MARCM) for Drosophila neural development //Trends Neurosci. 2001. V. 24. № 5. P. 251–254.

Liu Z., Chen Y., Rao Y. An RNAi screen for secreted factorsand cell-surface players in coordinating neuron and gliadevelopment in Drosophila // Mol. Brain. 2020. V. 13.№ 1. P. 1.

Lobo N., Li X., Fraser M.J. Transposition of the piggybac ele-ment in embryos of Drosophila melanogaster, Aedes aegyptiand Trichoplusia ni // Mol. Gen. Genet. 1999. V. 261.P. 803–810.

Lott S.E., Villalta J.E., Schroth G.P. et al. Noncanonicalcompensation of zygotic X transcription in early Dro-sophila melanogaster development revealed through sin-gle-embryo RNA-seq // PLoS Biol. 2011. V. 9. № 2.e1000590.

Loukeris T.G., Arcà B., Livadaras I. et al. Introduction of thetransposable element minos into the germ line of Dro-



sophila melanogaster // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.1995. V. 92. P. 9485–9489.

Mazina M.Y., Krasnov A.N., Georgiev P.G. et al. The devel-opment of reporter system for the investigation of mo-lecular mechanisms of ecdysone response // Dokl. Bio-chem. Biophys. 2019. V. 485. № 1. P. 138–140.

McGuire S.E., Roman G., Davis R.L. Gene expression sys-tems in Drosophila: a synthesis of time and space //Trends Genet. 2004. V. 20. № 8. P. 384–391.

Weisman N.Ya. Genetic and Epigenetic Pathways of lethal (2)giant larvae Tumor Suppressor in Drosophila melanogaster //Russian J. Genetics. 2019. V. 55. № 2. P. 133–143.

Nagarkar-Jaiswal S., DeLuca S.Z., Lee P.-T. et al. A genetictoolkit for tagging intronic MiMIC containing genes //Elife. 2015. V. 4. e08469.

Nakazawa N., Taniguchi K., Okumura T. et al. A novelcre/loxp system for mosaic gene expression in the Dro-sophila embryo // Dev. Dyn. 2012. V. 241. P. 965–974.

Neumüller R.A., Wirtz-Peitz F., Lee S. et al. Stringent analy-sis of gene function and protein-protein interactions us-ing f luorescently tagged genes // Genetics. 2012. V. 190.№ 3. P. 931–940.

Perkins L.A., Holderbaum L., Tao R. et al. The TransgenicRNAi Project at Harvard Medical School: Resourcesand Validation // Genetics. 2015. V. 201. № 3. P. 843–852.

Port F., Chen H.M., Lee T. et al. Optimized CRISPR/Castools for efficient germline and somatic genome engi-neering in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2014. V. 111. E2967–E2976.

Ramadan N., Flockhart I., Booker M. et al. Design and im-plementation of high-throughput RNAi screens in cul-tured Drosophila cells // Nat. Protoc. 2007. V. 2. № 9.2245–2264.

Riggleman B., Wieschaus E., Schedl P. Molecular analysis ofthe armadillo locus: Uniformly distributed transcriptsand a protein with novel internal repeats are associatedwith a drosophila segment polarity gene // Genes Dev.1989. V. 3. P. 96–113.

Rodal A.A., Del Signore S.J., Martin A.C. Drosophila comesof age as a model system for understanding the functionof cytoskeletal proteins in cells, tissues, and organisms //Cytoskeleton (Hoboken). 2015. V. 72. № 5. P. 207–224.

Rong Y.S. Gene targeting by homologous recombination: apowerful addition to the genetic arsenal for Drosophilageneticists // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002.V. 297. № 1. P. 1–5.

Rubin G.M., Spradling A.C. Genetic transformation of Dro-sophila with transposable element vectors // Science.1982. V. 218. P. 348–353.

Rubin T., Huynh J.R. Mosaic Analysis in the Drosophilamelanogaster ovary // Methods Mol. Biol. 2015. V. 1328.P. 29–55.

Ryder E., Ashburner M., Bautista-Llacer R. et al. The Dros-Del deletion collection: a Drosophila genomewidechromosomal deficiency resource // Genetics. 2007.V. 177. P. 615–629.

Ryder E., Russell S. Transposable elements as tools for ge-nomics and genetics in Drosophila // Brief Funct. Ge-nomic Proteomic. 2003. V. 2. № 1. P. 57–71.

Schertel C., Albacara M., Rockel-Bauer C. et al. A large-scale, in vivo transcription factor screen defines bivalentchromatin as a key property of regulatory factors medi-ating Drosophila wing development // Genome Res.2015. V. 25. № 4. P. 514–523.

Spirov A.V., Myasnikova E.M. Evolutionary stability of generegulatory networks that define the temporal identity ofneuroblasts // Mol. Biol. (Mosk.). 2019. V. 53. № 2.P. 225–239.

Theodosiou N.A., Xu T. Use of FLP/FRT system to studyDrosophila development // Methods. 1998. V. 14. № 4.P. 355–365.

Thorn K. Genetically encoded fluorescent tags // Mol. Biol.Cell. 2017. V. 28. P. 848–857.

Venken K.J., Schulze K.L., Haelterman N.A. et al. MiMIC:A highly versatile transposon insertion resource for en-gineering Drosophila melanogaster genes // Nat. Meth-ods. 2011. V. 8. P. 737–743.

Xu X.S., Gantz V.M., Siomava N. et al. CRISPR/Cas9 andactive genetics-based trans-species replacement of theendogenous Drosophila kni-L2 CRM reveals unexpect-ed complexity // Elife. 2017. V. 6. pii:e30281.

Xue Z., Ren M., Wu M. et al. Efficient gene knock-out andknock-in with transgenic Cas9 in Drosophila // G3(Bethesda). 2014. V. 4. № 5. P. 925–929.

Yang C.P., Fu C.C., Sugino K. et al. Transcriptomes of lin-eage-specific Drosophila neuroblasts profiled by genetictargeting and robotic sorting // Development. 2016.V. 143. № 3. P. 411–421.

Zhou J., Schor I.E., Yao V. et al. Accurate genome-wide pre-dictions of spatio-temporal gene expression during em-bryonic development // PLoS Genet. 2019. V. 15. № 9.e1008382.

Drosophila melanogaster as a Model of Development Genetics:Modern Approaches and Prospects

L. N. Nefedova*Faculty of Biology, Moscow State University, Moscow, 119234 Russia

*e-mail: [email protected]

For more than a hundred years, the fruit f ly Drosophila melanogaster has successfully served as a universalmodel in various genetic studies, including studies of the genetic control of individual development. To date,a whole arsenal of reverse genetics methods has been developed for Drosophila, making it quite easy to ma-nipulate its genome, which allows Drosophila to be considered one of the most powerful models of develop-mental genetics. The review considers the main modern methods for studying the expression and function ofgenes in Drosophila and the prospects for their use.

Keywords: Drosophila, developmental genetics, model, gene expression

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 254–274

254

РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО РЕТИНАЛЬНОГО ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯ МЛЕКОПИТАЮЩИХИ ЧЕЛОВЕКА: СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ И ПЕРСПЕКТИВЫ

© 2020 г. Л. А. Ржановаa, *, А. В. Кузнецоваa, М. А. Александроваa, b

aФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ул. Вавилова, 26, Москва, 119334 РоссияbМосковский государственный университет имени М.В. Ломоносова, Ленинские горы, 1, стр. 12,

Москва, 119991 Россия*e-mail: [email protected]



Нарушение гомеостатической и функциональной целостности сетчатки и ретинального пигмент-ного эпителия (РПЭ) является основной причиной ряда дегенеративных заболеваний глаза челове-ка, сопровождающихся потерей зрения. Несмотря на значительные успехи, достигнутые за послед-ние десятилетия, в разработке новых методов лечения указанной патологии, сохраняется рядосложнений при использовании хирургических способов коррекции зрения и пока непреодолимыхограничений в применении современных подходов, например, генной терапии и генной инжене-рии. Одним из перспективных подходов к лечению дегенеративных заболеваний сетчатки можетоказаться подход, основанный на использовании регенеративных способностей собственных эндо-генных клеток с высокой пластичностью, в частности клеток РПЭ и Мюллеровской глии. В насто-ящее время клетки РПЭ позвоночных вызывают огромный интерес в качестве источника новых фо-торецепторов и других нейронов в деградирующей сетчатке in vivo. В связи с этим исследуются воз-можности их прямого репрограммирования генетическими, эпигенетическими, химическимиметодами и их комбинацией. В обзоре сделан акцент на исследованиях по генетическому прямомурепрограммированию клеток РПЭ позвоночных в нейроны сетчатки, с подробным анализом ис-пользуемых генов в качестве основных репрограммирующих факторов, сравнительным анализом иэкстраполяцией экспериментальных данных с животных на человека. Кроме того, обзор затрагива-ет работы по использованию альтернативных генетическому прямому репрограммированию подхо-дов – химически-опосредованного с применением коктейлей из терапевтических низкомолекуляр-ных соединений и микроРНК. В целом, результаты исследований указывают на сложность процес-са прямого репрограммированния клеток РПЭ человека в нейроны сетчатки. Однако, учитываярезультаты по прямому репрограммированию клеток позвоночных и доступность клеток РПЭ че-ловека для различных векторов, доставляющих в клетки разнообразные молекулы: транскрипцион-ные факторы, химерные эндонуклеазы, рекомбинантные белки и низкомолекулярные соединения,можно предположить наиболее оптимальный набор факторов для успешной конверсии клеток РПЭчеловека в нейроны сетчатки.

Ключевые слова: ретинальный пигментный эпителий, РПЭ, регенерация сетчатки, генетическоепрямое репрограммирование, гены, транскрипционные факторы, дегенеративно-дистрофическиезаболевания глазаDOI: 10.31857/S0475145020040060

ВВЕДЕНИЕ. МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ВОССТАНОВЛЕНИЮ СЕТЧАТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

И ЧЕЛОВЕКА

Дегенерация сетчатки в результате гибели фото-рецепторов, специализированных клеток, обеспе-чивающих фототрансдукцию, и ретинального пиг-ментного эпителия (РПЭ) является основной при-чиной многих дегенеративно-дистрофических

заболеваний глаза человека, приводящих к потерезрения (Fu et al., 2018). В настоящее время в со-временной медицине для коррекции зрения приуказанной патологии активно разрабатываютсяподходы, направленные на сохранение исходныхфоторецепторов и РПЭ (Jiang et al., 2018), заменуклеток путем активации эндогенной регенерации(Otteson, 2017) или за счет клеточной трансплан-тации (Jiang et al., 2018; Léveillard, Klipfel, 2019).Все это стало возможным благодаря развитию ря-

УДК 576.08

ОБЗОРЫ


РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО РЕТИНАЛЬНОГО 255

да технологий в клеточной и молекулярной био-логии. Вследствие использования вирусных и не-вирусных векторов для доставки функциональ-ных генов в дефектные клетки глаза, открытияметодов получения индуцированных плюрипо-тентных стволовых клеток (ИПСК), а из них кле-ток РПЭ и нейронов сетчатки для транспланта-ции, а также создания CRISPR/Cas9 технологии,позволило говорить о революции, происходящейв офтальмологии (Jiang et al., 2018). Так, благода-ря успехам современной биоинженерии сталовозможным использовать принципы генной те-рапии и геномной хирургии для лечения наслед-ственных заболеваний глаз человека (Chan et al.,2017). Основная цель – заменить нефункциональ-ные или дефектные гены новыми полнофункцио-нальными, чтобы уровень генетической экспрессиимог вернуться к нормальному. Первый успешныйклинический пример генной терапии в офтальмо-логии показан у пациентов с врожденным амавро-зом Лебера, вызванный мутациями в гене RPE65(Bainbridge et al., 2008). Клинические испытаниягенной терапии начаты и для пациентов с болезньюШтаргардта (clinicaltrials.gov NCT01367444), син-дромом Ушера (clinicaltrials.gov NCT01505062), пиг-ментным ретинитом (clinicaltrials.gov NCT01482195)(Fu et al., 2018). Клинические испытания генной те-рапии, направленной на лечение заболеваний сет-чатки, показали, что она безопасна и эффективнадля людей (Al-Saikhan, 2013; Öner, 2017; Fu et al.,2018; Jiang et al., 2018). Однако лечение генной тера-пией ограничено только аутосомно-рецессивнымизаболеваниями. При этом в клетках остается функ-ционально дефектный ген, который необходимозаблокировать, сделав его не функциональным илиудалить. Лечение наследственных заболеваний глазс использованием методов хирургии генома в тече-ние последних нескольких лет развивается быстры-ми темпами. С внедрением технологии CRISPR/Casредактирования генов, которая позволяет не толь-ко заблокировать дефектный ген, но и встроитьрабочий, внимание многих исследователей на-правлено на восстановление сетчатки и РПЭ(Burnight et al., 2017). В ближайшее время начина-ются клинические испытания CRISPR/Cas9 налюдях с таким офтальмологическим заболевани-ем, как врожденный амавроз Лебера 10 типа (clin-icaltrials.gov NCT03872479). Поскольку генная те-рапия и геномная хирургия имеют высокий про-цент эффективности только на ранних стадияхразвитии дегенеративно-дистрофических заболе-ваний сетчатки, когда еще сохранились фоторе-цепторы и РПЭ, многое зависит от возможностиранней диагностики заболеваний. Кроме того,эти методы не подходят для лечения других видовпатологии сетчатки.

Другой подход в лечении ряда дегенеративныхзаболеваний сетчатки, в том числе возрастноймакулярной дегенерации – это заместительная

клеточная терапия. Клетки РПЭ, полученные изэмбриональных стволовых клеток (ЭСК) иИПСК человека уже проходят клинические ис-пытания и имеют большие перспективы как длялечения возрастной макулярной дистрофии(Schwartz et al., 2012; Kharitonov et al., 2018; Luo,Chen, 2018; Kashani et al., 2018), так и наследствен-ных, связанных с РПЭ, дистрофий сетчатки (Chi-chagova et al., 2018). Несмотря на разработанныевысокоэффективные протоколы по получениюклеток РПЭ в достаточном количестве для транс-плантаций, они все еще остаются трудо- и время-затратными (Kharitonov et al., 2018; Artero-Castroet al., 2019). Помимо позитивного эффекта транс-плантация может вызывать ряд осложнений, ко-торые могут быть спровоцированы хирургиче-ским повреждением сетчатки, приводящим к ееотслоению (Satarian et al., 2017), а так же самимиклетками при долгосрочным выживании/инте-грации, вызывая иммуносупрессию и опухолеоб-разование (Nguyen, Wong, 2017; Öner, 2018). В до-полнение к научным проблемам остаются нераз-решенными морально-этические вопросы поиспользованию ЭСК (Schwartz et al., 2015).

Благодаря повышенному интересу к ИПСК,возможности получения из них клеток РПЭ инейронов сетчатки для заместительной клеточ-ной терапии, область исследования регенератив-ных способностей собственных эндогенных кле-ток с высокой пластичностью, таких как РПЭ иМюллеровская глия, на наш взгляд, незаслужен-но оказалась в тени. Хотя очевидно, что прямоерепрограммирование эндогенных клеток в ней-роны сетчатки может быть перспективным длялечения многих дегенеративно-дистрофическихзаболеваний сетчатки глаза человека, позволяю-щее избежать перечисленные выше ограниченияи осложнения.

ПРЕДПОСЫЛКИ ДЛЯ ПРЯМОГО РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ РЕТИНАЛЬНОГО

ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯРПЭ – это однослойный эпителий, состоящий

из сильнопигментированных клеток, выполняю-щих жизненно важные функции в физиологии сет-чатки. РПЭ лежит непосредственно под сетчаткой иобразует внешний гематоретинальный барьер. Та-кое анатомическое расположение предоставляетуникальную возможность для прямого репрограм-мирования клеток РПЭ в фоторецепторы и другиенейроны и регенерации дегенерирующей сетчат-ки без хирургического вмешательства (Wang et al.,2010).

В процессе развития РПЭ и сетчатка происхо-дят из одной и той же структуры – глазного пузы-ря (Martínez-Morales et al., 2004). Образующие егоклетки нейроэпителия имеют общие молекуляр-ные характеристики, они бипотентны, и могут

256


РЖАНОВА и др.

дать начало как клеткам РПЭ, так и клеткам сет-чатки (Fuhrmann, 2010; Fuhrmann et al., 2014). Впроцессе развития глазной пузырь инвагинирует,образуя двухслойную глазную чашу, создаваяанатомическое разделение РПЭ (внешний слой)и сетчатки (внутренний слой) (Martínez-Moraleset al., 2004). РПЭ сохраняет свою простую одно-слойную эпителиальную структуру на протяже-нии всей жизни. В то время как сетчатка пред-ставляет собой высоко упорядоченную структурус пятью типами нейронов, включая ганглиозные,амакриновые, биполярные, горизонтальные ифоторецепторные клетки, и одним типом глии –клетки Мюллера (Zaghloul et al., 2005; Fuhrmann,2010; Fuhrmann et al., 2014). Благодаря общностипроисхождения в клетках РПЭ, по всей видимо-сти, сохраняются молекулярные и клеточныеособенности, которые могут способствовать пе-реключению их клеточной судьбы при прямомрепрограммировании. Так, последние исследова-ния (Dvoriantchikova et al., 2019) показали, чтоклетки РПЭ глаза взрослой мыши эпигенетиче-ски очень близки к фенотипам клеток-предше-ственников сетчатки и фоторецепторов. На осно-вании данных, полученных с использованием ря-да специфических методов (ДНК-микрочипа(DNA microarray) и методов, основанных на им-мунопреципитации хроматина и полногеномномбисульфитном секвенировании (ChIP- и whole-genome bisulfite sequencing)) авторы предположи-ли существование как минимум двух механизмов,необходимых для запуска прямого репрограмми-рования клеток РПЭ в нейрональные клетки сет-чатки. Первый механизм заключается в ремодели-ровании конденсированного хроматина, в которомнаходятся ключевые гены клеток-предшественни-ков и зрелых нейронов сетчатки транскрипцион-ными пионер-факторами. Второй механизм – в де-метилировании регуляторных элементов генов,связанных с фоторецепторами (Dvoriantchikovaet al., 2019). Можно предположить, что именноэти механизмы запускаются в клетках РПЭ у вы-сокорегенерирующих амфибий при регенерациисетчатки, а у млекопитающих они вероятно по-давлены или отсутствуют.

Классические эксперименты на животных моде-лях продемонстрировали способность клеток РПЭк трансдифференцировке, естественному прямомурепрограммированию, в нейральные клетки сет-чатки. Процесс трансдифференцировки клетокРПЭ в нейральные клетки у низших позвоночныхуспешно воспроизводится in vivo. Так, клетки РПЭу ряда амфибий после повреждения сетчатки ре-программируются в клетки подобные стволовымклеткам нейроэпителия, потомки которых диф-ференцируются во все нервные клетки сетчатки,включая фоторецепторы, глию, пигментный эпи-телий и полностью восстанавливают функциюсетчатки (Chiba, Mitashov, 2008; Vergara, Del Rio-

Tsonis, 2009; Grigoryan et al., 2013; Islam et al.,2014). У птиц и млекопитающих процесс конвер-сии РПЭ происходит в ранние периоды эмбрио-нального развития только под влиянием основ-ного фактора роста фибробластов (bFGF) (Luz-Madrigal et al., 2014), а у взрослых особей при уси-лении или потери функции генов, участвующих вопределении клеточной судьбы РПЭ и сетчатки(Nguyen, Arnheiter, 2000; Bumsted, Barnstable,2000; Martínez-Morales et al., 2003; Bäumer et al.,2003; Fujimura et al., 2009; Bassett et al., 2010; Bhartiet al., 2012; Remez et al., 2017). У взрослых млеко-питающих, включая человека, РПЭ может прояв-лять пластичность и пролиферацию. Показано,что в зрелом глазу крыс небольшая популяцияклеток на периферии РПЭ поддерживает митоти-ческую активность (Al-Hussaini et al., 2008). Клет-ки РПЭ, в норме находящиеся в состоянии по-коя, могут повторно входить в клеточный цикл ипролиферировать при определенных состояниях,таких как отслоение сетчатки (Anderson et al.,1981), физическая стимуляция (Zhang et al., 1993),повреждение сетчатки или ее дегенерация (LaCour, 2008). Пролиферативный ответ может иметьдва последствия – привести к регенерации РПЭ(Rabenlehner et al., 2008) или к пролиферативнойретинопатии, при которой клетки РПЭ трансдиф-ференцируются в фибробластоподобные клетки,вызывающие отслоение сетчатки (Tamiya, Kaplan,2016).

Трансдифференцировку клеток РПЭ у птиц имлекопитающих в нейроны сетчатки можно на-блюдать и in vitro при условии добавления морфо-генов и факторов роста (Zhao et al., 1995; Engel-hardt et al., 2005; Sakami et al., 2008; Salero et al.,2012). В культуре клетки РПЭ теряют исходныепризнаки, такие как пигментацию, значительноснижают экспрессию специфических маркеровRPE65, MITF, CRALBP и приобретают чертынейральных клеток по маркерам MUSASHI1,NESTIN, βIII-TUBULIN, GFAP, DOUBLECORTIN,NF 68 и 200 кДа. Наши исследования так же де-монстрируют, что клетки РПЭ эмбриона и взрос-лого человека in vitro в средах с добавками морфо-генов и факторов роста теряют пигментные гра-нулы, дедифференцируются, пролиферируют идемонстрируют маркеры нескольких типов ней-ральных и глиальных клеток (Milyushina et al.,2009, 2011, 2012; Kuznetsova, 2014; Kuznetsova et al.,2015, 2019). На стадии дедифференцировки клет-ки приобретают черты стволовых/нейроэпите-лиальных клеток, экспрессируя OCT4, NANOG,KLF4, OTX2, PAX6 и NESTIN (Milyushina et al.,2009, 2011, 2012; Kuznetsova et al., 2014, 2015, 2019a,2019b). Хотя экспрессия мРНК генов-маркеровплюрипотентности проявляется на очень низкомуровне в сравнении с ИПСК человека (Kuznetsovaet al., 2019), активность этих генов свидетель-ствует, что они могут действовать, как пионер-



факторы (Kuzmich et al., 2015). Клетки РПЭ че-ловека в условиях in vitro приобретают пронейраль-ные свойства при частичном сохранении свойствРПЭ. В культуре четко проявляется гетероген-ность популяции клеток РПЭ. Так, в условиях 2Dкультивирования выявляются различия в харак-тере роста клеток, в неоднородности монослоя:клетки различаются по размеру, форме, степенипигментации и количеству ядер, а также в форми-ровании колоний – клетки образуют как плотноупакованные эпителиоидные колонии с различ-ной морфологией, так и “рыхлые” колонии с раз-мытыми границами, что отражает происходящуюклональную пролиферацию клеток (Kuznetsovaet al., 2011). В условиях 3D культивирования (вколлагеновом геле, на бесклеточном каркасе сет-чатки) гетерогенность клеток РПЭ проявляется вразделении на две схожие по морфологии и одно-типные по поведению субпопуляции клеток: однасубпопуляция клеток мигрирует на поверхностьплотного субстрата, другая образует сфероподоб-ные структуры из агрегированных клеток(Kuznetsova, Aleksandrova, 2017). При этом субпо-пуляция, сохраняющая способность к образова-нию плотного монослоя и редифференцировкеРПЭ, может оказывать благоприятный эффект притрансплантации, тогда как вторая субпопуляция,образующая клеточные агрегаты, может оказыватьтракционное действие на окружающие ткани, чтонеблагоприятно при трансплантации. Такие осо-бенности гетерогенности клеток РПЭ следуетучитывать при его использовании в тканевой ин-женерии.

Наряду с этим, из патоморфологических иссле-дований хорошо известно, что в глазах человекаиногда обнаруживаются хрящевые и костные обра-зования, которые развиваются из клеток РПЭ(Frayer, 1966; Tso, Fine, 1979; Salero et al., 2012). Вусловиях культуры клетки РПЭ под влияниемспецифических индукторов проявляют признакине только нейральной, но и гладкомышечной,адипо-, хондро- и остеогенной дифференциров-ки. По мнению ряда авторов, клетки РПЭ в опре-деленных условиях могут становиться “мульти-потентными стволовыми клетками”, способны-ми продуцировать клетки и нейрального имезенхимального фенотипов (Milyushina et al.,2012; Salero et al., 2012). Способность к множе-ственным дифференцировкам подчеркивает ин-терес к чрезвычайно высокой пластичности кле-ток РПЭ и ставит задачу поиска механизмов, ко-торые ее определяют и факторов для регуляциинаправленной дифференцировки.

Анализ представленных работ свидетельствуето том, что клетки РПЭ млекопитающих и челове-ка по анатомическим, генетическим и эпигенети-ческим характеристикам, по особенностям про-исхождения, эволюционному наследству, по спо-собностям к дедифференцировке, пролиферации

и пластичности представляют огромный интересв качестве источника новых фоторецепторов идругих нейронов в деградирующей сетчатке. Од-нако кратковременный характер проявленияклетками РПЭ взрослого человека in vitro проней-ральных свойств инициировал исследования попоиску возможностей прямого репрограммиро-вания РПЭ с использованием генетических, эпи-генетических и химических методов воздействия,речь о которых и пойдет ниже.

ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ПРЯМОЕ РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ РЕТИНАЛЬНОГО

ПИГМЕНТНОГО ЭПИТЕЛИЯГенетические программы являются основными

движущими силами развития сетчатки, которыекоординируют пролиферацию и выход клеток изклеточного цикла, определяют клеточные судьбы,контролируют количество клеток и управляют кле-точным созреванием (Reese, Keeley, 2016). В основедифференцировки или репрограммирования лю-бых клеток лежат процессы распознавания и акти-вации молчащих генов. Эти процессы происходятв результате совместного действия так называе-мых первичных, пионерских или пионер-фактортранскрипции с каноническими транскрипцион-ными факторами (Kuzmich et al., 2015; Mayran et al.,2019). При репрограммировании клеток обычно ис-пользуется комбинация транскрипционных факто-ров, часть из которых являются пионер-факторами.Так, при получении функциональных глутаминер-гических нейронов из фибробластов мыши при по-мощи трех факторов транскрипции ASCL1, BRN2 иMYT1L (Vierbuchen et al., 2010), оказалось, чтоименно ASCL1 играет центральную роль в ини-циации прямого репрограммирования, посколь-ку его одного достаточно для индукции фиброб-ластов в незрелые нейральные клетки, а BRN2 иMYT1L – нет. Таким образом, ASCL1 являетсятранскрипционным пионер-фактором в нейро-нальном прямом репрограммировании фибробла-стов (Iwafuchi-Doi, Zaret, 2014). При репрограмми-ровании фибробластов в ИПСК OCT3/4, SOX2,и/или KLF4 действуют как пионер-факторы, вотличие от c-MYC (Iwafuchi-Doi, Zaret, 2014; Kuz-mich et al., 2015). Следовательно, для успешногогенетического прямого репрограммированияклеток РПЭ человека в нейроны сетчатки необхо-димо определить пионерские факторы, без кото-рых этот процесс не осуществим, и дополнитель-ные, канонические факторы, которые будут про-двигать клеточную конверсию после инициациипроцесса.

Современные методы генной инженерии, ис-пользуя пути усиления или подавления функциигенов, участвующих в определении клеточнойсудьбы РПЭ и сетчатки, создали возможностьпрямого репрограммирования клеток РПЭ у мле-

258



копитающих. Исследователи департамента оф-тальмологии Университета Алабамы и медицин-ского факультета Бирмингема США, а так же дру-гие группы исследователей показали, что клеткиРПЭ птицы, мышей и человека можно напрямуюрепрограммировать воздействием различных ге-нов, которые участвуют в процессе дифференци-ровки сетчатки in vivo и in vitro (Mathers et al., 1997;Yan, Wang, 1998; Toy et al., 1998b; Loosli et al., 1999;Bernier et al., 2000a; Lagutin et al., 2001; Yan et al.,2001, 2010, 2013a, 2013b, 2015; Azuma et al., 2005; Lianget al., 2008; Ma et al., 2009a; Li et al., 2010; Wang et al.,2010; Wang, Yan, 2014; Kole et al., 2018). В табл. 1представлены гены, необходимые для развитияглаза и сетчатки, использованные в эксперимен-тах по генетическому прямому репрограммирова-нию клеток РПЭ и другие клетки позвоночных ичеловека в нейроны сетчатки. Для этого исследу-емые гены при помощи вирусных векторов до-ставляли в клетки позвоночных и человека in vivoи in vitro. Транскрипционные факторы, участвую-щие в определении клеточной судьбы РПЭ и сет-чатки – это гомеодомен-содержащие транскрип-ционные факторы, которые кодируются гоме-обоксными генами (англ. homeobox). Их можноусловно разделить на факторы первичной индук-ции – факторы глазного поля и факторы клеточ-ной специализации и дифференцировки, относя-щиеся в основном к семейству с базовым струк-турным мотивом спираль–петля–спираль (англ.basic helix-loop-helix, bHLH) (Zagozewski et al.,2014).

Роль транскрипционных факторов первичной ин-дукции сетчатки в прямом репрограммировании.Транскрипционные факторы первичной индукцииклеток сетчатки PAX6, CHX10, RAX, SIX3, SIX6,OTX2, CRX, которые относятся к региональнымфакторам транскрипции глазного поля, необходи-мы для определения судьбы клеток-предшествен-ников и для терминальной дифференцировки не-которых типов клеток сетчатки (Zagozewski et al.,2014). Влияние этих факторов на прямое репро-граммирование клеток нейрального происхожде-ния в нейроны сетчатки были изучены в ряде работна позвоночных животных (Mathers et al., 1997;Toy et al., 1998b; Loosli et al., 1999; Bernier et al.,2000a; Lagutin et al., 2001; Azuma et al., 2005; Yan et al.,2010; Kole et al., 2018). Так, в работе (Azuma et al.,2005) показано, что одного гена РAX6 достаточно,чтобы вызвать прямое репрограммирование кле-ток РПЭ куриного эмбриона (лат. Gallus domesti-cus) в нейроны сетчатки. Авторы при помощиплазмиды, несущей кДНК PAX6 человека, инду-цировали прямое репрограммирование клетокРПЭ птицы in ovo с образованием полноценнойэктопической сетчатки. Несмотря на это, другиеисследователи (Yan et al., 2010), считают РAX6“неэффективным” геном для прямого репро-граммирования клеток РПЭ в нейральные клетки

сетчатки, поскольку они в своих экспериментахтакового не наблюдали.

Дополнительная сетчатка или сетчаткоподоб-ные структуры также образуются при эктопиче-ской экспрессии других факторов транскрипцииглазного поля. Так, эктопическая экспрессияSIX3 или SIX6 (известный так же, как OPTX2) ин-дуцировала гиперплазию сетчатки и образованиеэктопической зрительно-везикулярной или сет-чаткоподобной структуры в мозге рыбы японскоймедаки (лат. Oryzias latipes), у шпорцевой лягушки(лат. Xenopus) и у эмбрионов мышей (лат. Muridae)(Loosli et al., 1999; Bernier et al., 2000a; Lagutinet al., 2001). Авторы указывают, что SIX3/SIX6 ин-дуцирует, но не полностью реализует более позд-ние стадии развития клеток сетчатки. Эктопиче-ская экспрессия SIX6 в эмбриональных или зре-лых клетках РПЭ курицы также конвертирует ихк нейрональной морфологии и экспрессии мар-керов, характерных для развивающихся нейроновсетчатки (Toy et al., 1998b). Эмбрионы шпорцевойлягушки, инъецированные синтетическим РНКRX, но не PAX6 и OTX2, развивают эктопическуюткань сетчатки и РПЭ (Mathers et al., 1997). Одна-ко получить полностью структурированную сетчат-ку путем прямого репрограммирования РПЭ гена-ми SIX3/SIX6 в этих экспериментах не удалось.

Одним из ключевых гомеобокс-содержащимфактором является OTX2, который регулируетначальную спецификацию фоторецепторов иРПЭ (Karali, Banfi, 2015). Так было показано, чтопри трансфекции OTX2 ретинальных стволовыхклеток (РСК) человека происходит их дифферен-цировка в фоторецепторы in vitro (Inoue et al.,2010). Однако, Кол с коллегами показали (Koleet al., 2018), что в клетках РПЭ, полученных изИПСК человека, эктопическая экспрессия OTX2усиливала активности промоторов генов, кото-рые подавляются при дедифференцировке клетокРПЭ in vitro, тем самым способствуя восстановле-нию и сохранению исходного фенотипа РПЭ, ине индуцирует процесс прямого репрограммиро-вания этих клеток в фоторецепторы сетчатки (см.рис. 1). Эти результаты, по мнению авторов, а также (Fisher, Ferrington, 2018), имеют определеннуюзначимость, поскольку поддержание клеток РПЭ упациентов с ретинопатиями, связанными с функ-ционально дефектным РПЭ (например, возрастнаямакулярная дистрофия), поможет восстановлениюфункций фоторецепторов, поскольку РПЭ и фото-рецепторы – это единая функциональная единица всетчатке (Fuhrmann, 2010; Fuhrmann et al., 2014).

Отрицательные результаты были полученыпри прямом репрограммировании других клетокглаза человека (пигментного эпителия радужки,клеток Мюллеровской глии и цилиарного тела) вфоторецепторы при вирусной трансфекции SIX3,PAX6, RX и CRX (Seko et al., 2012). Авторы показа-


РЕПРОГРАММИРОВАНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРОВАННОГО РЕТИНАЛЬНОГО 259Т

абли

ца 1

.Ге

ны ф

акто

ров

тран

скри

пции

, исп

ольз

уем

ые

при

прям

ом р

епро

грам

мир

ован

ии с

омат

ичес

ких

клет

ок п

озво

ночн

ых

в кл

етки

сет

чатк

и

Вид

Исх

одны

е кл

етки

Фак

торы

тр

анск

рипц

ииIn

vivo

/in

vitro

/in

situ

Хар

акте

рист

ики

клет

окI/

II р

оль

Ссы

лки

Тран

скри

пцио

нны

е фак

торы

пер

вичн

ой и

ндук

ции

клет

ок с

етча

тки

Шпо

рцев

ая л

ягуш

ка(л

ат. X

enop

us)

Нер

вная

пл

асти

нка

RX

In vi

voЭ

ктоп

ичес

кая

сетч

атка

и Р

ПЭ

I(M

athe

rs et

al.,

1997

)

Нер

вная

пл

асти

нка

SIX3

или

SIX

6In

vivo

Гипе

рпла

зия

сетч

атки

и у

мен

ьшен

ие Р

ПЭ

. Экт

опич

е-ск

ие зр

ител

ьно-

вези

куля

рны

е сет

чатк

опод

обны

е стр

ук-

туры

в с

редн

ем и

задн

ем го

ловн

ом м

озге

. Нар

ушае

т ра

звит

ие н

орм

альн

ого

глаз

а

I(B

erni

er et

al.,

200

0b)

Япо

нска

я м

едак

а(л

ат. O

ryzia

s lat

ipes

)Н

ервн

ая

плас

тинк

аSI

X3In

vivo

Гипе

рпла

зия

сетч

атки

. Экт

опич

ески

е зри

тель

но-в

ези-

куля

рны

е сет

чатк

опод

обны

е стр

укту

ры в

голо

вном

м

озге

. Ини

циир

ует,

но

не р

еали

зует

поз

дние

стад

ии р

аз-

вити

я се

тчат

ки

I(L

oosli

et a

l., 19

99)

Мы

шь

(лат

. Mus

mus

-cu

lus)

Кле

тки

моз

гаSI

X3 и

ли S

IX6

In vi

voЭ

ктоп

ичес

кие з

рите

льно

-вез

икул

ярны

е сет

чатк

опод

об-

ные с

трук

туры

I(L

agut

in et

al.,

200

1)

Кур

ица

(лат

. Gal

lus

dom

estic

us)

РПЭ

SIX6

In vi

voН

ейро

наль

ная

мор

фол

огия

и э

кспр

есси

я м

арке

ров

I(T

oy et

al.,

1998

a)

РПЭ

Pax6

In vi

voП

олно

ценн

ая э

ктоп

ичес

кая

сетч

атка

I(A

zum

a et

al.,

200

5)

РПЭ

Pax6

In vi

troН

естр

укту

риро

ванн

ая э

ктоп

ичес

кая

сетч

атка

I(Y

an et

al.,

201

0)

SIX

3

SIX6

CR

X

SIX9

OPT

X2

Чел

овек

(лат

. Hom

o sa

pien

s)

РПЭ

OTX

2In

vitro

/in

situ

Вос

стан

овле

ние

фен

отип

а РП

ЭII

(Kol

e et

al.,

201

8)

Рети

наль

ные

ство

ловы

е кл

етки

PAX6

In vi

troН

е вли

яют н

а пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

кле

ток

в ф

отор

ецеп

торы

сет

чатк

иII

(Ino

ue et

al.,

2010

)

CH

X10

CH

X10V

P16

SIX

3

CR

XIn

vitro

Сти

мул

ирую

т пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

кле

ток

в ф

отор

ецеп

торы

сет

чатк

иI

OTX

2

260



Чел

овек

(лат

. Hom

o sa

pien

s

Цил

иарн

ое те

лоSI

X3

In vi

troН

е вли

яют н

а пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

кле

ток

в ф

отор

ецеп

торы

сет

чатк

иII

(Sek

o et

al.,

201

2)

PAX6

CR

X

CR

X

RX

Кле

тки

Мю

ллер

овск

ой

глии

SIX3

In vi

troН

е вли

яют н

а пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

кле

ток

в ф

отор

ецеп

торы

сет

чатк

иII

(Sek

o et

al.,

201

2)

PAX6

CR

X

CR

X

RX

Раду

жка

SIX3

In vi

troН

е вли

яют н

а пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

кле

ток

в ф

отор

ецеп

торы

сет

чатк

иII

(Sek

o et

al.,

201

2)

PAX6

CR

X

CR

X

RX

Тран

скри

пцио

нны

е фак

торы

кле

точн

ой с

пеци

ализ

ации

и д

ифф

ерен

циро

вки

клет

ок с

етча

тки

Кур

ица

(лат

. Gal

lus d

omes

ticus

)РП

Э

NE

UR

OD

In vi

vo/i

n vi

tro/i

n sit

u

Мор

фол

огич

ески

, мол

екул

ярно

и ф

ункц

иона

льно

пол

-но

ценн

ые ф

отор

ецеп

торн

ые,

кле

тки

ганг

лиоз

ного

сло

я и

амак

рино

вые к

летк

и се

тчат

киI

(Yan

, Wan

g, 19

98;

Lian

g et

al.,

2006

, 20

08)

NG

N1

In vi

vo/i

n vi

tro/i

n sit

u

Мор

фол

огич

ески

, мол

екул

ярно

и ф

ункц

иона

льно

пол

-но

ценн

ые ф

отор

ецеп

торн

ые к

летк

и, и

дру

гие н

ейро

ны

сетч

атки

I

(Lia

ng et

al.,

200

6;Li

et a

l., 2

010;

Yan

et a

l., 2

010;

Wan

g, Y

an, 2

014)

NG

N2

In vi

vo/i

n vi

tro/i

n sit

u

Мор

фол

огич

ески

, мол

екул

ярно

и ф

ункц

иона

льно

пол

-но

ценн

ые ф

отор

ецеп

торн

ые,

кле

тки

ганг

лиоз

ного

сло

я и

амак

рино

вые к

летк

и се

тчат

киI

(Yan

et a

l., 2

001;

Li

ang

et al

., 20

06)

NG

N3

In vi

vo/i

n vi

tro/

in si

tu

Мор

фол

огич

ески

, мол

екул

ярно

и ф

ункц

иона

льно

пол

-но

ценн

ые ф

отор

ецеп

торн

ые,

кле

тки

ганг

лиоз

ного

сло

я и

амак

рино

вые к

летк

и се

тчат

киI

(Lia

ng et

al.,

200

6;

Ma e

t al.,

200

9b;

Li et

al.,

201

0;Ya

n et

al.,

201

0;

Wan

g, Y

an, 2

014)

Вид

Исх

одны

е кл

етки

Фак

торы

тр

анск

рипц

ииIn

vivo

/in

vitro

/in

situ

Хар

акте

рист

ики

клет

окI/

II р

оль

Ссы

лки

Таб

лица

1.

