Upload
donga
View
228
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
FABAD Farın. Bil. Der.
8, 181 - 196, 1983
FABAD J. Phann, Sci,
8, 181 - 196, 1983
(}3ilün51,el 'Uatantalaı '
Lipozomlar. 1. Özellikleri ve Hazırlama Yöntemleri
Hayat ALKAN(*)
- ---- ---------özet : Fosfolipid moleküllerinin sulu ortamda özel dizilişiler gös
tererek ve aralarına sulu fazı alarak kapalı cisimcikler (lipozomlar) oluşturduğu yaklaşık yirmi yıldır bilinmektedir. Önceleri bu cisimcikler ınembran modeli , daha sonralarıda ilaç taşıyıcıları olarak kullanılmışlardır.
Lipozomlar üzerinde hazırlanan ve iki bölümden oluşacak olan derlemenin bu birinci bölümünde konu, fizikokimyasal ve teknolojik açıdan incelenmiştir. Lipozomların yapısal özellikler i ve hazırlanış yöntemleri ~.nlatılmıştır. Derlemenin ikinci bölümünde lipozomların eczacılık ve tıptaki uygulanışından bahsedilecektir.
LIPOSOMES .1. PROPERTIES AND METHODS OF PREPARATION
Sununary : For the !ast twenty years it h as been known that , aqueous dispersions of phospholipids form closed bilayer structures (liposomes). These lipid vesicles were first used as model membrane systems and more recently as drug carrier systems.
This review article on !iposomes will be composed of two parts. The physico - chemical and technical aspects of the topic are covered in this first part. The morphological properties and the preparation techniques of the liposomes are described. In the second part of the review the use of liposomes in medical and pharmaceutical sciences will be explained and discussed.
- - - -- - --- - --- --·--- ----
( * ) A.Ü. Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı, Tandoğan - Ankara.
181
GİRİŞ
Bir ila~ şeklinin içindeki etken madde, etkisini gösterebileceği hücrelere ulaşabilinceye kadar vücutt<t
ki birçok molekül, hücre, membran ve organlarla karşılaşır. Farmakolo
jik etkisi olan maddelerin bir kısmı sağlam dokular için belirgin derecede toksiktir. Aynca, madde vücıı
da girdikten sonra değişikliğe u~
rayabilir, inaktive olabilir veya has
ta dokuya az bir miktarda ulaşa·
bilir. Yukarıda bahsedilen sakın
calar nedeniyle son yıllarda etken maddeyi istenen dokuya taşıyan özel
taşıyıcı sistemlerin geliştirilme>i
konusunda yoğun araştırmalar yapılmaktadır (1, 2). Bu taşıyıcı sistemler, etken maddeyi yapılarınd'l.
saklıyarak, hasta dokulara ulaştı
rırlar ve ancak etki istenen bölg~
de, serbest bırakırlar. Böylece sağlam dokular ilacın yan etkilerinden, ilaç da yıkıcı ortam koşull9.
rından korunmuş olur. Ayrıca ilaç taşıyıcı preparatlar, etken madde
nin hemen hemen tümünü hasta dokuya ilettiği için çok daha düşük dozlarda hazırlanabilirler. İşte son yıllarda üzerinde çok araştırma ya
pılan bu taşıyıcı sistemlerin en önemlilerinden biri lipozomlard :.r (3 - 6).
Lipozomların yapıları hücre membran yapısına çok benzediği
için ilk kullanımları hücre memb
ranı ile ilgili çalışmalarda model
olaraktır (7 - 10). Lipozomlar toksik ve immunojenik değildirler, hücre membranı ile geçimlidirler, or
ganizmada istenen belli bölgele ~·e
182
gönderilebilirler ve biyolojik olar~~k
yıkılabilirler. Bütün bu çekici özelliklerinden dolayı Iipozomlar yet· mişli yılların başından beri ilaç taşıyıcıları olarak geliştirilmekt.':
dir (3 - 6).
Bu tarama yazısında oldukça yeni bir ilaç şekli olan lipozomların tanıtılması ve lipozomlarla ilgi
li günümüze dek geçirilen aşamala
rın anlatılması amacı güdülmüştür.
Konu çok geniş kapsamlı olduğu
için iki kısımda incelenmesi uygun görülmüştür. Birinci bölümde lipozomların morfolojik özellikleri ve hazırlanış yöntemleri anlatılmaya
çalışılacaktır. Derlemenin ikinci bölümünde ise lipozomların tıp ı.:e
eczacılıktaki kullanım yerleri ve bu
arada klinik uygulamalarından bahsedilecektir.
LİPOZOMLARIN TANIMI VE
YAPILARI
Lipozomlar, aralarında sulu faz bulunan, bir veya daha çok sayıda biyolojik membrana benzer _ yapı
daki lipid tabakalarının oluştu_rdu
ğu, mikroskopik boyutlarda, genr.1-likle küre şeklinde cisimciklerdir (Şekil 1 ve Şekil 3).
İlk defa Bangham ve arkad:ı5-
ları (11) tarafından fark edilen li
pozomlar, isminden de anlaşılaca~~ı gibi lipid moleküllerinden oluşur
lar, yapılarının temel elemanı fosfolipidlerdir. Benzer şekilde yağ
asitlerinden ufazomların (12) ve yü
zey etken maddelerden de, yüzey
etken madde keseciklerinin (13) h:.ı-
Foafolipid Mcl•küllt ri
Htk5ogo-nııt F.aı.
Smel<tlk Mezofaz
d
.Lipozom
Şekil ı. Fosfolipid Moleküllerinin Sulu Ortamda Dizilişleri
zırlanabileceği ve bu cisimcikleriı1
özellik ve yapılarının Upozomların
kine yakın olduklan gösterilmiştir.
Bazı yayınlarda lipozom sözcüğü
onlar için de kullanılmıştır. Bu derlemede lipozom sözcüğü ile ılo
ğal veya sentetik fosfolipidlerin oluşturduğu kesecikler kastedilecektir .