Про

долж

ение



Кур

ица

(лат

. Gal

lus d

omes

ticus

)РП

Э

SOX2

In vi

vo/i

n vi

troМ

орф

олог

ичес

ки, м

олек

уляр

но и

фун

кцио

наль

но п

ол-

ноце

нны

е кле

тки

ганг

лиоз

ного

сло

я и

амак

рино

вые

клет

ки с

етча

тки

I(M

a et

al.,

200

9a)

NSC

L1In

vitro

Еди

ничн

ые м

арке

ры к

лето

к га

нгли

озно

го с

лоя

сетч

атки

II(M

a et

al.,

200

4)

NSC

L2In

vivo

Дег

рада

ция

клет

ок М

юлл

еров

ской

глии

сет

чатк

иII

(Ma

et a

l., 2

009a

)

ASH

1In

vivo

/in

vitro

Мол

екул

ярны

е и м

орф

олог

ичес

кие м

арке

ры к

лето

к га

нгли

озно

го с

лоя

сетч

атки

, ам

акри

новы

х и

гори

зон-

таль

ных

клет

ок с

етча

тки

I(M

ao et

al.,

200

8;Li

et a

l., 2

010)

ATH

3In

vivo

/in

vitro

Не с

посо

бств

ует г

енез

у би

поля

рны

х кл

еток

сет

чатк

иII

(Yan

et a

l., 2

010)

ATH

5In

vitro

Мар

керы

кле

ток

ганг

лиоз

ного

сло

я се

тчат

киI

(Ma

et al

., 20

04)

Мы

шь

(лат

. Mus

mus

culu

s)

РПЭ

NG

N1

In vi

vo/i

n vi

troIn

vitro

30%

кле

ток

несу

т мар

керы

ней

раль

ных

клет

ок

сетч

атки

, 20%

дем

онст

риру

ют с

мор

фол

огие

й ф

отор

е-це

птор

ных

клет

ок. Э

ктоп

ичес

кая

сетч

атка

I(Y

an et

al.,

201

3a)

NG

N3

In vi

tro/i

n sit

uЭ

ктоп

ичес

кая

сетч

атка

I(Y

an et

al.,

201

3a,

2013

b; W

ang,

Yan

, 20

14)

Аст

рогл

ия

моз

жеч

каAS

H1

In vi

troМ

орф

олог

ия и

мар

керы

ней

роно

в. С

инап

тиче

ское

со

зрев

ание

. Фун

кцио

наль

ная

элек

троф

изио

логи

яI

(Cho

ucha

ne et

al.,

20

17)

NG

N2

Кле

тки

Мю

л-ле

ровс

кой

глии

ASC

L1

In vi

vo/i

n vi

tro/

in si

tu

Мор

фол

огия

и м

олек

уляр

ные м

арке

ры ф

отор

ецеп

тор-

ных,

ам

акри

новы

х кл

етки

с д

омин

иров

ание

м м

арке

ров

бипо

лярн

ых

клет

ок. О

твет

ы н

а раз

личн

ые т

ранс

ми-

теры

. Инт

егра

ция

в се

тчат

ку

I

(Pol

lak

et a

l., 2

013;

U

eki e

t al.,

201

5;Jo

rsta

d et

al.,

201

7;

Gui

mar

ães e

t al.,

201

8)

NG

N2

In vi

troМ

олек

уляр

ные,

мор

фол

огич

ески

е и ф

изио

логи

ческ

ие

мар

керы

фот

орец

епто

рны

х, а

мак

рино

вых

и кл

еток

ган-

глио

зног

о сл

оя с

етча

тки

I(G

uim

arãe

s et a

l.,

2018

)

Кол

бочк

иN

RL

In vi

voП

реоб

разо

вани

е кол

боче

к в

пало

чки

I(M

onta

na et

al.,

201

3)

Сви

нья

(лат

. Sus

scro

fa

dom

estic

us)

РПЭ

NE

UR

OD

In vi

troМ

орф

олог

ичес

кие и

мол

екул

ярны

е мар

керы

фот

оре-

цепт

орны

х кл

еток

I(Y

an et

al.,

201

3a)

Вид

Исх

одны

е кл

етки

Фак

торы

тр

анск

рипц

ииIn

vivo

/in

vitro

/in

situ

Хар

акте

рист

ики

клет

окI/

II р

оль

Ссы

лки

Таб

лица

1.

Про

долж

ение

262



Чел

овек

(л

ат. H

omo

sapi

ens)

РПЭ

SOX2

In vi

troП

овы

шен

ие э

кспр

есси

и не

йрал

ьны

х и

глиа

льны

х м

ар-

керо

в. О

тсут

стви

е ГА

МК

-ерг

ичес

ких

нейр

онов

. Н

ет с

инап

тиче

ских

мех

аниз

мов

I(H

u et

al.,

201

4;

Eza

ti et

al.,

201

8)

hTE

RT-

RPE

1N

EU

RO

DIn

vitro

30%

кле

ток

с м

олек

уляр

ным

и и

мор

фол

огич

ески

ми

мар

кера

ми

фот

орец

епто

рны

х кл

еток

сет

чатк

иI

(Yan

et a

l., 2

013a

)N

GN

150

% к

лето

к с

мол

екул

ярны

ми

и м

орф

олог

ичес

ким

и м

арке

рам

и ф

отор

ецеп

торн

ых

клет

ок с

етча

тки

I

AR

PE19

NG

N1

In vi

tro10

% к

лето

к с

мол

екул

ярны

ми

и м

орф

олог

ичес

ким

и м

арке

рам

и ф

отор

ецеп

торн

ых

клет

ок с

етча

тки

I(Y

an et

al.,

201

3a)

Рети

наль

ные

ство

ловы

е кл

етки

CH

X10V

P16

In vi

troИ

ндуц

ирую

т пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

фот

орец

еп-

торн

ых

клет

ок с

етча

тки

I(I

noue

et a

l., 2

010)

OTX

2

CR

X

Цил

иарн

ое те

лоN

EU

RO

DIn

vitro

Не и

ндуц

ирую

т пря

мое

реп

рогр

амм

иров

ание

в ф

отор

е-це

птор

ные к

летк

и се

тчат

киII

(Sek

o et

al.,

201

2)N

RL

Кле

тки

Мю

л-ле

ровс

кой

глии

NE

UR

OD

In vi

troН

е инд

уцир

уют п

рям

ое р

епро

грам

мир

ован

ие в

фот

оре-

цепт

орны

е кле

тки

сетч

атки

II(S

eko

et a

l., 2

012)

NR

L

Раду

жка

NE

UR

OD

In vi

troН

е инд

уцир

уют п

рям

ое р

епро

грам

мир

ован

ие в

фот

оре-

цепт

орны

е кле

тки

сетч

атки

II(S

eko

et a

l., 2

012)

NR

L

Ком

бина

ции

разл

ичны

х ге

нов

тра

нскр

ипци

онны

х ф

акт

оров

и д

руги

х ф

акт

оров

I Фак

тор

Ссы

лки

Кур

ица

(лат

. Gal

lus d

omes

ticus

)

РПЭ

ATH

5bF

GF

In vi

troМ

олек

уляр

ные,

мор

фол

огич

ески

е и ф

изио

логи

ческ

ие

мар

керы

кле

ток

ганг

лиоз

ных

клет

ок с

етча

тки

ATH

5(M

a et

al.,

200

4)

РПЭ

ASH

1, A

TH3,

C

HX1

0In

vitro

Мол

екул

ярны

е, м

орф

олог

ичес

ки и

физ

иоло

гиче

ские

м

арке

ры б

ипол

ярны

х кл

еток

сет

чатк

иAS

CL1

(Yan

et a

l., 2

010)

Мы

шь

(лат

. Mus

mus

culu

s)К

летк

и М

юл-

леро

вско

й гл

ии

ASC

L1,

TSA

,Тр

авм

аIn

vivo

Мол

екул

ярны

е, м

орф

олог

ичес

кие и

физ

иоло

гиче

ские

м

арке

ры б

ипол

ярны

х и

клет

ок га

нгли

озно

го с

лоя

сет-

чатк

и, с

фун

кцио

наль

ной

инте

грац

ией

в се

тчат

куAS

CL1

(Jor

stad

et al

., 20

17)

NG

N2

FGF2

EG

FIn

vivo

Мол

екул

ярны

е, м

орф

олог

ичес

кие и

физ

иоло

гиче

ские

м

арке

ры ф

отор

ецеп

торн

ых,

ам

акри

новы

х и

клет

ок га

н-гл

иозн

ого

слоя

сет

чатк

иN

GN

2(G

uim

arãe

s et a

l.,

2018

)

Вид

Исх

одны

е кл

етки

Фак

торы

тр

анск

рипц

ииIn

vivo

/in

vitro

/in

situ

Хар

акте

рист

ики

клет

окI/

II р

оль

Ссы

лки

Таб

лица

1.

Про

долж

ение



I – т

ранс

крип

цион

ный

пион

ер-ф

акто

р, II

– к

анон

ичес

кий

тран

скри

пцио

нны

й ф

акто

р.

Мы

шь

(лат

. Mus

mus

culu

s)

ИП

СК

MAT

H5

DA

PT

DK

K1

NO

GG

IN

In vi

tro/i

n sit

uМ

олек

уляр

ные,

мор

фол

огич

ески

е и ф

изио

логи

ческ

ие

мар

керы

кле

ток

ганг

лиоз

ного

сло

я се

тчат

ки. П

ри

тран

спла

нтац

ии в

глаз

инд

уцир

ован

ные к

летк

и вы

жи-

вали

, но

не п

риж

ивал

ись

MAT

H5

(Che

n et

al.,

2010

)

Чел

овек

(лат

. Hom

o sa

pien

s)

Рети

наль

ные

ство

ловы

е кл

етки

CH

X10V

P16,

O

TX2

и C

RX

In vi

tro/i

n sit

uФ

ункц

иона

льны

е фот

орец

епто

рны

е кле

тки

сетч

атки

, сп

особ

ные и

нтег

риро

вать

в тк

ань

реци

пиен

та и

уст

а-на

влив

ать

сина

псы

с б

ипол

ярны

ми

клет

кам

и

OTX

2и

CR

X(I

noue

et al

., 20

10)

Цил

иарн

ое те

лоSI

X3, P

AX6,

C

RX

и R

XIn

vitro

Фот

орец

епто

рны

е кле

тки

без н

аруж

ных

сегм

енто

в и

мех

аниз

мов

тран

сдук

ции

CR

X, R

X(S

eko

et a

l., 2

012)

Кле

тки

Мю

л-ле

ровс

кой

глии

SIX3

, PAX

6,

CR

X и

RX

In vi

troФ

отор

ецеп

торн

ые к

летк

и бе

з нар

ужны

х се

гмен

тов

и м

ехан

изм

ов тр

ансд

укци

иC

RX,

RX

(Sek

o et

al.,

201

2)

Раду

жка

SIX3

, PAX

6,

CR

X и

RX

In vi

troФ

отор

ецеп

торн

ые к

летк

и бе

з нар

ужны

х се

гмен

тов

и м

ехан

изм

ов тр

ансд

укци

иC

RX,

RX

(Sek

o et

al.,

201

2)C

RX,

RX

и N

EU

RO

D1

In vi

troМ

орф

олог

ичес

кие и

мол

екул

ярны

е мар

керы

ней

ро-

наль

ных

клет

ок. Ф

ункц

иона

льна

я эл

ектр

офиз

иоло

гия

CR

X, R

X

Фиб

робл

асты

ASC

L1,

BR

N2

(PO

U3F

2),

MYT

1LIn

vitro

Инд

уцир

ован

ные ф

ункц

иона

льны

е не

йрон

ыAS

CL1

(Vie

rbuc

hen

et a

l.,

2010

)

NE

UR

OD

, AS

CL

1 и

MYT

1Lm

iR-9

/9,

miR

-124

In vi

troН

ейра

льны

е кле

тки

с ос

новн

ым

и ф

ункц

иона

льны

ми

свой

ства

ми

нейр

онов

, вкл

юча

я об

разо

вани

е син

апсо

вAS

CL1

(Yoo

et a

l., 2

011)

CR

X, R

AX,

NE

UR

OD

1и

OTX

2In

vitro

Мол

екул

ярны

е, м

орф

олог

ичес

кие и

физ

иоло

гиче

ские

м

арке

ры ф

отор

ецеп

торн

ых

клет

окC

RX,

RX

(Sek

o et

al.,

201

4)

ИП

СК

ATO

H7

(MAT

H5)

DA

PT

DK

K1

LEFT

Y A

, N

OG

GIN

In vi

troМ

олек

уляр

ные,

мор

фол

огич

ески

е и ф

изио

логи

ческ

ие

мар

керы

кле

ток

ганг

лиоз

ного

сло

я се

тчат

киAT

OH

7 (M

ATH

5)(D

eng e

t al.,

201

6)

Вид

Исх

одны

е кл

етки

Фак

торы

тр

анск

рипц

ииIn

vivo

/in

vitro

/in

situ

Хар

акте

рист

ики

клет

окI/

II р

оль

Ссы

лки

Таб

лица

1.

Око

нчан

ие

264



ли, что ни один ген из этого ряда в одиночку приего экзогенной экспрессии не индуцирует обра-зование фоторецепторных фенотипов в исследуе-мых клетках in vitro (Seko et al., 2012). Однако,трансфекция OTX2 и CRX в одиночку вызывалапрямое репрограммирование РСК человека в фо-торецепторы in vitro (Inoue et al., 2010) Такую раз-ницу в эффективности прямого репрограммирова-ния можно объяснить тем, что более специализиро-ванные клетки (пигментный эпителий радужки,клетки Мюллеровской глии и цилиарного тела) го-раздо устойчивы к прямому репрограммированию,чем менее специализированные РСК (Pasque et al.,2011).

Интересно, что основные тканеспецифиче-ские гомеобоксные гены, находящиеся на верши-не генной регуляторной сети развития глазаи/или нейральной сетчатки, показали незначи-тельную активность в прямом репрограммирова-нии РПЭ позвоночных в нейроны сетчатки (Yanet al., 2010). Под влиянием этих факторов не проис-ходило формирования структурированной полно-ценной сетчатки. Ян с коллегами (Yan et al., 2010)отнесли эти транскрипционные факторы к “неэф-фективным” факторам прямого репрограммирова-

ния клеток РПЭ в нейроны сетчатки. Эту “неэф-фективность” генов глазного поля в прямом репро-граммировании клеток глаза, вероятно, можнообъяснить общим происхождением РПЭ и сетчаткииз клеток-предшественников с одинаковым пат-терном экспрессии генов глазного поля. Инициа-ция процесса их разделения происходит под эпиге-нетическим влиянием сигнальных молекул, синте-зируемых тканями окружающими глазной пузырь,покровной эктодермой и мезенхимой, что приво-дит к включению узкоспециализированных генов,например, относящихся к семейству bHLH в клет-ках-предшественниках нейральной сетчатки иMITF, TYR, TRP1, RPE65, CRBP, CRALBP, PITX2 вРПЭ (Fuhrmann, 2010; Fuhrmann et al., 2014; Zag-ozewski et al., 2014).

Таким образом, анализ литературы по прямо-му репрограммированию клеток РПЭ амфибий,птиц и млекопитающих в нейроны сетчатки с ис-пользованием эктопической экспрессии геновглазного поля показал инициацию процесса кле-точной конверсии, что указывает на их роль в ка-честве пионерских факторов. Поскольку у чело-века факторы глазного поля не индуцируют пря-мое репрограммирование клеток РПЭ в нейроны

Рис. 1. Схематическое изображение генетического прямого репрограммирования клеток РПЭ человека, полученныхиз различных источников, в клетки сетчатки и РПЭ. РПЭ – ретинальный пигментный эпителий; ЭСК – эмбриональ-ные стволовые клетки; ИПСК – индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.

Клеточные линии РПЭ(ARPE-19, hTERT RPE-1)

ЭСК человека

ИПСК человека

Глаз человека

КлеткиРПЭ 3–5 пассаж Нейроны сетчатки

ПроРПЭ

ПроРПЭ

Фоторецепторы

Нейроны сетчатки

Клетки РПЭ

OTX2

SOX2

SOX2

NEUROD1; NGN1

Kole et al., 2018

Hu et al., 2014

Yan et al., 2013

Ezati et al., 2018



сетчатки, можно предположить, что они либо нетребуются в качестве первооткрывателей в этомпроцессе, либо они относятся к пассивным пер-вичным факторам, которые ремоделируют хро-матин, делая его доступным для других тран-скрипционных факторов, но сами не влияют натранскрипцию генов (Kuzmich et al., 2015). Крометого, учитывая тот факт, что некоторые геныглазного поля экспрессируются в постнатальныхклетках РПЭ человека, например PAX6, OTX2, RX,LHX2 (Milyushina et al., 2012; Salero et al., 2012), эк-зогенная экспрессия этих генов в прямом репро-граммировании, возможно, не требуется, и по-этому ожидаемого результата прямого репро-граммирования под действием этих генов ненаблюдается (Masserdotti et al., 2016).

Роль факторов клеточной специализации и диф-ференцировки клеток сетчатки в прямом репрограм-мировании. Факторы клеточной специализации идифференцировки, это гомеодомен-содержащиетранскрипционные факторы, относящиеся к се-мейству bHLH, и к семейству Forkhead box (FOX)которые работают совместно, определяя судьбуклеток сетчатки (Zagozewski et al., 2014).

Влияние генов семейства bHLH на способ-ность клеток РПЭ позвоночных к прямому ре-программированию в нейроны сетчатки изученово многих работах (Yan, Wang, 1998; Yan et al.,2001, 2010, 2013a, 2013b, 2015; Liang et al., 2008; Maet al., 2009a; Li et al., 2010; Wang et al., 2010; Wang,Yan, 2014). Результаты этих исследований пока-зывают, что транскрипционные факторы семей-ства bHLH: NEUROD, NGN1, NGN2 и NGN3,могут эффективно напрямую репрограммироватьдифференцированные клетки РПЭ куриного эм-бриона в диссоциированных культурах и экс-плантатах в клетки с молекулярными, морфоло-гическими и физиологическими свойствами мо-лодых фоторецепторных клеток с небольшимифракциями других типов нейронов сетчатки (Yan,Wang, 1998; Yan et al., 2001, 2009, 2010; Liang et al.,2008; Li et al., 2010; Wang et al., 2010; Wang, Yan,2014). При трансплантации в глаза развивающих-ся цыплят конвертированные in vitro клетки РПЭпродолжают развиваться в фоторецепторном на-правлении. Некоторые из трансплантированныхклеток интегрируют в наружный ядерный слойсетчатки и встраиваются в функциональную сетьнейронов хозяина (Liang et al., 2006). В дополне-ние к этому показано, что клетки РПЭ курицымогут быть напрямую репрограммированы in situ(Li et al., 2010). В глазах куриных эмбрионов клет-ки РПЭ, измененные при помощи NGN1, NGN2 иNGN3, демонстрировали молекулярные и морфо-логические маркеры фоторецепторных, гангли-озных и амакриновых клеток (Yan et al., 2001,2010). У трансгенных мышей, экспрессирующихNGN1 или NGN3 описано возникновение эктопи-ческой сетчаткоподобной ткани, которая распо-

лагалась в сосудистой оболочке, около цилиарно-го тела, в зрительном нерве, а также в субрети-нальном пространстве (Yan et al., 2009; Wang, Yan,2014). Интересно, что клетки дополнительного эк-топического наружного ядерного слоя имели мо-лекулярные и морфологические признаки фоторе-цепторов, подобно нормальным клеткам сетчатки,но их пространственная ориентация относительнослоя РПЭ была нарушена. Клетки эктопическойсетчатки, расположенные во внутреннем ядерномслое, экспрессировали маркеры амакриновых ибиполярных клеток, тогда как, находящиеся вслое ганглиозных клеток – маркер ганглиозныхклеток (Yan et al., 2013b). Подобное прямое репро-граммирование происходит в клетках РПЭ пер-вичных культур ювенильных свиней, мышей и вклетках иммортализованных линий РПЭ челове-ка (Yan et al., 2013a). Так с помощью вирусных кон-струкций, несущих гены NEUROD и NGN1, показа-но, что при эктопической экспрессии NEUROD вклеточной линии hTERT RPE-11 около 30% кон-вертированных клеток РПЭ демонстрируют мо-лекулярные и морфологические маркеры моло-дых фоторецепторных клеток и количество ихувеличивается до 50% при эктопической экспрес-сии NGN1 (Yan et al., 2013a). В то же время, в кле-точной линии ARPE-192 количество клеток, под-вергшихся изменению в фоторецепторы, дости-гало лишь 10% (Yan et al., 2013a). Эту разницу вэффективности прямого репрограммированияклеточных линий РПЭ человека можно объяс-нить эпигенетической памятью, которая сохра-нилась от донорских клеток (Kim, Costello, 2017).Так линия ARPE-19 представлена наиболее эпи-генитическими дифференцированными клетка-ми (Dunn et al., 1996; Kim, Costello, 2017). Тем неменее, полученные результаты (Yan et al., 2013a)демонстрируют, что клетки РПЭ человека спо-собны к прямому репрограммированию под вли-янием эктопической экспрессии генов NEUROD1и NGN1. Однако при прямом репрограммирова-нии клеток других тканей глаза человека (радуж-ки, клеток Мюллеровской глии, цилиарного те-ла) под влиянием эктопической экспрессииNEUROD1, NGN2 образование фоторецепторныхклеток не наблюдалось (Seko et al., 2012). Можнопредположить, что для клеток РПЭ человекатранскрипционные факторы NEUROD1 и NGN1могут выступать как мастер-гены или пионер-факторы. Возможно, это указывает на эпигенети-

1 Клеточная линия hTERT RPE-1 получена путем трансфек-ции клеточной линии RPE-340 плазмидой, экспрессирую-щей каталитическую субъединицу теломеразы человека(Rambhatla et al., 2002). Клеточная линия RPE-340 получе-на от девочки 1-ого года жизни, умершей от травм (Matsu-naga et al., 1999).

2 ARPE-19 получена Aotaki-Keen в 1986 г от 19-летнего мужчи-ны, умершего от травмы головы после ДТП (Dunn et al.,1996).

266



ческую доступность ДНК клеток РПЭ для этихфакторов, которая возникла в ходе развития и со-храняется во взрослом состоянии под влияниемэндогенной экспрессии генов глазного поля, вы-ступающих как пассивные пионерские факторы.

Другой высокопластичный тип клеток сетчатки –глиальные клетки Мюллера – также обладает внут-ренней способностью к прямому репрограммиро-ванию. В исследовании (Guimarães et al., 2018) по-казано, что клетки ганглиозного слоя сетчатки умышей можно получить из постнатальных клетокМюллеровской глии посредством сверхэкспрес-сии NGN2. Эктопическая экспрессия NGN2 спо-собствовала продукции пула нейронов с экспрес-сией генов фоторецепторов, амакриновых клетоки клеток ганглиозного слоя. Авторы также пока-зали, что присутствие митогенных факторов, такихкак EGF или bFGF, стимулирующих пролифера-цию клеток Мюллеровской глии мыши, повышалоэффективность прямого репрограммирования(Guimarães et al., 2018). Пролиферация – это один изпассивных способов снятия метилирование ДНК,эпигенетической памяти, в результате котороговозрастает эффективность прямого репрограмми-рования (Masserdotti et al., 2016; Kim, Costello, 2017).

В работах (Pollak et al., 2013; Ueki et al., 2015)показано, что вирусная экспрессия ASCL1, друго-го представителя семейства транскрипционныхфакторов bHLH, достаточна для активации ней-рогенной программы в клетках Мюллеровскойглии млекопитающих (мышей), как в диссоции-рованных культурах in vitro, так и в интактной сет-чатке in vivo. Эктопическая экспрессия тран-скрипционного фактора ASCL1 стимулирует про-цесс прямого репрограммирования потомковклеток Мюллеровской глии в фоторецепторы,амакриновые и биполярные клетки после повре-ждения in vivo (Ueki et al., 2015). Это согласуется сролью ASCL1 в нормальном развитии, где извест-но, что ASCL1 экспрессируется в поздних предше-ственниках, которые дают амакриновые, биполяр-ные клетки и фоторецепторы, но не ганглиозныеклетки, а делеция ASCL1 у мышей приводит к сни-жению числа биполярных клеток и фоторецепто-ров (Brzezinski et al., 2011).

Другой представитель семейства транскрип-ционных факторов bHLH ASH1 (MASH1) необ-ходим в развитии для производства поздних ней-ронов, в том числе палочек фоторецепторов и би-полярных клеток у мышей (Tomita et al., 1996).Трансгенная экспрессия ASH1 инициирует ней-рогенез сетчатки в слое РПЭ у мышей in vivo (Lan-ning et al., 2005). У курицы временная и простран-ственная экспрессия ASH1 совпадает с генезомамакриновых клеток (Jasoni et al., 1994), а сверх-экспрессия ASH1 увеличивает популяцию этихклеток (Mao et al., 2009). В работе (Mao et al.,2008) на молекулярном, морфологическом и фи-

зиологическом уровнях показано, что ASH1 мо-жет напрямую репрограммировать клетки РПЭ всторону нейронов сетчатки in vitro, а в работе (Liet al., 2010) – in vivo. Однако отмечено, что в РПЭкуриных эмбрионов, инфицированных RCAS-ASH1, не происходит прямое репрограммирова-ние клеток в фоторецепторы (Li et al., 2010). Кро-ме того, эти же исследователи считают, что сов-местная эктопическая экспрессия ASH1, ATH3 иCHX10 способствует более эффективному генезубиполярных клеток (Yan et al., 2010), где за узкуюклеточную специализированность отвечает ASH1.

Однако не все гены bHLH семейства, экспрес-сирующиеся в развивающейся сетчатке, и гомо-логичные пронейральным генам дрозофилы,способны инициировать прямое репрограммиро-вание РПЭ в нейроны сетчатки. К таким “неэф-фективным” генам относят NSCL1 и NSCL2(Wang, Yan, 2012).

Дегенерация клеток ганглиозного слоя сетчат-ки является основным признаком глаукомы, по-ражающей людей пожилого возраста, поэтомувосстановление ганглиозных клеток находится вряду важнейших задач, как и восстановление фо-торецепторов (Guimarães et al., 2018). В работе(Ma et al., 2009a) показано участие транскрипци-онного фактора SOX2, относящегося к семействуSox, в индукции экспрессии маркеров ганглиоз-ных и амакриновых нейронов в клетках РПЭ кури-ных эмбрионов in vivo и in vitro и в ингибированииэкспрессии РПЭ-специфических генов. Применивподход (Ma et al., 2009a), использованный на ку-рицах, другие исследователи (Hu et al., 2014) по-пытались репрограммировать клетки РПЭ, полу-ченные из ЭСК человека (см. рис. 1). В результатеони обнаружили повышенную экспрессию ге-нов-маркеров нейрональных и глиальных клетоксетчатки и снижение экспрессии РПЭ-специфи-ческих генов. Однако в отличие от работы (Maet al., 2009a) исследователи (Hu et al., 2014) в РПЭчеловека не обнаружили экспрессию таких мар-керов ганглиозных клеток, как Islet 1/2 и проте-инкиназу C, а также экспрессию vGAT, что ука-зывало на отсутствие ГАМК-ергических нейро-нов. Кроме того, конвертированные клетки РПЭчеловека не усваивали FM1-43С при стимуляциикалием, что, по мнению (Hu et al., 2014), говоритоб отсутствии механизма синаптической переда-чи. Эффект сверхэкспрессии SOX2 в клетках РПЭнеонатального и взрослого человека in vitro такжебыл оценен и в других исследованиях (Ezati et al.,2018) (см. рис. 1). Результаты показали, что SOX2индуцирует прямое репрограммирование клетокРПЭ человека in vitro, при этом наблюдается уве-личение экспрессии PAX6, CHX10, THY1 и появ-ление родопсин-позитивных клеток, что указы-вает на генерацию нейрональных терминальнодифференцированных клеток сетчатки (Ezatiet al., 2018). SOX2 является пионер-фактором при



прямом репрограммировании в ганглиозныеклетки сетчатки для клеток РПЭ как курицы, таки человека. Но у человека происходит частичнаяклеточная конверсия, без образования функцио-нальных ганглиозных клеток.

Таким образом, анализ показал, что тран-скрипционные факторы клеточной специализа-ции и дифференцировки клеток сетчатки, отно-сящиеся к семейству bHLH и SOX, индуцируютпроцесс прямого репрограммирования клетокРПЭ позвоночных и человека в нейроны сетчат-ки. При этом тип клеток, индуцируемый пря-мым репрограммированием, зависит от исполь-зуемого гена и от его предполагаемой роли в раз-витии сетчатки. Так специфичными генами дляполучения фоторецептороподобных клеток припрямом репрограммировании клеток РПЭ явля-ются NEUROD1, NGN1 и NGN3 (Yan et al., 2013b;Wang, Yan, 2014), для получения биполярных кле-ток – ASH1 (Li et al., 2010), а для получения ган-глиозных клеток – SOX2 (Hu et al., 2014; Ezatiet al., 2018). Кроме того, исследования по прямо-му репрограммированию различных типов кле-ток показали, что индуцируемый тип клеток за-висит от исходного источника клеток. Так, на-пример, ASCL1 или NGN2 могут конвертироватьклетки астроглии мозжечка и неокортекса в ней-роны головного мозга (Chouchane et al., 2017), аклетки Мюллеровской глии – в нейроны сетчат-ки (Pollak et al., 2013). Эти данные свидетельствуюто важной роли типовой и региональной специфи-кации репрограммируемой клетки в определенииидентичности индуцированных нейронов (Mas-serdotti et al., 2016). Кроме того, очевидно, что эф-фективность прямого репрограммирования силь-но зависит от принадлежности клеток тому илииному виду позвоночных. Так, клетки РПЭ цып-лят под влиянием сверхэкспрессии генов преоб-разуются в морфологически, молекулярно и фи-зиологически полноценные специфическиеклетки сетчатки, тогда как у человека подобноеизменение происходит лишь частично. Если дляпрямого репрограммирования клеток РПЭ кури-цы достаточно одного генетического фактора, тодля РПЭ человека использование единичногофактора может быть малоэффективно. Тем не ме-нее, факторы семейства bHLH и SOX способныиндуцировать прямое репрограммирование кле-ток РПЭ человека в нейроны сетчатки, что позво-ляет их использовать, как пионерские факторыпри прямом репрограммировании в отличие оттранскрипционных факторов глазного поля.

Роль комбинации различных транскрипционныхфакторов в прямом репрограммировании. Накоплен-ные данные свидетельствуют о том, что не один, аконкретная комбинация нескольких транскрипци-онных факторов, может быть наиболее эффектив-ным инструментом для прямого репрограммирова-ния клеток РПЭ взрослого человека. Сочетание

транскрипционных факторов глазного поля и фак-торов клеточной специализации из семействаbHLH, стимулирует прямое репрограммированиеразличных клеток глаза человека в нейроны сет-чатки (Inoue et al., 2010; Seko et al., 2012). В 2012 го-ду Секо с коллегами (Seko et al., 2012) конвертиро-вали при помощи вирусной трансфекции генов,отвечающих за формирование и функционирова-ние различных фоторецепторов сетчатки: SIX3,PAX6, CRX, RX, NRL и NEUROD1 клетки пигмент-ного эпителия радужки, Мюллеровской глии ицилиарного тела человека в фоторецепторы, атакже фибробласты в фоторецепторы (Seko et al.,2014). Как уже было сказано выше, экзогеннаяэкспрессия одного гена из этого ряда в одиночкуне индуцирует образование фоторецепторных фе-нотипов в исследуемых клетках in vitro (Seko et al.,2012), при этом в различных комбинациях, на-пример, CRX, RX, и NEUROD, которая является“эффективной”, экзогенная экспрессия геновпревращает клетки радужки человека в фоторе-цепторы (Seko et al., 2012). Далее, при получениифоторецепторов из РСК человека in vitro (Inoueet al., 2010) использовали комбинированную транс-фекцию генов OTX2 и CRX. Повышенную эффек-тивность прямого репрограммирования РСК посравнению с другими клетками глаза можно объ-яснить, по аналогии с нейральными стволовымиклетками, не только эпигенетическими особен-ностями, но и их постепенной дифференциров-кой, с чередованием пролиферации и промежу-точных состояний дифференцировки, котораяпозволяет им медленно приобретать наиболееподходящий метаболизм, необходимый для при-обретения и преобразования клеточной судьбы.(Masserdotti et al., 2016).

Перспективы генетического прямого репрограм-мирования. Несмотря на ярко выраженные успехив прямом репрограммировании клеток глаза чело-века, оно зачастую проходит не полноценно и, хо-тя клетки приобретают многие характеристикинейральных клеток сетчатки они оказываются ма-лофункциональными (Seko et al., 2012; Yan et al.,2013a; Hu et al., 2014). В отличие от эмбрионов ку-рицы и мышей у человека клетки РПЭ несут та-кие разноуровневые блокировки, что даже экто-пическая экспрессия специфических генов не спо-собна полноценно их конвертировать. Дело можетбыть в том, что терминально дифференцирован-ные соматические клетки богаты эпигенетически-ми регуляторными механизмами, которые фикси-руют специфические паттерны экспрессии генов.Существуют работы, показывающие сохранение врепрограммируемых клетках эпигенетической па-мяти о прежнем состоянии. Так, исследователи(Hu et al., 2010) репрограммировали РПЭ плода че-ловека до состояния ИПСК с помощью лентиви-русной экспрессии OCT4, SOX2, LIN28 и NANOG.Полученные линии ИПСК демонстрировали

268



морфологию сходную с человеческими ЭСК, ониэкспрессировали маркеры стволовых клеток, иобразованные из них тератомы содержали произ-водные всех трех зародышевых листков. Однако не-которые из этих линий демонстрировали явноепредпочтение к редифференцировке в РПЭ. Однимиз способов сохранения эпигенетической памяти вклетках является метилирование ДНК, котороеспособно сохраняться в течение многочисленныхклеточных циклов (Kim, Costello, 2017).

В заключение по генетическому прямому ре-программированию можно с полной уверенно-стью сказать, что для клеток РПЭ человека ис-пользование данного метода малоэффективно,необходимо продолжить поиск других репро-граммирующих факторов и условий. Кроме того,сам метод генетической трансфекции транскрип-ционных факторов имеет низкий процент эффек-тивности репрограммирования (0.01–6%). Но этуэффективность можно повысить при помощи ма-лых молекул, некодирующих РНК, факторов ростаи других соединений, которые непосредственновлияют на молекулярные каскады, вовлеченных вклеточное репрограммирование, сигнальные пути,генетическую трансфекцию, на клеточный метабо-лизм, на пролиферацию и клеточную гибель. По-казано, что защита клеток от окислительногостресса и гибели, снижение пролиферации значи-тельно улучшает эффективность клеточного пря-мого репрограммирования в нейроны (Masserdottiet al., 2016). Метод последовательного увеличенияэкспрессии разных генов, имитирующий процес-сы индукции и созревание нейронов, так же уве-личивает эффективность прямого репрограмми-рования. Кроме того, исследователи используюткомбинации генетической трансфекции с эпиге-нетическими агентами и факторами роста. Так, вработе (Yao et al., 2018) при прямом репрограмми-ровании клеток Мюллеровской глии исследова-тели сначала стимулировали сверхэкспрессиюβ-катенина с последующей сверхэкспрессиейтранскрипционных факторов OTX2, CRX и NRL.А в исследовании (Chen et al., 2010) на ИПСК мы-шей in vitro показано, что для получения клетокганглиозного слоя требуется сверхэкспрессияMATH5 в комбинации с факторами роста и малымимолекулами DKK1, NOGGIN и DAPT. Схожие ре-зультаты получены в работе (Deng et al., 2016), в ко-торой сверхэкспрессия ATOH7 (MATH5) в присут-ствии экзогенных молекул, участвующих в нейро-генезе сетчатки, таких как DKK1, NOGGIN иLEFTY A, стимулировала дифференцировку проге-ниторных клеток сетчатки человека, полученных изИПСК, в клетки ганглиозного слоя сетчатки.

Из выше сказанного, можно предположить,что для полноценного прямого репрограммиро-вания клеток РПЭ человека в клетки сетчатки не-обходим тщательный подбор особых условий.Необходимо использовать комбинацию эпигене-

тических (в частности, деметилирующие агенты)и генетических факторов (например, трансфек-цию генов bHLH семейства), а также коктейли изнизкомолекулярных соединений, влияющие не-посредственно на ремоделирование хроматина,транскрипцию генов, сигнальные пути, клеточ-ный цикл (пролиферацию и апоптоз) и метабо-лизм, и дифференцировку клеток.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКОМУ МЕТОДЫ ПРЯМОГО

РЕПРОГРАММИРОВАНИЯ

Химическое прямое репрограммирование пред-ставляет собой прямое репрограммирование кле-ток при помощи малых молекул, основанное науправлении путями, которые определяют клеточ-ную судьбу. Показано, что ингибирование малы-ми молекулами четырех сигнальных путей,Notch, TGF-β, BMP, и GSK-3β, оказалось доста-точным для активации нейрогенеза в гиппокампеголовного мозга мыши in vivo (Yin et al., 2019). Ти-пичный низкомолекулярный коктейль, исполь-зуемый для конверсии клеток включает в себяследующие компоненты: эпигенетические модуля-торы; молекулы, подавляющие исходные характе-ристики клеток; соединения, индуцирующие ха-рактеристики получаемых клеток; факторы, спо-собствующие выживаемости и функционированиюрепрограммируемых клеток in vitro (Xie et al., 2017).Так, в работе (Zhu et al., 2010) комбинация химиче-ских соединений и одного фактора транскрипцииоказалось достаточным для репрограммированиясоматической клетки в ИПСК. Исследователи(Liu et al., 2013) при помощи комбинации NGN2 смалыми молекулами, форсколином, активаторомцАМФ в сигнальном пути PKA, и дорсоморфи-ном, ингибитором BMP, напрямую репрограм-мировали фибробласты легких плода человека вхолинергические нейроны с функциональнойэлектрофизиологией. Позднее исследователи(Hou et al., 2013) показали, что комбинациитолько из семи малых молекул достаточно дляхимического репрограммирования соматиче-ских клеток в ИПСК. За последние несколько летподходы с использованием низкомолекулярныхмолекул достигли значительных успехов в индук-ции плюрипотентных или функционально диф-ференцированных клеток из соматических кле-ток (Xie et al., 2017). По сравнению с другими ме-тодами, низкомолекулярные соединения имеютряд уникальных преимуществ, таких как универ-сальность структуры и простота в манипулирова-нии в зависимости от времени и концентрации.Наряду с этим, не стоит забывать о проблемахтоксичности, способах доставки малых молекул ио том, что сам процесс подбора необходимых ма-лых молекул может быть трудоемким и дорого-стоящим. Тем не менее, сегодня многие исследо-



ватели считают, что развитие технологий с ис-пользованием малых молекул и CRISPR/CAS9системы может лечь в основу успешной регенера-тивной терапии для восстановления тканей.

МикроРНК прямое репрограммирование. Из-вестно, что микроРНК играют важную роль в пост-транскрипционной регуляции, нейральной диф-ференцировке, морфологическом и фенотипиче-ском развитии (Ebert, Sharp, 2012). МикроРНКрегулируют не только экспрессию генов и белков,но и действуют как эпигенетические факторы.Многие исследования показали, что микроРНКобладают свойством прямого воздействия насубъединицы комплексов ремоделирования хро-матина, ассоциированных с АТФ-зависимымBRG/BRM-фактором (BAF), который являетсякритическим при дифференцировке нейронов(Staahl et al., 2013; Abernathy et al., 2017; Lu, Yoo,2018). При прямом репрограммировании сомати-ческих клеток в нейроны используют микроРНКв комбинациях с различными транскрипционны-ми факторами (Yoo et al., 2011). Исследователи(Yoo et al., 2011) использовали miR-9/9* и miR-124, микроРНК специфичные для нервных кле-ток, в комбинации с транскрипционным факто-ром NEUROD1 для превращения фибробластовчеловека в нейроны. Однако полученные клеткине всегда демонстрировали повторяющийся по-тенциал действия, что указывает на незрелостьнейронов. Для решения этой проблемы та жегруппа исследователей использовала два другихфактора, ASCL1 и MYT1L, где были полученыклетки с более высокой степенью зрелости (Yooet al., 2011). Многочисленные исследования де-монстрируют, что именно комбинация мик-роРНК и узкоспециализированных транскрипци-онных факторов является наиболее эффективнойдля получения нейронов из других соматическихклеток.

Хотя, в доступной нам литературе мы не встре-тили сообщений по использованию комбинацииэпигенетических, генетических и низкомолеку-лярных соединений для прямого репрограммиро-вания клеток РПЭ человека, достигнутые успехипо прямому репрограммированию иных сомати-ческих клеток в различные подтипы нейронов,вселяют надежду на возможность этого процесса.

ВЫЧИСЛИТЕЛЬНОЕ ПРОГНОЗИРОВАНИЕ ТРАНСКРИПЦИОННЫХ ФАКТОРОВ

Последние достижения в области вычислитель-ной биологии – это создание специфических про-грамм для прогнозирования транскрипционныхфакторов, необходимых для клеточного прямогорепрограммирования. Вычислительные алгоритмыCellNet, Mogrify, BART, MAGICACT и CellRouterанализируют, классифицируют и предсказываютфункции транскрипционных факторов, тем са-

мым облегчая и ускоряя процесс скрининга(Morris et al., 2014; El Wazan et al., 2019). Другойподход заключается в создании компьютерноймодели клетки, которая позволяет создавать си-муляцию событий при использовании тех илииных факторов прямого репрограммирования,например DeepNEU (Danter, 2019). Хотя эти пе-редовые алгоритмические модели все еще нахо-дятся в зачаточном состоянии, дальнейшее ихразвитие улучшит наше понимание фундамен-тальных свойств клеток и молекулярного взаимо-действия факторов транскрипции, необходимыхдля прямого репрограммирования (El Wazan et al.,2019).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Существующие исследования показывают вы-сокий потенциал клеток РПЭ позвоночных кпрямому репрограммированию в нейроны сет-чатки in vivo. Несмотря на незначительное числоработ по прямому репрограммированию клетокРПЭ человека, можно с полной уверенность ска-зать, что клетки РПЭ человека способны отвечатьна воздействия генной инженерии. РПЭ доступендля различных векторов, доставляющих в клеткиразнообразные молекулы: гены транскрипцион-ных факторов, химерные эндонуклеазы, системуCRISPR/Cas, рекомбинантные белки и низкомо-лекулярные соединения. Клетки отвечают наприсутствие экзогенного генома ожидаемо дляисследователей. Основываясь на результатах по-лученных по прямому репрограммированию кле-ток позвоночных в клетки сетчатки, на достиже-ниях вычислительной биологии, можно предпо-ложить наиболее оптимальный набор факторовиз эпигенетичеких, генетических и химическихфакторов с добавлением нейротропных факторови факторов роста для успешной конверсии клетокРПЭ человека в нейроны сетчатки.


Благодарность коллегам и рецензентам в помощиподготовки статьи.


Исследование выполнено при финансовой под-держке РФФИ в рамках научного проекта № 19-14-50135. Работа выполнена в рамках раздела ГосзаданияИБР РАН № 0108-2019-0004.


При выполнении данного исследования люди иживотные не использовались в качестве объектов.

270




Авторы заявляют, что какой-либо конфликт инте-ресов отсутствует.

ИНФОРМАЦИЯ О ВКЛАДЕ АВТОРОВ

Автор Л.А. Ржанова проводила анализ мировой ли-тературы и написание основного текста статьи. Авто-ры А.В. Кузнецова участвовала в редактировании и об-суждении текста статьи, М.А. Александрова иниции-ровала написание обзора, проводила сбор литературыи редактирование текста статьи.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫAbernathy D.G., Kim W.K., McCoy M.J. et al. MicroRNAs

induce a permissive chromatin environment that enablesneuronal subtype-specific reprogramming of adult hu-man fibroblasts // Cell Stem Cell. 2017. V. 21. № 3.P. 332–348.e9.

Al-Hussaini H., Kam J.H., Vugler A. et al. Mature retinalpigment epithelium cells are retained in the cell cycleand proliferate in vivo // Mol. Vis. 2008. V. 14. P. 1784–1791.

Al-Saikhan F.I. The gene therapy revolution in ophthalmo-logy // Saudi J. Ophthalmol. Off. J. Saudi Ophthalmol.Soc. 2013. V. 27. № 2. P. 107–111.

Anderson D.H., Stern W.H., Fisher S.K. et al. The onsetof pigment epithelial proliferation after retinal detach-ment // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1981. V. 21. № 1.Pt 1. P. 10–16.

Artero-Castro A., Popelka S., Jendelova P. et al. The identifi-cation of small molecules that stimulate retinal pigmentepithelial cells: potential novel therapeutic options fortreating retinopathies // Expert Opin. Drug Discov.2019. V. 14. № 2. P. 169–177.

Azuma N., Tadokoro K., Asaka A. et al. Transdifferentiationof the retinal pigment epithelia to the neural retina bytransfer of the Pax6 transcriptional factor // Hum. Mol.Genet. 2005. V. 14. № 8. P. 1059–1068.

Bainbridge J.W.B., Smith A.J., Barker S.S. et al. Effect ofgene therapy on visual function in Leber’s congenitalamaurosis // N. Engl. J. Med. 2008. V. 358. № 21.P. 2231–2239.

Bassett E.A., Williams T., Zacharias A.L. et al. AP-2alphaknockout mice exhibit optic cup patterning defects andfailure of optic stalk morphogenesis. // Hum. Mol.Genet. 2010. V. 19. № 9. P. 1791–1804.

Bäumer N., Marquardt T., Stoykova A. et al. Retinal pig-mented epithelium determination requires the redun-dant activities of Pax2 and Pax6 // Development. 2003.V. 130. № 13. P. 2903–2915.

Bernier G., Panitz F., Zhou X. et al. Expanded retina territoryby midbrain transformation upon overexpression of Six6(Optx2) in Xenopus embryos // Mech. Dev. 2000. V. 93.№ 1–2. P. 59–69.

Bharti K., Gasper M., Ou J. et al. A regulatory loop involvingPAX6, MITF, and WNT signaling controls retinal pig-ment epithelium development // PLoS Genet. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1002757

Brzezinski J.A., Kim E.J., Johnson J.E. et al. Ascl1 expres-sion defines a subpopulation of lineage-restricted pro-genitors in the mammalian retina // Development. 2011.V. 138. № 16. P. 3519–3531.

Bumsted K.M., Barnstable C.J. Dorsal retinal pigment epi-thelium differentiates as neural retina in the microph-thalmia (mi/mi) mouse // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2000. V. 41. № 3. P. 903–908.

Burnight E.R., Gupta M., Wiley L.A. et al. Using CRISPR-Cas9 to generate gene-corrected autologous iPSCs forthe treatment of inherited retinal degeneration // Mol.Ther. 2017. V. 25. № 9. P. 1999–2013.

Chan L., Mahajan V.B., Tsang S.H. Genome surgery andgene therapy in retinal disorders // Yale J. Biol. Med.2017. V. 90. № 4. P. 523–532.

Chen M., Chen Q., Sun X. et al. Generation of retinal gan-glion-like cells from reprogrammed mouse fibroblasts //Investig. Opthalmology Vis. Sci. 2010. V. 51. № 11. P. 5970.

Chiba C., Mitashov V. Cellular and molecular events in theadult newt retinal regeneration // Ed. Chiba C. Strate-gies for Retinal Tissue Repair and Regeneration in Ver-tebrates: From Fish to Human. Research Signpost,Trivandrum. India. 2007. P. 15–33.

Chichagova V., Hallam D., Collin J. et al. Cellular regenera-tion strategies for macular degeneration: Past, presentand future // Eye. 2018. 32(5). 946–971.

Chouchane M., Melo de Farias A.R., Moura D.M. de S. et al.Lineage reprogramming of astroglial cells from differentorigins into distinct neuronal subtypes // Stem cell re-ports. 2017. V. 9. № 1. P. 162–176.

Danter W.R. DeepNEU: cellular reprogramming comes ofage – a machine learning platform with application torare diseases research // Orphanet J. Rare Dis. 2019.V. 14. № 1. P. 13.

Deng F., Chen M., Liu Y. et al. Stage-specific differentiationof iPSCs toward retinal ganglion cell lineage // Mol. Vis.2016. V. 22. P. 536.

Dunn K.C., Aotaki-Keen A.E., Putkey F.R. et al. ARPE-19, ahuman retinal pigment epithelial cell line with differen-tiated properties // Exp. Eye Res. 1996. V. 62. № 2.P. 155–170.

Dvoriantchikova G., Seemungal R.J., Ivanov D. The epigen-etic basis for the impaired ability of adult murine retinalpigment epithelium cells to regenerate retinal tissue //Sci. Rep. 2019. V. 9. № 1. P. 3860.

Ebert M.S., Sharp P.A. Roles for microRNAs in conferringrobustness to biological processes // Cell. 2012. V. 149.№ 3. P. 515.

El Wazan L., Urrutia-Cabrera D., Wong R.C.-B. Using tran-scription factors for direct reprogramming of neurons invitro // World J. Stem Cells. 2019. V. 11. № 7. P. 431–444.

Engelhardt M., Bogdahn U., Aigner L. Adult retinal pigmentepithelium cells express neural progenitor propertiesand the neuronal precursor protein doublecortin //Brain Res. 2005. V. 1040. № 1–2. P. 98–111.

Ezati R., Etemadzadeh A., Soheili Z.-S. et al. The influenceof rAAV2-mediated SOX2 delivery into neonatal andadult human RPE cells; a comparative study // J. Cell.Physiol. 2018. V. 233. № 2. P. 1222–1235.



Fisher C.R., Ferrington D.A. Perspective on AMD pathobi-ology: a bioenergetic crisis in the RPE // Invest. Oph-thalmol. Vis. Sci. 2018. V. 59. № 4. P. AMD41–AMD47.

Frayer W.C. Reactivity of the retinal pigment epithelium: anexperimental and histopathologic study // Trans. Am.Ophthalmol. Soc. 1966. V. 64. P. 586.

Fu X., Huu V.A.N., Duan Y. et al. Clinical applications ofretinal gene therapies // Precis. Clin. Med. 2018. V. 1.№ 1. P. 5–20.

Fuhrmann S. Eye morphogenesis and patterning of the opticvesicle // Curr. Top Dev. Biol. 2010. V. 93. P. 61–84.

Fuhrmann S., Zou C., Levine E.M. Retinal pigment epithe-lium development, plasticity, and tissue homeostasis //Exp. Eye Res. 2014. V. 123. P. 141–150.

Fujimura N., Taketo M.M., Mori M. et al. Spatial and tem-poral regulation of Wnt/beta-catenin signaling is essen-tial for development of the retinal pigment epithelium //Dev. Biol. 2009. V. 334. № 1. P. 31–45.

Grigoryan E.N., Markitantova Y. V., Avdonin P.P. et al. Studyof regeneration in amphibians in age of molecular-ge-netic approaches and methods // Russ. J. Genet. 2013.V. 49. № 1. P. 46–62.

Guimarães R.P. de M., Landeira B.S., Coelho D.M. et al. Ev-idence of Müller glia conversion into retina ganglioncells using Neurogenin2 // Front. Cell. Neurosci. 2018.V. 12. P. 410.

Hou P., Li Y., Zhang X. et al. Pluripotent stem cells inducedfrom mouse somatic cells by small-molecule com-pounds // Science (80-.) . 2013. V. 341. № 6146. P. 651–654.

Hu Q., Chen R., Teesalu T. et al. Reprogramming humanretinal pigmented epithelial cells to neurons using re-combinant proteins // Stem Cells Transl. Med. 2014.V. 3. № 12. P. 1526–1534.

Hu Q., Friedrich A.M., Johnson L.V. et al. Memory in in-duced pluripotent stem cells: reprogrammed human ret-inal-pigmented epithelial cells show tendency for spon-taneous redifferentiation // Stem Cells. 2010. V. 28.№ 11. P. 1981–1991.

Inoue T., Coles B.L.K., Dorval K. et al. Maximizing func-tional photoreceptor differentiation from adult humanretinal stem cells // Stem Cells. 2010. V. 28. № 3.P. 489–500.

Islam M.R., Nakamura K., Casco-Robles M.M. et al. Thenewt reprograms mature RPE cells into a unique multi-potent state for retinal regeneration // Sci. Rep. 2014.V. 4. P. 6043.

Iwafuchi-Doi M., Zaret K.S. Pioneer transcription factors incell reprogramming // Genes Dev. 2014. V. 28. № 24.P. 2679–2692.

Jasoni C.L., Walker M.B., Morris M.D. et al. A chickenachaete-scute homolog (CASH-1) is expressed in atemporally and spatially discrete manner in the develop-ing nervous system // Development. 1994. V. 120. № 4.P. 769–783.

Jiang D.J., Xu C.L., Tsang S.H. Revolution in gene medi-cine therapy and genome surgery // Genes (Basel).2018. V. 9. № 12.

Karali M., Banfi S. Inherited retinal dystrophies: The role ofgene expression regulators // Int. J. Biochem. Cell Biol.2015. V. 61. P. 115–119.

Kashani A.H., Lebkowski J.S., Rahhal F.M. et al. A bioengi-neered retinal pigment epithelial monolayer for ad-vanced, dry age-related macular degeneration // Sci. Transl. Med. 2018. V. 10. № 435. P. eaao4097.

Kharitonov A.E., Surdina A.V., Lebedeva O.S., Bogomazo-va A.N., Lagarkova M.A. Possibilities for using pluripo-tent stem cells for restoring damaged eye retinal pigment epithelium // Acta Naturae. 2018. V. 10. № 3. P. 30–39.

Kim M., Costello J. DNA methylation: An epigenetic mark of cellular memory // Exp. Mol. Med. 2017. 49(4).

Kole C., Klipfel L., Yang Y. et al. Otx2-genetically modified retinal pigment epithelial cells rescue photoreceptors af-ter transplantation // Mol. Ther. 2018. V. 26. № 1. P. 219–237.

Kuzmich A.I., Tyulkina D.V., Vinogradova T.V. et al. Pioneer transcription factors in normal development and car-cinogenesis // Russ. J. Bioorganic Chem. 2015. V. 41. № 6. P. 570–577.

Kuznetsova A.V. Morphological and physiological charac-teristics of the native retinal pigment epithelium in ver-tebrate animals and human // Biol. Bull. Rev. 2014.https://doi.org/10.1134/s2079086414020030

Kuznetsova A.V., Aleksandrova M.A. Heterogeneity of retinalpigment epithelial cells from adult human eye in differ-ent culturing systems // Bull. Exp. Biol. Med. 2017. V. 162. № 4. P. 569–577.

Kuznetsova A.V., Grigoryan E.N., Aleksandrova M.A. Hu-man adult retinal pigment epithelial cells as potential cell source for retina recovery // Cell Tissue Biol. 2011. V. 5. № 5. P. 495–502.

Kuznetsova A.V., Kurinov A.M., Aleksandrova M.A. Cell models to study regulation of cell transformation in pa-thologies of retinal pigment epithelium // J. Ophthal-mol. 2014. V. 2014. doi: 10.1155/2014/801787.

Kuznetsova A.V., Kurinov A.M., Chentsova E.V. et al. Effect of hrWnt7a on human retinal pigment epithelial cells in vitro // Bull. Exp. Biol. Med. 2015. V. 159. № 4. P. 534–540.

Kuznetsova A.V., Kurinov A.M., Rzhanova L.A. et al. Mech-anisms of dedifferentiation of adult human retinal pig-ment epithelial cells in vitro. Morphological and molec-ular genetic analysis // Cell Tissue Biol. 2019a. V. 13. № 2. P. 107–119.

Kuznetsova A.V., Rzhanova L.A., Kurinov A.M. et al. Effect of basic fibroblast growth factor on signaling pathways in adult human retinal pigment epithelial cells // Cell Tis-sue Biol. 2019b. V. 13. № 4. P. 292–304.

La Cour M. ACTA-EVER lecture 2007. The retinal pigment epithelium: friend or foe? // Acta Ophthalmol. 2008. V. 86. № 6. P. 593–597.

Lagutin O., Zhu C.C., Furuta Y. et al. Six3 promotes the for-mation of ectopic optic vesicle-like structures in mouse embryos // Dev. Dyn. 2001. V. 221. № 3. P. 342–349.

Lanning J.L., Wallace J.S., Zhang D. et al. Altered melano-cyte differentiation and retinal pigmented epithelium transdifferentiation induced by Mash1 expression in pigment cell precursors // J. Invest. Dermatol. 2005. V. 125. № 4. P. 805–817.

272



Léveillard T., Klipfel L. Mechanisms underlying the visualbenefit of cell transplantation for the treatment of retinaldegenerations // Int. J. Mol. Sci. 2019. V. 20. № 3.

Li X., Ma W., Zhuo Y. et al. Using neurogenin to reprogramchick RPE to produce photoreceptor-like neurons // In-vest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2010. V. 51. № 1. P. 516–525.

Liang L., Yan R.-T., Li X. et al. Reprogramming progenycells of embryonic RPE to produce photoreceptors: de-velopment of advanced photoreceptor traits under theinduction of neuroD // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2008. V. 49. № 9. P. 4145–4153.

Liang L., Yan R.-T., Ma W. et al. Exploring RPE as a sourceof photoreceptors: Differentiation and integration oftransdifferentiating cells grafted into embryonic chickeyes // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2006. V. 47.№ 11. P. 5066–5074.

Liu M.-L., Zang T., Zou Y. et al. Small molecules enable neu-rogenin 2 to efficiently convert human fibroblasts into cho-linergic neurons // Nat. Commun. 2013. V. 4. P. 2183.

Loosli F., Winkler S., Wittbrodt J. Six3 overexpression initi-ates the formation of ectopic retina // Genes Dev. 1999.V. 13(6). № 6. P. 649–654.

Lu Y.-L., Yoo A.S. Mechanistic insights into microRNA-in-duced neuronal reprogramming of human adult fibro-blasts // Front. Neurosci. 2018. V. 12. P. 522.

Luo M., Chen Y. Application of stem cell-derived retinalpigmented epithelium in retinal degenerative diseas-es: Present and future // Int. J. Ophthalmol. 2018.V. 11. № 1. P. 150–159.

Luz-Madrigal A., Grajales-Esquivel E., McCorkle A. et al.Reprogramming of the chick retinal pigmented epitheli-um after retinal injury // BMC Biol. 2014. V. 12. № 28.

Ma W., Yan R.-T., Li X. et al. Reprogramming retinal pig-ment epithelium to differentiate toward retinal neuronswith Sox2 // Stem Cells. 2009. V. 27. № 6. P. 1376–1387.

Mao W., Yan R.-T., Wang S.-Z. Reprogramming chick RPEprogeny cells to differentiate towards retinal neurons byash1 // Mol. Vis. 2008. V. 14. P. 2309–2320.

Mao W., Yan R.-T., Wang S.Z. Proneural gene ash1 pro-motes amacrine cell production in the chick retina //Dev. Neurobiol. 2009. V. 69. № 2–3. P. 88–104.

Martínez-Morales J.R., Dolez V., Rodrigo I. et al. OTX2 acti-vates the molecular network underlying retina pigmentepithelium differentiation // J. Biol. Chem. 2003. V. 278.№ 24. P. 21721–21731.

Martínez-Morales J.R., Rodrigo I., Bovolenta P. Eye devel-opment: A view from the retina pigmented epithelium //Bio Essays. 2014. V. 26. №7. P. 766–777.

Masserdotti G., Gascón S., Götz M. Direct neuronal repro-gramming: Learning from and for development // Dev.2016. V. 143(14). P. 2494–2510.

Mathers P.H., Grinberg A., Mahon K.A. et al. The Rx homeo-box gene is essential for vertebrate eye development // Na-ture. 1997. V. 387. № 6633. P. 603–607.

Matsunaga H., Handa J.T., Aotaki-Keen A. et al. Beta-ga-lactosidase histochemistry and telomere loss in senes-cent retinal pigment epithelial cells // Invest. Ophthal-mol. Vis. Sci. 1999. V. 40. № 1. P. 197–202.

Mayran A., Sochodolsky K., Khetchoumian K. et al. Pioneerand nonpioneer factor cooperation drives lineage specif-ic chromatin opening // Nat. Commun. 2019. V. 10.№ 1. P. 3807.

Milyushina L.A., Kuznetsova A.V., Grigoryan E.N. et al. Phe-notypic plasticity of retinal pigment epithelial cells fromadult human eye in vitro // Bull. Exp. Biol. Med. 2011.V. 151. № 4.

Milyushina L.A., Poltavtseva R.A., Marei M.V. et al. In vitrophenotypic modifi cation of pigmented epithelium cellsfrom human eye at early stages of development // Bull.Exp. Biol. Med. 2009. V. 148. № 1.

Milyushina L.A., Verdiev B.I., Kuznetsova A.V. et al. Expres-sion of multipotent and retinal markers in pigment epi-thelium of adult human in vitro // Bull. Exp. Biol. Med.2012. V. 153. № 1.

Morris S.A., Cahan P., Li H. et al. Dissecting engineered celltypes and enhancing cell fate conversion via CellNet //Cell. 2014. V. 158. № 4. P. 889–902.

Nguyen M., Arnheiter H. Signaling and transcriptional regu-lation in early mammalian eye development: a link be-tween FGF and MITF // Development. 2000. V. 127.№ 16.

Nguyen T., Wong R.C.-B. Neuroregeneration using in vivocellular reprogramming // Neural. Regen. Res. 2017.V. 12. № 7. P. 1073–1074.

Öner A. Recent Advancements in gene therapy for heredi-tary retinal dystrophies // Turkish J. Ophthalmol. 2017.V. 47. № 6. P. 338.

Öner A. Stem Cell Treatment in retinal diseases: Recent de-velopments // Turkish J. Ophthalmol. 2018. V. 48. № 1.P. 33–38.

Otteson D.C. Talkin’ about my (re)generation: The who ofintrinsic retinal stem cells // Neuroscience. 2017. V. 346.P. 447–449.

Pasque V., Jullien J., Miyamoto K. et al. Epigenetic factorsinfluencing resistance to nuclear reprogramming //Trends Genet. 2011. V. 27(12). P. 516–525.

Pollak J., Wilken M.S., Ueki Y. et al. ASCL1 reprogramsmouse Muller glia into neurogenic retinal progenitors //Development. 2013. V. 140. № 12. P. 2619–2631.

Rabenlehner D., Stanzel B. V., Krebs I. et al. Reduction ofiatrogenic RPE lesions in AMD patients: evidence forwound healing? // Graefe’s Arch. Clin. Exp. Ophthal-mol. 2008. V. 246. № 3. P. 345–352.

Rambhatla L., Chiu C.P., Glickman R.D. et al. In vitro dif-ferentiation capacity of telomerase immortalized humanRPE cells // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2002. V. 43.№ 5. P. 1622–1630.

Reese B.E., Keeley P.W. Genomic control of neuronal de-mographics in the retina // Prog. Retin. Eye Res. 2016.V. 55. P. 246–259.

Remez L.A., Onishi A., Menuchin-Lasowski Y. et al. Pax6 isessential for the generation of late-born retinal neuronsand for inhibition of photoreceptor-fate during late stag-es of retinogenesis // Dev. Biol. 2017. V. 432. № 1.P. 140–150.

Sakami S., Etter P., Reh T.A. Activin signaling limits thecompetence for retinal regeneration from the pigmentedepithelium // Mech. Dev. 2008. V. 125. № 1–2. P. 106–116.



Salero E., Blenkinsop T.A., Corneo B. et al. Adult humanRPE can be activated into a multipotent stem cell thatproduces mesenchymal derivatives // Cell. Stem. Cell.2012. V. 6; 10(1). P. 88–95. https://doi.org/10.1016/j.stem.2011.11.018

Satarian L., Nourinia R., Safi S. et al. Intravitreal injectionof bone marrow mesenchymal stem cells in patients withadvanced retinitis pigmentosa; a safety study // J. Oph-thalmic Vis. Res. 2017. V. 12. № 1. P. 58–64.

Schwartz S.D., Hubschman J.P., Heilwell G. et al. Embryonicstem cell trials for macular degeneration: A preliminaryreport // Lancet. 2012. V. 379. № 9817. P. 713–720.

Schwartz S.D., Regillo C.D., Lam B.L., et al. Human embry-onic stem cell-derived retinal pigment epithelium in pa-tients with age-related macular degeneration and Star-gardt’s macular dystrophy: Follow-up of two open-labelphase 1/2 studies // Lancet. 2015. V. 385. № 9967.P. 509–516.

Seko Y., Azuma N., Ishii T., et al. Derivation of human dif-ferential photoreceptor cells from adult human dermalfibroblasts by defined combinations of CRX, RAX,OTX2 and NEUROD // Genes Cells. 2014. V. 19. № 3.P. 198–208.

Seko Y., Azuma N., Kaneda M. et al. Derivation of humandifferential photoreceptor-like cells from the iris by de-fined combinations of CRX, RX and NEUROD //PLoS One. 2012. V. 7. № 4. P. e35611.

Staahl B.T., Tang J., Wu W., et al. Kinetic analysis of npBAFto nBAF switching reveals exchange of SS18 withCREST and integration with neural developmentalpathways // J. Neurosci. 2013. V. 33. № 25. P. 10348–10361.

Tamiya S., Kaplan H.J. Role of epithelial – mesenchymaltransition in proliferative vitreoretinopathy // Exp. EyeRes. 2016. V. 142. № 110. P. 26–31.

Tomita K., Nakanishi S., Guillemot F. et al. Mash1 promotesneuronal differentiation in the retina // Genes to Cells.1996. V. 1. № 8. P. 765–774.

Toy J., Yang J.M., Leppert G.S. et al. The Optx2 homeoboxgene is expressed in early precursors of the eye and activatesretina-specific genes // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998.V. 95. № 18. P. 10643–10648.

Tso M.O., Fine B.S. Repair and late degeneration of the pri-mate foveola after injury by argon laser // Invest. Oph-thalmol. Vis. Sci. 1979. V. 18. № 5. P. 447–461.

Ueki Y., Wilken M.S., Cox K.E. et al. Transgenic expressionof the proneural transcription factor Ascl1 in Müller gliastimulates retinal regeneration in young mice // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2015. V. 112. № 44. P. 13717–13722.

Vergara M.N., Del Rio-Tsonis K. Retinal regeneration in theXenopus laevis tadpole: a new model system // Mol. Vis.2009. V. 15. P. 1000–1013.

Vierbuchen T., Ostermeier A., Pang Z.P. et al. Direct conver-sion of fibroblasts to functional neurons by defined fac-tors // Nature. 2010. V. 463. № 7284. P. 1035–1041.

Wang S.-Z., Ma W., Yan R.-T. et al. Generating retinal neu-rons by reprogramming retinal pigment epithelial cells //Expert Opin. Biol. Ther. 2010. V. 10. № 8. P. 1227–1239.

Wang S.-Z., Yan R.-T. The retinal pigment epithelium: aconvenient source of new photoreceptor cells? //J. Ophthalmic Vis. Res. 2014. V. 9. № 1. P. 83–93.

Wang S.-Z., Yan R.-T. Chick retinal pigment epitheliumtransdifferentiation assay for proneural activities //Methods Mol. Biol. 2012. V. 884. P. 201–209.

Xie X., Fu Y., Liu J. Chemical reprogramming and transdif-ferentiation // Curr. Opin. Genet. Dev. 2017. V. 46.P. 104–113.

Yan R.-T., He L., Wang S.Z. Pro-photoreceptor activity ofchick neurogenin1 // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci.2009. V. 50(12). № 12. P. 5567–5576.

Yan R.-T., He L., Zhan W. et al. Induction of ectopic retina-liketissue by transgenic expression of neurogenin // PLoSOne. 2015. V. 10. № 1. P. e0116171.

Yan R.-T., Li X., Huang J. et al. Photoreceptor-like cellsfrom reprogramming cultured mammalian RPE cells //Mol. Vis. 2013a. V. 19. P. 1178–1187.

Yan R.-T., Li X., Wang S.-Z. Photoreceptor-like cells intransgenic mouse eye // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci.2013b. V. 54. № 7. P. 4766–4775.

Yan R.-T., Liang L., Ma W. et al. Neurogenin1 effectively re-programs cultured chick retinal pigment epithelial cellsto differentiate toward photoreceptors // J. Comp. Neu-rol. 2010. V. 518. № 4. P. 526–546.

Yan R.-T., Ma W.X., Wang S.Z. Neurogenin2 elicits the gen-esis of retinal neurons from cultures of nonneural cells //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 26.P. 15014–15019.

Yan R.-T., Wang S.-Z. NeuroD induces photoreceptor celloverproduction in vivo and de novo generation in vitro //J. Neurobiol. 1998. V. 36. № 4. P. 485–496.

Yao K., Qiu S., Wang Y.V., et al. Restoration of vision afterde novo genesis of rod photoreceptors in mammalianretinas. // Nature. 2018. V. 560. № 7719. P. 484–488.

Yin J.-C., Zhang L., Ma N.-X. et al. Chemical conversion ofhuman fetal astrocytes into neurons through modula-tion of multiple signaling pathways // Stem cell reports.2019. V. 12. № 3. P. 488–501.

Yoo A.S., Sun A.X., Li L. et al. MicroRNA-mediated con-version of human fibroblasts to neurons // Nature. 2011.V. 476. № 7359. P. 228–231.

Zaghloul N.A., Yan B., Moody S.A. Step-wise specificationof retinal stem cells during normal embryogenesis //Biol. Cell. 2005. V. 97. № 5. P. 321–337.

Zagozewski J.L., Zhang Q., Pinto V.I. et al. The role of ho-meobox genes in retinal development and disease //Dev. Biol. 2014. V. 393. № 2. P. 195–208.

Zhang N.L., Samadani E.E., Frank R.N. Mitogenesis andretinal pigment epithelial cell antigen expression in therat after krypton laser photocoagulation // Invest. Oph-thalmol. Vis. Sci. 1993. V. 34. № 8. P. 2412–2424.

Zhao S., Thornquist S.C., Barnstable C.J. In vitro transdif-ferentiation of embryonic rat retinal pigment epitheliumto neural retina // Brain Res. 1995. V. 677. № 2. P. 300–310.

Zhu S., Li W., Zhou H. et al. Reprogramming of human pri-mary somatic cells by OCT4 and chemical compounds //Cell Stem Cell. 2010. V. 7. № 6. P. 651–655.

274



Reprogramming of Differentiated Mammalian and Human Retinal Pigment Epithelium: Current Achievements and Prospects

L. A. Rzhanova1, *, А. V. Kuznetsova1, and М. A. Aleksandrova1, 2

1Koltzov Institute of Developmental Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119334 Russia2Moscow State University, Moscow, 119991 Russia


Impairment of the homeostatic and functional integrity of the retina and retinal pigment epithelium (RPE)is the main reason of a number of degenerative diseases of the human eye, accompanied by loss of vision. De-spite the significant progress made over the past decades in the development of new methods of treatment forthis pathology, a number of complications remain when using surgical methods of vision correction and sofar insurmountable limitations in the use of modern approaches, such as gene therapy and genetic engineer-ing. One of the promising approaches to the treatment of degenerative diseases of the retina may be an ap-proach based on the use of regenerative abilities of own endogenous cells with high plasticity, in particularRPE cells and Muller glia. Currently, vertebrate RPE cells are of great interest as a source of new photorecep-tors and other neurons in the degraded retina in vivo. In this regard, the possibilities of their direct reprogram-ming by genetic, epigenetic, chemical methods and their combination are investigated. The review focuses onresearch on gene reprogramming of vertebrate RPE cells into retinal neurons, with detailed analysis of thegenes used as the main reprogramming factors, comparative analysis and extrapolation of experimental datafrom animals to humans. In addition, the review covers work on the use of alternative genetically-directed re-programming approaches-chemically-mediated with the use of cocktails of therapeutic low-molecular com-pounds and microRNAs. In general, the results of research indicate the complexity of the process of repro-gramming human RPE cells into retinal neurons. However, taking into account the results of reprogrammingvertebrate cells, the availability of human RPE cells for various vectors that deliver a variety of molecules tocells: transcription factors, chimeric endonucleases, recombinant proteins and low-molecular compounds,we can assume the most optimal set of factors for the successful conversion of human RPE cells into retinalneurons.

Keywords: retinal pigment epithelium, RPE, retinal regeneration, gene-directed reprogramming, transcrip-tion factors, degenerative-dystrophic diseases of the eye

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 275–291

275

ЦЕРЕБРАЛЬНЫЕ ОРГАНОИДЫ: МОДЕЛЬ РАЗВИТИЯ МОЗГА© 2020 г. К. К. Сухиничa, *, М. А. Александроваa

aФГБУН Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ул. Вавилова, 26, Москва, 119334 Россия*e-mail: [email protected]



На данный момент развитие человеческого мозга в норме и при патологии не может быть полно-стью воспроизведено на животных моделях, что ведет к необходимости поиска альтернативных ре-шений. За последние годы были достигнуты значительные успехи в разработке методов культиви-рования церебральных органоидов мозга человека. Церебральные органоиды представляют собой3D культуры, в которых развиваются специфичные для мозга типы клеток, полученные из эмбрио-нальных или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. В церебральных органоидах,благодаря самоорганизации нервной ткани, воспроизводятся уникальные особенности развитиячеловеческого мозга, которые отсутствуют в развивающемся мозге грызунов. Однако они не явля-ются точной копией, поэтому преодоление ряда ограничений в будущем расширит наши возмож-ности исследовать развитие и нарушения мозга человека. Очевидно, что уже в настоящее время мо-делирование церебральных органоидов открывает перспективы как для фундаментальных, так иклинических исследований. В настоящем обзоре мы обсуждаем методы культивирования нервнойткани, способы получения церебральных органоидов, особенности их самоорганизации, моделиро-вание в них процессов нормального развития и патологии мозга.

Ключевые слова: церебральные органоиды, 3D культуры, развитие мозга, нейрогенез, радиальнаяглия человекаDOI: 10.31857/S0475145020040072

ВВЕДЕНИЕ. ОБОСНОВАНИЕ РАЗРАБОТКИ АДЕКВАТНЫХ МОДЕЛЕЙ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ

РАЗВИТИЯ МОЗГА ЧЕЛОВЕКАИ РОЛЬ 3D ОРГАНОИДОВ

Изучение развития мозга в норме и при пато-логии является одной из ключевых задач нейро-биологии. Формирование мозга человека пред-ставляет собой особую проблему, решение кото-рой ограничивается не только сложностью егоморфо-функциональной организации, отличаю-щейся от приматов и грызунов, но и набором до-пустимых методов и животных модельных системдля его исследования (Fietz, Huttner, 2011; Tavernaet al., 2014; Florio et al., 2018).

Среди экспериментальных млекопитающихшироко используют лабораторных грызунов, вчастности мышей, на которых установлены базо-вые механизмы ранних этапов развития мозга. Ге-нетические манипуляции с геномом мыши в по-следние годы стали очень эффективными и слож-ными, но во многих случаях прямой анализчеловеческих тканей оказывается предпочтитель-нее, чем изучение модели на грызунах, поскольку,несмотря на эволюционную консервативность,развитие мозга мышей отличается от человека

(Lui et al., 2011). Так, в развивающейся коре мозгачеловека формируется обширная внешняя суб-вентрикулярная зона (вСВЗ), которая отсутствуету мышей (Hansen et al., 2010). В этой зоне распо-ложены клетки внешней радиальной глии (вРГ),отличные от других клеток радиальной глии поповедению и экспрессии ряда специфических длячеловека генов (Taverna et al., 2014; Pollen et al.,2015; Florio et al., 2015, 2018). Клетки вРГ из вСВЗгенерируют огромный пул нейронов, за счет ко-торого значительно увеличиваются размеры корыи обеспечивается ее гирификация (Sousa et al.,2017; Bershteyn et al., 2017). Они имеют характер-ные особенности в пролиферации (Homemet al.,2015), а их клеточный цикл может регулироватьсяуникальными для приматов микроРНК, участву-ющими в контроле уровня пролиферации (Nowa-kowski et al., 2018; Prodromidou, Matsas, 2019). Кроместруктурно-морфологических различий, известно,что эволюционно наиболее новая фронтополярнаяобласть коры мозга человека претерпела суще-ственные изменения, затрагивающие более 5% еетранскриптома в сравнении с близкими примата-ми, не говоря уже о грызунах (He et al., 2017). В до-полнение к этому, в мозге человека типы астроци-

УДК 576.08

ОБЗОРЫ

276


СУХИНИЧ, АЛЕКСАНДРОВА

тарных клеток морфологически и функциональ-но намного сложнее, чем у грызунов (Oberheimet al., 2009). Эти фундаментальные отличия ста-вят вопрос о поиске адекватных моделей для изуче-ния механизмов раннего развития мозга человека иего заболеваний. Новые модели необходимы и дляклинически направленных исследований лекар-ственных препаратов, потому что использование вдоклинических анализах экспериментальных жи-вотных, зачастую не позволяет адекватно спрогно-зировать, какие препараты и методы будут эффек-тивны, так как около 80% новых лекарственныхсредств, прошедших испытания на животных, у че-ловека терпят неудачу (Perrin, 2014; Mak et al.,2014).