Lipozom oluşturan fosfolipid molekülleri amfifil özelliktedir v~
suyu seven hidrofilik baş ile yağı
seven hidrofobi~ hidrokarbon zincirlerinden oluşurlar (Şekil ıa.1 •
Fosfopilid çözeltisi kuruluğa kad2.r uçurulduktan sonra geriye kalan artık üzerine az bir miktar su il::l.ve edilirse bu su lipid moleküllerinin hidrofilik başlan tarafınd:ın
tutulur ve moleküller birbirine ya~laşarak ortada su bulunan silindirik şekilde partiküller oluşturur
(Şekil 'lb). Heksagonal faz olarak tanınan bu geometrik diziliş lipid moleküllerinin hidrofil başların•.'l.
elektriksel özelliğinden ve suya karşı olan ilgisinden doğmaktadır. Bu tip diziliş ortamdaki su miktaıı
%5 a/a civarında iken izlenir. Fo:;folipid molekülleri sabun ve deterjanlar şeklindeki diğer amfifil mad-
deler gibi daha fazla sulu ortamda
(%15 • %50 a/a) miseller ve mono· merler halinde dağılmayıp, tab:ı-
kalar şeklinde dayanıklı oluştururlar. Bu yapı sıvı
özelliğindedir ve myelin
dizilişler
kristal şekiller
veya smektik mezofaz isimleri ile de anlatılabilir (Şekil le). Ortamda %50 a/a dan fazla su bulunursa, hidrofobik uçların sudan kaçma. eğilimi sonucu fosfolipid molekülleri çift moleküllü tabakalar halinde dizilerek iç içe dairesel halk:ı·
lar oluşturur. Lipozom adı yerileı:ı
bu küresel parçacıklar ortama bir· birinden bağımsız olarak dağılırlar (Şekil ld) (9).
Lipozomlann özellikleri kendilerini oluşturan fosfolipid bileşik
lerinin dizilişleriyle ve yapılarıyh
çok yakından ilişkilidir. Şekil 2 ~e lipozom oluşturan fosfolipidler göateril.miştir. Hldrofilik baş grupları
pH ye göre anyonik veya zwitteriyonik olabilir. Hidrokarbon zinciri ise değişik uzunlukla ve değişik ölçüde doymuş olabilir. Biyolojik kay
naklı fosfollpidlerin alkil zlncirle~i
oldukça uzundur (en aşağı 16 karbon içerirler ) ve doymamış yağ asitleri içerirler.
183
•
o il
·-
R-C-0-CH 1 2
I
R-C-0-CH o il 1 il O CH-0-P-X
2 . l o-
X = -OH Fosfatidik Asit
X = -OCH2CH2N+ (CH3) 3 Fosfa
tidilkolin
X = -OCH2CH2NH2 Fosfatidileto
nalamin
X =. -OCH2CHNH Fosfatidilserı!'l
1 COOH
X -OCH2CHCH20H Fosfatidil-
j gliserol
OH
R ve Rl = !ı:ağ Asitleri
Hoymuş Yağ Asitleri
CH3(CH2 )nCOOH
n = 10 laurik
n = 12 miristik
n = '14 palmitik
n = 16 stearik
n = 18 araşidik
Doymamış Yağ Asitleri
Oleik
Linoleik
Linolenik
Şekil 2. Lipozom Oluşturan Fosfolipidlerin Yapısı
Moleküler seviyede lipozomları:1
morfolojisinin anlaşılması. fosfoli
pidlerin kimyasal yapılarının inc..:
lenmesi ile gerçekleşebilir. Alkil
zincirinin oluşma şekli, baş gru.11-
Iarının sayısı, baş gruplarını hitl
rate eden su moleküllerinin sayısı
ve ,c;u - lipid etkileşme kuvvetleri !i
pozom oluşmasına ve özelliklerine
çok etkiyen faktörlerin arasında
sayılabilir (14) .
Normalde bir fosfotidilkolin
molekülü 23 molekül su ile birle
şir. Bunların 11 molekülü lipidin
iç kısmında tutulmuştur, 12 mole
külü ise baş gruplarını hidratiz.?
eder. Lipozomlardan suyun ayrıl-
184
ması için gerekli işin deneysel ola
rak ölçülmesi, faz değişimine sebep
olan serbest enerji yüklerinin direkt
saptanmasını sağlar (15).
Hidrokarbon klsımlar arasında
ki hidrofobik etkileşme ve baş grup
larındaki elektrostatik itme ku·ı
vetleri sonucu, lipidler çift mole
küllü tabakalar halinde ve bükük
bir diziliş gösterirler. Küresel 5e
killerde bükülme en yüksek düzey
de olduğu için dış yüzey alanı iç
yüzeyden büyüktür. Dış yüzeydeki
moleküllerin sayısı iç taraftakile
re kıyasla iki kat daha fazladır.
Bütün bu belirtilen noktalar göz
önüııe alınacak olursa, ileride anla-
tılacağı gibi tek tabakalı lipozomların hazırlanmasında ultrasonik enerji gereksinimine şaşmamak gerekir (16) .
Lipozomların yapılarına fosfolipidlerin yanında başka maddeler de girer. Bunlar :
- Stabiliteyi artırıcı maddel~r
(kolesterol, a - tokoferol gibi)-. - Hedeflenmeyi sağlayıcı mad
deler (immunoglobulinler, stearil amin, seti! fosfat, glikolipidler gibi) .
- Etken maddeler (antineoplastik maddeler, enzimler, hormonlar, şelat yapıcı ajanlar gibi), diye üç
grupta toplanabilir. Bu katkı maddeleri ve etki mekanizmaları il~
ilgili bilgiler derlemenin ikinci bölümünde ayrıntılı olarak verilecektir.
Lipozomların yapısal özellikleri elektron mikroskop <I 7 - 21), nükleer magnetik resonans (21 - 24), floresans (25 - 29), !eser. raman ve infrared spektroskopi (30 - 31 ), diferansiyel skenning kalorimetfi (532), ve X- ışını difraksiyonu (21)
~ibi yöntemleriyle incelenmiştir .