Одним из подходов к решению комплекснойпроблемы моделирования развития мозга челове-ка может быть применение методов культивирова-ния клеток. На данный момент широко распро-страненным методом является двумерное (2D), ад-гезивное культивирование клеток, которое имеетпреимущества в том, что культура легко масштаби-руется; клетки обеспечиваются равномерным до-ступом к факторам среды, сохраняется относи-тельно однородная популяция клеток, что помо-гает проводить экспериментальные воздействия,анализировать клетки и визуализировать их в ре-альном времени (Koo et al., 2019). Однако такаясистема имеет и ряд недостатков, ограничиваю-щих изучение развития нервной ткани (Hong, Do,2019; Pacitti et al., 2019). При 2D культивированиине достаточно реализуются специфические взаи-модействия между разными типами клеток иклетками и внеклеточным матриксом, которыеопределяют и регулируют важные морфогенети-ческие этапы развития in vivo. Например, в этойсистеме отсутствует пространственный градиентфакторов, имеющих решающее значение для ре-гиональной спецификации мозга; нарушаютсяхарактерная клеточная полярность и миграцияклеток. Но главное, что в 2D культуре не форми-руется трехмерная организация нервных и гли-альных клеток и специфические пространствен-ные межклеточные взаимодействия характерныедля развивающегося мозга in vivo. Из сказанногоследует, что необходимо искать пути для про-странственного воспроизведения процессов раз-вития и организации нервной ткани в условияхтрехмерного микроокружения. И здесь интерес-ным может быть создание трехмерных органои-дов в системе 3D культивирования, где, как пра-вило, клетки имеют более высокую скорость про-лиферации, чем в монослойных культурах, и ихдифференцировка более близка к той, что наблю-дается in situ. Церебральные органоиды частоопределяют, как органоподобные 3D культуры,состоящие из специфичных для мозга типов кле-ток, полученных из плюрипотентных стволовыхклеток (Lancaster, Knoblich, 2014; Qianetal., 2019).

Однако нужно обратить внимание, что термин“органоид” до сих пор не имеет четкого определе-ния и его трактовка различается в зависимости отэкспериментального контекста. Одни исследовате-ли называют органоидами структуры “напоминаю-щие органы”, возникающие при агрегации клеток,другие, – клеточные комплексы, образующиеся изкоммитированных эмбриональных стволовых кле-ток при реализации эндогенной генетической про-граммы (Simian, Bissell, 2017). По мнению Сасаи,органоид должен иметь: трехмерную структуру изклеток, которые устанавливают или сохраняютморфологическую идентичность моделируемогооргана; разнообразие типов клеток, как в самоморгане, проявляющих некоторые специализиро-ванные функции органа и, наконец, самооргани-зация органоида должна соответствовать тем жевнутренним организационным принципам, что ив самом органе (Sasai, 2013).

В настоящем обзоре мы суммировали данныепо методам культивирования нервной ткани, ихвозможности и ограничения; способы полученияцеребральных органоидов из стволовых клеток иособенности их самоорганизации, клеточные ха-рактеристики церебральных органоидов и модели-рование в них процессов нормального развития ипатологии мозга, структурные и молекулярныесвойства разных нейральных органоидов in vitro иin vivo, и перспективы их использования in vivo.

КУЛЬТИВИРОВАНИЕ НЕРВНОЙ ТКАНИ:ОТ 2D К 3D КУЛЬТУРАМ

История культивирования нейральных тканейнасчитывает уже более 100 лет. Первая культурабыла получена в 1907 году Харрисоном (Harrison,1907), который обнаружил рост нейритов нерв-ных клеток от кусочков нервной трубки лягушек,сохраненных в капле лимфы на протяжении 4 не-дель. Фрагменты тканей нервной системы челове-ка научились культивировать значительно позд-нее, в 40-е годы, используя хорошо зарекомендо-вавший себя метод висячей капли и новый методроллерного культивирования (Hogue, 1946). Через10 лет удалось получить первую монослойнуюкультуру энзиматически диссоциированных кле-ток из спинного мозга эмбриона цыпленка (Cava-naugh, 1955). Затем Москона вырастил агрегаци-онную культуру клеток из ткани эмбрионов мы-шей, где было показано, что диссоциированныеклетки способны реагрегировать и образовыватьтканеподобные структуры (Moscona, 1961).

Одновременно с этими исследованиями в ней-робиологии произошло принципиально важноеоткрытие, не замеченное в то время, но имевшеечрезвычайно важные последствия. В середине60-х годов прошлого века Дж. Альтман и Г. Дасобнаружили возникновение новых нервных кле-ток в мозге у взрослых грызунов (Altman, Das,


ЦЕРЕБРАЛЬНЫЕ ОРГАНОИДЫ: МОДЕЛЬ РАЗВИТИЯ МОЗГА 277

1965). Несмотря на доказательство (методом ав-торадиографии) нейрогенеза в субвентрикуляр-ной зоне (СВЗ) боковых желудочков и субграну-лярной зоне зубчатой извилины гиппокампа (Al-tman, Das, 1965; Altman, 1969), их открытие небыло востребованным вплоть до 90-х годов, домомента, когда клетки нейрогенных зон поме-стили в культуру. Работа с культурой привела кпониманию того, что нейрогенез в мозге поддер-живается за счет особых нейральных стволовыхклеток (НСК), способных к самоподдержанию идифференцировке во все основные типы клетокнервной системы (Reynolds, Weiss, 1996). Иссле-дование показало, что клетки из СВЗ мышей (всреде без сыворотки, с добавками bFGF и EGF)образуют в культуре свободноплавающие округ-лые агрегаты – нейросферы. Их клетки могли,как формировать новые нейросферы, так и диффе-ренцироваться в нейроны, астроциты и олигоденд-роциты, что доказывало их стволовые свойства(Reynolds, Weiss, 1996). Суммарно, способностьклеток к формированию нейросфер, самоподдер-жанию и дифференцировке была положена в опре-деление термина – нейральная стволовая клетка.

Первые мультипотентные НСК человека былиполучены из мозга эмбриона 10.5 недель развитияв 1999 году (Vescovi et al., 1999). Способные к са-мообновлению и длительному сохранению вкультуре НСК дали возможность исследоватьопределенные этапы развития мозга и моделиро-вать некоторые заболевания in vitro (Carpenter et al.,1999). Здесь интересно вспомнить о наших рабо-тах проведенных ранее. Анализируя морфологиюи клеточный состав нейросфер из НСК от эмбри-онов человека in vitro и после их трансплантациив мозг крыс, в ряде случаев мы обнаружили, чтовнутри сфер формировались четко организован-ные розетки клеток, напоминающие нейроэпите-лиальные структуры, о которых речь пойдет ниже(Podgornyi et al., 2005; Aleksandrova et al., 2006).

Несмотря на интерес исследователей к анали-зу нейросфер, их редко используют для изученияранних этапов развития мозга человека, что глав-ным образом, связано с этическими требования-ми, и особенностями их культивирования. Ней-росферы трудно длительное время сохранять вкультуре, они адгезируют, а их клетки хаотичномигрируют и не образуют упорядоченной струк-туры (Eiraku et al., 2008; Lancaster, Knoblich, 2014).

Методологические изменения произошли вконце 90-х, когда в дополнение к эмбриональ-ным стволовым клеткам мыши (мЭСК) были по-лучены эмбриональные стволовые клетки чело-века (чЭСК), способные генерировать клеткивсех зародышевых листков (Evans, Kaufman, 1981;Thomson et al., 1998). Направление ЭСК по ней-ральному пути развития происходит при подавле-нии индуктивных сигналов для альтернативных

дифференцировок (Ying et al., 2003; Chambers et al.,2016) или, например, при использования nogginдля блокирования BMP4 (Itsykson et al., 2005; Ger-rard et al., 2005; Eiraku et al., 2008). Наряду с этим,многие авторы отмечают интересный и важныйфакт, что ЭСК мыши и человека в культуре могутпойти по нейральному пути развития даже в от-сутствие внешних сигналов (Tropepe et al., 2001;Muñoz-Sanjuán, Brivanlou, 2002; Smukler et al.,2006). Естественно возникает вопрос, за счет ка-ких факторов происходит нейрализация клеток?Частично ответ на него был найден при изученииключевых для развития нервной ткани морфоге-нов (Bertacchi et al., 2015). Оказалось, что мЭСКнейрализуются и самостоятельно паттернируют-ся за счет эндогенного повышения экспрессииWNT, FGF и BMP (дорзо-каудальная ось), и низ-кого уровня экспрессия лигандов Activin/Nodal иShh (вентральная ось). Можно предположить, чтоблагодаря градиенту морфогенов, нейральныеклетки самоорганизуются и формируют округлыеструктуры из полярных нейроэпителиальныхклеток, которые при адгезии на пластике образу-ют нейроэпителиальные розетки (Zhang et al.,2001; Gerrard et al., 2005; Elkabetz, Studer, 2008).Розетки формируются клетками с четкой апико-базальной ориентацией, которые располагаютсяапикальным концом с ресничкой внутрь цен-тральной полости, а базальным концом наружу,что в целом напоминает фронтальный срез нерв-ной трубки с желудочком посередине. Как и принормальном развитии, нейроэпителиальные клет-ки из ЭСК пролиферируют, формируют подобиевентрикулярной и субвентрикулярной зоны, гдеони дифференцируются в радиальную глию (РГ).Для нее характерно плотное близко друг к другурасположение клеточных тел, имеющих радиаль-но отходящий длинный базальный отросток, рас-тущий по мере увеличения мозга. Радиальнаяглия генерируют практически все нейроны иглию мозга, одновременно играя роль стволовыхклеток (материнских) и рельсов, направляющихмиграцию новорожденных клеток (Zhang et al.,2001; Campbell, Götz, 2002; Fietz, Huttner, 2011;Taverna et al., 2014). В органоидах митозы РГ про-исходят в апикальной части клетки, куда опуска-ется ядро при делении, при этом материнскаяклетка сохраняет длинный отросток, а дочерняяклетка мигрирует вдоль отростка. Этот алгоритмточно повторяет нормальное развитие эмбриона(Curchoe et al., 2012; Ziller et al., 2015; Edri et al.,2015). На ЭСК были отработаны основные мето-дические приемы получения церебральных орга-ноидов, и многие исследования подтвердили, чтоin vitro можно создавать модели ранних этаповразвития мозга человека. Однако этические спо-ры о возможности использования эмбриональ-ных стволовых клеток, а главное получение инду-цированных плюрипотентных стволовых клеток

278



(ИПСК) сместили интересы исследователей всторону ИПСК (Takahashi et al., 2007). Хорошоизвестно, что данный тип клеток может быть по-лучен как от здорового человека, так и больногопациента, что открывает путь к изучению множе-ства заболеваний и персонализированной меди-цине (Avior et al., 2016). Пионерские работы (Eirakuet al., 2008; Mariani et al., 2012; Lancaster et al., 2013), вкоторых были получены церебральные органоидыиз разных ИПСК человека в 3D культуре, выделилиэти исследования в особое перспективное направ-ление.

ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ОРГАНОИДОВ

И ИХ МОРФО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

Изначально ЭСК или ИПСК культивируютдля получения эмбриоидных тел, которые пред-ставляет собой многоклеточный агрегат, имею-щий ряд характеристик, аналогичных внутреннейклеточной массе на стадии перед гаструляцией, спотенциалом развития клеток в три зародышевыхслоя: энтодерму, эктодерму и мезодерму (Zhanget al., 2001). Затем клетки эмбриоидных тел ком-митируют в нейральном направлении путем до-полнения среды для культивирования специфи-ческими факторами роста и/или ингибиторами.Благодаря самоорганизующей способности, ней-ральные клеточные агрегаты развиваются в орга-ноиды, состоящие из разных нейрональных под-типов и макроглии, образующих специализиро-ванные области ЦНС (такие как кора, гиппокамп,сетчатка, спинной мозг – Eiraku et al., 2011; Marianiet al., 2012; Lancaster et al., 2013; Todd et al., 2013;Chichagova et al., 2019; Winanto et al., 2019). В орга-ноида химитирующих структуры переднего мозга,хорошо воспроизводятся основные особенностиразвивающейся коры: апикально-базальная по-лярность нейроэпителия, интеркинетическая ми-грация ядер в нем и РГ, способы деления РГ и ха-рактер миграции нейронов (Mariani et al., 2012).Важная особенность церебральных органоидов че-ловека в том, что в них формируется увеличеннаявСВЗ, которая является основной пролифератив-ной зоной у приматов, но не у мышей.

В литературе выделяют две методологии дляполучения органоидов мозга, которые подразде-ляют на “направленную” и “ненаправленную”,что с нашей точки зрения очень условно, по-скольку есть множество разных протоколов дляполучения органоидов. “Ненаправленные” мето-ды, главным образом, опираются на способностьк спонтанному, генетически детерминированно-му морфогенезу и внутренней дифференцировкев агрегатах ЭСК и ИПСК (рис. 1). Минимальныедобавки в композицию среды культивированиядают стволовым клеткам наибольшую свободу

для самоорганизации. “Направленные” методы,наоборот, основаны на изначальном использова-нии внешних регуляторных факторов, чтобы на-править клетки дифференцироваться в желаемыхнейральных направлениях (Qian et al., 2019; Kooet al., 2019).

В основе одного из “направленных” базовыхпротоколов культивирования мЭСК и чЭСК ле-жит метод SFEBq (serum-free f loating culture ofembryoid body-like aggregates with quick reaggrega-tion) (Watanabe et al., 2005). Клетки культивируютс использованием среды с ингибиторами SMAD,подавляя развитие мезодермы и энтодермы (Cham-bers et al., 2009), после чего нейральная дифферен-цировка продолжается автономно (Eiraku et al.,2008). Общие принципы протокола заключались вследующем. Диссоциированные мЭСК (или чЭСК)культивировали в 96 луночном низко адгезивномпланшете с U-образными лунками, где через не-сколько часов образовывались клеточные агрегаты,подобные эмбриоидным телам, но в которых ужеоколо 70% клеток были положительны к bf1(Foxg1) – раннему маркеру клеток конечногомозга эмбрионов (Watanabe et al., 2005). В течение5 сут клетки в агрегатах формировали непрерыв-ный, поляризованный по апико-базальной осинейроэпителий, что подтверждалось позитивнымиммуногистохимическим окрашиванием клетокна N-cadherin+. На 7 сут культуру переводили насреду DMEM/F12 с добавкой N2, где к 10 сут об-разовывалось множество круглых кластеров (да-ющих при адгезии розетки) из поляризованныхнейроэпителиальных клеток с базальным отрост-ком и единственной ресничкой на апикальномконце, которые имели большое сходство с нейро-эпителием и радиальной глией в нормальном эм-бриональном развитии. Клетки в розетках дели-лись симметрично и асимметрично, а митотиче-ские ядра располагались ближе к апикальнойчасти клеток, как при интеркинетическом движе-нии ядер в нормальном эмбриогенезе (рис. 2).Нейрогенез в мЭСК органоидах имел сходство сэмбриональным по времени рождения специфи-ческих типов клеток из радиальной глии. После-довательно появлялись клетки, несущие марке-ры будущих слоев коры: Reelin+ (слой I),Tbr1+/Bf1+ (слой VI), Ctip2+/Emx1+ (слой V), иBrn2+/Tuj1+ (слой II/III), а время рождениянейронов приходилось на 8–10, 9–10, 10–11, и12–13 сутки соответственно. Хотя, в отличие отнормы, в органоидах из мЭСК могла наблюдатьсялибо инверсия слоев, либо смешанное располо-жение клеток всех слоев, их функциональные ис-следования свидетельствовали об активированииспецифических Ca2+ волн, характерных для нео-натальных кортикальных тканей. Как пишут ав-торы, они обнаружили интригующую разницумежду кортикальными тканями, происходящимиот мЭСК и чЭСК. Так, при развитии коры из



Рис. 1. Технологии получения церебральных органоидов. Из плюрипотентных стволовых клеток человека получаютэмбриоидные тельца. Затем, в основном за счет самоорганизации идет образование церебральных органоидов (“нена-правленный метод”) либо с помощью регуляторных факторов идет формирование “регион-специфических” органо-идов (“направленный метод”). Сфероиды, представляющие собой разные “регион-специфические” области мозгамогут быть объединены в “ассемблоид”.

Плюрипотентныестволовые клетки

Агрегация

Эмбриоидные тельца

“Ненаправленный”метод

Церебральный органоид

“Регион-специфический” органоид

“Направленный” метод

Сфероид Сфероид

Слияние

мЭСК непрерывный нейроэпителий образует не-сколько розеток начиная с 7-го дня культивиро-вания, которые дезорганизовались после 12-годня по мере уменьшения митозов нейрональныхпредшественников. В отличие от этого, ткани изчЭСК сохраняли непрерывную нейроэпители-альную структуру без розеток даже на 46 сут, что cс нашей точки зрения совершенно очевидно, по-скольку нейрогенез в переднем мозгу человекадлиться более 175 сут, а у мышей только 7 сут. Од-нако авторы связывали это с различиями в балан-се дифференцировки и самообновления клетокмЭСК и чЭСК, и с возможным различием в меха-нических свойствах клеток между видами (Eirakuet al., 2008).

Дальнейшее развитие этой технологий позво-лило усовершенствовать методы получения кор-тикальных органоидов (Kadoshima et al., 2013). В

новом протоколе в определенные моментыкультивирования, авторы использовали Rho ki-nase ингибитор, повышенный уровень кислоро-да, Матригель и разные добавки к среде. В ре-зультате, растущий нейроэпителий самопроиз-вольно сформировал полярность дорсо-каудальнойи вентро-ростральной оси, прошел специфичныйморфогенез и образовал полусферическую структу-ру с толстой вентрикулярной зоной из Pax6+ иSox2+ клеток, где больше делящихся клеток бы-ло в апикальной части ближе к вентрикулярнойполости, как in vivo. За пределами вентрикуляр-ной зоны в базальной части располагались TuJ1+нейроны, несущие маркеры ранних нейроновкортикальной пластинки Ctip2+, Tbr1+ (Molyneauxet al., 2007; Hébert, Fishell, 2008). К 70 сут культиви-рования в органоиде уже можно четко различитьмаргинальную зону с Reelin+ клетками Кахаля-Рет-

280



циуса, нейроны глубоких слоев Ctip2+, Tbr1+, амежду кортикальной пластинкой (КП) и СВЗ вы-делялась интермедиальная (промежуточная) зонас малым количеством клеток и большим числомнейритов. Непосредственно под кортикальнойпластинкой располагались Calretinin + клетки сMAP2+ отростками, которые были сходны с ней-ронами субпластинки. Важно, что в течение всеговремени стволовые клетки сохраняли правиль-ную апикально-базальную ориентацию, подобнорадиальной глие в нормальном развитии (Camp-bell, Götz, 2002). К 90 сут культивирования обра-зовывались нейроны верхних слоев с маркерамиSatb2+ и Brn2+ и кортикальная пластинка стано-вилась значительно толще. Авторы подчеркиваютудивительную самоорганизацию чЭСК, отмечая,что нейроэпителий самостоятельно (без участияэкзогенных морфогенов) образует три нейро-нальные зоны (субпластинку, кортикальную пла-стинку и зону клеток Кахала-Ретциуса), и трипрогениторные зоны (желудочковую, субвентри-кулярную и промежуточную зону) в том же апи-кально-базальном порядке, что и в коре человека вначале второго триместра. В органоиде воспроизво-дится и следующий этап кортикогенеза, характер-ный для второго триместра, а именно появление на91-й день (13 нед.) предшественников Sox2+ Tbr2+клеток внешней радиальной глии внешней СВЗ(которая характерна для человека, но отсутствуету мышей). Отмечается, что скорость развитиякортикальных структур в органоиде в культурепримерно сравнима с таковой в мозге плода чело-века (Kadoshima et al., 2013).

Есть представление, что в “направленных”культурах возникают разные типы клеток в отно-сительно постоянной пропорции с меньшей ва-риабельностью между партиями органоидов и ис-ходными клеточными линиями. В тоже время,“направленные” органоиды обычно содержат от-

носительно небольшие нейроэпителиальные ком-плексы, и их цитоархитектура зачастую не являет-ся четко определенной, что может быть следстви-ем неадекватных условий культивирования.

“Ненаправленный” метод получения нейраль-ных органоидов из ИПСК человека, который ис-пользовала М. Ланкастер, включает модифика-цию среды, использование матригеля и биореак-тора для поддержания самоорганизации клеток(Lancaster et al., 2013; Lancaster, Knoblich, 2014). Вотличие от протоколов “направленной” диффе-ренцировки, где активировали нейроэктодермуподавляя развитие мезодермы и энтодермы инги-биторами SMAD (Chambers et al., 2009), М. Лан-кастер инициировала образование церебральныхорганоидов в среде для эмбриональных стволо-вых клеток с низким уровнем основного факторароста фибробластов (bFGF), после чего трехмер-ные агрегаты переводили на среду для нейраль-ной индукции (с добавками N2 и B27). Общийпринцип создания органоидов такой: сначала изИПСК человека формируют эмбриоидные тела снейроэктодермой, затем добавляют Матригельдля формирования 3D структуры и помещают вбиореактор, который обеспечивает перемешива-ние среды, улучшает диффузию и трофику орга-ноидов. Далее авторы воздействовали на нейро-этодерму малыми молекулами CHIR99021 (CHIR)(GSK3 beta inhibitor) в течение 3 сут для актива-ции сигнального пути WNT/β-cathenin; в итогеудалось получить только структуры переднегомозга, где почти не было клеток с маркерамисреднего, заднего мозга и мозжечка. Добавление всреду Матригеля создавало подобие внеклеточ-ного матрикса и базальной мембраны, котораяобеспечивала механические свойства, необходи-мые для апико-базальной паттернизации нейро-эпителия и формирования кортикальной пла-стинки, более похожей на ту, которая наблюдает-

Рис. 2. Формирование ламинарной структуры неокортекса в церебральных органоидах, полученных из ИПСК чело-века. В начальный период в органоиде образуются 3D розетки, состоящие из клеток нейроэпителия. Далее структурарозеток значительно усложняется из-за пролиферации и миграции клеток, появляются внутренний и внешний слоирадиальной глии, интермедиальные прогениторы, а также слои, состоящие из нейронов.

Нейроны

Внешняярадиальная глия

Интермедиальныепрогениторы

Внутренняярадиальная глия



ся in vivo (Ranga et al., 2016). Разработанныйметод позволил М. Ланкастер получить органо-ид, названный “мини-мозгом”, содержащий сра-зу ряд областей, включая разные отделы коры,гиппокамп и сетчатку. Важно, что в органоидахпереднего мозга последовательно образуютсяструктуры коры с четко выраженными слоями,которые на структурном, клеточном и молеку-лярном уровнях подобны вентрикулярной зоне,внешней и внутренней субвентрикулярной зоне икортикальной пластинке in vivo. В последующемисследователи применили еще одно технологиче-ское усовершенствование, которое заключалось виспользовании нити (филамента) для удлиненияэмбриоидных тел и нервной трубки (Lancasteret al., 2017). Авторы добавляли в культуру отдель-ные волокна poly (lactide-co-glycolide) copolymer(PLGA) микрометрового размера, вокруг которыхформировалась ткань с большой поверхностью,сохраняя плотные межклеточные контакты и са-моорганизацию. В результате, в инженерных це-ребральных органоидах (enCOR) усиливалосьразвитие нейроэктодермы, улучшалось формиро-вание коры, и в целом полученные структуры ужеочень напоминали формирующийся мозг челове-ка на стадиях 8–9 недель эмбриогенеза. Цере-бральные органоиды росли не менее одного–двухмесяцев, и имели разные размеры, в среднем око-ло 4 мм, а те которые достигали крупного размера~1 см всегда в центре имели зоны некроза. От-дельные органоиды удавалось поддерживать вкультуре около года, что дало возможность изу-чать последовательные этапы дифференцировкиотдельных клеток (Lancaster, Knoblich, 2014).Важным аргументом в пользу органоидов из кле-ток человека была демонстрация того, что в нихповторяются уникальные особенности развитиямозга человека, которые отсутствуют в развиваю-щемся мозге грызунов (Lancaster et al., 2013, 2017;Bershteyn, Kriegstein, 2013; Pamies et al., 2014; Lan-caster, Knoblich, 2014; Otani et al., 2016).

Морфологию нервных клеток в наиболее зре-лых органоидах исследовали, используя методэлектропорации GFP. Анализ показал, что клет-ки правильно ориентированы, имеют развитоедендритное древо с ведущим дендритом и общейморфологией, характерной для пирамидных кор-тикальных нейронов (Lancaster, Knoblich, 2014;Lancaster et al., 2017). Наряду с этим, в ряде иссле-дований обращено внимание на то, что в органои-дах формируется большое разнообразие нейронов,которое не регулярно повторяется от органоида корганоиду, что ставит вопрос о стандартизацииметодов культивирования (Quadrato et al., 2017).Помимо нервных клеток в органоидах развивают-ся астроциты (Paşca et al., 2015; Sloan et al., 2017;Qian et al., 2018), но редко встречаются олигоденд-роциты (Monzel et al., 2017). Это привело к отра-ботке отдельного метода индукции клеток с ис-

пользованием PDGF-AA, IGF-1 и тиреоидногогормона, и созданию “олигокортикальных” сфе-роидов (Madhavan et al., 2018). На переживающихсрезах с органоидов с помощью кальциевого ими-джинга и микроэлектродного отведения было по-казано, что нейроны физиологически функцио-нальны (Jo et al., 2016; Lancaster et al., 2017; Bireyet al., 2017; Yakoub., 2019) и формируют зрелые си-напсы (Sakaguchi et al., 2015). Специально дляизучения синапсов в органоидах методами имму-нофлуоресценции были усовершенствованы иоптимизированы методы визуализации (Yakoub,Sadek, 2018, 2019). Тот факт, что физиологическаяактивность возбуждающих и тормозных нейро-нов в кортикальных органоидах показывает ихфункциональность, хотя еще и менее зрелую посравнению с взрослыми нейронами (Pasca et al.,2015; Birey et al., 2017; Qian et al., 2018; Durens et al.,2020), свидетельствует, что нейроны, образующи-еся в органоидах, могут отражать развитие и со-зревание нейрональных функций на эмбриональ-ных стадиях in vivo.

Одно их первых исследований генетическиххарактеристик органоидов было проведеноДж. Мариани с коллегами (Mariani et al., 2012).Она, следуя протоколу (Eiraku et al., 2008) для по-лучении органоидов переднего мозга из ИПСК,продемонстрировала согласованную активациюдорсальных теленцефальных генов в органоиде, иотсутствие молекул характерных для каудальныхобластей. Проведя глобальное сравнение междутранскриптомами органоидов и образцами эм-брионального мозга человека на нескольких эта-пах развития, автор выявила поразительное соот-ветствие в экспрессии генов между теленцефаль-ными органоидами в 50 сут и корой головногомозга на 8–10 нед. развития. В последние годы,уже методами полногеномного бисульфитногосеквенирования (scRNA-seq) церебральных орга-ноидов и фетальных тканей коры плода мозга че-ловека было показано, что кортикальные клеткив органоидах используют программы экспрессиигенов, очень похожие на те, что реализуются приразвитии в ткани мозга плода человека (Campet al., 2015). Дополняют это данные транскрип-томного анализа, которые показали, что его ди-намика точно моделирует траектории экспрессиигенов в мозге плода человека в начальной и сред-ней стадии развития (Luo et al., 2016). В работахподчеркивается, что в органоидах повторяютсямногие характерные особенности развития мозгачеловека, и что на этих моделях можно исследо-вать и изменения хроматина и генетические меха-низмы развития мозга человека (Kanton et al.,2019; Trevino et al., 2020). Эти результаты допол-няются протеомными исследованиями, в кото-рых методами протеомного анализа (label-freeshotgun proteomics) проводили сравнение цере-бральных органоидов с мозгом плода человека

282



(Nascimento et al., 2019). Авторы выявили болеетрех тысяч белков, связанных со стадиями диф-ференцировки нейронов, астроцитов и олиго-дендроцитов. Базовые группы этих белков суще-ственны для развития коры мозга, они участвуютв нейрогенезе, направленном росте аксонов и си-наптогенезе, а белки глиальных клеток ответ-ственны за поддержание клеток, энергетическийобмен, межклеточные связи и передачу сигналов.Профиль изученных белков в органоидах в значи-тельной степени повторял таковой при нормаль-ном развитии мозга плода человека.

Фундаментальное значение имеют исследо-вания церебральных органоидов человека с по-зиции эволюции мозга, поскольку их сравнениес органоидами других приматов может выявитьмолекулярные пути, лежащие в основе уни-кальных специализаций человеческого мозга.Пионерские работы, проведенные в этом на-правлении, выявили в органоидах человека бо-лее двухсот дифференциально экспрессируе-мых генов, обогащенных недавней дупликациейгенов и включающих множественные регулято-ры сигнальных путей PI3K-AKT-mTOR, что от-личает их от органоидов мозга шимпанзе и ко-ры макак (Pollen et al., 2019). Это важное на-правление требует выработки стратегии дляопределения эволюционных различий междучеловеком и другими приматами, в основу ко-торой может быть положен анализ молекуляр-ных изменений, способствовавших эволюции че-ловеческого мозга, проявляющихся в цере-бральных органоидах (Giandomenico, Lancaster,2017; Heide et al., 2018; Pollen et al., 2019; Mostajo-Radji et al., 2019; Muotri, 2019).

БИОЛОГИЧЕСКИЕ КОНСТРУКЦИИИЗ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ОРГАНОИДОВ

Авторы признают, что церебральные органо-иды не полностью моделируют организациюмозга. В них достаточно случайным образомформируются разные клеточные комплексы, безнормального их взаимодействия, дающего взаи-моподчиненные структуры в норме. В отличиеот нормального развития, где из единственнойнейроэпителиальной трубки развивается всяцентральная нервная система, в органоидах воз-никает несколько нейроэпителиальных комплек-сов (объемных розеток), каждый из которых дей-ствует как независимый центр морфогенеза. Этиособенности морфогенеза ставят вопрос об усо-вершенствовании методов культивирования ор-ганоидов с целью получения более стандартизи-рованных структур. Поэтому в многих лаборато-риях ведется разработка новых методов итехнологических подходов, направленных на ре-шение этих задач (Knight et al., 2018; Yakoub,Sadek, 2018: Qian et al., 2018; Eremeev et al., 2019).

Хотя современные методы позволяют получатьткани, напоминающие различные взаимодейству-ющие между собой области мозга, их пропорция ипространственная организация весьма неодно-родны и непредсказуемы. Чтобы улучшить моде-лирование межрегиональных взаимодействий,несколько групп исследователей одновременноразработали оригинальный подход. Сначала изплюрипотентных стволовых клеток, по отдель-ности, получают органоиды определенных об-ластей мозга, которые затем соединяют вместе(Bagley et al., 2017; Birey et al., 2017; Xiang et al.,2017). Например, при ассоцииации органоидовдорсального и вентрального переднего мозгаформируются “ассемблоид” с двумя отличнымидоменами (рис. 1) (Birey et al., 2017), между кото-рыми возникают определенные клеточные взаимо-действия. Так, рожденные в вентральном доменетормозные ГАМК-ергические интернейроны ми-грировали преимущественно в направлении дор-сального домена, где доминируют возбуждающиеглютаматергические нейроны. Поведение клетокимитировало тангенциальную миграцию интер-нейронов в нормально развивающейся коре моз-га in vivo (Anderson et al., 2001). Можно полагать,что получаемые на основе плюрипотентных ство-ловых клеток человека ассемблоиды могут статьмоделью для изучения клеточных взаимодействийи перекрестных связей, которые существенны какдля нормального развития мозга, так и при разви-тии его заболеваний (Marton, Pașca, 2019).

Особый интерес представляют экспериментыс формированием аксональных связей между раз-ными типами церебральных органоидов. Первыйпример in vitro выращенных длинных кортикаль-ных аксонных трактов между органоидами мозгачеловека представлен в работе Каллена с колле-гами (Cullen et al., 2019). Авторы собрали ком-плекс из двух органоидов, представляющих раз-ные отделы коры, между которыми поместилиспециальные гидрогелевые микроколонки,предназначенные для поддержания и направле-ния роста аксонов. В результате была сформи-рована достаточно “жесткая” биоинженернаяконструкция с аксональными трактами длинойдо 1 см, которая допускала физические манипу-ляции, необходимые для ее трансплантации вмозг. Авторы обращают внимание на то, что ра-бота представляет собой первый шаг к возмож-ности реконструкции мозга с помощью специ-фичной для пациента, выращенной in vitro корти-кальной ткани с длинными аксонными трактами(Cullen et al., 2019).



РОЛЬ ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ОРГАНОИДОВВ ИЗУЧЕНИИ ПРИРОДЫ

ПАТОЛОГИЧЕСКИХ НАРУШЕНИЙМОЗГА ЧЕЛОВЕКА

Органоиды головного мозга, полученные из ин-дуцированных плюрипотентных стволовых клетокпациентов, используются для моделирования рас-стройств головного мозга, связанных с развитиемнервной системы (Chen et al., 2019; Qian et al., 2019),для проверки эффектов лекарственных средств(Aasen, Vergara, 2020) и токсинов на нервные клетки(Chhibberet al., 2020). Прогресс, достигнутый в фор-мировании органоидов мозга, имеет исключитель-ную важность для изучения природы распростра-ненных нарушений развития мозга человека. Меха-низмы развития патологий часто ищут в изменениирегуляции клеток-предшественников, включая ихпреждевременную дифференцировку, сниженнуюпролиферацию или нарушение клеточного цикла,что можно, в определенных пределах, исследоватьна церебральных органоидах.

Одно из первых нарушений развития мозга че-ловека, исследованных на церебральных органо-идах была микроцефалия – патология, при кото-рой заметно уменьшается размер мозга (Lancasteret al., 2013). Микроцефалия связана с аутосомно-рецессивными мутациями в нескольких генах,каждый из которых кодирует белки, локализую-щиеся в аппарате митотического веретена (Me-graw et al., 2011). До недавнего времени патогенезмикроцефалии исследовался на мышиной моде-ли, где так и не удалось воспроизвести сильноуменьшенный размер мозга. В противополож-ность этому, микроцефальные органоиды чело-века имели выраженное уменьшение размеров всравнении с контрольными образцами. В органо-идах уменьшался слой нейроэпителия и клетокрадиальной глии и одновременно обнаружива-лось большее число нейронов. Это свидетель-ствовало об их преждевременной дифференци-ровке нейронов, что могло объяснять изменениеразмера мозга (Lancaster et al., 2013). Нарушениякасались и ориентации веретена деления клетокрадиальной глии, что так же могло приводить кснижению числа симметричных делений и нару-шению нейрогенеза. На органоидах было выявле-но, что на клеточном уровне микроцефалия у че-ловека, скорее всего, опосредуется снижениемпродукции прогениторных клеток и преждевре-менной дифференцировкой нейронов, что в сум-ме приводит к уменьшению размеров мозга.

Недавние клинические исследования обнару-жили, что вызвать микроцефалию может вирусЗика, который во время беременности можетпроходить через плаценту и получить доступ кразвивающемуся мозгу плода (Driggers et al., 2016;Mlakar et al., 2016). Поэтому органоиды были ис-пользованы как модель разных стадий развития

плода для изучения эффектов воздействия вирусаЗика. После того как в культуру добавляли вирусЗика на сутки, было обнаружено, что церебраль-ные органоиды развивались значительно мень-шего размера. В них происходило уменьшениетолщины и размера ростовой вентрикулярной зо-ны из-за клеточной гибели и подавления проли-ферации. Выяснилось, что вирус Зика локализо-вался в незрелых нейронах и астроцитах, однакоспецифический тропизм вирус проявлял к НСК,включая клетки вРГ, что, вероятно, и являлосьпричиной патологии развития мозга (Qian et al.,2016, 2017, 2019).

Церебральные органоиды были использованыдля изучения механизмов проявления синдромаДауна, при котором одной из причин когнитив-ных нарушений является дисбаланс возбуждающейи тормозной активности кортикальных нейронов.Как известно, много тормозных ГАМК-ергическихинтернейронов возникает и мигрирует в развиваю-щуюся кору из нейроэпителия вентральной частипереднего мозга (Anderson et al., 2001), где у челове-ка экспрессируются транскрипционные факторыOLIG1 и OLIG2 (Barber, Pierani, 2016). Авторы об-наружили, что в органоидах, полученных из клетокпациентов с синдромом Дауна, присутствует из-быточное количество OLIG2+ клеток. Эти клет-ки генерируют увеличенное число определенныхтипов ГАМК-ергических интернейронов, из-зачего в коре может нарушаться баланс возбуждаю-щих и тормозных нейронов и приводить к эпи-лептиформной активности (Xu et al., 2019). На ор-ганоидах, полученных от пациентов с синдромомАнгельмана, удалось показать, что в основе эпи-лептической нестабильности у больных лежитдисфункция калиевого канала, которую вызыва-ют нарушения в гене убиквитин-белковой лигазыE3A (UBE3A) (Sun et al., 2019). В дополнение, ор-ганоиды использовали для моделирования геми-ческого повреждения коры головного мозга, ко-торое развивается вследствие человеческой цере-бральной малярии, и для тестирования лекарств,снижающих повреждение головного мозга и нев-рологические осложнения при малярии (Harbu-zariu et al., 2019).

Нужно отдавать себе отчет в том, что большин-ство нейродегенеративных заболеваний проявля-ются у взрослых и пожилых людей, вследствие чегоорганоиды, имитирующие эмбриональное разви-тие мозга, могут не подходить для моделированияих патогенеза. Тем не менее, в настоящее время визучении патогенеза многих нейродегенератив-ных процессов получили важную роль исследо-вания, связанные именно с развитием нервнойсистемы, поэтому органоиды могут быть полез-ны и для патологий, проявляющихся с возрас-том (Faravelli et al., 2020). Удивительным образом,но уже в органоидах, созданных на основе клетокпациентов с болезнью Альцгеймера, проявляются

284



такие характерные возрастные патологическиепризнаки, как накопление амилоидных бляшек инейрофибриллярных клубков, что позволяет их ис-пользовать как модельные системы (Raja et al.,2016; Seo et al., 2017; Gonzalez et al., 2018). На орга-ноидах можно частично моделировать даже бо-лезнь Паркинсона. Известно, что допаминовыенейроны, дифференцированные из человеческихплюрипотентных стволовых клеток в адгезивныхусловиях in vitro, не повторяют некоторых осо-бенностей нейронов среднего мозга in vivo. Напри-мер, они не продуцируют пигмент нейромеланин,если только “старение” не вызвано искусственно,посредством экспрессии ассоциированного с забо-леванием прогерина (Miller et al., 2013). Исходя изэтого, был разработан протокол получения орга-ноидов среднего мозга, в которых развивалиськлетки экспрессирующие нейромеланин, струк-турно сходный с выделенным из черной субстан-ции мозга человека (Jo et al., 2016). Показано также,что органоиды среднего мозга, в которых развива-ются TH-позитивные допаминергические нейро-ны, при фармакологической индукции нейродеге-нерации могут служить подходящей моделью бо-лезни Паркинсона (Qian et al., 2016; Jo et al., 2016;Monzel et al., 2017). Считается, что исследование ор-ганоидов, полученных от пациентов с болезньюПаркинсона, может дать уникальную возмож-ность непосредственно исследовать патогенныемеханизмы и тестировать лекарственные соеди-нения в нейронах человека (Marotta et al., 2020).

С целью изучения развития нервно-мышеч-ных патологий, например, миастении были раз-работаны методы получения нервно-мышечныхорганоидов в которых развиваются функцио-нальные нервно-мышечные соединения в ком-плексе с Шванновскими клетками. Использова-ние таких органоидов даст возможность модели-ровать нервно-мышечных заболевания в будущем(Faustino Martins et al., 2020).

Церебральные органоиды человека могут пред-ставлять интересную модельную систему для изуче-ния широкого спектра лекарственных препаратов.На них были изучены эффекты галлюциногенноймолекулы 5-метокси-N,N-диметилтриптамина(5-MeO-DMT) на белковый состав 45 сут цере-бральных органоидов человека (Dakic et al., 2017).После воздействия 5-МеO-DMT в течение 24 ч,из 6728 идентифицированных белков 934 экс-прессировались отличным от контроля образом.В опытных органоидах снижалась регуляция сиг-нальных путей NFAT и NF-kB, что свидетельство-вало о противовоспалительных эффектах, и наблю-далась модификация белков связанных с организа-цией микротрубочек и цитоскелета, участвующегов формировании дендритных шипиков. О защит-ной функции препарата свидетельствовало сниже-ние белков клеточной гибели и путей нейродегене-рации. Интересно, что этот лекарственно-зависи-

мый паттерн экспрессии белка наблюдался только в3D органоидной модели мозга, но не в двумерныхклеточных культурах нейронов (Dakic et al., 2017).В другой работе церебральные органоиды челове-ка использовали для изучения пренатальноговлияния метамфетамина на развитие мозга плода.Исследование с использованием одноклеточногоРНК-секвенирования (scRNA-seq) показало из-менения транскрипции в астроцитах и нейрон-ных предшественниках. Авторы обнаружили по-вышенную регуляцию генов раннего ответа, фак-торов комплемента, апоптоза и генов иммунногоответа, что указывало на активацию нейровоспа-лительного ответа регулирующего пролифера-цию, дифференцировку и гибель нервных ство-ловых клеток. Метамфетамин-индуцированныеизменения в экспрессии нейровоспалительных ицитокиновых генов, показанные на уровне РНКи белка, свидетельствовали, что органоиды чело-века представляют собой модельную систему дляизучения лекарственно-индуцированного воспа-ления в ЦНС (Dang et al., 2020).

Органоиды можно применять и в другой сфе-ре, исследовать на них нейротоксичность, напри-мер, моделировать воздействие тяжелых метал-лов на плод (Chhibber et al., 2020). Кроме того, ор-ганоиды используют и для получения и изученияопухолей, без трансплантации опухолевых клетоклабораторным животным (Chenetal., 2019).

ОСОБЕННОСТИ ТКАНЕВОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ОРГАНОИДОВ, ПРОБЛЕМА

ВАСКУЛЯРИЗАЦИИ, И ВОЗМОЖНОСТЬИХ ТРАНСПЛАНТАЦИИ IN VIVO

Определенно, что церебральные органоиды,имитирующие ряд аспектов нейрогенеза мозгачеловека, подобно всем другим модельным си-стемам, имеют ряд ограничений. Одна из про-блем связана с тем, что в церебральных органоидахпрактически отсутствуют мезенхимные клетки, вчастности микроглия и эндотелиоциты, которыенеобходимы для нормального развития и функци-онирования нервной ткани. Клетки микроглии,происходящие от эритромиелодных предшествен-ников желточного мешка, в раннем эмбриогенезезаселяют мозг и, являясь медиатором воспаления,выполняют иммунную функцию при повреждениии нейродегенерации. О значении васкуляризациинет смысла говорить, поскольку очевидно, чтобез развития сосудистой системы жизнеспособ-ность церебральных органоидов резко ограниче-на. К решению этой “тканевой” проблемы подо-шли следующим образом, использовали раздель-ное культивирование клеток микроглии илиэндотелиальных клеток, после чего их соединялис мозговыми органоидами. Интересен пример со-культивирования изогенных микроглиоподоб-ных клеток с органоидами дорсального переднего



мозга. В результате миграции микроглии внутрьорганоидов в них усиливалась иммунная функ-ция, активировалась передача сигналов mTOR иp53, повышалась экспрессия лигандов Notch, ак-тивировалась репрессия NF-κB и каноническихпутей Wnt (Bejoy et al., 2019). Кроме сокультивиро-вания, путем манипулирования разными добавка-ми к среде культивирования (bFGF, ROCK-inhibi-tor Y-27632, neural induction medium) оказалосьвозможным получить церебральные органоиды смикрогиальными клетками, которые развивалисьиз мезенхимных закладок одновременно с ней-ральными клетками (Ormel et al., 2018). Авторыотмечают, что иммунологическая микросреда,приближенная к нормальной за счет ассоциациимикроглии в кортикальные органоиды in vitro,позволит намного лучше воспроизводить функ-цию мозговой ткани in vivo, что необходимо дляадекватного моделирования заболеваний и скри-нинга лекарств (Ormel et al., 2018; Bejoy et al.,2019).

Подобным образом эндотелиальные клеткиможно культивировать отдельно и добавлять корганоидам на стадии формирования эмбриоид-ных тел, что дает возможность эндотелиоцитамсамоорганизоваться с образованием сетчатыхструктур (Nzou et al., 2018; Pham et al., 2018).Кроме того, рост сосудов можно индуцироватьдобавкой в эмбриоидные тела фактора роста эн-дотелия сосудов (VEGF), который активируетдифференцировку эндотелиальных клеток, неблокируя нейрональную дифференцировку. В ре-зультате успешно развиваются церебральные ор-ганоиды с сосудистыми структурами, клетки ко-торых экспрессируют маркер эндотелия CD31 имаркер плотных контактов клаудин-5, характери-зующий гематоэнцефалический барьер (Hamet al., 2020). Хотя примитивные эндотелиальныесети оказались неспособными нормально функ-ционировать и обеспечивать доставку питатель-ных веществ в органоиды, сами эти исследованиядают потенциальную платформу для моделирова-ния нейроваскулярной ниши и гематоэнцефали-ческого барьера (Nzou et al., 2018; Pham et al., 2018;Ham et al., 2020).

Очевидно, что в органоиде по мере генерациибольшого числа нейронов кортикальная пластин-ка утолщается и отсутствие васкуляризации ухуд-шает выживаемость клеток, ограничивается раз-мер органоида и нарушает общую структуру ткани(Shen et al., 2004; Yin et al., 2016). Для васкуляриза-ции органоида была предпринята имплантация вживой мозг с целью провоцирования их васкуля-ризации для долгосрочного выживания (Mansouret al., 2018). Трансплантированные в полость, сде-ланную в коре головного мозга иммунодефицит-ных мышей, GFP чЭСК органоиды интегрирова-лись, и 80% из них переживало не менее 120 сут.Их отличительной морфологической чертой бы-

ло формирование четко выраженных нейроэпи-телиальных слоев и желудочковых зон. Крове-носные сосуды хозяина проникали на 7–10 день,и органоиды становились сильно васкуляризо-ванными на 14 день. С помощью двуфотонноймикроскопии авторы показали, что через сосудыидет активный кровоток, и ткани органоидаснабжаются кровью. Отдельные трансплантаты,выжившие до 233 сут (последний срок, протести-рованный в исследовании), показали постоян-ную экспрессию в нейронах NeuN и SOX2. Числомеченых hGFAP астроцитов, которых до транс-плантации в органоидах было минимально, послеинтеграции значительно возрастало со временем.Кроме того, на средних и поздних сроках, в транс-плантированных органоидах были выявлены оли-годендроциты Olig2+, однако миелинизации небыло обнаружено. О формировании синаптиче-ских контактов в трансплантированном органоидесвидетельствовала колокализация преснаптиче-ского маркера Synapsin I и постсинаптическогоPSD95. Микроглия Iba1 мигрировала из тканимозга хозяина в органоид. На 90 сутки обнаружи-вался обширный рост аксонов GFP+ человека изорганоида, и волокна распространялись в обоихполушариях мозга мыши, хотя в ипсилатераль-ном их было значительно больше. Кроме того,обнаруживались синапсы между нейронами че-ловека и мыши. Функциональную активностьнейронов трансплантатов подтвердили, исполь-зуя кальцевый имиджинг, методы оптогенетики иэлектрофизиологии.

В другом исследовании церебральные органо-иды из ИПСК человека сокультивировали с эн-дотелиальными клетками, выращенными от тогоже донора (Harding et al., 2017; Pham et al., 2018).Затем “васкуляризованные” органоиды транс-плантировали в полость в коре мозга иммуноде-фицитных мышей. Через две недели в некоторыхорганоидах наблюдалась сильная васкуляризациявплоть до центра, а неваскуляризованные органо-иды не переживали. После трансплантации чело-веческие CD31-позитивные кровеносные сосудысохранялись внутри и в центре органоида, чтосвидетельствовало о том, что васкуляризация ор-ганоидов головного мозга с помощью ИПСК, по-лученных от того же пациента, технически воз-можна. Недостатком этого исследования являет-ся то, что авторы не доказали ни связь междукапиллярами в органоидах человеческого мозга имозгом мыши хозяина, ни перфузию человече-ских капилляров кровью грызунов (Pham et al.,2018). Иную цель преследовала работа (Daviaudet al., 2018), где из чЭСК в культуре получали иНСК и церебральные органоиды, которые транс-плантировали в виде суспензии, либо целиком вкору постнатальных (П8-10) мышей. Сравниваливыживаемость трансплантатов, их васкуляриза-цию, пул НСК и дифференцировку через две и

286



четыре недели после трансплантации. Транс-плантаты НСК значимо уменьшались в размерахв интервале от двух до четырех недель после пере-садки, тогда как размеры церебральных органои-дов оставались стабильными в течение этого пе-риода, что подтверждало их лучшую интеграциюв сравнении с суспензированными клетками. Че-рез 2 недели в обоих видах трансплантатов хозяй-ских Iba1 клеток микроглии было мало, но через4 нед. микроглии было много вокруг трансплан-тата суспензии, хотя у органоида их было относи-тельно немного. Васкуляризацию изучали помаркеру эндотелиальных клеток CD31, и обнару-жили множество капилляров в органоиде, враста-ющих со стороны реципиента уже через две неде-ли. В результате оказалось, что в сравнении странсплантатом суспензированных НСК, орга-ноиды лучше переживают и интегрируются, в нихбольше DCX+ и NF+ нейронов, и лучше выраже-ны собственные астроциты и олигодендроциты(Daviaud et al., 2018).

В следующих работах церебральные органои-ды уже использовали для трансплантации в мозгпосле инсульта (Wang et al., 2019). Авторы подса-живали органоид в мозг крыс через 6 ч или даже24 ч после окклюзии средней мозговой артерии, ипоказали значительное уменьшение объема ин-фаркта мозга и улучшение двигательной функ-ции. Это пилотное исследование показало, чтопотенциально органоиды могут быть использова-ны для терапии при лечении инсульта.

Суммируя работы по трансплантации цере-бральных органоидов человека в мозг грызунов,необходимо обратить внимание на то, что основойорганоидов являются малодифференцированныеклетки, обладающих огромным потенциалом раз-вития, находящиеся в архитектурно целостномкомплексе. В органоидах прекрасно развит внекле-точный матрикс, являющийся источником нерас-творимых и растворимых белков с нейротрофина-ми, факторами роста, навигации и т.д. Именно этодает органоидам преимущество перед суспензиро-ванными НСК в интеграции при трансплантациив полость мозга. Целостные органоиды из-забольшого объема пересаживают в заранее приго-товленную полость в мозге. Однако можно пред-положить, что еще лучше органоид будет разви-ваться в естественных полостях мозга, например,в боковых желудочках (Pothayee et al., 2018), чемубудет способствовать цереброспинальная жид-кость, которая служит важным компонентом ни-ши НСК и важна для поддержания пролифера-тивной активности и дифференцировки раннихклеток-предшественников (Lehtinen et al., 2011).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. ОГРАНИЧЕНИЯИ ПЕРСПЕКТИВЫ В ИССЛЕДОВАНИИ

ЦЕРЕБРАЛЬНЫХ ОРГАНОИДОВМоделирование процесса формирования моз-

га путем построения его органоидов открываетперспективы изучения механизмов раннего эм-брионального развития в норме и при патологии,которые представляют особую проблему для че-ловека. До настоящего времени морфология иразвитие человеческого мозга не могут быть пол-ностью воспроизведены на животных моделях, агеномные, метаболические и биохимические раз-личия ограничивают прогностическую возмож-ность трансляционных исследований. За послед-ние годы были достигнуты значительные успехи вразработке методов культивирования 3D органо-идов мозга человека. Несомненное преимуще-ство органоидов, полученных из ЭСК или ИСПКчеловека, состоит в том, что в них воспроизводятсяуникальные особенности развития человеческогомозга, которые отсутствуют в развивающемся мозгегрызунов. Способность ЭСК и ИПСК к самоорга-низации в процессе нейрализации, и повторениеалгоритмов, свойственных нормальному развитию,делает органоиды уникальной моделью развитиямозга человека. Тем не менее, органоиды из кле-ток мыши, по-прежнему играют важную роль,поскольку они могут использоваться для сравни-тельных исследований человеческих органоидови разработки предварительных протоколов куль-тивирования для получения специфичных обла-стей мозга (Marshall, Mason, 2019). Несмотря навсю привлекательность органоидных моделей,очевидно, что на данном этапе существующиеограничения препятствуют их использованию вопределенных направлениях. Так, например, су-ществует много методов получения органоидов,но не один из них не позволяет получать стабиль-но повторяющиеся структуры из-за спонтаннойдифференцировки клеток. В органоидах развер-тываются ранние этапы развития мозга, в то вре-мя как более поздние стадии развития, характе-ризующиеся ростом нервных волокон и форми-рованием высших функций нейронной сети, немогут быть адекватно воспроизведены в этихструктурах. Кроме того, технологии полученияорганоидов не лишены недостатков и ограниче-ний, например, в них не происходит дифферен-цировка сосудов и капиллярной сети, обеспечи-вающих трофическую поддержку ткани мозга, и,в ряде случаев, играющих роль скаффолда примиграции клеток. Точно так же клетки микро-глии, которые происходят из эритромиелодныхпредшественников желточного мешка и заселяютмозг в раннем эмбриогенезе, отсутствуют в орга-ноидах, хотя их роль как медиатора воспаления иодного из ключевых игроков при повреждении инейродегенерации чрезвычайно важна. Крометого, существуют некоторые этические пробле-



мы, касающиеся источников клеток, которые ис-пользуются для получения органоидов, и потен-циального применения этих органоидов в орга-низме человека (Hyun et al., 2020).

Насчитывая менее чем десятилетнюю историю,технология получения и исследования органоидовмозга человека заняли важное место в нейробио-логии. Несмотря на существование множествапроблем, и нерешенных вопросов, можно ожи-дать, что исследования 3D органоидов – уникаль-ной модели развития мозга человека приведет кболее глубокому пониманию фундаментальныхмеханизмов эмбрионального нейрогенеза, разви-тия заболеваний и персонализированному лече-нию расстройств мозга.

БЛАГОДАРНОСТИАвторы выражают благодарности коллегам за об-

суждение и рекомендации при написании обзора.

ФИНАНСИРОВАНИЕРабота выполнена при поддержке Российского на-

учного фонда (проект № 19-74-00117).


Настоящий обзор не содержит описания выпол-ненных авторами исследований с участием людей илииспользованием животных в качестве объектов.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВАвторы заявляют, что какой-либо конфликт инте-

ресов отсутствует.

ВКЛАД АВТОРОВАвторы внесли одинаковый вклад в подготовку и

написание текста обзора.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫAasen D.M., Vergara M.N. New drug discovery paradigms

for retinal diseases: A focus on retinal organoids //J. Ocul. Pharmacol. Ther. 2020. V. 36. № 1. P. 18–24.

Aleksandrova M.A., Podgornyi O.V., Poltavtseva R.A. et al.Structure and cell composition of spheres cultured fromhuman fetal retina // Bull. Exp. Biol. Med. 2006. V. 142.№ 1. P. 9

Altman J., Das G.D. Post-natal origin of microneurones in therat brain // Nature. 1965. V. 207. № 5000. P. 953–956.

Altman J. Autoradiographic and histological studies of post-natal neurogenesis. 3. Dating the time of production andonset of differentiation of cerebellar microneurons inrats // J. Comp. Neurol. 1969. V. 136. № 3. P. 269–293.

Anderson S.A., Marín O., Horn C. et al. Distinct cortical mi-grations from the medial and lateral ganglionic emi-nences // Development. 2001. V. 128. P. 353–363.

Avior Y., Sagi I., Benvenisty N. Puripotent stem cells in dis-ease modelling and drug discovery // Nat. Rev. Mol.Cell. Biol. 2016. V. 17. № 3. P. 10–82.

Bagley J.A., Reumann D., Bian S. et al. Fused cerebral or-ganoids model interactions between brain regions //Nat. Methods. 2017. V. 14. № 7. P. 743–751.

Barber M., Pierani A. Tangential migration of glutamatergicneurons and cortical patterning during development:Lessons from Cajal-Retzius cells // Dev. Neurobiol.2016. V. 76. № 8. P. 847–881.

Bejoy J., Yuan X, Song L. et al. Genomics analysis of meta-bolic pathways of human stem cell-derived microglia-like cells and the integrated cortical spheroids // Stem.Cells. Int. 2019. V. 18: 2382534.

Bershteyn M., Kriegstein A.R. Cerebral organoids in a dish:progress and prospects // Cell. 2013. V. 155. № 1. P. 19–20.

Bershteyn M., Nowakowski T.J., Pollen A.A. et al. HumaniPSC-derived cerebral organoids model cellular fea-tures of lissencephaly and reveal prolonged mitosis ofouter radial glia // Cell Stem. Cell. 2017. V. 20. № 4.P. 435–449.e4.

Bertacchi M., Pandolfini L., D’Onofrio M. et al. The doubleinhibition of endogenously produced BMP and Wntfactors synergistically triggers dorsal telencephalic dif-ferentiation of mouse ES cells // Dev. Neurobiol. 2015.V. 75. № 1. P. 66–79.

Birey F., Andersen J., Makinson C.D. et al. Assembly of func-tionally integrated human forebrain spheroids // Na-ture. 2017. V. 545. № 7652. P. 54–59.

Camp J.G., Badsha F., Florio M. et al. Human cerebral or-ganoids recapitulate gene expression programs of fetalneocortex development // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.2015. V. 112. № 51. P. 15672–15677.

Campbell K., Götz M., Radial glia: multi-purpose cells forvertebrate brain development // Trends of Neurosci-ence. 2002. V. 25. № 5. P. 235–238.

Carpenter M.K., Cui X., Hu Z.Y. et al. In vitro expansion ofa multipotent population of human neural progenitorcells // Exp. Neurol. 1999. V. 158. № 2. P. 265–278.

Cavanaugh M.W. Neuron development from trypsin-disso-ciated cells of differentiated spinal cord of the chick em-bryo // Exp. Cell. Res. 1955. V. 9. № 1. P. 42–48.

Chambers S.M., Fasano C.A., Papapetrou E.P. et al. Highlyefficient neural conversion of human ES and iPS cells bydual inhibition of SMAD signaling // Nat. Biotechnol.2009. V. 27. № 3. P. 275–280.

Chambers J.M., McKee R.A., Drummond B.E. et al. Evolvingtechnology: creating kidney organoids from stem cells //AIMS Bioeng. 2016. V. 3. № 3. P. 305–318.

Chen H.I., Song H., Ming G.L. Applications of human brainorganoids to clinical problems // Dev. Dyn. 2019. V. 248.№ 1. P. 53–64.

Chhibber T., Bagchi S., Lahooti B. et al. CNS organoids: aninnovative tool for neurological disease modeling anddrug neurotoxicity screening // Drug. Discov. Today.2020. V. 25. № 2. P. 456–465.

Chichagova V., Dorgau B., Felemban M. et al. Differentiation ofretinal organoids from human pluripotent stem cells //Curr. Protoc. Stem. Cell. Biol. 2019. V. 50. № 1:e95.

288



Cullen D.K., Gordián-Vélez W.J., Struzyna L.A. et al. Bundledthree-dimensional human axon tracts derived from brainorganoids // i Science. 2019. № 21. P. 57–67.

Curchoe C.L., Russo J., Terskikh A.V. hESC derived neuro-epithelial rosettes recapitulate early mammalian neuru-lation events; an in vitro model // Stem. Cell. Res. 2012.V. 8. № 2. P. 239–246.

Dakic V., Minardi Nascimento J., Costa Sartore R. et al.Short term changes in the proteome of human cerebralorganoids induced by 5-MeO-DMT // Sci. Rep. 2017.V. 7. № 1. P. 12863.

Dang J., Tiwari S.K., Agrawal K. et al. Glial cell diversity andmethamphetamine-induced neuroinflammation in hu-man cerebral organoids // Mol. Psychiatry. 2020. Feb 12. https://doi.org/10.1038/s41380-020-0676-x

Daviaud N., Friedel R.H., Zou H. Vascularization and engraft-ment of transplanted human cerebral organoids in mousecortex // eNeuro. 2018. V. 5. № 6. pii: ENEURO.0219-18.2018.

Driggers R.W., Ho C.Y., Korhonen E.M., et al. Zika virus in-fection with prolonged maternal viremia and fetal brainabnormalities // N. Engl. J. Med. 2016. V. 374. № 22.P. 2142–2151.

Durens M., Nestor J., Williams M. et al. High-throughputscreening of human induced pluripotent stem cell-de-rived brain organoids // J. Neuro Sci. Methods. 2020.Feb. 4:108627.

Edri R., Yaffe Y., Ziller M.J. et al. Analysing human neuralstem cell ontogeny by consecutive isolation of Notch ac-tive neural progenitors // Nat. Commun. 2015. Mar. 23;6:6500.

Eiraku M., Watanabe K., Matsuo-Takasaki M. et al. Self-or-ganized formation of polarized cortical tissues fromESCs and its active manipulation by extrinsic signals //Cell. Stem. Cell. 2008. V. 3. № 5. P. 519–532.

Eiraku M., Takata N., Ishibashi H. et al. Self-organizing op-tic-cup morphogenesis in three-dimensional culture //Nature. 2011. V. 472. № 7341. P. 51–56.

Elkabetz Y., Studer L. Human ESC-derived neural rosettesand neural stem cell progression // Cold. Spring. Harb.Symp. Quant. Biol. 2008. № 73. P. 377–387.

Eremeev A.V., Volovikov E.A., Shuvalova L.D. et al. “Neces-sity is the mother of invention” or inexpensive, reliable,and reproducible protocol for generating organoids //Biochemistry (Mosc). 2019. V. 84. № 3. P. 321–328.

Evans M.J., Kaufman M.H. Establishment in culture of plu-ripotential cells from mouse embryos // Nature. 1981.V. 292. № 5819. P. 154–156.

Faravelli I., Costamagna G., Tamanini S. et al. Back to theorigins: Human brain organoids to investigate neurode-generation // Brain Res. 2020. Jan. 15; 1727:146561.

Faustino Martins J.M., Fischer C., Urzi A. et al. Self-organiz-ing 3D human trunk neuromuscular organoids // Cell.Stem. Cell. 2020. V. 26. № 2. P. 172–186.

Fietz S.A., Huttner W.B. Cortical progenitor expansion, self-renewal and neurogenesis-a polarized perspective //Curr. Opin. Neurobiol. 2011. V. 21. № 1. P. 23–35.

Florio M., Albert M., Taverna E. et al. Human-specific geneARHGAP11B promotes basal progenitor amplificationand neocortex expansion // Science. 2015. № 347. P. 470.

Florio M., Heide M., Pinson A. et al. Evolution and cell-typespecificity of human-specific genes preferentially ex-pressed in progenitors of fetal neocortex // Elife. 2018.Mar. 21. 7. pii: e32332.

Gerrard L., Rodgers L., Cui W. Differentiation human em-bryonic stem cells to neural lineages in adherent cultureby blocking bone morphogenetic protein signaling //Stem Cells. 2005. Oct.; 23(9): 1234–1241.

Giandomenico S.L., Lancaster M.A. Probing human brainevolution and development in organoids // Curr. Opin.Cell. Biol. 2017. V. 44. P. 36–43.

Gonzalez C., Armijo E., Bravo-Alegria J. et al. Modeling am-yloid beta and tau pathology in human cerebral organ-oids // Mol. Psychiatry. 2018. V. 23. № 12. P. 2363–2374.

Ham O., Jin Y.B., Kim J. et al. Blood vessel formation in ce-rebral organoids formed from human embryonic stemcells // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2020. V. 521.№ 1. P. 84–90.

Hansen D.V., Lui J.H., Parker P.R. et al. Neurogenic radial gliain the outer subventricular zone of human neocortex //Nature. 2010. V. 464. № 7288. P. 554–561.

Harbuzariu A., Pitts S., Cespedes J.C. et al. Modelling heme-mediated brain injury associated with cerebral malariain human brain cortical organoids // Sci. Rep. 2019.V. 9. № 1. P. 19162.

Harding A., Cortez-Toledo E., Magner N.L. et al. Highly ef-ficient differentiation of endothelial cells from pluripo-tent stem cells requires the MAPK and the PI3K path-ways // Stem. Cells. 2017. V. 35. № 4. P. 909–919.

Harrison R.G. Observations of the living developing nervefiber // Anat. Rec. 1907. V. 1. № 5. P. 116–128.

Heide M., Huttner W.B., Mora-Bermúdez F. Brain organoidsas models to study human neocortex development andevolution // Curr. Opin. Cell. Biol. 2018. № 55. P. 8–16.

He Z., Han D., Efimova O. et al. Comprehensive transcrip-tome analysis of neocortical layers in humans, chimpan-zees and macaques // Nat. Neurosci. 2017. V. 20. № 6.P. 886–895.

Hogue M.J. Tissue cultures of the brain; intercellular gran-ules // J. Comp. Neurol. 1946. V. 85. № 3. P. 519–530.

Homem C.C., Repic M., Knoblich J.A. Proliferation controlin neural stem and progenitor cells // Nat. Rev. Neuro-sci. 2015. V. 16. № 11. P. 647–659.

Hong Y.J., Do J.T. Neural lineage differentiation from plu-ripotent stem cells to mimic human brain tissues // Front.Bioeng. Biotechnol. 2019. Dec. 6. 7: 400.

Hyun I., Scharf-Deering J.C., Lunshof J.E. Ethical issues re-lated to brain organoid research // Brain Res. 2020. Feb. 1:146653.

Itsykson P., Ilouz N., Turetsky T. et al. Derivation of neuralprecursors from human embryonic stem cells in thepresence of noggin // Mol. Cell. Neurosci. 2005. V. 30.P. 24–36.

Jo J., Xiao Y., Sun A.X. et al. Midbrain-like organoids fromhuman pluripotent stem cells contain functional dopami-nergic and neuromelanin-producing neurons // Cell.Stem. Cell. 2016. V. 19. № 2. P. 248–257.

Kanton S., Boyle M.J., He Z. et al. Organoid single-cell ge-nomic atlas uncovers human-specific features of brain de-velopment // Nature. 2019. V. 574. № 7778. P. 418–422.



Kadoshima T., Sakaguchi H., Nakano T. et al. Self-organi-zation of axial polarity, inside-out layer pattern, andspecies-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013.V. 110. № 50. P. 20284–20289.

Knight G.T., Lundin B.F., Iyer N. et al. Engineering induc-tion of singular neural rosette emergence within hPSC-derived tissues // Elife. 2018. Oct. 29; 7. pii: e37549.

Koo B., Choi B., Park H. et al. Past, present, and future ofbrain organoid technology // Mol. Cells. 2019. V. 42.№ 9. P. 617–627.

Lancaster M.A., Renner M., Martin C.A. et al. Cerebral or-ganoids model human brain development and micro-cephaly // Nature. 2013. V. 501. № 7467. P. 373–379.

Lancaster M.A., Corsini N.S., Wolfinger S. et al. Guided self-organization and cortical plate formation in humanbrain organoids // Nat. Biotechnol. 2017. V. 35. № 7.P. 659–666.

Lancaster M.A., Knoblich J.A. Generation of cerebral or-ganoids from human pluripotent stem cells // Nat. Pro-toc. 2014. V. 9. № 10. P. 2329–2340.

Lehtinen M.K., Zappaterra M.W., Chen X. et al. The cere-brospinal f luid provides a proliferative niche for neuralprogenitor cells // Neuron. 2011. V. 69. № 5. P. 893–905.

Luo C., Lancaster M.A., Castanon R. et al. Cerebral organ-oids recapitulate epigenomic signatures of the humanfetal brain // Cell Rep. 2016. V. 17. № 12. P. 3369–3384.

Lui J.H., Hansen D.V., Kriegstein A.R. Development andevolution of the human neocortex // Cell. 2011. V. 146.№ 1. P. 18–36.

Mak I.W., Evaniew N., Ghert M. Lost in translation: animalmodels and clinical trials in cancer treatment // Am.J. Transl. Res. 2014. V. 6. P. 114–118.

Mansour A.A.F., Gonçalves J.T., Bloyd C.W. et al. An in vivomodel of functional and vascularized human brain or-ganoids // Nat. Biotechnol. 2018. V. 36. P. 432–441.

Mariani J., Simonini M.V., Palejev D. et al. Modeling humancortical development in vitro using induced pluripotentstem cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V. 109.№ 31. P. 12770–12775.

Marotta N., Kim S., Krainc D. Organoid and pluripotentstem cells in Parkinson’s disease modeling: an expertview on their value to drug discovery // Expert Opin.Drug. Discov. 2020. Jan. 3. P. 1–15.

Marshall J.J., Mason J.O. Mouse vs man: Organoid models ofbrain development & disease // Brain Res. 2019. Dec. 1;1724: 146427.

Marton R.M., Paşca S.P. Neural differentiation in the thirddimension: Generating a human midbrain // Cell.Stem. Cell. 2016. V. 19. № 2. P. 145–146.

Megraw T.L., Sharkey J.T., Nowakowski R.S. Cdk5rap2 expos-es the centrosomal root of microcephaly syndromes //Trends Cell Biol. 2011. V. 21. № 8. P. 470–480.

Miller J.D., Ganat Y.M., Kishinevsky S. et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-in-duced aging // Cell. Stem. Cell. 2013. V. 13. № 6.P. 691–705.

Mlakar J., Korva M., Tul N. et al. Zika virus associated withmicrocephaly // N. Engl. J. Med. 2016. V. 374. № 10.P. 951–958.

Moscona A. Effect of temperature on adhesion to glass andhistogenetic cohesion of dissociated cells // Nature.1961. V. 190. P. 408–409.

Monzel A.S., Smits L.M., Hemmer K. et al. Derivation of hu-man midbrain-specific organoids from neuroepithelialstem cells // Stem. Cell. Reports. 2017. V. 8. № 5.P. 1144–1154.

Mostajo-Radji M.A., Schmitz M.T., Montoya S.T. et al. Re-verse engineering human brain evolution using organoidmodels // Brain. Res. 2019. Feb. 15; 1729: 146582.

Muñoz-Sanjuán I., Brivanlou A.H. Neural induction, thedefault model and embryonic stem cells // Nat. Rev.Neurosci. 2002. V. 3. P. 271–280.

Muotri A.R. Brain organoids and insights on human evolu-tion // F1000Res. 2019. May 30;8. pii: F1000 FacultyRev-760.

Nascimento J.M., Saia-Cereda V.M., Sartore R.C. et al. Hu-man cerebral organoids and fetal brain tissue share pro-teomic similarities // Front. Cell. Dev. Biol. 2019.Nov. 28. 7: 303.

Nowakowski T.J., Rani N., Golkaram M. et al. Regulationof cell-type-specific transcriptomes by microRNAnetworks during human brain development // Nat.Neurosci. 2018. V. 21. № 12. P. 1784–1792.

Nzou G., Wicks R.T., Wicks E.E. et al. Human cortexspheroid with a functional blood brain barrier for high-throughput neurotoxicity screening and disease mod-eling // Sci. Rep. 2018. V. 8. № 1. P. 7413.

Oberheim N.A., Takano T., Han X. et al. Uniquely hominidfeatures of adult human astrocytes // J. Neurosci. 2009.V. 29. № 10. P. 3276–3287.

Ormel P.R., Vieira de Sá R., van Bodegraven E.J. et al. Mi-croglia innately develop within cerebral organoids //Nat. Commun. 2018. V. 9. № 1. P. 4167.

Otani T., Marchetto M.C., Gage F.H. et al. 2D and 3D stemcell models of primate cortical development identifyspecies-specific differences in progenitor behavior con-tributing to brain size // Cell. Stem. Cell. 2016. V. 18.№ 4. P. 467–480.

Pacitti D., Privolizzi R., Bax B.E. Organs to cells and cells toorganoids: The evolution of in vitro central nervous sys-tem modelling // Front. Cell. Neurosci. 2019. Apr. 9. V. 13.P. 129.

Pamies D., Hartung T., Hogberg H.T. Biological and medicalapplications of a brain-on-a-chip // Exp. Biol. Med.(Maywood). 2014. V. 239. № 9. P. 1096–1107.

Paşca A.M., Sloan S.A., Clarke L.E. et al. Functional corti-cal neurons and astrocytes from human pluripotent stemcells in 3D culture // Nat. Methods. 2015. V. 12. № 7.P. 671–678.

Podgornyi O.V., Poltavtseva R.A., Marei M.V. et al. Forma-tion of neuroepithelial structures in culture of neuralstem cells from human brain // Bull. Exp. Biol. Med.2005. V. 140. № 1. P. 113–117.

Prodromidou K., Matsas R. Species-specific miRNAs in hu-man brain development and disease // Front. Cell. Neu-rosci. 2019. Dec. 18; 13: 559.

Perrin S. Preclinical research: make mouse studies work //Nature. 2014. V. 507. P. 423–425.

290



Pham M.T., Pollock K.M., Rose M.D. et al. Generation ofhuman vascularized brain organoids // Neuroreport.2018. V. 29. № 7. P. 588–593.

Pollen A.A., Nowakowski T.J., Chen J. et al. Molecular iden-tity of human outer radial glia during cortical develop-ment // Cell. 2015. V. 163. № 1. P. 55–67.

Pollen A.A., Bhaduri A., Andrews M.G. et al. Establishing ce-rebral organoids as models of human-specific brain evo-lution // Cell. 2019. V. 176. № 4. P. 743–756.e17.

Pothayee N., Maric D., Sharer K. et al. Neural precursorcells form integrated brain-like tissue when implantedinto rat cerebrospinal f luid // Commun. Biol. 2018.Aug. 14. № 1. P. 114.

Qian X., Nguyen H.N., Song M.M. et al. Brain-region-spe-cific organoids using mini-bioreactors for modelingZIKV exposure // Cell. 2016. V. 165. № 5. P. 1238–1254.

Qian X., Nguyen H.N., Jacob F. et al. Using brain organoidsto understand Zika virus-induced microcephaly // De-velopment. 2017. V. 144. № 6. P. 952–957.

Qian X., Jacob F., Song M.M. et al. Generation of humanbrain region-specific organoids using a miniaturizedspinning bioreactor // Nat. Protoc. 2018. V. 13. № 3.P. 565–580.

Qian X., Song H., Ming G.L. Brain organoids: advances, ap-plications and challenges // Development. 2019. V. 146.№ 8. pii: dev166074.

Quadrato G., Nguyen T., Macosko E.Z. et al. Cell diversityand network dynamics in photosensitive human brainorganoids // Nature. 2017. V. 545. № 7652. P. 48–53.

Ranga A., Girgin M., Meinhardt A. et al. Neural tube mor-phogenesis in synthetic 3D microenvironments // Proc.Natl. Acad. Sci. USA. 2016. V. 113. № 44. E6831–E6839.

Raja W.K., Mungenast A.E., Lin Y.T. et al. Self-organizing3D human neural tissue derived from induced pluripo-tent stem cells recapitulate Alzheimer’s disease pheno-types // PLoS One. 2016. V. 11. № 9. e0161969.

Reynolds B.A., Weiss S. Clonal and population analysesdemonstrate that an EGF-responsive mammalian em-bryonic CNS precursor is a stem cell // Dev. Biol. 1996.V. 175. № 1. P. 1–13.

Sakaguchi H., Kadoshima T., Soen M. et al. Generation offunctional hippocampal neurons from self-organizinghuman embryonic stem cell-derived dorsomedial telen-cephalic tissue // Nat. Commun. 2015. V. 6. № 8896.

Sasai Y. Next-generation regenerative medicine: organo-genesis from stem cells in 3D culture // Cell. Stem. Cell.2013. V. 12. № 5. P. 520–530.

Seo J., Kritskiy O., Watson L.A. et al. Inhibition ofp25/Cdk5 attenuates tauopathy in mouse and iPSCmodels of frontotemporal dementia // J. Neurosci. 2017.V. 37. № 4. P. 9917–9924.

Simian M., Bissell M.J. Organoids: A historical perspectiveof thinking in three dimensions // J. Cell. Biol. 2017.V. 216. № 1. P. 31–40.

Shen Q., Goderie S.K., Jin L. et al. Endothelial cells stimu-late self-renewal and expand neurogenesis of neuralstem cells // Science. 2004. V. 304. № 5675. P. 1338–1340.

Sloan S.A., Darmanis S., Huber N., Khan T.A. et al. Humanastrocyte maturation captured in 3D cerebral corticalspheroids derived from pluripotent stem cells // Neu-ron. 2017. V. 95. № 4. P. 779–790.e6.

Smukler S.R., Runciman S.B., Xu S. et al. Embryonic stemcells assume a primitive neural stem cell fate in the ab-sence of extrinsic influences // J. Cell. Biol. 2006.V. 172. P. 79–90.

Sousa A.M.M., Meyer K.A., Santpere G. et al. Evolution ofthe human nervous system function, structure, and de-velopment // Cell. 2017. V. 170. P. 226–247.

Sun A.X., Ng H.H., Tan E.K. Translational potential of hu-man brain organoids // Ann. Clin. Transl. Neurol. 2018.V. 5. № 2. P. 226–235.

Takahashi K., Tanabe K., Ohnuki M. et al. Induction of plu-ripotent stem cells from adult human fibroblasts by de-fined factors // Cell. 2007. V. 131. № 5. P. 861–872.

Taverna E., Götz M., Huttner W.B. The cell biology of neu-rogenesis: toward an understanding of the developmentand evolution of the neocortex // Annu. Rev. Cell. Dev.Biol. 2014. V. 30. P. 465–502.

Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S. et al. Embry-onic stem cell lines derived from human blastocysts //Science. 1998. V. 282. № 5391. P. 1145–1147.

Todd G.K., Boosalis C.A., Burzycki A.A. et al. Towards neu-ronal organoids: a method for long-term culturing ofhigh-density hippocampal neurons // PLoS One. 2013.V. 8. № 4. e58996.

Trevino A.E., Sinnott-Armstrong N., Andersen J. et al. Chro-matin accessibility dynamics in a model of human fore-brain development // Science. 2020. V. 367. № 6476.pii: eaay164.

Tropepe V., Hitoshi S., Sirard C. et al. Direct neural fatespecification from embryonic stem cells: A primitivemammalian neural stem cell stage acquired through adefault mechanism // Neuron. 2001. V. 30. P. 65–78.

Vescovi A.L., Parati E.A., Gritti A. et al. Isolation and clon-ing of multipotential stem cells from the embryonic hu-man CNS and establishment of transplantable humanneural stem cell lines by epigenetic stimulation // Exp.Neurol. 1999. V. 156. № 1. P. 71–83.

Wang S.N., Wang Z., Xu T.Y. et al. Cerebral organoids repairischemic stroke brain injury // Transl Stroke Res. 2019.Dec. 30.