LİPOZOMLARIN FAZ DEGİŞİMİ
Lipozomların faz değiştirme
özelliklerinden gerek lipozom preparatları hazırlanırken gerekse kullanılmalarında çok yararlanılır. Ayrıca bu özellikleri lipozomlann stabilitelerini de çok etkiler. Burada bahsedilen fazlar jel (katı) ve sıvı
kristal (sıvı) fazlarıdır. Bir fazdan diğer faza geçiş üç şekilde sağla
nabilir.
Sıcaklığa Bağlı Faz Değişikliği :
Lipozomlar ısıtıldlltları vey.ı
soğutuldukları zaman, belli bir sıcaklıkta faz değişimi görülür. Bu sıcaklığa faz değişimi sıcaklığı veya kritik sıcaklık denir. Lipozomlar faz değişimlerinde belirgin yapısal değişiklikler gösterirler, ancak ·bu değişiklikler dış görünümlerini etkilemez yani yine smektik mezofaz veya çift moleküllü tabakalar halinde kapalı cisimciklerdir . Kritik sıcaklığın altında tabakaları oluşturan çift sıra dizilmiş fosfolipidler çok muntazam dizilmiş
lerdir ve katı haldedirler. Belirtilen sıcaklığın üzerinde ise lipid moleküleri sıvıdırlar. Lipozomların jel halinden sıvı kristal şekline dönüş
leri çeşitli araştırıcılar tarafından
değişik yöntemler kullanılarak incelenmiştir (31 - 37). Termodim.mik parametreleri elde etmede uygulanan en iyi metod diferansiyel skennig kalorimetridir. Bu yöntemle yapılan yeni bir çalışma.,
fosfotidilkolin tabakalarının faz değişmesine fosfolipidlerin zincir :.ı
zunluğunun ve bu zincirlerln gliserol iskeletine ·bağlanış durumunun etkisi olduğunu göstermiştir
(32).
Konsantrasy~n_a Bağlı Faz De
ğişimi:
Lipozom oluşturan fosfolipidler suda çözünmeyip şişen cinstendir. Yukarıda anlahldığı ve. Şekil
ı de gösterildiği gibi değişik su konsantrasyonunda değişik fazlara rastlanır (9, 19). Yüksek lipid kon-
185
santrasyontında si·;ı kristaller olu
şur, daha düşük lipid konsantras
yonlarında ise tabakaları oluşturan
1'osfolipid molekülleri ortamın faz
la suyundan kaçabilmek için daha
sıkışık bir diziliş oluşturur. Aşağıda
bahsedilecek olan tek tabakalı ve
yakın büyüklükteki lipozomlar %i1
den daha düşük lipid konsantras
yonlarında hazırlanırlar.
Katkı Maddelerine Bağlı Faz
Değişimi:
Aynı cins saf Iıpid molekülleri
için çok keskin olan faz değişimi,
katkı maddelerin varlığında daha ya
vaş olabilir veya hiç oluşmuyabi
Iir. Kardiolipid 1e fos1'atidilglise
rolün çift moleküllü tabakalannı.n
faz değişimine bir ve iki değerlikli
metal iyonlarının etkili olduğu gös
terilmiştir (19). Doğal membranda
ki varlığından dolayı lipozomlara
kolesterol ilavesinin etkisi araştı
rıbnıştır (19, 38 - 42). Genelde ko
lesterol lipozomların jel şeklinden
sıvı kristal şekline dönmesini zor
laştırır, ve lipozomların sertliğini
faz değişimi sıcaklığının altında
azaltır, üzerinde ise arttırır. Saf
dipalmitoilfosfotidilkolin Iipozomla
n 22°C de jel durumunda iken ko-
. lesterol ilave edilince aynı sıcak
lıkta sıvı kristal özelliği gösterirler
(41). Yakın zamanda yapılan bir
çalışma lipozomlann faz değiştirme
sıcaklığını ölçmek için yeni bir tek
nik ileri sürmektedir (42). Fosfo
lipidlerin polar gruplarının oluş
turduğu komplekslerin, fluoresans
spektrumları ile saptanması esası·
186
na dayanan bu te.lmikle kolestero
lün dipalmitoilfosfotidilkolin lipo
zomlarına etkisi araştırılmıştır. El
de edilen bulgulara göre, kolestero
lün %9 gibi az konsantrasyonları
polariteyi arttırıcı ve %13 veya da
ha fazla konsantrasyonlarının po
larileyi azaltıcı etkisi vardır. Koles
terolün, fosfolipid molekülleri ar~ı
sındaki yerleşim durumu henüz tam
açıklanamamıştır, ancak fosfolipid
lerin zincirlerine paralel olarak, ve
3{3 - OH grubunun, gliserol iskele
tine yakın bir şekilde durduğu, ve
alkil zincirlerinin hareket serbest
liğini kısıtlayıcı bir etkisi olduğu
hakkında genel bir kanı vardır (39).
LİPOZOMLARIN
SINIFLANDIRILMASI
Lipozomlar büyüklüklerine, ta
baka sayılarına ve elde ediliş
yöntemlerine göre dört sınıfta top
lanabilirler ~ - Çok Tabakalı Lipozomlar
(Multilameller Vesicles, MLV)
- Küçük Tek Tabakalı Lipo
zomlar (Small Unilameller Vesicles,
SUV) - Büyük Tek Tabakalı Lipo-
zomlar {Large Unilameller Vesicles,
LUV) 1
- Ters Faz Buharlaştırma Tek-
niği İle Hazırlanan Lipozomlar (Re·
verse Phase Evaporation Vesicles,
REV). Lipozonıların gruplarına göri?
özellikleri Papahadjopoulos ve ar·
kadaşları (3) tarafından saptanmış
ve sonuçlar Tablo l 'de gösterilmiş
tir.
Tablo 1. Lipozom Sınıflarının Karşılaştırılması
ÇAP
(mikrometre) TUTMA
KAPASİTESİ (%) TUTULAN HACIM (µ1 ml-1)
LİPOZOMLARIN
HAZIRLANMASI
MVL
0.2 - ıo
5 - 15
4
Lipozomları hazırlama tekniği
oluşacak lipozomların tabaka sayı
sına, büyüklük dağılımına, sulu fazın ne kadar etken madde tutabileceğine ve tabakaların geçirgenliğine etkiyeceği için, kullanılacak
metocl amaca yönelik seçilmelidir. Lipozom hazırlarken ilk önce
dikkat edilecek nokta kullanılaca!~
lipidin saf olmasıdır. İçerdikleri
serbest yağ asitleri ve lizofosfolipidler lipozomların yüküne, ve geçirgenliğine etkirler (43) . Bütün fosfolipidler kullanılmadan önce en az iki çözücü sisteminde ince tabaka kromatografisi ile kontrol edilmelidir ( 43).
Fosfotidilkolin lipozomların hazırlanmasında en yaygın olarak kullanılan fosfolipiddir ve yumurta sarısından ekstraksiyonla elde edilir ('23) . Fosfatidilserin, fosfatidik asit ve sifingomiyelin ise öküz beyninden elde edilir (44) . Yüksek basınç sıvı kromatografisi ile de soıı
suv LUV REV
0.02 - 0.05 0.2 - 1.0 0,2 - 0.8
o.5 - ı.o 5 - 15 36 - 65
0.5 9 14
zamanlarda karışımlardan saf fosf olipidler elde edilmiştir (45). Saflaştırılmış fosfolipidler inert gaz altında organik çözücüler içinde, -20°c de saklanmalıdır (43).
Çok Tabakalı Lipozomlarm (MLV) Hazırlanması:
MVL ler tam anlamıyla bütün özellikleri bilinmemesine rağmen,
en ilk hazırlanışı açıldanan ve en yaygın olarak kullanılan lipozom şeklidir (Şekil 3) .
Bangham (11) tarafından ortaya atılan ilk MLV hazırlama metodu ince lipid filminin hidratasyonu esasına dayanır. İnce lipid tabakası, lipidlerin kloroformdaki ÇÖ·
zeltisinin bir balon içinde önce rotovaporda sonra da vakumlu desikatörde iyice uçurulması sonuc~t
elde edilir. Tabakaların arasınd'.:ı.
tutulması istenen sulu çözelti ile balonun iç yüzeyindeki lipid filmi, ya el veya vorteks karıştırma ile lipozom tanecikleri halinde ortama dağıtılır. Lipozomlar ancak fosfo-
187
Sulu Faz
Şekil 3. Çok Tabakalı Bir Lipozomun Şematik Görünüşü
lipidler faz değiştirme sıcaklığı üze
rinde h idratize edildikleri zaman
oluşurlar. Hidratasyon zamanını'1
oluşan lipozomların kapladıkları ~u
fazı miktarına çok etkisi vardır.
Benzer lipid konsantrasyonları 2
saat yerine, yavaş yavas çalkalana
rak 20 saat hidratasyona bırakılır
sa, bir mol lipid başına %50 dah:ı
fazla sulu faz düşecek şekilde lipo
zom oluşturulabilir. Ancak bu iki
preparat hemen hemen aynı parti
kül büyüklüğüne sahiptir (46).
İlk defa Bangham tarafından
uygulanan (11) klasik yöntemle el
de edilen lipozomlar çok farklı bü
yüklükte ve küre yanında uzunc:ı
şekillere de sahip olabilirler. İste
nen büyüklük ve şekilde çok taba
kalı lipozomlar, heterojen karışımın
188
basınç altında polikarbonat filt
relerinden (Nucleopore Inc.) geçi
rilmesi ile elde edilir ( 46) . F il tre
lerin gözenek çapı 0.2, 0.4, 0.6, 0.8
ve ı.o µm olan cinsleri kullanılır.
Ancak filtrasyon işlemi faz değişi
mi sıcaklığının altında yapılmalıd ı<.
Küçük Tek Tabakalı Lipozom
ların (SUV) Hazırlanması :
Benzer büyüklükte ve tek kom
partmanlı olan Jipozomlar, fiziko
kimyasal özelliklerinin daha iyi bi
linmesi nedeniyle araştırma ve UY ·
gulamalar için MLV lere kıyasla çok
daha elverişlid ir. SUV lerin hazır
lanması için ultrasonik enerjinin
kullanılma fikri ilk Huang (47) ta
rafından öne sürülmüştür. Ya çu
buk veya banyo tipi sonikatör kul
lanarak işlem gerçekleştirilir. Çu-
ouk tipi kullanılırsa daha çok ener
jiden yararlanılır ve daha kısa sürede sonuç elde edilir, ancak çu
buğun ucundan kopan titanyum
parçacıklarının sonradan ultrafiltrasyon veya santrifüj ile temizlen
mesi gerekir. Sonikasyon, faz değişim sıcaklığının hemen üzerinde
ki bir sıcaklıkta yapılmalıdır. Ak~i
halde lipozomların yapılarında ku
surlu kısımlar oluşur (41, 48, 49).
Belli bir lipid dispersiyonunun so
nikasyon süresi arttıkça, dispersi
yonun bulanıklılığı ve viskozitesi semilogaritmik olarak azalır . Platoya ulaşıldığında ışığa karşı geçir
~en ve tek düze bir dağılımdadır.
Sonikasyon ile 215 - 500 A 0 boyutı~
rında lipozomlar elde edilir.
Deterjan ayrılması tekniğiyle
de tek tabakalı lipozomlar hazı:·
lanmıştır. Fosfolipidlerin sodyum
kolat gibi bir deterjanla karışık
miselleri hazırlanır ve bu misellerden deterjan moleküllerinin jel filtrasyonu (50) veya diyaliz (51) il<.
ayrılması sonucu lipozomlar oluşuı".
pH değişikliği ve farklı miktarlar
da kolestrol kullanılması istenen boyutlarda lipozomların hazırlan
masını sağlar. Diyaliz yöntemi ile
lipozom hazırlayan ticari bir alet de gelştirilmiştir (Lipoprep R Bi
layer Liposome Preparation Device Bachover, Reutlinger, Batı Alma nya).