Watanabe K., Kamiya D., Nishiyama A. et al. Directed differ-entiation of telencephalic precursors from embryonic stemcells // Nat. Neurosci. 2005. V. 8. № 3. P. 288–296.

Winanto, Khong Z.J., Hor J.H. et al. Spinal cord organoidsadd an extra dimension to traditional motor neuron cul-tures // Neural. Regen. Res. 2019. V. 14. № 9. P. 1515–1516.

Xiang Y., Tanaka Y., Patterson B. et al. Fusion of regionallyspecified hPSC-derived organoids models human braindevelopment and interneuron migration // Cell StemCell. 2017. V. 21. № 3. P. 383–398.e7.

Xu R., Brawner A.T., Li S., Liu J.J. et al. OLIG2 drives ab-normal neurodevelopmental phenotypes in humaniPSC-based organoid and chimeric mouse models ofdown syndrome // Cell Stem Cell. 2019. V. 24. № 6.P. 908–926.e8.



Yakoub A.M., Sadek M. Development and characterization ofhuman cerebral organoids: An optimized protocol // CellTransplant. 2018. V. 27. № 3. P. 393–406.

Yakoub A.M., Sadek M. Analysis of synapses in cerebral or-ganoids // Cell Transplant. 2019. V. 28. № 9–10.P. 1173–1182.

Yakoub A.M. Cerebral organoids exhibit mature neuronsand astrocytes and recapitulate electrophysiological ac-tivity of the human brain // Neural. Regen. Res. 2019.V. 14. № 5. P. 757–761.

Yin X., Mead B.E., Safaee H. et al. Engineering stem cell or-ganoids // Cell Stem. Cell. 2016. V. 18. № 1. P. 25–38.

Ying Q.L., Stavridis M., Griffiths D. et al. Conversion of em-bryonic stem cells into neuroectodermal precursors in

adherent monoculture // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21.№ 2. P. 183–186.

Zhang S.C., Wernig M., Duncan I.D. et al. In vitro differen-tiation of transplantable neural precursors from humanembryonic stem cells // Nat. Biotechnol. 2001. V. 19.P. 1129–1133.

Ziller M.J., Edri R., Yaffe Y. et al. Dissecting neural differen-tiation regulatory networks through epigenetic foot-printing // Nature. 2015. V. 518. № 7539. P. 355–359.

Ziv O., Zaritsky A., Yaffe Y. et al. Quantitative live imagingof human embryonic stem cell derived neural rosettesreveals structure-function dynamics coupled to corticaldevelopment // PLoS. Comput. Biol. 2015. V. 11. № 10.e1004453.

Cerebral Organoids: Brain Development ModelK. K. Sukhinich1, * and M. A. Aleksandrova1

1Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences,ul. Vavilova 26, Moscow, 119334 Russian


At the moment, the development of the human brain in normal and pathological conditions cannot be fullyreproduced in animal models, which leads to the necessity to search for alternative solutions. In recent years,significant successes have been achieved in the development of methods of culturing of the human brain ce-rebral organoids. Cerebral organoids are 3D cultures in which brain-specific cell types develop from embry-onic or induced pluripotent stem cells. In cerebral organoids, due to self-organization of nervous tissue,unique features of the development of the human brain are reproduced, which are absent in the developingbrain of rodents. However, they are not an exact copy, therefore, overcoming a number of restrictions will ex-pand our ability to study the development and disorders of the human brain in the future. Obviously, model-ing of cerebral organoids is already opening up prospects for both basic and clinical research. In this review,we discuss methods of nerve tissue culturing, production methods of cerebral organoids, features of their self-organization, modeling of normal development processes and brain pathology.

Keywords: cerebral organoids, 3D cultures, brain development, neurogenesis, human radial glia

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 292–301

292

ГЕТЕРОХРОНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ Lanf И FoxG1 У МИНОГИ ПОДТВЕРЖДАЕТ ПОЯВЛЕНИЕ КОНЕЧНОГО МОЗГА

КАК ЭВОЛЮЦИОННО МОЛОДОЙ НАДСТРОЙКИ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ПОЗВОНОЧНЫХ

© 2020 г. Г. В. Ермаковаa, А. В. Кучерявыйb, А. Г. Зарайскийa, А. В. Байрамовa, *aФедеральное государственное учреждение науки Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина

и Ю.А. Овчинникова РАН, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, Москва, 117997 РоссияbФедеральное государственное учреждение науки Институт проблем экологии и эволюции им. А.М. Северцова РАН,

Ленинский проспект, д. 33, Москва, 119071 Россия*e-mail: [email protected]



Одной из важнейших эволюционных инноваций позвоночных является сложноструктурирован-ный конечный мозг – теленцефалон, обеспечивающий высшие формы нервной деятельности у жи-вотных и человека. Эта работа посвящена исследованию вопроса появления конечного мозга наранних этапах эволюции позвоночных. Есть основания полагать, что у миног, в силу их эволюци-онной древности, могли сохраниться некоторые паттерны экспрессии, характерные для генов, ре-гулирующих развитие конечного мозга у самых первых позвоночных. Поэтому исследование осо-бенностей пространственно-временных паттернов экспрессии ключевых генов-регуляторов разви-тия конечного мозга у миног по сравнению с другими позвоночными может помочь понятьмолекулярные механизмы, лежавшие в основе появления и эволюционного развития этой уникаль-ной структуры позвоночных. В этой статье приводятся результаты анализа динамики экспрессиинекоторых маркеров конечного мозга и структур осевого комплекса органов, Lanf, FoxG1, Otx2,Goosecoid и HoxB9, на ранних стадиях развития Европейской речной миноги Lampetra fluviatilis. По-казано, что у генов миног, участвующих в дифференцировке конечного мозга (Lanf и FoxG1), на-блюдается гетерохрония экспрессии по сравнению с более эволюционно продвинутым представи-телем позвоночных – шпорцевой лягушкой Xenopus laevis. Это подтверждает идею о том, что конеч-ный мозг, являясь наиболее эволюционно молодым отделом центральной нервной системы, могпоявиться у предков позвоночных в качестве надстройки на поздних стадиях их эмбриональногоразвития.

Ключевые слова: Lanf, FoxG1, Otx2, Goosecoid, HoxB9, круглоротые, миноги, Lampetra fluviatilis, разви-тие конечного мозгаDOI: 10.31857/S0475145020040047

ВВЕДЕНИЕПроблемы изучения механизмов формирова-

ния конечного мозга в онтогенезе, а также иссле-дование факторов, которые могли привести к егопоявлению в эволюции являются на сегодняш-ний день актуальными в биологии развития. На-стоящая работа посвящена рассмотрению вопро-са появления конечного мозга в эволюции позво-ночных в контексте молекулярных механизмов,обеспечивающих дифференцировку этого отде-ла центральной нервной системы. Тот факт, чтовсе остальные типы многоклеточных животных,включая ближайших родственников позвоноч-ных низших хордовых (ланцетники и оболочни-

ки) не имеют структур гомологичных конечномумозгу указывает, на то, что, по всей видимости,он появился в эволюции только у предков совре-менных позвоночных. В связи с этим, важным яв-ляется вопрос о генетических механизмах, лежа-щих в основе данного ароморфоза. Согласно тео-рии филэмбриогенеза А.Н. Северцова, одним изпутей появления новых признаков в эволюцииявляется надставка конечных стадий. В ходе по-следующей эволюции время их закладки можетсмещаться в сторону более ранних стадий, из-зачего наблюдаются гетерохронии в развитии техили иных структур у животных, принадлежащих кразным филогенетическим группам.

УДК 591.3



ГЕТЕРОХРОНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ LANF И FOXG1 293

В контексте изучения механизмов появления вэволюции и развития конечного мозга, миногиявляются уникальным объектом, как самые древ-ние из ныне живущих позвоночных, у которыхимеется конечный мозг. Поскольку ветвь миноготделилась от общего ствола позвоночных на са-мых ранних этапах их эволюции, около 500 милли-онов лет назад (Kuraki, Kuratani, 2006; Feinberg,Mallatt, 2013), у них с большой вероятностью, могсохраниться древний тип экспрессионных паттер-нов генов-регуляторов развития конечного мозга,характерный для предковых форм позвоночных.

В данной работе мы провели сравнение наранних стадиях эмбриогенеза пространственно-временных паттернов экспрессии, описанных на-ми ранее регуляторов раннего развития конечно-го мозга Европейской речной миноги Lampetrafluviatilis, Anf (Lanf) и FoxG1, с паттернами экс-прессии их ортологов у шпорцевой лягушки Xen-opus laevis. Также было проведено аналогичноесравнение для генов, экспрессирующихся в Шпе-мановском организаторе (Goosecoid), в туловищ-ном отделе (HoxB9) и в среднем отделе мозга(Otx2). В результате мы установили, что экспрес-сия генов, необходимых для развития конечногомозга (Anf и FoxG1) у речной миноги активируетсяна гораздо более поздних стадиях развития, чем ушпорцевой лягушки. При этом, у остальных про-анализированных генов подобной гетерохрониине наблюдается. Если считать, что динамика экс-прессии выбранных генов-регуляторов опреде-ляет динамику программ, ответственных за эм-бриональное развитие, то обнаруженная намигетерохрония в начале экспрессии Anf и FoxG1 вэмбриогенезе миноги и шпорцевой лягушкисвидетельствует об относительно более позднейспецификации зачатка конечного мозга у мино-ги. В свою очередь, в силу биогенетического за-кона, это может свидетельствовать о сравнитель-но недавнем, по сравнению с другими отделамиЦНС, появлении конечного мозга в эволюции.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫЖивотные

Взрослые половозрелые особи Lampetra fluvi-atilis были выловлены в Ленинградской области.Зародыши получались путем искусственногооплодотворения в лабораторных условиях. Икраполовозрелых самок сдаивалась в контейнер и ак-

тивировалась в растворе 0.1× MMR (температура12°C) в течение 3 минут при постоянном помеши-вании. После активации в раствор добавляласьсперма половозрелого самца, икра инкубирова-лась 10 минут при постоянном помешивании.После оплодотворения икра дважды промыва-лась раствором 0.1× MMR. Инкубация осуществ-лялась в чашках Петри (9 см) на 12 градусах поЦельсию. Стадии определялись согласно Tahara(Tahara, 1988). Для гибридизации in situ зароды-ши фиксировались в растворе MEMFA. Зародышишпорцевой лягушки Xenopus laevis были получены влаборатории путем искусственного оплодотворе-нияь (Sive et al., 2000), стадии определялись соглас-но таблицам нормального развития Nieuwkoop andFaber (Nieuwkoop and Faber, 1967).

Обратная транскрипция-ПЦР

Для количественного ПЦР в реальном време-ни были отобраны три группы по 50 зародышейL. fluviatilis указанных стадий развития. Тоталь-ная РНК была выделена с помощью набора длявыделения РНК MASHEREY-NAGEL согаласнопротоколу производителя. 250 нг тотальной РНК,выделенной из каждой пробы, было использова-но для обратной трансрипции с помощью ревер-тазы M-MLV фирмы Promega в присутствии10 пмоль олиго-dT праймера фирмы Evrogen со-гласно протоколу. В качестве контроля использо-валась аналогичная реакционная смесь без ревер-тазы (–ОТ контроль). Количественный ПЦР былпроведен на приборе DTPrim4 фирмы ДНК Тех-нология, с использованием 2 мкл первой цепи(или –ОТ контроля) на реакцию и применением5-кратной реакционной смеси qPCRmix-HS SYBRфирмы Evrogen. В реакции использовались ука-занные ниже праймеры в финальной концен-трации 5 пмоль каждый, а общий объем реациидоводился до 25 мл водой, очищенной в прибореmilli-Q. Для ПЦР использовалась стандартнаяпрограмма из 40 циклов с горячим стартом. Дан-ные ПЦР импортировались в Microsoft Excel ианализировались методом ΔΔCt. Нормализацияполученных результатов проводилась по двум кон-трольным генам: орнитиндекарбоксилазе (ODC) ифактору элонгации (EF1alpha). Для количествен-ного ПЦР в реальном времени использовалисьследующие пары праймеров:

Lanf-ОТ-ПЦР-прямой GGCCTCGCACGTCCTTCA и Lanf-ОТ-ПЦР-обратный CTCGTCCACGCCGACTCT;

FoxG1-ОТ-ПЦР-прямой CTTTCGGGACTTACCGTTCCA иFoxG1-ОТ-ПЦР-обратный CCACTTGACTTTGCTGCTGA;

294


ЕРМАКОВА и др.

Otx2-ОТ-ПЦР-прямой GCAGAGCGGCGGGCAGAGCAA и Otx2-ОТ-ПЦР-обратный CCTCTCAGAGCACCTGGAACTT;

Goosecoid-ОТ-ПЦР-прямой GACACGAGGACAACCGAGAG и Goosecoid-ОТ-ПЦР-обратный ATCACATCACACGGGCACAA;

HoxB9-ОТ-ПЦР-прямой CTGCCCCTACACCAAGTTCC и HoxB9-ОТ-ПЦР-обратный GATCTTCACCTGGCGCTCG;

EF1alpha-ОТ-ПЦР-прямой AGAACGTGTCTGTCAAGGATGT

и EF1alpha-ОТ-ПЦР-обратный TAGCCGGCATTGATCTGGCCA; ODC-ОТ-ПЦР-прямой

CCGTCGGTATCATCGCCAAG и ODC-ОТ-ПЦР-обратный CGAAGAGGATGCAGTTGAAG;

X. laevis:OTX2a-ОТ-ПЦР-прямой TTCAATGCTGACTGCTTGGAT и OTX2a-ОТ-ПЦР-обратный AGATGAGGTTTGGCCCGAG;

FoxG1-ОТ-ПЦР-прямой AACAAGCAGGGCTGGCAGAA и FoxG1-ОТ-ПЦР-обратный CCGCTCTATCCATAAAGGTG;

Xanf1-ОТ-ПЦР-прямой CCGCAGAAGAGGAGACAAAG и Xanf1-ОТ-ПЦР-обратный TAGTGAAAGCAGTTCGGGGT;

Goosecoid-ОТ-ПЦР-прямой AGTGCCTCACCAAATGCTCC и Goosecoid-ОТ-ПЦР-обратный GTGAAGATGGTCCTGTGCCT;

HoxB9-ОТ-ПЦР-прямой AAAGTGTGTGAAGCCAACGC и HoxB9-ОТ-ПЦР-обратный TTCTTTCTGGAGGAGCGAGC;

EF-ОТ-ПЦР-прямой TCATACAGCTCATATTGCTTGTAAGT и EF-ОТ-ПЦР-обратный CAAGTGGAGGATAGTCTGAGAA;

ODC-ОТ-ПЦР-прямой GCCATTGTGAAGACTCTCTCCATTC иODС-ОТ-ПЦР-обратный TTCGGGTGATTCCTTGCCAC.

Гибридизация in situ

Фрагменты генов Lanf, FoxG1 и Otx2 для гибридизации in situ были получены методом ОТ-ПЦР с ис-пользованием следующих пар праймеров:

FoxG1-прямой GCCTCAACAAGTGCTTCGTGAAGGT иFoxG1-обратный GTTATATACAGTTTGTATTTACAAGCCAT;

Otx2-прямой GCAGAGCGGCGGGCAGAGCAA иOtx2-обратный CCTCTCAGAGCACCTGGAACTT;

Lanf-прямой CGGCGCTCCAGAAGTTCATTCTC иLanf-обратный CACCGCGCGGAGCTGCGACTCG.

Для ПЦР использовался набор фирмы Evrogenс полимеразой Encyclo. Полученные кДНК фраг-менты были клонированы в вектор pAL2-T (Evro-gen) и отсеквенированы.

Гибридизация in situ была проведена на целыхзародышах согласно протоколу, описанному вSugahara et al., 2015. Оболочку зародышей удаляли

микропинцетами до фиксации. Фиксацию про-водили в растворе параформальдегида (MEMFA)в течение ночи на 4°C. Предгибридизационный игибридизационный буфер содержали: 50% фор-мамид, 5× SSC, 100 мкг/мл гепарин, 100 мкг/млtRNA, 5 мМ EGTA, 1% CHAPS, 2% Tween20. По-сле предгибридизации (1 ч 70°C), зародыши ин-



кубировались ночь на 70°C в гибридизационномбуфере, содержащем 5 мкг/мл Dig-меченой РНКпробы, промывались (дважды в гибридизацион-ном буфере, дважды в двухкратном растворе SSCна 70°C, дважды в 0.2-кратном растворе SSC прикомнатной температуре, а также в растворе MAB) иинкубировались в блокирующем буфере (MAB ++ 2% блокирующего реагента (Roch) + 20% теля-чьей сыворотки (Sigma)) 2 часа при комнатнойтемпературе. Затем эмбрионы инкубировались сантиDig-Fab фрагментом, конъюгированным салкалиновой фосфатазой (фирмы Roche, разве-дение 1 : 1500 в блокирующем буфере) в течениеночи на 4°C.

Затем эмбрионы были 8 раз промыты в буфереMABT (MAB + 0.1% Triton X100) и помещены валкалинфосфатазный буфер на 20 мин при ком-натной температуре. Краситель BM purple (Roch)был использован для проявки.

30 мкм срезы гибридизованных эмбрионоввыполнялись на вибратоме Microm HM 650 (за-родыши помещались в 4% агарозные блоки).

Фотографирование производилось на стерео-микроскопе Leica M205.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕГены, выбранные для сравнения программ развития конечного мозга и туловищного отдела у эмбрионов

миноги и шпорцевой лягушкиВ качестве маркеров динамики развертывания

генетических программ развития конечного моз-га и туловищного отдела тела эмбрионов миногии шпорцевой лягушки были использованы пат-терны экспрессии следующих генов: Lanf, FoxG1,Otx2, Goosecoid и HoxB9. Далее приводится крат-кая характеристика каждого их этих генов.

Гомеобоксные гены класса Anf/Hesx1 (далееAnf) являются одним из ключевых регуляторовразвития переднего мозга позвоночных. Впервыеген Anf был описан в лаборатории молекулярныхоснов эмбриогенеза ИБХ РАН в 1992 году у шпор-цевой лягушки (Zaraisky et al., 1992). Исследова-ния, проведенные впоследствии показали, что вклетках зачатка переднего мозга белок Anf играетроль специфического репрессора транскрипции,подавляя экспрессию генов, индуцирующих диф-ференцировку задних отделов мозга (Ermakovaet al., 1999, 2007; Eroshkin et al., 2002; Martynova et al.,2004; Bayramov et al., 2004). Нам удалось обнару-жить и клонировать кДНК гомологов Anf у трех ви-дов миног Lethenteron сamtschaticum, Lampetra fluvi-atilis и Petromyzon marinus (Bayramov et al., 2016).Экспрессия гена Lanf обнаруживается у речнойминоги методом гибридизации in situ начиная состадии поздней нейрулы (ст. 20 по Tahara, 1988) напереднем конце формирующейся нервной систе-мы (рис. 1а, 1а'). Как уже отмечалось нами ранее

(Байрамов и др., 2017), такой пространственныйпаттерн экспрессии Lanf у миног в целом соответ-ствует паттерну экспрессии генов Anf у другихгрупп позвоночных.

Поскольку впервые в эволюции конечныймозг появляется именно у миног, обнаружение упредставителей этой группы гомологов гена Anfстало важным подтверждением выдвинутой намиранее гипотезы о том, что появление у позвоноч-ных генов класса Anf могло быть одним из ключе-вых факторов, создавших условия для возникно-вения у них конечного мозга (Bayramov et al.,2016; Байрамов и др., 2017). В частности, мы пока-зали, что у миноги, так же, как у шпорцевой ля-гушки, Anf ингибирует экспрессию Otx2 в обла-сти будущего переднего мозга, тем самым как бы“очищая” переднюю часть нервной пластинки отэкспрессии этого регулятора развития более ка-удальных отделов мозга. Это позволяет клеткам впередней части нервной пластинке начать экс-прессировать один из важнейших регуляторовразвития конечного мозга – FoxG1.

Белок, кодируемый геном FoxG1, относится ксемейству Forkhead-связывающих транскрипци-онных факторов и играет ключевую роль в индук-ции и пространственной организации развитияконечного мозга у позвоночных. Экспериментыпо подавлению и усилению его функции показа-ли, что FoxG1 участвует в развитии нейронов вен-тральной (подкорковой) зоны конечного мозга.Экспрессия FoxG1 в переднем отделе мозга доста-точно консервативна у разных групп позвоноч-ных и, поэтому этот ген часто применяется в ка-честве маркера данного отдела мозга (Kumamoto,Hanashima, 2017). У всех исследованных позвоноч-ных FoxG1 (ранее также известный как BF-1), явля-ется одним из первых транскрипционных факто-ров, экспрессирующихся в передней части нерв-ной пластинки – области будущего конечногомозга и в дальнейшем его экспрессия сохраняетсядо зрелых стадий (Danesin, Houart, 2012). Былопоказано, что ген FoxG1 имеет важное значениедля многих аспектов развития конечного мозга ивыживания нейронов в коре головного мозга увзрослых организмов. Нокаут FoxG1 у рыб и мы-шей приводит к редукции вентральной областиконечного мозга, что отражается в вентральнойэкспансии маркеров дорсальной части конечногомозга (Martynoga et al., 2005, Danesin et al., 2009).У человека мутации гена FOXG1 приводят к нару-шениям развития, таким как синдром Ретта, эпи-лепсия, постнатальная микроцефалия, тяжелаяумственная отсталость, нарушения речи, диски-незия и гипогенез мозолистого тела (Kortum et al.,2011; Danesin, Houart, 2012).

Пространственный паттерн экспрессии FoxG1у речной миноги в целом соответствует паттернамэкспрессии FoxG1 у других позвоночных, в том

296



числе у шпорцевой лягушки. В тоже время имеет-ся и ряд отличий. Так, экспрессия FoxG1 у миногивпервые в развитии детектируется в формирую-щихся ушных плакодах и вентаральной части те-ленцефалона (рис. 1б, 1б'). При этом у миногиFoxG1 совсем не экспрессируется в дорзальнойчасти теленцефалона, тогда как у других позво-ночных экспрессия этого гена в теленцефалоне

носит градиентный характер, с возрастанием ин-тенсивности от дорзальной части к вентральной(Danesin, Houart, 2012). Также у миноги в отличиеот других позвоночных экспреcсия FoxG1 не об-наруживается в формирующихся глазных струк-турах, что может объясняться особенностью раз-вития этих структур у миног. В отличие от че-люстноротых у миног наблюдается

Рис. 1. Паттерны экспрессии генов Lanf, FoxG1 и Otx2 в раннем развитии Европейской речной миноги показаные ме-тодом гибридизации in situ. a – на стадии 20 ген Lanf экспрессируется в передней части нервной системы – областибудущего теленцефалона и диенцефалона. a' – на стадии 22 уровень экспрессии гена Lanf уменьшается в области пе-реднего мозга и возрастает в ротовой эктодерме и гипофизарной плакоде. б, б' – ген FoxG1 экспрессируется в областибудущего теленцефалона и ушных плакодах. в – на стадии 20 ген Otx2 экспрессируется в области будущего переднегои среднего отделов мозга. в' – на стадии 23 ген Otx2 экспрессируется в области будущего промежуточного и среднегоотделов мозга.

(а) Lanf

FoxG1

Otx2

Ст. 20 (срез) Ст. 23

Ст. 24 Ст. 26

Ст. 20 (срез) Ст. 22

Otx2

FoxG1

Lanf(а')

(б) (б')

(в) (в')



двухступенчатое развитие глаза и зрительного нер-ва. На эмбриональной стадии глаз покрыт толстойнепрозрачной кожей, хрусталик незрелый что, воз-можно, указывает на примитивное состояние зри-тельной системы позвоночных (Melendez-Ferroet al., 2002; Suzuki et al., 2015). В этот период образу-ется небольшое количество волокон зрительногонерва. Позже в онтогенезе формируются новые оп-тические волокна, и после метаморфоза у взрослыхминог развиваются полноценные глазные камеры.

Гомеодоменный транскрипционый факторOtx2 играет важную роль в формировании перед-него мозга и развитии глазных структур (Beby,Lamonerie, 2013). Было показано, что эктопиче-ская экспрессия Otx2 приводит у шпорцевой ля-гушки к уменьшению размеров туловищного от-дела и появлению вторичной железы вылупления(Boyl et al., 2001). Фактор Otx2 вовлечен в молеку-лярный механизм, обеспечивающий дифферен-цировку глутаматэргических нейронов в таламусепутем репрессии транскрипционного регулятораMash1. Кроме развития нейронов таламуса, Otx2также вовлечен в дифференцировку и последующееразвитие и пролиферацию мезенцефалических до-фаминэргических предшественников. Нокаут Otx2летален, а у гомозиготных эмбрионов полностьюотсутствуют структуры переднего и среднего отде-лов мозга. При экспериментальном пониженииуровня экспрессии гена Otx2 наблюдаются нару-шения развития средних отделов мозга (Bozzy,Simeone, 2014).

Экспрессия гомеобоксного гена Goosecoid (Gsc)наблюдается в первичном эмбриональном органи-заторе как у позвоночных, так и у беспозвоночных(Blum et al., 1992; Broun et al., 1999). При экспери-ментальной эктопической экспрессии на брюш-ной стороне, то есть в области противоположнойнормальному месту экспрессии, Gsc эффективноиндуцирует образование вторичных эмбриональ-ных осей у шпорцевой лягушки (Cho et al., 1991).Эта способность Gsc имитировать активностьШпемманновского организатора объясняется егохорошо охарактеризованной способностью ре-прессировать транскрипцию генов, участвующихв функционировании сигнальных каскадов Wnt8aи BMP4 у разных групп позвоночных. Кроме то-го, активно исследуется роль гена Gsc в регуляцииподвижности и миграционного поведения клеток(Ulmer et al., 2017).

Ген HoxB9, экспрессирующийся в эктодермаль-ной и мезодермальной тканях, с момента его опи-сания применяется в качестве маркера задних отде-лов нервной системы (Sharpe et al., 1987).

Сравнение временных паттернов экспрессии выбранных генов в раннем развитии миноги

и шпорцевой лягушкиКолоколообразный профиль временной экс-

прессии Anf у миноги похож на профиль экспрес-сии его ортолога у шпорцевой лягушки: достаточ-но резкое возрастание и последующий спад на бо-лее поздних стадиях развития (рис. 2). Однако, вотличие от шпорцевой лягушки у миноги выявля-ется отчетливая гетерохрония в экспрессии Anf,выражающаяся в сдвиге начала экспрессии этогогена на сравнительно более поздние стадии раз-вития. Так, по данным qRT-PCR, у шпорцевойлягушки возрастание экспрессии Anf наблюдает-ся еще до начала нейруляции, на стадии позднейгаструлы, в то время как у миноги данный ген на-чинает активно экспрессироваться только начи-ная со стадии поздней нейрулы, что соответствуети данным полученным с помощью метода гибри-дизации in situ (ст. 20 по Tahara, 1988) (рис. 2).

Похожая гетерохрония наблюдается у миногии в случае гена FoxG1. Уровень экспрессии этогогена у речной миноги поддерживается на оченьнизком уровне во время гаструляции и нейруля-ции и начинает повышаться только на стадии ро-ста головы (стадия 21, Tahara, 1988) (рис. 2). Послеэтого постепенное увеличение экспрессии отме-чается на стадиях 23, 24 и 26.

В отличие от миноги у шпорцевой лягушкиFoxG1 начинает экспрессироваться уже в концегаструляции – начале нейруляции в клетках за-чатка конечного мозга. Проведенный нами ана-лиз экспрессии FoxG1 у шпорцевой лягушки так-же показал активацию экспрессии этого гена настадии ранней нейрулы (рис. 2).

Наиболее наглядно гетерохронию экспрессииFoxG1 у миноги можно продемонстрировать, еслииспользовать в качестве временного счетчика длясравнения стадий у разных видов количество об-разовавшихся к данной стадии сомитов (Gorodi-lov, 1992, 2010). Так, если у остальных изученныхпозвоночных, FoxG1 начинает впервые экспрес-сироваться в зачатке конечного мозга в диапазонеот пресомитной стадии у шпорцевой лягушки достадии 5–6 сомитов у рыб и млекопитающих(Tao, Lai, 1992; Toresson et al., 1998; Zhao et al.,2009) что в целом соответствует стадии раннейнейрулы, то у миног экспрессия этого гена обна-руживается в области конечного мозга только настадии 22 сомитов, т.е. уже после окончания ней-руляции (стадия 22 по Tahara, 1988).

Для проверки специфичности полученных ре-зультатов, полученных по генам Lanf и FoxG1, мыпровели аналогичный сравнительный анализ дляряда других генов регуляторов раннего развитияпозвоночных.

Ген Otx2 у миног экспрессируется в передней ча-сти формирующейся нервной системы (рис. 1в, 1в')

298



Рис. 2. Анализ динамики экспрессии генов Lanf, FoxG1, Otx2, Goosecoid и HoxB9 у речной миноги и шпорцевой лягуш-ки, проведенный методом ОТ-ПЦР в реальном времени. Обозначение проанализированных стадий развития: L. flu-viatilis: 1 – бластула, 2 – ранняя гаструла, 3 – поздняя гаструла, 4 – ранняя нейрула, 5 – поздняя нейрула, 6 – стадияголовного выроста-1, 7 – стадия головного выроста-2, 8 – стадия головного выроста-3, 9 – начало самопроизвольныхдвижений, 10 – стадия вылупления, 11 – 3 суток после вылупления. X. laevis: 1 – бластула, 2 – ранняя гаструла, 3 –поздняя гаструла, 4 – ранняя нейрула, 5 – поздняя нейрула, 6 – стадия 20 (по Nieuwkoop, Faber, 1967), 7 – стадия 23 (поNieuwkoop, Faber, 1967), 8 – стадия 28 (по Nieuwkoop, Faber, 1967).

121110987654321

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011

Anf 121110987654321

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011

FoxG1

Уров

ень

эксп

ресс

ии,

усло

вны

е ед

иниц

ы

8

20

7654321

1 2 3 4 5 6 7 8

Уров

ень

эксп

ресс

ии,

усло

вны

е ед

иниц

ы

8

20

7654321

1 2 3 4 5 6 7 8

87654321

1 2 3 4 5 6 7 8

20

87654321

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011

Otx2

6

5

4

3

2

1

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011

987654321

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011

Goosecoid HoxB9

87654321

1 2 3 4 5 6 7 8

87654321

1 2 3 4 5 6 7 8

Уров

ень

эксп

ресс

ии,

усло

вны

е ед

иниц

ыУр

овен

ь эк

спре

ссии

,ус

ловн

ые

един

ицы

Стадия развития


Lam

petra

fluv

iatil

isXe

nopu

s lae

vis

Lam

petra

fluv

iatil

isXe

nopu

s lae

vis





и его экспрессия начинается уже на стадии позд-ней гаструлы как у миноги, так и у шпорцевой ля-гушки (рис. 2).

Ген HoxB9, экспрессия которого обнаружива-ется в туловищном и хвостовом отделах (Sharpeet al., 1987) также не обнаруживает гетерохронииу миног и амфибий (рис. 2).

Ген Goosecoid – один из наиболее ранних мар-керов индукции осевых структур и у миног и у ам-фибий активируется на стадии ранней гаструлы(рис. 2).

Таким образом, на основе проведенного ана-лиза можно заключить, что гетерохрония не явля-ется типичным явлением для всех проанализиро-ванных генов, участвующих в развитии осевыхструктур и мозга у миног, а характерна только длягенов, вовлеченных в дифференцировку конеч-ного мозга – генов Anf и FoxG1. Полученные ре-зультаты представлены в виде схемы на рис. 3.

ЗАКЛЮЧЕНИЕВыявленная гетерохрония экспрессии Lanf и

FoxG1 у миноги, как одного из наиболее древнихпредставителей позвоночных, может отражатьтот факт, что конечный мозг является самым эво-люционно молодым отделом головного мозга.

Согласно гипотезе Геккеля, эволюционные ин-новации могут успешней проходить естествен-ный отбор если они появляются на более позднихстадиях эмбриогенеза, поскольку в этом случаеони вносят меньше нарушений в базовую про-грамму онтогенеза (Richardson, Keuck, 2002; Raff,Raff, 2009). Сравнительно поздняя экспрессияLanf и FoxG1 у миноги, выявленная в этой работе,на уровне экспрессии генов подтверждает болеепозднюю дифференцировку конечного мозга в он-тогенезе миног по сравнению с представителямиболее эволюционно продвинутых позвоночных.Поскольку на сегодняшний день миноги являютсянаиболее древними из существующих представите-лей позвоночных, эти данные хорошо согласуютсяс тем фактом, что конечный мозг является наиболееэволюционно молодым отделом мозга, которыймог появиться у предков позвоночных на позднихстадиях их эмбрионального развития.


Работа выполнена за счет гранта РФФИ (проект№ 18-04-00015). Эксперименты по ОТ-ПЦР на заро-дышах шпорцевой лягушки выполнены за счет грантаРоссийского научного фонда (проект № 19-14-00098).Получение серий образцов кДНК ранних стадий раз-

Рис. 3. Схема проведенного сравнительного анализа динамики экспрессии исследованных генов у речной миноги ишпорцевой лягушки.

Anf

FoxG1

Otx2

HoxB9

Goosec

L. fluviatilis X. laevis

Гаструла Нейрула Фарингула Вылупление

Конечныймозг

Промежуточный,средний

мозг

Туловищныйотдел

Первичныйорганизатор

300



вития шпорцевой лягушки выполнено за счет грантаРФФИ (проект № 18-29-07014 MK).


Все применимые принципы использования живот-ных в экспериментах и условия ухода за ними приня-тые в ИБХ РАН, ASPA’1986 и Хельсинкской деклара-цией были соблюдены.



ИНФОРМАЦИЯ О ВКЛАДЕ АВТОРОВ

Г.В. Ермакова – инкубация зародышей речной ми-ноги, подготовка образцов и проведение гибридиза-ции in situ, фоторафирование, подготовка рисунков.

А.В. Кучерявый – получение половозрелых произ-водителей и живых зародышей речной миноги.

А.Г. Зарайский – планирование экспериментов,написание статьи.

А.В. Байрамов – планирование экспериментов,подготовка образцов тотальной РНК и ОТ-ПЦР, на-писание статьи, подготовка рисунков.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫBayramov A.V., Ermakova G.V., Eroshkin F.M. et al. The

presence of the Anf/Hesx1 homeobox in lampreys indi-cates that it may play important role in telencephalonemergence // Sci. Rep. 2016. V. 6. P. 39849.

Bayramov A.V., Martynova N.Yu., Eroshkin F.M. et al. Thehomeodomain-containing transcription factor X-nkx-5.1inhibits expression of the homeobox gene Xanf-1 duringthe Xenopus laevis forebrain development // Mechanismof Development. 2004. V. 121. P. 1425–1441.

Beby F., Lamonerie T. The homeobox gene Otx2 in develop-ment and disease // Exp. Eye. Res. 2013. V. 111. P. 9–16.

Blum M., Gaunt S.J., Cho K.W. et al. Gastrulation in themouse: the role of the homeobox gene goosecoid //Cell. 1992. V. 69. P. 1097–1106.

Boyl P.P., Signore M., Annino A. et al. Otx genes in the devel-opment and evolution of the vertebrate brain // Int.J. Dev. Neurosci. 2001. V. 19. № 4. P. 353–363.

Bozzi Y., Simeone A. Otx genes and seizure susceptibility //Molecular & Cellular Epilepsy. 2014. V. 1. e74.

Broun M., Sokol S., Bode H.R. Cngsc, a homologue ofgoosecoid, participates in the patterning of the head,and is expressed in the organizer region of Hydra // De-velopment 1999. V. 126. P. 5245–5254.

Cho K.W., Blumberg B., Steinbeisser H. et al. Molecular na-ture of Spemann’s organizer: the role of the Xenopus ho-meobox gene goosecoid // Cell. 1991. V. 67. P. 1111–1120.

Danesin C., Peres J.N., Johansson M. et al. Integration of tel-encephalic Wnt and hedgehog signaling center activitiesby Foxg1 // Dev. Cell. 2009. V. 16. № 4. P. 576–587.

Danesin C., Houart C. A Fox stops the Wnt: implicationsfor forebrain development and diseases // Curr. Opin.Genet. Dev. 2012. V. 22. № 4. P. 323–330.

Eroshkin F., Kazanskaya O., Martynova N. et al. Character-ization of cis-regulatory elements of the homeobox geneXanf-1 // Gene. 2002. V. 285. P. 279–286.

Ermakova G.V., Alexandrova E.M., Kazanskaya O.V. et al.The homeobox gene, Xanf-1, can control both neuraldifferentiation and patterning in the presumptive ante-rior neurectoderm of the Xenopus laevis embryo //Development. 1999. V. 126. P. 4513–4523.

Ermakova G.V., Solovieva E.A., Martynova N.Y. et al. Thehomeodomain factor Xanf represses expression of genesin the presumptive rostral forebrain that specify morecaudal brain regions // Developmental Biology. 2007.V. 307. P. 483–497.

Feinberg T.E., Mallatt J. The evolutionary and genetic originsof consciousness in the Cambrian Period over 500 millionyears ago // Front Psychol. 2013. V. 4. P. 667.

Gorodilov Y.N. Rhythmic processes in lower vertebrate em-bryo genesis and their role for developmental control //Zool. Sci. 1992. V. 9. P. 1101–1111.

Gorodilov Y.N. The biological clock in vertebrate embryo-genesis as a mechanism of general control over the de-velopmental organism // Russian J. DevelopmentalBiology. 2010. V. 41. P. 243–260.

Kortüm F., Das S., Flindt M. et al. The core FOXG1 syn-drome phenotype consists of postnatal microcephaly,severe mental retardation, absent language, dyskinesia,and corpus callosum hypogenesis // J. Med. Genet.2011. V. 8. № 6. P. 396–406.

Kumamoto T., Hanashima C. Evolutionary conservation andconversion of Foxg1 function in brain development // Dev.Growth. Differ. 2017. V. 59. № 4. P. 258–269.

Kuraku S., Kuratani S. Time scale for cyclostome evolutioninferred with a phylogenetic diagnosis of hagfish andlamprey cDNA sequences // Zoolog. Sci. 2006. V. 23.№ 12. P. 1053–1064.

Martynova N.Yu., Eroshkin F.M., Ermakova G.V. et al. Pat-terning the forebrain: FoxA4a/Pintallavis and Xvent-2determine the posterior limit of the Xanf-1 expression inthe neural plate // Development. 2004. V. 131. P. 2329–2338.

Martynoga B., Morrison H., Price D.J. et al. Foxg1 is re-quired for specification of ventral telencephalon and re-gion-specific regulation of dorsal telencephalic precur-sor proliferation and apoptosis // Dev. Biol. 2005.V. 283(1). P. 113–127.

Meléndez-Ferro M., Villar-Cheda B., Abalo X.M. et al. Earlydevelopment of the retina and pineal complex in the sealamprey: comparative immunocytochemical study //J. Comp. Neurol. 2002. V. 442. № 3. P. 250–265.

Nieuwkoop P.D., Faber J. Normal Table of Xenopus laevis //Amsterdam: North Holland, 1967.

Raff R.A., Raff E.C. Evolution in the light of embryos: seekingthe origins of novelties in ontogeny // Forms and Functionin Developmental Evolution / Eds. Laubichler M.D.,Maienshein J. Cambridge University Press, 2009.