Küçük tek tabakalı lipozomlar enjeksiyon metoduyla da elde edilebilir. Lipidlerin etanollü çözeltileri bir Hamilton iğnesi kullanıla
rak yavaş yavaş karıştınlan, faz
değiştirme sıcaklığının üzerinde ısı
tılmış sulu çözeltinin üzerine enjekte edilir (52). Oluşan lipozom
ların büyüklükleri alkol çözeltisin
deki lipid konsantrasyonuna göre değişir (53). Bu yöntemin bir de
zavantaj ı çok seyreltik lipozom przparatlarının oluşmasıdır. French
basınç hücresi ile de küçük tek tabakalı lipozomlar hazırlanmıştır.
(54, 55). Lipidlerin sulu sjspansiyonu
French basınç hücresinin odacığı
na konur ve 20.000 psi basınçl::ı
ufak bir delikten fışkırtılır. Oluşan lipozomlar 150 - 300 A büyüklü
ğündedir.
Büyiik Tek Tabakalı Lipozom
Iarın (LUV) Hazırlanması : KüçüK
tek tabakalı lipozomlar her ne kadar fizikokimyasal özelliklerin incelenmesi açısından uygunsa da
pratikte makromoleküllü maddelerin preparatlarının hazırlanma:;ı
için ve fazla miktarda sulu fazrn tutulmasvı için uygun değildir. Bu nedenden LUV lerin hazırlanma-;ı
için yöntemler geliştirilmiştir. Li
pid tabakasının yavaş yavaş hidratasyonla şişmesi ile bu tip lipo
zomlar elde edilebil ir (56>.
Bu yöntemde şişme olayı dış
tan hiçbir ŞE.kilde sarsma oımadarı
~erçekleşmelidir. Yavaşça su buha. rı ile doyurulmuş azot gazının
cam üzerindeki lipid filminin üzetine üflenmesi ile lipid tabakasının .~iı;mesi ve ayrılması sağl anır. µ ..
nun üzerine bir miktar su damlatıl ı rsa büyük tek tabakalı lipozom
lar oluşacaktır (56) .
189
Oo- <;)~ o ·-- 0 ~+ Q ~(\-+ ----t~- TA o o ~(,) ~ - -
0 0 0 .O . -
suv Ko klt <ıt -LUV Şekil 4. Kalsiyum ve EDTA Etkisiyle LUV Hazırlanması
Eter enjeksiyon yöntemi ile de LUV ler elde edilebilir (57). Fosfo
lipidlerin eterdeki çözeltilerinin ılık
(55° - 65°C) sulu çözeltiye enjeksi
yonu sonucu organik çözücünün uçurulması ile lipozomlar hazırla
nır. 1.2 µm milipor filtrelerinden
süzüldükten sonra lipozom dispersi
yonunun ortalama partikül büyüklüğü 1500 - 2500 A0 arasındadır.
Papahadjopoulos ve arkadaşla
rının (58) önerdiği LUV elde etme
tekniği ise asidik fosfolipidlerden hazırlanmış SUV ler üzerine kal
siyum ilavesiyle büyük silindiri!~
kıvrık çok tabakalı yapılar oluştu
rulması prensibine dayanır. Bu silindirik yapıların (kokleat} üzerine
etilendiamintetraasetik asit ilavesi büyük tek tabakalı lipozomların eldesine neden olur (Şekil 4).
Ters faz buharlaşma yöntemi LUV hazırlanması için önerilen ye
ni bir metodtur (59). Fosfolipidlerin eterdeki çözeltisine sulu çözel
tinin ilavesinden sonra organik çözücünün alçak basınçta uçurulması ile lipozomlar hazırlanır. Fosfolipidler önce dietileter, izopropileter
veya izopropileter ve kloroform ka-
190
rışımı (1 : 1) gibi organik çözücü
lerde çözülür. Sulu çözelti bunun üzerine ilave edilir. Kısa bir süre
sonikasyon uygulanır ve homojen.
bir S/Y emülsiyonu oluşur. Organik faz alçak basınçta uçurulunca faz değişimi sonucu viskoz jel bir
yapı oluşur, sonra bu jelden roto
vaporda organik çözücünün uçurulmasına devam edildikçe lipozomlar meydana gelir. Şayet buharlaştırma
çok hızlı olursa, bir miktar su da
buharlaşabileceğinden çok tabakalı
lipozomların da oluşması mümkün
dür. Daha sonraki bir çalışmada
orta büyüklükte (0.1 - 0.2 µm) lipo
zomlar elde etmek için REV ler polikarbonat filitrelerindeıi geçi
rilmişlerdir (60) .
Tek tabakalı ve büyük lipu
zomların hazırlanması için son za
manlarda yeni bir yöntem daha ö
nerilmiştir (61). Dondurup eritme
prensibine dayanan bu yöntemde
önce klasik şekilde çok tabakalı li
pozom süspansiyonu hazırlanır. 1 O
dakika kadar sonikasyon uygulanıp
- 196°C sıvı azot içerisinde yavaş
yavaş çalkalayarak dondurulur. 15
dakika 23°C de eritilip 25°C de tek
rar 30 saniye sonikasyona tabi tu
tularak istenen özellikte LUV ler
elde edilir.
Yukarıda anlatılan tekniklerle
elde edilen lipozomlardan ortamd':l.
ki Jipozom yapısına girmeden ka-
lan maddeler,- jel
(62, 63) (Sephadex kromatografisi
G - 50, G - 75),
ultrasantrifüj (64, 65), ultrafiltras
yon (66), ve diyaliz (67, 68) yön
temleri ile ayrılır.
Hazırlanmış lipozomlarda, et
ken maddeyi en randımanlı ş.ekil
de tutma, büyük molekülleri de
yapılarına alabilme, dayanıklı ol
ma, dar büyüklük dağılımı göster
me ve bilinen tabaka sayısına sa
h ip olma gibi özellikler aranır. Bu
özelliklerin hepsini sağlayabilecek
tek bir hazırlama yöntemi bulmak
çok zordur. Her hazırlama tekni
ğinde birtakım arzu edilmeyen nok
talar bulunur. Ancak mevcut yön
temler arasında, yukarıda sayılan
özelliklerin çoğuna sahip lipozom
ların hazırlanmasını sağlıyabilen
ve son zamanlarda ilerisi için en
çok ümit vadeder gibi görülen yön
tem ters faz buharlaştırma yönte
midir (3) (Bak. Tablo 1). Günü
m üze dek, üzerinde bu denli çalı
şılmasına rağmen istenen özellik
lerde lipowmlann endüstriyel çap
ta büyük miktarlarda hazırlanma
sını sağlayacak bir teknik henüz
geliştirilememiştir.
SONUÇ Lipozomlar son yıllarda özel
likle ilaç taşıyıcı sistemler olarak
üzerinde çok çalışılan bir konu ol-
muştur. Temel yapılarını fosfolipid
moleküllerinin çift sıralı dizilişleri
oluşturur. Doğal membrana ben
zeyen bu yapının özellikleri kendi
ni oluşturan fosfolipid molekülle
rinin ve diğer katkı maddelerin
özelliklerine bağlı olarak değişir.
Lipozom hazırlanırken, bitmiş ürün
den istenen özellikler gözönüne a
lınarak yöntem saptanmalıdır. Mev
cut yöntemler arasında şimdilik aranan özellikleri en fazla sağlaya
bilen metod olarak ters faz buhar
laştırma yöntemi söylenebilir . AP.
cak henüz endüstriyel çapta lipo
zom imalatı geliştirilememiştir.
(Geliş Tarihi : 21.10.1982)
KAYNAKLAR
ı. Windder, K.J., Senyei, A.E,
Sears, B., «Experimental Met
hods in Cancer Therapeutics»,
J. Pharm. Sci, 71, 379 - 387,
1982. 2. Gregoriadis, G., «Targeting of
Drugs: Implications in Medi
cine», Lancet, 2, 241 - 247, 198!.
3. Papahadjopoulos, D., Fraley,
R ., Heath, T.. «Optimization
of Liposomes As
System for the
A Carrier
In tracell ula ı:
Delivery of Drugs, Macromole
cules», Tom B.H., Six H.R.
(Ed) ., Liposomes and Iınınu
nobiology, Elsevier North Hol
land, Inc., 151 - 164, 1980.
4. Gregoriadis, G ., Allison, A.C .,
(Ed} «Liposomes in Biological
Systems» Chichester, N.Y ..
John Wiley and Sons, 1980.
5. Saunder, R., «Liposomes as
Carriers in Biological Systems»,
191
South African. J. Sci., 76, 297 ·
298, 1980.
6. I'apahadjopoulos, D. «Liposomes as Drug Carriers», Amı.
Rep. Med. Chem, 14, 250 - 260,
1979
7. Bangham, A.D., Hill, M.W., Miller, N.G.A., «Preparation and use of Liposomes as MJdels of Biological Membranes.», Korn E.D. (Ed) , Methods in Membrane Biology, New Yorıc,
Plenum Press, Vol. 1, 1974.
8. Bangham A.D., «Properties and Uses of Lipid Vesicles An Overview», Ann. N.Y. Acaıl,
Sci., 308, 2 - 7, 1978.
9. Fifield, R., «Liposomes Bags
of Biological Potential», New Scientist, 150 - 153, 16 Oct. 1980.
10. Ceztaro B., Cervato G,, Suman T., Pistolesi E., Bolognani L. «Liposomes as Tool in Studying Functions of the Membranes A Biophysical Approach to the Properties of Sulfatide - Phospholipid Bilayers», Basic Ap_(>. Histo - ehem., 26, 28, "1982.
11. Bangham A.D., Standish M.M., Watkins, J.C., «Diffusion of Unilavent ions across the lamella of swollen phospholipids», J. Mol. Bio., 13, 238 - 252,
1965.
12. Hicks, M., Gebicki J.M., «Microscopic Studies of Fatty Acıd Vesicles», Chem. Phys. Lipids, 20' 243 - 252, 1977.
13. Fendlcr, J.H., «Surfaclant V~
sicles as Membrane Mimectic Agents Characterization and
192
Utilization», Acc. Chem, Res .• 13, 7 - 13, 1980.
14. Hauser H., Guyer W., Pascher I., Skarabel P., Sundell S., «Polar Group Conformation of Phosphatidylcholine : Effect of Solvent and Aggregatiom. Biochemistry, 19, 366 · 373, 1980.
15. Parsegian V.A., Rand R.P ., Fuller N. Mc Alister M, Lis L.J., «Molecular Forces between and within Lipid Membranes», Biorheology, 16, 293 -
295, 1979.
16. Tanf0ld C., (Ed) The Hydrophobic Effect. Formation of Micelles and Biological Membranes, John Wiley, N. Y 2nd. Ed. 1980
17. Goto K., Sata H., «Formation of Celi - Sized Single - Layered Liposomes in a Simple System of Phospholipid, Ethanol
and Water», Tokoku J. Exp.
Med., 131 , 399 - 407, 1980.
18. Bangham A.D., Horne R.W .. «Negative Staining of Phospholipids and their Structuml Modification by Surface Active Agents as Observed in the Electron Microscope», J. Mol. Bio., 8, 660 - 668, 1964.
19. Rainier S., Jain M.K., Ramirez F., Ioannou V.P., Marecek J.F. , Wagner R., «Phase Transition Charecteristics of Diphosphatidyl - Glycerol (Cardiolipin) and Stereoisomeric Phosphatidyldiacylglycerol Bilayers. M.ono and Divalent Metal Ion Ef. fects, «Bioc1lim. Biophys. Act.ı ,
558, 187 - 198, 1979.
20. Goto K. Tamahashi N., «Elet:
tron Microscopic Studies on
Celi - Sized Bilayer Liposomes-.ı,
Tohoku J. Exp. Med., 134, 97 -
102, 1981.
21. Hui S.W. Stewart T .P ., Yeag
Je P.L., -Albert A.D., «Bilaycr
to Non - bilaycr Transition in
Mixtures of Phosphatidyletha
nolaminc and Phosphatidylcho
line. Iınpications for Memb
ranc Propcrties», Arch. Bioc
hcın. Bioplıys, 207, 227 - 240.
1981.
22. Pctcrsen, N.O., Chan SJ., «Mo-
re on the Motional State of Lipid Bilayer Membranes : In
terpratations of Order Para
meters Obtained frorn Nııcleo.:
Magnetic Resonance Experi
men ts», Biochcmistry, 16 .. 2687 -
2660, 1977.