Richardson M.K., Keuck G. Haeckel’s ABC of evolution anddevelopment // Biological Reviews of the CambridgePhilosophical Society. 2002. V. 77. P. 495–528.



Roth M., Bonev B., Lindsay J. et al. FoxG1 and TLE2 actcooperatively to regulate ventral telencephalon forma-tion // Development. 2010. V. 137. № 9. P. 1553–1562.

Sive H., Grainger R.M., Harland R.M. Early Developmentof Xenopus laevis: A Laboratory Manual. CSH Labora-tory Press, 2000.

Sharpe C.R., Fritz A., De Robertis E.M. et al. A homeobox-containing marker of posterior neural differentiationshows the importance of predetermination in neural in-duction // Cell. 1987. V. 50. № 5. P. 749–758.

Suzuki D.G., Murakami Y., Escriva H. et al. A comparativeexamination of neural circuit and brain patterning be-tween the lamprey and amphioxus reveals the evolution-ary origin of the vertebrate visual center // J. Comp.Neurol. 2015. V. 523. № 2. P. 251–261.

Tahara Y. Normal stages of development in the lamprey,Lampetra reissneri (Dybowski) // Zoological Science.1988. V. 5. P. 109–118.

Tao W., Lai E., Telencephalon-restricted expression of BF-1,a new member of the HNF-3/fork head gene family, inthe developing rat brain // Neuron. 1992. V. 8. № 5.P. 957–666.

Toresson H., Martinez-Barbera J.P., Bardsley A. et al. Con-servation of BF-1 expression in amphioxus and zebraf-ish suggests evolutionary ancestry of anterior cell typesthat contribute to the vertebrate telencephalon // Dev.Genes. Evol. 1998. V. 208. P. 431–439.

Ulmer B., Tingler M., Kurz S. et al. A novel role of the orga-nizer gene Goosecoid as an inhibitor of Wnt/PCP-me-diated convergent extension in Xenopus and mouse //Sci. Rep. 2017. V. 7. P. 43010.

Zaraisky A.G., Lukyanov S.A., Vasiliev O.L. et al. A novelhomeobox gene expressed in the anterior neural plate ofthe Xenopus embryo // Developmental Biology. 1992.V. 152. P. 373–382.

Zhao X.F., Suh C.S., Prat C.R. et al. Distinct expression oftwo foxg1 paralogues in zebrafish // Gene. Expr. Pat-terns. 2009. V. 9. № 5. P. 266–272.

Байрамов А.В., Ермакова Г.В., Ерошкин Ф.М. и др. Гоме-обоксный ген семейства Anf, обнаруженный у ти-хоокеанской миноги Lethenteron camtschaticum, под-тверждает гипотезу о важности появления генов Anfдля возникновения конечного мозга в эволюциипозвоночных // Онтогенез. 2017. Т. 48. № 4. С. 241–251.

Heterochrony of the Expression of Lanf and Foxg1 in Lamprey Confirmsthe Appearance of the Telencephalon as an Evolutionarily Young Superstructure

in the Central Nervous System of VertebratesG. V. Ermakova1, A. V. Kucheryavyy2, A. G. Zaraisky1, and А. V. Bayramov1, *

1Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry, Russian Academy of Sciences, Moscow, 117997 Russia2Severtsov Institute of Ecology and Evolution, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119071 Russia


One of the most important evolutionary innovations of vertebrates is a complex structured telencephalonwhich provides higher forms of nervous activity in animals and humans. This work is devoted to the study ofthe appearance of the telencephalon in the early stages of vertebrate evolution. At the same time, there is rea-son to believe that lampreys, due to their evolutionary antiquity, could retain some ancient expression pat-terns of genes that regulate the development of the brain in the very first vertebrates. The study of the featuresof spatio-temporal expression patterns of key genes that regulate the development of the forebrain in lampreyscompared with other vertebrates can help to understand the molecular mechanisms underlying the appear-ance and evolutionary development of this unique structure of vertebrates. This article presents the results ofanalysis of the dynamics of gene expression of Lanf, FoxG1, Otx2, Goosecoid and HoxB9 in the early stages ofdevelopment of the European river lamprey Lampetra fluviatilis. It was shown that lamprey genes involved intelencephalon differentiation (Lanf and FoxG1) exhibit heterochrony of expression compared with more evo-lutionarily advanced representatives of vertebrates. This fact confirms the idea that the telencephalon, beingthe most evolutionarily young part of the brain, could appear in vertebrate ancestors as a superstructure in thelate stages of their embryonic development.

Keywords: Lanf, FoxG1, Otx2, Goosecoid, HoxB9, cyclostomates, Lampetra fluviatilis, telencephalon develop-ment, heterochrony

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 302–308

302

ЭНДОГЕННЫЕ БИОРИТМЫ ИНТЕНСИВНОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА В ИНДИВИДУАЛЬНОМ РАЗВИТИИ

PLANORBARIUS CORNEUS (PLANORBIDAE, GASTROPODA)© 2020 г. А. А. Зотин*

Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ул. Вавилова, 26, Москва, 119334 Россия*e-mail: [email protected]



Два эндогенных биоритма интенсивности потребления кислорода с периодами 10.8 и 4.7 нед. выяв-лено в позднем постларвальном онтогенезе пресноводных брюхоногих моллюсков Planorbarius cor-neus с помощью сингулярного спектрального анализа. Локальные экстремумы обоих биоритмов уразных особей приходятся на одни и те же возраста, а их периоды приблизительно одинаковы у всехисследованных животных и остаются неизменными на протяжении индивидуального развития.Оба биоритма затухающие и имеют сходную амплитуду, которая уменьшается от примерно 1.1 мклО2/(ч г) в возрасте до 20 нед. до 0.26 мкл О2/(ч г) к моменту гибели. Таким образом, выявлены новые,не описанные ранее эндогенные биоритмы, связанные со скоростью метаболизма.

Ключевые слова: интенсивность потребления кислорода, онтогенез, биоритмы, брюхоногие мол-люски, Gastropoda, Planorbarius corneusDOI: 10.31857/S0475145020040096

ВВЕДЕНИЕ

Энергетический обмен, как и большинство про-цессов, происходящих в онтогенезе животных, об-ладает определенными ритмами. Подобные ритмысоставляют основу жизнедеятельности организмов,являются скорее правилом, чем исключением, и,по-видимому, тесно связаны с механизмами регу-ляции биологических процессов посредством изме-нения длительности периодов и амплитуды коле-баний (Мина, Клевезаль, 1976; Браун, 1977; Брод-ский, Нечаева, 1988; Зотин А.И., 1988). Данные оритмах энергетического обмена суммированы вмонографии А.И. Зотина (1988).

Наиболее многочисленны сведения по циркад-ным и сезонным колебаниям основного и стандарт-ного обмена (Строганов, 1962; Беркович, 1964;Dmi’el, 1969; Dawson, Hudson, 1970; Brett, 1972;Chiba et al., 1973; Palmer, 1974; Kinnear, Shield, 1975;Bennett, Dawson, 1976; McCormick, 1981; Панте-леев, 1983; Way, Wissing, 1984; Ляшенко, Харчен-ко, 1989). Циркадные и сезонные ритмы интен-сивности потребления кислорода, скорее всего,определяются внешними причинами и приспо-соблением организмов к специфическим услови-ям существования жизни на Земле.

Животные, однако, имеют и строго эндоген-ные ритмы дыхания. Наиболее известны эндо-

генные ритмы энергетического обмена, связан-ные с линьками у членистоногих и ряда другихживотных (Клейменов, 1997). Эндогенные ритмыпотребления кислорода с периодом 0.5–3.0 ч бы-ли установлены у ряда живых объектов. Напри-мер, у дробящихся яйцеклеток (Zeuthen, 1960; Зо-тин А.И., 1966), в делящихся синхронизированныхкультурах амеб (Edwards, Lloyd, 1978), у взрослыхракообразных (Brown et al., 1954; Palmer, 1974),млекопитающих (Kayser, Hildwein, 1974; Stupfelet al., 1979) и человека (Horne, Whitehead, 1976).

Ранее нами были выявлены эндогенные био-ритмы интенсивности потребления кислорода впозднем постларвальном онтогенезе у пресно-водных брюхоногих моллюсков Lymnaea stagnalis(Lymnaeidae) (Зотин А.А., Клейменов, 2013).

Данная работа посвящена анализу эндогенныхбиоритмов интенсивности энергетического об-мена в позднем постларвальном онтогенезе дру-гого вида брюхоногих моллюсков – Planorbariuscorneus, принадлежащих к другому семейству Pla-norbidae.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫМоллюсков P. corneus L. (Gastropoda, Planor-

bidae) получали путем разведения в лабораторныхусловиях. Вылупившихся 30.09.2016 г. моллюсков

УДК 57.017.73:57.034:57.036:591.3:594.381.5



ЭНДОГЕННЫЕ БИОРИТМЫ ИНТЕНСИВНОСТИ ПОТРЕБЛЕНИЯ КИСЛОРОДА 303

содержали в стандартных условиях: в отстоянной(не менее 2 сут) водопроводной воде в термостатепри постоянной температуре 20°С поодиночке впластиковых стаканах объемом 50 мл. Корм (листодуванчика Taraxacum officinale Wigg) добавляли визбытке, то есть в таком количестве, которое мол-люск не успевал потребить до замены корма насвежую порцию.

Скорость потребления кислорода измеряли спомощью оксиметра Orion Star A223 RDO/DOportable meter (“Thermo Fisher Scientific”, USA),как это описано в предыдущей статье (Зотин А.А.,Кирик, 2017). Животных помещали в закрытыесосуды и инкубировали в течение 3 ч. Измеренияколичества кислорода в воде проводили до и по-сле инкубации. Скорость потребления кислородаP за единицу времени t определяли по формуле:

где a0 и a1 – количество кислорода в воде до и по-сле инкубации моллюсков соответственно; c0 и c1 –аналогичные значения в контрольных сосудах(только с водой без животных).

Для всех животных измерение скорости по-требления кислорода проводили в один и тот жедень в произвольном порядке с интервалом меж-ду измерениями, не превышающим 2 ч. Измере-ния проводили 2 раза в неделю (по понедельни-кам и четвергам), начиная с 3 нед. после вылупле-ния вплоть до естественной гибели животных.После чего животных помещали в свежую воду сосвежей порцией корма.

Всего исследовано 9 животных.Общую массу тела моллюсков определяли на

весах Scout Pro (Швейцария) с точностью 1 мг.Интенсивность потребления кислорода рассчи-тывали путем деления величины скорости по-требления кислорода одной особью на массу этойособи.

Анализ полученных данных проводили с исполь-зованием метода сингулярного спектрального анали-за с помощью программы “Гусеница” (версия 3.40,разработана компанией GistaT Group, Россия).Каждый временной ряд разлагали на компоненты всоответствии с формулой (Главные…, 1997; Кря-нев, Лукин, 2010):

(1)

где F(t) – общая временнáя зависимость исследу-емого параметра; T(t) – основной тренд (общеенаправление изменения исследуемого парамет-ра); W(t) – одна или несколько волновых компо-нент, связанных с закономерным изменением па-раметра; N(t) – “шумовая” компонента, связан-ная со случайными вариациями, вызванныминеточностью измерений, флуктуациями парамет-ра и т.д.

( ) ( )( )= 0 1 0 1– – – ,P a a c c t

( ) ( ) ( ) ( )= + Σ + ,F t T t W t N t

Следует отметить, что программа “Гусеница”,использованная для вычленения основного трен-да и биоритмов, работает только с временнымирядами, то есть с рядами, в которых последова-тельные интервалы между измерениями временипостоянны. Поскольку измерения проводили с не-равными временными интервалами, чередуя три ичетыре сут, построение временного ряда на основепервичных данных оказалось невозможным. По-этому первичные данные для каждого моллюскасглаживали с помощью кубических сплайнов с ис-пользованием программы Matlab (версия 7.3.0.267,разработана компанией The MathWorks, Inc., США).При этом мощность сглаживания выбирали поумолчанию (опция “Default”). На основании прове-денного сглаживания с помощью той же программыстроили временной ряд с интервалом 0.5 нед. Одно-временно при этом достигалось частичное удале-ние случайных шумов. Построение временного ря-да программным способом на основе сглаженнойкривой дает вполне приемлемые результаты, еслиучесть, что ошибка, которую дает использованныйпрограммный метод, сопоставима с ошибкой изме-рения скорости потребления кислорода. Относи-тельная ошибка, получаемая при смещении време-ни измерения в связи с построением временногоряда, не зависит от возраста моллюска, примерноравна относительной ошибке измерения скоростипотребления кислорода и равна 2% (Thermo…,2020). Исследование величины шумовых колеба-ний не входило в задачу работы.

При применении программы была выбранаопция “без центрирования”. Выбор опции “дли-на гусеницы” (“длина окна”) осуществляли сле-дующим образом. Длину окна варьировали от 4 до28 (половина количества измерений для моллюс-ка с наименьшей продолжительностью жизни) ивыбирали вариант, для которого основной тренди ритмы разделялись наиболее отчетливо. В ре-зультате была выбрана длина окна равная 22.

Анализ основного тренда и волновых компо-нент проводили для каждой особи P. corneus ин-дивидуально.

Период колебаний вычисляли как удвоеннуюразницу между значениями возрастов текущего иследующего локальных экстремумов. Амплитудуколебаний вычисляли как половину разницымежду значениями интенсивности потреблениякислорода в текущем локальном максимуме иследующем локальном минимуме.

“Шумовой” составляющей, связанной со слу-чайными колебаниями измеренных параметров,считали ритмы с периодом меньше, чем проме-жуток между измерениями, умноженный на 4, тоесть 2 нед.

304


ЗОТИН

РЕЗУЛЬТАТЫНаличие биоритмов, сопровождающих основ-

ной тренд становится очевидным уже при анализекинетики интенсивности потребления кислорода виндивидуальном развитии P. corneus (рис. 1а).

Более подробный анализ с помощью сингуляр-ного спектрального анализа показывает, что изме-нение интенсивности обмена для каждой особи мо-жет быть разложено на следующие составляющие:основной тренд, закономерные волновые составля-ющие и “шумовая” составляющая.

В качестве примера на рис. 1 приведено разло-жение на составляющие зависимости интенсив-ности потребления кислорода от возраста у одно-го из моллюсков.

Для всех исследованных особей основнойтренд показывает постепенное снижение интен-сивности потребления кислорода (рис. 1а). Изме-нение интенсивности обмена связано с основ-ным трендом в наибольшей степени (92.3 ± 1.9%).

Закономерные периодические изменения пред-ставлены двумя биоритмами (рис. 1б, 1в) со средни-ми значениями периодов 10.8 ± 1.1 и 4.7 ± 0.4 нед.(n = 9). Вклады биоритмов в изменчивость интен-сивности обмена составляют 4.0 ± 1.1 и 3.5 ± 2.1%соответственно.

Изменение периодов и амплитуд биоритмов вонтогенезе каждой особи представлены в табл. 1.При анализе данных выявляется ряд закономер-ностей.

1. Для всех биоритмов колебания у разныхмоллюсков происходят синхронно, т.е. локаль-ные экстремумы приходятся приблизительно наодни и те же возраста.

2. Периоды биоритмов на протяжении онтоге-неза одной и той же особи остаются приблизи-тельно постоянными.

3. Все биоритмы затухающие. Причем, наи-большая амплитуда колебаний приходится на пер-вые 20 нед. развития. В дальнейшем она уменьша-ется, и в пределах чувствительности использован-ного метода ее можно считать постоянной вплотьдо гибели животных.

4. Различия средних значений амплитуд длябиоритмов с разными периодами не достоверны.Для моллюсков в возрасте до 20 нед. амплитуда всреднем равна 1.1 ± 0.3, для моллюсков в возрастеболее 20 нед. – 0.26 ± 0.07 мкл О2/(ч г).

ОБСУЖДЕНИЕВ предыдущей статье (Зотин А.А., 2019) было

проведено исследование основного тренда изме-нения интенсивности потребления кислорода уP. corneus. Было показано, что после вылуплениянаблюдается постепенное нарастание интен-сивности энергетического обмена и к 3–8 нед.

постларвального развития у P. corneus достигаетсямаксимум. Затем наблюдается тенденция к не-прерывному снижению интенсивности потребле-

Рис. 1. Разложение временного ряда интенсивностипотребления кислорода (особь № 8). а – изменениеинтенсивности потребления кислорода: кружки –исходный временной ряд, линия – основной тренд;б – низкочастотная волновая составляющая (периодоколо 10.8 нед.); в – высокочастотная волновая со-ставляющая (период около 4.7 нед.).

140

120

100

80

60

40

20

100 20 30 40 50 60 70

(а)

q, м

кл O

2/(ч

г)

40

30

20

10

0

–10

–20

–30100 20 30 40 50 60 70

(б)

q, м

кл O

2/(ч

г)

20

10

0

–10

–20

–30100 20 30 40 50 60 70

(в)

q, м

кл O

2/(ч

г)

Возраст, нед.



Таблица 1. Изменение индивидуальных параметров биоритмов интенсивности потребления кислорода в онто-генезе P. corneus

Примечания. P, нед. – период; Pср, нед. – среднее значение периода для особи; A мкл О2/(ч ⋅ г) – амплитуда; ΔA – диапазонамплитуд. Пустая ячейка – моллюск к этому возрасту погиб.

№моллюска Параметр

PсрΔA

Диапазон возрастов, нед.

1–20 21–40 41–60 61–80 81–100 101–120

Низкочастотный биоритм

1P 9.8 ± 0.4 9.3 9.0 10.4 9.7 9.5 10.7A 0.55–0.35 0.55 0.34 0.33 0.18 0.31 0.35

2P 13.0 ± 2.6 13.0A 0.60 0.60

3P 10.7 ± 0.6 9.5 11.0 11.0 11.0A 0.55–0.16 0.55 0.11 0.19 0.16

4P 9.5 ± 1.4 12.5 10.0 7.7 9.0A 2.09–0.16 2.09 0.13 0.19 0.16

5P 11.8 ± 1.1 13.0 13.3 10.5 11.7A 2.14–0.09 2.14 0.30 0.14 0.09

6P 10.4 ± 1.9 10.3 11.0A 1.77–0.78 1.77 0.78

7P 13.6 ± 0.4 13.0 13.0 15.0 14.0A 1.18–0.10 1.18 0.56 0.57 0.10

8P 11.0 ± 0.6 11.3 12.0 10.0 11.0A 1.56–0.46 1.56 0.56 0.18 0.46

9P 11.1 ± 1.5 11.0 13.0 9.3A 1.14–0.32 1.14 0.71 0.32

Высокочастотный биоритм

1P 4.8 ± 0.2 4.7 6.0 4.6 4.8 4.3 4.4A 0.61–0.35 0.61 0.47 0.35 0.17 0.17 0.35

2P 4.5 ± 0.3 4.4 5.0A 1.49–0.18 1.49 0.18

3P 4.7 ± 0.3 5.0 4.4 5.1 4.3A 1.63–0.18 1.63 0.42 0.26 0.18

4P 5.1 ± 0.2 5.0 5.0 5.8 4.7A 1.41–0.09 1.41 0.31 0.26 0.09

5P 5.0 ± 0.3 4.5 5.5 5.1 4.9A 0.68–0.21 0.68 0.37 0.17 0.21

6P 5.0 ± 0.3 5.2 5.3A 0.47–0.39 0.47 0.39

7P 4.7 ± 0.2 4.7 4.8 5.2 4.4A 0.76–0.13 0.76 0.27 0.12 0.13

8P 5.3 ± 0.2 5.0 5.0 5.5 5.8A 0.74–0.33 0.74 0.28 0.38 0.33

9P 3.8 ± 0.2 3.8 3.5 4.1A 0.58–0.16 0.58 0.15 0.16

306


ЗОТИН

ния кислорода вплоть до гибели моллюсков. По-стоянное снижение интенсивности энергетиче-ского обмена характерно для взрослых животных(Зотин А.А., 2006, 2009, 2010).

В данной работе показано, что основная тенден-ция сопровождается закономерными колебатель-ными процессами. Насколько такие ритмическиепроцессы закономерны для разных видов живот-ных остается неясным в связи с немногочисленно-стью работ, в которых выявлены эндогенные, не за-висящие от среды ритмы энергетического обмена.Немногочисленность работ, по-видимому, объяс-няется, во-первых, трудоемкостью подобных ис-следований, во-вторых, отсутствием до недавнеговремени компьютерных программ, позволяющихвыявить и проанализировать биоритмы, в-третьих,невысокой точностью измерений, приводящих ктому, что случайный разброс чаще всего маскиру-ет закономерные колебания.

Применение сглаживания кубическими сплай-нами и сингулярного спектрального анализа позво-ляет выявить закономерные ритмические измене-ния интенсивности энергетического обмена. Этиколебания, по всей вероятности, не связаны с ка-кими-либо периодическими изменениями вовнешней среде, т.е. являются эндогенными био-ритмами по следующим соображениям:

– колебания интенсивности потребления кис-лорода наблюдаются в индивидуальном развитиимоллюсков при более или менее постоянныхусловиях среды;

– периоды колебаний не совпадают с периода-ми каких-либо известных природных ритмиче-ских процессов.

Биологическое значение биоритмов для функ-ционирования живых систем, по мнению многихавторов, связано с возможностью на их основеосуществлять регуляцию биологических процес-сов (Мина, Клевезаль, 1976; Бродский, Нечаева,1988 и др.).

Причины колебаний не ясны. Мы полагаем,что обнаруженные колебания могут получитьнаиболее адекватное объяснение с позиций тер-модинамики необратимых процессов, которая рас-сматривает организмы как диссипативные структу-ры, т.е. определенным образом организованныестабильные структуры, характерной особенностьюкоторых является повышенная по сравнению сокружающей средой диссипация энергии (Приго-жин, 1960; Prigogine, Nicolis, 1967; Prigogine, 1972;Васильев, 1976; Зотин А.И., 1976; Лампрехт, 1976).

Формирование таких структур возможно толь-ко в открытых системах определенного уровня не-равновесности. При этом диссипативные структу-ры находятся в так называемом неравновесномстационарном состоянии, в котором термодина-мические потоки и силы не остаются строго по-стоянными, а колеблются вокруг некой величины

(Пригожин, 1960; Prigogine, Nicolis, 1967; Nicolis,1972; Шахпаронов, Павленко, 1988).

В онтогенезе животных выделяют два вида ста-ционарных состояний: текущее, в котором орга-низм находится в настоящее время, и конечное, ккоторому организм стремится на протяжении всейжизни. Первое стационарное состояние можносвязать с понятием “гомеостаз”, второе – с поняти-ем “гомеорез” (Зотин А.И., 1988).

Таким образом, наличие двух ритмов интен-сивности потребления кислорода находится вполном соответствии с выводами термодинамикинелинейных систем (Малек-Мансур и др., 1980) исвидетельствует в пользу гипотезы об эндогеннойприроде наблюдаемых биоритмов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ РАБОТЫВыполнено в рамках раздела Государственного за-

дания ИБР РАН 2020 года.


Все применимые международные, национальныеи/или институциональные принципы использованияживотных в экспериментах и условия ухода за нимибыли соблюдены.

КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВАвтор заявляет, что какой-либо конфликт интере-

сов отсутствует.

ИНФОРМАЦИЯ О ВКЛАДЕ АВТОРОВРабота полностью выполнена одним автором

А.А. Зотиным.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫБеркович Е.М. Энергетический обмен в норме и пато-

логии. М.: Медицина, 1964. 333 с.Браун Ф. Биологические ритмы // Сравнительная фи-

зиология животных. Т. 2. М.: Мир, 1977. С. 210–260.Бродский В.Я., Нечаева Н.В. Ритмы синтеза белка. М.:

Наука, 1988. 240 с.Васильев В.А. Стационарные диссипативные структу-

ры // Термодинамика биологических процессов.М.: Наука, 1976. С. 186–198.

Главные компоненты временных рядов: метод “Гусе-ница” / Под ред. Данилова Д.П., Жиглявского А.А.СПб: Изд-во СГПбУ, 1997. 308 с.

Зотин А.А. Уравнения, описывающие изменение мас-сы и интенсивности дыхания в постэмбриональ-ный период развития животных // Изв. РАН. Сер.биол. 2006. № 4. С. 404–413.

Зотин А.А. Закономерности роста и энергетическогообмена в онтогенезе моллюсков: Автореф. дис. …докт. биол. наук. М.: ИБР РАН, 2009. 30 с.



Зотин А.А. Энергетический обмен в индивидуальномразвитии Lymnaea stagnalis (Lymnaeidae, Gastropo-da). III. Поздний постличиночный онтогенез //Изв. РАН. Сер. биол. 2010. № 6. С. 695–703.

Зотин А.А. Энергетический обмен в постличиночномонтогенезе Planorbarius corneus (Planorbidae, Gas-tropoda) // Онтогенез. 2019. Т. 50. № 5. С. 306–311.

Зотин А.А., Кирик Е.Ф. Скорость потребления кисло-рода в зародышевом развитии роговой катушкиPlanorbarius corneus (Gastropoda) // Онтогенез. 2017.Т. 48. № 4. С. 295–300.

Зотин А.А., Клейменов С.Ю. Эндогенные биоритмыинтенсивности потребления кислорода в индиви-дуальном развитии Lymnaea stagnalis (Lymnaeidae,Gastropoda) // Изв. РАН. Сер. биол. 2013. № 6.С. 653–660.

Зотин А.И. Изменение скорости продукции энтропииво время эмбрионального развития и роста // Био-физика. 1966. Т. 11. № 3. С. 554–557.

Зотин А.И. Диссипативные структуры и ψu-функции //Термодинамика биологических процессов. М.: Нау-ка, 1976. С. 203–205.

Зотин А.И. Термодинамическая основа реакции орга-низмов на внешние и внутренние факторы. М.: На-ука, 1988. 272 с.

Клейменов С.Ю. Энергетический обмен растущих ли-чинок сверчка Acheta domestica L. по данным непря-мой и прямой калориметрии // ДАН. 1997. Т. 353.№ 5. С. 690–692.

Крянев А.В., Лукин Г.В. Метрический анализ и обработ-ка данных. М.: Физматлит, 2010. 279 с.

Лампрехт И. Диссипативные структуры в физике, хи-мии и биологии // Термодинамика биологическихпроцессов. М.: Наука, 1976. С. 175–186.

Ляшенко А.В., Харченко Т.А. Годовая динамика энерге-тического обмена у дрейссены // Гидробиол. журн.1989. Т. 25. № 3. С. 31–38.

Малек-Мансур М., Николис Г., Пригожин И. Неравновес-ные фазовые переходы в химических системах // Тер-модинамика и кинетика биологических процессов.М.: Наука, 1980. С. 59–83.

Мина М.В., Клевезаль Г.А. Рост животных. М.: Наука,1976. 291 с.

Пантелеев П.А. Биоэнергетика мелких млекопитаю-щих. М.: Наука, 1983. 271 с.

Пригожин И. Введение в термодинамику необратимыхпроцессов. М.: ИЛ, 1960. 127 с.

Строганов Н.С. Экологическая физиология рыб. М.:Изд-во МГУ, 1962. 444 с.

Шахпаронов М.И., Павленко А.А. Неравновесная тер-модинамика и теория периодических процессов вмакросистемах. II. Химические колебания вблизисостояния термодинамического равновесия //Журн. физ. химии. 1988. Т. 62. № 8. С. 2275–2278.

Bennett A.F., Dawson W.R. Metabolism // Biology of Rep-tilia. N.Y.: Acad. Press, 1976. V. 5. P. 121–223.

Brett J.R. The metabolic demand for oxygen in fish, particu-larly salmonids, and a comparison with other vertebrates //Respirat. Physiol. 1972. V. 14. № 1/2. P. 151–170.

Brown F.A., Bennett M.F., Webb H.M. Persistent daily andtidal rhythms of O2-consumption in fiddle crabs //J. Cell. Comp. Physiol. 1954. V. 44. № 3. P. 477–505.

Chiba Y., Cutkomp L.K., Halberg F. Circadian oxygen con-sumption rhythm of the flour beetle, Tribolium confusum //J. Insect. Physiol. 1973. V. 19. № 11. P. 2163–2172.

Dawson W.R., Hudson J.W. Birds // Comp. Physiol. ofThermoregulation. N.Y.: Acad. Press, 1970. V. 1.P. 224–310.

Dmi’el R. Circadian rhythm of oxygen consumption insnake embryos // Life Sci. 1969. V. 8. № 24. P. 1333–1341.

Edwards S.W., Lloyd D. Oscillations of respiration and ade-nine nucleotides in synchronous cultures of Acan-thamoeba castellanii: mitochondrial respiratory controlin vivo // J. Gen. Microbiol. 1978. V. 108. Pt 2. P. 197–204.

Horne Y.A., Whitehead M. Ultradian and other rhythms inhuman respiration rate // Experientia. 1976. V. 32. № 9.P. 1165–1167.

Kayser C., Hildwein G. Evolution de la consommation d’oxy-gen et de l’activité du cobaye au cours du nycthémère //Arch. Sci. Physiol. 1974. V. 28. № 1. P. 1–23.

Kinnear A., Shield J.W. Metabolism and temperature regu-lation in marsupials // Comp. Biochem. Physiol. 1975.V. A52. № 1. P. 235–245.

McCormick S.A. Oxygen consumption and torpor in the fat-tailed dwarf lemur (Cheirogallus medius): rethinkingprosimian metabolism // Comp. Biochem. Physiol.1981. V. A68. № 4. P. 605–610.

Nicolis G. Fluctuations around non-equilibrium states inopen non-linear systems // J. Stat. Phys. 1972. V. 6.№ 2/3. P. 195–222.

Palmer J.D. Biological Clocks in Marine Organisms. N.Y.:Wiley, 1974. 173 p.

Prigogine I. La thermodynamique de la vie // La Recher-che. 1972. V. 3. № 24. P. 547–562.

Prigogine I., Nicolis G. On symmetry-breaking instabilitiesin dissipative systems // J. Chem. Phys. 1967. V. 46.№ 9. P. 3542–3549.

Stupfel M., Davergne M., Peramon A., Lemercerre C., Gour-let V. Rythmes ultradiens respiratoires de quatre petitsvertébrés // C. R. Acad. Sci. D. 1979. V. 289. № 9.P. 675–678.

Thermo Scientific™ Orion Star™ A223 Dissolved OxygenPortable Meter. 2020. https://www. fishersci.com/shop/products/orion-star-a223-dissolved-oxygen-portable-meter/p-4529337.

Way C.M., Wissing T. Seasonal variability in the respirationof the freshwater clams. Pisidium variabilc (Prime) andP. compressum (Prime) (Bivalvia: Pisidiidae) // Comp.Biochem. Physiol. 1984. V. 78A. P. 453–457.

Zeuthen E. Cyclic in oxygen consumption in cleaving eggs //Exp. Cell Res. 1960. V. 19. № 1. P. 1–16.

308


ЗОТИН

Endogenous Biorhythms of Mass Specific Rate of Oxygen Consumption in Individual Development of Planorbarius corneus (Planorbidae, Gastropoda)

A. A. Zotin*Koltsov Institute of Development Biology RAS, ul. Vavilova 26, Moscow, 119334 Russia


Two endogenous biorhythms of mass specific rate of oxygen consumption with periods of 10.8 and 4.7 weekswere detected in the late postlarval ontogenesis of freshwater gastropod mollusks Planorbarius corneus usinga singular spectral analysis. The local extreme points of both biorhythms in different individuals fall at thesame ages. Periods of both biorhythms are approximately the same in all the animals studied and remain un-changed throughout the individual development. Both biorhythms are fading and have a similar amplitude,which decreases from about 1.1 μL O2/(h g) up to 20 weeks to 0.26 μL O2/(h g) at the time of death. Thus,new, not previously described endogenous biorhythms associated with metabolic rate have been identified.

Keywords: oxygen consumption rate, ontogenesis, biorhythms, gastropods, Gastropoda, Planorbarius corneus

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 309–315

309

НАРУШЕНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙПРИ СТАРЕНИИ МОГУТ БЫТЬ ИСПРАВЛЕНЫ

© 2020 г. В. Я. Бродский*Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ул. Вавилова, 26, Москва, 119334 Россия

*e-mail: [email protected]Поступила в редакцию 15.03.2020 г.

После доработки 25.03.2020 г.Принята к публикации 27.03.2020 г.

В кратком обзоре суммированы данные о возможности компенсации одного из нарушений биоло-гии клеток при старении. В культурах гепатоцитов старых крыс, сравнительно с молодыми, сниже-ны амплитуды ритма синтеза белка. Как и другие околочасовые (ультрадианные) ритмы in vitro,ритм синтеза белка является маркером синхронизации клеточной популяции путем прямых меж-клеточных взаимодействий. Амплитуды ритма характеризуют выраженность взаимодействий. Ониувеличивались после добавления в среду культур ранее выявленных сигнальных факторов органи-зации межклеточных взаимодействий: ганглиозидов, фенилэфрина, мелатонина, глутаминовойкислоты, регуляторных пептидов. К тому же приводило введение трех последних сигнальных фак-торов крысе in vivo. Эффект сохранялся 2–3 дня. Добавление к среде культур сыворотки крови мо-лодой крысы увеличивало амплитуды ритма не меньше, чем сигнальные факторы. Сыворотка кровистарой крысы не изменяла ритм. Но сыворотка крови старой крысы, обогащенная ганглиозидами,действовала как молодая сыворотка. Эти данные и сведения литературы позволяют предложить ис-пользование сигнальных факторов прямых межклеточных взаимодействий, для улучшения состоя-ния старых людей.

Ключевые слова: межклеточные взаимодействия, старение, ультрадианные ритмы, синтез белка,ганглиозиды, катехоламины, мелатонин, глутаминовая кислота, регуляторные пептидыDOI: 10.31857/S0475145020040023

Одно из давно известных нарушений метабо-лизма при старении млекопитающих – измене-ния обмена белков (Makrides, 1983; Rattan, 2009).Снижается интенсивность синтеза белков – от 20до 80% в разных тканях. Кроме того, падает точ-ность сборки молекул, накапливаются дефектныебелки. Именно это приводит к развитию катарак-ты и нейродегенеративных болезней. В старостинарушается и катаболизм белков. Мы обнаружи-ли еще одно следствие старения – нарушение ки-нетики околочасового (ультрадианного) ритмаскорости синтеза белка (Brodsky et al., 2004).

Для того, чтобы стала понятна значимость на-шего открытия, необходимо сначала рассказать отом, что такое ультрадианные ритмы и какуюроль они играют в жизни разных организмов.Околочасовые (ультрадианные) ритмы – это рит-мы с периодами от 20 до 120 минут. Они принци-пиально отличаются от суточного ритма многихпроцессов, миллионами лет вынужденно приня-тыми всеми формами жизни из-за регулярнойсмены дня и ночи; суточные циклы регулируютсяу всех организмов на генетическом уровне. Длякоротких ритмов такого внешнего датчика-орга-

низатора нет. Они отражают фундаментальнуюсобственно клеточную регуляцию метаболизмана основе обратных связей, как пример фракталь-ной кинетики. Одно из свойств такой кинетики,замеченное нами, возможность клеток приспосо-биться к варьирующим внешним условиям путемпрямых межклеточных взаимодействий. Околоча-совые ритмы в клеточных культурах как раз харак-теризуют прямые межклеточные взаимодействия.Такие связи клеток, единственные у бактерий, про-тистов и растений дополняют центральные нерв-ные регуляции у животных (Brodsky, 2006). В кле-точных культурах обнаружение любого околочасо-вого ритма характеризует кооперацию клеток.Иного способа согласования колебаний, их син-хронизации в культуре нет. Любой околочасовойритм в клеточной культуре можно использовать какмаркер прямых взаимодействий клеток. Есть ритм,значит клетки согласуют свою активность, нетритма – колебания разрозненны, не синхронны.

Величина размаха колебаний, амплитуд средне-го ритма клеточной популяции in vitro соответствуетсинхронности популяции, величине кооперацииклеток в организации ритма: чем амплитуды боль-

УДК 591.3

ТОЧКАЗРЕНИЯ

310


БРОДСКИЙ

ше, тем больше клетки взаимодействуют. В несин-хронной популяции среднего (суммарного) ритманет: индивидуальные осцилляторы-клетки колеб-лются в противофазах.

Экспериментально показано, что клетки вкультуре самосинхронизируются путем накопле-ния в межклеточной среде некоторого фактора-синхронизатора, синтезируемого и выделяемого всреду самими клетками (Brodsky et al., 2000). Види-мый результат – околочасовой ритм. В плотныхкультурах с небольшими промежутками междуклетками ритм находят уже через несколько минутпосле смены среды на свежую бессывороточную. Вредких культурах с большими промежутками меж-ду клетками ритм обнаруживают через несколькочасов. На этом основана наша модель исследова-ния механизмов прямых межклеточных взаимо-действий: плотные и редкие культуры из клетокодной крысы. Очевидно, что выявление ритма вотмытых редких культурах после добавления ксреде некоего фактора, определяет синхронизаторритма. Если другой какой-то фактор ликвидируетритм в плотных культурах, найден десинхрониза-тор ритма. Разумеется, при этом учитываютсясвойства рецепторов, воспринимающих синхро-низирующий или десинхронизирующий сигнал.Так, среди семи семейств рецепторов серотонинадва блокируют синхронизацию клеток, а пятьстимулируют. Рецепторы одного семейства дела-ют дофамин синхронизатором клеток, а связав-шись с рецепторами другого семейства, тот же до-фамин становится дезорганизатором ритма.

В организме млекопитающих с развитой и со-вершенной нервной системой значимость прямо-го общения клеток, казалось бы, ограничена илидаже минимальна. Это не так. Во-первых, пря-мые взаимодействия остаются после денервацииоргана. Так ритм синтеза белка, маркера прямыхмежклеточных взаимодействий сохраняется вгепатоцитах после почти полной ваготомии и де-симпатизации печени. Во-вторых, в раннем эм-бриональном развитии задолго до становлениянервной системы околочасовые метаболическиеритмы сохраняются после торможения деленийдробления и даже после энуклеации яйцеклетки, тоесть прямые взаимодействия клеток являются базо-выми в эмбриогенезе. И, третье, эксперименталь-ное нарушение прямых взаимодействий клеток,приводит к их гибели.

Основной маркер наших работ – ритм синтезабелка в первичных культурах гепатоцитов крысы.Результаты подтверждены в исследованиях культуркератиноцитов, клеток околоушной железы, мезен-химных стромальных клеток, некоторых нейронов.Совпадение с межклеточными взаимодействиямиin vivo доказано введением синхронизаторов в кровькрысам. В лаборатории Д. Ллойда сходные законо-мерности обнаружены при изучении дыхания син-

хронных и несинхронных культур дрожжей и амеб(Lloyd, 1998, 2007), в лаборатории Д. Гилберта иК. Хэммонд – в исследованиях ферментов фосфо-рилирования и дефосфорилирования белков (Ham-mond et al., 1998; Gilbert and Hammond, 2008).

Ритм синтеза белка обнаружили в плотныхкультурах гепатоцита крыс от рождения и до ста-рости. Сильно различались амплитуды ритма умолодых и старых животных: в старости снижа-лись примерно вдвое. Следовательно, при старе-нии снижаются взаимодействия клеток, их ко-операция в синхронизации индивидуальных ко-лебаний интенсивности синтеза белка.