23. Mason J.T., Huang, C., «Hyd
rodynamic Analysis of Eg",
Pho~phatidylcholin Vesicles·\
Aıın. N,Y. Acad. Sci, 308, 29 -
49, 1978.
24. Wu P.S., Tin G.W., Ba\desclı
wieler J.D., Shen T .Y., P on
pipom MM., «Effect of SıJrf'.l
ce Modification on Aggregatio11
of Phospholipid Vesiclesıı. Pro-:.:
Natl. Acad. Sci. USA, 78, 6211 -
6215, 1981.
2!1. H ichols J.W , Hill M.W., Bang
harn A.D., Dearner D.W, «Me:o.
surement of Net Proton - Hyd
roxyl Permeability of Largc
Unilamellar Liposornes with
the Fluorencent pH Prob , !l -
Aminoacridine», Biochim. Bi
ophys, Acta., 596, 393 - 403 ,
1980.
26. Wilschut J ., Düzgüneş N., Frn
Iey R., Papahadjopoulos D ,
«Studies on the Merhanism of
Membrane Fusion Kinetics
of Calcium Ion Induced Fusi
on of Phosphatidylserine Vc
sicles Followed by a New As
say for Mixing of Arıueous Ve
sicles Contcntsıı, Biochemistry,
19, 6011 - 6021, 1980.
27. Clement N.R., Gould J.M.,
«Pyraninc (8 - Hydroxy - 1, 3. 6
Phospholipid Vesiclc», Bioc
be of Internal Aqueous Hydro
gen Ion Concentration in
Phospholipid Vesicelsıı, Bio·;
hcmistry, 20, 1534 • 1538, 1981.
28 Clement N.R , Gould J.M ..
<(Modulation by Srnall Hydrop
hobic Mo!ecules of Valinomy ·
cin Mediated Potassiura
Transpor t across Phosph olipid
Vesicl e Membranesıı. Bioch~
mistry, 20, 1534 - 1538, 1981.
2fl. Clement N R ., Gould .J.M., «Ki
netics for Develooment ·of Gr,ı
micidin - Induced Ion Perm<:
ability in Unilameller Phosn
holipid Vesicles», Biochemistry,
20. 1544 - 1548, 1981.
30. Wallach D.F., Verma S.P
Fookson J ., «Applic·ıtion of
Laser Raman and Infrared
Spectroscopy to the Ana lysi';
of Membrane Structure», Bi·
ochim, Biophys. Acta. 550, 153 ·
208, 1979.
31 Pink D.A, Green T.J., Chap ·
193
man D., «Raman Scattering in Bilayevrs of Saturated Phosp-hatidylcholines. Experiment and theory ,)> Biochcmistry 22,
349 - 356, 1980.
32. Mason J.T., Huang C., Biltonen R.L., «Calorimetric Investigations of Saturated Mixed -Chain Phosphatidylcoline Bilayer Dispersions». Biochcmistry, 20, 6086 - 6092, 1981.
33. Lee A.G., «Lipid Phase Transitions and Phase Diagrames I. Lipid Phase Transitivns», Biochim, Biophys. Acta, 472, 237
281, 1977.
34. Lee A.G., «Analysis of the Defect Structure of gel - phase Lipid», Biochcmistry, 16, 835 -
841, 1977.
35. Mabrey S., Mates P.L, Sturtevant J .M., «High Sensitivity Scanning Calorhnetric Study Qf Mixtures of Cholesterol with dimyristoyl and Dipalmitoylphosphatidylcholines», Biochı>
mistry, 17, 2464 - 2468, 1978.
36. Hınz H.J .,Stu r tevant J .M., «Calorimetric Investigation of the Influence of Cholesterol on the Transition Properties of Bilayers Formed From Synthetic - L - Lecithins in Aqueous Suspensions.», J. Biol. Chem., 247, 3697 - 3700.
37. Gruenewald B_, Blume A., Wa-
194
tanage F ., «Kinetic Investigations on the Phase Transition of Phospholipid Bilayers», Bio<:him. Biophys. Acta., !>97, 41 - 52,
1980.
38. Dresdner G ., Ehrenberg A ,
Hammarström L., Smith E , «Interaction Between Lymphocytes and Lecithin - cholesterol Vesicles», Acta. Chem. Scand_, 33, 599, 1979.
39. J ain M.K., Ramirez F., McCaf
frey T.M., Ioannou P.V., Marecek J.F., IHjvelt J.L., «Phos-phatidylcholesterol
A Model For
Bilayers
Phvspholipid Cholesterol Interaction», Biochim. Biophys. Acta., 600, 678 -
688, 1980.
40. Kirby C., Gregoriadis G., «The Effect of the Cholesterol Content of Small Unilamellar Liposomes on the Fate of Lipid Components In Vivo», Life Sci , 27 (23) : 2223 - 2230, 1980.
41. Brendzel A.M., Miller I.F_, «Effects of Lipid - Soluble Substances on the Thermotropic Properties of Liposoıne Filtration», Biochim. Biophys. Acta, 601, 260 - 270. '1980.
42. Georghiou S.. Mukhopadhyay A.K., «Phase Transitions and Cholesterol Effects in Phospholipid Liposomes, A New Method Employing the Enhancement of the O - O Vibronic Transition of Pyrene», Biochim. Biophys. Acta., 645, 365 -
368, 1981.
43. Szoka Jr. F., Papahadjopoule;
D., «Comparavtive Properties and Methods of Preparation of Lipid Vesicles (Liposomes) )), Ann. Rev. Biophys. Bioeng., 9 :
467 - 509, 1980.
44. Papahadjopeulos D. Miller, N.
«Ph ospholipid Model Membra
nes I Structural Characteris
tics of Hydrated Liquid Crys
tals», Biochim. Biopbys, Acta,
135, 624 - 638, 1967.
45. Nonaka, G., Kishimoto, Y.,
«Simultaneous Determination
of Picomole Levels of gluco -
and galacto Cer ebroside, Mo
nogalactosyl diglyceride and
sulfatide by HPLC. «Biochim.
Bioph ys. Acta, 572, 423 - 431,
1979.
46. Olson F., Hunt C.A.. Szoka
F.C., Vail W.J., Papahadjopou
los D., «Preparation of Lipo
somes of Defined Size Distri
bution By Extrusion Through
Polycarbonate Membranes», Bi
ochim. Biophys. Acta, 557,
9 - 2,3 1979.
47 Huang. c., «Studies on Phos
pha tidylcholine Vesicles For
mation and Ph ysical Charac
teristics» Biochemistry, 8, 344 -
352, 1969.
48. Lawaczeck. R-, Kainosho, . M.,
Girardet, J.L., Cha n, S, I ... «Ef
fects of Structural Defects in
Sonicated Ph ospholipid Vesic
les on Fusion and Ion Perme
ability», Nature, 256, 584 - 586,
1975.
49. Lawaczeck. R,, Kainosho, M.,
Chan, S. I,, «The Formation
and Annealing of Structural
Defects in Llpivd Bilayer Vc
sicles», Biochim. Biophys. Acta.
443, 313 - 330. 1976.
50. Brunner, J., Skrabal, P ., Hau
ser, H., «Single Bilayer Vesic
les Prepared Without Sonica
tion : Physico - Cheınical Pro
perties», Biochim. Biophys. A•~
ta 455, 322 - 331, 1976.
51. Milsmann, M.H.W., Schwend~
ner, R .A., Weder, H.G., «The
Preparation of Large Single
Bilayer Liposomes By A Fa~t
and Controlled Dialysis», Bi
ochim. Biophys. Acta., 512,
147 -155, 1978,
52. Batzri, S., Korn, E.D., «Single
Bilayer Liposomes Prepared
Wilhout Sonicatiom>, Biochim.
Biophys. Acta., 298, 1015 - 1019,
1973.
53. Kremer, J.M., Esker , M.W.,
Pathmamanohoran, C,, Wier..>e
ma, P.H., «Vesicles of Variable
Diameter Prepared by a Mo
dified Injection Method», Bi
ochemistry. 16, 3932 - 3935, 1977.
54. Barenholz, Y., Amselem, s., Lichtenberg, D., «A New Met
hod for Preparation of Phos
pholipid Vesicles {Liposomes) :
French Press», FEBS Letter,
99, 210 - 214, 1979.
55. Hamilton Jr. R .L,, George, .T.,
Guo, L,S.S., Williams, M.C.,
Havel, R.J., «Unilamellar Li
posomes Made With thc French
Pressure Cell A Simple Pre
par ative and Semiquantitative
Technique», J. Lipid. Res, 21,
981 - 992, 1980,
56. Reeves, J.P., Dowben, R.M,
«Formation and Properties of
Thin - Walled Phospholipid Ve-
195
sicles», J. Celi. Physiol., 73,
49 - 60, 1969.
57. Deamer. D., Bangham. A.D ,
«Large Volume Liposomes by
an Ether Vaporization Met
hod», Biochim. Biophys. Acta,
443, 629 - 634, 1976.
58 Papah adjopoulos, D.P ,, Vail ,
W.J., Jacobson, K., Postc, G.
«Cochleate Lipid Cylinders
Formation by Fusion of Uni
lamellar Lipid Vesicles», Bl
ochim, Biophys. Acta , 394, 483
491, 1975.
59. Szoka, F C., P apahadjopoulos,
D., «A New Procedure for Pr<!
paration of Liposomes Witll
La.rge Internal Aqueous Spacc
and High Capture, by R everse
Phasc Evaporation (REV )ı>,
Proc. Natl. Acad . Sci., USı\,
75, 4194 - 4198, 1978.
GO Szoka, F ., Olson, F., H~ath, T.,
Vail, W., Mayhem, E., Pap·.ı
hadjopoulos, D, «Preparation
of Unilamellar Liposomes of
Intermediate Size (0.1 - 0.2 iJ.m)
by a Combination of Rcversc
Phase Evaooration · and Extru-
sion Through Polycarbom.t.~
membranes», Biochim. Biop-
hys, Acta., 601, 559 - 571. 1980.
Gl. Pick, U., «Liposomes With "
L:ırge Trapping Capacity Pr .>
pared by Freezing and Tha
wing of Sonicated Phospholi
pid Mixtures», ı\.rch . Biochcm.
Eiophy., 212, 186 - 194, 1981.
62. Nichols, J .W., Deamer, D .W ..
«Net Proton - h ydroxyl Per
meability of La.rge Unilamellar
196
Liposomcs Measured by .. 111
Acid - base Titra tion Techni
que», Proc, Natl. Acad, Sci.
USA., 77, 2038 - 2042, 1980.
63. Kawada, J ., Tanaka, N., Noza
ki, Y ., «No R eduction of Blocd
Glucose in Diabetic Rats Af
ter Oral Administration or Insulin Liposomes Preparc~l
Under Acidic Conditions.», Eo
docrinol. Jap., 28 (2), 235 - 238,
1981.
G4. Abra, R M., Bosworth, M E ..
Hunt. C.A., «Liposome Dispo
sition In Vivo I Effects of
Pre - Dosing With Liposomes».
Rcs. Com. Chcm. Patholo1nı
Pharma col., 29, 349 360, 1980
65. Barrow, DA., Lentz, B.R .,
«La.rge Vesiclc Contamination
in Small llnilamellar Vesicles.ı,
Biochim Biophys. Acta., 597,
92 - 99, 1930.
66. Strauss, G.. Ingenito, E P .,
<ıStabilization of Liposome Bi
layers to Freezing and Tha
wing : Effects of Cryoprotecti
ve Agents and Membrane Pr0-
teins», Cryobiology, 17, 508 -
515, 1980.
67. Kin sky, C, «Preparation of Li
posomes and a Spectrophoto
metric Assay for Release of
Trapped Glucose Markero ,,
Methods in Enzymologv, 32
501 - 503. 1974.
68. Hunt, C., Tsang, S., «x - To
copherol Reta rds Autoxidation
and Prolongs the Shelf - Lifz
of Liposomes» .. Int. J. Pharm ..
8, 101 - 110, 1981.