Введение в среду с плотными культурами гепа-тоцитов старых крыс синхронизаторов повышалоамплитуды ритма до уровня молодых животных.На рис. 1 приведен пример. Видно, что амплиту-ды ритма синтеза белка в плотных культурах гепа-тоцитов старой крысы (вес 610 г) значительноменьше, чем у молодой (280 г). Введение в среду скультурами этой старой крысы ганглиозидов илифенилэфрина вскоре (для фенилэфрина через2 мин) повышало амплитуды ритма клеток старойкрысы до уровня культур молодой крысы.

Таким же был результат влияния еще одногосинхронизатора – мелатонина (рис. 2). Здесьприведен пример прямого действия мелатонина по-сле введения его в культуральную среду (рис. 2а и 2б)и в опыте in vivo после инъекции мелатонина кры-се. Еще один синхронизатор, глутаминовая кис-лота, также как мелатонин, проникая в клетку,как и он, действовал через свои специфическиерецепторы (рис. 3). Из опытов in vivo следует, чтосинхронизатор, введенный в кровь (мелатонин)или поглощенный с пищей (глутаминовая кисло-та), то есть тоже через кровь, доходит до печени,синхронизирует там в течение 2 часов клетки(время постановки культур), и затем его эффектсохраняется еще сутки. Клетки помнят сигнал 2–4 дня.

Наши данные показали, что синхронизаторыритма синтеза белка, влияя на прямые взаимо-действия гепатоцитов, исправляют нарушениякинетики синтеза у старых животных. Гепатоци-ты – долго живущие клетки. После завершенияинтенсивных их делений вскоре после рождениякрысы, гепатоциты слабо обновляются (один ми-тоз на 10–20 тысяч клеток у взрослых). Без деленийгепатоциты могут жить полгода или год, то естьчетверть или половину жизни крысы. В старостимогут произойти изменения состояния гепатоци-тов. Известно, что в печени старых крыс и мышейзначительно снижена концентрация ганглиозидов,как суммарных, так и моносиалоганглиозида –GM1 (Nakamura et al., 1993; Ozkok et al., 1999).GM1 – один из двух синхронизаторов гепатоци-тов, из десятков содержащихся в печени (Brodskyet al., 2000). Изменения ганглиозидов в сыворотке


НАРУШЕНИЯ МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ ПРИ СТАРЕНИИ 311

крови известны (Senn et al., 1989; Bergelson, 1995).Значительно падает в крови старых крыс концен-трация другого синхронизатора – норадреналина(Прозоровская, 1983). Судя по нашим данным,

стареют не столько клетки, сколько межклеточ-ная среда. И это можно исправить.

Вывод подтвердили в изучении влияния сыво-ротки крови, то есть межклеточной среды на ки-

Рис. 1. Кинетика синтеза белка (Icorr, cpm) в плотных культурах молодой (280 г) или старой (610 г) крыс – (а) и (б).Действие на культуры старой крысы ганглиозидов (в) или фенилэфрина (г). Суточные культуры отмыты и перенесеныв свежую бессывороточную среду, (а) и (б) или в среду с 0.3 мкМ ганглиозидов на 30 мин (в) или в среду с 2 мкМ фе-нилэфрина на 2 мин (г); затем все культуры опять отмыты и в них определена кинетика синтеза белка (по материаламBrodsky et al., 2004). Прямая линия – среднее для данного варианта опыта; пунктирные линии – ошибка этой средней.

500

300

1000 60 120

Icorr(а)

0 60 120

(б)

0 60 120

(в)

0 60 120

(г)

Время, мин

Рис. 2. Влияние мелатонина на кинетику синтеза белка в плотных культурах старых крыс: (а) суточные плотные куль-туры 2-год (570 г) крысы; (б) в среду с такими культурами этой крысы ввели 5 нМ мелатонина; (в) другой старой крысе(540 г) ввели физраствор и поставили плотные культуры; (г) третьей старой крысе (580 г) ввели 0.017 мкг/кг мелатони-на и поставили такие культуры (по материалам Brodsky, Zvezdina, 2010).

450

250

50

Icorr(а)

550

350

150

(в) (г)

(б)

0 60 1200 60 120Время, мин

312


БРОДСКИЙ

нетику синтеза белка в гепатоцитах старых крыс(рис. 4). 10 мин нахождения культур в среде с 10%сыворотки старых крыс не изменили кинетикусинтеза белка сравнительно со средой без сыво-ротки. Сыворотка крови молодых крыс увеличи-ла амплитуды колебаний примерно вдвое. Так же

подействовала старая сыворотка, к которой доба-вили ганглиозиды. Значит, в старой сыворотке нехватает синхронизаторов, в этом случае, ганглиози-дов. По нашему показателю, прямым межклеточ-ным взаимодействиям, старую сыворотку можнопревратить в молодую.

Рис. 3. Действие глутаминовой кислоты на кинетику синтеза белка в плотных суточных культурах гепатоцитов моло-дой и старой крысы: (a) – культуры молодой крысы отмыты, перенесены в свежую нормальную среду и через 60 минисследован синтез белка; (б) – такие же культуры старой крысы; (в) – в среду культур той же старой крысы добав-лено 0.2 мг/мл глутаминовой кислоты; (г) – в среду добавили ингибитор рецепторов глутаминовой кислоты MCPG(0.01 мг/мл) и затем 0.4 мг/мл глутаминовой кислоты на 60 мин. Включение лейцина с поправкой на пул Icorr выра-жено в процентах от среднего уровня (100%) для каждого варианта опыта. Пунктир – ошибка этой средней (Brodskyet al., 2018).

150

100

50

Icorr%

150

100

50

(а) (б)

(в) (г)

0 0 60 12060 120Время, мин

Таблица 1. Амплитуды ритма синтеза белка у старых крыс в контроле и после введения синхронизатора

* Амплитуды ритма синтеза белка выражены в % от среднего уровня для каждого варианта опыта, принятого за 100%.

Контроль Амплитуда (контроль)* Синхронизатор Амплитуда (эксперимент)*

In vitro 24 ± 2 Фенилэфрин 62 ± 4In vitro То же Ганглиозиды 46 ± 3In vitro 23 ± 2 Мелатонин 65 ± 5In vitro 34 ± 2 Глутаминовая кислота 65 ± 4In vivo 38 ± 3 То же 68 ± 3In vitro 44 ± 3 Пептид семакс 91 ± 8In vitro То же Пептид HLDF-6 86 ± 7In vivo 34 ± 2 Семакс 77 ± 4In vivo То же HLDF-6 73 ± 4



В серии опытов выясняли действие сывороткина редкие культуры молодых крыс (Brodsky et al.,2004). В таких культурах, как уже отмечалось, по-сле смены нормальной среды ритм не определя-ется несколько часов. Добавление в среду 10% сы-воротки крови старых крыс привело к выявлениюритма, но его амплитуды были небольшими, чтоможно расценить как следствие малой концен-трации синхронизирующих факторов в сыворот-ке старой крысы. Добавление в среду с редкимикультурами сыворотки крови молодых крыс при-вело к обнаружению ритма с высокими амплиту-дами, такими как на рис. 4б и 4в.

В табл. 1 приведен материал более чем по50 крысам (наши данные (2000–2020). Главныйвывод: прямые взаимодействия, нарушенные встарости, можно нормализовать, влияя на свой-ства межклеточной среды.

Независимо Д. Ллойд и др. (Murrey et al., 1999;Lloyd, Murrey, 2005; Lloyd, 2008) в опытах надрожжах и амебах показали, что околочасовыеритмы этих одноклеточных организуются факто-рами среды, продуктами активности самих дрож-жей. Принципиально важно, что уже найден орга-низатор клеточных популяций дрожжей, общий спопуляциями клеток млекопитающих. Нашли вли-яние серотонина на синхронный рост культурCandida (Страховская и др., 1993) и Saccharomyces(Цавкелова и др., 2000). Рост дрожжей подавлял-ся при добавлении к среде n-хлорофенилаланина,ингибитора синтеза серотонина и ускорялся пара-дизолом, ингибирующим моноаминоокcидазу,фермент деградации моноаминов. Позже и в лабо-ратории Ллойда (Lloyd, Murrey, 2005) отмеченачувствительность популяции дрожжей к инги-биторам моноаминооксидазы; эти веществапредотвращают окисление биоаминов, включая

нейротрансмиттеры. В лаборатории А.В. Олески-на (2009) фундаментально обосновано влияниесеротонина, норадреналина на рост бактерий.

Уже в первых наших исследованиях обнару-жили любопытный факт. Небольшая часть кри-вых кинетики синтеза белка в гепатоцитах моло-дых крыс имеет низкие амплитуды, а единичныекривые старых животных не отличаются от моло-дых (рис. 5). По нашему показателю – амплиту-дам, характеризующим выраженность прямых

Рис. 4. Влияние сыворотки крови на кинетику синтеза белка (прямые межклеточные взаимодействия) в плотных куль-турах старой крысы (вес 560 г): (а) –плотные культуры крысы (вес 580 г) отмыли и перенесли в среду с 10% сывороткистарых крыс; через 10 мин исследовали синтез белка; (б) – такие же культуры перенесли в среду с 10% сыворотки мо-лодых крыс и также через 10 мин исследовали синтез белка; (в) такие культуры перенесли в сыворотку старых крыс,обогащенную 0.3 мл ганглиозидов (по материалам Brodsky et al., 2004).

600

400

200

Icorr(а)

0 30 60 90 120

(б)

0 30 60 90 120

(в)

0 30 60 90 120

Время, мин

Рис. 5. Вариабельность средних амплитуд кинетикисинтеза белка (прямых межклеточных взаимодей-ствий) у 15 старых (а) и 43 молодых (б) крыс (по дан-ным работ лаборатории цитологии ИБР).

Время, мин

15

10

5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

N

а

б

314


БРОДСКИЙ

межклеточных взаимодействий, 10–15% молодыхкрыс (всего их здесь 43) соответствуют макси-мальным значениям у старых животных. Что, по-моему, интереснее: две старые крысы из 15 изу-ченных не отличались по межклеточным взаимо-действиям от медиан молодых крыс.

Исправление кинетики синтеза белка путемпрямых межклеточных взаимодействий – част-ный пример адаптивности фракталов, околочасо-вого ритма синтеза белка, как их представителя. Вданном случае клетки приспосабливаются к средеих обитания. В межклеточной среде стариков нехватает синхронизирующих факторов. Добавле-ние в среду культур старых животных или в ихкровь синхронизаторов ритма синтеза белка омо-лаживает клетки.


Благодарю профессора В.В. Терских за обсуждениеи полезные замечания.


Все применимые международные, национальныеи/или институциональные принципы использованияживотных в экспериментах и условия ухода за нимибыли соблюдены. Люди в данном исследовании неучаствовали в качестве объектов.


Автор заявляет, что какой-либо конфликт интере-сов отсутствует.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫБродский В.Я., Мальченко Л.А., Лазарев Д.С., Бутори-

на Н.Н., Дубовая Т.К., Звездина Н.Д. Сигнал глута-миновой кислоты синхронизирует кинетику синте-за белка в гепатоцитах старых крыс в течение не-скольких дней. Память в метаболизме клеток //Биохимия. 2018. Т. 83. № 3. С. 429–435.

Олескин А.В. Нейрохимия и симбиотическая микро-флора человека // Вестник Российской Академиинаук. 2009. Т. 79. № 5. С. 431–438.

Прозоровская М.П. Возрастные изменения адреналинаи норадреналина в тканях крысы // Физиол. журн.СССР. 1983. Т. 69. С. 1244–1246.

Страховская М.Г., Иванова Э.В., Фрайкин Г.Я. Стиму-лирующее влияние серотонина на рост дрожжей Can-dida guilliesmondii и бактерий Streptococcus faecalis //Микробиология. Т. 62. № 1. С. 46–49.

Цавкелова Е.А., Ботвинко И.Б., Кудрин В.С., Олескин А.В.Детекция нейромедиаторных аминов у микроорга-низмов // Доклады РАН. 2000. Т. 372. С. 840–842.

Bergelson L.D. Serum gangliosides as endogenous immu-nomodulators // Immunol. Today. 1995. V. 16. P. 483–486.

Brodsky V.Y. Direct cell–cell communication. A new ap-proach derived from recent data on the nature and self-organization of ultradian (circahoralian) intracellularrhythms // Biol. Rev. Cambridge Phyl. Soc. 2006. V. 82.P. 143−162.

Brodsky V.Y., Zvezdina N.D. Melatonin as the most effectiveorganizer of the protein synthesis rhythm in hepatocytesin vitro and in vivo // Cell Biology Internat. 2010. V. 34.P. 1199–1204.

Brodsky V.Y., Nechaeva N.V., Zvezdina N.D., Prokazova N.V.,Golovanova N.K., Novikova T.E., Gvasava I.G., Fateeva V.I.Gangliodide-mediated synchronization of the proteinsynthesis activity in cultured hepatocytes // Cell BiologyInternational. 2000. V. 24. P. 211–222.

Brodsky V.Y., Nechaeva N.V., Zvezdina N.D., Novikova T.E.,Gvasava I.G., Fateeva V.I., Malchenko L.A. Small coop-erative activity of old rat’s hepatocytes may depend oncomposition of the intercellular medium // Cell BiologyInternational. 2004. V. 28. P. 311–316.

Brodsky V.Y., Malchenko L.A., Butorina N.N., Lazarev D.S.,Zvezdina N.D., Dubovaya T.K. Glutamic acid as en-hancer of protein synthesis kinetics in hepatocytes fromold rats // Biochemistry (Moscow). 2017. V. 82. № 8.P. 957–961.

Gilbert D.A., Hammond K.D. Phosphorylation dynamics inmammalian cells // Ultradian Rhythms from Moleculesto Mind / Eds. Lloyd D., Rossi E.L. Springer-Verlag,London. NY, 2008. P. 105–128.

Hammond K.D., Bhoola R., Bodalina U., Gilbert D.A. Dy-namic cells: temporal organisation and control of phos-phorylation // Trends Comparative Bioch. Physiol.1998. № 4. P. 75–88.

Lloyd D. Circadian and ultradian clock-controlled rhythmsin unicellular microorganisms // Adv. Microb. Physiol.1998. V. 39. P. 291–338.

Lloyd D. Biological time is fractal: Early events reverberateover a life time // J. Biosci. 2008. V. 33. № 1. P. 9–19.

Lloyd D., Murrey D.B. Ultradian metronome: timekeeperfor orchestration of cellular coherence // Trends in Bio-chemical Sciences. 2005. V. 30. № 7. P. 373–377.

Makrides S.C. Protein synthesis and degradation during ag-ing and senescence // Biol. Rev. Cambridge Phil. Soc.1983. V. 58. P. 343–422.

Murray D.B., Engelen F., Lloyd D., Kuriyama H. Involve-ment of glutathione in the regulation of respiratory os-cillation during a continuous culture of Saccharomycescerevisiae // Microbiology. 1999. V. 145. P. 2739–2745.

Nakamura Y., Hishimoto Y., Yamakawa T., Suzuki A. Age-dependent changes in GM1 and GD1a expression inmouse liver // J. Biochem. 1988. V. 103. P. 396–398.

Ozkok E., Cendiz S., Guevener B. Age-dependent changes inliver ganglioside levels // J. Basic. Clin. Physiol. Phar-macol. 1999. V. 10. P. 337–344.

Rattan S.I.S. Synthesis, modification and turnover of pro-teins during aging // Protein Metabolism andHomeostasis in Aging / Еd. Tavernarakis N. LandesBioscience and Springer Science, 2009. P. 1–13.

Senn H.J., Orth M., Fitzke E., Wieland H., Gerok W. Gan-gliosides in normal human serum. Concentrations, pat-tern and transport by lipoproteins // Europ. J. Biochem.1989. V. 81. P. 657–662.



Cell-Cell Interaction Disorders Associated with the Senescence Can Be RepairedV. Ya. Brodsky*

Koltzov Institute of Developmental Biology of the Russian Academy of Sciences,ul. Vavilova 26, Moscow, 119334 Russia


This mini-review summarizes the data concerning the possibility of compensating for one of senescence dis-orders. In hepatocyte cultures of old rats, comparing with young ones, the ultradian protein synthesis rhythmswere reduced in amplitudes. Like other ultradian rhythms detected in vitro, protein synthesis rhythm is amarker of cell population synchronization through direct intercellular interactions. Amplitudes of the rhythmcharacterize the intensity of interactions. The interactions were enhanced after adding to the culture mediumpreviously identified signaling factors of cell-cell communication, such as gangliosides, phenylephrine, mel-atonin, glutamic acid, some regulatory peptides. The same occurred after addition the factors in vivo. Thiseffect lasted for 2–3 days. The addition of the blood serum of young rats to the culture medium increased theamplitudes of protein synthesis rhythm as well. The blood serum of old rats did not change the rhythm am-plitudes. However, the blood serum of old rats enriched with gangliosides enhanced the amplitudes as effec-tive as a young rat serum. These data as well as some literature data allow to recommend the use of signalingfactors of cell-cell communication for improving the condition of old people.

Keywords: cell-cell communication, senescence, ultradian rhythms, protein synthesis, gangliosides, catecholamines, melatonin, glutamic acid, regulatory peptides

ОНТОГЕНЕЗ, 2020, том 51, № 4, с. 316–320

316

ТЕРАПИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ –СОСУД НАПОЛОВИНУ ПОЛОН ИЛИ НАПОЛОВИНУ ПУСТ?

© 2020 г. Ю. В. Сухановa, *, Е. А. Воротелякa, И. В. Лядоваa, А. В. Васильевa

aИнститут биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ул. Вавилова, 26, Москва, 119334 Россия*e-mail: [email protected]Поступила в редакцию 28.04.2020 г.

После доработки 30.04.2020 г.Принята к публикации 02.05.2020 г.

Актуальность скорейшего поиска и внедрения в медицинскую практику метода терапии особо тя-желых форм пневмонии COVID-19 обусловлена отсутствием эффективных методов лечения, уни-чтожающих возбудителя. Ожидания получить хороший клинический эффект от применения мезен-химальных стволовых клеток (МСК) не беспочвенны – имеется научное обоснование использова-ния МСК в терапии воспалительных заболеваний, в том числе доказанные механизмы их действия.Наряду с этим, надежных данных о механизме действия МСК при их системном введении человекукрайне мало, так же, как и данных о распределении клеток в организме и отдаленных последствияхтакого введения. Данные модельных экспериментов противоречивы как в отношении специфическо-го действия МСК, так и их безопасности. Если клинические исследования покажут приемлемое соот-ношение риск/польза применения МСК, страны, где такие исследования проводились, могут рассчи-тывать на их внедрение в медицинскую практику. В России следует инициировать экспериментальнуюпроверку наличия специфического действия МСК и риски их применения при COVID-19 в достаточ-ном объеме, и параллельно создавать механизм ускоренного, но обоснованного допуска биомедицин-ских клеточных продуктов в практику.

Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, МСК, SARS-CoV-2, пневмония, COVID-19,воспаление, цитокины, клинические исследования, биомедицинские клеточные продуктыDOI: 10.31857/S0475145020040102

Среди множества проблем клеточных техно-логий самым актуальным остается вопрос клини-ческого использования мезенхимальных стволо-вых клеток (МСК). Эти клетки привлекают вни-мание в качестве наиболее доступного ресурсаклеточных технологий, пригодных для решениямногих медицинских задач. Многолетние усилияпо трансдифференцировке МСК в другие типыклеток, в т.ч. нейральные, кроветворные, а такжев гепатоциты, кардиомиоциты и клетки поджелу-дочной железы как и многие другие, не привели кожидаемым результатам, однако попытки клини-ческого применения МСК в качестве системногорегулятора воспалительных и репаративных про-цессов продолжаются.

В связи с этим не стали неожиданными попыт-ки использовать МСК для лечения пациентов стяжелой формой SARS-CoV-2. Актуальность ско-рейшего поиска и внедрения в медицинскуюпрактику метода терапии особо тяжелых формпневмонии COVID-19 обусловлена отсутствиемтаргетных методов лечения, уничтожающих воз-будителя, а также особенностями пациентов,имеющих самый высокий риск смерти – это па-

циенты старшей возрастной группы, с осложне-ниями в виде иных заболеваний. Не следует забы-вать и о коммерческой мотивации стремлениявнедрить МСК в клиническую практику.

Ожидания получить клинический эффект отприменения МСК не беспочвенны – есть науч-ное обоснование использования МСК в противо-воспалительной терапии, в том числе доказанныемеханизмы их действия.

Одной из основных характеристик МСК являет-ся их иммуномодулирующая/иммунорегуляторнаяактивность, которая обеспечивается как прямымимежклеточными контактами, так и паракринно, засчет экспрессии на МСК и секреции ими большогоколичества молекул, обладающих иммуномодуля-торными свойствами (Lyadova et al., 2016; Jiang, Xu,2020). К таким молекулам относятся цитокиныTGF-β, IL-10, ферменты индоламин-2,3-диокси-геназа (IDO), аргиназа-1 (Arg1), индуцибельнаяNO-синтаза (NOS2), простагландин Е2 (PGE2),неклассические молекулы главного комплексагистосовместимости 1 типа (HLA-G2), молекулыCD39 и CD73 (экспрессируются на МСК и сов-местно обеспечивают расщепление АТФ до аде-

УДК 578;57.085

ТОЧКАЗРЕНИЯ


ТЕРАПИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ 317

нозина, обладающего иммуносупрессорной ак-тивностью), галектины (Gal-1 Gal-9). Эти факто-ры ингибируют пролиферацию Т-лимфоцитов иNK-клеток, образование и активность Т-хелпе-ров 1 типа (Th1), продукцию ими IFN-γ и TNF-α,созревание и антигенпрезентирующую функциюдендритных клеток и макрофагов, продукцию про-воспалительных цитокинов и хемокинов (IL-1α,IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α, CCL2, CCL5, IL-8). Засчет образования антагониста CCL2 МСК могуттакже ингибировать миграцию провоспалитель-ных CCR2+ моноцитов в очаг воспаления. Приэтом МСК стимулируют образование Т-хелперов2 типа (Th2) и регуляторных популяций Т- иВ-лимфоцитов (Treg и Breg соответственно). Пере-численные свойства МСК обусловливают их про-тивовоспалительную активность, которая потен-цируется в “воспалительном” микроокружении,в частности, в присутствии IFN-γ, TNF-α, чтопозволяет рассматривать МСК не как иммуносу-прессорную, а как иммунорегулирующую попу-ляцию клеток (Lyadova et al., 2016; Jiang, Xu, 2020).

Наличие у МСК противовоспалительной ак-тивности подтверждается многочисленными ис-следованиями in vivo. В моделях эксперименталь-ного сепсиса внутривенное введение МСК, полу-ченных из различных источников (костного мозга,жировой ткани, пуповинной крови) снижало уро-вень провоспалительных цитокинов TNF-α и IL-6,стимулировало продукцию IL-10 макрофагами,уменьшало тяжесть сепсиса и смертность живот-ных от него (Németh et al., 2002; Ahn et al., 2020). Вмодели эмфиземы легких у мышей терапия МСКкостного мозга человека и кондиционированнаяМСК среда оказывали существенное цитопротек-тивное действие при раннем применении (Ken-nelly et al., 2016). Эти защитные эффекты былиобусловлены значительными противовоспали-тельными, антифиброзными и антиапоптотиче-скими свойствами.

В то же время в исследованиях на животныхвстречаются указания на возможную недостаточ-ную эффективность и возможные побочные эф-фекты при введении МСК. Так, в модели сепсисана свиньях введение МСК не выявило сколь-ни-будь значимых положительных эффектов (Horaket al., 2020), не уменьшало гемодинамические из-менения и развитие полиорганной недостаточно-сти, вызванных сепсисом. У мышей в условияхвыраженного воспалительного процесса в легоч-ной ткани, вызванного инфекцией M. tuberculosis,МСК не обеспечивали эффективного снижениявоспалительного процесса (Nenasheva et al., 2017).

Побочные эффекты от введения МСК связаны,прежде всего, с их прокоагулянтной активностью ириском возникновения тромбозов, обусловленны-ми продукцией тканевого фактора и, возможно,активацией системы комплемента (подробно рас-

сматривается в обзоре Coppin и соавт. (Coppinet al., 2017). В экстраклеточных секретируемыхвезикулах, полученных от МСК, выявлено при-сутствие тканевого фактора (TF) и других белков,вовлеченных в систему коагуляции крови. Крометого, обнаружено, что некоторые МСК и их вези-кулы содержали аннексин V, что подразумеваетприсутствие фосфатидилсерина на их поверхно-стях, усиливающее образование сгустка крови (Si-lachev et al., 2019). При системном введении здоро-вым животным МСК могут вызвать блокаду ка-пиллярного русла легочной ткани и, помимоснижения продукции провоспалительных цито-кинов (IL-6, IL-12, IFN-γ), индуцировать повы-шение локального уровня хемокинов (CCL3,CCL4, RANTES) (Nenasheva et al., 2017).

Еще одним важным моментом является то, чтовызываемое МСК снижение воспалительного от-вета сопровождается ингибированием иммунныхреакций, ответственных за защитные функции ор-ганизма, в частности, за развитие противовирус-ного и противобактериального ответов (ингибиро-вание образования и активности Th1, NK-клеток).В связи с этим применение МСК в условиях ин-фекционной патологии представляется невоз-можным без четкого определения иммунологиче-ских критериев целесообразности их применения(“окон возможностей”).

Результаты клинических исследований МСКтакже весьма противоречивы (Gomez-Salazar et al.,2010) и зачастую не достигают поставленных це-лей. Наиболее разработанным является примене-ние МСК для смягчения рефрактерной к стерои-дам тяжелой реакции “трансплантат против хозя-ина”. Однако, например, на III фазе клиническихисследований было продемонстрировано отсут-ствие значимого клинического эффекта препара-та МСК ProchymalTM. Этот препарат, тем не ме-нее, был разрешен в некоторых странах для лече-ния этой патологии у детей, поскольку именно вэтой группе пациентов была заметна значимаяразница с группой плацебо. Проводятся исследова-ния для оценки потенциала МСК для лечения диа-бета, патологий печени, почек и легких, сердечно-сосудистой системы, опорно-двигательного аппа-рата, воспалительных, неврологических и аутоим-мунных заболеваний (Squillaro et al., 2016). Острыйреспираторный дистресс-синдром (ОРДС) такжерассматривается в контексте возможного приме-нения МСК (Han et al., 2019). Однако ОРДС явля-ется гетерогенным синдромом и на основаниианализа данных клинических исследований дела-ется вывод о наличии, по крайней мере, двух ти-пов ОРДС, из которых только один характеризо-вался более высокими уровнями воспалительныхбиомаркеров в плазме (Calfee et al., 2014). Возмож-но, терапия МСК для таких пациентов с гипервос-палительным типом ОРДС будет наиболее эффек-тивной.

318


СУХАНОВ и др.

В экспериментальных моделях вирусного ОРДСэффект МСК также не был однозначным. Вы-званное вирусом гриппа H1N1 повреждение лег-ких у мышей не купировалось введением МСК(Gotts et al., 2014). Однако введение МСК заметноослабляло травму альвеолярно-капиллярного ба-рьера у мышей, зараженных H5N1, которые име-ют высокий уровень воспаления, и повышало ве-роятность выживания животных (Chan et al.,2016). В клинических исследованиях введение ал-логенных МСК из жировой ткани больным сОРДС не оказало положительного клиническогоэффекта и не вызвало сколь-нибудь статистиче-ски значимых изменений в биохимических пока-зателях крови, в частности, в уровнях IL-8 и IL-6(Zheng et al., 2016).

Хотя пока нет результатов серьезных клиниче-ских исследований долговременных эффектов и со-отношения риск/польза внутривенного введенияМСК, по имеющейся информации, количествократкосрочных побочных эффектов и осложне-ний невелико. Среди краткосрочных осложне-ний обращают на себя внимание сообщения ориске тромбоза, вызванного терапией (Tatsumiet al., 2017). При введении здоровым людям ли-пополисахарида, предварительное введение МСК ввысокой дозе оказывало смешанное провоспа-лительное (повышенное высвобождение IL-8 инуклеосом) и противовоспалительное действие(повышенное высвобождение IL-10 и TGF-β), атакже увеличивало активацию системы коагуля-ции и снижало фибринолитическую активностькрови (Perlee et al., 2018).

Пока нет ответа и на самый важный вопрос овозможной индукции трансплантированнымиМСК опухолевого роста за счет модификацииопухолевой стромы (Direkze et al., 2004).

Таким образом, надежных данных о механиз-ме действия МСК при системном введении чело-веку крайне мало, так же, как и данных о распре-делении клеток в организме и отдаленных по-следствиях такого введения, а данные модельныхэкспериментов противоречивы как в отношенииспецифического действия МСК, так и их без-опасности.

Тем не менее, вскоре после начала развитияпандемии SARS-Cov-2 были инициированы кли-нические исследования с использованием МСКдля лечения тяжелых проявлений этой инфек-ции. Большая часть таких исследований начата вКНР, однако вскоре появились сообщения и издругих стран, и их число постоянно растет (болеечем в два раза за неделю).

В связи с этим нами была предпринята попыт-ка оценить масштаб исследований возможноготерапевтического эффекта МСК при COVID-19человека на основе информации международнойбазы данных клинических исследований Clinical-

Trials.gov (https://clinicaltrials.gov) (табл. 1 в Прило-жении на сайте журнала “Онтогенез”). На моментнаписания статьи было официально зарегистриро-вано 29 клинических исследований биомедицин-ских клеточных продуктов (БМКП) (включая 1 от-мененное) с целью лечения осложнений COVID-19,а также одно исследование клеточных везикул. Изних 18 соответствуют критериям клинических ис-следований, в то время как остальные могут бытьописаны термином “Клиническая апробация”.Кроме того, по имеющимся данным ряд клини-ческих исследований проводится с регистрациейтолько в КНР (Golchin et al., 2020). В качестве ис-точника для клеточного продукта чаще всего ис-пользованы клетки пупочного канатика, что, ве-роятно, объясняется доступностью и/или свой-ствами биоматериала.

Вероятно, отсутствие серьезных доказательствэффективности продуктов на основе живых кле-ток человека при COVID-19 не позволило их упо-мянуть в выпущенном 21 апреля 2020 года Руковод-стве по лечению COVID-19 (Coronavirus Disease2019 (COVID-19) Treatment Guidelines) Националь-ных институтов здоровья США (NIH) как возмож-но перспективных. В Руководстве отмечается, что внастоящее время ни один препарат не является без-опасным и эффективным для лечения COVID-19, аэмпирически подобранные и применяемые в на-стоящее время средства лечения оказывают незна-чительное сдерживающее действие на развитиесимптомов пневмонии, в том числе легочной недо-статочности, приводящей к летальному исходу. ВРекомендациях отмечается, что не существуетодобренных FDA лекарств, специально предназна-ченных для лечения пациентов с COVID-19 и недо-статочно данных для того, чтобы рекомендоватьприменение противовирусной или иммуномодули-рующей терапии у пациентов с COVID-19 (Corona-virus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guidelines).Тем не менее, если клинические исследования по-кажут приемлемое соотношение риск/польза при-менения МСК, страны, где такие исследованияпроводились, могут рассчитывать на их внедрениев медицинскую практику, вероятно, не ранее чемчерез год.

В России, однако, действующее законодатель-ство в области БМКП не предполагает не толькокаких-либо механизмов ускоренной, либо упро-щенной регистрации БМКП (в отличие от мно-гих зарубежных стран, где для таких случаевпредусмотрены механизмы Fast Track (быстрыйвариант) или условной регистрации), но и меха-низма ускоренного получения разрешения напроведение клинических исследований. Даже ес-ли специальный механизм для БМКП будет раз-работан и одобрен, критическим вопросом явля-ется проведение доказательных доклиническихисследований и изготовление образцов для кли-нических исследований на лицензированном


ТЕРАПИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫМИ СТВОЛОВЫМИ КЛЕТКАМИ 319

согласно надлежащим правилам производствеБМКП.

Представляется крайне важным, с одной сторо-ны, не пропустить шанс для медицины получитьновый эффективный инструмент лечения неизле-чимых обычными методами заболеваний (либо со-стояний с высокой фатальностью), а с другой – недопустить массового применения БМКП с неоце-ненным соотношением риск/польза. Сначала сле-дует провести экспериментальную проверку нали-чия специфического действия МСК и риски ихприменения при COVID-19 в достаточном объемеи параллельно создавать механизм ускоренного,но обоснованного допуска БМКП в практику. Впротивном случае, выявление серьезных побоч-ных эффектов может произойти через какое-товремя и полностью дискредитировать БМКП.


Работа была выполнена в рамках ГосзаданияИБР РАН № 0108-2019-0004. 2020 год.


Настоящая статья не содержит описания выпол-ненных авторами исследований с участием людей илииспользованием животных в качестве объектов.



ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ Таблица 1 (см. на сайте журнала "Онтогенез": http://ontogenez.org/?show=content4).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫAhn S.Y., Maeng Y.-S., Kim Y.R. et al. In vivo monitoring of

dynamic interaction between neutrophil and human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cell in mouse liver during sepsis // Stem Cell Research & Ther-apy. 2020. V. 11. № 1. P. 44–59.

Calfee C.S., Delucchi K., Parsons P.E. et al. Subphenotypes in acute respiratory distress syndrome: latent class anal-ysis of data from two randomized controlled trials // Lancet Respir. Med. 2014. V. 2. №. 8. P. 611–620.

Chan M.C., Kuok D.I., Leung C.Y. et al. Human mesenchy-mal stromal cells reduce influenza A H5N1-associated acute lung injury in vitro and in vivo // Proc Natl Acad Sci U S A. 2016. V. 113. № 13. P. 3621–3626.

Coppin L., Sokal E., Stéphenne X. Thrombogenic risk in-duced by intravascular mesenchymal stem cell therapy: Current status and future perspectives // Cells. 2019. V. 8. № 10. P. 1160.

Coronavirus Disease 2019 (COVID-19) Treatment Guide-lines. https://www.covid19treatmentguidelines.nih.gov/).

Direkze N.C., Hodivala-Dilke K., Jeffery R. et al. Bone mar-row contribution to tumor-associated myofibroblasts and fibroblasts // Cancer Res. 2004. V. 64. № 23. P. 8492–8495.

Golchin A. Seyedjafari E., Ardeshirylajimi A. Mesenchymalstem cell therapy for COVID-19: present or future //Stem Cell Rev. Rep. 2020. P. 1–7.

Gomez-Salazar M., Gonzalez-Galofre Z.N., Casamitjana J.et al. Five decades later, are mesenchymal stem cells stillrelevant? // Front Bioeng. Biotechnol. 2020. V. 8.№. 148. P. 1–13.

Gotts J.E., Abbott J., Matthay M.A. Influenza causes pro-longed disruption of the alveolar-capillary barrier inmice unresponsive to mesenchymal stem cell therapy //Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2014. V. 307.№ 5. P. L395–L406.

Han J., Li Y., Li Y. Strategies to enhance mesenchymal stemcell-based therapies for acute respiratory distress syn-drome // Stem Cells Int. 2019. № 5432134. P. 1–12.https://clinicaltrials.gov.

Horak J., Nalos L., Martinkova V. et al. Evaluation of mes-enchymal stem cell therapy for sepsis: a randomizedcontrolled porcine study // Front Immunol. 2020. V. 11.№ 126. P. 1–13.

Jiang W., Xu J. Immune modulation by mesenchymal stemcells // Cell Prolif. 2020. V. 53. P. e12712.

Kennelly H., Mahon B., English K. Human mesenchymalstromal cells exert HGF dependent cytoprotective ef-fects in a human relevant pre-clinical model of COPD //Sci. Rep. 2016. V. 6. № 38207. P. 1–11.

Lyadova I.V., Sosunova E., Nikolaev A.V. et al. Mesenchymalstem cells and myeloid derived suppressor cells: Com-mon traits in immune regulation // J. Immunol. Res.2016. 2016: 7121580.

Németh K., Leelahavanichkul A., Yuen P.S. et al. Bone mar-row stromal cells attenuate sepsis via prostaglandinE(2)-dependent reprogramming of host macrophages toincrease their interleukin-10 production // Nat. Med.2009. V. 15. № 1. P. 42–49.

Nenasheva T., Nikolaev A., Diykanov D. et al. The introduc-tion of mesenchymal stromal cells induces different im-munological responses in the lungs of healthy and M. tu-berculosis infected mice // PLoS One. 2017. V. 12. № 6.e0178983.

Perlee D., van Vught L.A., Scicluna B.P. et al. Intravenousinfusion of human adipose mesenchymal stem cellsmodifies the host response to lipopolysaccharide in hu-mans: a randomized, single-blind, parallel group, place-bo controlled trial // Stem Cells. 2018. V. 36. № 11.P. 1778–1788.

Silachev D.N., Goryunov K.V., Shpilyuk M.A. et al. Effect ofMSCs and MSC-derived extracellular vesicles on hu-man blood coagulation // Cells. 2019. V. 8. № 258.P. 1–23.

Squillaro T., Peluso G., Galderisi U. et al. Clinical trials withmesenchymal stem cells: an update // Cell Transplant.2016. V. 25. № 5. P. 829–848.

Tatsumi K., Ohashi K., Matsubara Y. et al. Tissue factor trig-gers procoagulation in transplanted mesenchymal stemcells leading to thromboembolism // Biochem. Biophys.Res. Commun. 2013. V. 431. № 2. P. 203–209.

Zheng G., Huang L., Tong H. et al. Treatment of acute respi-ratory distress syndrome with allogeneic adipose-de-rived mesenchymal stem cells: a randomized, placebo-controlled pilot study // Respir. Res. 2014. V. 15. № 39.P. 1–10.

320


СУХАНОВ и др.

News and Views Mesenchymal Stem Cells Therapy –Is a Glass Half Full or Half Empty?

Yu. V. Sukhanov1, *, E. A. Vorotelyak1, I. V. Lyadova1, and A. V. Vasiliev1

1Koltzov Institute of Development Biology of the Russian Academy of Sciences, ul. Vavilova 26, Moscow, 119334 Russia*e-mail: [email protected]

The relevance of the speedy search and implementation to the medical practice new methods of severe formsof pneumonia COVID-19 treatment is to the lack of effective methods that destroy the pathogen. Expecta-tions for a good clinical effect of use MSCs are not unfounded – there is a scientific justification for the useof MSCs, including proven mechanisms of their action. Reliable data on the mechanism of action of MSCsduring systemic administration to humans are extremely scarce, as well as the data on the distribution of cellsin the body and the long-term consequences of the administration. The data of model experiments are con-tradictory both with respect to the specific action of MSCs and its safety. If clinical trials show an acceptablerisk/benefit ratio for the use of MSCs, countries where such studies have been conducted can count on theirintroduction into medical practice. In Russia, an experimental verification of the presence of a specific actionof MSCs and the risks of their use with COVID-19 in sufficient quantities should be initiated, and in parallel,a mechanism should be established for the accelerated but substantiated admission of cell products.

Keywords: mesenchymal stem cells, MSCs, SARS-CoV-2, pneumonia, COVID-19, inflammation, cytokines,clinical trials, biomedical cell products

Documents

Журнал биологии развития ОНТОГЕНЕЗontogenez.org/archive/2020/4/Ont4_20v51.pdf · 2020-07-07 · Журнал биологии развития ОНТОГЕНЕЗ